EA005577B1

EA005577B1 - Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученный способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, днк-полимеразы и эндонуклеазы

Info

Publication number: EA005577B1
Application number: EA200300991A
Authority: EA
Inventors: Хироюки Мукаи; Юнко Ямамото; Осаму Такеда; Казуе Мияке; Такаси Уемори; Есими Сато; Марико Морияма; Харухиза Савараги; Митио Хагия; Киезо Асада; Икуносин Като
Original assignee: Такара Био Инк.
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2005-04-28
Also published as: CA2365135A1; EP1167524B1; EA200100990A1; AU773536B2; ATE362532T1; CN1350581A; KR20010104720A; AU2944200A; EP1167524A1; TWI259204B; KR100682576B1; EP1167524A4; WO2000056877A1; DE60034878T2; EA004327B1; EA200300991A1; CA2365135C; JP3433929B2; CN1227357C; DE60034878D1

Abstract

В изобретении раскрыто средство, применимое для удобного и эффективного способа амплификации последовательности нуклеиновой кислоты и способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени, а именно химерные олигонуклеотидные праймеры, содержащие дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид расположен на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, а также применение ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи и эндонуклеазы для осуществления указанных способов. Кроме того в изобретении раскрыт продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, размещенную в определенном порядке на предварительно заданном участке, причем способ получения продукта включает амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи и эндонуклеазы.

Description

Настоящее изобретение относится к области генетической инженерии и биотехнологии. В частности, оно применимо для амплификации нуклеотидных последовательностей, выявления нуклеиновой кислоты - мишени, и получения продукта, содержащего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, размещенную в определенном порядке на предварительно заданном участке.

Уровень техники

Синтез ДНК применяют для различных целей при исследованиях в области генетической инженерии. В большинстве случаев синтез ДНК, за исключением синтеза короткоцепочечных ДНК, таких как олигонуклеотид, осуществляют с помощью каталитических способов, в которых используют ДНКполимеразу. Примером таких способов является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), подробно описанный в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является метод ПЦР с ревертированием (с обратной транскрипцией) (ОТ-ПЦР), который представляет собой сочетание метода ПЦР и реакции обратной транскрипции, что описано в Тгепбх ίη Вю1есйио1оду, 1992, 10, 146-152. Развитие упомянутых выше способов позволяет амплифицировать представляющий интерес участок из состава ДНК или РНК.

Упомянутые выше способы синтеза ДНК осуществляют, например, с использованием реакции, состоящей из трёх стадий. Тремя стадиями являются стадия диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК, стадия отжига (присоединения) праймера на одноцепочечные ДНК и стадия синтеза (достройки) комплементарной цепи от праймера с целью амплификации интересующего участка ДНК. Как альтернатива, они могут быть осуществлены с использованием реакции, обозначаемой как «челночная ПЦР» («РСК йо χαίζοηχοη» (Кесеп! Лбуапсех ίη РСК те!йобо1оду: Вахю те11юбо1оду апб ίΐ'χ аррйсайоп), Тапракихййхи Какихап Коихо, Вохха1хи (Рго1ет, М.1с1с1с Ас1б апб Εηζуте, хирр1етеп1), 41 (5), 425-428 (1996)), в которой две из трёх стадий, а именно стадию отжига и стадию достройки, проводят при одной и той же температуре.

Как альтернатива, могут быть использованы способ лигазной цепной реакции (ЛЦР) в соответствии с описанным в европейской патентной заявке ЕР 320-308, опубликованной 14 июня 1989 г., или транскрипционная амплификационная система (ΤΑ8), описанная в РСК Рго1осо1х, Асабетю Ргехх 1пс., 1990, рр. 245-252. В четырёх способах, упоминавшихся выше, необходимым является повтор реакции при высокой температуре, а также несколько раз при низкой температуре с целью регенерации одноцепочечной молекулы-мишени для следующего цикла амплификации. Реакционная система должна быть реализована с использованием дискретных фаз или циклов, потому что реакция ограничена указанной выше температурой.

Таким образом, для таких способов необходимо использование дорогостоящего амплификатора («термоячейки»), который позволяет по ходу процесса быстро и точно корректировать температуру в широком диапазоне. Более того, в реакции требуется время для корректировки температуры до двух или трёх заранее определённых значений. Потери времени повышаются пропорционально числу циклов.

С целью решения указанных проблем были разработаны способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно проводить в изотермическом режиме. Их примерами являются способ амплификации с вытеснением (смещением) цепи (8ΌΑ) в соответствии с описанным в японской патентной заявке 1Р-В 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (38К), способ специфичной по конкретной последовательности амплификации нуклеиновой кислоты (ΝΑ8ΒΑ) в соответствии с описанным в японском патенте № 2650159, способ амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), способ с репликазой Οβ в соответствии с описанным в японском патенте № 2710159 и различные модификации способа 8ΌΑ в соответствии с описанным в патенте США № 5824517 и международных патентных заявках АО 99/09211, АО 95/25180 и АО 99/49081. Способ изотермического каталитического синтеза олигонуклеотида описан в патенте США № 5916777. В реакции в соответствии с данными способами изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтеза олигонуклеотида достройка с праймера и/или отжиг праймера на одноцепочечный продукт достройки (или на исходную последовательность-мишень) с последующей достройкой с праймера происходит «параллельно» в реакционной смеси, инкубируемой при постоянной температуре.

Среди способов изотермической амплификации нуклеиновых кислот способ 8ΌΑ является примером систем, в которых конечным результатом является амплификация ДНК. Способ 8ΌΑ представляет собой способ амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты (и комплементарной ей цепи) в образце за счёт вытеснения двойных цепей с использованием ДНК-полимеразы и рестриктазы. Способ требует использования четырёх праймеров для амплификации, два из которых должны быть сконструированы так, чтобы включать рестрикционные сайты для рестриктаз. Способ требует использования модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в качестве субстрата для синтеза ДНК в больших количествах. Примером модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов является (α8)-дезоксирибонуклеотидтрифосфат, в котором атом кислорода фосфатной группы по α-положению заменён на атом серы (8). Проблема текущих расходов, связанная с использованием модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата, становится серьёзной тогда, когда реакцию проводят как стандарт

- 1 005577 ную процедуру, например, при генетическом тестировании. Более того, включение модифицированного нуклеотида, такого как (а-8)-дезоксирибонуклеотид, в состав амплифицированного фрагмента ДНК в данном способе может исключить отщепляемость амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой, например, если его подвергают анализу методом ПДРФ (полиморфизма длин рестрикционных фрагментов).

Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в патенте США № 5824517 представляет собой способ амплификации ДНК, в котором используют химерный праймер, который состоит из РНК и ДНК и который характеризуется ключевым структурным элементом, в котором ДНК располагается на самом З'-конце. Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в международной патентной заявке XVО 99/09211 требует использования рестриктазы, которая образует 5'выступающий конец. Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в международной патентной заявке νθ 95/25180 требует использования по крайней мере двух пар праймеров. Модифицированный способ 8ΌΑ в соответствии с описанным в международной патентной заявке νθ 99/49081 требует использования по крайней мере двух пар праймеров и по крайней мере одного модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотида в соответствии с описанным в патенте США № 5916777 включает синтез ДНК с использованием праймера, имеющего на З'-конце рибонуклеотид, завершение реакции с использованием праймера, внесение с помощью эндонуклеазы ника между праймером и достроенным праймером в составе достроенной с праймера цепи с целью её отделения, отщепление матрицы и выделение праймера для его повторного использования. Необходимым для данного способа является выделение праймера из реакционной системы и затем снова отжиг его на матрицу с целью повторного использования праймера.

Как было описано выше, стандартные способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот создают ряд различных проблем. Следовательно, желательным является способ амплификации нуклеотидной последовательности при низкой стоимости расходов, в котором получают фрагмент ДНК, который может быть далее использован в генетической инженерии.

Сущность изобретения

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения сконструировали эффективную систему для реакции амплификации гена. Конструирование было осуществлено путём разработки способа, в котором представляющий интерес участок ДНК амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, включающего рибонуклеотид, расположенный на З'-конце или со стороны З'-конца, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Таким образом, настоящее изобретение было завершено. Способ по настоящему изобретению был определён как способ изотермической амплификации нуклеиновой кислоты (ΚΑΝ) с использованием химерного праймера, который является способом амплификации нуклеотидной последовательности, в котором химерный олигонуклеотидный праймер используют в изотермических условиях.

Первый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру, содержащему дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид и имеющему структуру, в которой рибонуклеотид расположен на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, для применения в способе, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является указанный химерный олигонуклеотидный праймер, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Согласно одному из аспектов изобретения химерный олигонуклеотидный праймер содержит два или большее число расположенных подряд рибонуклеотидных остатков. В соответствии еще с одним аспектом один или большее число рибонуклеотидных остатков могут представлять собой модифицированные рибонуклеотиды. Одним из аспектов настоящего изобретения предусмотрено, что таким модифицированны рибонуклеотидным остатком в составе химерного олигонуклеотидного праймера является (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с атомом фосфора в α-положении рибонуклеозидтрифосфата, заменён на атом серы, в качестве модифицированного рибонуклеотида.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к применению ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, в способе, включающем:

(а) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и

- 2 005577 (Ь) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

В следующем аспекте предусмотрено применение эндонуклеазы в способе, включающем:

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Еще одним аспектом настоящего изобретения предусматривается применение ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, в способе выявления нуклеиновой кислоты - мишени, включающем:

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, и амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени;

и дополнительно включающем выявление нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (Ь).

Следующий аспект изобретения относится к эндонуклеазе, используемой в способе выявления нуклеиновой кислоты-мишени, включающем:

Еще один аспект изобретения относится к продукту, содержащему иммобилизованную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота размещена в определенном порядке на предварительно заданном участке, приготовленному способом, включающим:

(A) амплификацию нуклеиновой кислоты, подлежащей иммобилизации, способом, включающим:

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, и амплификацию нуклеиновой кислоты - мишени; и (B) размещение в определенном порядке и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (Ь), на предварительно заданном участке подложки.

Согласно еще одному из аспектов иммобилизованная нуклеиновая кислота, содержащаяся в продукте, является одноцепочечной.

Следующим аспектом предусмотрено, что содержащаяся в продукте иммобилизованная одноцепочечная нуклеиновая кислота по существу свободна от комплементарной к ней цепи.

Перечень фигур

На фиг. 1 показана схема, иллюстрирующая пример способа по настоящему изобретению, в котором используют одноцепочечную ДНК. На фигуре высвобожденная цепь ДНК, обозначенная закрашенным кружочком, выполняет роль ДНК-матрицы для (6).

На фиг. 2 показаны результаты электрофореза в агарозном геле в отношении ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью способа по настоящему изобретению при различном времени реакции.

- 3 005577

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном тексте термин «дезоксирибонуклеотид» (также обозначаемый как 6Ν) обозначает нуклеотид, сахарный компонент которого представлен Ό-2-дезоксирибозой. Дезоксирибонуклеотиды включают, например, те дезоксирибонуклеотиды, основаниями в которых являются аденин, цитозин, гуанин или тимин.

«Рибонуклеотид» (также обозначаемый как Ν) обозначает нуклеотид, сахарный компонент которого представлен Ό-рибозой. Рибонуклеотиды включают, например, те рибонуклеотиды, основаниями в которых являются аденин, цитозин, гуанин или урацил. Рибонуклеотиды также включают модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода в составе фосфатной группы по α-положению заменён на атом серы (также обозначается как (α-8)рибонуклеотид или как (α-δ)-Ν), или другие производные.

«Химерный олигонуклеотидный праймер» обозначает праймер, который включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Праймер может включать немодифицированный дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный дезоксирибонуклеотид. Как альтернатива, он может включать немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Используемые в настоящем изобретении химерные олигонуклеотидные праймеры включают любой химерный олигонуклеотидный праймер, который включает рибонуклеотид, размещённый на 3'-конце или со стороны З'-конца праймера, может быть использован для достройки цепи нуклеиновой кислоты в способе по настоящему изобретению, может быть отщеплён эндонуклеазой и может быть использован для осуществления реакции вытеснения цепи.

Выражение «со стороны З'-конца» указывает на участок от середины до З'-конца нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Таким же образом выражение «со стороны 5'-конца» указывает на участок от середины до 5'-конца нуклеиновой кислоты.

«Эндонуклеаза» может являться любой эндонуклеазой, которая действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК от химерного олигонуклеотидного праймера, присоединённого к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, и которая специфическим образом отщепляет её по праймерному сегменту, включающему рибонуклеотид.

«ДНК-полимераза» обозначает фермент, который синтезирует цепь ДНК бе ηονο с использованием цепи ДНК в качестве матрицы. ДНК-полимеразой являются, тем самым не ограничиваясь, ДНКполимераза ро11-го типа (например, ДНК-полимераза I ЕксйепсЫа сой, фрагмент Клёнова и ДНКполимераза Тац), ДНК-полимеразы α-типа (например, ДНК-полимераза Ругососсик Гипокик (81га1адепе). ДНК-полимераза νΕΝΤ (№\ν Епд1апб Вю1аЬк), ДНК-полимераза ΚΘΌ (ТоуоЬо) и ДНК-полимераза ΌΕΕΡ νΕΝΤ (№\ν Епд1апб Вю1аЬк)) и ДНК-полимеразы, не относящиеся к α-типу или ροΐΐ-типу (например, ДНК-полимераза в соответствии с описанным в международной патентной заявке АО 97/24444). ДНКполимеразы, обладающие активностью по вытеснению цепи, включают ДНК-полимеразы термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик са1бо!епах (здесь и далее обозначаемой как В.са) и ВасШик к1еаго1йегторЫ1ик (здесь и далее обозначаемая как В.к1), а также варианты этих ДНК-полимераз, утратившие свою 5 иЗ'-экзо нуклеазную активность. Более того, ДНК-полимеразы с активностью по вытеснению цепи включают ДНК-полимеразы, например, фрагмент Клёнова, которые имеют активность по вытеснению цепи и не имеют 5и3'-экзонуклеазной активности. Кроме того, ДНК-полимераза может являться смесью нескольких ДНК-полимераз, такой как, без каких-либо ограничений, смесь ДНКполимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, и ДНК-полимеразы, которая не имеет активности по вытеснению цепи.

Выражение «активность по вытеснению цепи» указывает на активность, которая может обусловливать вытеснение цепи, а именно активность, которая может обеспечивать удвоение ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, путём вытеснения цепи ДНК с высвобождением комплементарной цепи, которая была присоединена к цепи-матрице. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная в результате вытеснения цепи с нуклеотидной последовательности, являющейся матрицей, обозначается здесь как «вытесненная цепь».

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

(1) Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении

Праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, является химерным олигонуклеотидным праймером, который включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Такие праймеры включают олигонуклеотидный праймер, который включает немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, может быть любым химерным олигонуклеотидным праймером, имеющим нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарна части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, который можно использовать для достройки цепи ДНК от его З'-конца и который имеет сайт на З'-конце или со стороны З'-конца, по которому эндонуклеаза отщепляет его в процессе реакции синтеза ДНК. Например, может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер,

- 4 005577 включающий рибонуклеотид, размещённый на З'-конце или со стороны З'-конца. Может быть использован химерный олигонуклеотид, в структуре которого имеется по крайней мере один, предпочтительно два или большее число последовательно расположенных рибонуклеотидных остатков, присоединённых к З'-концу или со стороны З'-конца праймера. Праймер обычно конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен участку, расположенному выше сегмента, предназначенного для амплификации, т.е. участку, находящемуся с З'-стороны нуклеотидной последовательности, соответствующей сегменту, предназначенному для амплификации, в составе нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. В данном тексте выражение «по существу комплементарная нуклеотидная последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая может соединиться с ДНК, являющейся матрицей, в используемых условиях проведения реакции. Такой химерный олигонуклеотидный праймер или олигонуклеотидный праймер может быть сконструирован специалистом в данной области техники в соответствии с известными процедурами, например, в соответствии со ссылкой на ЬаЬо Мапиа1 РСК (Такага δΐιιιζο. рр. 1З16, 1996). Можно использовать имеющийся в продаже программный пакет для конструирования праймера, такой как компьютерная программа ОЫ6О™ Рптег Лпа1у818 (Такага δΐιιιζο). Праймер конструируют таким образом, чтобы он расщеплялся под действием рибонуклеазы, такой как РНКаза-Н, по З'-концу рибонуклеотидного остатка.

Случайный праймер или вырожденный праймер может быть использован в реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, предпочтительно без каких-либо ограничений может быть использован праймер, имеющий случайную последовательность или вырожденную последовательность, находящуюся на самом З'-конце или со стороны З'-конца.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, может включать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. Рибонуклеотид может быть либо немодифицированным рибонуклеотидом, либо модифицированным рибонуклеотидом, который может быть размещён на З'-конце или со стороны З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера и который распознаётся эндонуклеазой или отщепляется ею. Рибонуклеотиды включают и немодифицированный рибонуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид в соответствии с описанным выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание могут быть использованы для химерного олигонуклеотидного праймера по настоящему изобретению, лишь бы они не нарушали функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются, тем самым не ограничиваясь, (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменён на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксильная группа во 2-м положении в составе рибозы заменена на метоксигруппу. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, включающий модифицированный рибонуклеотид, может быть получен с использованием, например, (а-8)-рибонуклеотидтрифосфата, который получают с помощью способа, описанного в патенте США № 500З097, с использованием реагента для реакции сульфирования (С1еп Кезеатсй) или 2-ОМе-КПА-СЕ-фосфоамидитного реагента (С1еп Кезеатсй).

Химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации по настоящему изобретению, может быть сконструирован так, чтобы он включал модифицированный рибонуклеотид, который обеспечивает устойчивость к отщеплению эндонуклеазой. Такой праймер применим для того, чтобы можно было контролировать сайт отщепления эндонуклеазой в процессе стадий реакции амплификации.

В настоящем изобретении могут быть использованы один или два химерных олигонуклеотидных праймера, что зависит от желательной формы ДНК-фрагмента, получаемого в результате амплификации (одноцепочечного или двухцепочечного). В частности, один химерный олигонуклеотидный праймер используют тогда, когда желательной является одноцепочечная ДНК, в то время как два праймера используют тогда, когда желательной является двухцепочечная ДНК.

Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, конкретным образом не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида была, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, таким образом, чтобы он соединялся с нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, при используемых условиях проведения реакции. Праймер включает последовательность, распознаваемую эндонуклеазой, которую используют на стадии, описанной далее, находящуюся на З'-конце или со стороны З'-конца.

Например, олигонуклеотид, имеющий структуру, представляемую нижеследующей общей формулой, можно использовать в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению в качестве праймера, хотя она и не призвана ограничить настоящее изобретение.

