EA007414B1

EA007414B1 - Химерный олигонуклеотидный праймер для способа амплификации нуклеиновой кислоты; продукт для амплификации нуклеиновой кислоты; зонд для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени; материал с иммобилизованной амплифицированной нуклеиновой кислотой и способ его получения; способ определения нуклеотидной последовательности

Info

Publication number: EA007414B1
Application number: EA200401354A
Authority: EA
Inventors: Хироаки Сагава; Такаси Уемори; Хироюки Мукаи; Дзунко Ямамото; Дзун Томоно; Ейдзи Кобаяси; Тацудзи Еноки; Киезо Асада; Икуносин Като
Original assignee: Такара Био Инк.
Priority date: 2000-08-23
Filing date: 2001-08-21
Publication date: 2006-10-27
Also published as: TWI249577B; KR20030036707A; EP1312682A4; CN1854309A; EA200401354A1; KR100735131B1; CN1254548C; AU2001278783B2; CA2417798A1; EP1312682A1; JP4128074B2; WO2002016639A1; EA200300284A1; EA005739B1; AU7878301A; CN1471588A

Abstract

Описываются химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, расположенный на 3'-конце или в 3'-концевой области, используемый в способе высокочувствительной и специфической амплификации нуклеиновой кислоты-мишени с использованием эндорибонуклеазы и ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи; зонд, используемый в способ детекции амплифицированного фрагмента, полученного способом амплификации с использованием химерного праймера; материал, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученную способом амплификации с использованием химерного праймера, и способ получения материала; способ определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающий ее амплификацию способом с использованием химерного праймера; а также продукт для амплификации нуклеиновой кислоты.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, полезному в области клинической медицины, и к способу синтеза ДНК, полезному в области генной инженерии. Оно относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты как матрицы и к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированный указанным способом.

Уровень техники

Синтез ДНК используют для разных целей при исследованиях в области генной инженерии. Большинство синтезов ДНК, за исключением синтеза короткоцепных ДНК, таких как олигонуклеотиды, осуществляют ферментативными способами, при которых используют ДНК-полимеразу. Примером таких способов является способ полимеразной цепной реакции (ПЦР, РСК), подробно описанный в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является способ ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), являющийся сочетанием ПЦР и обратно-транскриптазной реакции, описанный в Тгепбк ίη Вю1сс1то1оду. 10:146-152 (1992). Развитие вышеуказанных способов делает возможной амплификацию представляющего интерес участка ДНК или РНК.

Вышеуказанные способы синтеза ДНК осуществляют, например, с использованием реакции, состоящей из трех стадий. Три стадии представляют собой стадию диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК, стадию отжига праймера к одноцепочечной ДНК и стадию синтеза (наращивания, достраивания) комплементарной цепочки с праймера для того, чтобы амплифицировать участок ДНК, представляющий интерес. С другой стороны, такие синтезы проводят с использованием реакции, называемой челночной ПЦР ((Не кйи((1е РСК (Кесеп( абуапсек ίη РСК те(йобо1оду), Тапраки51Ш51.1 Какикап Коико, Векка(ки (Рго(еш, М.1с1е1с Ас1б апб Епхуте, 8ирр1етеп(), 41(5):425-428 (1996)), где стадию отжига праймера и стадию наращивания проводят при одной и той же температуре.

С другой стороны, можно использовать способ лигазной цепной реакции (ЛЦР, ЬСК), описываемый в ЕР 320308, опубликованном 14 июня 1989г., или способ с системой амплификации на основе транскрипции (ΤΑ8), описанный в РСК Рго(осо1к, Асабепис Ргекк 1пс., 1990, рр. 245-252. Четыре способа, указанные выше, требуют повторения реакции при высокой температуре и реакции при низкой температуре несколько раз для того, чтобы регенерировать одноцепочечную молекулу-мишень для следующего цикла амплификации. Систему реакций надо осуществлять с использованием перемежающихся фаз или циклов, поскольку реакция ограничивается температурой, как указано выше.

Таким образом, указанные способы требуют применения дорогостоящего термоциклера, который может точно поддерживать значение температуры в широком интервале по времени. Кроме того, при реакции требуется время для установления температуры на уровне двух или трех заранее определенных значений. Потеря времени увеличивается пропорционально числу циклов.

Для того, чтобы решить указанные проблемы, разрабатываются способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно осуществить в изотермических условиях. Примерами являются способ амплификации с замещением цепи (8ΌΑ), описанный в 1Р-В 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (38К), способ амплификации на основе нуклеотидной последовательности (ΝΑ8ΒΑ), описанный в патенте Японии № 2650159, способ амплификации, опосредуемой транскрипцией (ТМА), способ с Ρβ-репликазой, описанный в патенте Японии № 2710159, и различные модификации способа 8ΌΑ, описанные в патенте США № 5824517, АО 99/09211, АО 95/25180 и АО 99/49081. Способ изотермического ферментативного синтеза олигонуклеотидов описывается в патенте США № 5916777. В таких способах изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтеза олигонуклеотидов при реакции в реакционной смеси при постоянной температуре параллельно происходит достраивание с праймера и/или отжиг праймера к одноцепочечному достроенному продукту (или к исходной последовательности-мишени) с последующим достраиванием с праймера.

Среди изотермических способов амплификации нуклеиновых кислот способ 8ΌΑ является примером системы, в которой ДНК в конечном счете амплифицируется. Способ 8ΌΑ является способом амплификации нуклеиновой кислоты-мишени (и ее комплементарной цепи) в образце путем замещения двух цепей с использованием ДНК-полимеразы и эндонуклеазы рестрикции. Для способа требуются четыре праймера, используемых для амплификации, два из которых должны быть сконструированы так, чтобы они содержали сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. Способ требует применения модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата в больших количествах в качестве субстрата для синтеза ДНК. Примером модифицированных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов является (а-8)-дезоксирибонуклеозидтрифосфат, в котором атом кислорода фосфатной группы в α-положении заменен на атом серы (8). Проблема стоимости работ, связанная с применением модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата становится серьезной, если реакцию проводят регулярно, например, при генетических исследованиях. Кроме того, введение в способе модифицированного нуклеотида, такого как (α-8)дезоксирибонуклеотид, в состав амплифицированного фрагмента ДНК может ликвидировать возможность расщепления амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой, например, когда его подвергают анализу на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ИБЕР).

Модифицированный способ 8ΌΑ, описанный в патенте США № 5824517, является способом ам

- 1 007414 плификации ДНК, в котором используется химерный праймер, состоящий из РНК и ДНК и имеющий существенный элемент структуры, в котором ДНК располагается по меньшей мере на З'-конце. Модифицированный способ 8ΌΆ, описанный в АО 99/09211, требует использования рестриктазы, дающей 3'выступающий конец. Модифицированный способ 8ΌΆ, описанный в АО 95/25180, требует использования по меньшей мере двух пар праймеров. Модифицированный способ 8ΌΆ, описанный в АО 99/49081, требует использования по меньшей мере двух пар праймеров и по меньшей мере одного модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотидов, описанный в патенте США № 5916777, включает синтез ДНК с использованием праймера, содержащего рибонуклеотид на З'-конце, осуществление реакции с использованием праймера, введение ника между праймером и наращенной цепью в достраиваемой с праймера цепи с помощью эндонуклеазы с целью их разделения, расщепление матрицы и возвращение праймера в исходное состояние для его повторного использования. Для этого праймер нужно отделить от реакционной системы и затем снова отжечь его к матрице для того, чтобы повторно использовать праймер в способе. Кроме того, для способа изотермической амплификации, опосредованной петлей (ЬАМР), описанного в АО 00/28082, требуется четыре праймера для амплификации, и продукты, амплифицированные с использованием такого метода, представляют собой ДНК разного размера, в которых участки-мишени для амплификации повторяются.

Как описано выше, общепринятые способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот, тем не менее, страдают различными недостатками. Таким образом, сохраняется потребность в способе амплификации нуклеиновых кислот, с помощью которого, при низкой стоимости работы, получают фрагмент ДНК, который затем можно использовать в генной инженерии.

Цели изобретения

Основными целями настоящего изобретения являются способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, с помощью которого в образце с высокой чувствительностью специфически амплифицируется нуклеиновая кислота-мишень путем синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, способ детекции амплифицированного фрагмента, полученного указанным способом, способ получения нуклеиновой кислоты-мишени с использованием указанного способа амплификации, и химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в указанных способах.

Сущность изобретения

В результате интенсивных исследований авторы сконструировали превосходную систему реакции амплификации гена. Конструирование осуществили путем разработки способа, при котором участок ДНК, представляющий интерес, амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, содержащего рибонуклеотид, расположенный на З'-конце или в З'-концевой области, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. таким образом осуществлено настоящее изобретение. Способ представляет собой способ амплификации нуклеиновых кислот, в котором используют химерный олигонуклеотидный праймер, и называется в данном описании способом ΙΟΑΝ (изотермическая инициируемая химерным праймером амплификация нуклеиновых кислот).

Первый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислотымишени, включающему:

(a) приготовление реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, используемой в качестве матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

По первому аспекту настоящего изобретения можно также использовать реакционную смесь, содержащую химерный олигонуклеотидный праймер с последовательностью, существенно, гомологичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему:

(a) обработку нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достраиваемой с праймера цепи, комплементарной матрице, и синтеза двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;

(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения це

- 2 007414 пи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и (с) повторное использование на стадии (Ь) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), как матрицы.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты с использованием по меньшей мере двух праймеров, включающему:

(a) обработку нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной матрице, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;

(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте как матрице, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты;

(c) повторное использование на стадии (Ь) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), как матрицы;

(ά) обработку замещенной цепи, полученной на стадии (Ь), используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, отличающимся от праймера, используемого на стадии (а), и ДНК-полимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной замещенной цепи, где праймер, отличающийся от праймера, используемого на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности замещенной цепи, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;

(е) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и (1) повторное использование на стадии (е) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), как матрицы.

По второму и третьему аспектам настоящего изобретения в качестве ДНК-полимеразы можно использовать ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему:

(a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;

(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и (c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с З'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему:

(а) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;

(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и (c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, от 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой.

Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему:

(a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;

(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;

(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, от 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);

(6) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей полученной на стадии (с) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а); и (е) повторное использование на стадии (6) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера, полученной на стадии (6).

Седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему:

(a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;

(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;

(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);

(6) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей полученной на стадии (с) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи;

- 4 007414 (е) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи, полученной на стадии (6), по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (1) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с З'-конца праймерной части двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенная с праймера цепь расщеплена, полученной на стадии (е), для синтеза замещенной цепи.

По четвертому-седьмому аспектам в качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н.

По первому-седьмому аспектам, где используют РНКазу Н, можно использовать РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода АгсйаеофоЬик, бактерии рода ВасШик или подобной бактерии.

По первому-седьмому аспектам примером подходящей длины специфически амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени являются 200 п.о. или менее.

В случае первого-седьмого аспектов настоящего изобретения можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже:

общая формула: 5'-6№-НЬШНс-3', где:

(а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 6Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 6Ν в 6Νη могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на З'-конце может быть модифицирован, так что достраивание на З'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).

Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0, и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-8)-рибонуклеотид. Кроме того, когда используют такой химерный олигонуклеотидный праймер, реакцию достраивания ДНК проводят при температуре, подходящей для праймера.

Способ амплификации по первому-седьмому аспектам может включать отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, в растворе для отжига, содержащем вещество, которое усиливает отжиг нуклеиновой кислоты с праймером. Например, раствор для отжига может содержать спермидин и/или пропилендиамин. Отжиг можно провести путем инкубации раствора для отжига, содержащего нуклеиновую кислоту, используемую в качестве матрицы, и химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, при 90° или выше и последующего охлаждения раствора до температуры, при которой проводят реакцию амплификации, или до более низкой.

Реакцию амплификации по первому-седьмому аспектам можно провести в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕ8.

По первому-седьмому аспектам, например, в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи можно использовать ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик 81еаго1йегторййи8 и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са16о1еиах.

В одном из вариантов воплощения первого-седьмого аспекта в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи используют Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са16о1еиах, и в качестве эндонуклеазы используют РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксйепсЫа сой или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода АгсйаеофоЬик.

По первому-седьмому аспектам можно использовать ДНК-полимеразу с эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са16о1еиах, и реакцию амплификации можно проводить в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНКполимеразы, является ион марганца.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени по первому-седьмому аспектам можно осуществить в присутствии вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота.

Первый-седьмой аспекты настоящего изобретения могут быть воплощены с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК. Если нуклеиновая кислота, используемая в качестве матрицы, является двухцепочечной ДНК, амплификацию можно проводить после превраще

- 5 007414 ния ее в одноцепочечные ДНК.

Нуклеиновая кислота, используемая в качестве матрицы, может представлять собой кДНК, полученную реакцией обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК. С одной стороны, реакцию амплификации проводят после синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК. Для реакции обратной транскрипции можно использовать ДНКполимеразу, обладающую активностью обратной транскриптазы. Например, реакцию обратной транскрипции и синтез достроенной цепи, комплементарной матрице, можно проводить с использованием только ДНК-полимеразы, обладающей обратно-транскриптазной активностью и активностью замещения цепи. Примерами такой ДНК-полимеразы являются Вь( ДНК-полимераза, лишенная 5'^3' экзонуклеазной активностью, из ВасШик 81еаго1йегторЫ1и8 или Вса ДНК-полимераза, лишенная 5'^3' экзонуклеазной активностью, из ВасШик са14о!еиах.

По первому-седьмому аспектам реакцию амплификации можно проводить в изотермических условиях. Ее можно проводить в присутствии аналога дезоксинуклеозидтрифосфата, такого как дезоксиуридинтрифосфат или его производное.

Восьмой аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей:

(a) по меньшей мере один праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;

(b) эндонуклеазу; и (c) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.

Девятый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей:

(a) по меньшей мере два праймера, существенно комплементарные нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце в 3'-концевой области праймера;

Десятый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, полученной путем смешивания нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и эндонуклеазы, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера.

Одиннадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, полученной путем смешивания нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере двух праймеров и эндонуклеазы, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности каждой цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера.

Примером праймера, входящего в состав композиции по восьмому-одиннадцатому аспектам настоящего изобретения, может являться химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже: общая формула: 5'-ά№ι-№-4№-3'. где:

(а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 4Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 4Ν в 4№1 могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).

Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0, и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-8)-рибонуклеотид.

Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕ8.

- 6 007414

Примером композиции по восьмому-одиннадцатому аспектам является композиция, содержащая в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа со11, Вк! ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к!еаго!йегторЫ1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са14о!епах. В качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером РНКазы Н является РНКаза Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик или бактерии рода ВасШик.

В одном из вариантов по восьмому-одиннадцатому аспектам композиция содержит в качестве ДНКполимеразы с активностью замещения цепи Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са14о!еиах, и в качестве эндонуклеазы используют РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксйепсЫа сой или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик.

Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНКполимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са14о!еиах, которую можно использовать в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНКполимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца.

Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, композиция может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридитрифосфата или его производное.

Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам, содержащей:

(a) РНКазу Н и (b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.

Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам, содержащей:

(a) эндонуклеазу и (b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.

В качестве эндонуклеазы для композиции по тринадцатому аспекту можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н.

В качестве РНКазы Н для композиции по двенадцатому или тринадцатому аспекту, содержащей РНКазу Н, можно использовать РНКазу Н, выбранную из числа РНКаз Н из ЕксйепсШа сой, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик и бактерии рода ВасШик.

Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспекту также может содержать буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, композиция может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕ8.

Примером по двенадцатому или тринадцатому аспекту является композиция, содержащая в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа со11, Вк! ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к!еагоШегторЫ1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са14о!еиах. В качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером РНКазы Н является РНКаза Н из ЕксйепсЫа со11, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик или бактерии рода ВасШик.

В одном из вариантов воплощения композиция по двенадцатому или тринадцатому аспекту содержит в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са14о!еиах, и в качестве эндонуклеазы РНКазу Н из ЕксйепсЫа со11, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксйепсЫа со11 или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик.

Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспектам может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са14о!еиах, которую можно использовать в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца.

Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирую

- 7 007414 щее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, композиция может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридинтрифосфат или его производное.

Четырнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, содержащему:

Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам настоящего изобретения, содержащему:

В качестве эндонуклеазы для композиции по пятнадцатому аспекту можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н.

Примером набора по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту, содержащего РНКазу Н, является набор, содержащий РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксбепсШа соб, РНКазы Н из бактерии рода ТНегтоЮда. РНКазы Н из бактерии рода Тбегтик, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик, РНКазы Н из бактерии рода Агсбаеод1оЬик и РНКазы Н из бактерии рода ВасШик.

Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту также может содержать буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, композиция может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕ8. Набор также может содержать раствор для отжига, содержащий вещество, усиливающее отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты. Например, раствор для отжига может содержать спермидин и/или пропилендиамин.

Примером ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, входящей в состав набора по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту, является ДНК-полимераза, выбранная из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксбебсЫа соб, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еагоШегторЫ1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах.

В одном из вариантов набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту содержит Вса ДНКполимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах, и РНКазу Н из ЕксНепсЫа соб, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсбаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксНепсЫа соб или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсбаеод1оЬик.

Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспектам настоящего изобретения может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах. Набор может содержать вещество, дающее возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНКполимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца.

Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, набор может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридинтрифосфат или его производное.

Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, находящемуся в упакованной форме и содержащему инструкции по применению ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи и РНКазы Н.

Семнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам настоящего изобретения, находящемуся в упакованной форме и содержащему инструкции по применению ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи и эндонуклеазы.

Восемнадцатый аспект настоящего изобретения относится к продукту с реагентом для амплификации нуклеиновой кислоты, состоящему из упаковки и реагента для амплификации нуклеиновой кислоты, заключенного в упаковку, где реагент для амплификации нуклеиновой кислоты содержит ДНКполимеразу с активностью замещения цепи и/или РНКазу Н, и на этикетке, наклеенной на упаковку, или в инструкциях, прилагаемых к упаковке, содержится описание того, что реагент для амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях.

- 8 007414

Девятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к продукту с реагентом для амплификации нуклеиновой кислоты, состоящему из упаковки и реагента для амплификации нуклеиновой кислоты, заключенного в упаковку, где реагент для амплификации нуклеиновой кислоты содержит ДНКполимеразу, обладающую активностью замещения цепи, и/или эндонуклеазу, и на этикетке, наклеенной на упаковку, или в инструкциях, прилагаемых к упаковке, содержится описание того, что реагент для амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях.

Двадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу детекции в образце нуклеиновой кислоты-мишени, включающему:

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (а). Способ детекции по двадцатому аспекту настоящего изобретения может включать детекцию амплифицированной нуклеиновой кислоты с использованием зонда для детекции. Зонд может представлять собой зонд, меченный веществом-меткой. Например, можно использовать РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, пространственно разнесенных так, что происходит тушение.

Двадцать первый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру, используемому для двадцатого аспекта. Примером химерного олигонуклеотидного праймера является праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже:

общая формула: 5'-0№-№-0Нс-З'.

где:

(а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; άΝ: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из άΝ в άΝα могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на З'-конце может быть модифицирован, так что достраивание на З'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).

Примером праймера по двадцать первому аспекту настоящего изобретения является праймер для детекции патогенного микроорганизма или связанного с заболеванием гена. Настоящее изобретение охватывает химерные олигонуклеотидные праймеры для детекции патогенных микроорганизмов, таких как энтерогеморрагическая ЕзсйепсЫа сой, С1оз1^шт ЬоШйпит, 81арйу1ососсив аигеиз, МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818, СЫатуά^а, вирус папилломы, вирус гепатита С или вироид.

Двадцать второй аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции энтерогеморрагической ЕзсйейсЫа со11, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО № З1-З4, 47, 48, 51-5З, 64-72, 84, 85, 11З, 114, 1З0 и 1З1.

Двадцать третий аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вироида, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО № 59, 60, 119, 120, 122 и 12З.

Двадцать четвертый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции С1о81и&ит ЬоШйпит, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕС ГО № 116 или 117.

Двадцать пятый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вируса папилломы, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕС ГО № 96 или 97.

Двадцать шестой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вируса гепатита С, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО № 101, 102, 1З8, 1З9, 200, 201, 205 и 206.

Двадцать седьмой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции 81ар11у1ососси5 аигеиз, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕС ГО № 1З6 или 1З7.

Двадцать восьмой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО № 155, 156, 159-162, 194 и 195.

Двадцать девятый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции 0113111)413, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО № 157, 158, 20З и 204.

Тридцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-пятому аспектам настоящего изобретения, содержащему химерный олигонуклеотидный праймер по двадцать первому

- 9 007414 двадцать девятому аспектам.

Тридцать первый аспект настоящего изобретения относится к набору для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, используемому в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по двадцатому аспекту настоящего изобретения, содержащему химерный олигонуклеотидный праймер по двадцать первому-двадцать девятому аспектам.

Тридцать второй аспект настоящего изобретения относится к зонду, используемому в способе по двадцатому аспекту.

Тридцать третий аспект настоящего изобретения относится к зонду, гибридизующемуся с нуклеиновой кислотой, амплифицированной по способу по первому-седьмому аспектам.

Тридцать четвертый аспект настоящего изобретения относится к зонду, гибридизующемуся с фрагментом, амплифицированным с использованием химерного олигонуклеотидного праймера по двадцать первому-двадцать девятому аспектам.

Зонд по тридцать второму-тридцать четвертому аспектам может представлять собой зонд, меченный веществом-меткой, например, РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, разнесенных пространственно так, что происходит тушение.

Тридцать пятый аспект настоящего изобретения относится к набору, используемому для детекции нуклеиновой кислоты-мишени способом по двадцатому аспекту, содержащему зонд по тридцать второму-тридцать четвертому аспектам.

Тридцать шестой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, для осуществления реакции переключения матрицы.

Примером ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, используемой по тридцать шестому аспекту, является ДНК-полимераза, выбранная из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНКполимеразы I из ЕксйепсЫа сой, Вз1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик 51еаго1йегторй11и5 и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из Васб1ик са16о!еиах.

Тридцать седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу получения материала, содержащего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, включающему:

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, подлежащей иммобилизации способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и (b) нанесение в виде упорядоченного массива и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (а), в предварительно заданном месте.

Тридцать восьмой аспект настоящего изобретения относится к материалу с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, полученному способом по тридцать седьмому аспекту.

Тридцать девятый аспект настоящего изобретения относится к способу получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, включающему:

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и (b) сбор нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а).

Сороковой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кисло ты, включающему:

(a) дупликацию ДНК или РНК, содержащей последовательность, подлежащую амплификации, для получения нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и (b) амплификацию нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, полученной на стадии (а), способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам.

Сорок первый аспект настоящего изобретения относится к способу определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающему амплификацию нуклеиновой кислоты согласно способу по первому-седьмому, тридцать девятому или сороковому аспектам.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 2 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 3 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 4 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 5 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 6 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле геле геле геле геле геле амплифицированных фрагментов амплифицированных фрагментов амплифицированных фрагментов амплифицированных фрагментов амплифицированных фрагментов амплифицированных фрагментов

- 10 007414

ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 7 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 8 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 9 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 10 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения. Α: ΙΟΑΝ; В: ПЦР.

Фиг. 11 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 12 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 13 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 14 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 15 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 16 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 17 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 18 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 19 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 20 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 21 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 22 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 23 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 24 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 25 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 26 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 27 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 28 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения, и картину дот-блоттинг гибридизации.

Фиг. 29 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 30 представляет собой диаграмму, на которой сравниваются количества продуктов амплификации, амплифицированных способом настоящего изобретения и при помощи ПЦР.

Фиг. 31 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 32 иллюстрирует картину электрофореза в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 33 иллюстрирует один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Фиг. 34 иллюстрирует один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Фиг. 35 иллюстрирует один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Фиг. 36 иллюстрирует один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Фиг. 37 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов

- 11 007414

Фиг. 38 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Фиг. 39 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В контексте данного изобретения дезоксирибонуклеотид (также обозначаемый как бы) относится к нуклеотиду, в котором углеводная часть представлена Ό-2-дезоксирибозой. Дезоксирибонуклеотиды включают, например, дезоксирибонуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или тимин. Кроме того, дезоксирибонуклеотиды также включают дезоксирибонуклеотид, содержащий модифицированное основание, такое как 7-деазагуанозин, и аналог дезоксирибонуклеотида, такой как дезоксиинозиннуклеотид.

В контексте данного изобретения рибонуклеотид (также обозначаемый как Ν) относится к нуклеотиду, в котором углеводная часть представлена Ό-рибозой. Рибонуклеотиды включают, например, рибонуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или урацил. Рибонуклеотиды также включают модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода фосфатной группы в α-положении заменен на атом серы (называемый также (α8)-рибонуклеотидом или (α-8)Ν), или другие производные.

В контексте данного изобретения химерный олигонуклеотидный праймер относится к праймеру, содержащему дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Праймер может содержать нуклеотидный аналог и/или модифицированный рибонуклеотид.

Химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, включают любые химерные олигонуклеотидные праймеры, содержащие рибонуклеотид, расположенный на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера, и могут использоваться для наращивания цепи нуклеиновой кислоты по способу настоящего изобретения, могут расщепляться эндонуклеазой и могут использоваться для осуществления реакции замещения цепи.

В контексте данного изобретения 3'-концевая область означает часть от центра к 3'-концу нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Аналогично, 5'-концевая область означает часть от центра к 5'-концу нуклеиновой кислоты.

В контексте данного изобретения эндонуклеаза может представлять собой любую эндонуклеазу, действующую на двухцепочечную ДНК, полученную путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, отожженного с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, и специфически расщепляющую ее по участку праймера, содержащему рибонуклеотид.

В контексте данного изобретения ДНК-полимераза относится к ферменту, синтезирующему цепь ДНК бе поуо с использованием цепи ДНК как матрицы. К ДНК-полимеразам относятся ДНКполимеразы, встречающиеся в природе, и варианты ферментов, обладающие вышеуказанной активностью. Например, к таким ферментам относится ДНК-полимераза с активностью замещения цепи, ДНКполимераза, лишенная 5'^3' экзонуклеазной активности, и ДНК-полимераза, обладающая активностью обратной транскриптазы или эндонуклеазной активностью.

В контексте данного изобретения термин активность замещения цепи относится к активности, которая может приводить к замещению цепи, т. е., которая может осуществлять дупликацию ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, в то же время замещая цепь ДНК, с высвобождением комплементарной цепи, которая была отожжена с матричной целью. Кроме того, цепь ДНК, высвобождаемая из нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, в результате замещения цепи, в данном описании обозначается как замещенная цепь.

Далее настоящее изобретение будет описано подробнее.

(1) Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении.

Праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога. К таким праймерам также относится олигорибонуклеотидный праймер, содержащий немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, существенно комплементарную фрагменту нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица. Он может вносить вклад в наращивание цепи ДНК в используемых условиях. Кроме того, рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера. Как правило, праймер конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен участку, расположенному «выше» (ирк(теат) относительно участка, подлежащего амплификации, т.е., участку, находящемуся в 3'-положении по отношению к нуклеотидной последовательности, соответствующей участку, подлежащему амплификации, в нуклеиновой кислоте, используемой как матрица. Используе

- 12 007414 мый в данном описании термин существенно комплементарная нуклеотидная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться с ДНК, используемой как матрица, в используемых условиях реакции.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. В контексте данного изобретения рибонуклеотид может представлять собой немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, который может располагаться на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера, и который узнается или расщепляется эндонуклеазой. Рибонуклеотиды включают как немодифицированные рибонуклеотиды, так и модифицированные рибонуклеотиды, как описано выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание могут быть использованы для химерного олигонуклеотидного праймера настоящего изобретения до тех пор, пока они не уничтожают функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменен на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксигруппа в положении 2 рибозы заменена на метоксигруппу, но не ограничиваясь ими. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий модифицированный рибонуклеотид, можно получить, используя, например, (а-8)-рибонуклеозидтрифосфат, который получают способом с использованием реагента для реакции сульфурирования (С1еп Кекеагсй), как описано в патенте США № 5003097, или реагента 2-ОМе-РНК-цианоэтилфосфоамидита (61еи Кекеагсй).

Можно сконструировать химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации по настоящему изобретению, так чтобы он содержал модифицированный рибонуклеотид, придающий устойчивость к расщеплению эндонуклеазой. Такой праймер полезен в том отношении, что можно контролировать сайт расщепления эндонуклеазой во время стадий реакции амплификации.