Общая формула: 5'-бК_а-Л_Ь-бК_с-З', где а - целое число от 11 или больше; Ь - 0 или целое число от 1 или больше; с - 0 или целое число от 1 или больше, при условии, что Ь и с одновременно не могут быть равны 0; 6Ν дезоксирибонуклеотид; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

- 5 005577

Например, в настоящем изобретении предпочтительно может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, в которой «а» является целым числом 11 или больше; и «Ь» = 1 и «с» = 0, «Ь» = 2 и «с» = 0, «Ь» = 3-5 и «с» = 0 или «Ь» = 2 и «с» = 0-5. Длина рибонуклеотидов на З'-конце или со стороны З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, предпочтительно является от мономерной до 15-мерной, более предпочтительно от мономерной до 10-мерной, наиболее предпочтительно от мономерной до пентамерной. Число «с» в базовой формуле конкретным образом не ограничивается, но можно выбрать любое число, которое может быть использовано в способе по настоящему изобретению. Обычно предпочтительным является 5 или меньше. Лучшие результаты получают в реакции, выбирая для «с» 3, нежели 4, выбирая 2, нежели 3, и выбирая 1, нежели 2. В частности, наиболее эффективно реакция может быть осуществлена в случае «с»=0.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, имеет структуру, в которой эндонуклеаза отщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНКполимеразы (достроенная с праймера цепь), по сайту, который включает рибонуклеотид. Другими словами, рибонуклеотид размещают на З'-конце или со стороны З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера для отщепления эндонуклеазой. Например, когда РНКаза-Н действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного общей формулой, который был присоединён к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, то химерный олигонуклеотидный праймер отщепляется по рибонуклеотидному участку. Затем получают двухцепочечную ДНК, в которую ник внесён между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной в результате достройки. Затем реакция вытеснения цепи с участием ДНК-полимеразы происходит от сайта внесённого ника. Таким образом, в способе по настоящему изобретению можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достройки цепи нуклеиновой кислоты от З'-конца праймера, который может быть отщеплён эндонуклеазой и с помощью которого ДНК-полимераза может осуществлять реакцию вытеснения цепи.

Химерный олигонуклеотидный праймер может быть синтезирован так, чтобы иметь любую нуклеотидную последовательность, с использованием, например, ДНК-синтезатора модели З94 от фирмы Аррйеб Вю5у51сш5 1пс. (АВ1) в соответствии с фосфоамидитным методом. Как альтернатива, любые способы, включая фосфотриэфирный метод, Н-фосфонатный метод и тиофосфонатный метод, могут быть использованы для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера.

(2) Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении.

Любая эндонуклеаза, которая действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера в соответствии с описанным выше в (1), который был соединён с нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, и которая отщепляет достроенную цепь, обеспечивая реакцию вытеснения цепи, может быть использована в настоящем изобретении. Таким образом, эндонуклеаза является ферментом, который создаёт ник (разрыв) на участке химерного олигонуклеотидного праймера в составе двухцепочечной ДНК. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются, тем самым не ограничиваясь, рибонуклеазы. Среди них предпочтительно может быть использована эндорибонуклеаза-Н (РНКаза-Н), которая действует на РНКчасть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, образованной ДНК и РНК. Любая рибонуклеаза, которая обладает указанными выше активностями, может быть предпочтительно использована в настоящем изобретении, включая мезофильные и устойчивые к нагреванию рибонуклеазы. Например, РНКаза-Н Е.сой может быть использована в реакции при температуре от примерно 50°С до примерно 70°С в способе по настоящему изобретению в соответствии с описанным далее в примерах. Также предпочтительно можно использовать имеющуюся в продаже термоустойчивую рибонуклеазу - термостабильную РНКазу-Н НуЬпбаке™ (ЕркеШет Тесйпо1още5). Более того, рибонуклеаза может являться встречающейся в нативных условиях или быть вариантом. Единица каталитической активности указанной здесь РНКазы-Н представляет собой величину, определённую в соответствии со способом измерения единицы каталитической активности, описанном в сравнительных примерах.

Эффективность реакции отщепления с участием эндонуклеазы, такой как РНКаза-Н, используемой в способе по настоящему изобретению, может зависеть от нуклеотидной последовательности вблизи от З'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации желательной ДНК. Следовательно, вполне естественно конструировать праймер, оптимальный для используемой РНКазы-Н.

В данном тексте термин «внесение ника (разрыва)» или «никинг» обозначает внутреннее отщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза-Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и содержащей рибонуклеотиды ДНК, избирательным среди двух цепей образом расщепляя содержащую рибонуклеотид цепь на участке присутствия рибонуклеотидов, тем самым внося ник в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

(3) ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении.

- 6 005577

ДНК-полимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи в ДНК, может быть использована в настоящем изобретении. В частности, предпочтительно может быть использована ДНК-полимераза, по существу лишённая 5'^3'-экзонуклеазной активности.

Выражение «активность по вытеснению цепи» обозначает активность, которая может обеспечивать вытеснение цепи, т.е. тем самым может обеспечивать удвоение ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, путём вытеснения цепи ДНК с высвобождением комплементарной цепи, которая была присоединена к цепи-матрице. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная в результате вытеснения цепи с нуклеотидной последовательности, являющейся матрицей, обозначается здесь как «вытесненная цепь».

В настоящем изобретении для достройки праймера могут быть использованы любые ДНКполимеразы, обладающие активностью по вытеснению цепи. Их примерами являются варианты ДНКполимераз, лишённые 5'^3'-экзонуклеазной активности, происходящие от термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик са1бо1еиах (здесь и далее обозначается как «В.са») и ВасШик ЧеатоФегторййш (здесь и далее обозначается как «В.81»), равно как и большой фрагмент (фрагмент Клёнова) ДНКполимеразы I ЕзсйепсЫа сой (Е.сой). И мезофильные, и термоустойчивые ДНК-полимеразы могут быть предпочтительно использованы в настоящем изобретении.

В.са является термофильной бактерией, характеризующейся оптимальной температурой роста примерно 70°С. ДНК-полимераза Вса от этой бактерии известна, как обладающая ДНК-зависимой ДНКполимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратнотранскриптазной активностью), 5'^3'-экзонуклеазной активностью и 3'^5'-экзонуклеазной активностью.

Фермент может быть либо ферментом, очищенным из его оригинального источника, либо рекомбинантным белком, полученным с использованием методов генетической инженерии. Фермент может быть подвергнут модификации, такой как замена, делеция, добавление или вставка, с применением методов генетической инженерии или иных способов. Примером модифицированных ферментов являются ДНКполимераза Вса ВЕ8Т (Такага ЗПшхо). которая является ДНК-полимеразой Вса, лишённой 5'^3'экзонуклеазной активности.

(4) Состав реакционного буфера, используемого в настоящем изобретении.

Реакционный буфер, который содержит буферный компонент, соль магния и άΝΤΡδ, используют в настоящем изобретении. Примерами буферных компонентов, которые предпочтительно можно использовать, являются, тем самым не ограничиваясь, трицин, Трис-гидрохлорид и фосфат (такой как фосфат натрия и фосфат калия). Среди них предпочтительным для настоящего изобретения является буфер, который содержит трицин или фосфат в качестве буферного компонента. Конечная концентрация буферного компонента находится в диапазоне 5-100 мМ, предпочтительно 20-50 мМ. Диапазон рН составляет 6,0-9,5, предпочтительно 7,0-9,2. Например, предпочтительно используют буфер, содержащий 22-46 мМ трицина, при рН=7,5-9,2 или буфер, содержащий 25-50 мМ фосфата калия, при рН=7,0-8,0. Примерами солей магния, которые можно предпочтительно использовать, являются, тем самым не ограничиваясь, хлорид магния, ацетат магния или сульфат магния. Конечная концентрация соли магния находится в диапазоне 1-20 мМ, предпочтительно 2-10 мМ. Конечная концентрация άΝΤΡδ (6ΆΤΡ, 6СТР, 6СТР и 6ΤΤΡ) в смеси, являющихся субстратами для реакции достройки ДНК, находится в диапазоне 0,1-3,0 мМ, предпочтительно 0,2-1,2 мМ. Содержание праймеров, используемых в реакционном объёме 50 мкл, составляет 1-1000 пкмоль, предпочтительно 10-100 пкмоль. Кроме того, реакционная смесь может содержать добавки, обеспечивающие, например, стабилизацию реакции амплификации. Могут быть добавлены БСА в конечной концентрации 0,1% или меньше, диметилсульфоксид в конечной концентрации 10% или меньше, путресцина дигидрохлорид в конечной концентрации 4 мМ или меньше или пропилендиамин в концентрации 0,01% или меньше. Как альтернатива, могут включаться ΝΜΡ (1-метил-2пирролидинон), глицерин, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид и/или формамид. Ожидается, что добавление таких органических растворителей снижает неспецифический отжиг олигонуклеотидных праймеров.

Количество РНКазы-Н Е.сой, являющейся примером эндонуклеаз, в реакционном объёме 50 мкл находится в диапазоне предпочтительно 3-200 ед., более предпочтительно 15-60 ед. Количество ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т, являющейся примером ДНК-полимераз, в реакционном объёме 50 мкл составляет предпочтительно 0,5-100 ед., более предпочтительно 1-22 ед. Предпочтительно количество единиц эндонуклеазы в этих диапазонах может варьироваться в зависимости от её типа. В таком случае состав буфера и количество фермента, которое необходимо добавить, корректируют таким образом, чтобы количество продукта амплификации достигало максимума. В любом случае естественной является оптимизация состава реакционного буфера и подобного с учётом типа используемого фермента.

(5) Амплификация нуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением.

Амплификация нуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлена с использованием по крайней мере одного олигонуклеотидного праймера в соответствии с описанным выше в (1) в сочетании с эндонуклеазой в соответствии с описанным выше в (2) и ДНК-полимеразой в соответствии с описанным выше в (3). άΝΤΡδ, используемые в методе ПЦР или по

- 7 005577 добном (смесь 6ЛТР, 6СТР, 6СТР и 6ТТР), могут быть предпочтительно использованы в качестве нуклеотидтрифосфатов, служащих субстратами для реакции достройки в данном способе. бИТРк могут включать аналог бЫТР, такой как 7-деаза-бСТР, лишь бы он выполнял роль субстрата для используемой ДНК-полимеразы. В данном способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер может быть получен, например, с использованием ДНК-синтезатора в соответствии со стандартным методом синтеза. В способе по настоящему изобретению можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и нормального олигонуклеотидного праймера.

Нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), используемая в качестве матрицы в способе по настоящему изобретению, может быть получена или выделена из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, тем самым не ограничиваясь, образцы, взятые от организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитарная плёнка, моча, фекалии, спинно-мозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или лимфатический узел) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или бактериальная клеточная культура), образцы, которые содержат нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, грибок, дрожжи, растение и животное, образцы, для которых предполагается загрязнение или инфицирование микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологический препарат), и образцы, которые могут содержать организм, такие как почва и сточные воды. Образец может являться препаратом, содержащим нуклеиновую кислоту, полученным в результате обработки образцов, описанных выше, в соответствии с известным методом. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный в результате фракционирования продукта, нуклеиновая кислота из образца или конкретные молекулы нуклеиновых кислот, такие как образец, обогащённый по содержанию мРНК. Более того, предпочтительно может быть использована нуклеиновая кислота, такая как ДНК или РНК, полученная в результате амплификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце, с помощью известных способов.

Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть приготовлен из упоминавшихся выше материалов с помощью, например, лизиса под действием детергента, ультразвука, встряхивания/перемешивания со стеклянными шариками или пресса Френча без каких-либо ограничений. В некоторых случаях предпочтение имеет дополнительная обработка препарата с целью очистки нуклеиновой кислоты (например, в случае, когда имеется эндогенная эндонуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают с помощью известных методов, таких как фенольная экстракция, хроматография, ионообменные реакции, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности.

Когда желательно амплифицировать нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, производную от РНК, способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной в реакции обратной транскрипции, в которой РНК используется в качестве матрицы. Любая РНК, для которой можно сформировать праймер для реакции обратной транскрипции, может быть использована в способе по настоящему изобретению, включая молекулы РНК, такие как тотальная РНК, мРНК, тРНК и рРНК в образце, равно как и конкретные виды РНК.

Любой праймер, который соединяется с РНК, служащей матрицей, в используемых условиях реакции, может быть использован в реакции обратной транскрипции. Праймер может являться праймером, характеризующимся нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна конкретной РНК, служащей матрицей (специфичный праймер), олиго-дТ (олиготиминовым) праймером и праймером, имеющим случайную последовательность (случайный праймер). С точки зрения специфичности отжига длина праймера для обратной транскрипции составляет предпочтительно 6 нуклеотидов или больше, более предпочтительно 9 нуклеотидов или больше. С точки зрения синтеза олигонуклеотидов длина предпочтительно составляет 100 нуклеотидов или меньше, более предпочтительно 30 нуклеотидов или меньше.

Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в качестве праймера для обратной транскрипции. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно использовать в качестве праймера для реакции вытеснения цепи в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с использованием кДНК, полученной в результате обратной транскрипции, в качестве матрицы. Такой праймер может быть любым праймером, который обладает свойствами, описанными выше в (1), и который можно использовать в реакции обратной транскрипции на материале РНК.

В реакции обратной транскрипции может быть использован любой фермент, который обладает активностью по синтезу кДНК с использованием РНК в качестве матрицы. Их примерами являются обратные транскриптазы, происходящие от различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая от вируса миелобластоза птиц (ОТаза АМУ), обратная транскриптаза, происходящая от вируса лейкоза Молони мышей (ОТаза ММЬУ), и обратная транскриптаза вируса-2, ассоциированного с вирусом саркомы Рауса (ОТаза КА.У-2). Кроме того, может быть использована ДНК-полимераза, которая также обладает обратнотранскриптазной активностью. Предпочтительным для настоящего изобретения является фермент, обладающий обратнотранскриптазной активностью при высокой температуре, такой

- 8 005577 как ДНК-полимераза бактерии рода Тйегтик (например, ДНК-полимераза Т(Н) и ДНК-полимераза термофильной бактерии рода ВасШик. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы термофильных бактерий рода ВасШик, такие как ДНК-полимераза В.к1 (ДНК-полимераза Вк1) и ДНК-полимераза В.са (ДНКполимераза Вса), хотя это не призвано ограничить настоящее изобретение. Например, для ДНКполимеразы Вса необязательно присутствие иона магния для реакции обратной транскрипции. Более того, она может синтезировать кДНК, подавляя при этом образование вторичной структуры РНК, служащей матрицей, в условиях высокой температуры. И встречающийся в нативных условиях, и вариантный фермент, обладающий обратнотранскриптазной активностью, может быть использован, лишь бы он проявлял такую активность.

При амплификации нуклеиновой кислоты в способе по настоящему изобретению представляющая интерес нуклеиновая кислота может быть более эффективно амплифицирована путём предварительной амплификации нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Например, когда амплифицируют нуклеотидную последовательность, присутствующую в геномной ДНК в следовых количествах, то ДНК-фрагмент, включающий интересующую нуклеотидную последовательность, сначала амплифицируют с помощью подходящего способа амплификации нуклеиновых кислот. Полученный таким образом амплифицированный ДНК-фрагмент затем используют в качестве матрицы для осуществления способа амплификации по настоящему изобретению. Стадия первой амплификации может быть осуществлена с помощью способа по настоящему изобретению. Как альтернатива, способ ТАЗ. способ 3ЗВ, способ ΝΛ3ΒΛ. способ ТМА, способ с репликазой 0(Е способ ПЦР, способ ЛЦР и способ 8ΌΑ может быть использован в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты, хотя могут быть использованы без какого-либо ограничения любые способы амплификации нуклеиновых кислот. Более того, специфическая нуклеотидная последовательность может быть добавлена со стороны 5'-конца праймера, предназначенного для использования на стадии амплификации. Когда фрагмент, амплифицированный с использованием такого праймера, используют в качестве матрицы, способ амплификации по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, имеющего конкретную нуклеотидную последовательность, добавленную к указанному выше праймеру. Другими словами, возможно осуществить стадию амплификации нуклеиновой кислоты в соответствии со способом по настоящему изобретению, на которой ПЦР-амплифицированный ДНК-фрагмент используют в качестве матрицы, с использованием общего химерного олигонуклеотидного праймера, независимо от нуклеотидной последовательности участка, предназначенного для амплификации. Это осуществляют путём сочетания способа по настоящему изобретению и ПЦР с использованием праймера, включающего конкретную нуклеотидную последовательность, добавленную со стороны 5'-конца в соответствии с описанным выше.

Обычно необходимо сконструировать пару праймеров, специфичных для интересующей нуклеотидной последовательности, с целью специфичной амплификации последовательности на первой стадии амплификации нуклеиновой кислоты. Однако, нуклеиновая кислота, служащая матрицей, может быть амплифицирована без использования праймера, специфичного для интересующей нуклеотидной последовательности, путём использования случайного праймера, который амплифицирует фрагменты нуклеиновой кислоты по неспецифичному типу, или использования пары праймеров, выбранных из набора уже имеющихся вырожденных праймеров. Число пар праймеров, необходимых для амплификации множества нуклеиновых кислот, служащих матрицами, может быть сокращено. Сокращение обеспечивают путём использования, например, метода ПЦР со случайным праймером, включающим последовательностьметку (№с1ею АсДбк Векеагсй, 1996, 24 [19], 3778-3783), или метода ПЦР с праймированием вырожденными праймерами (ВП-ПЦР: ОепотДск, 1992, 13, 718-725), в котором используется вырожденный праймер с последовательностью-меткой. Каждый из таких праймеров включает случайную последовательность или вырожденную последовательность на 3'-конце. Если способ амплификации по настоящему изобретению осуществляют с использованием в качестве матрицы нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью праймера, имеющего последовательность-метку, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием одного химерного олигонуклеотидного праймера. Такой химерный олигонуклеотидный праймер характеризуется нуклеотидной последовательностью, идентичной таковой у последовательности-метки. За счёт использования такого праймера все нуклеиновые кислоты, которые были амплифицированы с использованием праймера, имеющего такую же последовательность-метку, используют в качестве матриц. Следовательно, различные нуклеотидные последовательности могут быть получены при очень низкой стоимости и в больших количествах путём сочетания способа по настоящему изобретению со способом амплификации нуклеиновых кислот, в котором используют случайный праймер или вырожденный праймер.

Любая ДНК-полимераза, которая синтезирует цепь ДНК бе ηονο с использованием цепи ДНК в качестве матрицы, может быть использована в способе амплификации нуклеиновой кислоты. Такими ДНКполимеразами являются ДНК-полимеразы ро1 1-типа (например, ДНК-полимераза I Е.сой, фрагмент Клёнова и ДНК-полимераза Тад), ДНК-полимеразы α-типа (например, ДНК-полимераза Ругососсик Шгюкик, ДНК-полимераза ΥΕΝΓ, ДНК-полимераза ΚΘΌ и ДНК-полимераза ΌΕΕΡ УЕЭТ) и ДНК-полимеразы, не относящиеся к α- или ро11-типам (например, ДНК-полимераза, описанная в международной патентной

- 9 005577 заявке АО 97/24444). Кроме того, предпочтительно может быть использована смесь по крайней мере двух ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимераза ТаКаКа Ех Тад (Такага δΐιιιζο) или ДНК-полимераза КОЭ-бакк (ТоуоЬо). Более того, предпочтительно могут быть использованы ДНК-полимеразы, такие как ДНК-полимераза В.са, ДНК-полимераза В.51. варианты этих ДНК-полимераз, лишённые своей 5'^3'экзонуклеазной активности, ДНК-полимераза 9°Ν, ДНК-полимераза Р£и (экзо-) (81та1адепе), ДНКполимераза Т111 (ТоуоЬо) и ДНК-полимераза ТД (Рготеда).

Если линейный фрагмент ДНК (например, ПЦР-амплифицированный фрагмент) используют в способе амплификации по настоящему изобретению в качестве матрицы, то включение последовательности, сконструированной в качестве спейсерного участка, может повышать эффективность амплификации. Спейсерный участок расположен между З'-концом линейного ДНК-фрагмента, являющегося матрицей, и сайтом отжига на 5'-конце праймера, использованного в способе по настоящему изобретению. Например, предпочтительным является конструирование праймера для способа амплификации по настоящему изобретению таким образом, чтобы длина спейсерного участка составляла без какого-либо ограничения от 1 до примерно 70 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 5 до примерно 60 нуклеотидов. Предпочтительное число нуклеотидов в спейсерном участке может варьировать в зависимости от последовательности праймера, предназначенного для способа амплификации по настоящему изобретению. Оптимальный спейсерный участок может быть определён в соответствии с описанным в примерах настоящей заявки. Фрагмент, предварительно амплифицированный с помощью, например, ПЦР, таким образом, что спейсерный участок добавлен с 3'-стороны к участку отжига амплификационного праймера по настоящему изобретению, может быть использован в качестве матрицы в способе амплификации по настоящему изобретению. В одном варианте нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, амплифицируют заранее с использованием праймера. Такой праймер в ориентации 5'^3' имеет сегмент спейсерного участка, сегмент амплификационного праймера по настоящему изобретению и сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты. Амплифицированный таким образом фрагмент может быть затем использован в качестве матрицы в способе амплификации по настоящему изобретению. Сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты может являться любым сегментом праймера для способа амплификации нуклеиновой кислоты, такого как метод ПЦР. Как альтернатива, сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты может являться сегментом другого амплификационного праймера по настоящему изобретению.

И двухцепочечная ДНК, такая как выделенная геномная ДНК или ПЦР-фрагмент, и одноцепочечная ДНК, такая как кДНК, полученная в реакции обратной транскрипции на материале тотальной РНК, или мРНК могут быть предпочтительно использованы в качестве ДНК-матрицы в настоящем изобретении. Предпочтительно двухцепочечную ДНК используют после её денатурации на одноцепочечные ДНК.

Стадия денатурации может быть исключена из способа амплификации по настоящему изобретению, если в качестве матрицы используют линейную двухцепочечную ДНК, такую как ПЦРамплифицированный продукт. Исключение может быть осуществлено размещением сайта отжига праймера по настоящему изобретению примерно на 50 нуклеотидах внутрь от конца ДНК. Если должна быть амплифицирована нуклеиновая кислота, характеризующаяся последовательностью РНК, то реакция обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы и реакция амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции, могут быть осуществлены с одной ДНК-полимеразой в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению. Такая ДНК-полимераза обладает обратнотранскриптазной активностью и активностью по вытеснению цепи.

Подходящей длиной матрицы является такая длина, которая обеспечивает достаточное связывание праймерной последовательности вследствие присутствия полной последовательности-мишени или по крайней мере достаточной части последовательности-мишени в составе фрагмента.

Если ДНК, служащая матрицей, является двухцепочечной ДНК, то такую ДНК денатурируют на одноцепочечные ДНК, чтобы обеспечить связывание праймера с цепью ДНК, служащей матрицей, в способе по настоящему изобретению. Предпочтительным для денатурации является выдерживание двухцепочечной ДНК при температуре, при которой она денатурируется (например, при примерно 95°С). Другими подходами являются такие, при которых используют повышение рН. В этом случае величина рН должна быть снижена с целью обеспечения связывания олигонуклеотидного праймера с мишенью в реакции амплификации. Нуклеотидная последовательность последовательно амплифицируется в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК (одноцепочечной ДНК) в реакции обратной транскрипции.

«Последовательно» означает то, что реакция проходит без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Понятие «изотермические» указывает на условия по существу постоянной температуры, при которой фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии.

- 10 005577

Не ограничиваясь какой-либо теорией, предусматривается, что следующие стадии последовательно и повторяющимся образом протекают параллельно (например, в изотермических условиях) в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению:

[1] стадия отжига ДНК, служащей матрицей, по крайней мере на один олигонуклеотидный праймер;

[2] стадия осуществления реакции достройки ДНК, которая комплементарна ДНК-матрице, от 3'конца праймера;

[3] стадия отщепления цепи ДНК, достроенной на стадии [2], действием эндонуклеазы;

[4] стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца сайта отщепления стадии [3], притом, что высвобождение цепи ДНК, достроенной на стадии [2], происходит без отделения от ДНК, служащей матрицей; и [5] стадия повтора стадии [3] и стадии [4] с использованием двухцепочечного полинуклеотида, полученного на стадии [4].

Упоминавшаяся выше реакция может быть проведена при нормальной температуре (например, 37°С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Клёнова. Она также может быть проведена при высокой температуре (например, 50°С или выше, или 60°С или выше) с использованием термостабильного фермента (эндонуклеазы и ДНК-полимеразы). В этом случае неспецифический отжиг праймера подавлен, в результате чего повышается специфичность амплификации ДНК. Более того, решается проблема формирования вторичной структуры ДНК, являющейся матрицей, результатом чего является повышение способности к достройке у ДНК-полимеразы. В одном варианте реакция обратной транскрипции и амплификация нуклеотидной последовательности могут быть проведены последовательно в данном способе. В этом случае ДНК, имеющая последовательность, производную от РНК, может быть амплифицирована путём объединённого использования обратной транскриптазы с упомянутой выше реакцией или путём использования ДНК-полимеразы, обладающей обратнотранскриптазной активностью.

Таким образом, амплификация нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться способом, включающим следующие стадии:

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Также амплификация нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться способом, включающим следующие стадии:

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

При амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух химерных праймеров способ характеризуется следующими стадиями:

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка

- 11 005577 двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (Г) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

В рамках настоящего изобретения также предусмотрена амплификация нукелотидной последовательности способом, характеризующимся следующими стадиями:

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Амплификация может осуществляться и способом, включающим следующие стадии:

(a) обработка нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройка нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

При использовании по крайней мере двух праймеров способ амплификации нуклеотидной последовательности предполагает следующие стадии:

(c) достройка нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработка высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последова- 12 005577 тельности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройка нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

Настоящее изобретение также предусматривает амплификацию нуклеотидной последовательности способом, характеризующимся следующими стадиями:

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Амплификация нуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением также может осуществляться способом, включающим:

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

В том случае, когда амплификацию нуклеотидной последовательности ведут с использованием по крайней мере двух праймеров, способ характеризуется тем, что он включает:

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

- 1З 005577

Настоящим изобретением предусматривается способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием в качестве матрицы как собственно одноцепочечной ДНК, так и одноцепочечной

ДНК, полученной после стадии предварительной денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные

ДНК.

Амплификация нуклеотидной последовательности может проводиться с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной после стадии синтеза одноцепочечной кДНК в реакции обратной транскрипции, используя РНК в качестве матрицы.

В данном тексте выражение «регенерированная достроенная с праймера цепь» обозначает цепь ДНК, комплементарную нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, которая достроена от олигонуклеотидного праймера, заново используемого для удвоения, являющегося результатом вытеснения цепи.

Термин «повторное использование» обозначает то, что двухцепочечную ДНК, составленную нуклеотидной последовательностью матрицы и регенерированной достроенной с праймера цепью, используют снова на стадии вытеснения цепи.

При осуществлении упоминавшихся выше способов амплификации химерный олигонуклеотидный праймер, который комплементарен одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, сначала отжигают на ДНК. ДНК, которая комплементарна ДНК-матрице (достроенная с праймера цепь), затем достраивают вдоль оставшейся последовательности ДНК-матрицы, начиная от 3'-конца праймера, за счёт действия ДНК-полимеразы с целью синтеза двухцепочечной ДНК. Эндонуклеаза действует на двухцепочечную ДНК, расщепляя её по сайту со стороны З'-конца рибонуклеотидной части химерного олигонуклеотидного праймера. Эндонуклеаза не расщепляет ДНК по другим сайтам. Таким образом, эндонуклеаза действует как ник-вносящий фермент, который вносит ник («одноцепочечный разрыв») в двухцепочечную ДНК. Эндонуклеаза способна изменять структуру двухцепочечной ДНК, составленной химерным олигонуклеотидным праймером и ДНК, служащей матрицей, хотя настоящее изобретение не ограничено какой-либо теорией. ДНК-полимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи, повторно достраивает цепь ДНК от З'-конца ника, внесённого в двухцепочечную ДНК, в результате чего образуется новая достроенная с праймера цепь, приводя к высвобождению ДНК вниз от З'-конца ника. Следовательно, новая достроенная с праймера цепь замещает ранее синтезированную достроенную с праймера цепь.

Амплификация нуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлена с использованием двух праймеров, а именно химерного олигонуклеотидного праймера, который комплементарен нуклеиновой кислоте, являющейся матрицей, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, который комплементарен вытесненной цепи. В этом случае один праймер связывается с цепью ДНК, являющейся матрицей, инициируя реакцию вытеснения цепи, в то время как другой праймер связывается со вытесненной цепью, высвобожденной в результате реакции вытеснения цепи, инициируя следующую реакцию вытеснения цепи. Ясно, что продукт реакции, проводимой с одним праймером, может служить матрицей для другого праймера в случае использования данного аспекта изобретения. Таким образом, количество продукта амплификации возрастает в нелинейной зависимости по мере возрастания количества матрицы.

В случае, когда амплификацию нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, химерный олигонуклеотидный праймер, четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата (άΝΤΡδ), ДНК-полимеразу и эндонуклеазу добавляют в реакционную смесь перед денатурацией двухцепочечной ДНК или после неё. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют нагревание и при этом не используют теплоустойчивый фермент, то предпочтительно добавлять фермент после проведения денатурации.

Как было описано выше в (2), эндонуклеаза для использования в способе должна быть выбрана таким образом, чтобы она отщепляла цепь по рибонуклеотидному сайту праймера. Предпочтительно цепь отщепляют по З'-сайту рибонуклеотида. Необходимо выбрать ДНК-полимеразу так, чтобы она с подходящей скоростью диссоциировала цепь ДНК, в которую был внесён ник.

ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достроенную цепь от сайта ника в направлении 3', тем самым вытесняя ранее достроенную цепь ДНК. Важно, чтобы ДНК-полимераза не проявляла экзонуклеазной активности 5'^3', которая могла бы разрушить вытесненную цепь. Например, фрагмент Клёнова, который представляет собой дефицитный по экзонуклеазной активности вариант ДНК-полимеразы I Е.сой, сходный фрагмент, происходящий от ДНК-полимеразы В§1 (Νονν Еид1аиб Вю1аЬ§), и ДНК-полимераза Вса ВЕ8Т от В.са (Такага 81ιιιζο) применимы в качестве такой ДНК-полимеразы. Также могут быть использованы 8ес.|иепа5е 1.0 и 8ес.|иепа5е 2.0 (Ипйеб 81а1е§ Вюсйеш1са1), а также ДНК-полимераза фага Т5 и ДНК-полимераза фага φ29 в соответствии с описанным в Сепе, 97, 13-19 (1991). Полимераза, которая в норме обладает экзонуклеазной активностью, может быть использована в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению, если включение подходящего ингибитора сможет подавить такую активность.

Амплификация нуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлена при различной температуре или она может быть осуществлена в изотермических

- 14 005577 условиях. Варьирование температур означает, что температура реакции изменяется на соответствующих стадиях таким образом, что такое изменение не препятствует реакциям на этих стадиях. В частности, варьирующиеся температуры указывают на изменение до такой температуры, которая подходит, например, для каждого этапа отжига праймера, реакции синтеза комплементарной цепи, внесения ника в комплементарную цепь и реакции вытеснения цепи.

С другой стороны, изотермия означает, что температура реакции на каждой из стадий остаётся неизменной, и каждую стадию осуществляют по существу при постоянной температуре. В обоих случаях естествен выбор такой температуры, которая является оптимальной для условий проведения реакции.

Одним из свойств способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению является то, что способ не требует повышающей и понижающей корректировки температуры в ходе синтеза нуклеиновой кислоты. Следовательно, настоящее изобретение представляет способ изотермического синтеза нуклеотидной последовательности. Многие из стандартных способов амплификации нуклеиновых кислот требуют повышающей и понижающей корректировки температуры с целью диссоциации мишени от синтезированной цепи. В этих способах для решения такой задачи необходимо специальное оборудование, такое как амплификатор («гермоциклер»). Однако способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием только такого оборудования, которое поддерживает постоянную температуру.

Как было описано выше, способ по настоящему изобретению может быть осуществлён при одной и той же температуре. Предпочтительно его осуществляют путём выбора температуры реакции и степени жёсткости таким образом, чтобы неспецифический отжиг праймера был снижен, и таким образом, чтобы праймер специфически соединялся с нуклеотидной последовательностью, служащей матрицей. Хотя это и не призвано в чём-либо ограничить настоящее изобретение, способ по настоящему изобретению может быть осуществлён при условиях высокой температуры с использованием термоустойчивого фермента в соответствии с описанным выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ по настоящему изобретению при температуре, подходящей для сохранения достаточной активности используемого фермента с целью поддержания эффективности реакции на высоком уровне. Так, температура реакции предпочтительно составляет примерно от 20°С до примерно 80°С, более предпочтительно от примерно 30°С до примерно 75°С, наиболее предпочтительно от примерно 50°С до примерно 70°С, хотя это варьируется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию осуществляют при условиях высокой температуры, в частности, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем тот, который используется в реакции при нормальной температуре. Последовательность и длина праймера, подходящие для температуры реакции, можно определить, например, с учётом величины Тт. Как альтернатива, для конструирования праймера можно использовать имеющиеся в продаже программные продукты, такие как программа ОЬЮО™ Рптет Лпа1у818 (Такага δΐιι,ιζο). Например, когда используют температуру реакции от 55°С до 60°С или 65°С, то праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, может, например, иметь без какого-либо ограничения иметь длину 12-100 нуклеотидов, предпочтительно 14-50 нуклеотидов в длину, более предпочтительно 15-40 нуклеотидов в длину. Примером эффекта, обусловливаемого повышением температуры реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры у ДНК, служащей матрицей. Повышенная температура реакции обеспечивает амплификацию желательной нуклеиновой кислоты, даже если в качестве матрицы используется нуклеиновая кислота с высоким содержанием пары СС. Более того, это в одинаковой степени эффективно при амплификации длинноцепочечного участка. Такой эффект наблюдается в диапазоне от примерно 100 п.н. до примерно 20 т.п.н., в частности от примерно 200 п.н. до примерно 4,3 т.п.н., более конкретно от примерно 250 п.н. до примерно 1500 п.н.

Использование ДНК-полимеразы, обладающей обратнотранскриптазной активностью (например, ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т), в способе по настоящему изобретению делает осуществимой стандартным образом амплификацию нуклеотидной последовательности на материале РНК, которая включает стадию получения кДНК на матрице РНК (в реакции обратной транскрипции). Как альтернатива, продукт, полученный на независимо проведённой стадии получения кДНК на матрице РНК, т.е. кДНК, может быть использован в способе по настоящему изобретению в качестве ДНК, служащей матрицей.

В каждом случае реакцию в способе по настоящему изобретению повторяют до тех пор, как её останавливают подходящим путём, например, с помощью инактивации фермента или снижения температуры реакции, или до тех пор, как в реакции не закончится один из реагентов.

На фиг. 1 показан один вариант, в котором используют одноцепочечную ДНК в качестве матрицы и два праймера. Соответствующие стадии, которые проводят последовательно, описаны далее:

(1) стадия отжига одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, на химерный олигонуклеотидный праймер;

(2) стадия осуществления реакции достройки ДНК от З'-конца праймера с образованием достроенной с праймера цепи;

(3) стадия отщепления эндонуклеазой по сайту праймера, который включает рибонуклеотид;

(4) стадия осуществления вытеснения цепи с использованием ДНК-полимеразы от сайта отщепления стадии (3);

- 15 005577 (5) стадия повторного использования двухцепочечной ДНК, которая составлена матрицей, полученной на стадии (4), и регенерированной достроенной с праймера цепью стадии (З), с последующим использованием высвобожденной вытесненной цепи в реакции на стадии (6) и последующих стадиях;

(6) стадия отжига олигонуклеотидного праймера, который отличается от праймера стадии (1), на высвобожденную вытесненную цепь стадии (5), служащую матрицей;

(7) стадия осуществления реакции достройки ДНК от З'-конца праймера с образованием достроенной с праймера цепи;

(8) стадия отщепления эндонуклеазой по сайту праймера, который включает рибонуклеотид;

(9) стадия осуществления вытеснения цепи с использованием ДНК-полимеразы от сайта отщепления стадии (8); и (10) стадия повторного использования матрицы, полученной на стадии (9), и регенерированной достроенной с праймера цепи стадии (8).

В случае, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК, каждая из одноцепочечных ДНК, полученных после денатурации двухцепочечной ДНК, служит матрицей для стадии (1). Следовательно, количество продукта амплификации больше, чем то количество, которое получают при использовании в качестве матрицы одноцепочечной ДНК. Кроме того, выявление продукта амплификации может быть осуществлено за более короткое время по сравнению с тем временем, которое требуется при использовании в качестве матрицы одноцепочечной ДНК.

Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть использован в различных экспериментальных процедурах, в которых используется амплификация нуклеотидной последовательности, включая выявление, мечение и секвенирование нуклеиновых кислот.

Более того, способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть использован в способе амплификации нуклеиновой кислоты ίη δίΐιι. в способе амплификации нуклеиновой кислоты на твёрдом субстрате, таком как ДНК-чип, или в способе множественной амплификации нуклеиновых кислот, в котором одновременно амплифицируется значительное число сегментов.

Одним из свойств способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению является способность получать в нём одноцепочечную ДНК.

Для данной цели в способе можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера. Например, если используются два олигонуклеотидных праймера, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлён с применением отношения праймеров в соответствии с использованием т.н. способа «асимметричной ПЦР», в котором реакцию амплификации проводят с использованием избыточного количества одного олигонуклеотидного праймера по отношению ко второму. В результате количество продукта, вытесненного с одной цепи, становится выше по сравнению с продуктом другой цепи.

В соответствии со способом амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть получена одноцепочечная ДНК, по существу свободная от цепи, которая ей комплементарна. Например, одноцепочечная ДНК для получения продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, такого как ДНК-чип, одноцепочечный ДНК-зонд для выявления нуклеиновой кислоты-мишени или мегапраймер для метода ПЦР длинных цепей могут быть легко получены за короткое время. Избирательным образом только смысловая последовательность или антисмысловая последовательность могут быть амплифицированы с использованием способа по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение применимо в качестве способа получения нуклеиновой кислоты, имеющей смысловую последовательность или антисмысловую последовательность.

Более того, способы амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению не требуют использования оборудования для реакции, которое может корректировать температуру в зависимости от времени. Следовательно, реакцию амплификации можно проводить в большом объёме реакционной смеси. Это значит, что нуклеиновая кислота (например, для медицинского применения) может быть получена в больших количествах на промышленном уровне.

Эффективность использования праймера, используемого в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем в стандартном способе, таком как метод ПЦР.

Поскольку ДНК-фрагмент, амплифицированный в настоящем изобретении, составлен нормальными нуклеотидами, то амплифицированная ДНК может быть субклонирована в состав подходящего вектора с использованием рестрикционного сайта в составе ДНК. Более того, ДНК без каких-либо проблем может быть обработана рестриктазой, например, с целью выявления ПДРФ. Следовательно, ДНК может быть широко использована в области генетического тестирования. Поскольку фрагмент ДНК, амплифицированный в настоящем изобретении, составлен нормальными нуклеотидами, то промоторная последовательность для РНК-полимеразы может быть встроена в состав амплифицированного фрагмента. Амплифицированный фрагмент может быть использован в качестве матрицы для синтеза РНК, которую можно использовать в качестве, например, зонда. Понятно, что флуоресцентномеченный ДНК-зонд может быть

- 16 005577 получен путём осуществления способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с использованием флуоресцентномеченного 6ΝΤΡ вместо нормального 6ΝΤΡ.