В способе настоящего изобретения можно использовать один или два химерных олигонуклеотидньгх праймера, в зависимости от требуемой формы фрагмента ДНК после амплификации (одноцепочечной или двухцепочечной). Конкретно, используют один химерный олигонуклеотидный праймер, когда нужна одноцепочечная ДНК, тогда как два праймера используют, когда нужна двухцепочечная ДНК.

Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения, конкретно не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительнее - от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида была существенно комплементарной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, так что он отжигается с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, в используемых условиях реакции. Праймер содержит на 3'-конце или в 3'-концевой области последовательность, узнаваемую эндонуклеазой, которая используется на стадии, описываемой ниже.

Например, в способе синтеза ДНК настоящего изобретения в качестве праймера можно использовать олигонуклеотид структуры, представленной приведенной далее общей формулой, хотя имеется в виду, что она не предназначена для ограничения настоящего изобретения:

Общая формула: 5'-άΝ;ι-Νό-ά+-3', где:

(а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; άΝ: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из άΝ в άΝη могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).

Например, в настоящем изобретении предпочтительно можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, где а = целому числу 11 или большему, и Ь = 1 и с = 0, или Ь = 2 и с = 0, или Ь = 3-5 и с = 0, или Ь = 2 и с = 0-5. Длина рибонуклеотидного звена на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения, предпочтительно, соответствует 1-меру-15-меру, предпочтительнее - 1-меру-10-меру, наиболее предпочтительно - 1-меру-5-меру. Число с в общей формуле конкретно не ограничивается, но можно выбрать любое число, которое можно использовать в способе настоящего изобретения. Как правило, предпочтительно число 5 или меньшее. Лучшие результаты реакции получают, выбирая значение с, равное 3, а не 4, равное 2, а не 3, и равное 1, а не 2. В частности, наиболее эффективно реакцию можно осуществить в случае с = 0.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, имеет структуру, в которой эндонуклеаза узнает или расщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь) по сайту, содержащему рибонуклеотид, располагающийся на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера. Хотя настоящее изобретение не предполагается ограничить случаем, когда, например, РНКаза Н действует на

- 13 007414 двухцепочечную ДНК, образовавшуюся путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного приведенной выше общей формулой, отожженного с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, химерный олигонуклеотидный праймер расщепляется по рибонуклеотидной части. Затем получают двухцепочечную ДНК, в которую вводят ник (одноцепочечный разрыв) между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной путем наращивания. Затем из ник-сайта с помощью ДНК-полимеразы проводят реакцию замещения цепи. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты с З'-конца праймера, который можно расщепить эндонуклеазой и с которым ДНК-полимераза может осуществлять реакцию замещения цепи. Кроме того, к химерным олигонуклеотидным праймерам настоящего изобретения относятся праймеры, 3'-концы которых модифицированы, так что достраивания под действием ДНК-полимеразы не происходит, и достраивание ДНК происходит с 3'-конца, образованного в результате расщепления эндонуклеазой.

Кроме того, в 5'-концевую область химерного олигонуклеотидного праймера может быть включена промоторная последовательность для РНК-полимеразы. Примерами таких РНК-полимераз являются РНК-полимераза фага Т7 и РНК-полимераза фага 8Р6.

Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Иными словами, в химерном олигонуклеотидном праймере настоящего изобретения могут содержаться один или несколько нуклеотидных аналогов до тех пор, пока сохраняется способность праймера к осуществлению реакции достраивания полимеризацией с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы. Можно использовать несколько типов нуклеотидных аналогов в сочетании. Примерами нуклеотидных аналогов являются дезоксиинозиннуклеотид, дезоксиурацилнуклеотид, нуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7деазагуанин, нуклеотидный аналог, содержащий производное рибозы, и т.п., но не ограничиваются ими. Кроме того, химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, могут содержать дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или нуклеотидные аналоги, содержащие различные модификации, такие как присоединение меченных соединений, до тех пор, пока они сохраняют функции, описанные выше.

Введение нуклеотидного аналога в праймер эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самого праймера и стабилизации отжига с матрицей. Рибонуклеотид можно ввести в праймер для такой же цели. Хотя не имеется в виду ограничение настоящего изобретения, предпочтительно можно использовать модифицированный рибонуклеотид, такой как (а-8)-рибонуклеотид, для того, чтобы предотвратить расщепление праймера неспецифической эндонуклеазой (РНКазой).

Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную нуклеотидную последовательность, можно синтезировать с использованием, например, синтезатора ДНК типа 394 производства Аррйеб Βίο5у51ст5 1пс. (ΑΒΙ), согласно фосфоамидитному методу. С другой стороны, для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера можно использовать любые способы, включая фосфаттриэфирный способ, Нфосфонатный способ и тиофосфонатный способ.

(2) Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении можно использовать любую эндонуклеазу, которая может действовать на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, как описано выше в (1), который отжигается с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, и расщеплять достроенную цепь для осуществления реакции замещения цепи. Иными словами, эндонуклеаза представляет собой фермент, который может вносить ник (одноцепочечный разрыв) в участок двухцепочечной ДНК, соответствующий химерному олигонуклеотидному праймеру. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, но не ограничиваясь ими, являются рибонуклеазы. Из них предпочтительно можно использовать эндорибонуклеазу Н (РНКазу Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из ДНК и РНК. Любую рибонуклеазу, обладающую вышеуказанными активностями, можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении, включая мезофильные и термоустойчивые рибонуклеазы. Например, РНКазу Н из Е. сой можно использовать в способе настоящего изобретения для реакции при примерно 50-70°С, как описывается ниже в примерах. Термоустойчивые рибонуклеазы предпочтительно можно использовать в способе настоящего изобретения. Примерами термоустойчивых рибонуклеаз, которые можно предпочтительно использовать, но не ограничиваясь ими, являются коммерчески доступная рибонуклеаза-термоустойчивая РНКаза Н НуЬпбазе™ (ЕркеШег Тсс1шо1ощс5). а также РНКаза Н из термофильной бактерии рода Васй1и8, бактерии рода Тйегтиз, бактерии рода Ругососсиз, бактерии рода Тйегто!ода, бактерии рода Агсйаеод1оЬиз или подобной бактерии. Кроме того, можно предпочтительно использовать как рибонуклеазы, встречающиеся в природе, так и варианты. Единица активности фермента РНКазы, указанная в данном описании, является величиной, выраженной согласно методу определения единицы активности фермента, описанному в ссылочных примерах.

Конкретных ограничений для РНКазы Н не существует до тех пор, пока ее можно использовать в способе настоящего изобретения. Например, РНКаза Н может происходить из разных вирусов, фагов, прокариот или эукариот. Она может представлять собой или клеточную РНКазу, или вирусную РНКазу.

- 14 007414

Примером клеточной РНКазы Н является РНКаза ΗΙ из ЕксйепсЫа сой, и примером вирусной РНКазы Н является РНКаза ВИЧ-1. В способе настоящего изобретения можно использовать РНКазу Н типа I, типа II или типа III. Например, предпочтительны, без ограничений, РНКаза ΗΙ из ЕксйепсЫа сой или РНКаза Н11 из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Лгсйаеод1оЬик.

Эффективность реакции расщепления эндонуклеазой, такой как РНКаза Н, используемой в способе настоящего изобретения, может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности вблизи 3'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации нужной ДНК. Поэтому естественно конструировать праймер, оптимальный для используемой РНКазы Н.

Используемый в данном описании термин введение ника или введение одноцепочечного разрыва (шскшд) означает внутреннее расщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и рибонуклеотидсодержащей ДНК, селективно расщепляя из двух цепей рибонуклеотидсодержащую цепь по рибонуклеотидной части, посредством чего в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводится ник.

(3) ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи ДНК. В частности, можно предпочтительно использовать ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3'-экзонуклеазной активности.

Используемый в данном описании термин активность замещения цепи относится к активности, которая может осуществлять замещение цепи, т.е., которая может проводить дупликацию ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, в то же время замещая цепь ДНК с высвобождением комплементарной цепи, отожженной с матричной цепью. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная из нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, в результате замещения цепи, в данном описании называется замещенной цепью.

В настоящем изобретении можно использовать любую ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи. Ее примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишенные 5'^3'-экзонуклеазной активности, полученные из термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик са16о!еиах (далее обозначаемой как Вса), и ВасШик йеагоШегторййик (далее обозначаемой как Βκΐ), а также большой фрагмент (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой (Е. сой). Как мезофильные, так и термоустойчивые ДНК-полимеразы можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении.

Вса является термофильной бактерией с оптимальной температурой роста примерно 70°С. Известно, что Вса ДНК-полимераза из этой бактерии обладает ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратно-транскриптазной активностью), 5'^3'экзонуклеазной активностью и 3'^5'-экзонуклеазной активностью. Фермент может представлять собой или фермент, выделенный в чистом виде из источника своего происхождения, или рекомбинантный белок, полученный с использованием методов генной инженерии. Фермент может быть подвергнут модификации, такой как замещение, делеция, присоединение или вставка с использованием методов генной инженерии или других способов. Примером таких ферментов является ДНК-полимераза ВсаВЕ8Т (Такага 81шхо). представляющая собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную ее 5'^3'-экзонуклеазной активности.

Известно, что некоторые ДНК-полимеразы в определенных условиях обладают эндонуклеазной активностью, такой как активность РНКазы Н. Такую ДНК-полимеразу можно использовать в способе настоящего изобретения. В одном аспекте ДНК-полимеразу можно использовать в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, например, в присутствии Мп²⁺. В таком случае способ настоящего изобретения можно осуществлять без добавления РНКазы Н. Авторы изобретения впервые показали, что Вса ДНК-полимераза обнаруживает РНКазную активность в буфере, содержащем Мп²⁺, и что способ амплификации по настоящему изобретению можно осуществлять в реакционной смеси, не содержащей других ферментов, помимо Вса ДНК-полимераза. Вышеуказанный аспект не ограничивается применением Вса ДНК-полимеразы. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, о которых известно, что они обладают активностью РНКазы Н, такие как ТШ ДНК-полимераза из Тйегтик Шегторййик.

(4) Состав реакционного буфера, используемого в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении используют реакционный буфер, содержащий буферный компонент, соль магния или другого металла и 6ΝΊΡ. Конечно, тип и концентрацию соли оптимизируют в зависимости от потребностей используемого фермента в металлах и т. п. Примерами буферного компонента, который можно предпочтительно использовать, являются, но не ограничиваются перечисленным, Бицин, Трицин, НЕРЕ8, Трис и фосфат (такой как фосфат натрия и фосфат калия). Среди них для настоящего изобретения предпочтителен буфер, содержащий в качестве буферного компонента Бицин, Трицин, НЕРЕ8 или фосфат. Например, но без намерения ограничивать настоящее изобретение, когда температура реакции высокая, предпочтительно использовать бициновый буфер, рН которого мало изменяется с изменением температуры. Буфер НЕРЕ8 может быть предпочтительным в зависимости от типа используемой РНКазы Н. Таким образом, оптимальный буфер можно выбирать в зависимости от температуры реакции, ис

- 15 007414 пользуемых эндонуклеазы или ДНК-полимеразы и т. п. Конечная концентрация буферного компонента колеблется от 5 до 100 мМ, предпочтительно, в интервале 20-50 мМ. Величина рН колеблется от 6,0 до 9,5, предпочтительно - от 7,0 до 9,2. Например, предпочтительно используют буфер, содержащий 22-46 мМ Трицина с рН 7,5-9,2 или буфер, содержащий 25-50 мМ фосфата калия с рН 7,0-8,0. Примерами солей магния, которые можно использовать, предпочтительно являются, но не ограничиваются перечисленным, хлорид магния, ацетат магния или сульфат магния. Конечная концентрация соли магния колеблется от 1 до 20 мМ, предпочтительно - от 2 до 10 мМ. Конечная концентрация 6ΝΤΓ (смесь 6АТР, 6СТР, 6СТР и 6ТТР) в смеси как субстратов для реакции достраивания ДНК колеблется от 0,1 до 3,0 мМ, предпочтительно - от 0,2 до 1,2 мМ. Количество праймеров, используемых в реакционном объеме 50 мкл, колеблется от 1 до 1000 пмоль, предпочтительно - от 10 до 150 пмоль. Кроме того, реакционная смесь может содержать добавки, например, для того, чтобы стабилизировать реакцию амплификации. Можно добавлять бычий сывороточный альбумин (БСА) в конечной концентрации 0,1% или менее, диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 10% или менее, дигидрохлорид путресцина в конечной концентрации 4 мМ или менее или пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% или менее. Кроме того, в смеси могут содержаться ΝΜΓ (1-метил-2-пирролидинон), глицерин, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид и/или -формамид. Ожидается, что добавление такого органического растворителя уменьшает неспецифический отжиг олигонуклеотидных праймеров.

Способ настоящего изобретения можно осуществлять, добавляя вещество, ингибирующее обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, такое как фосфономуравьиная кислота (РЕ А). Если добавляют вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность, уменьшается амплификация неспецифических продуктов, отличающихся от нуклеиновой кислоты-мишени.

В другом аспекте отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с химерным олигонуклеотидным праймером, используемым в настоящем изобретении, перед реакцией амплификации, эффективен для уменьшения неспецифического отжига олигонуклеотидного праймера в способе детекции, амплификации или получения по настоящему изобретению. Предпочтительно проводить отжиг с использованием раствора для отжига, содержащего вещество, усиливающее отжиг, такое как полиамин (например, спермин или спермидин) или пропилендиамин. Предпочтительно, раствор для отжига, содержащий полиамин, содержит также соль. Например, без ограничений, раствор для отжига может содержать хлорид натрия, хлорид калия, ацетат калия, ацетат натрия или подобную соль и полиамин.

Отжиг обычно проводят путем инкубации раствора для отжига, содержащего праймер и нуклеиновую кислоту, используемую как матрица, при температуре, при которой денатурируется двухцепочечная нуклеиновая кислота (например, при 90°С или выше), и последующего охлаждения раствора до температуры реакции, используемой для способа настоящего изобретения, или до более низкой температуры.

После отжига инициируют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, добавляя в смесь другие необходимые компоненты, такие как ДНК-полимераза, РНКаза Н и 6№ГР.

Количество РНКазы Н из ЕксйепсЫа со11, как пример эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 3 до 200 Е, предпочтительнее - от 15 до 60 Е. Сходным образом, количество РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик, как примеры эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 3 до 200 Е, предпочтительнее - от 4 до 40 Е. Количество ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ (Такага 8йц/о), как пример эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 0,5 до 100 Е, предпочтительнее - от 1 до 22 Е.

Когда в способе настоящего изобретения используют сочетание эндонуклеазы и ДНК-полимеразы, например, без ограничений, предпочтительно использовать сочетание РНКазы Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода АгсйаеофоЬик и ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Считается, что предпочтительное количество единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы может меняться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав используемого буфера и количество добавляемых ферментов можно подбирать, ориентируясь на повышение чувствительности детекции или количество продукта амплификации в качестве показателя. В любом случае естественно оптимизировать состав реакционного буфера и т. п. в зависимости от типа используемого фермента.

(5) Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера, описанного выше в (1), в сочетании с эндонуклеазой, описанной выше в (2), и ДНК-полимеразой, описанной выше в (3). С другой стороны, можно использовать ДНКполимеразу, обладающую активностью РНКазы Н, в условиях, позволяющих проявиться активности РНКазы Н, как описано выше.

6№ГР, используемые для ПНР, и т.п. (смесь 6АТР, 6СТР, 6СТР и 6ТТР) могут быть предпочтительно использованы в качестве нуклеозидтрифосфатов, служащих в способе в качестве субстратов реакции наращивания. Кроме того, в качестве субстрата можно использовать 6ИТР. άΝΊΚ могут содержать аналог άΝΊΚ (дезоксирибонуклеозидтрифосфата), такой как 7-деаза-6СТР, 6ГГР и т.п., до тех пор, пока он может служить субстратом для используемой ДНК-полимеразы. Можно использовать производное άΝΊΚ или аналог άΝΊΚ. Может содержаться производное с функциональной группой, такое как 6ИТР, содержащий аминогруппу. В способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер можно

- 16 007414 получить, например, с использованием синтезатора ДНК согласно обычному способу синтеза. В способе настоящего изобретения можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и обычного олигонуклеотидного праймера.

Если активность фермента, используемого в реакции, может снизиться в ходе реакции, в способе настоящего изобретения фермент можно добавлять по ходу реакции. Например, без намерения ограничивать настоящее изобретение, во время реакции, в которой используют РНКазу Н, можно дополнительно добавлять РНКазу Н из ЕксбепсШа соб. Добавляемый фермент может быть таким же, какой содержится в реакционной смеси в начале реакции, или он может быть другим ферментом, проявляющим такую же активность. Таким образом, тип или свойство добавляемого фермента не ограничивается конкретным одним ферментом до тех пор, пока добавление во время реакции производит действие, такое как повышение чувствительности детекции или повышение количества продукта амплификации.

Нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), используемую в способе настоящего изобретения в качестве матрицы, можно получить или выделить из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. С другой стороны, образец можно использовать непосредственно при реакции амплификации нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов), и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Образец может представлять собой препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, полученную обработкой вышеуказанных образцов известным способом. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный путем фракционирования такого продукта, нуклеиновая кислота в образце или образец, обогащенный молекулами определенной нуклеиновой кислоты, такой как мРНК. Кроме того, можно предпочтительно использовать нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, полученную амплификацией нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце.

Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, можно получить из указанных выше материалов с использованием, например, лизиса с детергентом, ультразвука, встряхивания/перемешивания с использованием стеклянных шариков или пресса Френча, без ограничений. В некоторых случаях для способа выгодно дополнительно очистить полученную нуклеиновую кислоту (например, в случае, когда присутствует эндогенная нуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают известным способом, таким как фенольная экстракция, хроматография, ионный обмен, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности.

Когда нужно амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной в реакции обратной транскрипции, в которой в качестве матрицы используют РНК. В способе настоящего изобретения можно применить любую РНК, для которой можно создать праймер, используемый в реакции обратной транскрипции, включая тотальную РНК в образце, молекулы РНК, такие как мРНК, тРНК и рРНК, а также определенные виды молекул РНК.

Любой праймер, который в условиях реакции отжигается с РНК, служащей матрицей, можно использовать в реакции обратной транскрипции. Праймер может представлять собой праймер с олигонуклеотидной последовательностью, комплементарной специфической РНК, используемой как матрица (специфический праймер), олиго-бТ (дезокситимин) праймер, и праймер со случайной последовательностью (случайный праймер). С учетом специфического отжига, длина праймера для обратной транскрипции составляет, предпочтительно, 6 нуклеотидов или более, предпочтительнее - 9 нуклеотидов или более. С учетом синтеза олигонуклеотида длина составляет предпочтительно 100 нуклеотидов или менее, предпочтительнее - З0 нуклеотидов или менее. Химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в качестве праймера для обратной транскрипции. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно использовать в качестве праймера в стандартной реакции замещения цепи в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной после обратной транскрипции. Такой праймер может представлять собой любой праймер, который имеет свойства, описанные выше в (1), и который можно использовать в реакции обратной транскрипции РНК.

В реакции обратной транскрипции можно использовать любой фермент, обладающий активностью синтеза кДНК, с использованием РНК в качестве матрицы. Его примерами являются обратные транскриптазы, полученные из различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая из вируса миелоидного лейкоза птиц (АМУ КЛаке), обратная транскриптаза, происходящая из вируса мышиного лейкоза Молони (ММЬУ КТаке), и обратная транскриптаза из вируса саркомы Рауса 2 (обратная транскриптаза КАУ-2). Кроме того, можно использовать ДНК-полимеразу, которая также обладает об

- 17 007414 ратно-транскриптазной активностью. Для настоящего изобретения предпочтителен фермент, обладающий обратно-транскриптазной активностью при высокой температуре, такой как ДНК-полимераза из бактерии рода ТНегтик (например, Т(Н ДНК-полимераза) и ДНК-полимераза из термофильной бактерии рода ВасШик. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы из термофильных бактерий рода ВасШик, такие как ДНК-полимераза из В к( (Вк( ДНК-полимераза) и Вса ДНК-полимераза, хотя они и не предназначаются для ограничения настоящего изобретения. Например, Вса ДНК-полимераза не требует иона марганца для обратно-транскриптазной реакции. Кроме того, она может синтезировать кДНК, подавляя в то же время образование вторичной структуры РНК, используемой как матрица, в условиях высокой температуры. Как встречающиеся в природе ферменты, так и варианты ферментов с обратнотранскриптазной активностью можно использовать до тех пор, пока они обладают такой активностью.

В другом аспекте в способе настоящего изобретения после дупликации ДНК или РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая должна быть заранее амплифицированна, продукт дупликации можно использовать в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Примером способа дупликации является, но не ограничивается им, способ, при котором соответствующего хозяина трансформируют вектором, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий амплифицируемую нуклеотидную последовательность, полученный трансформант культивируют, вектор, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий амплифицируемую нуклеотидную последовательность, экстрагируют и используют. Можно использовать любые векторы до тех пор, пока они устойчиво реплицируются в хозяине. Например, предпочтительно использовать вектора серии рИС, серии рВШекспрР серии рСЕМ, вектора космидного типа и вектора фагового типа. Можно использовать любые хозяева до тех пор, пока они могут поддерживать используемые вектора. Например, примером является ЕксНепсЫа соб, которая легко культивируется.

В другом аспекте способа дупликации после того, как РНК, имеющая нуклеотидную последовательность, которая должна быть амплифицированна, транскрибирована с использованием РНКполимеразы и фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего такую нуклеотидную последовательность, в качестве матрицы, РНК может быть использована в способе настоящего изобретения в качестве матрицы непосредственно или после превращения ее в кДНК в реакции обратной транскрипции. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, специально не ограничивается до тех пор, пока он содержит промоторную последовательность для РНКполимеразы. Он может быть встроен в вектор, содержащий промоторную последовательность для РНКполимеразы, лигирован с адаптером или кассетой, содержащими промоторную последовательность для РНК-полимеразы на своих концах, или синтезирован ферментативно с использованием праймера, содержащего промоторную последовательность для РНК-полимеразы, и соответствующей матрицы. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, можно дуплицировать или амплифицировать в форме РНК с использованием промоторной последовательности для РНК-полимеразы, расположенной так, как описано выше. Любые векторы можно использовать до тех пор, пока они содержат промоторные последовательности для РНКполимераз. Например, предпочтительно использовать вектора серии рИС, серии рВШекспрР серии рСЕМ, вектора космидного типа и вектора фагового типа. Вектор можно предпочтительно использовать в его кольцевой форме или после преобразования в линейную форму. Для способа дупликации или амплификации можно использовать любые РНК-полимеразы. Например, можно предпочтительно использовать РНК-полимеразу фага 8Р6, РНК-полимеразу фага Т7, РНК-полимеразу фага Т3 или подобную РНК-полимеразу.

В настоящем изобретении в качестве матрицы можно предпочтительно использовать как двухцепочечную ДНК, такую как геномная ДНК, выделенная так, как описано выше, или фрагмент ПЦР, и одноцепочечную ДНК, такую как кДНК, полученная реакцией обратной транскрипции тотальной РНК или мРНК. Двухцепочечную ДНК предпочтительно используют после ее денатурации до одноцепочечных ДНК или без такой денатурации.

В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения стадию денатурации можно исключить, если в качестве матрицы используют линейную двухцепочечную ДНК, такую как продукт ПЦР-амплификации. Исключение можно осуществить путем размещения сайта отжига для праймера, используемого в способе настоящего изобретения, примерно на расстоянии 50 оснований от конца ДНК. Если необходимо амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, реакцию амплификации можно инициировать путем добавления двухцепочечной нуклеиновой кислоты РНК-кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы, в реакционную смесь для амплификации настоящего изобретения, содержащую РНКазу Н для расщепления цепи РНК и превращения нуклеиновой кислоты в одноцепочечную кДНК. Кроме того, при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения реакционно-обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы и реакцию амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы полученной в реакции обратной транскрипции кДНК можно проводить с одной лишь ДНК-полимеразой. Такая ДНК-полимераза обладает обратно-транскриптазной активностью и активностью замещения цепи.

Подходящей длиной матрицы является длина, обеспечивающая достаточное связывание праймер

- 18 007414 ной последовательности благодаря наличию в фрагменте полной последовательности-мишени или по меньшей мере достаточной части последовательности-мишени.

Без ограничений, если ДНК, используемая в качестве матрицы, представляет собой двухцепочечную ДНК, в способе настоящего изобретения ДНК можно денатурировать до одноцепочечных ДНК для того, чтобы позволить праймеру связываться с цепью ДНК, служащей матрицей. Для денатурации предпочтительна инкубация двухцепочечной ДНК при температуре, при которой она денатурируется (например, около 95°С). Другие способы включают процесс, при котором используют повышенный рН. В таком случае рН перед амплификацией необходимо снизить для того, чтобы позволить олигонуклеотидному праймеру связаться с мишенью. Нуклеиновую кислоту непрерывно амплифицируют в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК (одноцепочечной ДНК) в реакции обратной транскрипции.

Непрерывно означает, что реакция протекает без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Используемый в данном описании термин изотермические относится к условиям с существенно постоянной температурой, при которых фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии.

Реакцию амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно проводить при обычной температуре (например, З7°С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Кленова. Ее также можно проводить при высокой температуре (например, 50°С или выше, или 60°С или выше) с использованием термостойких ферментов (эндонуклеазы и ДНК-полимеразы). В таком случае подавляется неспецифический отжиг праймера, что приводит к повышению специфичности амплификации ДНК. Кроме того, решается проблема образования вторичной структуры ДНК, используемой как матрица, что приводит к повышению способности ДНК-полимеразы к наращиванию цепи. По способу можно последовательно проводить реакцию обратной транскрипции и амплификацию нуклеиновой кислоты. В таком случае ДНК с последовательностью, происходящей от РНК, можно амплифицировать путем сочетания использования обратной транскриптазы и вышеуказанной реакции или путем использования ДНК-полимеразы с обратно-транскриптазной активностью.

В каждом аспекте настоящего изобретения химерный олигонуклеотидный праймер, комплементарный одноцепочечной ДНК как матрице, предпочтительно сначала отжигают с ДНК, хотя это не предполагается как ограничение настоящего изобретения. ДНК, комплементарную ДНК, используемую как матрица (цепь, достроенная с праймера), затем наращивают вдоль остальной последовательности ДНК, используемой как матрица с З'-конца праймера под действием ДНК-полимеразы, и синтезируют двухцепочечную ДНК. Эндонуклеаза действует на двухцепочечную ДНК и позволяет инициировать вновь наращивание ДНК, начиная с праймерной части достроенной с праймера άе поуо цепи. В одном аспекте настоящего изобретения эндонуклеаза действует как ник-фермент, вводящий ник в двухцепочечную ДНК, или она изменяет структуру двухцепочечной ДНК, состоящей из химерного олигонуклеотидного праймера и ДНК, используемой как матрица, хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо теорией. ДНК-полимераза с активностью замещения цепи вновь достраивает цепь ДНК с З'-конца ника, введенного в двухцепочечную ДНК, с образованием новой достроенной с праймера цепи, причем в то же время высвобождая ДНК ниже (Яо\уп51геат) от З'-конца ника. Таким образом, новая достроенная с праймера цепь замещает синтезированную ранее достроенную с праймера цепь.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществить с использованием двух праймеров, т. е. химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного замещенной цепи. В таком случае один праймер связывается с цепью ДНК, служащей матрицей, чтобы вызвать реакцию замещения цепи, в то время как другой праймер связывается с замещенной цепью, высвобождаемой в результате реакции замещения цепи, для инициации другой реакции замещения цепи. Ясно, что продукт реакции с одним праймером может функционировать как матрица для другого праймера, если используется такой аспект. Таким образом, количество продукта амплификации нелинейно возрастает с увеличением количества матрицы.

Когда способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, обе цепи могут служить матрицами в реакции амплификации с использованием химерных олигонуклеотидных праймеров, которые отжигаются к соответствующим двум цепям. Если реакцию инициируют после денатурации двухцепочечной ДНК, в реакционную смесь перед или после денатурации двухцепочечной ДНК добавляют химерный олигонуклеотидный праймер, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (άΝΤΡ), ДНК-полимеразу и эндонуклеазу. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют тепловую обработку и не используют термостойкий фермент, предпочтительно добавлять фермент после денатурации.