Поскольку фрагмент, в конечном счёте амплифицированный в способе по настоящему изобретению, не имеет нуклеотидной последовательности, комплементарной праймеру для амплификации по обоим его концам, то может быть снижено загрязнение из-за переноса амплификационного продукта. Следовательно, способ по настоящему изобретению применим в генетическом тестировании и подобном, где такой же участок амплифицируется стандартным образом.

В том случае, когда для повышения эффективности амплификации очень малых количеств нуклеиновой кислоты используется предварительная амплификация с помощью описанных выше способов, предусмотренных настоящим изобретением, или способов ТЛ8, З8К, ΝΑΞΕΑ, ТМА, способа с репликазой 0β, способов ПЦР, ЛЦР, 8ΌΑ или любого другого способа, амплификация нуклеотидной последовательности будет включать следующие стадии:

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и (c) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Также предусматривается амплификация нуклеотидной последовательности способом, включающим:

(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), по крайней мере одним праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (б) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

При амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров способ включает:

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(б) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (с);

(е) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (а), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (Ь), и

- 17 005577

ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (Ь), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на З'-конце или со стороны З'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(Г) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (д) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от З'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Г), отщепляют с целью вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Г).

На стадии предварительной амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать случайный праймер или вырожденный праймер. Например, предпочтительно может быть использован праймер, имеющий, без какого-либо ограничения, случайную последовательность или вырожденную последовательность на самом З'-конце или со стороны З'-конца.

Свойства способов амплификации нуклеотидной последовательности, предусмотренных настоящим изобретением, суммированы ниже.

1. Он способен амплифицировать большое количество нуклеиновой кислоты из малого количества матрицы. При использовании двух праймеров количество амплифицированного продукта возрастает в квадратичной зависимости.

2. Он может быть проведён в изотермических условиях. В этом случае для него не требуется использование такого оборудования, как амплификатор. Следовательно, объём реакции может быть легко промасштабирован в сторону увеличения.

3. Обычно реакцию амплификации осуществляют с использованием одного или двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух ферментов (ДНК-полимеразы и эндонуклеазы).

4. Поскольку несколько цепей ДНК синтезируется с одной молекулы праймера, то количество праймера не ограничивает количество амплификационного продукта. Более того, эффективность использования праймера равна примерно 100%, что намного выше, чем в методе ПЦР.

5. Исходя из конкретной цели избирательным образом может быть амплифицирована одноцепочечная или двухцепочечная ДНК.

6. Поскольку нет необходимости в использовании аналога 6ΝΤΡ. такого как (α-δ)-άΝΤΡ, для реакции амплификации, то стоимость реагентов низка. Более того, может быть получена нуклеиновая кислота в нативной форме, т.е. без аналога 6ΝΤΡ в составе.

7. Он может предоставить амплифицированный фрагмент ДНК при низкой себестоимости и в больших количествах путём сочетания способа по настоящему изобретению с другим способом амплификации нуклеиновых кислот.

(6) Выявление нуклеотидной последовательности.

Нуклеиновая кислота-мишень в образце может быть выявлена с использованием способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Способ выявления включает:

(A) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени с помощью описанных выше способов амплификации нуклеотидной последовательности; и (B) выявление нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на предыдущей стадии.

Способ может быть использован для выявления или количественной оценки конкретного гена в образце. Другими словами, конкретный ген может быть выявлен или количественно оценен во всех образцах, в которых предполагается присутствие нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых конкретный ген может быть выявлен или количественно оценен, являются, тем самым не ограничиваясь, образцы из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитарная плёнка, моча, фекалии, спинно-мозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или лимфатический узел) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, которые содержат нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, грибок, дрожжи, растение и животное, образцы, которые, как предполагается, загрязнены или инфицированы микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологический препарат), и образцы, которые могут содержать организм, такие как почва или сточные воды. Например, вироид, вирус, грибок, бактерия или другой микроорганизм в образце могут быть выявлены или количественно оценены на основании присутствия или содержания конкретного гена, являющегося мишенью, происходящего от вироида, вируса, грибка, бактерии или других микроорганизмов. Более того, способ по настоящему изобретению может быть использован для определения генотипа организма или для определения уровня экспрессии гена. Предпочтительно в способе выявления и РНК, и ДНК могут быть использованы в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей.

- 18 005577

Известные способы выявления нуклеиновой кислоты могут быть использованы на стадии (В). Примерами таких способов являются выявление продукта реакции, имеющего конкретный размер, с помощью электрофореза и выявление с помощью гибридизации с зондом. Флуоресцентное вещество, такое как бромистый этидий, используют для выявления с помощью электрофореза. Гибридизация с зондом может быть объединена с электрофоретическим выявлением. Зонд может быть помечен радиоактивным изотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование меченного нуклеотида на стадии (А) может облегчить выявление продукта амплификации. Для выявления можно использовать метод флуоресцентной поляризации, метод переноса энергии флуоресценции или подобное. Нуклеиновая кислота-мишень может быть выявлена автоматически или количественно оценена с помощью создания подходящей системы выявления.

Рибонуклеотидный (РНК) зонд, меченный двумя или несколькими флуоресцентными веществами, расположенными на расстоянии, обеспечивающем эффект гашения флуоресценции, могут быть использованы в способе выявления по настоящему изобретению. Зонд не флуоресцирует. Когда проводят его отжиг на ДНК, амплифицированную с нуклеиновой кислоты-мишени, которая комплементарна зонду, РНКаза-Н расщепляет зонд. В результате расстояние между флуоресцирующими веществами в зонде увеличивается, что приводит к флуоресценции. Следовательно, флуоресценция указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени. Если РНКаза-Н используется в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, то нуклеиновая кислота-мишень может быть выявлена только при добавлении зонда в реакционную смесь. Например, сочетание флуоресцентных веществ -6карбоксифлуоресцеина (6-ЕАМ) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-б-карбоксиродамина (ТАМКА) - может быть предпочтительно использовано для мечения зонда.

Способ амплификации нуклеотидной последовательности в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует использования такого оборудования как амплификатор. Число праймеров, используемых в способе амплификации по настоящему изобретению, может составлять один или два, что меньше того, что используется в стандартном способе. Поскольку такие реагенты, как бКГРк, используемые в ПЦР и подобных методах, могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, то расходы могут быть снижены по сравнению со стандартным способом. Следовательно, способ по настоящему изобретению предпочтительно может быть использован в области, включающей генетическое тестирование, в котором проводят рутинное выявление. Способ по настоящему изобретению предоставляет большее количество амплифицированного продукта за более короткое время по сравнению с методом ПЦР. Следовательно, способ по настоящему изобретению может быть использован в качестве удобного, быстрого и чувствительного способа выявления гена.

(7) Продукт по настоящему изобретению, имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоты, размещённую в определенном порядке в заданном участке, и способ его получения.

ДНК-чип (также называемый микроматрицей ДНК или матрицей ДНК) является продуктом, несущим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором различные фрагменты генов или ДНК размещены в определенном порядке и иммобилизованы в заданном участке или в заранее определённых положениях на твёрдом субстрате, таком как предметное стекло. ДНК-чип используют для анализа присутствия нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновых кислот, характеризущейся последовательностью, которая комплементарна размещённой и иммобилизованной ДНК на заданном участке ДНК-чипа. Анализ проводят путём контактирования ДНК-чипа с образцом нуклеиновых кислот, приготовленным для гибридизации на материале образца, предпочтительно образца помеченных нуклеиновых кислот. Поскольку ДНК-чип может быть использован для выявления или количественного анализа ряда нуклеиновых кислот в образце в одной процедуре, то он является весьма эффективным средством, которое в значительной степени ускоряет анализ экспрессии генов или анализ мутаций или полиморфизма. ДНК-чип, на котором в заданном участке размещена в определенном порядке и иммобилизована двухцепочечная ДНК, используют для гибридизации после того, как его подвергают соответствующей денатурации. ДНК-чип, на котором в заданном участке размещена в определенном порядке и иммобилизована одноцепочечная ДНК, комплементарная нуклеиновой кислоте-мишени, которую предстоит выявить, является конкретно предпочтительным для выявления нуклеиновой кислоты-мишени.

Как было описано выше, желательная ДНК может быть амплифицирована в одноцепочечной форме с помощью способа по настоящему изобретению. Хотя может быть использован любой способ очистки продукта амплификации, предпочтительной является очистка с помощью преципитации изопропанолом. Полученную таким путём ДНК, предпочтительно одноцепочечную ДНК, которая по существу свободна от комплементарной ей цепи, предпочтительно можно использовать в качестве ДНК-фрагмента, который необходимо иммобилизовать на ДНК-чип. Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно используется в качестве способа получения ДНК, предназначенной для размещения в определенном порядке и иммобилизации в заданном участке с целью конструирования ДНК-чипа. Любой нерастворимый субстрат можно использовать в качестве субстрата, на котором полученную таким путём ДНК размещают в определенном порядке и иммобилизуют в заданном участке, но предпочтительно используют имеющий плоскую поверхность субстрат, изготовленный из стекла или пластмассы, и субстрат в форме мембраны, изготавленный из нитроцеллюлозы или нейлона. Известный способ иммобилизации

- 19 005577 нуклеиновых кислот можно использовать для иммобилизации. ДНК может быть иммобилизована на субстрат так, как она есть. Как альтернатива, ДНК может быть иммобилизована с помощью подходящего линкера или после лигирования нескольких молекул ДНК.

Нуклеиновая кислота-мишень, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой на продукте, имеющим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором ДНК, амплифицированная с помощью способа по настоящему изобретению, размещена в определенном порядке и иммобилизована в заданном участке (например, ДНК-чип), может быть выявлена или оценена количественно. Такие выявление или количественная оценка могут быть осуществлены путём контактирования с целью гибридизации продукта с образцом нуклеиновых кислот, приготовленным на материале образца, для которого предполагается присутствие нуклеиновой кислоты. В связи с этим ДНК-чип, на котором одноцепочечная ДНК, амплифицированная с помощью способа по настоящему изобретению, размещена в определенном порядке и иммобилизована в заданном участке, обеспечивает выявление нуклеиновой кислоты-мишени с большим удобством процедуры, более высокой чувствительностью и более высокой воспроизводимостью данных по сравнению со стандартным продуктом.

(8) Получение нуклеиновой кислоты в больших количествах.

В соответствии с описанным выше настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации нуклеотидной последовательности, который может быть осуществлён в изотермических условиях. Желательная нуклеиновая кислота может быть получена с помощью данного способа путём смешивания нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, которая должна быть амплифицирована, с различными компонентами, необходимыми для реакции, и проведения реакции в смеси при изотермических условиях. Поскольку метод ПЦР требует изменения температуры реакционной смеси в зависимости от времени, то объём реакции ограничен таким объёмом, в котором можно контролировать температуру (обычно 200 мкл или меньше). Следовательно, трудно промасштабировать объём в сторону увеличения. С другой стороны, такого ограничения не существует в способе по настоящему изобретению. Большое количество нуклеиновой кислоты может быть получено путём увеличения объёма реакционной смеси. В способе по настоящему изобретению ряд молекул комплементарной цепи синтезируют с одной молекулы-матрицы. Более того, нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием таких молекул комплементарных цепей, взятых в качестве матриц. Следовательно, желательная нуклеиновая кислота может быть эффективно выработана в больших количествах путём соответствующего подбора матрицы и праймера. Помимо того, тот факт, что, в отличие от метода ПЦР, способ по настоящему изобретению не требует специального оборудования или сложного цикла изменений температуры, делает такой способ преимущественным с точки зрения стоимости оборудования и затрат энергии. Следовательно, способ является прекрасным промышленным способом получения нуклеиновой кислоты в больших количествах.

Более того, способ по настоящему изобретению применим в качестве способа предоставления ряда ДНК-фрагментов в больших количествах, таких как количества, необходимые для иммобилизации на ДНК-чип. В частности, фрагменты ДНК могут быть получены в больших количествах в простых стадиях реакций одного варианта. В другом варианте ограниченное число праймеров может быть использовано для получения ряда фрагментов ДНК. Стадия предварительной амплификации нуклеиновой кислоты, которая служит матрицей в способе по настоящему изобретению, с помощью известного способа амплификации нуклеиновых кислот, такого как метод ПЦР, может быть включена в последний вариант. Все типы нуклеиновых кислот, являющихся матрицами, могут быть амплифицированы с использованием ограниченного числа праймеров, например, основываясь на способе амплификации нуклеиновых кислоты с использованием случайного праймера, включающего последовательность-метку (М.1с1с1с Ле1Й8 Рекеатсй, 1996, 24 (19), 3778-3783), или на способе олигонуклеотид-праймируемой ПЦР (ΌΘΡ-ПЦР: СеПО1ШС5. 1992, 13, 718-725), в котором используют вырожденный праймер. Способ амплификации по настоящему изобретению может быть осуществлён с использованием одного или нескольких праймеров для всех нуклеиновых кислот, служащих матрицами, полученных на упомянутой выше стадии. Это можно осуществить путём конструирования праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, таким образом, чтобы он соответствовал последовательности-метке, добавляемой к случайному или вырожденному праймеру. Следовательно, сочетание подходящей стадии получения нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, и способа по настоящему изобретению может предоставить ряд фрагментов ДНК в больших количествах при меньшей стоимости по сравнению со стандартным способом.

Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать двухцепочечную ДНК для экспрессии полезного полипептида в клетке или одноцепочечную антисмысловую ДНК для подавления экспрессии интересующего гена. Такую нуклеиновую кислоту вводят в организм с использованием подходящего средства, например, носителя для переноса гена, такого как липосома. Способ получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению является предпочтительным для получения в больших количествах одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, предназначенной для медицинского применения. Кроме того, нуклеиновая кислота, включающая аналог άΝΤΡ, который, например, подавляет разрушение нуклеиновой кислоты ίη νίνο, может быть легко получена с

- 20 005577 помощью способа по настоящему изобретению. Способ по настоящему изобретению пригоден для получения нуклеиновой кислоты в промышленном масштабе.

Получение нуклеиновой кислоты в больших количествах может осуществляться способом, характеризующимся следующими стадиями:

Также получение нуклеиновой кислоты в больших количествах может осуществляться способом, который включает:

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

Кроме того, для получения нуклеиновой кислоты в больших количествах с использованием по крайней мере двух праймеров может использоваться способ, включающий:

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (Ь), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (Ь);

(б) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(е) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (б), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и (ί) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (е).

- 21 005577

Примеры

Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение более подробно, но не призваны ограничить его объем.

Референсный пример.

Величина единицы активности РНКазы-Н, использованной в способе по настоящему изобретению, была определена в соответствии со следующим способом.

(1) Приготовление использованных растворов реагентов.

Реакционная смесь для определения активности. Следующие вещества при указанных конечных концентрациях содержались в стерильной воде: 40 мМ Трис-гидрохлорида (рН=7,7 при 37°С), 4 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 0,003% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 4% глицерина и 24 мкМ поли-бТ.

Раствор поли[8-³Н]адениловой кислоты: Раствор 370 кБк поли[8-³Н]адениловой кислоты растворяли в 200 мкл стерильной воды.

Раствор полиадениловой кислоты: полиадениловую кислоту растворяли до концентрации 3 мМ в стерильной сверхчистой воде.

Раствор разведения фермента. Следующие вещества при указанных конечных концентрациях содержались в стерильной воде: 25 мМ Трис-гидрохлорида (рН=7,5 при 37°С), 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА (рН=7,5 при 37°С), 30 мМ хлорида натрия и 50% глицерина.

Приготовление денатурированной нагреванием ДНК вилочковой железы телёнка: 200 мг ДНК вилочковой железы телёнка суспендировали и переливали в 100 мл буфера ТЕ. Раствор разбавляли до концентрации 1 мг/мл стерильной сверхчистой водой, исходя из уровня поглощения, измеренного в УФ при 260 нм. Разведённый раствор нагревали до 100°С на 10 мин и затем быстро охлаждали на ледяной бане.

(2) Способ измерения активности.

мкл раствора поли[8-³Н]адениловой кислоты добавляли к 985 мкл реакционной смеси для определения активности, приготовленной в (1) выше. Смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин. 8 мкл полиадениловой кислоты добавляли к смеси до достижения конечной концентрации 24 мкМ. Далее смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. В результате было получено 1000 мкл реакционной смеси поли[8-³Н]гА-поли-бТ. Затем 200 мкл реакционной смеси инкубировали при 30°С в течение 5 мин. К полученному добавляли 1 мкл соответствующего серийного разведения фермента. В течение времени по 50 мкл каждого из образцов отбирали из реакционной смеси для использования в последующем измерении. Время в минутах после добавления фермента к образцу определяли как «Υ». 50 мкл реакционной смеси для общей величины СРМ или для «пустого» контроля приготавливали добавлением 1 мкл раствора разведённого фермента вместо раствора фермента. К образцу добавляли 100 мкл 100 мМ пирофосфата натрия, 50 мкл раствора денатурированной нагреванием ДНК вилочковой железы телёнка и 300 мкл 10%ной трихлоруксусной кислоты (300 мкл сверхчистой воды для измерения общего СРМ). Смесь инкубировали в течение 5 мин при 0°С и затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования 250 мкл полученной в результате надосадочной фракции помещали в ёмкость. К этому добавляли 10 мл Лс.|иако1-2 (ΝΕΝ ЫГе ЗсДепсе Ргобис(к). СРМ (имп/мин) определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика.

(3) Подсчёт единиц.

Величину единиц активности для каждого фермента подсчитывали в соответствии со следующим уравнением:

Ед./мл = {(измеренный СРМ - контрольный СРМ) х 1,2* х 20 х 1000 х уровень разведения} 200 (мкл) / (общий СРМ х Υ (минуты) х 50 (мкл) х 9**)

1,2* - количество наномолей поли[8-³Н]гА-поли-бТ, содержащихся в общих СРМ, в расчёте на 50 мкл,

9** - коэффициент корреляции.

Пример 1.

(1) Синтез ДНК-матрицы и праймеров.

Одноцепочечная ДНК из 99 нуклеотидов, являющаяся матрицей, и праймеры, используемые в данном примере, были синтезированы с использованием ДНК-синтезатора (АррНеб Вюкук1етк). Нуклеотидная последовательность одноцепочечной ДНК из 99 нуклеотидов показана в ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 1 списка последовательностей. Основные нуклеотидные последовательности прямого праймера и обратного праймера показаны в ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 2 и 3 списка последовательностей, соответственно. Структура праймеров, использованных в данном примере, описана далее подробно.

Пара праймеров 1: комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 2 или 3 списка последовательностей, и полностью состоящих из дезоксирибонуклеотидов;

пара праймеров 2: комбинация праймеров, в которых первый и второй дезоксрибонуклеотиды с 3'конца заменены рибонуклеотидами, а фосфатная связь со стороны 5'-конца второго с 3'-конца рибонуклеотида заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1;

- 22 005577 пара праймеров 3: комбинация праймеров, в которой дезоксирибонуклеотид на 3'-конце заменён рибонуклеотидом, а фосфатная связь со стороны 5'-конца рибонуклеотида заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1;

пара праймеров 4: комбинация праймеров, в которых первый и второй дезоксирибонуклеотиды с 3'конца заменены на рибонуклеотиды в каждом из праймеров в паре праймеров 1; и пара праймеров 5: комбинация праймеров, в которых третий и четвёртый дезоксирибонуклеотиды от З'-конца заменены на рибонуклеотиды, а фосфатная связь со стороны 5'-конца четвёртого рибонуклеотида З'-конца заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1.

(2) Реакция амплификации.