По аспекту способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК и используют два химерных олигонуклеотидных праймера, может происходить переключение матриц между промежуточными достроенными с матрицы цепями во время реакции достраивания с праймеров, с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, со

- 19 007414 стоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, хотя это зависит от условий реакции и т. п. Двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит химерные олигонуклеотидные праймеры по обоим концам. Затем с обоих концов можно снова инициировать реакцию наращивания комплементарных цепей, включая замещение цепи. В результате реакции образуется продукт амплификации, содержащий на одном конце праймерную последовательность. Кроме того, если во время реакции происходит переключение матриц, снова образуется двухцепочечная нуклеиновая кислота, подобная той, что была описана выше.

Настоящее изобретение предусматривает способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи для осуществления реакции переключения матрицы. При реакции переключения матрицы в присутствии двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей в качестве матрицы, двух химерных олигонуклеотидных праймеров, существенно комплементарных нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи синтезируются две достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Во время синтеза достраиваемых с праймеров цепей для каждой достраиваемой с праймера цепи происходит переключение с матрицы на другую достроенную с праймера цепь.

Используемый в данном описании термин реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой, когда комплементарные цепи синтезируются с обеих сторон двухцепочечной нуклеиновой кислоты в реакции замещения цепей, ДНК-полимераза переключает матрицу и затем синтезирует комплементарную цепь с использованием в качестве матрицы другой комплементарной цепи, вновь синтезированной с помощью другой молекулы ДНК-полимеразы. Иными словами, реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, обрабатывают праймерами и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, с образованием достроенных цепей, комплементарных матрице, где ДНК-полимераза, которая синтезирует достроенные с праймеров цепи, во время синтеза достроенных цепей активно переключает матрицу с исходных матриц на другие достроенные с праймеров цепи. Способность ДНК-полимеразы осуществлять реакцию переключения матрицы можно определить, например, согласно способу, описанному ниже в примере 32, хотя такой способ не предназначен для ограничения настоящего изобретения.

ДНК-полимеразу, способную осуществлять реакцию переключения матрицы во время реакции замещения цепи, предпочтительно можно использовать для настоящего изобретения. Например, предпочтительно использовать, в частности, фермент Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3'-эндонуклеазной активности. Такой фермент коммерчески доступен как ДНК-полимераза ВсаВЕ8Т (Такага 81шхо). Ее также можно выделить из штамма ЕксйепсЫа сой НВ101/ рИ1205 (БЕВМ ВР-3720), который содержит ген для фермента, согласно способу, описанному в патенте Японии № 2978001. Штамм ЕксйепсЫа со11 НВ101/рИ1205 (БЕВМ ВР-3720) депонирован в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (!п1егпа11опа1 Ра!еи! Огдаткт Оерокйагу, №1йопа1 !пк11(и(е ой Айуаисей [пНик(г1а1 8с1еисе аий Тесйио1оду, АКТ ТкикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, ШдакЫ 1-сйоте, ТкикиЬа-кЫ, Шагай 305-8566, Япония) с 10 мая 1991г. (дата исходного депозита).

Без намерения ограничивать настоящее изобретение, далее рассматривается, примерный механизм реакции по способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей обрабатывают в присутствии РНКазы Н двумя химерными олигонуклеотидными праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которыми отжигаются два праймера. Последнюю двухцепочечную нуклеиновую кислоту используют повторно в качестве матрицы.

Двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, расщепляют РНКазой Н в сайтах, содержащих рибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи достраивают с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, с осуществлением замещения цепей. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которой отжигаются оба праймера.

Если реакции переключения матрицы не происходит, может быть получено два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая.

Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, для осуществления замещения цепей достраивают с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, с которой отжигаются два праймера. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота,

- 20 007414 состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которой отжигаются два праймера. Двухцепочечная нуклеиновая кислота, с которой отжигаются оба праймера, используется повторно как матрица.

Если реакции переключения матрицы не происходит, можно получить два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая.

Два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот расщепляют РНКазой Н в сайтах, содержащих рибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи достраивают с З'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты для осуществления замещения цепей.

В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, обрабатывают в присутствии РНКазы Н двумя химерными олигонуклеотидными праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, и синтезируют достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Если реакции переключения матриц не происходит, можно получить два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая.

В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения цепь, достроенную с химерного олигонуклеотидного праймера, можно расщепить в сайте, содержащем рибонуклеотид, так что 5'-фрагмент (праймерная часть), полученная при расщеплении, не будет содержать рибонуклеотид. Достроенная с праймера цепь, достроенная с образовавшейся таким образом праймерной части, далее не будет расщепляться эндонуклеазой. В результате образуется продукт амплификации, содержащий праймерную последовательность.

Как описано выше, методом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно получить продукт амплификации без праймерной последовательности или продукт, содержащий праймерную(ые) последовательность(и) на одном или обоих концах. Такие продукты в контексте данного изобретения включаются в продукты амплификации.

Пример способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения иллюстрируется фиг. 33-36. Иными словами, фиг. 33-36 иллюстрируют примеры амплификации нуклеиновой кислоты по способу амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

Фиг. 33-36 иллюстрируют пример амплификации нуклеиновой кислоты в присутствии в качестве матрицы ДНК, представляющей собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, пары химерных олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности ДНК, используемой как матрица (на фигурах химерные олигонуклеотидные праймеры содержат три рибонуклеотида на своих 3'-концах; незаштрихованные кружочки на фигурах представляют рибонуклеотиды), ДНК-синтетазы (ДНК-полимеразы) с активностью замещения цепи, РНКазы Н, представляющей собой рибонуклеазу, расщепляющую гибридный сайт ДНК-РНК, и 6ΝΤΡ, являющихся субстратами, включаемыми в достроенные цепи.

Как видно на фиг. 33, пара химерных олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности ДНК, используемой как матрица, отжигаются к специфическим частям ДНК, служащей матрицей. Цепи ДНК достраиваются с 3'-концов соответствующих химерных олигонуклеотидных праймеров в результате реакции замещения цепи, как показано на стадии 1.

Затем, как видно на фиг. 34, некоторые из достроенных с праймеров цепей, достроенные в обратном и прямом направлении, освобождаются от исходных матриц в результате реакции переключения матрицы, как показано на стадии 2. Достроенные с праймеров цепи отжигаются одна с другой в их 3'-частях. Комплементарные цепи наращиваются с отожженных цепей, образуя двухцепочечную ДНК, состоящую из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Кроме того, образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещенных цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается упомянутая выше пара химерных олигонуклеотидных праймеров. Она служит в качестве исходного материала на фиг. 34.

Как показано на стадии 3 на фиг. 35, только одна цепь двухцепочечной ДНК на фиг. 34, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, содержащая РНК, происходящую из химерного олигонуклеотидного праймера, расщепляется под действием РНКазы Н в ДНК/РНК гибридном сайте двухцепочечной ДНК, в результате чего в двухцепочечную ДНК вводится ник.

Затем из ника в двухцепочечной ДНК происходит реакция замещения цепи, и ДНК наращивается, как указывается на стадии 4 на фиг. 35. Затем происходит реакция переключения матрицы, подобная реакции на стадии 2 на фиг. 34, в некоторой степени или с некоторой частотой, как указывается на стадии 5 на фиг. 35, результатом чего является двухцепочечная ДНК, состоящая из продуктов амплификации, т.е., достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой.

Кроме того, образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещаемых цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается упомянутая выше пара химерных олигонуклеотидных праймеров.

- 21 007414

Затем, как показано на фиг. 36, в результате реакции замещения цепи ДНК достраиваются с 3'концов соответствующих химерных олигонуклеотидных праймеров в двухцепочечной ДНК на фиг. 35, состоящей из замещаемых цепей, отожженных одна с другой, с которой отжигаются химерные олигонуклеотидные праймеры. В некоторой степени происходит реакция переключения матрицы, подобная реакции на стадии 2 и на стадии 5, результатом которой является двухцепочечная ДНК, состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Такую двухцепочечную ДНК возвращают на стадию 3, фиг. 35. Снова начинается реакция стадии 3, фиг. 35. Образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещаемых цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается пара химерных олигонуклеотидных праймеров, и используется в качестве исходного материала в реакции, отображенной на фиг. 36. В результате происходит цепная реакция, при которой повторно образуются указанные двухцепочечные нуклеиновые кислоты, приводящая к специфической амплификации и образованию фрагмента, ограниченного парой химерных олигонуклеотидных праймеров.

В способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения с использованием химерных олигонуклеотидных праймеров может быть получен полимер, в котором амплифицируемые участки соединены друг с другом. Полимер имеет структуру, в которой множество амплифицируемых участков повторяется в одном и том же направлении. Полимеры обнаруживают при анализе продуктов амплификации методом электрофореза в виде мультимерных полос. Полагают, что на образование таких полимеров влияет амплифицируемый участок, размер участка, фланкирующие области, нуклеотидная последовательность используемого химерного олигонуклеотидного праймера, условия реакции и т. п.

Полимер, описанный выше, содержит множество амплифицируемых участков. Например, поскольку при гибридизации с соответствующей пробой он гибридизуется с несколькими пробами и дает интенсивный сигнал, полимер может быть использован, когда имеется ввиду детекция нуклеиновой кислоты, содержащей амплифицируемый фрагмент. Амплифицируемый участок или его часть можно получить в виде мономера из полимера с использованием расщепления рестриктазой или подобного в сочетании.

ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достроенную цепь с 3'-конца праймерной части в прямом направлении ^отаккеат), в то же время замещая достроенную ранее цепь ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не должна проявлять 5'^3'-экзонуклеазную активность, которая может расщепить замещаемую цепь. Например, в качестве таких ДНК-полимераз могут использоваться фрагмент

Кленова, представляющий собой лишенный экзонуклеазы вариант ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой, аналогичный фрагмент, полученный из Вк1 ДНК-полимеразы (№\ν ΕπβΕ-ιηά Вю1аЬк), и ДНКполимераза ВсаВЕЗТ из Вса (Такага Зйнхо). Также можно использовать Зесщепаке 1.0 и Зесщепаке 2.0 (Όηί^ά 8(а(ек Вюсйетюа1) и ДНК-полимеразу фага Т5 и ДНК-полимеразу фага φ29, описанную в Сепе, 97:13-19 (1991). Полимеразу, обычно обладающую 5'^3'-экзонуклеазной активностью, можно использовать в способе настоящего изобретения, если ингибировать такую активность может добавление соответствующего ингибитора.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществлять при переменной температуре или его можно осуществлять изотермически. Переменная температура означает, что температура реакции изменяется для соответствующих стадий таким образом, что изменение не мешает реакциям на этих стадиях. Конкретно, переменная температура относится к ее изменению до таких значений, которые будут подходить, например, для отжига праймера, для реакции синтеза комплементарной цепи, для введения ника в комплементарную цепь и для реакции замещения.

С другой стороны, термин изотермическая означает, что температура реакции для каждой стадии неизменна, и каждую стадию проводят при существенно постоянной температуре. Естественно, что в обоих случаях выбирают температуру так, чтобы оптимизировать условия реакции.

Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является то, что способ не требует повышения и понижения температуры во время синтеза нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу изотермического синтеза нуклеиновой кислоты. Во многих известных способах амплификации нуклеиновых кислот требуется повышение и понижение температуры для диссоциации мишени от синтезированной цепи. Такие способы требуют специального оборудования для указанной цели, такого как термоциклер. Однако способ настоящего изобретения можно проводить с использованием только оборудования, позволяющего поддерживать постоянную температуру. Как описано выше, способ настоящего изобретения можно осуществлять при одной температуре. Предпочтительно, его осуществляют, выбирая температуру реакции и уровень строгости такими, чтобы уменьшить неспецифический отжиг праймера, и такими, чтобы праймер специфически отжигался к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, способ настоящего изобретения можно осуществить в условиях высокой температуры, используя термостойкий фермент, как описано выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ настоящего изобретения при соответствующей температуре для поддержания активности используемого фермента для того, чтобы сохранить эффективность реакции на высоком уровне. Таким образом, температура реакции предпочтительно составляет от примерно 20 до примерно 80°С, предпочтительнее - от примерно 30 до примерно 75°С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70°С, хотя она

- 22 007414 изменяется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию проводят, в частности, в высокотемпературных условиях, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем в случае реакции при нормальной температуре. Последовательность и длину праймера, соответствующие температуре реакции, можно определить, например, в соответствии с величиной его температуры плавления Тт. С другой стороны, для создания праймера можно использовать коммерчески доступное программное обеспечение, такое как программа ОЬЮО™ Рйтег Лиа1у515 (Такага δΐιιιζο). Например, когда используют температуру реакции 55-60°С или 65°С, праймер, используемый для способа настоящего изобретения, может иметь, например, без ограничений, длину 12-100 нуклеотидов, предпочтительно длину 14-50 нуклеотидов, предпочтительнее длину 15-40 нуклеотидов. Примером влияния, привносимого повышенной температурой реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры ДНК, используемой как матрица. Повышенная температура реакции создает возможность амплификации нужной нуклеиновой кислоты даже в том случае, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с высоким содержанием СС. Кроме того, она также эффективна при амплификации участка с большой длиной цепи. Такое действие наблюдают в интервале от примерно 60 п.о. до примерно 20 т.п.о., конкретно - от примерно 110 п.о. до примерно 4,3 т.п.о., конкретнее - от примерно 130 п.о. до примерно 1500 п.о.

Эффективность амплификации можно повысить путем подбора температуры реакции в соответствии с содержанием СС в нуклеиновой кислоте, служащей матрицей. Например, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с низким содержанием СС, реакцию амплификации по настоящему изобретению можно проводить при 50-55°С, хотя температура зависит от длины амплифицируемой цепи и величины Тт праймера.

Использование ДНК-полимеразы с обратно-транскриптазной активностью (например, ДНКполимеразы ВсаВЕЗТ) в способе настоящего изобретения может сделать удобным проведение амплификации нуклеиновой кислоты, начиная с РНК, включающее стадию получения кДНК из РНК (реакция обратной транскрипции). В качестве альтернативы продукт, полученный путем независимого проведения стадии получения кДНК из РНК, т. е., кДНК, можно использовать в способе настоящего изобретения в качестве ДНК, служащей матрицей.

В каждом случае реакцию в способе настоящего изобретения проводят до остановки ее подходящим способом, например, путем инактивации фермента или путем снижения температуры реакции, или до тех пор, пока реакционная смесь не истощится по одному из субстратов.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для различных экспериментальных процедур, в которых используют амплификацию нуклеиновых кислот, включая детекцию, мечение и секвенирование нуклеиновой кислоты.

Кроме того, способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты ίη 81Щ, способа амплификации нуклеиновой кислоты на твердой подложке, такой как ДНК-чип, или метода мультиплексной амплификации нуклеиновых кислот, при котором одновременно амплифицируют несколько фрагментов.

Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является возможность получения одноцепочечной ДНК. В способе для указанной цели можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера. Например, если используют два химерных олигонуклеотидных праймера, способ настоящего изобретения можно осуществлять, используя соотношение праймеров, подобное тому, что используется в так называемой асимметричной ПЦР, при которой реакция амплификации осуществляется с использованием избыточного количества одного олигонуклеотидного праймера относительно другого. Отношение праймеров находится, без ограничений, предпочтительно в интервале от 1:10 до 1:500, предпочтительнее - в интервале от 1:10 до 1:100. В результате количество продукта замещения одной цепи становится избыточным относительно продукта другой цепи.

По способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить одноцепочечную ДНК, в значительной мере свободную от комплементарной ей цепи. Например, можно легко получить за короткий промежуток времени одноцепочечную ДНК для получения материала с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, такого как ДНК-чип, одноцепочечную ДНК-зонд для детекции нуклеиновой кислоты-мишени или мегапраймер для длинной ПЦР. С использованием способа настоящего изобретения можно селективно амплифицировать только смысловую или антисмысловую последовательность. Таким образом, настоящее изобретение также может быть использовано как способ получения нуклеиновой кислоты со смысловой последовательностью или с антисмысловой последовательностью.

Участок нуклеиновой кислоты, представляющий интерес, можно амплифицировать даже из следового количества нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, путем осуществления способа настоящего изобретения в буфере с бицином, Трицином, НЕРЕ8, фосфатом или Трис.

Кроме того, способы амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения не требуют специального оборудования для реакции, которое может регулировать температуру по времени. Поэтому реакцию амплификации можно проводить в большом объеме реакционной смеси. Таким образом, можно промышленно получать нуклеиновую кислоту (например, для применения в медицине) в больших количествах.

- 23 007414

Эффективность использования праймера в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем эффективность при обычном способе, таком как ПЦР.

Способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить продукт амплификации с высоким соответствием нуклеотидной последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Когда подтверждали частоту ошибок при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения путем анализа нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации, частота ошибок, обнаруженная в продуктах амплификации, полученных по способу настоящего изобретения, была эквивалента частоте ошибок при ЬА-РСЯ, которая, как известно, позволяет амплифицировать нуклеиновую кислоту с высокой точностью. Иными словами, способ настоящего изобретения имеет точность, эквивалентную таковой при ЬА-РСЯ.

(6) Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения и набор для такого способа.

Нуклеиновую кислоту-мишень в образце можно обнаружить, используя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Способ детекции включает:

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, как описано выше; и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, полученной на указанной выше стадии.

На указанной выше стадии (а), если в качестве матрицы используют РНК, реакцию обратной транскрипции и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно проводить в одну стадию. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, в качестве сочетания обратной транскриптазы и ДНКполимеразы с активностью замещения цепи можно предпочтительно использовать, например, сочетание обратной транскриптазы АМУ, обратной транскриптазы ММЬУ или обратной транскриптазы ЯАУ-2 и Вса ДНК-полимеразы.

Способ можно использовать для детекции или количественного определения гена в образце. Иными словами, конкретный ген можно обнаружить или определить количественно во всех образцах, где предполагается наличие нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых можно обнаружить конкретный ген или определить его количественно, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов), и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Например, вироиды, вирусы, грибы, бактерии или другие микроорганизмы в образце можно обнаружить или определить количественно на основании присутствия или содержания в специфического гена, происходящего из таких микроорганизмов и являющегося мишенью. В частности, способ детекции патогенных микроорганизмов может быть использован в областях санитарии и охраны окружающей среды. Кроме того, способ настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы отличить генотип организма или определить уровень экспрессии гена. В частности, детекция или подтверждение уровня экспрессии гена, связанного с заболеванием, например, гена, связанного с появлением признаков злокачественности клеток, может быть использовано в области медицины. При детекции в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей можно предпочтительно использовать как РНК, так и ДНК.

Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению можно использовать для того, чтобы распознавать отличие в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислотымишени. В таком аспекте используемый химерный олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы 3'-концевая часть праймера располагалась вблизи специфического распознаваемого основания нуклеотидной последовательности-мишени. Например, его конструируют так, чтобы между основанием и 3'концевым основанием праймера образовывалась водородная связь. Если имеет место мисматч между нуклеотидной последовательностью 3'-концевой части праймера и нуклеотидной последовательностью матрицы, амплификации нуклеиновой кислоты-мишени не происходит, и продукт амплификации с использованием в реакции амплификации вышеуказанного химерного олигонуклеотидного праймера не образуется. С использованием способа можно получить информацию о специфическом основании в гене, такую как информация о точечной мутация или однонуклеотизном полиморфизме (8ΝΓ).

Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению можно осуществить путем амплификации нуклеиновой кислоты-мишени непосредственно из образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В таком случае длина цепи амплифицируемой нуклеиновой кислоты-мишени на ограничивается определенной длиной. Например, для чувствительной детекции нуклеиновой кислоты-мишени эффективен участок в 200 п.о. или короче, предпочтительно - в 150 п.о. или короче. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в образце с высокой чувствительностью, сконструировав химерные олигонуклеотидные праймеры по настоящему изобретению для того, чтобы в результате получить длину

- 24 007414 амплифицируемой цепи, указанную выше.

Кроме того, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить с большей чувствительностью даже из следового количества образца нуклеиновой кислоты способом детекции по настоящему изобретению с использованием реакционного буфера, содержащего бицин, Трицин, НЕРЕЗ, фосфат или Трис в качестве буферного компонента, и раствора для отжига, содержащего спермидин или пропилендиамин, приведенные в качестве примеров выше в (4). В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНКполимераза не ограничиваются какими-либо конкретными. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик и ДНКполимеразы ВсаВЕЗТ. Полагают, что предпочтительное количество единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы может меняться в зависимости от типа ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подобрать, используя в качестве показателя повышение чувствительности детекции или количество продукта амплификации.

В способе детекции настоящего изобретения во время амплификации нуклеиновой кислотымишени в качестве субстрата можно вводить 6ИТР. Таким образом, если в качестве субстрата используют 6ИТР, возможно предотвратить контаминацию продуктами амплификации за счет разрушения продуктов амплификации с использованием урацил-Ы-гликозилазы (ϋΝΟ).

Для стадии (Ь) можно использовать известные способы детекции нуклеиновой кислоты. Примерами таких способов являются детекция продукта реакции, имеющего специфический размер, методом электрофореза и детекция путем гибридизации с зондом. Кроме того, можно предпочтительно применять способ детекции, сочетающий использование магнитных бус. При детекции методом электрофореза, как правило, используют флуоресцирующее вещество, такое как бромистый этидий. Гибридизацию с зондом можно сочетать с детекцией методом электрофореза. Зонд может быть мечен радиоизотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование меченого олигонуклеотида на стадии (а) может облегчить детекцию продукта амплификации, в который включен меченый нуклеотид, или, используя метку, можно усилить сигнал для детекции. Также можно использовать для детекции метод поляризации флуоресценции, метод переноса энергии флуоресценции или подобный метод. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить автоматизированным способом или определить количественно, сконструировав подходящую систему детекции. Кроме того, можно предпочтительно использовать детекцию невооруженным глазом с помощью метода гибридной хроматографии.

В способе детекции настоящего изобретения можно использовать рибонуклеотидный (РНК) зонд, меченный двумя или большим числом пространственно разнесенных флуоресцирующих веществ, что приводит к состоянию тушения. Зонд не дает флуоресценции. Когда его отжигают с ДНК, амплифицированной с нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарной зонду, РНКаза Н расщепляет зонд. В результате увеличивается расстояние между флуоресцирующими веществами на зонде, что приводит к появлению флуоресценции. Таким образом, испускание обнаруживает присутствие нуклеиновой кислотымишени. Если в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения используют РНКазу Н, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить путем одного лишь добавления зонда в реакционную смесь. Например, для мечения зонда можно предпочтительно использовать сочетание флуоресцирующих веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-ЕАМ) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-б-карбоксиродамина (ТАМКА).

Настоящее изобретение также предусматривает зонд, используемый в вышеописанном способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Зонд настоящего изобретения на ограничивается каким-либо конкретным зондом до тех пор, пока он в нормальных условиях гибридизации может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, амплифицированной способом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Имея ввиду специфическую детекцию продукта амплификации, предпочтителен зонд, гибридизующийся в условиях, например, известных специалистам в данной области техники как строгие. Строгие условия гибридизации описываются, например, в Т. Машайк е1 а1., (ебк.), Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2и6 еб., 1989, Со16 Зргшд НагЬог БайогаЮгу. Конкретно, примером строгих условий являются следующие условия: инкубация при температуре примерно на 25°С ниже Тт используемого зонда на протяжении от 4 ч до ночи в 6 х 88С (1 х 88С: 0,15 М №С1, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0), содержащем 0,5% додецилсульфат натрия (8Ό8), 5 х раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин (ВЗА), 0,1% поливинилпирролидон, 0,1% фиколл 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Зонд с меткой, описанный выше, можно использовать в качестве зонда для облегчения детекции нуклеиновой кислоты-мишени.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует применения оборудования, такого как термоциклер. Число праймеров, используемых в способе амплификации настоящего изобретения, может равняться одному или двум, что меньше, чем число праймеров, используемых в обычном способе. Так как реагенты, такие как όΝΊ^, используемый для ПЦР и подобных способов, можно применять в способе настоящего изобретения, эксплуатационные расходы могут быть уменьшены по сравнению с обычным способом. Таким образом, способ настоящего изобретения можно использовать предпочтительно, например, в области генетических анализов, при ко

- 25 007414 торых обычно проводят детекцию. Способ настоящего изобретения дает большее количество продукта амплификации за более короткий промежуток времени, чем ПЦР. Поэтому способ настоящего изобретения можно использовать как удобный, быстрый и чувствительный способ детекции гена.

При генетическом анализе на геномном уровне предпринимаются попытки сделать реакционную систему небольшой и повысить степень интеграции для того, чтобы анализировать большое количество нуклеотидных последовательностей. Была разработана система для указанной цели с использованием новейших сверхтонких технологий производства, в которой основные процессы для геномного анализа (например, экстракция ДНК из клеток, реакция амплификации ДНК, электрофорез, гибридизация, обнаружение ДНК, представляющей интерес, и т.п.) интегрированы на микрочипе размером от нескольких квадратных сантиметров до кончика пальца. Такая система называется микрочипом или наночипом.

В настоящее время рассматривается использование ПЦР в системе в качестве реакции для амплификации гена. Однако, так как для ПЦР требуются средства для повторяющегося регулирования температуры с ее повышением и понижением во времени, система становится сложной. Напротив, так как систему можно упростить, используя способ настоящего изобретения, по которому можно амплифицировать нуклеиновую кислоту в изотермических условиях, такой способ является вполне подходящим для использования в интегрированной системе, описанной выше. Высокоинтегрированную систему можно сконструировать, используя методы настоящего изобретения.

(7) Набор настоящего изобретения.

Настоящее изобретения предусматривает набор, используемый для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанного выше. В одном из вариантов воплощения набор находится в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся применения ДНКполимеразы и эндонуклеазы в реакции замещения цепи. Также для способа настоящего изобретения предпочтительно использовать набор, содержащий ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи, эндонуклеазу и буфер для реакции замещения цепи. В качестве альтернативы можно выбрать коммерчески доступную ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи и/или эндонуклеазу и использовать согласно инструкциям. Кроме того, набор может содержать реагент для реакции обратной транскрипции, который используют, когда в качестве матрицы используют РНК. ДНК-полимеразу можно выбрать из числа ДНК-полимераз, используемых в настоящем изобретении, описанных выше в (З). Эндонуклеазу можно выбрать из числа эндонуклеаз, описанных выше в (2). Реакционный буфер, имеющий состав, описанный выше в (4), можно предпочтительно использовать в качестве буфера для реакции замещения цепи.

Инструкции представляют собой отпечатанный материал, где описывается способ применения набора, например, способ получения раствора реагентов для реакции замещения цепи, рекомендуемые условия реакций и т.п. Инструкции включают руководство по использованию в форме проспекта или листовки, этикетку, наклеенную на набор, и описание на поверхности упаковки, содержащей набор. Инструкции также включают сведения, доступные или предоставляемые через электронные средства передачи данных, такие как Интернет.

Набор настоящего изобретения также может содержать реакционный буфер, содержащий в качестве буферного компонента бицин, Трицин, НЕРЕ8, фосфат или Трис, и раствор для отжига, примеры которого приводятся выше в (4). Кроме того, он может содержать ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, и РНКазу Н. Кроме того, набор может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата.

Набор, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени, также может содержать, кроме инструкций и реагентов для амплификации, описанных выше, соответствующий химерный олигонуклеотидный праймер для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и реагент для детекции амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени, такой как зонд.

Кроме того, наборы настоящего изобретения включают набор, содержащий химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, и/или зонд настоящего изобретения, описанные выше.

(8) Композиция настоящего изобретения.

Настоящее изобретение предусматривает композицию, используемую в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения или способе детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанных выше. Например, композиция может содержать эндонуклеазу, описанную выше в (2), и ДНК-полимеразу, описанную выше в (З). Композиция также может содержать буферный компонент, магниевую соль, б№ГР и т.п., как компоненты для проведения реакции амплификации. Кроме того, он может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата. Вещества, описанные выше в (4), можно использовать в качестве буферного компонента и других добавок.

В особенно предпочтительном аспекте композиция может содержать подходящие количества различных компонентов, как перечислено выше для способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Реакцию амплификации можно проводить, добавив в композицию лишь соответствующие матрицу и химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) праймер(ы). Если амплифицируемый объект зара

- 26 007414 нее известен, композиция предпочтительно содержит химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) праймер(ы), пригодные для амплификации такого объекта.

(9) Материал настоящего изобретения с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, нанесенной в виде матрицы в заранее определенном участке, и способ его получения.