ДНК-полимеразу Вса ВЕ8Т (Такага 81ш/о), которая является ДНК-полимеразой, не имеющей экзонуклеазной 5'^3'-активности, от ВасШиз са1бо!епах, и клонированную рибонуклеазу-Н (Такага 81шхо), которая является РНКазой-Н Е.со11, использовали для анализа реакционных систем в моделях 1-7, описанных далее.

Реакционную смесь приготавливали следующим образом.

мМ Трис-гидрохлоридного буфера (рН=7,5), 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2,7% глицерина, 5% диметилсульфоксида, по 1,4 мМ каждого из бЫТРз, 10 мМ хлорида магния, 20 пкмоль одного или обоих праймеров из одной из пар праймеров в соответствии с описанным выше в (1), 0,6 нг синтетической одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, 5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. клонированной рибонуклеазы-Н при конечном объёме 50 мкл. Реакционную смесь смешивали до гомогенного состояния, инкубировали при 55°С в течение 60 мин и затем нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Ыи81еуе 3:1 (Такага 81шхо). Праймеры, использованные в соответствующих моделях, описаны далее. Модели 1-5: использовали одну из пар праймеров 1-5; модель 6: использовали только обратный праймер из пары праймеров 2; и модель 7: пару праймеров 4 использовали без добавления РНКазы-Н. В результате амплифицированные фрагменты, характеризующиеся размером в интересующем диапазоне от примерно 40 пар нуклеотидов (п.н.) до примерно 90 п.н., были получены тогда, когда использовали реакционную смесь моделей 2-5: это указывает на то, что при использовании этих схем реакции ДНК были амплифицированы. Амплифицированный фрагмент, который характеризовался ожидаемой длиной примерно 70 нуклеотидов (н.) (фрагмент одноцепочечной ДНК), был получен в модели 6, в которой использовали только один из двух праймеров. Не происходило амплификации ДНК при проведении реакций в моделях 1 или 7.

(3) Подтверждение продуктов амплификации.

Реакционную смесь, полученную с помощью реакции в модели 4 в соответствии с описанным в (2), отфильтровывали с использованием М1сгосоп-100 (Такага 81шхо) с выделением амплифицированного фрагмента ДНК, улавливаемого фильтром. Нуклеотидную последовательность данного фрагмента ДНК определяли с помощью метода (дизокси) Сэйнджера. В результате для фрагмента, амплифицированного с помощью указанной выше реакции, было подтверждено наличие ДНК, характеризующейся той же нуклеотидной последовательностью, как в ДНК, служащей матрицей.

(4) Анализ времени реакции.

Реакционную смесь модели 2 в соответствии с описанным выше в (2) приготавливали с целью анализа изменения количества амплифицированного продукта в случае, когда взаимодействие происходило в течение разного времени. Реакционную смесь инкубировали в течение 0, 15, 30, 60, 90 или 120 мин при 55°С. Затем смесь нагревали до 90°С в течение 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси анализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле М.18|еуе 3:1. Результаты электрофореза показаны на фиг. 2. Числа от 1 до 6 на фигуре представляют дорожки, которые соответствуют взаимодействию в реакционной смеси в течение 0, 15, 30, 60, 90 или 120 мин, соответственно. М обозначает дорожку, на которую внесён ступенчатый маркёр молекулярной массы ДНК 100 п.н. (Такага 8ки/о).

Как показано на фиг. 2, при времени реакции в 0 мин продукт амплификации не выявляется. Было подтверждено, что количество продукта амплификации увеличивалось со временем реакции, которое возрастало от 15 мин до 30 или 60 мин. Однако, количество продукта амплификации по данным электрофореза было практически неизменным при времени реакции 60 мин или больше: это указывает на то, что амплификация в использованной системе реакции примерно за 60 мин выходит на «плато»-фазу.

Пример 2.

(1) Приготовление РНК.

РНК, использованная в качестве матрицы в данном примере, была приготовлена из культивируемых клеток НТ29 человека (АТСС НТВ-38) (Оапнрроп Ркагшасеийса1) с использованием реагента ТР1хо1 (Ы£е ТесЬпо1од1ез). Концентрацию полученного в результате тотального пула РНК доводили до 1 мкг/мкл. Величина ΘΌ₂₆₀/ΘΌ₂₈₀ составила 1,8: это указывает на спектрофотометрическую чистоту РНК.

- 23 005577 (2) Реакция амплификации.

ДНК-полимеразу Вса ВЕ8Т, которая обладает активностью обратной транскриптазы и активностью

ДНК-полимеразы, а также эндонуклеазу РНКазу-Н использовали для определения того, амплифицировалась ли кДНК на матрице РНК.

Реакционную смесь, состав которой был описан в примере 2, приготавливали добавлением 1 мкг упомянутой выше тотальной РНК. Сегмент-мишень, кодирующий рецептор трансферрина человека (СепВапк: депозитарный № Х01060), амплифицировали с использованием в качестве праймеров пары праймеров 2 из примера 1.

Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин и затем нагревали до 90°С на 2 минуты с целью инактивации ферментов. Когда 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%ном агарозном геле М.18|еуе 3:1, был получен амплифицированный фрагмент, характеризующийся ожидаемым размером 56 п.н. Более того, Саузерн-блот-гибридизацию проводили с использованием зонда, соответствующего мишени нуклеотидной последовательности. ДНК-зонд, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0 4 списка последовательностей, помеченный биотином по 5'концу, использовали для проведения гибридизации по Саузерну. В результате этот зонд гибридизовал с упомянутым выше амплифицированным фрагментом: это подтверждает, что участок-мишень был безошибочно амплифицирован с помощью способа по настоящему изобретению.

Пример 3.

(1) Синтез праймеров.

Способ амплификации по настоящему изобретению был протестирован с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК. Использованные праймеры были синтезированы на ДНК-синтезаторе (АррНеб Вю5у51ет5). Основные нуклеотидные последовательности праймеров показаны в 8ЕЦ ΙΌ N0 513 списка последовательностей. Структура праймеров, использованных в данном примере, подробно описана далее. ДНК плазмиды рИС19 (Такага 81ито) использовали в качестве матрицы для пар праймеров А-Р. Нуклеотидная последовательность рИС19 доступна из базы данных (СепВапк: депозитарный № Ь09137). Амплифицированный фрагмент двухцепочечной ДНК использовали в качестве матрицы для пары праймеров С. Фрагмент был сформирован на материале тотального пула РНК человека, полученного в примере 2, с использованием праймеров, имеющих последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0 14 или 15 списка последовательностей, и набора реактивов ТаКаКа ΚΝΑ РСК К11 (АМУ), уегк. 2.1 (Такага 81ито) в соответствии с прилагающейся стандартной прописью.

Пара праймеров А (длина амплифицированного фрагмента примерно 450 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 5 или 6 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров В (длина амплифицированного фрагмента примерно 250 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 5 или 7 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров С (длина амплифицированного фрагмента примерно 520 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 5 или 8 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров Ό (длина амплифицированного фрагмента примерно 890 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 5 или 9 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров Е (длина амплифицированного фрагмента примерно 130 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 10 или 6 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров Р (длина амплифицированного фрагмента примерно 220 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 11 или 6 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров С (длина амплифицированного фрагмента примерно 320 п.н.):

комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0 12 или 13 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

(2) Реакция амплификации.

мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,5), 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% диметилсульфоксида, по 1,4 мМ каждого из бКГРк, 10 мМ хлорида магния, 60 пкмоль каждого праймера

- 24 005577 из одной из пар праймеров в соответствии с описанным выше в (1), 100 нг ДНК рИС19, являющейся матрицей, 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н до конечного объёма реакции 50 мкл.

Условия реакции были следующими. Реакционную смесь без ДНК-полимеразы или РНКазы-Н денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. Затем добавляли ДНКполимеразу и РНКазу-Н, и полученную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. По завершении реакции смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси затем подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле М.18|еуе 3:1.

В результате было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент образовывался с использованием любой из пар праймеров. Таким образом, было подтверждено, что двухцепочечную ДНК можно использовать в качестве матрицы для осуществления реакции амплификации в способе амплификации по настоящему изобретению.

(3) Отщепление продукта амплификации рестриктазой.

Было проанализировано рестрикционное отщепление амплифицированного фрагмента, полученного с использованием способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве ДНК-матрицы использовали ДНК плазмиды рИС19. Использовали прямой праймер рИС19 иррег (2) NN и обратный праймер рИС19 1о\\'ег NN в соответствии с показанным в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 5 и 6 списка последовательностей, соответственно. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Состав реакционной смеси был следующим.

Реакционная смесь А: 35 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,5), 10 мМ хлорида магния, по 1,4 мМ каждого бЭТРх, 0,01% БСА, 5% ДМСО, 2,7% глицерина, по 100 пкмоль каждого из праймеров рИС19 иррег (2) NN и рИС19 1о\уег NN 500 нг ДНК рИС19 и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. Затем добавляли 60 ед. РНКазы-Н Е.со11 и 5,5 ед. Вса ВЕ8Т с доведением объёма реакции до 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Реакционную смесь подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле с целью очистки полученного в результате амплифицированного продукта. Выделенный продукт амплификации ресуспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды.

Раствор полученной таким образом ДНК использовали для отщепления рестриктазой. Использованными рестриктазами были Асс11 (Такага 81и^о) и Всп1 (Такага 81и^о). Состав реакционной смеси был следующим.

мкл раствора ДНК, 1 мкл буфера 10хАсс11 или буфера 10хВсп1, прилагающегося к каждой из рестриктаз, 1 мкл рестриктазы Асс11 или Всп1 и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 10 мкл. Реакцию в реакционной смеси проводили при 37°С в течение 30 мин. К полученному добавляли 1,5 мкл 10х загрузочного буфера. 6 мкл полученной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле №81еуе.

В результате интересующие отщеплённые рестриктазой фрагменты ДНК были получены при использовании обеих рестриктаз - и Асс11, и Всп1.

(4) Выявление мутаций.

Анализировали выявление мутации с помощью способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве матрицы использовали рИС19. Основные нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров рИС19 иррег (2) NN рптег и рИС19 1о\уег NN показаны в 8ЕО ΙΌ N0 5 и 6 списка последовательностей, соответственно. Оба этих праймера являются химерными олигонуклеотидными праймерами, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеиновые кислоты. Кроме того, были сконструированы четыре праймера, в которых 3'-концевой нуклеотид праймера рИС19 иррег (2) NN заменён на и (который комплементарен соответствующему нуклеотиду в матрице) или А, С или С (который является неправильно встроенным нуклеотидом), обозначенные как рИС19 иррег (2) NNи, рИС19 иррег (2) NN-Α, рИС19 иррег (2) NN-С или рИС19 иррег (2) NN-С, соответственно. Комбинации праймеров были следующими.

Пара праймеров 1: прямой рИС19 иррег (2) NN-υ и обратный рИС19 1о\уег NN пара праймеров 2: прямой рИС19 иррег (2) NN-Α и обратный рИС19 1о\уег NN пара праймеров 3: прямой рИС19 иррег (2) NN-С и обратный рИС19 1о\уег NN и пара праймеров 4: прямой рИС19 иррег (2) NN-С и обратный рИС19 1о\уег NN.

мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,3), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого бNТРχ, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, 50 нг ДНКматрицы и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. Затем в нее добавляли 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н Е.сой, и реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. Затем смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле М.18|еуе 3:1 (Такага 81и^о). В результате интересующий амплифицированный фрагмент длиной примерно 450 п.н.

- 25 005577 был выявлен только в случае использования комбинации праймеров, которая включает праймер, имеющий комплементарный нуклеотид на 3'-конце рИС19 иррег (2) NN. С другой стороны, амплифицированный фрагмент отсутствовал в случае комбинаций, включающих праймер, имеющий ошибочный нуклеотид на 3'-конце рИС19 иррег (2) NN.

Пример 4.

(1) Реакция в микропробирке.

Анализировали реакционный объём для способа амплификации по настоящему изобретению. Участок, кодирующий рецептор трансферрина человека, был выбран в качестве сегмента для амплификации. Использовали праймеры, характеризующиеся последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 12 или 13 списка последовательностей. В составе праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Фрагмент длиной примерно 750 п.н., амплифицированный методом ОТ-ПЦР, использовали в качестве ДНК-матрицы. Реакционный объём доводили до 50, 100, 300 или 500 мкл. Состав реакционной смеси был следующим.

Реакционная смесь А: 10 мкл 5х специального буфера (135 мМ калий-фосфатного буфера - рН=7,5, 0,5 мг/мл БСА, 2,5% ДМСО), 4 мкл 100 мМ ацетата магния, по 5 мкл 10 мМ йКТРк, 10 мкл 10 мкМ АТФ, 1 мкл ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т (22 ед./мкл), 1 мкл РНКазы-Н (60 ед./мкл) и стерильная дистиллированная вода до 39 мкл.

Реакционная смесь В: 3 мкл 20 мкМ праймера 8 для рецептора трансферрина человека (8Е0 ΙΌ N0 12) и 20 мкМ праймера для рецептора трансферрина человека (8Е0 ΙΌ N0 13) каждого, примерно 100 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до 11 мкл. Если объём становился 50 мкл или больше, то его масштабировали так, чтобы обеспечить указанный выше состав.

Для реакции амплификации реакционную смесь В нагревали до 98°С на 2 мин и затем инкубировали при 55°С в течение 3 мин. Реакционную смесь В добавляли к реакционной смеси А, которая была предварительно проинкубирована в 1500-мкл микропробирке при 55°С. После смешивания реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь переносили на ледяную баню. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле.

В результате интересующий фрагмент длиной примерно 300 п.н. был эффективно амплифицирован с использованием каждого из объёмов реакции. Кроме того, было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент может быть получен без проблем с использованием ПЦРамплифицированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы.

(2) Реакция в чашке Петри.

Анализировали использование чашки Петри с целью предотвращения неоднородности температуры в реакционной смеси, которая могла бы быть вызвана большим объёмом реакции. Участок, кодирующий рецептор трансферрина человека, был выбран как участок, который предстояло амплифицировать. Использовали праймеры, характеризующиеся последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 12 или 13 списка последовательностей. В составе праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами. Фрагмент длиной примерно 750 п.н., амплифицированный методом ОТ-ПЦР, использовали в качестве ДНК-матрицы. Объём реакции доводили до 10 мл. Состав реакционной смеси был следующим.

Реакционная смесь А: 2000 мкл 5х специального буфера (135 мМ калий-фосфатного буфера рН=7,5; 0,5 мг/мл БСА, 2,5% ДМСО), 800 мкл 100 мМ ацетата магния, 1000 мкл 10 мМ άNΤΡ8 и стерильная дистиллированная вода до 9,1 мл.

Реакционная смесь В: по 200 мкл 60 мкМ праймера 8 рецептора трансферрина человека (8Е0 ΙΌ N0 12) и 60 мкМ праймера рецептора трансферрина человека (8Е0 ΙΌ N0 13) каждого, примерно 10 мкг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до 500 мкл.

Реакционная смесь С: 200 мкл ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т (22 ед./мкл) и 200 мкл РНКазы-Н (60 ед./мкл).

Для реакции амплификации реакционную смесь В нагревали до 98°С на 1 мин и затем инкубировали при 55°С в течение 3 мин. Реакционную смесь В добавляли к реакционной смеси А, которая была предварительно проинкубирована в 60-мм (диаметр) пластиковой чашке Петри при 55°С. Далее к полученному добавляли реакционную смесь С. После смешивания реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции реакционную смесь переносили на ледяную баню. Затем 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле.

В результате был эффективно амплифицирован фрагмент длиной примерно 300 п.н., причём даже тогда, когда объём реакции составлял 10 мл. Кроме того, было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент можно без проблем получить с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы. Таким образом, было подтверждено, что способ по настоящему изобретению предпочтительно по сравнению со стандартным методом ПЦР можно использовать для изготовления ДНК-чипа, для чего требуется значительное количество ДНК-фрагмента.

Пример 5 (1). Отношение между типом буфера и количеством используемой РНКазы-Н.

Исследовали отношение между типом буфера и количеством используемой РНКазы-Н. Плазмидные ДНК (обозначенные как рИС 19-249 и рИС19-911), представляющие собой вектор рИС 19, в состав кото- 26 005577 рого был клонирован фрагмент размером 249 п.н. или 911 п.н., использовали в качестве матриц. В качестве праймеров использовали химерные олигонуклеотидные праймеры, в которых были заменены на рибонуклеотиды первые три нуклеотида с З'-конца праймера МЕ2Ш (24) или праймера МКШЗ (24), характеризующихся последовательностью, показанной в 8Е0 Ш N0 16 или 17 списка последовательностей. При использовании комбинации этих праймеров для рИС 19-249 и рИС19-911 были получены амплифицированные фрагменты длиной примерно 450 п.н. и примерно 1100 п.н., соответственно.

Трис-гидрохлоридный буфер, калий-фосфатный буфер и трициновый буфер были выбраны в качестве буферных систем для исследования. Анализируемые количества РНКазы-Н представляли её отсутствие и конечные концентрации в диапазоне от 0,З до 1,2 ед./мкл. Трис-гидрохлоридная буферная система была приготовлена в соответствии с описанным в примере 1 (2), за исключением того, что использовали 10 нг рИС19-249 или 200 нг рИС19-911, по 60 пкмоль каждого из праймеров и 11 ед. ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т на 50 мкл реакционной смеси. Калий-фосфатный буфер был приготовлен так, чтобы иметь сходный состав. Трициновая буферная система была приготовлена таким образом, чтобы содержать следующее с указанием конечных концентраций: З4 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния и по 0,5 мМ каждого из 6ΝΤΡ§. К данной буферной системе добавляли 10 нг плазмиды рИС 19-249 на 50 мкл объёма реакции или 200 нг плазмиды рИС19-911 на 50 мкл объёма реакции, по 60 пкмоль каждого из праймеров на 50 мкл объёма реакции, РНКазу-Н в заданной концентрации и 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т на 50 мкл объёма реакции.

Для реакции амплификации смесь являющихся матрицами рИС 19-249 или рИС19-911 и соответствующих праймеров денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли смесь остальных компонентов реакции. Реакцию в полученной смеси проводили при 55°С в течение 60 мин. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и к полученному добавляли 1/10 объёма 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции. З мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в З%-ном агарозном геле №81еуе З:1 (Такага δΐιιιζο).

В результате при использовании рИС 19-249 в качестве матрицы увеличение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от использованной буферной системы в следующем порядке: Трис-гидрохлоридный < калий-фосфатный < трициновый. При использовании рИС19-911 в качестве матрицы увеличение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от использованной буферной системы в следующем порядке: Трис-гидрохлоридный < трициновый < калий-фосфатный. Использование РНКазы-Н в конечной концентрации в диапазоне 0,З-1,2 ед./мкл приводило в результате к получению интересующего амплифицированного фрагмента, хотя при отсутствии добавления РНКазы-Н интересующий продукт амплификации отсутствовал.

(2) Анализ количества праймера.

Анализировали влияние количества использованного праймера на способ амплификации по настоящему изобретению. Систему реакционной смеси, в состав которой входит рИС 19-249, использовали в качестве матрицы, выбрав её из композиций, описанных выше в (1). Для калий-фосфатной буферной системы использовали 60 ед. РНКазы-Н на 50 мкл объёма реакции, в то время как для Трисгидрохлоридной или трициновой буферной системы использовали З0 ед. РНКазы-Н на 50 мкл объёма реакции. Анализируемые концентрации праймера варьировались в пределах от 10 до 100 пкмоль на 50 мкл. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен при использовании каждой из буферных систем, содержащих праймер в концентрации в диапазоне 10-100 пкмоль на 50 мкл.

(3) Влияние рН реакционного буфера.

Анализировали влияние рН реакционной смеси на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (2). Исследованные рН составляли 7,0-8,0 для калий-фосфатной буферной системы, 7,5-9,2 для трициновой буферной системы и 7,5-9,0 для Трис-гидрохлоридной буферной системы. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен в использованном диапазоне рН для соответствующих буферных систем.

(4) Влияние добавок.

Влияние добавления диметилсульфоксида (ДМСО) анализировали с использованием состава реакционной смеси с фосфатной буферной системой (рН=7,5) в соответствии с описанным выше в (З). Кроме того, также исследовали влияние добавления полиамина. Анализируемое количество добавляемого ДМСО варьировалось от 0 до 10%. С другой стороны, в качестве полиамина использовали спермина тетрагидрохлорид (81дта), спермидина тригидрохлорид (81дта), ацетилпутресцин (№1са1а1 Те^цне), путресцина дигидрохлорид (№1са1а1 Те^цне), триметилендиамин (№1са1а1 Те^цне), пропилендиамин ЩасаЕн Те5С|ие) и диаминометана дигидрохлорид Щасакн Теэдие). Количество добавляемых пропилендиамина и триметилендиамина колебалось от 0 до 2%. Другие полиамины использовали в диапазоне концентраций от 0 до 5 мМ. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

- 27 005577

В результате интересующий ДНК-фрагмент был эффективно амплифицирован с использованием добавки в концентрации в пределах указанных диапазонов: от 0 до 5% ДМСО; от 0 до 200 мкМ спермина тетрагидрохлорида или спермидина; от 40 мкМ до 40 мМ ацетилпутресцина или путресцина дигидрохлорида; 0,002-0,02% триметилендиамина; 0,0001-0,01% пропилендиамина; и 0,1-10 мкМ диаминометана дигидрохлорида.

(5) Анализ типа соли магния.

Исследовали влияние типа соли магния на способ амплификации по настоящему изобретению. ДНК риС19 использовали в качестве матрицы. В качестве праймеров использовали праймер рИС19 иррег NN 249 и праймер рИС19 1о\гег ΝΝ, характеризующиеся последовательностями, показанными в 8ΕΟ ΙΌ N0 11 и 6 списка последовательностей, соответственно. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 225 п. н. был получен с использованием пары этих праймеров. В качестве солей магния использовали хлорид магния, ацетат магния и сульфат магния. Состав реакционной смеси был следующим.

мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,3), 8 мМ (конечная концентрация) хлорида магния, ацетата магния или сульфата магния, по 1,0 мМ (конечная концентрация) каждого άΝΤΡδ, 50 нг ДНК рИС19, по 60 пкмоль каждого из праймеров, 60 ед. РНКазы-Н, 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ΒΕ8Τ и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 50 мкл. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (3).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен с использованием каждой из солей магния.

(6) Анализ концентраций магния и άΝΤΡδ.

Анализировали влияние концентраций магния и άΝΤΡδ на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (5), за исключением того, что использовали 25 нг ДНК рИС19 и различные концентрации магния и άΝΤΡδ. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В реакционной системе, в которой конечная концентрация каждого из άΝΤΡδ была зафиксирована на уровне 1 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовали конечную концентрацию магния в диапазоне от 6 мМ до 10 мМ. В реакционной системе, в которой конечная концентрация магния была зафиксирована на уровне 8 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовалась конечная концентрация каждого из άΝΤΡδ в диапазоне от 0,6 мМ до 1,2 мМ. Более того, в реакционной системе, в которой конечная концентрация каждого из άΝΤΡδ была зафиксирована на уровне 0,5 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовалась конечная концентрация магния в диапазоне от 2 мМ до 6 мМ. В реакционной системе, в которой конечная концентрация магния была зафиксирована на уровне 4 мМ, интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовалась конечная концентрация каждого из άΝΤΡδ в диапазоне от 0,2 мМ до 0,8 мМ.

(7) Анализ изменения концентрации калий-фосфатного буфера или трицинового буфера и реактивности.

Анализировали влияние концентрации калий-фосфатного буфера или трицинового буфера на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (1) в случае, когда рИС 19-249 использовали в качестве матрицы, за исключением того, что использовали калий-фосфатный буфер в конечной концентрации 20-50 мМ или трициновый буфер в конечной концентрации 22-46 мМ. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда использовали калий-фосфатный буфер в конечной концентрации в диапазоне от 20 до 50 мМ или трициновый буфер в конечной концентрации в диапазоне от 22 до 46 мМ.

(8) Анализ концентрации ДНК-полимеразы Вса ΒΕ8Τ.

Исследовали влияние концентрации ДНК-полимеразы Вса ΒΕ8Τ на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (1) в случае, когда рИС 19-249 использовали в качестве матрицы, за исключением того, что использовали калийфосфатную буферную систему или трициновую буферную систему и ДНК-полимеразу Вса ΒΕ8Τ в концентрации в диапазоне 1-22 ед. на 50 мкл объёма реакции. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1).

В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен тогда, когда ДНКполимеразу Вса ΒΕ8Τ использовали в концентрации в диапазоне 1-22 ед. на 50 мкл.

Пример 6. Сравнение с методом ПЦР.

Способ амплификации по настоящему изобретению сравнивали с методом ПЦР. Конструкции, в которых ДНК-фрагмент длиной примерно 150 п.н. или примерно 250 п.н. встроен по сайту для множественного клонирования плазмиды рИС 19, использовали в качестве матриц. Матрицы были приготовлены следующим образом.

Прямой праймер рИС 19 иррег 150, прямой праймер рИС19 иррег 249 и обратный праймер рИС19 1о\гег ΝΝ, которые характеризуются последовательностями, показанными в 8ΕΟ ΙΌ Ν0 10, 11 и 6 списка

- 28 005577 последовательностей, соответственно, использовали для осуществления реакции ПЦР с использования 100 пкг ДНК плазмиды рИС19 в качестве матрицы. Амплифицированный фрагмент размером примерно 150 п.н. был получен с использованием комбинации прямого праймера рИС19 иррег 150 и обратного праймера рИС19 1отеег NN. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 250 п.н. был получен при использовании комбинации прямого рИС19 иррег 249 и обратного праймера рИС19 1отеег NN. Каждый из этих амплифицированных фрагментов очищали с использованием М1сгосоп-100, затупляли их концы с использованием набора ЭНА Ыипйпд кй (Такага Зйнхо) и затем субклонировали по НтсП-сайту в состав плазмиды рИС19. Плазмиды, в которые встроен один из амплифицированных фрагментов, использовали для трансформации клеток Е.сой ДМ109. Полученных в результате трансформантов культивировали, и плазмиды со встроенной ДНК очищали из клеток с использованием реактивов О1ЛСЕк Р1а8Ш1б М1ш кй (О|адеп). Плазмиды со встроенной ДНК использовали в качестве матриц.

Последовательности праймеров, использованных в данном примере, показаны в 8ЕО ΙΌ N0 18 и 19 списка последовательностей. Праймеры, в которых первые три с З'-конца нуклеотида заменены на рибонуклеотиды, использовали в способе амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,З), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из бКТРк, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого из праймеров, 1 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н Е.сой, и полученную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. З мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле Ш8|еуе З:1 (Такага Зйнхо).

С другой стороны, амплификацию с применением метода ПЦР осуществляли в качестве контроля. Набор для ПЦР-амплификации от Такага 81шхо, по 10 пкмоль каждого праймера, имеющего последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ N0 18 или 19 списка последовательностей, не имеющую рибонуклеотида, 1 нг ДНК-матрицы и стерильную дистиллированную воду до объёма реакции 50 мкл использовали для этой реакции. Условия реакции составили 25 циклов по З0 с при 94°С, З0 с при 55°С и 40 с при 72°С. По завершении реакции З мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле М.18|еуе З:1 (Такага 8йихо).

В результате большее количество интересующего фрагмента было амплифицировано для каждой из являющихся матрицами плазмид, несущих вставку длиной 150 п.н. или 249 п.н., в способе амплификации по настоящему изобретению по сравнению с методом ПЦР. 20 мкл реакционной смеси было очищено с использованием М1сгосоп-200, и количество амплифицированного продукта оценивали с помощью бекмановского спектрофотометра Όϋ-640 (Весктап) с целью цифрового выражения количества амплифицированного продукта. Количество фрагмента, который был амплифицирован с являющейся матрицей плазмиды, включающей вставку длиной 150 п.н., в способе амплификации по настоящему изобретению было подтверждено как примерно в 60 раз превышающее количество, полученное в методе ПЦР. Количество фрагмента, который был амплифицирован с являющейся матрицей плазмиды, включающей вставку длиной 250 п.н., в способе амплификации по настоящему изобретению было подтверждено как примерно в 40 раз превышающее количество, полученное в методе ПЦР. Основываясь на этих результатах, было подтверждено, что способ по настоящему изобретению может быть преимущественно использован для изготовления ДНК-чипа, для которого требуется значительное количество ДНК-фрагмента, по сравнению со стандартным методом ПЦР.

Пример 7.

(1) Приготовление РНК-зонда.

Анализировали способ выявления амплифицированного фрагмента, полученного с помощью способа амплификации по настоящему изобретению. Был сформирован детекционный зонд, состоящий из рибонуклеотидов, в котором два различных флуоресцентных вещества присоединены к рибонуклеотидам по обоим концам зонда. Детекционный РНК-зонд был синтезирован с использованием ДНКсинтезатора (Аррйеб Вюкуйетк). Нуклеотидная последовательность зонда показана в 8Е0 ΙΌ N0 20 списка последовательностей. 6-РАМ (61еп Кекеагсй) и ТАМКА (61еп Кекеагсй) были использованы в качестве флуоресцентных веществ для мечения зонда по 5'-концу и по З'-концу, соответственно.

(2) Реакция амплификации и выявление.

В качестве матрицы использовали 0,1 или 1 нг ДНК рИС19. В качестве праймеров использовали прямой праймер рИС19 иррег 150 и обратный праймер рИС19 1отеег 542, характеризующиеся последовательностями, показанными в 8Е0 ΙΌ N0 10 и 8 списка последовательностей, соответственно, в которых первый и второй нуклеотиды с З'-конца праймера заменены рибонуклеотидами.

Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,З), 0,01% БСА, 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из бЭТРк, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, 0,1 или 1 нг ДНК-матрицы, 0,1 мкг РНК-зонда и стериль- 29 005577 ная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл. В качестве контроля готовили вариант, в котором отсутствовала ДНК-матрица.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 22 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и стерильной воды и 60 ед. РНКазы-Н Е.со11, и смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого 5 мкл 10%-ного додецилсульфата натрия (ДСН; Ν;·κ;·ι1;·ιί Текцие) добавляли к смеси с целью инактивации ферментов. 50 мкл реакционной смеси разводили равным объёмом стерильной воды и переносили на микропланшет. Анализатор изображения ЕМ В1О II МиШ-Щете (Такага 81ιιιζο) использовали для выявления при длине волны возбуждения 505 нм.

В результате не было выявлено флуоресцентного сигнала при использовании любой из матриц в отсутствие ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т. Также не было выявлено флуоресцентного сигнала в случае реакционной смеси, содержащей ДНК-полимеразу Вса ВЕ8Т, когда не добавляли ДНК, служащую матрицей. С другой стороны, флуоресцентный сигнал был выявлен тогда, когда добавляли либо 0,1, либо 1 нг ДНК, являющейся матрицей. Интересующий амплифицированный фрагмент длиной примерно 190 п.н. также был выявлен с помощью электрофореза в З%-ном агарозном геле, содержащем 0,0000З% бромистого этидия, причём только тогда, когда 0,1 или 1 нг ДНК, являющейся матрицей, добавляли в присутствие ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т. Такие же результаты были получены с помощью способа выявления с использованием РНК-зонда и стандартного метода электрофореза. Таким образом, был разработан способ выявления амплифицированного фрагмента, полученного с помощью способа амплификации по настоящему изобретению, с использованием РНК-зонда.

Пример 8.

Анализировали использование праймера, составленного дезоксирибонуклеотидами, в качестве одного из двух праймеров в способе по настоящему изобретению. В качестве праймеров использовали праймер МКШЗ (З0), имеющий последовательность, показанную в 8Еф ΙΌ ΝΟ 19 списка последовательностей, и праймер М4 (Такага 81ιιιζο), имеющий последовательность, показанную в 8Еф ΙΌ ΝΟ 58 списка последовательностей. В составе праймера МКШЗ первые три нуклеотида с З'-конца заменены на рибонуклеотиды. Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,З), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из бКТРк, 8 мМ ацетата магния, по З0 пкмоль каждого из праймеров, 1 нг ДНКматрицы и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 24 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 2 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и З0 ед. РНКазы-Н Е.со11, достигая объёма реакции 25 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого смесь нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 5 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле №.18|е\^ге З:1. В результате был выявлен интересующий амплифицированный фрагмент.

Пример 9.

Способ по настоящему изобретению был использован для выявления геморрагического штамма Е.соИ О-157.

Последовательности праймеров, использованных в данном примере, показаны в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 21-24 списка последовательностей. Комбинация праймеров, характеризующихся последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 21 или 22, и комбинация праймеров, характеризующихся последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 2З или 24, были сконструированы для выявления последовательности, кодирующей веротоксин-1 и веротоксин2 Ο-157 в соответствии с описанным в Кшкйо То В1ке1Ьи1ки (Сйшса1 М1сгоЫо1оду), 18 (4), 507-51З (1991). Праймеры, в которых три первых с З'-конца нуклеотида заменены рибонуклеотидами, использовали в способе амплификации по настоящему изобретению. Обработанный нагреванием экстракт, приготовленный путём сбора культуры геморрагического штамма Е.со11 Ο-157 (АТСС, депозитарный № 4З895), суспендирования его в стерильной воде при подходящей плотности клеток и обработки его при температуре 98°С в течение 10 мин, использовали в качестве матрицы. Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,З), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого из бКГРк, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, ДНК-матрица (обработанный нагреванием экстракт), соответствующая 10⁴-10⁶ клеток, и стерильная дистиллированная вода до объёма реакции 48 мкл.

Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98°С на 1 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 60 ед. РНКазы-Н Е.со11. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 60 мин. После этого смесь нагревали до 90°С в течение 2 мин с целью инактивации ферментов. З мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле №.18|е\^ге З:1 (Такага 81ιιιζο).

В результате веротоксины 1 и 2 О-157 могут быть выявлены с использованием любой из пар праймеров и ДНК-матрицы, соответствующей 10⁴ клеток: это подтверждает, что способ по настоящему изобретению может быть использован в качестве способа выявления патогенной бактерии.

- З0 005577

Пример 10.

Анализировали амплификацию длинноцепочечного фрагмента ДНК с помощью способа по настоящему изобретению. Двухцепочечную ДНК, служащую матрицей, приготавливали следующим образом. Сначала конструировали библиотеку на материале мРНК, происходящей из ткани нормального желудка, с использованием вектора υηί-Ζαρ ХВ (81га1адепе) в соответствии со стандартным методом. Библиотеку подвергали скринингу с целью отбора клонов, несущих вставку длиной примерно 2,1 т.п.н. или примерно 4,3 т.п.н. Клоны были использованы для получения фаговых векторов рВ1ие8спр! 8К(-) с помощью вырезания ίη νίΐΓΟ. Амплифицированные фрагменты длиной примерно 2,2 т.п.н. и примерно 4,4 т.п.н. были получены с использованием плазмид в качестве матриц, праймера МСВ-Ρ и праймера МСВВ, характеризующихся последовательностями, показанными в 8Е0 ΙΌ N0 25 и 26 списка последовательностей, соответственно, и набора для ПЦР-амплификации от Такага 81шхо. Полученные ПЦР-фрагменты использовали в качестве матриц для способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве праймеров использовали праймер ΜΡ2Ν3 (24) и праймер ΜΒ1Ν3 (24), имеющие последовательности, показанные в 8Е0 ΙΌ N0 27 и 28 списка последовательностей, соответственно, в которых первые три нуклеотида с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Состав реакционной смеси был следующим.

мМ фосфатного буфера (рН=7,5), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1% ДМСО, по 0,5 мМ каждого из 6ΝΤΡ§, 4 мМ ацетата магния, по 30 пкмоль каждого праймера, 0,2 мМ путресцина и стерильная дистиллированная вода до 24,25 мкл. Реакционную смесь нагревали до 92°С на 2 мин и затем охлаждали до 55°С. К полученному добавляли 30 ед. РНКазы-Н и 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т, доводя объём реакции до 25 мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и к полученному добавляли 2,5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА с целью остановки реакции. 5 мкл смеси подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле.

В результате амплифицированный фрагмент размером примерно 2,2 т.п.н. или примерно 4,4 т.п.н. был получен с помощью способа по настоящему изобретению: это подтверждает, что способ по настоящему изобретению может быть использован для амплификации длинноцепочечного фрагмента ДНК.

Пример 11. Была сформирована микроматрица ДНК, на которую поместили фрагмент ДНК λ-фага длиной примерно 400 п.н., амплифицированный с помощью способа по настоящему изобретению, и фрагменты ДНК λ-фага длиной примерно 300 п.н. и 1000 п.н., амплифицированные с помощью ПЦР. Нуклеотидная последовательность ДНК λ-фага доступна из базы данных СепВапк под депозитарными №№ У00636, 102459. М17233 и Х00906. Последовательности праймеров, использованных в данном примере, показаны в 8Е0 ΙΌ N0 25-26 и 29-35 списка последовательностей. Реакционная смесь для способа амплификации по настоящему изобретению была приготовлена следующим образом.

мМ Трицин-гидрохлоридного буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1% диметилсульфоксида, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого 6ΝΤΡ§, по 500 пкмоль каждого праймера, 100 нг продукта ПЦР-амплификации, взятого в качестве матрицы, 110 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 300 ед. клонированной РНКазы-Н при конечном объёме реакции 500 мкл. Реакционную смесь смешивали до однородного состояния, инкубировали при 55°С в течение 60 мин и затем нагревали до 90°С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Этот раствор использовали в последующих стадиях. Размещённые на матрице («раскапанные») фрагменты ДНК были следующими.

1. Образец. ПЦР-амплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использованием ДНК λфага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕО ΙΌ Ν0 29 или 30 списка последовательностей, был субклонирован в состав вектора рИС19. Субклонированный продукт затем амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры, последовательности которых показаны в 8ЕО ΙΌ Ν0 25 или 26 списка последовательностей. Полученный таким путём продукт, служащий матрицей, и химерные олигонуклеотидные праймеры, имеющие последовательность в соответствии с показанным в 8ЕО ΙΌ Ν0 31 или 32 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца праймера заменены на рибонуклеотиды, использовали для амплификации продукта длиной примерно 400 п. н. с помощью способа амплификации по настоящему изобретению с получением указанного образца. Пять растворов ДНК, т. е. реакционная смесь в своей исходной концентрации или её 2-, 4-, 8- или 16-кратные разведения в карбонатном буфере (карбонатный буфер в концентрации 50 мМ использовали для разведения в каждом случае), использовали для «раскапывания».