ДНК-чип (также называемый ДНК-микроматрицей или ДНК-матрицей) представляет собой материал с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором различные фрагменты генов или ДНК нанесены в виде матрицы и иммобилизованы на твердой подложке, такой как предметное стекло, в заранее определенном участке или в заранее определенном положении. ДНК-чип используют для проверки наличия нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновой кислоты с последовательностью, комплементарной ДНК, нанесенной и иммобилизованной в заранее определенном участке ДНК-чипа. Проверку осуществляют, приводя ДНК-чип в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, полученной из образца, предпочтительно образцом меченной нуклеиновой кислоты для гибридизации. Так как ДНК-чип можно использовать для детекции или количественного определения в образце в одной процедуре нескольких нуклеиновых кислот, он является очень полезным средством, существенно ускоряющим анализ экспрессии генов или анализ мутаций или полиморфизма. ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована двухцепочечная нуклеиновая кислота, используют в гибридизации после того, как его подвергли соответствующей денатурации. ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, комплементарная детектируемой нуклеиновой кислоте, особенно предпочтителен для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени.

Как описано выше, нужную ДНК по способу настоящего изобретения можно амплифицировать в одноцепочечной форме. Хотя можно использовать любой способ очистки продукта амплификации, предпочтительна очистка с использованием осаждения изопропанолом. Полученную таким образом ДНК, предпочтительно одноцепочечную ДНК, в значительной мере свободную от комплементарной цепи, можно предпочтительно использовать в качестве фрагмента ДНК для иммобилизации на ДНК-чипе. Таким образом, способ настоящего изобретения предпочтительно используют как способ получения ДНК для нанесения и иммобилизации в заранее определенном участке для получения ДНК-чипа. Можно использовать любой нерастворимый субстрат в качестве подложки, на которой в заранее определенном участке наносят в виде матрицы и иммобилизуют полученную таким образом ДНК, но предпочтительно используют подложку в форме пластины, изготовленной из стекла или пластмассы, и подложку в форме мембраны, изготовленной из нитроцеллюлозы или нейлона. Для иммобилизации нуклеиновой кислоты можно использовать известный способ иммобилизации. ДНК можно иммобилизовать непосредственно на подложке. В качестве альтернативы ДНК можно иммобилизовать через подходящий линкер или после лигирования нескольких молекул ДНК. Кроме того, так как по способу настоящего изобретения в амплифицированную нуклеиновую кислоту можно ввести модифицированный дезоксирибонуклеотид, материал, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, можно получить, используя модифицирующую группу.

Нуклеиновую кислоту-мишень, гибридизующуюся с нуклеиновой кислотой на материале с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована ДНК, амплифицированная по способу настоящего изобретения (например, ДНК-чипе), можно обнаружить или определить количественно. Такую детекцию или количественное определение можно осуществить путем приведения материала в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из образца, предположительно содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, с целью гибридизации. Из таких материалов ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, амплифицированная по способу настоящего изобретения, позволяет осуществить детекцию нуклеиновой кислоты удобнее, с более высокой чувствительностью и лучшей воспроизводимостью, по сравнению с обычными материалами.

(10) Способ настоящего изобретения получения нуклеиновой кислоты в больших количествах.

Как описано выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, который можно осуществить в изотермических условиях. Нужную нуклеиновую кислоту можно получить, смешивая нуклеиновую кислоту, служащую матрицей для получения амплифицированной нуклеиновой кислоты, и различные компоненты, необходимые для реакции, и проведения реакции в смеси в изотермических условиях. Так как для ПЦР требуется изменение температуры реакционной смеси во времени, реакционный объем ограничивается объемом, в котором можно регулировать температуру (как правило, 200 мкл или менее). Поэтому объем трудно увеличить. С другой стороны, в способе настоящего изобретения такого ограничения не имеется. Можно получить большое количество нуклеиновой кислоты, увеличивая объем реакционной смеси. В способе настоящего изобретения объем составляет, например, предпочтительно более 200 мкл, предпочтительнее - 300 мкл или более, и наиболее предпочтительно - 500 мкл или более, хотя такой объем не предназначен для ограничения настоящего изобретения. В способе настоящего изобретения из одной матричной молекулы синтезируют несколько молекул комплементарной цепи. Кроме того, нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием этих молекул комплементарной цепи в качестве матриц. Таким образом, нужную нуклеиновую кислоту можно эффективно получить в больших количествах, выбрав соответствующим образом матри

- 27 007414 цу и праймер. Кроме того, тот факт, что, в отличие от ПЦР, способ настоящего изобретения не требует специального оборудования или сложного изменения температуры, делает его выгодным с точки зрения стоимости оборудования и энергии. Следовательно, способ является превосходным промышленным способом получения нуклеиновых кислот в больших количествах.

Нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, можно амплифицировать или получать даже из следового количества нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по способу получения настоящего изобретения, используя буфер для реакции и раствор для отжига, примеры которых приводятся выше в (4). В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНК-полимераза не ограничиваются какими-то конкретными вариантами. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из ЕзсйепсЫа со11 и ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т. Полагают, что предпочтительные количества единиц активности эндонуклеаза и ДНК-полимераза могут меняться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подбирать, ориентируясь в качестве показателя на максимальное количество продукта амплификации.

Кроме того, способ настоящего изобретения полезен как способ получения в больших количествах различных фрагментов ДНК, таких как фрагменты для иммобилизации на ДНК-чипе. Конкретно, в одном из вариантов воплощения фрагменты ДНК можно получить в больших количествах с помощью простых реакционных стадий. В другом варианте воплощения для получения различных фрагментов ДНК можно использовать ограниченное число праймеров. В последний вариант воплощения можно включить предварительную стадию амплификации нуклеиновой кислоты, служащей в качестве матрицы в способе настоящего изобретения, известным способом амплификации нуклеиновой кислоты, таким как ПЦР. Все виды нуклеиновых кислот, служащих матрицами, можно амплифицировать с использованием ограниченного числа праймеров, например, на основе способа амплификации нуклеиновой кислоты с использованием случайного праймера с 1ад-последовательностью (Ыис1е1с АсИз Везеатсй, 24(19):3778-3783 (1996)) или ПЦР с вырожденным олигонуклеотидом в качестве затравки (ΌΟΡ-РСР: Сепопйсз. 13:718725 (1992)), где используют вырожденный праймер. Способ амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно осуществить с использованием на вышеуказанной стадии одного или нескольких праймеров для всех нуклеиновых кислот, служащих матрицами. Это можно осуществить путем конструирования такого праймера, используемого в способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения, который соответствует 1ад-последовательности, добавляемой к случайному или вырожденному праймеру. Таким образом, сочетание подходящей стадии подготовки нуклеиновой кислоты для использования как матрицы и способа настоящего изобретения может обеспечить получение различных фрагментов ДНК в больших количествах и при более низкой стоимости по сравнению с обычным способом.

Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать двухцепочечную ДНК для экспрессии полезного полипептида в клетке или одноцепочечную антисмысловую ДНК для подавления экспрессии гена, представляющего интерес. Такую нуклеиновую кислоту вводят в организм с использованием подходящих средств доставки, например, носителя для переноса генов, такого как липосома. Способ получения нуклеиновой кислоты настоящего изобретения предпочтителен для получения одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты в больших количествах для медицинского применения. Кроме того, способом настоящего изобретения легко получить нуклеиновую кислоту, содержащую аналог 6ΝΤΡ, который, например, подавляет разрушение нуклеиновой кислоты ίη νΐνο.

Так как фрагмент ДНК, амплифицированный по настоящему изобретению, состоит из обычных нуклеотидов, амплифицированную ДНК можно, например, субклонировать в подходящий вектор с использованием сайта рестрикционного фермента в ДНК. Кроме того, ДНК можно без сложностей обработать рестрикционным ферментом, например, для КЕЬР. Следовательно, ДНК можно широко использовать в области генетического анализа. Кроме того, в амплифицированный фрагмент можно ввести промоторную последовательность для РНК-полимеразы. Амплифицированный фрагмент можно использовать в качестве матрицы для синтеза РНК, которую можно использовать, например, как зонд. Безусловно, можно получить ДНК-зонд, меченный флуоресцирующим веществом, осуществляя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием меченного флуоресцентной меткой 6ΝΤΡ вместо обычного 6ΝΤΡ.

Ниже перечисляются особенности способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

1. Можно амплифицировать большое количество нуклеиновой кислоты из небольшого количества матрицы. Количество продукта амплификации возрастает квадратично при использовании двух праймеров.

2. Способ можно осуществлять изотермически. В таком случае не требуется использования такого оборудования, как термоциклер. Поэтому можно легко увеличить реакционный объем.

3. Как правило, реакцию амплификации проводят с использованием одного или двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух ферментов (ДНК-полимеразы и эндонуклеазы).

4. Так как с одной молекулы праймера синтезируется несколько цепей ДНК, количество праймера

- 28 007414 не ограничивает количество продукта амплификации. Кроме того, эффективность использования праймера близка к 100%, что значительно выше, чем эффективность ПЦР.

5. Можно селективно амплифицировать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, в зависимости от цели.

6. Так как для реакции амплификации не требуется аналог άΝΤΡ, такой как (α-δ)-άΝΤΡ, стоимость реагентов низкая. Кроме того, можно получить нуклеиновую кислоту в естественной форме, не содержащую аналога άΝΤΡ.

7. Можно получать амплифицированный фрагмент ДНК с низкой стоимостью в больших количествах, комбинируя способ настоящего изобретения с другим способом дупликации нуклеиновой кислоты.

8. Способ детекции настоящего изобретения имеет равную или более высокую чувствительность детекции по сравнению с обычным способом. Способ детекции настоящего изобретения можно осуществить с равной чувствительностью за более короткий промежуток времени, чем тот, который требуется для обычного способа.

9. Способ подходит для амплификации нуклеиновой кислоты, автоматизированной детекции, детекции малого количества и высокоинтегрированной детекции на микрочипе или наночипе.

Как описано выше, способ настоящего изобретения подходит для детекции генов и промышленного получения нуклеиновой кислоты.

Примеры

Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение подробнее, но не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Ссылочный пример 1. Получение РНКазы Н из термофила ВасШик саИо1епах.

ВасШик саШо1епах ΥΤ-0 (приобретенную у БеШксНе 8итт1ипд уоп МШгоогдатктеп; Ό8Μ406) инокулировали в 100 мл среды, содержащей 0,2% триптона (Бг£со ЬаЬогаЮпек) и 1,5% дрожжевого экстракта (БИсо ЬаЬогаЮпек) (рН 6,5), культивировали при 60°С в течение 140 мин при встряхивании и использовали в качестве стартовой культуры. Стартовую культуру (З0 мл) инокулируют в З л среды того же состава и культивируют при температуре 60°С в течение 5 ч с аэрацией 2,5 л/мин и при перемешивании при 250 об/мин.

Клетки собирают путем центрифугирования культуры при 5000 х д в течение 15 мин. Клетки (402 г, масса во влажном состоянии) суспендируют в 1000 мл 50 мМ Трис-НС1 буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ меркаптоэтанол, 0,5 М №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мкМ ΡΑΡΜ8Τ, и разрушают с использованием ΜΙΝΙЬаЬ (ΑΡν ΟΑυΜΝ/ ΡΑΝΝΙΞ). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием для получения супернатанта.

К полученному супернатанту добавляют раствор полиэтиленимина до конечной концентрации 0,1%. После перемешивания смесь оставляют на 1 ч. Затем супернатант извлекают центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения. Осадок, полученный центрифугированием, растворяют в 20 мл Трис-НС1 буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ меркаптоэтанол, 0,11 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Раствор диализуют против такого же буфера. Диализованный образец наносят на 280-мл колонку с БЕ52 (^На1тап), уравновешенную тем же буфером, и собирают фракции несвязавшегося материала.

Затем колонку промывают 420 мл буфера, используемого для уравновешивания, и собирают вымывающиеся фракции. Несвязавшиеся фракции и фракции, вымытые при колоночной хроматографии на БЕ52, смешивают вместе и наносят на 240-мл колонку с Р-11 (^На1тап), уравновешенную 20 мМ ТрисНС1 буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Затем осуществляют элюирование с использованием буфера для уравновешивания, содержащего 0-0,5 М №С1. Полученные активные фракции помещают в мешок для диализа. Мешок помещают на твердый полиэтиленгликоль 20000 при 4°С для дегидратации-концентрирования. Затем концентрат фермента наносят на З00-мл колонку с 8иреШех 0-200 (ЛтегкНат Ρ1ι;·ιπη;κί;·ι Вю(есН), уравновешенную 25 мМ ТрисНС1 буфером (рН 7,5), содержащим 5 мМ меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, З0 М №1С1 и 50% глицерин. Осуществляют элюирование буфером, используемым для уравновешивания, для получения активных фракций. Активные фракции наносят на 15-мл колонку с гепарин-Сефарозой (ЛтегкНат Ρ1ι;·ιπη;κί;·ι Вю(есН), уравновешенную 20 мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Элюирование осуществляют буфером, используемым для уравновешивания, содержащим 0-0,5 М №С1.

Полученные активные фракции наносят на 5-мл колонку с ННгар-δΡ (ЛтегкНат ЕНагтааа Вю(есН), уравновешенную 20 мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Элюирование осуществляют буфером, используемым для уравновешивания, содержащим 0-0,5 М КаС1. Полученные активные фракции снова наносят на З00-мл колонку с 8иреШех 0-200 (ЛтегкНат ЕНагтааа Вю(есН), уравновешенную 25 мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 5 мМ меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, З0 М №1С1 и 50% глицерин. Полученные активные фракции используют в качестве препарата РНКазы Н (раствор фермента).

Активность термостойкой РНКазы Н измеряют следующим образом.

В 1 мл 40 мМ Трис-НС1 (рН 7,7), содержащем 1 мМ ЭДТА, растворяют 1 мг поли(гА) или поли(АТ)

- 29 007414 (оба препарата от Αιι-κιέΙ-ιι!! РНагтааа Вю(:есй), и получают раствор поли(гА) и раствор поли(бТ).

Затем добавляют раствор поли(гА) (до конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(бТ) (до конечной концентрации 30 мкг/мл) к 40 мМ Трис-НС1 буферу (рН 7,7), содержащему 4 мМ МдС1₂, 1 мМ ОТТ, 0,003% Β8Α и 4% глицерин. Смеси дают реагировать при 37°С в течение 10 мин и затем охлаждают до 4°С для получения раствора поли(гА)-поли(бТ).

К 100 мкл раствора поли(гА)-поли(бТ) добавляют 1 мкл раствора фермента. Смеси дают реагировать при 40°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА, полученной смеси дают реагировать при 40°С в течение 10 мин, и затем измеряют поглощение. Получают величину (разница в поглощении), вычитая поглощение в случае контроля из поглощения в случае реакции в отсутствии ЭДТА. Таким образом, на основании разницы в поглощении определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(гА)-поли(бТ) в ходе ферментативной реакции. Одна единица РНКазы Н определяется как количество фермента, увеличивающее А₂₆₀, соответствующее высвобождению 1 нмоль рибонуклеотида за 10 мин, вычисленное согласно уравнению, приведенному далее. Если используют разбавленный раствор фермента, величину, полученную с использованием уравнения, приведенного далее, корректируют с учетом степени разбавления.

Единица = [разница в поглощении х реакционный объем (мл)]/0,0152

Ссылочный пример 2. Клонирование гена РНКазы НИ из ВасШик са1бо(епах.

(1) Получение геномной ДНК из ВасШик са1бо(епах.

ВасШик са1бо(епах УТ-6 (Ό8Μ406) инокулируют в 60 мл среды ЬВ (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,5% ЫаС1, рН 7,2) и культивируют при 65°С в течение 20 ч. После культивирования культуру центрифугируют, и собирают клетки. Клетки суспендируют в 2 мл 25% сахарозы и 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к суспензии 0,2 мл раствора 10 мг/мл хлорида лизоцима (Ыаса1а1 Текцие) в воде. Смеси дают реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 12 мл смеси, содержащей 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 0,1 мл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 8Нихо) и 1 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч.

Затем к смеси добавляют 2,1 мл 5 М раствора ЫаС1 и 2 мл раствора СТАВ-ИаО [10% бромида цетилтриметиламмония (Ыаса1а1 Текцие) и 0,7 М ЫаС1], и полученную смесь тщательно перемешивают и инкубируют при 65°С в течение 10 мин. Добавляют к смеси равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1, об./об.). Полученную смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 10 мин при 10000 х д. После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют равный объем смеси фенола, насыщенного 100 мМ Трис-НС1 (рН 8,0) / хлороформа / изоамилового спирта (25:24:1, об./об.). Полученную смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 10 мин при 10000 х д. После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют 0,6 объема 2-пропанола. Полученный волокнистый осадок вытягивают с использованием стеклянной палочки, промывают 70% этанолом в воде, сушат на воздухе и затем растворяют в 0,5 мл буфера ТЕ, и получают раствор геномной ДНК.

(2) Клонирование средней части гена РНКазы.

Синтезируют олигонуклеотиды Вки11-3 и Вки11-6, представленные 8ЕО ГО Ыо 1 и 2, на базе мотива I и мотива III - консервативных участков аминокислотных последовательностей РНКаз Н11 из различных организмов (ВюсйетщНу, 38:605-608 (1999).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 1 мкл раствора геномной ДНК ВасШик са1бо(епах, полученного так, как в ссылочном примере 2-(1), и 100 пмоль ВкиП-3 и 100 пмоль ВкиП-6 в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Тас.|полимеразу (Такага 81шхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 50 циклов 94°С в течение 30 с, 45°С в течение 30 с, и 72°С в течение 1 мин. После реакции реакционную смесь подвергают обработке фенолом с последующим осаждением этанолом для очистки ДНК. У полученной ДНК тупят концы с использованием ДНК-полимеразы фага Т4 (Такага 8йи7о), и затем подвергают ее электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,4 т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 0,4 т.п.о. с использованием ДНК-лигазы фага Т4 (Такага 811ихо) лигируют с плазмидой рИС119 (Такага 8йи7о), расщепленной 8та I (Такага 8Нихо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксНепсЫа сой ΙΜ109. Полученные трансформанты культивируют, и получают плазмиду 21-12, в которую встроена ДНК примерно в 0,4 т.п.о.

(3) Клонирование расположенной против хода транскрипции (ирк(геат) части гена РНКазы II.

Была определена нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента примерно в 0,4 т.п.о., полученного в ссылочном примере 2-(2). На базе установленной нуклеотидной последовательности синтезируют олигонуклеотиды ΡΝΠ-81 и ^N6-82, представленные 8ЕО ГО Ыо 3 и 4.

Геномную ДНК ВасШик са1бо(епах, полученную так, как в ссылочном примере 2-(1), расщепляют ВатН I (Такага 8Нихо) и лигируют с кассетой 8аи3ΑI (Такага 8Нихо) с использованием Т4 ДНК-лигазы. Процедуру осуществляют согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ш νί(ΐΌ ТаКаКа ΓΑ РСК (Такага 8йи7о), с использованием лигазной смеси в качестве матрицы, КЫН-82 в качестве

- 30 007414 праймера для первичной ПЦР и ΒΝΙΙ-81 в качестве праймера для вторичной ПЦР. ДНК выделяют из раствора после вторичной ПЦР экстракцией фенолом с последующим осаждением этанолом. У полученной ДНК тупят концы с использованием Т4 ДНК-полимеразы, и затем подвергают ее электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля амплифицированный фрагмент ДНК длиной примерно в 1,5 т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о. с использованием Т4 ДНК-лигазы лигируют с рИС119, расщепленной Зта I. Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйегкЫа сой 1М109.

Полученные трансформанты культивируют, и получают плазмиду Β25Ν16, в которую встроена ДНК примерно в 1,5 т.п.о.

(4) Клонирование полноразмерного гена РНКазы II.

Синтезируют олигонуклеотиды ΒΝΙΙ-85 и ΒΝΙΙ-86, представленные 8Еф ΙΌ Νο 5 и 6, на базе нуклеотидной последовательности встроенного фрагмента длиной около 0,4 т.п.о. в плазмиде 21-12, определенной, как описано в ссылочном примере 2-(3).

Осуществляют ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды 21-12, полученной так, как в ссылочном примере 2-(2), и ΒΝΙΙ-85 и ΒΝΙΙ-86 в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаВа Ех Тац-полимеразу (Такага δΐιιιζο) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 циклов 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, и 72°С в течение 30 с. После реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в агарозном геле. Из геля извлекают амплифицированный фрагмент ДНК размером около 0,3 т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 0,3 т.п.о. метят дигоксигенином с использованием ΌΙΟ Шдй-рпте (Восйе П1адио8Йс).

Осуществляют гибридизацию по Саузерну геномной ДНК ВасШик са1бопе1ах. полученной так, как в ссылочном примере 2-(1), после расщепления ΗίηάΙΙΙ (Такага 8йщо), 8аЛ (Такага 81и^о) или смеси ΗίηάΙΙΙ и 8аЛ с использованием меченной дигоксигенином ДНК в качестве зонда. Гибридизацию и детекцию осуществляют с использованием набора ΌΙΟ ЬиттексеШ Эе1ес11оп Кй (Воске П1адпо8Йс8) согласно приложенному к нему протоколу. В результате в гидролизатах, полученных с использованием ΗίηάΙΙΙ, 8аЛ и ΗίηάΙΙΙ и 5>асЕ с зондом гидридизуются фрагменты размером около 4,5 т.п.о., около 5,8 т.п.о. и около 1,3 т.п.о. соответственно.

На основании полученных результатов геномную ДНК ВасШик са1бопе1ах расщепляют ΗίηάΙΙΙ и подвергают электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля ДНК длиной около 4,5 т.п.о. Полученные фрагменты ДНК расщепляют 8аЛ и подвергают электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля ДНК длиной около 1,3 т.п.о. Полученные ДНК лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с рИС19 (Такага 8й^о), расщепленной ΗίηάΙΙΙ и 8асГ Лигазную смесь используют для трансформации ЕкскегкЫа сой ΗΒ101.

Полученные трансформанты переносят методом отпечатков на мембрану ИукоЮ-Мт^АтегкИат Ркагтас1а Вю1ес11). Затем осуществляют гибридизацию колоний с использованием вышеуказанного меченного дигоксигенином зонда согласно обычному способу. Из полученного таким образом положительного клона выделяют плазмиду ρΒΗΒ 1.

Затем определяют нуклеотидную последовательность ДНК, встроенной в ρΒΗΒ1. Из сравнения аминокислотной последовательности, предсказанной на основе нуклеотидной последовательности, с аминокислотной последовательностью РНКазы ΗΙΙ из Βηαΐΐιικ киЬННк следует, что в ДНК ρΒΗΒ1 вблизи инициирующего кодона отсутствует участок длиной около 40 п.о. Затем конструируют полноразмерный ген РНКазы Н следующим образом.

Β25Ν16, полученную так, как описывается в ссылочном примере 2-(3), расщепляют ΗίηάΙΙΙ и подвергают электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля фрагмент ДНК длиной около 160 п. о. Фрагмент ДНК около 160 п.о. с использованием Т4 ДНК-лигазы лигируют с ρΒΗΒΙ, расщепленной ΗίηάΙΙΙ. Лигазную смесь используют для трансформации ЕкскегкЫа сой ΗΒ101. Из полученных трансформантов выделяют плазмиды.

Затем синтезируют олигонуклеотид ΒΝΙΙ-Νάε, представленный 8Еф ΙΌ Ж 7, на базе предполагаемой нуклеотидной последовательности вблизи инициирующего кодона. ПЦР проводят с использованием в качестве матриц плазмид, выделенных из трансформантов, и ΒNII-Nάе и ΒΝΙΙ-86 в качестве праймеров. Плазмиду, из которой амплифицирован фрагмент размером примерно 0,7 т.п.о., отбирают и обозначают как ρΒΗΒ11.

Определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в полученную таким образом плазмиду ρΒΗΒ11. Анализ результатов выявляет открытую рамку считывания, предположительно кодирующую РНКазу НП. Эта нуклеотидная последовательность приведена в 8Еф ΙΌ Ж 8. Аминокислотная последовательность, предсказанная на основе нуклеотидной последовательности, показана в 8Еф ΙΌ Ж 9.

Штамм ЕкскегкЫа сой ΗΒ101, трансформированный плазмидой ρΒΗΒ11, обозначен и указывается как ЕкскегкЫа сой 1Μ109/ρΒΗΒ11, депонирован 5 сентября 2000 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов (Iηΐетаί^οηа1 Ра1егИ Огдаткт ^еρο8Йа^у, №101'131 ΙηκΙίΙιιΝ о£ Αάνаηсеά Ιηάιΐ8ΐπ;·ι1 Зскисе ηηά ТесктО^у, АКТ ТкикиЬа Секга1 6, 1-1, Ηφηκίιί 1скоте, Ткикика-кЫ, ΙΕ;·ιπι1<ί 305-8566), Япония, под инвентарным номером ΓΕΒΜ ΒΡ-7655.

(5) Экспрессия гена РНКазы НП ΒасШи8 са1άοΐеηаx.

- 31 007414

ЕзсйегкЫа со11 НВ101, трансформированную рЯНВ11 или рЯНВ1, инокулируют в 5 мл среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение ночи. После культивирования клетки, собранные центрифугирвоанием, суспендируют в 0,5 мл ТЕ-буфера и обрабатывают ультразвуком. Суспернатант, полученный центрифугированием, используют в качестве грубого клеточного экстракта.

Смешивают вместе 10 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ дитиотреитол (№са1а1 Тездие), 0,003% бычий сывороточный альбумин (фракция V, 81дта), 4% глицерин, 20 мкг/мл поли((бТ) (Атегзйат Ркагтас1а В1о!еск) и 30 мкг/мл поли(гА) (Атегзйат Ркагтааа Вюксй). Смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин и используют в качестве раствора субстрата для измерения активности РНКазы Н.

К 100 мкл раствора субстрата добавляют 1 мкл 1 М раствора МпС1₂. Смесь инкубируют при 40°С. К смеси для инициации реакции добавляют 10 мкл грубого клеточного экстракта, разведенного в 10 раз. После реакции при 40°С в течение 30 мин к смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА для прекращения реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В результате поглощение при 260 нм реакционной смеси, в которой используют грубый клеточный экстракт, полученный из ЕзскепсЫа со11 НВ 101, содержащей рЯНВ11, было явно выше, чем поглощение реакционной смеси, в которой используют грубый клеточный экстракт, полученный из ЕзсйегкЫа сой НВ101, содержащей рЯНВ1. Таким образом демонстрируется, что рЯНВ11 содержит ген РНКазы Н и что ЕзсйепсЫа со11 НВ101, несущая рЯНВ11, экспрессирует активность РНКазы.

(6) Получение очищенного препарата РНКазы Н11.

ЕзсйегкЫа со11 НВ101, трансформированную рЯНВ11, полученную в ссылочном примере 2-(4), инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 52,3 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают 50,0 мл прогретого супернатанта.

Раствор наносят на колонку ЯЕ8ОИЯСЕ О (Атегзйат Ркагтааа Вюксй), уравновешенную буфером С [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегзйат Р1агтас1а Вюксй). В результате РНКаза Н11 проскакивает через колонку ЯЕ8ОИЯСЕ О. Наносят 51 мл такой проскочившей через колонку РНКазы Н11 на колонку ЯЕ8ОИЯСЕ 8 (Атегзйат Ркагтааа Вюксй), уравновешенную буфером С, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при 240 мМ №С1. Наносят 3,0 мл фракции РНКазы Н11 в два приема на колонку с РБ-10 (Атегзйат Ркагтааа Вюксй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ №С1. Полученный элюат (7,0 мл) наносят на колонку с НГГгар-гепарином (Атегзйат Ркагтааа Вюксй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при приблизительно 310 мМ №С1. Концентрируют 4,4 мл фракции РНКазы Н11 путем ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Аткоп). Концентрат (280 мкл) подвергают гель-фильтрации на колонке с 8ирегбех 200 (Атегзйат Ркагташа Вюксй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате РНКаза Н11 элюируется в положении, соответствующем молекулярной массе в 35 кДа. Такая молекулярная масса соответствует РНКазе Н11 в мономерной форме. Элюированную таким образом РНКазу Н11 используют в качестве препарата Вса РНКазы Н11.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата Вса РНКазы Н11 измеряют следующим образом.

Реакционную смесь (100 мкл) [20 мМ НЕРЕ8-гидроксида калия (рН 7,8), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (Такага 8йи7о), 1% диметилсульфоксида, 10 мМ хлорида марганца, 20 мкг/мл поли(бТ) (АтегзЬат Ркагташа Вюксй), 30 мкг/мл поли(гА) (Атегзйат Ркагташа Вюксй)], икубированную при 40°С, добавляют к 1 мкл препарата Вса РНКазы Н11. Смеси дают прореагировать при 40°С в течение 10 мин. Затем реакцию останавливают, добавляя 10 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Затем измеряют поглощение при 260 нм.