2. Образец. ДНК-фрагмент, амплифицированный в описанном выше (1), обрабатывали с помощью М1сгосоп-100 (Такага 81шхо). Затем пять растворов ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,5 мкг/мкл, 1,0 мкг/мкл и 2,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

3. Положительный контроль. ПЦР-амплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использованием ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕО ΙΌ Ν0 29 или 30 списка последовательностей, обрабатывали с помощью М1сгосоп-100. Затем пять растворов ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125

- 31 005577 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,5 мкг/мкл, 1,0 мкг/мкл и 2,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

4. Положительный контроль. ПЦР-амплифицированный продукт (1000 п.н.), полученный с использованием ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 33 или 34 списка последовательностей, обрабатывали с помощью М1сгосоп-100. Затем четыре раствора ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,5 мкг/мкл и 1,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

5. Отрицательный контроль. ПЦР-амплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использованием ДНК λ-фага в качестве матрицы и комбинации праймеров, характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 33 или 35 списка последовательностей, субклонировали в состав вектора риС19. Субклонированный продукт затем амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры, имеющие последовательности, показанные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 25 или 26 списка последовательностей. Полученный таким образом продукт, служащий матрицей, и праймеры, имеющие последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 31 или 32 списка последовательностей, использовали для амплификации продукта длиной примерно 400 п.н. с помощью способа амплификации по настоящему изобретению с получением указанного негативного контроля. Пять растворов ДНК , т.е. реакционная смесь в своей исходной концентрации или её 2-, 4-, 8- или 16-кратные разведения в карбонатном буфере (карбонатный буфер в концентрации 50 мМ использовали для разведения в каждом случае), использовали для «раскапывания».

6. Отрицательный контроль. ДНК-фрагмент, полученный выше в (5), обрабатывали с помощью М1сгосоп-100. Затем пять растворов ДНК приготавливали путём доведения концентраций до 0,125 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,5 мкг/мкл, 1,0 мкг/мкл и 2,0 мкг/мкл с использованием 50 мМ карбонатного буфера.

Полученные таким образом соответствующие растворы ДНК раскапывали на предметное стекло, на которое были нанесены аминогруппы (Ма18ипаш1 С1а§8), с использованием оборудования для изготовления ДНК-чипов (Сепейс МюгохуДспъ (СМ8)), и иммобилизовали с помощью УФ-облучения. Предметное стекло промывали 0,2%-ным ДСН и затем дистиллированной водой, высушивали и затем использовали в качестве матрицы ДНК.

ПЦР-амплифицированный продукт (300 п.н.), полученный с использованием комбинации праймеров, характеризующихся последовательностью, показанной в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 29 или 30 списка последовательностей, помечали Су5 с использованием набора ЬаЬе1 ГТ Су5® ЬаЬейпд кй (Такага Зкихо) для использования его в качестве зонда. Гибридизацию осуществляли с использованием прегибридизационного раствора и гибридизационного раствора, которые описаны в инструкциях, прилагающихся к ЕиеШСепе (Такага Зкихо). Сначала матрицу ДНК подвергали прегибридизации при комнатной температуре в течение 2 ч. Гибридизационный раствор, содержащий денатурированный Су5-помеченный зонд, наносили каплями на матрицу ДНК. Сверху размещали покровное стекло. Поверхности предметного стекла закрывали плёнкой. Упакованную матрицу ДНК инкубировали при 65°С в течение 13 ч. После этого удаляли покровное стекло, матрицу ДНК промывали в 2х88С при 65°С в течение 5 мин, в растворе, содержащем 0,2х88С и 0,1% ДСН при 65°С - в течение 5 мин и наконец в 0,2х88С при комнатной температуре - в течение 5 мин, и высушивали на воздухе. Затем матрицу ДНК подвергали микроматричному сканированию (СМ8) с целью анализа флуоресцентных сигналов на соответствующих пятнах.

В результате флуоресцентный сигнал был выявлен в каждом из положений, на которые были нанесены фрагменты, амплифицированные методом ПЦР (положительные контроли в соответствии с описанным выше в 3 и 4) и с помощью способа по настоящему изобретению (образцы в соответствии с описанным выше в 1 и 2). Интенсивность сигналов была следующей: образец 2 > положительный контроль 4 > образец 1 > положительный контроль 3. С другой стороны, для всех отрицательных контролей 5 и 6 сигналы отсутствовали. Полученные результаты подтверждают, что неочищенный или очищенный ДНКфрагмент, амплифицированный с помощью способа по настоящему изобретению, может быть предпочтительно использован в качестве ДНК-фрагмента, предназначенного для иммобилизации при изготовлении ДНК-чипа.

Пример 12.

(1) Анализировали конструирование праймера, использованного в способе по настоящему изобретению, в котором ПЦР-амплифицированный фрагмент используют в качестве матрицы. Сначала праймеры, имеющие одну из последовательностей, показанных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ 36-41 списка последовательностей, синтезировали в соответствии со стандартным методом. Структура соответствующих праймеров такова:

(ί) праймер К1-81: от 5'-конца - 7 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М13КУ (или последовательности КУ; нуклеотидная последовательность праймера М13КУ (Такага 81шхо)) и 20 нуклеотидов смысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага;

(ίί) праймер К1-А3: от 5'-конца - 7 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М13КУ и 20 нуклеотидов антисмысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага;

- 32 005577 (ίίί) праймер К2-81: от 5'-конца - 25 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов смысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага;

(ίν) праймер К2-АЗ: от 5'-конца - 25 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов антисмысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага;

(ν) праймер КЗ -81: от 5'-конца - 58 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов смысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага;

(νί) праймер КЗ-АЗ: от 5'-конца - 58 нуклеотидов спейсерной последовательности, 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и 20 нуклеотидов антисмысловой праймерной последовательности для ПЦР, специфичной для ДНК λ-фага.

20-мерная последовательность М1ЗКУ имеет последовательность всего из 20 нуклеотидов и состоит из 17 нуклеотидов последовательности М1ЗКУ и З нуклеотидов с 5'-конца. Следовательно, когда 20мерный М1ЗКУ используется в способе по настоящему изобретению, то длина спейсерных последовательностей у упомянутых выше праймеров составляет 4 нуклеотида, 22 нуклеотида и 55 нуклеотидов, соответственно. Праймеры без спейсерной последовательности также были сформированы в качестве контрольных по отношению к упомянутых выше праймерам.

Например, когда используют пару праймеров - праймер К1-81 и праймер К1-АЗ, - то получают амплифицированный фрагмент длиной З48 п.н. По 7 нуклеотидов на обоих концах амплифицированного фрагмента соответствуют спейсерным сегментам. Последовательности КУ расположены внутрь от спейсерных сегментов. Последовательности λ-ДНК расположены внутрь от последовательностей КУ.

Сходным образом, когда используют пару праймеров - праймер К2-81 и праймер К2-АЗ, - то получают амплифицированный фрагмент длиной З84 п.н., в котором по 25 нуклеотидов на обоих концах амплифицированного фрагмента соответствуют спейсерным сегментам. Кроме того, когда используют пару праймеров - праймер КЗ-81 и праймер КЗ-АЗ, - то получают амплифицированный фрагмент длиной 450 п.н., в котором по 58 нуклеотидов на обоих концах амплифицированного фрагмента соответствуют спейсерным сегментам. С другой стороны, во фрагменте, амплифицированном с использованием контрольных праймеров, не было спейсерного сегмента. Эти ПЦР-амплифицированные фрагменты использовали в качестве матриц для следующего анализа.

Один из двух праймеров - 17-мерный праймер М13КУ-2N или 20-мерный праймер М1ЗКУ-2Н имеющие последовательность в соответствии с показанным в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 42 или 4З списка последовательностей, - использовали в данном примере. В составе этих праймеров первый и второй нуклеотиды с З'-конца заменены на рибонуклеотиды. Реакцию проводили следующим образом. 5 мкл смеси 20 мкМ праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55°С. После этого З4 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого 6ΝΤΡ8, 1 ед. ДНК-полимеразы Вса ΒΕ8Τ и 15 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному с достижением конечного объёма реакции 25 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и затем к полученному добавляли 2,5 мкл 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции. З мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в З%-ном агарозном геле Νι.ι8ίονο З:1 (Гака га 81111ΖΟ). В результате, при использовании 17-мерного М13КУ-2N повышение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от длины спейсерной последовательности в следующем порядке: 25нуклеотидный > 7-нуклеотидный > 58-нуклеотидный > без спейсерной последовательности. При использовании 20-мерного праймера М13КУ-2N повышение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от длины спейсерной последовательности в следующем порядке: 22-нуклеотидный > 4нуклеотидный > 55-нуклеотидный > без спейсерной последовательности. Более того, когда последовательности М1ЗКУ в праймерах, описанных выше в (ί)-(ίν), заменяли на последовательности М1ЗМ4, то для отношений между спейсерной последовательностью и эффективностью амплификации была выявлена сходная тенденция. Таким образом, было подтверждено, что, когда линейный фрагмент, такой как ПЦР-амплифицированный фрагмент, используют в качестве матрицы, тогда конструирование праймеров, используемых в способе по настоящему изобретению, со внесением спейсерной последовательности (сегмента), приводит к повышению эффективности амплификации.

(2) Анализировали амплификацию матрицы, характеризующейся высоким содержанием пары ОС, с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием повышения температуры реакции. Сначала были сформированы праймеры, имеющие последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 44 или 45 списка последовательности, для ПЦР-амплификации участка длиной З07 п.н. (содержание пары ОС - 62,5%) из состава гена ΡΙ88 ЬКЕ, кодирующего СЭС2-подобную протеинкиназу (ОепВапк: депозитарный № АА789З28). Кроме того, были получены праймеры, имеющие последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 46 или 47 списка последовательностей, для ПЦР-амплификации участка длиной 284 п.н. (содержание пары ОС - 61,З%) из состава гена, кодирующего цитоскелетный

- ЗЗ 005577 кератин-1 ΙΙ-го типа (СепВапк: депозитарный № АА706022). ПЦР-амплификацию осуществляют с использованием этих праймеров и имеющихся в продаже фрагментов ДНК (Кезеагей Сепейез) в качестве матриц. Соответствующие ПЦР-ампнифицированные фрагменты, полученные с использованием указанных выше пар праймеров, включают спейсерные последовательности и последовательности М13КУ на обоих концах. Фрагменты использовали в качестве матриц для настоящего изобретения.

В данном примере использовали 17-мерный праймер Μ13ΚΑ-2Ν, характеризующийся последовательностью, показанной в 8ЕС) 10 N0 42 списка последовательностей, или 20-мерный праймер М13КУ2Ν, характеризующийся последовательностью, показанной в 8ЕС) II) N0 43 списка последовательностей. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами. Реакцию осуществляли следующим образом. 10 мкл смеси 100 пкмоль праймера, 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55°С или 60°С. После этого к полученному добавляли 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ КС1, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого άΝΤΡδ, 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 30 ед. РНКазы-Н с получением конечного объёма реакции 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С или 60°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле. Полученные результаты показаны ниже в табл. 1.

Таблица 1

Температура реакции	Использованные праймеры	Ген и результаты амплификации
СОС2-киназа	цитоскелетный кератин П
55°С	Μ13Κν-2Ν, 17-мер	++	++
Μ13Κν-2Ν,20-мер	++	++
60°С	Μ13Κν-2Ν,17-мер	+	+
Μ13ΚΥ-2Ν,20-мер	++++	++++
от «+» до «++++» - степень амплификации оценивали по 4-балльной системе; «-» амплификация отсутствовала

Как показано в табл. 1, интересующий сегмент эффективно амплифицируется даже тогда, когда используется матрица, характеризующаяся высоким содержанием пары СС. Такую амплификацию проводили при повышении температуры (с 55 до 60°С) и с использованием в случае проведения реакции при 60°С праймера, характеризующегося более высоким значением Тт по сравнению с праймером, оптимальным для реакции при 55 °С.

(3) Анализировали отношение между длиной амплифицированного фрагмента и количеством амплификационного продукта в способе амплификации нуклеотидной последовательности в условиях высокой температуры реакции. Сначала пару праймеров, характеризующихся последовательностью, показанной в 8 ЕС) 10 N0 48 или 49 списка последовательностей, для амплификации участка ДНК λ-фага длиной 800 п.н. (Такага 81ιιιζο). и пару праймеров, характеризующихся последовательностью, показанной в 8ЕС) 10 N0 50 или 51 списка последовательностей, для амплификации участка ДНК λ-фага длиной 400 п. н. синтезировали в соответствии со стандартным методом. ПЦР проводили с использованием одной из этих пар праймеров и λ-ДНК в качестве матрицы с получением амплифицированного фрагмента. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 1,1 т.п.н. также был получен с использованием плазмиды риС19-911 в соответствии с описанным в примере 5 (1) в качестве матрицы и праймера МЕ2 (24) и праймера МК1 (24), которые характеризовались последовательностями, показанными в 8ЕС) 10 N0 16 и 17 списка последовательностей, соответственно. ПЦР-амплифицированные фрагменты, полученные с использованием указанных выше пар праймеров, имели спейсерные последовательности и последовательности М13КУ или М4 по обоим концам. Эти фрагменты использовали в качестве матриц для настоящего изобретения.

В данном примере в качестве праймера использовали 17-мерный праймер М 131К\'-2\, имеющий последовательность, показанную в 8ЕС) 10 N0 42 списка последовательностей, или 20-мерный праймер М131К\'-2\, имеющий последовательность, показанную в 8ЕС) 10 N0 43 списка последовательностей. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Комбинацию 20мерного праймера М13М4-3^ имеющего последовательность, показанную в 8 ЕС) II) N0 55 списка последовательностей, и 20-мерного праймера М13КУ-3^ имеющего последовательность, показанную в 8ЕС) ΙΟ N0 43 списка последовательностей, а также комбинацию 24-мерного праймера Μ13Μ4-3N и 24мерного праймера М13КУ-3^ характеризующихся последовательностями, показанными в 8ЕС) II) N0 56 и 57 списка последовательностей, соответственно, использовали для амплификации участка длиной приблизительно 1 т.п.н. В этих праймерах первые три нуклеотида с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

- 34 005577

Реакцию проводили следующим образом. 10 мкл смеси 10 пкмоль праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55°С или 60°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого άΝΤΡδ, 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 30 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному, достигая конечного объёма реакции 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55°С или 60°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С, и затем к полученному добавляли 5 мкл раствора 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле Nи8^еνе 3:1 (Такага 8Ηπζο). Полученные результаты показаны ниже в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Температура реакции	Использованные праймеры	Длина амплифицированного фрагмента и результаты
400 п.н.	800 п.н.
55°С	Μ13ΒΥ-2Ν, 17-мер	++	44-
Μ13ΚΥ-2Ν,20-мер	++	4-4-
60°С	Μ13Κν-2Ν,17-мер	+	4-
Μ13ΚΥ-2Ν,20-мер	++++	+4-4-+
от «+» до «4·1 1 I» - степень амплификации оценивали по 4-балльной системе; «-» амплификация отсутствовала

Как показано в табл. 2, фрагменты участков 400 п.н. и 800 п.н. были эффективно амплифицированы при наращивании длины праймера для амплификации от 17 до 20 нуклеотидов и путём повышения температуры реакции от 55 до 60°С.

Таблица 3

Температура реакции	Использованные праймеры	Длина ампли- фицированного фрагмента и результаты: 1034 п.н.
	Μ13ΚΥ-3Ν 20-мер и Μ13Μ4-3Ν 20-мер	4-4-

55°С	Μ13Κν-3Ν 20-мер и Μ13Μ4-3Ν 20-мер	4-4-
55°С	Μ13Κν-3Ν 20-мер и Μ13Μ4-3Ν 20-мер	4-4-
Μ13Κ.Υ-3Ν 24-мер и Μ13Μ4-3Ν 24-мер	+4-4-4-
от «4-» до «++++» - степень амплификации оценивали по 4-балльной системе; «-» амплификация отсутствовала

Кроме того, как показано в табл. 3, фрагмент участка длиной примерно 1 т.п.н. эффективно амплифицировался путём изменения длины амплификационного праймера с 20-нуклеотидного на 24нуклеотидный и путём повышения температуры реакции с 55 до 65°С. Кроме того, сходные результаты были получены для амплификации длинноцепочечного фрагмента ДНК в соответствии с описанным в примере 10 с использованием более длинных праймеров и повышенной температуры реакции. Повышение эффективности амплификации было выявлено тогда, когда амплифицировали участок длиной примерно 2 т.п.н. или больше.

Пример 13.

(1) В способе по настоящему изобретению анализировали использование теплоустойчивой ДНКполимеразы, иной нежели ДНК-полимераза Вса ΒΕ8Τ. ДНК-полимеразу Βδί (Νυ\ν Епд1апб Вю1аЪз) использовали в качестве теплоустойчивой ДНК-полимеразы. Пара праймеров - праймер 5'-Ш и праймер 3'ΙΌ, характеризующиеся последовательностями, показанными в 8 ЕС) ΙΌ ΝΟ 52 и 53 списка последовательностей, соответственно, - была синтезирована в соответствии со стандартным методом. ПЦР осуществляли с использованием пары праймеров и имеющегося в продаже ДНК-фрагмента гена циклина-А (КезеагсЪ Сепейсз) в качестве матрицы, в результате чего получили амплифицированный фрагмент длиной примерно 300 п.н. ПЦР-амплифицированный фрагмент, полученный с использованием пары праймеров, включал по обоим концам последовательность М13КУ. Фрагмент был использован в качестве матрицы в настоящем изобретении.

- 35 005577

В качестве праймера в данном примере использовали 17-мерный праймер Μ13ΚΥ-2Ν, имеющий последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0 42 списка последовательностей. В этом праймере первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами. Реакцию проводили следующим образом. 10 мкл смеси 20 мкМ праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 55°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида натрия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого άΝΤΡδ, 4, 8, 12 или 16 ед. ДНК-полимеразы В§1 и 30 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному с достижением конечного объёма реакции 50 мкл. В качестве контроля была приготовлена реакционная смесь, состав которой идентичен упомянутому выше, за исключением того, что использовали 11 ед. ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т. Реакционную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С и затем добавляли к полученному 5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА для остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле М18|еуе 3:1 (Такага δΐιιιζο). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен при использовании каждого количества единиц ДНК-полимеразы ВЦ. Таким образом, было подтверждено, что теплоустойчивые ДНК-полимеразы могут быть предпочтительно использованы в способе по настоящему изобретению.

(2) Анализировали использование мезофильной ДНК-полимеразы в способе по настоящему изобретению. Фрагмент Клёнова без 5'^3'-экзонуклеазной активности (-) (Такага δΐιιιζο) использовали в качестве мезофильной ДНК-полимеразы. ДНК, приготовленную в соответствии с (1) выше, использовали в качестве ДНК-матрицы для способа по настоящему изобретению.

В качестве праймера в данном примере использовали 16-мерный праймер М13-КУ-2^ характеризующийся последовательностью, показанной в 8ЕО ΙΌ N0 54 списка последовательностей. В этом праймере первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Реакцию осуществляли следующим образом. 10 мкл смеси 20 мкМ праймера, примерно 20 нг матрицы и 0,01% пропилендиамина денатурировали при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждали до 40°С. После этого 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния, по 0,5 мМ каждого бЭТРк, 0, 2, 4, 6 или 8 ед. фрагмента Клёнова и 30 ед. РНКазы-Н добавляли к полученному с достижением конечного объёма реакции 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 40°С в течение 1 часа. По завершении реакции смесь охлаждали до 4°С, и затем 5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА добавляли к полученному с целью остановки реакции. 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле №81еуе 3:1 (Такага δΐιιιζο). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен в случаях, когда использовали различное количество единиц фрагмента Клёнова, за исключением того случая, когда фрагмент Клёнова не был добавлен. Таким образом, было подтверждено, что мезофильные ДНК-полимеразы могут быть предпочтительно использованы в способе по настоящему изобретению.

Пример 14. Анализировали химерные олигонуклеотидные праймеры, предназначенные для использования в способе по настоящему изобретению. ДНК в качестве матрицы и праймеры синтезировали в соответствии с описанным в примере 1 (1). Структура праймеров, использованных в данном примере, подробно описана далее.