В результате в препарате Вса РНКазы Н11 отмечают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 3. Клонирование гена РНКазы Н111 ВасШиз са1бо!епах (1) Клонирование фрагмента гена РНКазы НШ.

Праймеры для скрининга гена, кодирующего РНКазу Н111, ВзиН111-1, Взи111-3, Взи111-6 и Взи111-8, представленные 8Еф ΙΌ № 10-13, синтезируют на основе аминокислотных последовательностей участков, весьма консервативных среди ВасШиз зиЬ1Шз и других организмов, определенных на основе гомологии аминокислотных последовательностей РНКазы Н111 из ВасШиз зиЫШз [Вюсйет1з!гу, 38:605-608 (1999)] и других организмов.

Первую ПЦР осуществляют в объеме 50 мкл с использованием в качестве матрицы 200 нг геномной

- 32 007414

ДНК ВасШик са1йо!епах, полученной так, как описывается в ссылочном примере 2-(1), и 100 пмоль ВкиШ-1 и 100 пмоль ВкиШ-8 в качестве праймеров. Затем осуществляют вторую ПЦР в объеме 100 мкл с использованием 1 мкл реакционной смеси после первой стадии ПЦР в качестве матрицы и 100 пмоль ВкиШ-3 и 100 пмоль ВкиШ-6 в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для двух ПЦР используют ТаКаВа Тац-полимеразу (Такага 811ихо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 (первая ПЦР) или 30 (вторая ПЦР) циклов - 94°С в течение 30 с, 45°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин.

У амплифицированного фрагмента ДНК размером около 450 п.о. тупят концы с использованием Т4 ДНК-полимеразы (Такага ЗНихо), и затем его подвергают электрофрезу в агарозном геле, и извлекают амплифицированный фрагмент ДНК около 450 п.о. Фрагмент ДНК длиной около 450 п.о. лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с рИС119 (Такага ЗНихо), расщепленной 8та1 (Такага 81шхо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйепсЫа сой 1М109. Полученные трансформанты культивируют, и получают плазмиду рВСА3204, в которую встроен фрагмент ДНК длиной около 450 п.о.

(2) Клонирование гена РНКазы НШ с использованием метода гибридизации по Саузерну.

Определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в рВСА3204, полученную в ссылочном примере 3(1). На основе определенной нуклеотидной последовательности синтезируют праймеры ВЫШ-83 и ВсаВЫШ-3, представленные 8ЕО ГО Ыо 14 и 15. Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием ВЫШ-83 и ВсаВМШ-3 в качестве праймеров и рВСА3204 в качестве матрицы. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаВа Ζ-Тас] (Такага 8Нихо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 98°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 20 с. После реакции реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом, осаждению этанолом и электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля фрагмент ДНК длиной примерно 0,4 т.п.о. Фрагмент ДНК длиной около 0,4 т.п.о. метят с использованием набора ЭЮ ΩΝΛ ЬаЬейпд Кй (Воейппдег Маппйет), и получают зонд.

Геномную ДНК ВасШик са1йо!епах (10 мкг), полученную в ссылочном примере 2-(1), полностью расщепляют ВатШ, ЕсоВЕ НшйШ, РкЙ или ХЬа! (все от Такага 8Нихо). Затем половину каждого гидролизата подвергают электрофорезу в агарозном геле. ДНК из агарозного геля переносят на нейлоновую мембрану с использованием 0,4 N раствора гидроксида натрия и фиксируют при 120°С в течение 30 мин. Мембрану предварительно инкубируют при 60°С в течение 4 ч в запаянном мешке, содержащем 30 мл буфера для гибридизации [43,4 г/л хлорида натрия, 17,6 г/л цитрата натрия, 1% блокирующего вещества (Воейгшдег Маппйет), 0,1% Ν-лауроилсаркозина, 0,02% лаурилсульфата натрия (8Ό8)], и затем инкубируют при 60°С в течение 16 ч в запаянном мешке, содержащем 5 мл буфера для гибридизации, содержащем зонд.

Мембрану дважды промывают 50 мл 2 х 88С (17,5 г/л ЫаС1, 8,8 г/л цитрата натрия), содержащим 0,1% 8Ό8, при комнатной температуре и дважды 50 мл 0,5 х 88С (4,3 г/л хлорида натрия, 1,9 г/л цитрата натрия), содержащим 0,1% 8Ό8, при 45°С. Затем детектируют фрагмент ЕсоШ размером около 8 т.п.о., фрагмент РкЙ около 4,5 т.п.о. и фрагмент НтйШ около 1 т.п.о., имеющие последовательности, комплементарные зонду, с использованием набора для обнаружения нуклеиновых кислот ЭЮ (Воейлпдег Маппйет).

Оставшуюся половину геномной ДНК ВасШик са1йо!епах, полностью расщепленную РкЛ, подвергают электрофорезу в агарозном геле. Из геля извлекают фрагменты РкЛ размером около 4,5 т.п.о. Затем фрагменты ДНК лигируют с плазмидным вектором рТУ119Ы, расщепленным РкЙ и дефосфорилированным щелочной фосфатазой (Такага 8Нихо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйепсЫа сой 1М109.

Осуществляют ПЦР в объеме 50 мкл с использованием ВЫШ-83 и ВсаВЫШ-3 в качестве праймеров и одной из колоний в качестве матрицы, с целью отбора колонии, предположительно содержащей ген РНКазы НШ. Для ПЦР используют ТаКаВа-Ζ Тац-полимеразу (Такага 8Нихо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 98°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 20 с. В результате обнаруживают, что ген, представляющий интерес, содержится в колонии № 88.

Осуществляют ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды, выделенной из колонии № 88, и пары праймеров ΡΝ-Ν (Такага 8Нихо) и ВсаВЫШ-3 или пары праймеров М4 (Такага 8Нихо) и ВЫШ-83, для того, чтобы проверить, содержится или нет в плазмиде полный ген РНКазы НШ. В результате обнаруживают, что полный ген РНКазы НШ содержится в плазмиде, которую обозначают рВСА3Р88.

(3) Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК гена РНКазы НШ.

Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рВСА3Р88, полученную в ссылочном примере 3-(2), определяют дидезокси-методом.

Анализ определенной нуклеотидной последовательности показывает наличие открытой рамки считывания, кодирующей аминокислотную последовательность, содержащую Ν-концевую аминокислотную последовательность РНКазы НШ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания и аминокислотная последовательность РНКазы НШ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показаны в 8ЕО ГО № 16 и 8ЕО ГО № 17, соответственно.

- 33 007414 (4) Конструирование плазмиды для экспрессии РНКазы НШ.

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы плазмиды рВСАЗР88, описанной в ссылочном примере З-(2), праймера ВсаКМПШе, представленного 8ЕО ГО N 18, сконструированного с учетом последовательности вблизи вышеуказанной открытой рамки считывания для РНКазы НШ, и М1З-праймера М4 (Такага 811ихо). В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ДНК-полимеразу РугоЬек! (Такага 81шхо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: З0 циклов - 94°С в течение З0 с, 55°С в течение З0 с и 72°С в течение З мин. Амплифицированный фрагмент ДНК размером около 4 т.п.о. расщепляют NбеI (Такага 81ш/о) и подвергают электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля фрагмент ДНК около 1,4 т.п.о. Фрагмент ДНК длиной около 1,4 т.п.о. лигируют с рТУ119Ш (плазмида, в которой сайт Ν^ в рТУ119N превращен в сайт ШеЦ которая расщеплена NбеI и дефосфорилирована щелочной фосфатазой (Такага 8Ннхо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксНепсЫа сой 1М109.

Затем осуществляют ПЦР в объеме 50 мкл с использованием одной из колоний в качестве матрицы и ΚΝ-Ν (Такага 81шхо) и ВсаКННШ-З в качестве праймеров для скрининга плазмиды, в которой ген РНКазы НШ во фрагменте NбеI расположен по направлению транскрипции (бо^икбеат) от 1аспромотора в векторе рТУ119№. Затем отбирают колонию, предположительно содержащую ген РНКазы НШ. Для ПЦР в качестве ДНК-полимеразы используют ТаКаКа-Ζ Тад (Такага 8Ннхо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: З0 циклов - 98°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 20 с. В результате обнаруживают, что плазмиду, в которой ген РНКазы НШ во фрагменте NбеI расположен по направлению транскрипции от 1ас-промотора в векторе рТУ119Ν6, содержит колония № 2. Такую плазмиду обозначают рВСАЗ№2.

Определение дидезокси-методом нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду, показывает, что не имеется мутаций из-за ПЦР, за исключением того, что инициирующий кодон СТС заменяется на АТС.

Штамм Екс11епс1иа сой 1М109, трансформированный плазмидой рВСАЗ№2, был обозначен и указывается как Екс11епс1иа со11 1М109/ рВСАЗ№2, депонирован 5 сентября 2000г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (б'Иегпабошй Ра1еп1 Огдап1кт Оерокбагу, №1йопа1 ШкбШе о£ Абуапсеб Шбикбга! Заепсе апб Тесбпо1оду, АКТ ТкикиЬа Сеп1га1 6, 11, Н1дакЫ 1-сботе, ТкикиЬа-кЫ, ШагакЕкеп З05-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР765З.

(5) Получение очищенного препарата РНКазы НШ.

ЕксНепсЫа соб 1М109, трансформированную рВСАЗНб2, полученную в ссылочном примере З-(4), инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при З7°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в З9,6 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, нагревают при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают З9,8 мл прогретого супернатанта.

Прогретый супернатант наносят на колонку КЕЗОиКСЕ О (Атегкбат РНагтааа Вю1есб), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкбат РНагтааа Вю1ес11). В результате РНКаза НШ сходит с колонки КЕЗОиКСЕ О в свободном объеме.

Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы НШ (45 мл) диализуют против 2 л буфера В [50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА] в течение 2 ч. Диализ повторяют еще два раза в тех же условиях. Диализованный раствор фермента (55,8 мл) наносят на колонку КЕЗОИКСЕ О (Атегкбат РНагтааа Вю1есб), уравновешенную буфером В, и элюируют линейным градиентом №С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу НШ, элюированную при примерно 105 мМ №С1.

К 7,0 мл фракции добавляют буфер В, содержащий 1 М №С1, для получения концентрации №101 150 мМ. Смесь наносят на колонку с Н1Тгар-гепарином (Атегкбат Рбагтааа Вю1есб), уравновешенную буфером В, содержащим 150 мМ №С1. В результате РНКаза НШ сходит с колонки с ШТгар-гепарином в свободном объеме.

Фракцию РНКазы НШ (7,5 мл), сошедшую с колонки в свободном объеме, концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сепбгсоп-10 (Аписон). Концентрат (190 мкл) подвергают гельфильтрации на колонке Зирегбех 200 (Атегкбат РНагтааа Вю1есб), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ Ν;·ιΟ1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу НШ в положении, соответствующем молекулярной массе в ЗЗ килодальтона. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы НШ в мономерной форме.

Элюированную таким образом РНКазу НШ используют в качестве препарата Вса РНКазы НШ.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата Вса РНКазы НШ измеряют следующим образом.

- З4 007414

Реакционную смесь (100 мкл) [20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 0,01% бычий сывороточный альбумин (Такага 8йи/о), 1% диметилсульфоксид, 4 мМ ацетат магния, 20 мкг/мл поли(б!) (Атегкйат Рйагтас1а Вю1есй), 30 мкг/мл поли(гА) (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй)], икубированную при 40°С, добавляют к 1 мкл препарата Вса РНКазы НШ. Смесь оставляют реагировать при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливают, добавляя 10 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Затем измеряют поглощение при 260 нм. В результате для препарата Вса РНКазы НШ наблюдают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 4. Клонирование гена РНКазы НИ Ругососсик Гшюкик.

(1) Получение геномной ДНК из Ругососсик Гшюкик.

Среду (2 л), содержащую 1% триптона (Όίίοο ЬаЬогакпек), 0,5% дрожжевого экстракта (ОгГсо ЬаЬогакпек), 1% растворимого крахмала (№са1а1 Текдие), 3,5% .Татагше 8 койб Датаппе ЬаЬогаШгу), 0,5% .Татагше 8 йдшб Датагше ЬаЬогаТогу), 0,003% Мд8О₄, 0,001% №С1, 0,0001% Ре8О₄-7Н₂О, 0,0001% Со8О₄, 0,0001% СаС1₂-7Н₂О, 0,0001% /118(% 0,1 ч/млн Си8О₄-5Н₂О, 0,1 ч/млн КА1(8О₄)₂, 0,1 ч/млн Н₃ВО₃, 0,1 ч/млн №₂МоО₄-2Н₂О и 0,25 ч/млн №С1₂-6Н₂О, помещают в 2-л бутыль, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, барботируют газообразным азотом для удаления растворенного кислорода, затем в среду инокулируют Ругососсик Гипокик (приобретенную у Эеи1ксйе 8атт1ипд гоп М1кгоогдашктеп; Ό8Μ3638) и культивируют при 95°С в течение 16 ч без встряхивания. После культивирования клетки собирают центрифугированием.

Затем полученные клетки суспендируют в 4 мл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к смеси 0,4 мл 10 мг/мл хлорида лизоцима (№1са1а1 Текдие) в воде. Смесь оставляют реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 24 мл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 0,2 мл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 8йихо) и 2 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом с последующим осаждением этанолом, и получают примерно 1 мг геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы II.

Полная геномная последовательность Ругососсик Гипокик опубликована [ΌΝΑ Кекеагсй, 5:55-76 (1998)]. Известно существование в геноме одного гена, кодирующего гомолог РНКазы НИ (РН1650) (8ЕД ГО № 19, домашняя страница №Иопа1 !пк111и1е оГ Тесйпо1оду апб Еуа1иИоп йир://\\л\лу.пЦе.до.]р/).

Исследуют гомологию между геном РШ650 и частично опубликованной геномной последовательностью Ругососсик Гипокик (домашняя страница Ишуегкйу оГ ИТай, Ыасй Сепоте СеШег: йЦр://^^^.депоте.и1асй.еби/кециепсе.й1т1). В результате обнаруживают высоко гомологичную последовательность. На базе гомологичной последовательности синтезируют праймеры 1650№е (8ЕД ГО № 20) и 1650Ват (81%) ГО Νο 21).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 200 нг геномной ДНК Ругососсик Гипокик, полученной в ссылочном примере 4-(1), и 20 пмоль 1650№е и 20 пмоль 1650Ват в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Ех Тад (Такага 8йихо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК размером около 0,7 т.п.о. расщепляют N6еI и ВатШ (обе от Такага 8йихо). Полученный фрагмент ДНК встраивают между сайтом N6еI и сайтом ВатШ в плазмидном векторе рЕТ3а (№уадеи), для получения плазмиды рРРИ220.

(3) Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы НИ.

Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рРРИ220, полученную в ссылочном примере 4-(2), определяют дидезокси-методом.

Анализ определенной нуклеотидной последовательности показывает существование открытой рамки считывания, предположительно кодирующей РНКазу НИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания показана в 8 ЕД ГО Νο 22. Аминокислотная последовательность РНКазы НИ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в 8ЕД ГО Νο 23.

Штамм ЕксйепсЫа сой ДМ109, трансформированный плазмидой рРРИ220, был обозначен и указывается как ЕксйепсЫа сой !М109/рРРи220, депонирован 5 сентября 2000 (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (!п1егпа1юпа1 Ра1еп1 Огдашкт Эерокйагу, №1йопа1 ШкТйиТе оГ Абгапсеб ШбикТпаТ 8с1епсе апб ТесйпоКду, АКТ ТкикиЬа Сеп1га1 6, 1-1, Н1дакй1 1-сйоте, ТкикиЬа-кЫ, !Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером РЕКМ ВР-7654.

(4) Получение очищенного препарата РНКазы НИ.

ЕксйепсЫа сой НМ8174 (№уадец) трансформируют рРРИ220, полученной в ссылочном примере 4- (2). Полученную ЕксйепсЫа сой НМ8174 фЕ3), содержащую рРРИ220, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 66,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова цен

- 35 007414 трифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают 61,5 мл прогретого супернатанта.

Прогретый супернатант наносят на колонку КЕЗОИКСЕ О (Лтегкйат Рйагтас1а Вю!есй), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат Рйагтас1а Вю1есй). В результате РНКаза Н11 сходит с колонки КЕЗОИКСЕ О в свободном объеме.

Сошедшую в свободном объеме с колонки фракцию РНКазы Н11 (60,0 мл) наносят на колонку КЕЗОИКСЕ З (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй), уравновешенную буфером А, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 150 мМ ЫаС1. Фракцию РНКазы Н11 (2,0 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сеп!псоп-10 (Анисом). Концентрат (250 мкл) подвергают гельфильтрации на колонке Зирегкех 200 (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу Н11 в положении, соответствующем молекулярной массе 17 килодальтон. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в мономерной форме.

Элюированную таким образом РНКазу Н11 используют в качестве препарата Р£и РНКазы Н11.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата Р£и РНКазы Н11 измеряют так, как описывается в ссылочном примере 3-(5). В результате в препарате Р£и РНКазы Н11 наблюдают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 5. Клонирование гена РНКазы Н11 ТйегтоЮда тагФта.

(1) Получение геномной ДНК из ТйегтоЮда тапйт.

Среду (2 л), содержащую 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% растворимого крахмала, 3,5% .Пинание З Зойк, 0,5% .Пинание З Ыдшк, 0,003% МдЗО₄, 0,001% ЫаС1, 0,0001% ЕеЗО^ЩО, 0,0001% СоЗО₄, 0,0001% СаС1₂-7Н₂О, 0,0001% 2пЗО₄, 0,1 ч/млн СиЗО₄-5Н₂О, 0,1 ч/млн КА1(ЗО₄)₂, 0,1 ч/млн Н₃ВО₃, 0,1 ч/млн Ыа₂МоО₄-2Н₂О и 0,25 ч/млн №С1₂-6Н₂О, помещают в 2-л бутыль, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, барботируют газообразным азотом для удаления растворенного кислорода, затем в среду инокулируют ТйегтоЮда тапйта (приобретенную у Иеийсйе Затт1ипд уоп М1кгоогдапктеп ипк 2е11ки11игеп СтЬН; ЭЗМ3109) и культивируют при 85°С в течение 16 ч без встряхивания.

Затем клетки, собранные центрифугированием из 300 мл культуры, суспендируют в 3 мл ТЕ-буфера [10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА]. Добавляют к смеси 150 мкл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия (Ыаса1а1 Те^дне) и 15 мкл 20 мг/мл протеиназы К (Такага Зйгао). Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После реакции к смеси добавляют 0,5 мл 5 М раствора ЫаС1. После тщательного перемешивания к смеси добавляют 0,4 мл раствора СТАВ-ЫаС1 [10% бромида цетилтриметиламмония (Иасайи Те^дне), 0,7 М ЫаС1]. После тщательного перемешивания смесь инкубируют при 65°С в течение 10 минут. К смеси добавляют 1,5 мл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1, об./об.). Смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют при 20000 х д в течение 5 мин. После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют равный объем смеси фенола, насыщенного 100 мМ Трис-НС1 (рН 8,0) / хлороформа / изоамилового спирта (25 : 24:1, об./об.). Смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют при 20000 х д в течение 5 мин. После центрифугирования к супернатанту добавляют 0,6 объема 2-пропанола. Осадок, полученный центрифугированием при 10000 х д в течение 5 мин, промывают 70% этанолом в воде, сушат на воздухе и затем растворяют в 200 мкл ТЕ, получая раствор геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы Н11.

На базе нуклеотидной последовательности части, идентифицированной как ген РНКазы Н11 в нуклеотидной последовательности геномной ДНК ТйегтоЮда тагФта (ййр://тетете.йдг.огд/!кЬ/СМК/Ыт/ й!т18/Зр1а8ЙРаде.й!ш1), синтезируют олигонуклеотиды 915-Е1, 915-Е2, 915-К1 и 915-К2, представленные ЗЕф ΙΌ Ыо 24-27, для того, чтобы получить амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий ген РНКазы Н, путем осуществления ПЦР с использованием геномной ДНК ТйегтоЮда тагЩта в качестве матрицы.

ПЦР осуществляют с использованием геномной ДНК ТйегтоЮда талкта, полученной в ссылочном примере 5-(1), в качестве матрицы и 915-Е1 и 915-К1, 915-Е1 и 915-К2, 915-Е2 и 915-К1 или 915-Е2 и 915-К2 в качестве пар праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Ех Тад согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 циклов - 95°С в течение 0,5 мин, 55°С в течение 0,5 мин и 72°С в течение 1,5 мин. После реакции соответствующие продукты ПЦР подвергают электрофорезу в агарозном геле, и экстрагируют и очищают амплифицированные фрагменты ДНК длиной около 0,7 т.п.о. ДНК, амплифицированные с использованием пары праймеров 915-Е1 и 915-К1 или 915-Е1 и 915-К2, расщепляют НткШ и ХЬа1 (обе от Такага З1иао) и лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с рИС19, расщепленной НткШ и ХЬа1. Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйелсЫа сой 1М109. Полученные транформанты культивируют, и выделяют плазмидные ДНК, в которые встроены ДНК длиной около 0,7 т.п.о. В результате получают плазмиды № 1 и № 2, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Е1 и 915-К1, и плазмиды № 3 и № 4, со

- 36 007414 держащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Е1 и 915-К2.

Кроме того, ДНК, амплифицированные с использованием пары праймеров 915-Е2 и 915-К1 или 915Е2 и 915-К2, расщепляют №о1 (Такага ЗНнхо) и ХЬа1 и лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с ρΤν119Ν (Такага ЗНихо), расщепленной №о1 и ХЬа1. Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйейсЫа сой ΙΜ109.

Полученные транформанты культивируют, и получают плазмидные ДНК, в которые встроены ДНК размером около 0,7 т.п.о. В результате получают плазмиды № 5 и № 6, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Е2 и 915-К1, и плазмиды № 7 и № 8, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Е2 и 915-К2.

Штамм Екс11епс1па сой ΙΜ109, трансформированный плазмидой № 7, был обозначен и указывается как ЕксйейсЫа сой ]М109/рТМ-КЫН, депонирован 5 сентября 2000 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (1п1егпайопа1 Ра1еп1 Огдаткт Иерокйагу, №йопа1 1пкШи1е о£ Αάνаηсеά 1Ыикй1а1 Заепсе ππά Тес1по1оду, А1ЗТ ТкикиЬа Сеп1га1 6, 1-1, Н1дакЫ 1с1оте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7652.

(3) Экспрессия гена РНКазы НИ ТНегтоЮда тапйта.

ЕксйепсЫа сой ΙΜ109, трансформированную одной из плазмид №№ 1-7 или рИС19, инокулируют в 5 мл среды ЬВ (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №101 рН 7,2), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С. Когда поглощение при 660 нм достигнет 0,5, к смеси добавляют изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 1 мМ, и клетки культивируют в течение ночи. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера и обрабатывают ультразвуком. Обработанную ультразвуком суспензию прогревают при 80°С в течение 10 мин. Супернатант, полученный центрифугированием, используют в качестве грубого клеточного экстракта. Измеряют поглощение с использованием грубого клеточного экстракта, как описывается в ссылочном примере 2-(5). В результате, когда реакцию проводят в присутствии МпС12, поглощение при 260 нм в каждой из реакционных смесей, в которой используют грубые клеточные экстракты, полученные из ЕксйепсЫа сой ΙΜ109, содержащие плазмиды №№ 3, 5, 6 или 7, явно выше, чем поглощение реакционной смеси, в которой используют грубый клеточный экстракт из ЕксйепсЫа сой ΙΜ109, содержащей рИС19. Таким образом, демонстрируется, что плазмиды №№ 3, 5, 6 и 7 содержат гены РНКазы Н, и что ЕксйепсЫа сой, содержащая одну из указанных плазмид, экспрессирует активность РНКазы Н.

Определяют частичные нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, встроенных в плазмиды, демонстрирующие экспрессию активностей в ЕксйепсЫа сой. Анализ установленных нуклеотидных последовательностей выявляет наличие открытой рамки считывания, предположительно кодирующей РНКазу НИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания приведена в ЗЕЦ ΙΌ № 143. Аминокислотная последовательность, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в ЗЕЦ ΙΌ № 144. Затем обнаруживают, что наблюдается одно замещение основания, которое, предположительно, образуется в результате ПЦР, в участке нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду № 7, что приводит к изменению кодируемого аминокислотного остатка.

(4) Получение очищенного препарата РНКазы Н11.

ЕксйепсЫа сой ΙΜ109 трансформируют рТМ-ΚΝΗ, полученной в ссылочном примере 5-(2). Полученную Екс11епс1па сой ΙΜ109, содержащую рТМ-ΚΝΗ, инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 31,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об/мин в течение 10 мин, прогревают при 70°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают 32,0 мл прогретого супернатанта.

Прогретый супернатант наносят на колонку КЕЗОиКСЕ О (Атегкйат РНагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером С [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат Рйагташа Вю1ес11). В результате РНКаза Н11 сходит с колонки КЕЗОИКСЕ О в свободном объеме. Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы Н11 (32,5 мл) наносят на колонку КЕЗОИКСЕ З (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером С, и элюируют линейным градиентом Ν10Ί от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС.

Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 240 мМ ИаСЕ

Фракцию РНКазы Н11 (2,0 мл) наносят на колонку РЭ-10 (Атегкйат Рйагташа Вю1есй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ ИаСЕ Полученный элюат (3,5 мл) наносят на колонку с Н1Тгаргепарином (Атегкйат Рйагташа Вю1есй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ ИаС1, и элюируют линейным градиентом Ν10Ί от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 295 мМ Ν10Ί. Элюированную таким образом РНКазу Н11 используют в качестве препарата Тта РНКазы Н11.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата Тта РНКазы Н11 измеряют так,

- 37 007414 как описывается в ссылочном примере 2-(6). В результате в препарате Тта РНКазы ΗΙΙ наблюдают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 6. Клонирование гена РНКазы НП из Ругососсик ΗοΓίΚοκΒίί.

(1) Получение геномной ДНК из Ругососсик йопкокйй.

Среду (2 л), содержащую 1% триптона (Эбсо ЬаЬогаЮпек), 0,5% дрожжевого экстракта (Эбсо ЬаЬогаЮпек), 1% растворимого крахмала (Ν;·κ;·ι1;·ιί Тексще), 3,5% Рипаппе 8 8ойб Цатаппе ЬаЬогаЮгу), 0,5% Кипаппе 8 Ыс.|тб Наталпе ЬаЬогаЮгу), 0,003% Мд8О₄, 0,001% №С1, 0,0001% Ре8О₄.7Н₂О, 0,0001% Со8О₄, 0,0001% СаС1₂.7Н₂О, 0,0001% Ζη8Ο₄, 0,1 ч/млн Си8О₄-5Н₂О, 0,1 ч/млн КА1(8О₄)₂, 0,1 ч/млн Н₃ВО₃, 0,1 ч/млн №₂МоО₄.2Н₂О и 0,25 ч/млн ШС1₂.6Н₂О, помещают в 2-л бутыль, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, барботируют газообразным азотом для удаления растворенного кислорода, затем в среду инокулируют Ругососсик йопкокйй ОТ3 (приобретенную у 1пкН(и(е о! Рйукюа1 апб Сйет1са1 Кекеагсй (ΚΙΧΕΝ); ЗСМ9974) и культивируют при 95°С в течение 16 ч без встряхивания. После культивирования клетки собирают центрифугированием.

Затем клетки суспендируют в 4 мл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к смеси 0,4 мл 10 мг/мл хлорида лизоцима (Ν;κ;·ι1;·ιί Текцне) в воде. Смесь оставляют реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 24 мл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 0,2 мл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 8йихо) и 2 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч.

После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом с последующим осаждением этанолом, и получают примерно 1 мг геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы ΙΙ.

Полная геномная последовательность Ругососсик йопкокйй опубликована [ΌΝΑ Кекеагсй, 5:55-76 (1998)]. Известно существование в геноме одного гена, кодирующего гомолог РНКазы Н11 (РН1650) (8ЕЦ ΙΌ № 145, домашняя страница №-10опа1 1пкШи1е о! Тесйпо1оду апб Еуа1ийоп 11ир://\\л\лу.1Ше.до.]р/).

На базе последовательности гена РН1650 синтезируют праймеры РйоШе (8ЕЦ ΙΌ № 146) и РйоВат (8ЕО ΙΌ № 147).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 100 нг геномной ДНК Ругососсик йопкокйй, полученной в ссылочном примере 6-(1), и 20 пмоль РйоШе и 20 пмоль РйоВат в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаРа Ех Тас.| (Такага 8йнхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 40 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,7 т.п.о. расщепляют ШеК ВатШ (обе от Такага 8йнхо). Затем создают плазмиду рРНО238, встраивая полученный фрагмент ДНК между сайтами NбеI и ВатШ в плазмидном векторе рЕТ3а (№уадеп).

Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рРНО238, полученную в ссылочном примере 6-(2), определяют дидезокси-методом.

Анализ определенной нуклеотидной последовательности выявляет открытую рамку считывания, предположительно кодирующую РНКазу НИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания представлена в 8ЕЦ ΙΌ № 148. Аминокислотная последовательность РНКазы НИ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в 8ЕЦ ΙΌ № 149.

Штамм ЕксйепсЫа со11 ДМ109, трансформированный плазмидой рРНО238, был обозначен и указывается как ЕксйепсЫа сой 1М109/рРНО238, депонирован 22 февраля 2001г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, ([п(егпа(1опа1 Ра1еШ ОгдаЫкт Оерокйагу, №Ыопа1 [пк1Ии1е о! Абуапсеб [пНик(г1а1 8аепсе апб Тесйпо1оду, АКТ ТкикиЬа Сепйа1 6, 1-1, ШдакЫ 1-сНоте, ТкикиЬа-кЫ, !Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером РЕРМ ВР-7692.

ЕксйепсЫа со11 НМ8174(ЭЕ3) (№уадеп) трансформируют рРНО238, полученной в ссылочном примере 6-(2). Полученную ЕксйепсЫа сой НМ8174(ОЕ3), содержащую рРНО238, инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 34,3 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 80°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают 33,5 мл прогретого супернатанта.

Прогретый супернатант наносят на колонку РЕ8ОИРСЕ О (Атегкйат Рйагташа Вю1есй), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы РРЬС (Атегкйат Рйагташа Вю1есй). В результате РНКаза НИ сходит с колонки РЕ8ОИРСЕ О в свободном объеме.

Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы НИ (35,0 мл) диализуют против 2 л буфера В [50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА] в течение 2 ч. Диализ повторяют еще два раза. Диализованный раствор фермента (34,5 мл) наносят на колонку РЕ8ОИРСЕ 8 (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй),

- 38 007414 уравновешенную буфером В, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу НШ, элюированную при примерно 155 мМ №01.

Добавляют буфер В к 4,0 мл фракции, чтобы довести концентрацию №С1 до 50 мМ. Смесь наносят на колонку с Н1Тгар-гепарином (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НИ, элюированную при примерно 160 мМ №С1.

Фракцию РНКазы НИ (6,9 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сеп1псои-10 (Ат1соп). Две части, выделенные, каждая, из 250 мкл концентрата, подвергают гель-фильтрации на колонке с Зирегоке 6 (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу НИ в положении, соответствующем молекулярной массе в 24,5 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы НИ в мономерной форме.

Элюированную таким образом РНКазу НИ используют в качестве препарата Рйо РНКазы НИ.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата Рйо РНКазы НИ измеряют так, как описывается в ссылочном примере 3-(5). В результате в препарате Рйо РНКазы НИ наблюдают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 7. Клонирование гена РНКазы НИ из Агсйаеод1оЬик ГЫщбик.

(1) Получение геномной ДНК из Агсйаеод1оЬик ГЫщбик.

Клетки АгсйаеофоЬик Ги1д16ик (приобретенной у БеШксйе Заттйпщ уоп М1кгоогдашктеп ипб 2е11кийигеп СтЬН; БЗМ4139), собранные из 8 мл культуры, суспендируют в 100 мкл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к смеси 20 мкл 0,5 М ЭДТА и 10 мкл 10 мг/мл хлорида лизоцима (№са1а1 Текцие) в воде. Смеси дают реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 800 мкл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 10 мкл 20 мг/мл протеиназы К (Такага Зйнхо) и 50 мкл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом, осаждают этанолом и сушат на воздухе, и затем растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера, с получением раствора геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы НИ.

Полная геномная последовательность Агсйаеод1оЬик ГЫщбик опубликована Щайте, 390:364-370 (1997)]. Известно существование одного гена, кодирующего гомолог РНКазы НИ (АЕ0621) (ЗЕф ГО Νο 150, ййр://тетете.йдг.огд/16Ь/СМК/Ыт/й1т1к/Зр1акйРаде.йЙт).

На основе последовательности гена АЕ0621 (ЗЕф ГО Νο 150) синтезируют праймеры АЕцИбе (ЗЕф ГО Νο 151) и АГиВат (ЗЕС) ГО Νθ 152).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 30 нг геномной ДНК Агсйаеод1оЬик ГЫщбик, полученной в ссылочном примере 7-(1), и 20 пмоль каждого из ЛЕцИбе и АГиВат в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для РСК используют ДНК-полимеразу РугоЬек! (Такага Зйи/о) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 40 циклов 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,6 т.п.о. расщепляют NάеI и ВатШ (обе от Такага Зйи/о). Затем получают плазмиду рАЕи204, встраивая полученный фрагмент ДНК между сайтами NάеI и ВатШ в плазмидном векторе рТУ119Х6 (плазмида, в которой сайт Ν^ в рТV119Nά превращен в сайт NάеI).

Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рАЕи204, полученную в ссылочном примере 7-(2), определяют дидезокси-методом.

Анализ определенной нуклеотидной последовательности выявляет наличие открытой рамки считывания, предположительно кодирующей РНКазу НИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания показана в ЗЕф ГО Νο 153. Аминокислотная последовательность РНКазы НИ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в ЗЕф ГО Νο 154.

Штамм ЕксйепсЫа соИ ДМ109, трансформированный плазмидой рАЕи204, был обозначен и указывается как ЕксйепсЫа сой ^Μ109/рЛЕυ204, депонирован 22 февраля 2001г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, ([п1егпа(1опа1 Ра1еп1 Огдаткт Берокйагу, №11юпа1 !пк1Ни1е оГ Абуапсеб [пНик(г1а1 Заепсе апб Тесйпо1оду, АКТ ТкикиЬа Сепйа1 6, 1-1, Н1дакй1 1-сйоте, ТкикиЬа-кЫ, !Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7691.

ЕксйепсЫа сой ДМ 109 трансформируют рАЕи204, полученной в ссылочном примере 7-(2). Полученную ЕксйепсЫа сой 1М109, содержащую рАЕи204, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 37,1 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 70°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугиру

- 39 007414 ют при 12000 об/мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают 40,3 мл прогретого супернатанта.

Прогретый супернатант наносят на колонку ВЕЗОИВСЕ О (Атегзйат Рйагтас.а Вю1есй), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегзйат Рйагтас.а Вю1ес11). В результате РНКаза Н11 сходит с колонки ВЕЗОИВСЕ О в свободном объеме.

Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы Н11 наносят на колонку ВЕЗОИВСЕ З (Атегзйат Рйагтас.а Вю1есй), уравновешенную буфером А, и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегзйат Рйагтас.а Вю1ес11). В результате РНКаза Н11 сходит в свободном объеме с колонки ВЕЗОиВСЕ 8.

Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы Н11 (40,0 мл) диализуют против 2 л буфера В [50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА], содержащего 50 мМ №С1, в течение 2 ч. Диализ повторяют еще два раза. Диализованный раствор фермента (40,2 мл) наносят на колонку с Н1Тгаргепарином (Атегзйат Рйагтас.а Вю1есй), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НШ, элюированную при примерно 240 мМ №С1.

Фракцию РНКазы Н11 (7,8 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Атюоп). Четыре части, выделенные, каждая, из 600 мкл концентрата, подвергают гельфильтрации на колонке с Зирегозе 6 (Атегзйат Рйагтас.а Вю1есй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу Н11 в положении, соответствующем молекулярной массе в 30,0 килодальтон. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в мономерной форме.

РНКазу Н11, элюированную так, как описано выше, используют в качестве препарата АГи РНКазы НИ.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата АГи РНКазы Н11 измеряют так, как описывается в ссылочном примере 3-(5). В результате в препарате АГи РНКазы Н11 наблюдают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 8.

Величину активности РНКазы Н из ЕзсйепсЫа сой, используемую в способе настоящего изобретения, измеряют согласно способу, описанному далее.

(1) Получение растворов используемых реагентов.

Реакционная смесь для определения активности: в стерильной воде содержатся перечисленные далее вещества в указанных конечных концентрациях: 40 мМ Трис-гидрохлорид (рН 7,7 при 37°С), 4 мМ хлорид магния, 1 мМ ЭТТ, 0,003% ВЗА, 4% глицерин и 24 мкМ поли(б1).

Раствор поли[8-³Н]адениловой кислоты: в 200 мкл стерильной воды вносят 370 кБк раствора поли[8-³Н]адениловой кислоты.

Раствор полиадениловой кислоты: полиадениловую кислоту разводят сверхчистой стерильной водой до концентрации 3 мМ.

Разведение раствора фермента: в стерильной воде в указанных конечных концентрациях содержатся следующие вещества: 25 мМ Трис-гидрохлорид (рН 7,5 при 37°С), 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА (рН 7,5 при 37°С), 30 мМ хлорид натрия и 50% глицерин.

Получение ДНК тимуса теленка, денатурированной под действием тепла: суспендируют 200 мг ДНК тимуса теленка и оставляют набухать в 100 мл ТЕ-буфера. Раствор разбавляют до концентрации 1 мг/мл стерильной сверхчистой водой, основываясь на поглощении в УФ-области при 260 нм. Разбавленный раствор нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем быстро охлаждают на ледяной бане.

(2) Способ измерения активности.

Раствор поли[8-³Н]адениловой кислоты (7 мкл) добавляют к 985 мкл реакционной смеси для определения активности, полученной выше в (1). Смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 8 мкл полиадениловой кислоты для получения конечной концентрации 24 мкМ. Затем смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин. Таким образом получают 1000 мкл реакционной смеси с поли[8³Н]гА-поли-бГ Затем 200 мкл реакционной смеси инкубируют при 30°С в течение 5 мин. К смеси добавляют 1 мкл подходящего серийного разведения раствора фермента. Для использования в последующих измерениях из реакционной смеси по времени отбирают 50 мкл каждого из образцов. Период времени в минутах от момента добавления фермента до момента отбора образца определяют как Υ. Готовят по 50 мкл реакционной смеси для подсчета общего числа импульсов (срт) и в качестве контроля, добавляя 1 мкл раствора для разведения фермента вместо раствора фермента. К образцу добавляют 100 мкл 100 мМ раствора пирофосфата натрия, 50 мкл раствора ДНК тимуса теленка, денатурированной под действием тепла, и 300 мкл 10% трихлоруксусной кислоты (300 мкл сверхчистой воды для измерения общего срт). Смесь инкубируют при 0°С в течение 5 мин и затем центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования помещают во флакон 250 мкл полученного супернатанта. Добавляют 10 мл аквазола-2 (ΝΓΝ ЬГГе Зс.епсе Ргобис1з). Измеряют срт в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

(3) Вычисление единиц.

- 40 007414

Величину активности (в Е) для каждого фермента вычисляют согласно следующему уравнению:

Единиц/мл = {(измеренное срт - срт в онтроле) х 1,2* х 20 х 1000 х степень разведения} 200(мкл) / (общее срт х У(мин) х 50(мкл) х 9**)

1,2* - количество, в нмоль, поли[8- ³НгА-поли-бТ, соответствующее общему срт в расчете на 50 мкл.

9** - поправочный коэффициент.

Пример 1. Способ настоящего изобретения используют для обнаружения энтерогеморрагической Е. сой 0-157.

Последовательности праймеров, используемых в данном примере, показаны в БЕО ГО Νο 31-34 в перечне последовательностей. Конструируют комбинацию праймеров, каждый с последовательностью БЕО ГО Νο 31 или 32, для обнаружения последовательности, кодирующей веротоксин (УТ) 1 Е. сой О157, и комбинацию праймеров, каждый с последовательностью БЕО ГО Νο 33 или 34, для обнаружения последовательности, кодирующей веротоксин 2 Е.соН 0-157. В качестве матрицы используют экстракт, полученный культивированием энтерогеморрагической Е. сой О-157 (АТСС, инвентарный № 43895), сбором клеток, суспендированием клеток в стерильной воде при соответствующей плотности клеток и обработкой суспензии при 98°С в течение 10 мин. Состав реакционной смеси следующий: 27 мМ фосфатный буфер (рН 7,3), 0,01% бычий сывороточный альбумин (ВБА), 5% диметилсульфоксид (ДМСО), 1 мМ каждого 6ΝΤΡ, 8 мМ ацетат магния, 60 пмоль каждого праймера, ДНК как матрица (полученная экстракцией горячей водой), соответствующая 10⁴-10⁶ клеток, и стерильная вода до реакционного объема 48 мкл. Реакционную смесь денатурируют под действием тепла при 98°С в течение 1 мин и затем охлаждают до 55°С. К смеси добавляют 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ и 60 Е РНКазы Н Е. сой. Реакционную смесь инкубируют при 55°С в течение 60 мин. Затем смесь прогревают при 90°С в течение 2 мин для инактивации ферментов. По 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле ШЛссс-агароза 3:1 (Такага Бйнхо). В результате можно обнаружить веротоксин 1 и 2 Е.соН 0-157 с использованием соответствующей пары праймеров и ДНК в качестве матрицы, соответствующей 10⁴ клеток, что подтверждает, что способ настоящего изобретения можно использовать какспособ обнаружения вирулентных бактерий.

Пример 2.

(1) Проверяют влияние типа буфера, используемого в способе настоящего изобретения. В данном примере используют праймеры для амплификации λ ДНК с последовательностями, представленными БЕО ГО № 39 и 40. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей по 120 пмоль каждого праймера, 0,01% водный раствор пропилендиамина и 10 нг или 1 нг ДНК в качестве матрицы, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают на льду для отжига праймеров к матричной ДНК. Амплифицированный продукт (1005 п.о.), полученный ПЦР с использованием λ ДНК (Такага Бйнхо) в качестве матрицы и праймеров, представленных БЕО ГО N 41 и 42, который затем очищают с использованием Биргес02 (Такага 31шхо). используют в качестве матрицы.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буфера для реакции (42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 42,5 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащего 0,625 мМ каждого из άNΤΡ, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (ВБА), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНКполимеразы ВсаВЕБТ, до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения. Затем наблюдают наличие представляющих интерес амплифицированных фрагментов для обоих количеств матрицы. В частности, большее количество продукта амплификации получают в случае реакционной системы, содержащей буфер бицин-гидроксид калия (рН 8,5).

(2) Проверяют улучшение реакционной способности за счет использования буфера НЕРЕБгидроксид калия. В качестве матрицы используют плазмидную ДНК рИС19 с фрагментом ДНК длиной около 150 п.о., встроенным в участок, содержащий множественные сайты для клонирования. Такую матрицу получают следующим образом.

Осуществляют ПЦР с использованием верхнего ПЦР-праймера рИС19 иррег 150 и ПЦР-праймера риС19 1о\\сг с последовательностями, представленными БЕО ГО № 134 и 135, и 100 пг плазмидной ДНК риС19 в качестве матрицы. Полученный амплифицированный фрагмент очищают с использованием М1сгосоп-100, тупят концы с использованием набора для затупления ДНК (Такага БНпхо) и субклонируют в сайт НшсП плазмиды рИС19. Плазмиду с встроенным амплифицированным фрагментом используют для трансформации ЕксйепсЫа сой 1М109. Трансформант культивируют. Плазмиду со встроенной ДНК очищают из клеток с использованием набора О1АСЕН р1а8тИ тш1 кН (О1;щеп) и используют в качестве матрицы.

Фрагмент ДНК, амплифицированный ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК рИС19-150, полученной, как описано выше, и праймеров МСБ-Е и МСБ-К. с нуклеотидными последовательностями, представленными БЕО ГО № 35 и 36, использовали в качестве матрицы. Праймеры МЕ2№(24) и МК.Ш3(24) с нуклеотидными последовательностями, представленными БЕО ГО № 37 и 38,

- 41 007414 используют в качестве химерных олигонуклеотидных праймеров. Размер амплифицированного фрагмента, полученного с использованием комбинации указанных праймеров, составляет примерно 350 п.о.

В качестве буфера для проверки выбирают буферную систему НЕРЕ8-гидроксид калия. Калий фосфатную буферную систему и Трициновую буферную систему используют как контроли. Составы реакционных смесей указаны ниже.

Реакционная смесь А: 10 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента, 50 пмоль каждого из праймеров ΜΡ2Ν3(24) и МК1Ы3(24), 0,01% водный раствор пропилендиамина и стерильная дистиллированная вода до реакционного объема 10 мкл.

Реакционная смесь В: готовят три указанных далее типа.

Калий-фосфатная буферная система: готовят 40 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечной концентрации, 35 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5), 1,25% ДМСО, 0,0125% Β8Α, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из бЫТР, 60 Е РНКазы Н Е. соб и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т.

Трициновая буферная система: готовят 40 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечной концентрации, 42,5 мМ трициновый буфер (рН 8,7), 12,5 мМ хлорид калия, 12,5 мМ сульфат аммония, 1,25% ДМСО, 0,0125% Β8Α, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из бЫТР, 30 Е РНКазы Н Е. соб и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т.

Буферная система НЕРЕ8-гидроксид калия: готовят 40 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечной концентрации, 25 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 1,25% ДМСО, 0,0125% Β8Α, 5 мМ ацетат магния 0,625 мМ каждого из бЫТР, 30 Е РНКазы Н Е. соб и 5,5 Е ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т.

Реакционную смесь А денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 60 или 65°С и затем оставляют на льду. Одну из реакционных смесей В добавляют к реакционной смеси А на льду и смешивают для получения реакционного объема 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 60 или 65°С в течение 1 ч.

После реакции их охлаждают до 4°С, и к каждой смеси добавляют 1/10 объема 0,5 М ЭДТА для прекращения реакции. По 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле Ыи81еуе-агароза 3:1. В результате в случае трех буферных систем независимо от используемой температуры реакции отмечают появление представляющих интерес амплифицированных фрагментов. В частности, в данном примере самое большое количество продукта амплификации и самую высокую реакционную способность наблюдают в случае буферной системы НЕРЕ8-гидроксид калия.

Пример 3.

(1) Проверяют условия, используемые в способе настоящего изобретения для отжига праймеров к матрице. Используют праймеры с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ГО Ыо 43 и 44, основанными на неполной нуклеотидной последовательности бактерии вида Б1ауоЬас(ег1ит 8Α0082, как описывается в АО 97/32010 (депонирована 29 марта 1995 в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (бЧегпабогий Ра(еп( Огдашкт Оерокбагу, Ыабопа1 б^ШШе оГ Αбνаηсеб ИчбикШй 8с1епсе апб ТесНпо1оду, ΑI8Т ТкикиЬа Сеп(га1 6, 1-1, ШдакЫ 1-сНоте, ТкикиЬа-кЫ, Шагай 3058566), Япония, под инвентарным номером БЕКМ Р-14872, и депонирована в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (бЛегпаиошй Ра(еп( Огдашкт Оерокбагу, Ыабопа1 ШкбШе оГ Α6уапсеб ИчбикЩй 8с1епсе апб ТесНпо1оду, ΑI8Т ТкикиЬа Сеп(га1 6, 1-1, ШдакЫ 1-сНоте, ТкикиЬа-кЫ, Шагай 305-8566), Япония, под инвентарным номером БЕКМ ВР-5402 (дата требования для передачи международному депозитарному учреждению 15 февраля 1996)). В данном примере в качестве ДНК как матрицы используют амплифицированный продукт (573 п.о.), полученный ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК бактерии Р1ауоЬас(епит 8Α-0082 и комбинации праймеров, представленных 8ЕО ГО Ыо 45 и 46, который затем очищают с использованием 8иргес02 (Такага 81шхо). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 2 мкл одного из растворов для отжига (500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин или 0,05% пропилендиамин) добавляют к 120 пмоль каждого из праймеров. Каждую реакционную смесь, также содержащую 10 или 1 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента, в конечном объеме 10 мкл денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин. После денатурации смеси быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буфера (42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 42,5 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащего 0,625 мМ каждого из бЫТР, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (Β8Α), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. соб и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 52°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 1. Фиг. 1 иллюстрирует результаты электрофореза реакционных смесей с использованием соответствующих сочетаний растворов для отжига и буферов. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом в 100 п.о., Такага 81шхо); полоса 2: пропилендиамин/Трицин (10 нг матрицы); полоса 3: пропилендиамин/НЕРЕ8 (10 нг матрицы); полоса 4: пропилендиамин/НЕРЕ8 (1 нг матрицы); полоса 5: пропилендиамин/Бицин (10 нг матрицы); полоса 6: пропилендиамин/Бицин (1 нг матрицы); полоса 7: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Бицин (10 нг матрицы); полоса 8: 500 мМ хлорид

- 42 007414 калия - 8 мкМ спермидин/Бицин (1 нг матрицы); полоса 9: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 10: пропилендиамин/Трицин (1 нг матрицы); полоса 11: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Трицин (1 нг матрицы); полоса 12: пропилендиамин/НЕΡЕ§ (1 нг матрицы); полоса 1З: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/НЕΡЕ§ (1 нг матрицы); полоса 14: пропилендиамин/Бицин (1 нг матрицы); и полоса 15: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Бицин (1 нг матрицы).

Как видно на фиг. 1, большее количество представляющего интерес продукта амплификации получают, когда для отжига праймеров к матрице используют раствор для отжига, содержащий 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, в случае любого из трех буферов независимо от количества ДНК, используемой в качестве матрицы. В частности, в данном примере хорошие результаты дает комбинация раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, и буфера Бицин-гидроксид калия.

(2) Проверяют влияние раствора для отжига в случае, когда в качестве матрицы используют ПЦРамплифицированный фрагмент ДНК фага λ. В данном примере используют химерные олигонуклеотидные праймеры, описанные в примере 2(1). В качестве матричной ДНК используют ПЦР-амплифицированный фрагмент, полученный в примере 2(1) или ДНК фага λ. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 2 мкл одного из трех типов растворов для отжига (500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, 0,05% пропилендиамин или стерильная вода) добавляют к 120 пмоль каждого праймера. Готовят по 10 мкл смесей, также содержащих 10 нг или 1 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента. Смеси денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буфера (42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,З) и 42,5 мМ НЕΡЕ§-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащего 0,625 мМ каждого из άΝΤΡ, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), З0 Е РНКазы Н Е. со11 и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЭТ, до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по З мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 2. Фиг. 2 иллюстрирует результаты электрофореза, показывающие результаты проверки сочетаний количеств матрицы, буферов для реакции и растворов для отжига. Полоса 1: маркер (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: 10 нг матрицы, сочетание Трицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса З: 1 нг матрицы, сочетание Трицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 4: 10 нг матрицы, сочетание Бицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 5: 1 нг матрицы, сочетание Бицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 6: 10 нг матрицы, сочетание НЕΡЕ§/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 7: 1 нг матрицы, сочетание НЕΡЕ§/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 8: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 9: 10 нг матрицы, сочетание Трицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 10: 1 нг матрицы, сочетание Трицин/пропилен диамин; полоса 11: 10 нг матрицы, сочетание Бицин/пропилендиамин; полоса 12: 1 нг матрицы, сочетание Бицин/пропилендиамин; полоса 1З: 10 нг матрицы, сочетание НЕΡЕ§/пропилендиамин; полоса 14: 1 нг матрицы, сочетание НЕΡЕ§/пропилендиамин; полоса 15: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 16: 10 нг матрицы, сочетание Трицин/вода; полоса 17: 1 нг матрицы, сочетание Трицин/вода; полоса 18: 10 нг матрицы, сочетание Бицин/вода; полоса 19: 1 нг матрицы, сочетание Бицин/вода; полоса 20: 10 нг матрицы, сочетание НЕΡЕ§/вода; и полоса 21: 1 нг матрицы, сочетание НЕΡЕ§/вода.

Как видно на фиг. 2, представляющие интерес амплифицированные фрагменты наблюдают в случае соответствующих сочетаний трех буферов и трех растворов для отжига, независимо от количества матричной ДНК. В частности, установлено, что большее количество амплифицированного фрагмента получают с использованием сочетания Бицинового буфера и раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин.

Пример 4.

Проверяют влияние присутствия ингибитора обратной транскриптазы (ревертазы) в способе настоящего изобретения. В качестве ингибитора ревертазы используют фосфономуравьиную кислоту (ΡΡΑ). В данном примере используют праймеры, представленные 8Е0 ΙΌ № 47 и 48. Амплифицированный продукт (576 п.о.), полученный ПЦР с использованием геномной ДНК энтерогеморрагической Е. со11 0-157 в качестве матрицы и праймеров, представленных 8Е0 ΙΌ № 49 и 50, затем очищают с использованием 8иргес02 (ΤηΚηΓη 81шхо) и используют в качестве матричной ДНК. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, полученной добавлением 1 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента к 120 пмоль каждого праймера и 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси для отжига до конечного объема 50 мкл добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άΝΤΡ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (ВЗД), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), З0 Е РНКазы Н Е.

- 4З 007414 сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, а также РЕА до концентрации 500 мкг/мл или 50 мкг/мкл. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. В качестве контроля готовят также систему без добавления РЕА. После реакции по 9 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 3. Фиг. 3 иллюстрирует результаты электрофореза, показывающие влияние ингибитора обратно-транскриптазной активности. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: без добавления РЕА; полоса 3: с добавлением РЕА в концентрации 500 мкг/мл; полоса 4: с добавлением РЕА в концентрации 50 мкг/мл.

Как видно на фиг. 3, когда добавляют РЕА, подавляется неспецифическая амплификация, и наблюдают амплификацию фрагмента, представляющего интерес. В частности, подтверждается, что продукт неспецифической амплификации, который наблюдают в системе без добавления РЕА, не образуется, а амплифицированный фрагмент, представляющий интерес, явно амплифицируется в системе, в которую РЕА добавляют в концентрации 500 мкг/мл.

Пример 5.

Проверяют взаимосвязь между длиной амплифицируемого фрагмента и чувствительностью детекции в способе настоящего изобретения.

(1) Синтезируют праймеры для амплификации веротоксина ЕксйепсЫа сой О-157, представленные 8ЕО ГО Νο 51-53. Также используют химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в примере 4. Длина фрагмента, амплифицируемого с каждым сочетанием праймеров, составляет 247 п.о. (8ЕО ГО Νο 51 и 48); 166 п.о. (8ЕО ГО Νο 52 и 53); 206 п.о. (8ЕО ГО Νο 52 и 48); 135 п.о. (8ЕО ГО Νο 47 и 53) и 173 п.о. (8ЕО ГО Νο 47 и 48). В данном примере в качестве матрицы используют очищенный ПЦРамплифицированный фрагмент длиной 576 п.о., полученный в примере 4. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей 60 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина и от 10 фг до 10 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 (Такага 81ιιιζο) для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из д№ГР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой, 5,5 Е ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т, и стерильную воду до конечного объема 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В качестве контроля осуществляют детекцию 10 фг-1 пг ПЦР-амплифицированного фрагмента с использованием праймеров, представленных 8ЕО ГО Νο 54 и 55. Фрагмент длиной 135 п.о. амплифицируют с использованием сочетания указанных праймеров. Готовят раствор для ПЦР (50 мкл), содержащий 60 пмоль каждого праймера, 5 мкл 10-кратного буфера Ех Тас.| (Такага 81ιι.ιζο), 1,25 Е ТаКаВа Ех Тац-ДНК-полимеразы (Такага 81ιιιζο) и 0,2 мМ каждого из άΝΊΤ. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 или 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с (2 мин. 38 с/цикл). После реакции по 1 мкл ЦСАК) или 5 мкл (ПЦР) реакционных смесей подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 4 и в табл.1.

Таблица 1

Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)

IСАN (общее время 70 мин)

247

168

206

Предел детекции

100 пг

100 фг

100 пг

135

173

ПЦР (25 циклов, общее время примерно 65 мин)

135

ПЦР (30 циклов, общее время примерно 80 мин)

135 фг

100 фг

100 фг фг

Фиг. 4 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают пределы обнаружения при амплификации цепи длиной в 135 п.о., осуществляемой методом IСАN (наносится 1/50 реакционной смеси) и ПЦР (наносится 1/10 реакционной смеси). Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: IСΛN с использованием 1 пг матрицы; полоса 3: IСАN с использованием 100 фг матрицы; полоса 4: IСАN с использованием 10 фг матрицы; полоса 5: ПЦР (25 циклов) с использованием 1 пг матрицы; полоса 6: ПЦР (25 циклов) с использованием 100 фг матрицы; полоса 7: ПЦР (25 циклов) с использованием 10 фг матрицы; полоса 8: ПЦР (30 циклов) с использованием 1 пг матрицы; полоса 9: ПЦР (30 циклов) с использованием 100 фг матрицы; полоса 10: ПЦР (30 циклов) с использованием 10 фг матрицы.