Пара праймеров 1. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 2 или 3 списка последовательностей и полностью составленной дезоксирибонуклеотидами.

Пара праймеров 2. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 59 или 60 списка последовательностей, в которой шестой и седьмой дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 3. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 61 или 62 списка последовательностей, в которой пятый и шестой дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 4. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 63 или 64 списка последовательностей, в которой четвёртый и пятый дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 5. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 65 или 66 списка последовательностей, в которой третий и четвёртый дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 6. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 67 или 68 списка последовательностей, в которой второй и третий дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 7. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 2 или 3 списка последовательностей, в которой первый и второй дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды.

Пара праймеров 8. Комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 67 или 68 списка последовательностей, в которой второй и третий дезок

- 36 005577 сирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды, а фосфатная связь со стороны 5'-конца третьего с 3'-конца рибонуклеотида заменена на фосфотиоатную связь.

Условия амплификации и способ выявления соответствовали описанному в примере 1 (2) и (3). В результате амплифицированный фрагмент, имеющий интересующую длину, был получен для каждой из пар праймеров 2-8. Для пар праймеров 2-7 количество амплифицированного продукта возрастало по мере того, как число дезоксирибонуклеотидов на 3'-конце уменьшалось. В частности, наибольшее количество продукта амплификации было выявлено для пары праймеров 7, у которых на 3'-конце дезоксирибонуклеотидов не было. С другой стороны, не было выявлено амплифицированного фрагмента для пары праймеров 1. Более того, тот факт, что интересующие амплифицированные фрагменты были получены для пар праймеров и 6, и 8, подтверждает, что и модифицированный рибонуклеотид, и немодифицированный рибонуклеотид может быть предпочтительно использован в качестве рибонуклеотида, входящего в состав праймера для способа по настоящему изобретению.

Промышленное применение

Настоящее изобретение обеспечивает средство, применимое для удобного и эффективного способа амплификации последовательности нуклеиновой кислоты и способа выявления нуклеиновой кислоты мишени для целей обнаружения или количественного анализа микроорганизма, такого как вирус, бактерия, гриб или дрожжи. Таким средством по изобретению являются химерные олигонуклеотидные праймеры, содержащие дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид расположен на 3'конце или со стороны 3'-конца праймера. Указанные способы осуществляются с применением ДНКполимеразы с активностью вытеснения цепи и эндонуклеазы. Раскрытый в изобретении продукт (иными словами, ДНК-чип), содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, размещенную в определенном порядке на предварительно заданном участке, обеспечивает выявление нуклеиновой кислотымишени с большим удобством процедуры, более высокой чувствительностью и более высокой воспроизводимостью данных по сравнению со стандартным продуктом и может быть использован в медицинских или ветеринарных целях.

Пояснения к списку последовательностей

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 1 - синтетическая ДНК, соответствующая участку используемой в качестве матрицы последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 2 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 3 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 4 - сконструированный олигонуклеотид, используемый в качестве зонда для выявления амплифицированного сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 5 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 иррег (2) ΝΝ, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 6 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 1о\\^гег ΝΝ, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 7 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 8 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 1о\\^гег 542, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 9 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 10 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 иррег 150, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 11 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС19 иррег 249, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 12 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 13 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 14 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 15 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 16 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как ΜΕ2Ν3 (24), для амплификации сегмента плазмиды рИС 19-249 или плазмиды рИС 19-911.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 17 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как ΜΒ1Ν3 (24), для амплификации сегмента плазмиды рИС19-249 или плазмиды рИС 19-911.

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ 18 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рИС 19.

- 37 005577

8Е0 ΙΌ N0 19 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МЯШ3, для амплификации сегмента плазмиды рИС19.

8Е0 ΙΌ N0 20 - синтетическая РНК, используемая в качестве зонда для выявления амплифицированного сегмента плазмиды рИС19.

8Е0 ΙΌ N0 21 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 геморрагического штамма 0-157 Ексйегйсййа сой.

8Е0 ГОО N0 22 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 геморрагического штамма 0-157 Ексйепсййа сой.

8Е0 ΙΌ N0 23 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-2 геморрагического штамма 0-157 Ексйегйсййа сой.

8Е0 ΙΌ N0 24 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-2 геморрагического штамма 0-157 Ексйегйсййа сой.

8Е0 ΙΌ N0 25 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МСЕ-Е, для амплификации длинного ДНК-фрагмента.

8Е0 ΙΌ N0 26 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МСЕ-Е, для амплификации длинного ДНК-фрагмента.

8Е0 ΙΌ N0 27 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МЕ2Н3 (24), для амплификации длинного ДНК-фрагмента.

8Е0 ΙΌ N0 28 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МЕШ3 (24), для амплификации длинного ДНК-фрагмента.

8Е0 ΙΌ N0 29 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 30 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 31 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 32 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ,

8Е0 ΙΌ N0 33 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 34 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 35 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 36 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Е1-81, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 37 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Е1-А3, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 38 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Е2-81, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 39 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Е2-А3, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 40 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Е3-81, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 41 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Е3-А3, для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8Е0 ΙΌ N0 42 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13ЕУ-2Ю7мер.

8Е0 ΙΌ N0 43 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13ЕV-2N 20-мер.

8Е0 ΙΌ N0 44 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена СОС2-родственной протеинкиназы ΡΙ88ΕΕΗ.

8Е0 ΙΌ N0 45 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена СОС2-родственной протеинкиназы ΡΙ88ΕΕΗ.

8Е0 ΙΌ N0 46 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена цитоскелетного кератина-11 ΙΙ-го типа.

8Е0 ΙΌ N0 47 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента гена цитоскелетного кератина-11 ΙΙ-го типа.

8Е0 ΙΌ N0 48 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

- 38 005577

8ЕЦ ΙΌ N0 49 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ N0 50 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ N0 51 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК бактериофага λ.

8ЕЦ ΙΌ N0 52 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как 5ΊΌ, для амплификации сегмента ДНК циклина-А.

8ЕЦ ΙΌ N0 53 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как 3ΊΌ, для амплификации сегмента ДНК циклина-А.

8ЕЦ ΙΌ N0 54 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13КV-2N 16-мер.

8ЕЦ ΙΌ N0 55 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13М4-3N 16-мер.

8ЕЦ ΙΌ N0 56 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13М4-3N 24-мер.

8ЕЦ ΙΌ N0 57 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13КV-3N 24-мер.

8ЕЦ ΙΌ N0 58 - сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как М13М4 17мер.

8ЕЦ ΙΌ N0 59 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 60 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 61 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 62 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 63 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 64 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 65 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 66 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 67 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

8ЕЦ ΙΌ N0 68 - сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека.

- 39 005577

Перечень последовательностей <110> Такага Βίο 1пс.

<120> Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученный способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, ДНКполимеразы и эндонуклеазы <130> 661724 <140> РСТ/ЕР00/02219 <141> 13 марта 2000 г.

<150> ΊΡ 11-076966 <151> 19 марта 1999 г.

<150> 1Р 11-370035 <151> 27 декабря 1999 г.

<160> 68 <210> 1 <211> 99 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая ДНК, соответствующая сегменту последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека, используемая в качестве матрицы <400> 1 ддасадсаас (дддссадса аадЦдадаа ас1сасй1а §адаайс1§ 50 с1йсссй1 ссй§са1а! 1с1§адса§1 йс1йс1§1 ййдсдад 99 <210> 2 <211> 22 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 2 са§саас1д§ дссадсааад й 22

- 40 005577 <210> 3 <211> 22 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400>3 §саааааса§ ааа§ааас1§ с1 22 <210>4 <211> 26 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотид, используемый в качестве зонда для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400>4

1§с1Пссс1 ПссПдса! апс1§ 26 <210>5 <211> 25 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как риС 19 иррег (2) ΝΝ, для амплификации сегмента плазмиды рЁ1С19 <400>5 айдсПааС са§1§ад§са сс(а1 25 <210>6 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 41 005577 <223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рИС 19 Ιον/ег ΝΝ, для амплификации сегмента плазмиды р11С19 <400>6 §а1аасас1§ с§§ссаасй асйс 25 <210>7 <211> 25 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды риС19 <400>7 ас1§§с§аас (асЦасЮ! а§сй 25 <210>8 <211>26 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как риС19 Ιοχνετ 542, для амплификации сегмента плазмиды р!1С19 <400>8 а§Тсасса§аа аа§са1сйа с§§а1 26 <210>9 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды р11С19 <400> 9 §с1са1§а§а саа1аассс1 §а1аа 25 <210> 10

- 42 005577 <211> 25 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рис 19 иррег 150, для амплификации сегмента плазмиды риС19 <400> 10 £§{£[сас£с Гс§Гс§1«£ §1а1д 25 <210> И <211> 25 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как рис 19 иррег 249, для амплификации сегмента плазмиды рСГС19 <400>11 с§сс1сса1с са§1с1а«а а11§1 25 <210> 12 <211>22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 12

ЩдаНдада ддаПссЩа §1 22 <210> 13 <211> 22 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека

- 4З 005577 <400> 13

1а§££ада§а §§аа§1§а1а с1 <210> 14 <211> 22 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 14

<210> 15 <211> 21 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 15

<210> 16 <211>24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как ΜΡ2Ν3 (24), для амплификации сегмента плазмиды р11С 19-249 или плазмиды рЫС 19-911 <400> 16 §с!§саа§§с ёаПаа§Ц§ §§1а <210> 17 <211>24 <212>ДНК <213> искусственная последовательность

- 44 005577 <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как ΜΚ/1Ν3 (24), для амплификации сегмента плазмиды риС19-249 или плазмиды р11С19-911 <400> 17 сП1а1дс11 сс§£с1с§1а 1д11 24 <210> 18 <211> 30 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента плазмиды рСГС19 <400> 18 сааддсдаЦ аа§П§§§1а 30 <210> 19 <211> 30 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как ΜΚ1Ν3, для амплификации сегмента плазмиды рСГС19 <400> 19

Шасасй! а!§сЦсс§д с!сд!аГ§Ц 30 <210> 20 <211> 30 <212> РНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая РНК, использованная в качестве зонда для выявления амплифицированной сегмента плазмиды р11С19 <400> 20 идаиссссса идиидидсаа аааадсддии 30

- 45 005577 <210> 21 <211> 18 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 геморрагического штамма 0-157 ЕзсйепсЫа сой <400> 21 а§«аа1§1§ §1§ёС£аа 18 <210> 22 <211> 17 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 геморрагического штамма 0-157 ЕзсЬепсЫа сой <400> 22 §ас!с11сса Одесса 17 <210> 23 <211> 18 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-2 геморрагического штамма 0-157 ЕзсйепсЫа сой <400> 23

Пс§§1а1сс Тайсссд 18 <210> 24

- 46 005577 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей веротоксин-2 геморрагического штамма 0-157 ЕзсЬепсЫа сой <400> 24

1с1с1§§1са й§1айа 18 <210> 25 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МСК-Р, для амплификации длинного фрагмента ДНК <400> 25 ссаПса§§с 1§с§саас1§ и 22 <210> 26 <211>22 ‘ <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как МСК.-К, для амплификации длинного фрагмента ДНК <400> 26

1§§сас§аса §§Шссс§а с! 22 <210>27 <211>24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 47 005577 <223> Сконструированный олигонуклеотидный

ΜΡ2Ν3 (24), для амплификации длинного фрагмента ДНК праймер, обозначенный как <400> 27 §с(£саа££с §а11ааё«ё §§1а <210> 28 <211>24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный

ΜΚ.1Ν3 (24), для амплификации длинного фрагмента ДНК праймер, обозначенный как <400> 28

СШа1£СП сс§£с1с§1а <210> 29 <211> 20 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации <400> 29 аасаасаа§а аас1§§Шс <210> 30 <211> 20 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации <400> 30 <210> 31

- 48 005577 <211> 17 <212>ДНК <213> искусственная последовательность праймер для амплификации <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага <400>31 §1Шссса§ 1сас§ас <210> 32 <211> 17 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации <400> 32 са§§аааса§ с!а1§ас <210> 33 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации <400> 33 §1ас§§1са1 са(с1дасас <210> 34 <211> 20 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации

- 49 005577 <400> 34 §саа1с§§са 1дПааас§с 20 <210> 35 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400> 35 с£сса1сс1§ §§аа§ас1сс 20 <210> 36 <211>44 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как К1-

81, для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400> 36

Шсасасад §ааасадс1а Гдасаасаас аа§ааас(д§ (Нс 44 <210> 37 <211>44 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как ΚΙАЗ, для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400> 37

Шсасасад §аааса§с1а 1§асдсаа(§ са1£асдас1 £§§§ 44 <210> 38 <211> 62 <212>ДНК <213> искусственная последовательность

- 50 005577 <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как К2 81, для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400> 38 айд1дадсд да!аасаай 1сасасадда аасадс1а1д асаасаасаа 50 дааас1ддй1с 62 <210> 39 <211>62 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как К2АЗ, для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400> 39 айд1дадсд да1аасаай (сасасадда аасадс1а1д асдсаа1дса 50

1дасдас1дд дд 62 <210> 40 <211> 95 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как КЗ81, для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400> 40 сасШа1дс Нссддс1сд 1а1дКд!д1 ддаайд1да дсдда1ааса 50 аШсасаса ддааасадс! а(дасаасаа саадааас1д дй(с 95 <210>41 <211> 95 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как КЗАЗ, для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага

- 51 005577 <400>41 сасШа1дс 11ссд§с1с§ §§аап§1да §с§да1ааса аШсасаса ддааасадс! а1§ас§саа1 §са1§ас§ас 1ддд§ <210>42 <211> 17 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный Μ13ΚΥ-2Ν 17-мер праймер, обозначенный как <400> 42 саддааасад с1а1дас <210>43 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный Μ13Κ.Υ-2Ν 20-мер праймер, обозначенный как <400> 43 асасаддааа садсГа1дас <210>44 <211>70 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента гена Р18ЬКЕ СОС2-родственной протеинкиназы праймер для амплификации <400> 44 §адйс§1дС ссд1асаас1 аШсасаса ддааасадс! а(§асссаас аа§а§сс(а( адсйс§с1с

- 52 005577 праймер для амплификации <210> 45 <211> 67 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента гена Р181ЛЕ СОС2-родственной протеинкиназы <400> 45

1с§ааа1са§ ссасадсдсс аШсасаса §§аааса§сС а!§ассс§с1 <210>46 <211> 70 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента гена цитоскелетного кератина-11 П-типа праймер

ДЛЯ амплификации <400> 46 §а§11с§1£1 ссд1асаас1 аШсасаса §§ааасадс! а1§ас§с1а1

1с1§аса1са сШссадас <210>47 <211> 66 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента гена цитоскелетного кератина-11 П-типа праймер для амплификации <400> 47

1сдааа1са§ ссасадсдсс аШсасаса §§ааасадс1 а!§ас§аак ссасг§§1§§ са§1а§ <210> 48 <211> 62 <212> ДНК <213> искусственная последовательность

- 53 005577 <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер

Для амплификации <400> 48 аП§1§а§с§ §а1аасааП 1сасаса§§а ааса§с!а1§ ас§1ас§§1с а1са!с!§ас ас <210> 49 <211>62 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации <400> 49 аЦ§!§а§с§ §а!аасаай !сасаса§§а ааса§с1а1§ аса1§с§сс§ сс1§аассас са <210> 50 <211> 62 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный сегмента ДНК λ-бактериофага праймер для амплификации <400> 50 ай§1§а§с§ §а!аасааД 1сасаса§§а ааса§с1а!§ асс1§с1с1£ сс£сйсас§ са <210> 51 <211> 62 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 54 005577 <223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента ДНК λ-бактериофага <400>51 аП§1да§сд §а1аасааН 1сасасад§а аасадс1а1д асдсааГсдд 50 саГдйааас дд 62 <210> 52 <211> 69 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как 5’-Ιϋ, для амплификации сегмента ДНК циклина-А <400> 52

1сдааа1сад ссасадсдсс аШсасаса ддааасадс! а(даса(дЦ 50

Пдддадаа ПаадГсГда 69 <210> 53 <211> 69 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как З’-П), для амплификации сегмента ДНК циклина-А <400> 53 дадПсд1дс сд1асаас!а Гйсасасад дааасадсГа (дасПасад 50 аП1ад!д!с 1с1дд1ддд 69 <210> 54 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 55 005577 <223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13ΚΥ-2Ν 16-мер <400> 54 а§§аааса§с 1а1§ас 16 <210> 55 <211> 20 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Μ4-3Ν 16-мер <400> 55 а§§§1Шсс са§(сас§ас 20 <210> 56 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13Μ4-3Ν 24-мер <400> 56 с§сса§£§И Нссса§1са сдас <210> 57 <211>24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как Μ13ΚΥ-3Ν 24-мер <400> 57

Шсасасад §аааса§с1а 1§ас

- 56 005577 <210> 58 <211> 17 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как

М13М4 <400> 58 дШсссад (сасдас 17 <210> 59 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 59 са§саас1§§ дссадсааад 11§а§аа 27 <210> 60 <211>27 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 60 §саааааса§ ааа§ааас1§ сСсадаа 27 <210> 61 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 57 005577 <400> 61

<210> 62 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 62

<210> 63 <211> 25 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 63

<210> 64 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 64

<210>65

- 58 005577 <211>24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 65 са§саас1§£ §сса§сааа§ и§а 24 <210>66 <211>24 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 66 §саааааса§ ааа§ааас1§ с1са 24 <210> 67 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 67 са£саас1§§ §^ссаё^саааё 23 <210> 68 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер для амплификации сегмента последовательности, кодирующей рецептор трансферрина человека <400> 68 £саааааса§ ааа§ааас(§ с1с 23

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид и имеющий структуру, в которой рибонуклеотид расположен на З'-конце или со стороны З'-конца праймера, для применения в способе, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является указанный химерный олигонуклеотидный праймер, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
2. Химерный олигонуклеотидный праймер по п.1, который содержит два или большее число расположенных подряд рибонуклеотидных остатков.
3. Химерный олигонуклеотидный праймер по пп.1 или 2, который содержит один или большее число модифицированных рибонуклеотидов.
4. Химерный олигонуклеотидный праймер по п.З, который содержит (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с атомом фосфора в α-положении рибонуклеозидтрифосфата, заменён на атом серы, в качестве модифицированного рибонуклеотида.
5. Применение ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, в способе, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер по п.1, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
6. Применение эндонуклеазы в способе, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер по п.1, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
7. Применение ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, в способе выявления нуклеиновой кислоты - мишени, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер по п.1, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, и амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени;

и дополнительно включающем выявление нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (Ь).
8. Эндонуклеаза, используемая в способе выявления нуклеиновой кислоты - мишени, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер по п.1, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, и амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени;

и дополнительно включающем выявление нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (Ь).

- 60 005577
9. Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота размещена в определенном порядке на предварительно заданном участке, приготовленный способом, включающим:

(A) амплификацию нуклеиновой кислоты, подлежащей иммобилизации, способом, включающим (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, где праймером является химерный олигонуклеотидный праймер по п.1, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, причем эндонуклеаза отщепляет по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, и амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени; и (B) размещение в определенном порядке и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (Ь), на предварительно заданном участке подложки.
10. Продукт по п.9, в котором указанная иммобилизованная нуклеиновая кислота является одноцепочечной.
11. Продукт по п.10, в котором указанная одноцепочечная нуклеиновая кислота по существу свободна от комплементарной к ней цепи.