Как видно из табл.1, подтверждается, что почти такая же чувствительность детекции, как при ПЦР, достигается при ΚΆΝ. Кроме того, общее время реакции для ПЦР составляет примерно 80 мин, в то

- 44 007414 время как время реакции, необходимое для получения такой же чувствительность детекции с использованием способа настоящего изобретения, составляет 70 мин, что подтверждает, что время реакции можно сократить, применяя способ настоящего изобретения.

(2) Синтезируют праймеры для амплификации λ ДНК с нуклеотидными последовательностями, представленными 8Еф ГО № 39, 40 и 56. Длина фрагмента, амплифицируемого с использованием каждого сочетания праймеров, составляет 151 п.о. (8Еф ГО N 39 и 40) и 125 п.о. (8Еф ГО № 56 и 40). В данном примере используют матричную ДНК, полученную в примере 2(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 2 мкл раствора для отжига (500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин), 1 фг - 1 нг матрицы добавляют к 120 пмоль каждого праймера, и доводят до объема 10 мкл стерильной водой. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из б№ГР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл.2.

Таблица 2

Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.) Предел детекции

125 10 фг

151 100 фг

Как видно из табл.2, подтверждается, что когда в качестве матрицы используют λ ДНК, также можно достичь такой чувствительности детекции как 10 фг при анализе оптимального участка.

(3) Получают плазмиду, встраивая амплифицированный фрагмент (длина 340 п.о.) в плазмиду Т7В1ие Т-уес1ог (Такага 811ихо). Фрагмент получают так, как описано в 1Р-А 9-140383, с использованием для амплификации гена вироида хризантемы синтетических праймеров с нуклеотидными последовательностями, представленными 8Еф ГО N3 57 и 58, и в качестве матрицы - РНК из хризантемы, инфицированной вироидом. Плазмиду используют для трансформации компетентных клеток ЕзйепсЫа сой ДМ109 (Такага 81шхо). Трансформант культивируют в 5 мл среды ЬВ при 37°С в течение 16 ч. Плазмиду выделяют из собранных клеток в чистом виде с использованием набора ^IΑСЕN Р1азт1б М1ш Кй (01адеп) согласно руководству. Получают разведения, содержащие 0 фг, 1 фг, 10 фг, 100 фг, 1 пг, 10 пг, 100 пг или 1 нг плазмиды в 1 мкл стерильной воды, основываясь на концентрации плазмиды, измеренной с использованием спектрофотометра Весктап Би-600 (Весктап). Используют 1 мкл одного из приготовленных таким образом растворов плазмиды в качестве матрицы для 50 мкл каждой из реакционных систем для проведения Ιί,ΆΝ. В данном примере используют праймеры С8УБ-Е2 и С8УБ-Я6 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8Еф ГБ N 59 и 60. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 1 мкл полученного раствора плазмиды и пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%. Смесь нагревают при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 60°С, инкубируют при указанной температуре в течение 1 мин в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регзопа1 (Такага 81ихо) и затем помещают на лед.

После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях, буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бЭТР, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регзопа1, установленный на 60°С, и проводят реакцию в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №81еуе-агароза 3:1. В результате отмечают образование представляющих интерес продуктов амплификации (длиной около 90 п.о., около 70 п.о. и около 50 п.о.) при использовании матрицы в концентрации 10 фг.

Пример 6.

Проверяют праймеры, используемые в способе настоящего изобретения.

(1) Проверяют величину Тт праймера и температуру реакции. Синтезируют праймеры для амплификации Е1ауоЬас1ег1нт зр. 8А-0082, имеющие нуклеотидные последовательности, представленные 8Еф ГО № 43 и 61-63. Указанные праймеры конструируют так, чтобы амплифицировать участок в 160 п.о. или короче с содержанием ОС примерно 20%. Длина фрагмента, амплифицируемого с использованием каждой пары праймеров, составляет 126 п.о. (8Еф ГО № 43 и 62); 158 п.о. (8Еф ГО N 43 и 63); 91 п.о. (8Еф ГО № 61 и 62) и 123 п.о. (8Еф ГО № 61 и 63). В данном примере в качестве ДНК-матрицы используют продукт ПЦР-амплификации, полученный в примере 3(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого праймера, 2 мкл одного из трех типов растворов для отжига (500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, 0,05% пропилендиамин или вода) и от 1 фг до 10 нг матрицы. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буферов (17 мМ Трицин-гидроксид

- 45 007414 калия (рН 8,5), 17 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 20 мМ ЫЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащих 0,625 мМ каждого из άNΤΡ, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (Β8Α), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ΒсаΒЕЗΤ, и получают конечный объем 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 52, 55 или 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате отмечают обрывание представляющего интерес амплифицированного фрагмента при использовании температуры реакции 52°С. В частности, большее количество представляющего интерес амплифицированного фрагмента получают с использованием сочетания раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, и Трицино- или Бицино-буфера. Пара праймеров, длина амплифицированного фрагмента и чувствительность детекции для температуры реакции 52°С приводятся на фиг. 5 и в табл.3.

Таблица 3

126 100 фг

158 1 пг

1фг

123 100 фг

Фиг. 5 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают взаимосвязь между длиной амплифицированного фрагмента и количеством ДНК, служащей матрицей, когда амплифицируют участок, богатый АТ. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 и.о.); полоса 2: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 3: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 100 фг матрицы; полоса 4: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 10 фг матрицы; полоса 5: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 1 фг матрицы; полоса 6: амплификация фрагмента длиной 123 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 7: амплификация фрагмента длиной 123 п.о. с использованием 100 фг матрицы; полоса 8: амплификация фрагмента длиной 123 п.о. с использованием 10 фг матрицы; полоса 9: амплификация фрагмента длиной 126 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 10: амплификация фрагмента длиной 126 п.о. с использованием 100 фг матрицы; полоса 11: амплификация фрагмента длиной 126 п.о. с использованием 10 фг матрицы; полоса 12: амплификация фрагмента длиной 158 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 13: амплификация фрагмента длиной 158 п.о. с использованием 100 фг матрицы; и полоса 14: амплификация фрагмента длиной 158 п.о. с использованием 10 фг матрицы.

Как видно на фиг. 5 и из табл.3, показано, что хорошие результаты получают при более низкой температуре реакции, в зависимости от величины Тт праймера, когда способ настоящего изобретения осуществляют с использованием матрицы, богатой АТ, и набором праймеров, богатых АТ.

(2) Структура более высокого порядка праймера может влиять на реакционноспособность в способе настоящего изобретения. Поэтому проверяют модификацию праймера с целью избежать образования структуры более высокого порядка праймера и для получения праймера, легко отжигающегося к матрице. Используют праймеры, представленные 8Еф ΙΌ Ж 47, 48 и 64-69. Конкретно, используют праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Еф ΙΌ Ж 47, праймеры 120Ι4, 121Ι5 и 122Ι6, являющиеся праймерами с нуклеотидными последовательностями, представленными 8Еф ΙΌ Ж 64-66, и содержащие инозиндезоксинуклеотид в четвертом, пятом или шестом положении от 3'-конца, праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Еф ΙΌ Ж 104 и праймеры 123Ι4, 124Ι5 и 125Ι6, которые являются праймерами с нуклеотидными последовательностями, представленными 8Еф ΙΌ Ж 67-69, содержащими инозиндезоксинуклеотид в четвертом, пятом или шестом положении от 3'-конца. В данном примере в качестве матрицы используют ДНК, полученную в примере 4. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина, от 1 до 10 нг ДНК как матрицы и стерильную дистиллированную воду, нагревают при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 55°С и инкубируют при указанной температуре в течение 1 мин с использованием термоциклера (6еηеΑтρ ΡСΒ 8ук1ет 9600, Αρρ^ά Β^ο8у8ΐет8).

После отжига к смеси добавляют 0,625 мМ каждого из άNΤΡ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% Β8Α, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой или 5 Е термостойкой РНКазы Н из Тйегтик ίйе^тορЫ1и8 (Т(Н) (ТоуЬо, далее называется Т(Н РНКаза Н) и 5,5 Е ДНКполимеразы ΒсаΒЕ8Τ, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 6.

Фиг. 6 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают действие химерных олгонуклеотидных праймеров, содержащих инозиндезоксинуклеотиды, когда используют РНКазу Н Е. сой и Т111 РНКазу Н. Полосы 2-9 представляют результаты, полученные с использованием РНКазы Н Е. сой. Полосы 10-17 представляют результаты, полученные с использованием Т111 РНКазы Н. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: пара праймеров, представленных 8Еф ΙΌ Ж 47 и 48, 1 нг матрицы; полоса 3: пара праймеров 120Ι4 и 123Ι4, 1 нг матрицы; полоса 4: пара праймеров 121Ι5 и 124Ι5, 1 нг матрицы; полоса 5: пара праймеров 122Ι6 и 125Ι6, 1 нг матрицы; полоса 6:

- 46 007414 пара праймеров, представленных ЗЕО ГО № 47 и 48, 10 нг матрицы; полоса 7: пара праймеров 120М и 12ЗМ, 10 нг матрицы; полоса 8: пара праймеров 12Н5 и 124^, 10 нг матрицы; полоса 9: пара праймеров 12216 и 12516, 1 нг матрицы; полоса 10: пара праймеров, представленных ЗЕО ГО № 47 и 48, 1 нг матрицы; полоса 11: пара праймеров 120М- и 12ЗМ, 1 нг матрицы; полоса 12: пара праймеров 12Н5 и 124^, 1 нг матрицы; полоса 1З: пара праймеров 122К и 125Ю, 1 нг матрицы; полоса 14: пара праймеров, представленных ЗЕО ГО № 47 и 48, 10 нг матрицы; полоса 15: пара праймеров 120М и 12ЗМ, 10 нг матрицы; полоса 16: пара праймеров 12Н5 и 124^, 10 нг матрицы; и полоса 17: пара праймеров 122К и 125К, 10 нг матрицы.

Как показано на фиг. 6, когда используют праймеры с инозинами, включенными в четвертое или пятое положение от З'-концов праймеров, отмечают увеличение продукта амплификации, представляющего интерес, с использованием или РНКазы Н Е. сой и термостойкой РНКазы Н из Тйегтик ШегторЫ1ик, независимо от количества матрицы. Такие результаты показывают, что реакционная способность в способе IСΑN повышается за счет введения инозина в соответствующую позицию.

(З) Проверяют праймеры с той же целью, какая указана выше в (2). Синтезируют олигонуклеотидные праймеры 1З и 4З с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕО ГО № 84 и 85, в которых три основания с З'-конца представляют собой α-З (или альфа-тио) рибонуклеотиды, т.е., содержащие 5'-фософтиоатные связи в РНК-компоненте. Кроме того, синтезируют олигонуклеотидные праймеры ШЗЮ и 4№ХЗ с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕО ГО Ν 70 и 71, содержащие рибонуклеотиды в трех основаниях от З'-конца и в части последовательности дезоксирибонуклеотидного компонента, т.е. рибонуклеотиды в одиннадцатом и тринадцатом положениях от З'-конца праймера. Используют матричную ДНК, полученную так, как в примере 4. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина, 10 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильную воду, нагревают при 98°С в течение 2 мин с использованием термоциклера и затем помещают на лед для охлаждения.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бНТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, З0 Е РНКазы Н Е. сой или 5 Е Т1Н РНКазы Н и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч в термоциклере.

После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле. В результате в случае использования сочетания праймеров 1З и 4З или ШЗЮ и 4№ХЗ отчетливо отмечают продукт амплификации в ожидаемом положении, независимо от используемой РНКазы Н. Эти результаты подтверждают, что модификация праймера по З'-концу 5'-фосфотиоатом является эффективной для способа настоящего изобретения. Дополнительно установлено, что замещение рибонуклеотидом по подходящему внутреннему положению в дополнение к З'-концу праймера эффективно для повышения реакционной способности в способе настоящего изобретения.

Пример 7.

Проверяют использование в способе настоящего изобретения ДНК-полимеразы с активностью РНКазы Н Е. сой в присутствии определенного иона металла. Денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого из химерных олигонуклеотидных праймеров, используемых в примере 2(1), 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, 1 нг ДНК как матрицы, используемой в примере 2(1), и стерильную воду, и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице. После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из όΝΊ^, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,0% ДМСО и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ и хлорид марганца (ИасаЫ Тексще) в конечной концентрации 0,5, 2,5 или 10 мМ, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. Кроме того, готовят в качестве контроля смесь без добавления хлорида марганца и смесь, в которую добавляют З0 Е РНКазы Н Е. сой, но хлорид марганца не добавляют. После реакции З мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле. Результаты приведены на фиг. 7.

Фиг. 7 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают результаты метода IСΑN с использованием активности РНКазы Н ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: без добавления хлорида марганца/с добавлением РНКазы Н Е. сой; полоса З: без добавления хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; полоса 4: с добавлением 0,5 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; полоса 5: с добавлением 2,5 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; полоса 6: с добавлением 5,0 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; и полоса 7: с добавлением 10,0 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой.

Как видно на фиг. 7, образование представляющего интерес продукта амплификации отмечают в случае реакционной системы, в которую добавляют хлорид марганца в концентрации 2,5 мМ в отсутствие РНКазы Н Е. сой.

Пример 8. Проверяют способ настоящего изобретения с использованием реального биологического

- 47 007414 образца.

(1) Осуществляют детекцию с использованием в качестве матрицы полученного с использованием горячей воды экстракта из культуры энтерогеморрагической ЕзйепсЫа сой О-157 (АТСС, инвентарный № 43895). Энтерогеморрагическую ЕзйепсЫа сой О-157 культивируют в среде тЕС, содержащей новобиоцин, при 42°С в течение 18 ч и затем нагревают при 95°С в течение 10 мин. Вытяжки горячей водой из Е. сой О-157, соответствующие 0, 1, 10, 10², 10³, 10⁴ или 10⁵ клеток, получают разведением вытяжки стерильной водой. Ген веротоксина 2 (УТ2) амплифицируют с использованием одной из таких водных вытяжек Е. сой Щ-157 в тех же условиях, что и в примере 5(1). Кроме того, в качестве контроля проводят ПЦР с использованием той же матрицы в условиях, описанных в примере 5(1). После реакции 1 мкл (Ιί,'ΛΝ) или 5 мкл (ПЦР) каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл.4 и на фиг. 8.

Таблица 4

Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)Предел детекции (клетки)

IСАN (общее время 70 мин)

13510

17310

ПЦР (25 циклов, общее время примерно 66 мин)

13510

ПЦР (30 циклов, общее время примерно 80 мин)

13510

Фиг. 8 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают возможности детекции ЕзсйепсЫа сой О157 с использованием IСАN и ПЦР. Длина модифицируемой цепи 135 п.о. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.): полоса 2: IСАN для 10⁴ клеток; полоса 3: IСАN для 10³ клеток; полоса 4: IСАN для 10² клеток; полоса 5: ПЦР, 25 циклов для 10⁴ клеток; полоса 6: ПЦР, 25 циклов для 10³ клеток; полоса 7: ПЦР, 25 циклов для 10² клеток; полоса 8: ПЦР, 30 циклов для 10⁴ клеток; полоса 9: ПЦР, 30 циклов для 10³ клеток; и полоса 10: ПЦР, 30 циклов для 10² клеток.

Как видно из табл. 4 и фиг. 8, подтверждается, что чувствительность детекции способа детекции настоящего изобретения эквивалентна чувствительности ПЦР, и что способ настоящего изобретения требует меньшего времени для детекции по сравнению со временем, требуемым в случае ПЦР.

(2) Обнаруживают λ ДНК с использованием праймеров, представленных ЗЕО ПЭ N 40 и 56, используемых в примерах 2 и 4. Реакцию проводят следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого праймера, 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, от 10 фг до 1 нг λ ДНК(Такага Зйихо) и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из 6№ТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл.5.

Таблица 5

125 1 пг

Как видно из табл.5, подтверждается, что способ настоящего изобретения эффективен для детекции λ ДНК.

(3) Осуществляют детекцию с использованием геномной ДНК из бактерии Е1атоЬас1епит зр. ЗА0082 в качестве матрицы и праймеров, представленных ЗЕО Ю № 61 и 62, используемых в примере 6(1). Геномную ДНК как матрицу получают согласно обычному способу из бактерии рода Е1ауоЬас1егшт, культивированной так, как описывается в \УО 97/32010. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, получают 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого праймера, 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, от 10 фг до 1 нг геномной ДНК и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из 6№ТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 52°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл.6 и на фиг. 9.

Таблица 6

100 фг

Фиг. 9 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают обнаружение бактерии рода

- 48 007414

Е1ауоЬас1егшт. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: 1 нг матрицы; полоса 3: 10 пг матрицы; полоса 4: 1 пг матрицы; полоса 5: 100 фг матрицы; и полоса 6: 10 фг матрицы.

Как видно из табл.6 и фиг. 9, подтверждается, что способ настоящего изобретения эффективен для детекции бактерий.

Пример 9. Проверяют способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, в котором объединяют способ амплификации настоящего изобретения и способ гибридизации. В качестве мишени выбирают энтерогеморрагическую ЕксйепсШа со11 0-157. ДНК как матрицу получают так, как описывается в примере 8(1). В качестве фрагмента для амплификации выбирают участок длиной около 100 п.о. с содержанием ОС около 40%. В качестве праймеров используют праймеры УТ2-1Е20 и УТ2-1К20-2 с нуклеотидными последовательностями, представленными БЕО ΙΌ N 51 и 72. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого из праймеров УТ2-1Е20 и УТ2-1К202, раствор для отжига, содержащий пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%, одну из вытяжек горячей водой, соответствующую 0-10⁴ клеткам, и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 55°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1 (Такага БНи/о), и затем помещают на лед для отжига.

После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях, буфер 20 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1,% ДМСО, 0,01% ВБА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из НЫТР, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Затем реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1, установленный на 55°С, и инкубируют при указанной температуре в течение 60 мин. В качестве контроля с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1 проводят ПЦР с использованием набора для типирования О-157 Туртд Бе! (Такага Бйнхо) согласно руководству. ПЦР осуществляют следующим образом: 35 циклов - 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Для такой реакции требуется примерно 4 мин на цикл, и общее время составляет примерно 145 мин. Ожидаемый размер продукта амплификации примерно 404 п.о. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% геле №Б1еуе-агарозе, 3:1. Результаты приводятся на фиг. 28 А. Фиг. 28 А иллюстрирует результаты электрофореза по детекции гена веротоксина II энтерогеморрагической ЕксйепсШа сой О-157 с использованием методов Κ.ΆΝ или ПЦР. Полоса М1: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса М2: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса Ν: отрицательный контроль; полоса 1: матрица, соответствующая 1 клетке; полоса 2: матрица, соответствующая 10 клеткам; полоса 3: матрица, соответствующая 10² клеток; полоса 4: матрица, соответствующая 10³ клеток; и полоса 5: матрица, соответствующая 10⁴ клеток. Кроме того, в табл. 7 приводятся результаты сравнения уровней амплификации, достигнутых методами Ιί.ΆΝ и ПЦР для 1 клетки или для 10 клеток.

Таблица 7

	Число клеток Е. сой 0-157
0	1	10
1САЫ	-	+	+++
ПЦР	-	+	++

- : амплификация отсутствует; от + до +++ указывает степень амплификации по 3-балльной шкале.

Как видно из фиг. 28А и табл. 7, представляющие интерес продукты амплификации образуются в случае реакционных систем с использованием вытяжки горячей водой, соответствующей 1 клетке, согласно способу детекции как настоящего изобретения, так и ПЦР. Также методом дот-блоттинга осуществляют гибридизацию продукта амплификации, полученного по способу ΙΕΆΝ, с использованием в качестве зонда олигонуклеотида УТ2 с нуклеотидной последовательностью, представленной БЕО ΙΌ № 73, меченного биотином по 5'-концу. Гибридизацию осуществляют следующим образом. Коротко, 1 мкл реакционной смеси денатурируют при 98°С в течение 5 мин, быстро охлаждают на льду, и наносят каплями на мембрану НуЬопН-Ν® (Атегкйат Рйагтааа Вю1ес11). После воздействия УФ мембрану помещают в гибридизационный мешок. Добавляют в него 10 мл раствора для гибридизации, содержащего 0,5 М двухзамещенный фосфат натрия (рН 7,2), 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту и 7% лаурилсульфат натрия. Затем осуществляют предварительную гибридизацию при 42°С в течение 30 мин. Денатурируют нагреванием тепла 10 мкл раствора зонда УТ2 с концентрацией 100 нг/мкл и добавляют к реакционной системе предварительной гибридизации. После гибридизации при 42°С в течение 60 мин мембрану дважды промывают при комнатной температуре в течение 5 мин в растворе, содержащем 66,6 мМ хлорид натрия, 66,6 мМ цитрат натрия и 0,1% лаурилсульфат натрия, инкубируют при 42°С в течение 12 мин в 6 мл буфера для промывки (0,3 М хлорид натрия, 17,3 мМ двухзамещенный фосфат натрия двухводный, 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 % лаурилсульфат натрия), к которому добавляют 2 мкл конъюгата пероксидазы из хрена и стрептавидина (Р1ЕКСЕ) с концентрацией 5 мг/мл, и затем дважды промывают в буфере для промывки при комнатной температуре. Затем мембрану промывают в 10 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 5,0) при комнатной температуре и дают реагировать со смесью 5 мл 0,1 М цитратного буфера, 5 млк

- 49 007414

3% пероксида водорода и 250 мкл раствора 2 мг/мл тетраметилбензидина (ТМВ, №аса1а1 Текс.|ие) в этаноле в темноте в течение примерно 10 мин. После появления окраски реакцию обрывают деионизованной водой. Результаты показаны на фиг. 28В. Фиг. 28В показывает результаты гибридизации методом дотблоттинга для детекции гена веротоксина II из энтерогеморрагической ЕксйепсЫа сой О-157 способом ΙΓΆΝ. Результаты совпадают с результатами, полученными в случае описанного выше электрофореза. Таким образом, чувствительность детекции способа настоящего изобретения эквивалента чувствительности ПЦР. Общее время, необходимое для реакции амплификации с использованием способа ΙΓΆΝ настоящего изобретения, составляет 1/2 или меньше по сравнению со временем, требуемым для ПЦР. Таким образом, подтверждается, что способ ΙΓΆΝ настоящего изобретения эффективен как способ детекции патогена и т. п.

Пример 10.

(1) Проверяют сочетание обратно-транскриптазной реакции и способа настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы РНК из культивированных клеток. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, клетки КА^264.7 (АТСС Т1В 71) суспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Вю ^Ыйакег, 12-604Е), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (С1Ьсо), в концентрации 1,5 х 10⁵ клеток/мл. В каждую лунку 6-луночного микротитровального планшета добавляют по 5 мл суспензии, и планшет инкубируют при 37°С в течение ночи в присутствии 5% СО2. В лунки добавляют 50 мкл раствора 100 мкг/мл липополисахарида (ЬРЗ, З1дта) в воде и 50 мкл раствора 1000 Е/мкл интерферона-γ (ΙΕΝ-γ, Сепхуте Тесйпе) в воде. Планшет инкубируют еще в течение 4 ч. Затем из клеток получают РНК с использованием набора Кпеаку М1ш Κίΐ (О1адеп) согласно инструкциям, приложенным к набору. В качестве отрицательного контроля используют группу, в которую ЬРЗ или ΙΕΝ-γ не добавляют.

Получают кДНК, инкубируя, с использованием термоциклера (СепАтр РСК Зук1ет 9600, Аρρ1^еά Вюкук1етк), 60 мкл смеси, содержащей 3 мкг полученной таким образом РНК, 10 мМ Трисгидрохлоридный буфер (рН 8,3), 50 мМ КС1, 5 мМ МдС1₂, по 1 мМ каждого άNΤР, 150 пмоль случайного 6-мерного праймера, 60 Е ингибитора рибонуклеазы (Такага ЗНихо) и 15 Е обратной транскриптазы ХЬ (АΜV) (Такага ЗНихо, 2620А), при 30°С в течение 10 мин, при 42°С в течение 1 ч и затем при 99°С в течение 5 мин, для инактивации фермента.

Праймеры с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕЦ ΙΌ № 74 и 75, синтезируют на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой NО-синтазы (|НОЗ) (СепеВапк, инвентарный № NΜ-010927). В качестве контроля также синтезируют праймеры для РСК, представленные ЗЕЦ ΙΌ № 76 и 77.

Готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 2 мкл водного раствора пропилендиамина в концентрации 0,05%, 1 мкл кДНК как матрицы (соответствует 50 нг РНК) и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 55°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин в термоциклере для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άNΤР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 15 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55 °С в течение 1 ч в термоциклере. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С. В качестве контроля проводят ПЦР следующим образом. Коротко, 50 мкл реакционной смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 1 мкл кДНК (соответствует 50 нг РНК), 5 мкл 10-кратного Ех Тас.|-буфера (Такага ЗНихо), 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-полимеразы (Такага З1шхо) и 0,2 мМ каждого из άNΤР, дают реагировать в термоциклере. Программа следующая: 1 цикл - 94°С в течение 2 мин; 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 10.

Фиг. 10 иллюстрирует результаты электрофореза, показывающие сравнение между способами КТЮАН (А) и ОТ-ПЦР (В). Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: группа отрицательного контроля; и полоса 3: группа, обработанная ЬРЗ и ΙΕΝ-д.Как видно на фиг. 10, образование продуктов амплификации отмечают как в случае способа настоящего изобретения, так и ПЦР только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК, полученную из клеток, обработанных ЬРЗ и ΙΕΝ-γ. Таким образом, подтверждается, что, так как для способа настоящего изобретения требуется более короткий промежуток времени для реакции, по сравнению с ПЦР, способ настоящего изобретения более эффективен как способ амплификации ДНК после обратной транскрипции.

Пример 11.

РНКаза Н Е. сой, для которой оптимальной температурой является 37°С, может подвергаться инактивации во время реакции амплификации по настоящему изобретению. Поэтому проверяют влияние добавления РНКазы Н Е. сой в реакционную смесь во время реакции амплификации. В качестве матричной ДНК используют амплифицированный фрагмент (1071 п.о.), полученный ПЦР с использованием прай

- 50 007414 меров СМО-РСК-Е и СМО-РСК-К, представленных ЗЕф ΙΌ Ыо 78 и 79, и геномной ДНК, экстрагированной из рекомбинантных бобов сои, в которую введен промотор 35З вируса мозаики цветной капусты и ген ЕРЗРЗ. Кроме того, используют праймеры СМО-З1, З2, А1 и А2 с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕф ΙΌ Ыо 80-83. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%, от 1 пг до 10 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и охлаждают до 55°С для отжига.

После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях, 500 мкМ каждого из кЫТР, буфер 34 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,7), 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% ВЗА, 1% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют в термоциклере при 55°С в течение 25 мин. Через 25 мин после начала реакции в смесь добавляют еще 30 Е РНКазы Н Е. сой. Смесь инкубируют при 55°С в течение 30 мин. В качестве контроля проводят реакцию, инкубируя смесь при 55°С в течение 55 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозе. В результате подтверждается, что эффективность амплификации улучшается за счет добавления РНКазы Н Е. сой во время реакции, независимо от концентрации матричной ДНК, для любого сочетания праймеров З1/А1, З1/А2, З2/А1 и З2/А2.

Пример 12.

Проверяют сочетание способа амплификации или дупликации нуклеиновой кислоты для использования в качестве матрицы в настоящем изобретении и способа настоящего изобретения. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, проводят транскрипцию ш уйго с использованием в качестве матрицы плазмиды, содержащей ген вироида хризантемы, полученной так, как описывается в примере 5(3), которую дуплицируют в ЕкйейсЫа сой, и Т7-РНК-полимеразы (Такага З1иао) для получения фрагмента, дуплицированного с РНК. Синтезируют кДНК с использованием праймеров с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕф ΙΌ Ыо 57 и 58, и набора для синтеза кДНК (Такага Зйцао). Реакцию амплификации осуществляют так, как описывается в примере 5(3), с использованием в качестве матрицы фрагмента кДНК или дуплицированной плазмиды. В результате подтверждается, что в способе настоящего изобретения можно использовать в качестве матрицы как нуклеиновую кислоту, дуплицированную в форме плазмиды, так и нуклеиновую кислоту в форме кДНК, дуплицированной с РНК с использованием РНК-полимеразы.

Пример 13.

(1) Синтез праймеров.

Олигонуклеотидные праймеры N81 и ЫЗ2, представленные ЗЕф ΙΌ Ыо 86 и 87, синтезируют на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой ЫО-синтазы (1ЫОЗ).

(2) Амплификация фрагмента ДНК способом ГСАЫ с использованием в качестве матрицы продукта ПЦР.

Смесь (10 мкл), содержащую 50 пмоль каждого синтетического олигонуклеотидного праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина и от 10 фг до 10 пг матрицы, с использованием термоциклера (СепеАтр РСК ЗуЦет 9600, Аррйек ЗуЦеиъ) нагревают при 98°С в течение 2 мин и затем, для отжига праймеров к матрице, при 60°С в течение 2 мин кДНК 1ЫОЗ (741 п.о.), амплифицированную с использованием праймеров ЫЗ-РСК1 и ЫЗ-РСК2, представленных ЗЕф ΙΌ Ыо 132 и 133, и затем очищенную с использованием Зиргес02 (Такага Зй^о), используют в качестве матрицы. В прогретый раствор добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из кЫТР, буфер 40 мМ НЕРЕЗгидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 0,0156 мкг Р£ц РНКазы Н и 0,66 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. По 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в 3,0%) агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 11. Фиг. 11 представляет результаты ГСАЫ с использованием Р£и РНКазы Н. Полоса 1: маркер молекулярной массы (100 п.о.); полоса 2: 10 фг матрицы; полоса 3: 100 фг матрицы; полоса 4: 1 пг матрицы; и полоса 5: 10 пг матрицы.

Как видно на фиг. 11, образование продукта амплификации, представляющего интерес, отмечают при использовании 100 фг матрицы.

Пример 14.

(1) Получение ДНК.

Клетки КА^264.7 (АТСС ТШ 71) суспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Вю ^йИакег), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (С1Ьсо), в концентрации 1,5 х 10⁵клеток/мл. В каждую лунку 6-луночного микротитровального планшета добавляют по 5 мл суспензии, и планшет инкубируют при 37°С в течение ночи в присутствии 5% СО₂. В лунки добавляют 50 мкл раствора 100 мкг/мл липополисахарида (ЬРЗ, З1дта) в воде и 50 мкл раствора 1000 Е/мкл интерферона-γ (ГЕЫγ, Сеηζуше Тесйпе) в воде. Планшет инкубируют еще в течение 4 ч. Затем из клеток получают РНК с использованием набора КЫеаку М1ш Кй (ф1адеп, 74104) согласно инструкциям, приложенным к набору. В качестве отрицательного контроля используют группу, в которую ЬРЗ или ГЕЫ-γ не добавляют.

Получают кДНК, инкубируя, с использованием термоциклера (СепАтр РСК ЗуЦет 9600, Аррйек

- 51 007414

В1окук1етк), 60 мкл смеси, содержащей 3 мкг полученной таким образом РНК, 10 мМ Трисгидрохлоридный буфер (рН 8,3), 50 мМ КС1, 5 мМ МдСЬ, по 1 мМ каждого бЭТР, 150 пмоль случайного 6-мерного праймера, 60 Е ингибитора рибонуклеазы (Такага 8йпхо) и 15 Е обратной транскриптазы ХЬ (АМУ) (Такага 8йи/о, 2620А), при 30°С в течение 10 мин, при 42°С в течение 1 ч и затем при 99°С в течение 5 мин для инактивации фермента.

Праймеры Ν85 и Ν86 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕД ГО Νο 92 и 93, синтезируют на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой NОсинтазы (|ХО8). Кроме того, также синтезируют праймеры для ПЦР Ν83 и Ν84, представленные 8ЕД ГО Νο 88 и 89.

Смесь (50 мкл), содержащую 50 пмоль каждого из праймеров Ν85 и Ν86, в качестве матрицы 1 мкл раствора кДНК, синтезированной так, как описывается выше (соответствует 50 нг РНК), или его 10-, 1001000- или 10000-кратного разведения водой, 0,5 мМ каждого из бNТΡ, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8А, 1% ДМСО, 0,0156 мкг РГи РНКазы Н и 0,66 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С.

С другой стороны, проводят ПЦР в качестве контроля. С использованием термоциклера проводят реакцию в 50 мкл реакционной системы, содержащей 50 пмоль каждого из праймеров Ν83 и Ν84, 1 мкл раствора кДНК (соответствует 50 нг РНК) или его 10-, 100-, 1000- или 10000-кратного разведения водой, 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера (Такага 8йц/о), 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-полимеразы (Такага 8йпхо) и 0,2 мМ каждого из б№ТР. Программа следующая: 1 цикл - 94°С в течение 2 мин; 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С.

По 5 мкл каждой реакционной смеси (IСΑN или ПЦР) анализируют методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 12. Фиг. 12 показывает результаты детекции гена |ХО8 способом IСΑN с использованием РНКазы Н или ПЦР. Полоса 1: ступенчатый маркер ДНК с шагом 100 п.о.; полоса 2: 10000-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса 3: 1000-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса 4: 100-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса 5: 10-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса 6: исходный раствор кДНК отрицательного контроля; полоса 7: 10000-кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬР8 и ΨΝ-γ; полоса 8: 1000-кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬР8 и ΣΕΝ-γ; полоса 9: 100кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬР8 и ΤΝ-γ; полоса 10: 10-кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬР8 и ΓΡΝ-γ; и полоса 11: исходный раствор кДНК из группы с добавлением ЬР8 и ΓΡΝ-γ.

Как видно на фиг. 12, продукты амплификации отмечают в случае как ΚΙΆΝ, так и ПЦР только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК, полученную из клеток, обработанных ЬР8 и ΓΡΝ-γ. В случае IСΑN образование продукта амплификации отмечают с использованием 1000-кратного разведения кДНК. В случае ПЦР образование продукта амплификации отмечают с использованием 100-кратного разведения кДНК.

Пример 15.

(1) Синтезируют олигонуклеотидные праймеры 4 и 5, представленные 8ЕД ГО Νο 90 и 91, на основе нуклеотидной последовательности λ ДНК. Олигонуклеотидный праймер 4 является смысловым праймером с 75% содержанием СС. Олигонуклеотидный праймер 5 является антисмысловым праймером с 80% содержанием СС.

Реакционную систему (10 мкл), содержащую по 120 пмоль каждого из праймеров 4 и 5, 2 мкл 0,05% раствора пропилендиамина и 10 нг матрицы денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице. В качестве матрицы используют продукт ПЦР (1005 п.о.), очищенный с использованием 8иргес02 так, как описывается в примере 2.

(2) После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из б№ТР, буфер 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 0,5 мкл РНКазы НП ТйегшоЮда тагИта (0,58 мкг/мл) и 2,2 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и осуществляют IСΑN при 60, 65 или 70°С в течение 1 ч. После IСΑN по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 13. Фиг. 13 показывает результаты IСΑN с использованием РНКазы НИ. ТйегшоЮда тагйта. Полоса 1: маркер молекулярной массы (100 п.о.); полоса 2: температура реакции 60°С; полоса 3: температура реакции 65°С; и полоса 4: температура реакции 70°С.

Как видно на фиг. 13, образование продуктов амплификации, представляющих интерес, отмечают в случае соответствующих температур реакции.

Пример 16.

(1) Проверяют амплификацию фрагмента ДНК способом IСΑN с использованием в качестве матрицы продукта ПЦР (денатурированного под действием щелочи). Смешивают 1 мкл раствора, содержащего от 10 фг до 10 пг матрицы, и 1 мкл 0,4 Ν раствора №1ОН. Смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин

- 52 007414 для денатурации матрицы. В качестве матрицы используют ПЦР-амплифицированную кДНК ίΝΘδ (741 п.о.), очищенную с использованием 8иргес02 (Τака^а ЗНихо), как описано в примере 1З. Каждую из денатурированных матриц нейтрализуют с использованием 1 мкл 0,4 Ν НС1. Добавляют 47 мкл реакционной смеси, содержащей по 50 пмоль каждого из праймеров Ν81 и Ν82, 0,5 мМ каждого из άΝΤΡ, буфер З2 мМ НЕΡЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8Α, 1,0% ДМСО, 0,0156 мкг ΡΓιι РНКазы Н и 0,66 Е ДНК-полимеразы ВсаБЕЗЕ Смесь инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. Анализируют по 5 мкл каждой реакционной смеси методом электрофореза в З,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 14. Фиг. 14 показывает результаты Κ'.ΆΝ с использованием матрицы, денатурированной под действием щелочи. Полоса 1: маркер молекулярной массы (100 п.о.); полоса 2: 10 фг матрицы; полоса З: 100 фг матрицы; полоса 4: 1 пг матрицы; и полоса 5: 10 пг матрицы.

Как видно на фиг. 14, образование продукта амплификации отчетливо наблюдается при использовании 1 пг матрицы.

Пример 17.

(1) Проверяют амплификацию фрагмента ДНК способом Ιί,ΆΝ без денатурации матрицы. В качестве праймеров используют праймеры Ν85 и Ν86, представленные 8ЕО ΙΌ Ыо 92 и 9З. В качестве ДНКматрицы используют матрицу, полученную в примере 1З.

Реакционную смесь (50 мкл), содержащую от 10 фг до 100 пг матрицы или воды в случае отрицательного контроля, по 50 пмоль каждого из праймеров Ν85 и Ν86, 0,5 мМ каждого из άΝΤΡ, буфер З2 мМ НЕΡЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8Α, 1,0% ДМСО, 0,0156 мкг ΡΓυ РНКазы Н и 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Τ (Наката ЗНихо), инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в З,0% агарозном геле. Результаты электрофореза приводятся на фиг. 15. Фиг. 15 иллюстрирует результаты электрофореза для способа амплификации настоящего изобретения без денатурации матрицы. Полоса 1: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль (вода); полоса З: 10 фг матрицы; полоса 4: 100 фг матрицы; полоса 5: 1 пг матрицы; полоса 6: 10 пг матрицы; и полоса 7: 100 пг матрицы.

Как видно на фиг. 15, образование продукта амплификации, представляющего интерес, отмечают при использовании 1 пг матрицы.

Пример 18.

(1) Синтезируют праймеры р^ΟN-ΑI-1 и р^ΟN-ΑI-2, представленные 8ЕО ΙΌ № 94 и 95, на основе нуклеотидной последовательности ДНК области упаковки векторной плазмиды р^ΟN-ΑI (Наката 81шхо).

(2) Амплификация фрагмента ДНК способом Κ'.ΆΝ без денатурации матрицы Реакционную смесь (50 мкл), содержащую 1 мкл раствора, содержащего от 10 фг до 1 нг ДНК р^ΟN-ΑI или воды в качестве отрицательного контроля, 50 пмоль каждого праймера, 0,5 мМ каждого из άΝΤΡ, буфер З2 мМ НЕЕЕ8гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8Α, 1,0% ДМСО, 0,0156 мкг ΡΓυ РНКазы Н, полученной так, как в ссылочном примере 4, и 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Τ, инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. По 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в З,0% агарозном геле. Результаты электрофореза приводятся на фиг. 16. Фиг. 16 иллюстрирует результаты электрофореза для способа настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы кольцевой двухцепочечной ДНК без денатурации. Полоса 1: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль (вода); полоса З: 10 фг матрицы; полоса 4: 100 фг матрицы; полоса 5: 1 пг матрицы; полоса 6: 10 пг матрицы; полоса 7: 100 пг матрицы; и полоса 8: 1 нг матрицы.

Как видно на фиг. 16, подтверждается, что продукт амплификации, представляющий интерес, получают при использовании 10 фг матрицы.

Пример 19.

Проверяют детекцию гена вируса 16 папилломы человека с использованием способа настоящего изобретения. В качестве матрицы используют ДНК из клеток, инфицированных вирусом 16 папилломы человека (клетки Са8к1 (Байирроп ΡНа^тасеШ^са1), содержат 500 копий вируса 16 папилломы человека на клетку). В качестве праймеров для детекции НΡV16 используют праймеры НΡV16 8З и №ν16 А2 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 96 и 97. Ожидаемый размер продукта амплификации, полученного с использованием пары праймеров, составляет примерно 120 п.о. Реакцию осуществляют следующим образом.

Готовят 10 мкл смеси, содержащей 1 пг, З пг, З0 пг, 100 пг, З00 пг, 1 нг, З нг или 10 нг матричной ДНК, 50 пмоль каждого из праймеров №ν16 8З и №ν16 А2 и пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%. Смеси инкубируют при 98°С в течение 2 мин и при 55°С в течение 1 мин в термоциклере Τ1κηηα1 Сус1ег Еегкопак и затем помещают на лед. К смеси добавляют, в конечных концентрациях, буфер 20 мМ НЕΡЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1,0% ДМСО, 0,01% В8Α, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из άΝΤΡ, З0 Е РНКазы Н Е. со11 и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Е и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси помещают в термоциклер, установленный на 55°С, и проводят реакцию в течение 60 мин. В качестве контроля осуществляют ПЦР в термоциклере Τ1κηηα1 Сус1ег Ρе^коηа1 с использованием праймеров вируса папилломы человека НΡVр16 (прямого, обратного)

- 5З 007414 (Такага Зйи/о) согласно руководству. Ожидаемый размер продукта амплификации 140 п.о.

После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле №1З|еуеагароза 3:1. Фиг. 17А показывает результаты обнаружения гена НРУ16 с использованием IСАN и ПЦР. Полоса М1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса М2: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса 1: без матрицы; полоса 2: 1 пг матрицы; полоса 3: 3 пг матрицы; полоса 4: 30 пг матрицы; полоса 5: 100 пг матрицы; полоса 6: 300 пг матрицы; полоса 7: 1 нг матрицы; полоса 8: 3 нг матрицы; и полоса 9: 10 нг матрицы.

Как видно на фиг. 17А, подтверждается, что продукты амплификации, представляющие интерес, получают при использовании 3 пг матричной ДНК в случае IСАN и 1 пг матричной ДНК в случае ПЦР, соответственно.

Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов реакции методом дот-блоттинга с использованием олигонуклеотидного зонда НРУ16 с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕф ГО Νο 98. Гибридизацию осуществляют так, как описывается в примере 9. Результаты приводятся на фиг. 17В. Фиг. 17В показывает результаты детекции гена НРУ16 гибридизацией методом дот-блоттинга после проведения ПЦР и ΚΆΝ. Полоса 1: без матрицы; полоса 2: 1 пг матрицы; полоса 3: 3 пг матрицы; полоса 4: 30 пг матрицы; полоса 5: 100 пг матрицы; полоса 6: 300 пг матрицы; полоса 7: 1 нг матрицы; полоса 8: 3 нг матрицы; и полоса 9: 10 нг матрицы.

Как видно из фиг. 17В, чувствительность детекции с использованием методов IСАN и ПЦР почти одинаковая. Таким образом, подтверждается, что указанные способы эффективны для обнаружения вирусов и т.п.

Пример 20. Проверяют детекцию гена вируса 16 папилломы человека в клиническом образце ДНК. В качестве матриц используют ДНК, полученные обычным способом из 6 клинических образцов, полученных с информированного согласия пациентов. Типы инфицирующих НРУ в пробах, полученных из клинических образцов, были предварительно подтверждены ПЦР. В качестве праймеров для детекции НРУ16 используют праймеры НРУ16 З3 и НРУ16 А2, описанные в примере 19. Концентрации образцов ДНК из клинических образцов, используемых в качестве матриц, доводят до 100 нг/мкл с помощью ТЕбуфера. Используют те же состав реакционной смеси и условия реакции, как в примере 19, за исключением количества матрицы. Кроме того, осуществляют подобные реакции с использованием реакционной смеси без добавления матричной ДНК в качестве отрицательного контроля и реакционной смеси, содержащей 500 пг ДНК из клеток СаЗк1, инфицированных НРУ 16, в качестве положительного контроля. После реакции 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле М^ете-агароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 18А. Фиг. 18А показывает результаты детекции гена НРУ16 в клинических образцах. Полоса М: маркер молекулярной массы; полосы 1-6: клинические образцы; полоса 7: отрицательный контроль; и полоса 8: положительный контроль.

Как видно из фиг. 18 А, отмечают образование продуктов амплификации по способу IСАN длиной около 120 п.о. в случае образцов, где инфицирование НРУ16 было доказано обычной ПЦР. Амплификацию не наблюдают в случае образцов, инфицированных другими типами НРУ, или неинфицированных образцов.

Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов амплификации методом дот-блоттинга, как описывается в примере 9. Результаты приводятся на фиг. 18В. Фиг. 18В показывает результаты детекции гена НРУ16 в клинических образцах гибридизацией методом дот-блоттинга. Полосы 1-6: клинические образцы; полоса 7: отрицательный контроль; и полоса 8: положительный контроль.

Как видно на фиг. 18В, получают результаты, совпадающие с результатами, полученными электрофорезом, что подтверждает, что результаты, схожие с результатами ПЦР, можно получить с использованием электрофореза, а также гибридизации методом дот-блоттинга. Таким образом, подтверждается, что НРУ 16 можно обнаружить в реальных клинических образцах согласно способу настоящего изобретения, и что способ эффективен для детекции вируса и т.п.

Таблица 8

Образец	Типирование методом ПЦР	IСАN-амплификация с использованием праймера для детекции НРУ16
№3	не инфицирован	-
№4	не инфицирован	-
№6	тип 18	-
№7	тип 16	+
№8	тип 67	-
№9	тип 16	+
Без матрицы	*	-
Полож. контроль	*	+

-: нет амплификации; + : амплификация отмечается.

Пример 21. Проверяют детекцию НСУ в клинических образцах. Образцы получают из 300 мкл каж

- 54 007414 дой из 5 сывороток от пациентов с НСУ, полученных с информационного согласия пациентов, с использованием реагента ТКIζо1 (Ь1£е ТесЬпо1од1ек), согласно инструкциям, приложенным к реагенту, и, наконец, растворяют в 6 мкл воды для инъекций (О(кика Рйагтасеибса1), получая образцы РНК. РНК, экстрагированную подобным же образом из 300 мкл сыворотки здорового индивидуума, используют в качестве отрицательного контроля. Сначала, с использованием набора КNΑ РСК й( (ΑΜА), уег. 2.1 (Такага 8й^о), готовят 4 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции, содержащей 1-кратный буфера КNΑ РСК, 5 мМ МдСй, 1 мМ бЫТР, 1 Е обратной транскриптаза ХЬ ΑΜV, по 10 пмоль каждого праймера НСУ-Р и НСУ-К, представленных 8ЕО ГО Ыо 99 и 100, и 2 мкл одного из образцов РНК. Смеси нагревают при 30°С в течение 10 мин, и затем проводят реакцию при 50°С в течение 30 мин. После обратной транскрипции осуществляют IСΑЫ. Для IСΑЫ используют праймеры НСУ-Р2 и НСУ-К1 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ГО Ыо 101 и 102. Реакцию осуществляют следующим образом.

Готовят 10 мкл смеси, содержащей по 50 пмоль каждого праймера, 3 мкл одной из реакционных смесей для обратной транскрипции и пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%. В качестве контроля используют 3 мкл стерильной воды. Смеси в термоциклере Т11егта1 Сус1ег Регкопа1 нагревают при 98°С в течение 2 мин, быстро охлаждают до 60°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин, и переносят на лед.

После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 10 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% Β8Α, 4 мМ ацетат магния, по 500 мкМ каждого бЫТР, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Т11егта1 Сус1ег МР, установленный на 60°С, и проводят реакцию в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле Ыи81еуе-агароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 19 А. Фиг. 19А показывает результаты детекции НСУ в клинических образцах. Полоса В: стерильная вода в качестве матрицы; полоса 1: образец от здорового индивидуума; полосы 2-6: образцы от пациентов с НСУ; и полоса М: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.).

Как видно на фиг. 19 А, продукты амплификации размером около 107 п.о., ожидаемым на основании нуклеотидной последовательности генома НСУ, отмечают только в образцах РНК от пациентов с НСУ, в то время как такого продукта амплификации не наблюдают в случае сыворотки здорового индивидуума и контроля. Кроме того, методом дот-блоттинга осуществляют гибридизацию IСΑЫ-амплифицированных продуктов, как описано в примере 9, с использованием зонда для НСУ, представленного 8ЕО ГО Ыо 103, биотинилированного по 5'-концу. Результаты приводятся на фигуре 19В. Полосы для образцов на фиг. 19В соответствуют указанным для электрофореза.

Как видно на фиг. 19, подтверждается, что результаты электрофореза соответствуют результатам гибридизации дот-блоттингом. Такие результаты подтверждают, что способ настоящего изобретения можно использовать для детекции НСУ в реальных клинических образцах, и он эффективен для детекции вируса и т.п.

Пример 22. Проверяют способ детекции аденовируса.

Праймеры для амплификации Е1 А (опухолевый ген) - Е1 А-1 (смысловой), Е1 А-2 (антисмысловой) и Е1А-3 (антисмысловой), представленные 8ЕО ГО Ыо 104-106, конструируют на основе нуклеотидной последовательности аденовируса (СепеВапк, инвентарный № Ю1917). Используют аденовирус (АТСС, инвентарный № УК-5). Матрицу готовят следующим образом. Инкубируют 100 мкл раствора, содержащего аденовирус в концентрации 8,73 х 10¹⁰ бляшкообразующих единиц/мл (бое/мл), в присутствии 8Ό8 в конечной концентрации 0,1% и протеиназы К в конечной концентрации 0,2 мг/мл при 37°С в течение 1 ч. ДНК очищают адсорбцией на силикагеле. Используют аденовирусные ДНК, соответствующие по количеству 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶ бое, полученные разведением очищенной ДНК стерильной водой. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл реакционной системы, содержащей по 60 пмоль каждого из праймеров Е1А-1 и Е1А-2 (длина амплифицируемой цепи 112 п.о.) или Е1А-1 и Е1А-3 (длина амплифицируемой цепи 91 п.о.), 2 мкл 0,05% раствора пропилендиамина и матрицу, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бЫТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% Β8Α, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. со11 и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч. В качестве контроля осуществляют детекцию методом ПЦР с использованием той же матрицы, описанной выше, и праймеров, сконструированных для ПЦРамплификации Е1А (опухолевый ген) - Е1А-1Р (смысловой), Е1А-2Р (антисмысловой) и Е1А-3Р (антисмысловой), с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ГО Ыо 107, 108 и 142. ПЦР осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 50 мкл раствора для ПЦР, содержащего по 60 пмоль каждого из праймеров Е1А-1Р и Е1А-2Р (длина амплифицируемой цепи 112 п.о.) или Е1А-1Р и Е1А-3Р (длина амплифицируемой цепи 91 п.о.), 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера (Такага 8Ниζо). 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-ДНК-полимеразы (Такага 81шхо) и 0,2 мМ каждого из бЫТР. Условия РСК следующие: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с.

- 55 007414

После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси IСАN и ПЦР подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 20 и в табл.9. Фиг. 20 показывает результаты детекции вирусного гена Е1 А из аденовирусных частиц. Полосы 1-10 показывают результаты, полученные с использованием комбинации праймеров Е1 А-1 и Е1 А-2. Полосы 11-20 показывают результаты, полученные с использованием комбинации праймеров Е1А-1 и Е1А-3. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10⁶бое; полоса 3: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10⁵ бое; полоса 4: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10⁴ бое; полоса 5: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10³ бое; полоса 6: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 7: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10⁶ бое; полоса 8: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10⁵ бое; полоса 9: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10⁴ бое; полоса 10: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10³ бое. Кроме того, полоса 11: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 12: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10⁶ бое; полоса 13: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10⁵ бое; полоса 14: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10⁴ бое; полоса 15: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 10³ бое; полоса 16: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 17: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10⁶ бое; полоса 18: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10⁵ бое; полоса 19: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10⁴ бое; и полоса 20: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 10³ бое.

Таблица 9

Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)	Предел детекции
^Ν	ПЦР
112	10⁴	10⁴
91	10⁴	10⁴

Как видно из фиг. 20 и табл .9, подтверждается, что чувствительность детекции в случае детекции гена Е1А аденовируса методом IСАN эквивалента чувствительности ПЦР.

Пример 23.

Проверяют детекцию интегрированного вирусного гена в клетках, инфицированных ретровирусным вектором. Клетки, инфицированные ретровирусом, и геномную ДНК получают следующим образом. Коротко, векторную плазмиду рОО^А! (Такага δΐιιιζο) вводят в упаковывающие клетки СРЕ+86 кальций-фосфатным способом. Из культурального супернатанта трансфицированных клеток получают экотропный вектор. Клетки, инфицированные вирусным вектором, получают путем инфицирования клеток МН/3Т3 экотропным вектором и культивирования инфицированных клеток в течение 14 суток в среде, содержащей С418. Из 4 х 10⁴ клеток, инфицированных ретровирусом, обычным способом получают 27 мкг геномной ДНК. В качестве праймеров используют праймеры рОО^АЫ и рОО^АМ, описанные в примере 18(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл реакционной системы, содержащей 60 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,25% водного раствора пропилендиамина и от 0,1 до 1000 нг геномной ДНК в качестве матрицы, нагревают в термоциклере (Такага δΐιιιζο) при 98°С в течение 2 мин и затем при 60°С для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из д№ГР, буфер 40 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 5 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Кроме того, для сравнения чувствительности детекции ДНК методом IСАN и ПЦР проводят ПЦР с использованием праймеров рОО^АМ и рОО^АМ, представленных 8ЕО ГО Νο 111 и 112. ПЦР осуществляют следующим образом. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей от 0,1 до 100 нг матрицы, 60 пмоль каждого праймера, 5 мкл 10-кратного Ех Тац-буфера, 1,25 Е ТаКаВа Ех Тац-ДНК-полимеразы и 0,2 мМ каждого из άΝΊΤ. В смесях проводят реакцию с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 в следующих условиях: 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 21. Фиг. 21 показывает результаты детекции методом IСАN и ПЦР гена интегрированного вируса гена в клетках, инфицированных ретровирусным вектором. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: 1000 нг матрицы; полоса 3: 100 нг матрицы; полоса 4: 10 нг матрицы; полоса 5: 1 нг матрицы; и полоса 6: 0,1 нг матрицы.

Как видно из фиг. 21, продукты амплификации, представляющие интерес, отмечают в случае IСАN с использованием 1 нг матричной ДНК и в случае ПЦР из 35 циклов - с использованием 1 нг матрицы.

Пример 24. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, при котором комбинируют способ амплификации настоящего изобретения и способ гибридизации, проверяют на детекции гена веротоксина I ЕксйепсЫа сой О-157. Ген веротоксина I из энтерогеморрагической ЕксйепсЫа сой О-157 выбирают в

- 56 007414 качестве матрицы. Матричную ДНК получают так, как описывается в примере 8(1). В качестве участка для амплификации выбирают участок длиной около 80 п.о. с содержанием ОС примерно 40%. В качестве праймеров используют праймеры УТ1-ГГ4 и УТ1-ГК1 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕЦ ΙΌ № 113 и 114. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 5 мкл смеси, содержащей по 60 пмоль каждого из праймеров УТ1-ГЕ4 и УП-ГКб, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%, одну из вытяжек горячей водой, соответствующих 0-10⁵ клеткам, и стерилизованную воду. Смеси в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 денатурируют при 98°С в течение 2 мин, быстро охлаждают до 55°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин, и затем помещают на лед для отжига.

После отжига к смеси добавляют, в конечной концентрации, буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 500 мкМ каждого из бЭТР, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 15 Е РНКазы Н Е. сой и 2,75 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят конечный объем до 25 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 55°С, и инкубируют при указанной температуре в течение 60 мин. В качестве контроля в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 проводят ПЦР с вытяжками горячей водой с использованием набора О-157 Тур1пд 8е1 (Такага 8йнхо) согласно инструкции. ПЦР осуществляют следующим образом: 35 циклов - 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Общее время, необходимое для реакции, составляет примерно 145 мин. Ожидаемый размер амплифицированного продукта 349 п.о. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №81еуе-агароза 3:1. Результаты для IСΑN приводятся на фиг. 22. Фиг. 21 показывает результаты детекции гена веротоксина Ι Е. сой 0-157. Полоса М: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса Ν: в качестве матрицы стерильная вода; полоса 1: матрица соответствует 1 клетке; полоса 2: матрица соответствует 10 клеткам; полоса 3: матрица соответствует 10² клеткам; полоса 4: матрица соответствует 10³ клеткам. Кроме того, результаты детекции методами IСΑN и ПЦР приводятся в табл. 10.

Таблица 10

	Число клеток Е. сой 0-157
0	1	10
ГСАИ	-	+	+++
ПЦР	-	+	++
-: амплификация отсутствует; от + до +++ указывает степень амплис	икации по трехбалльной шка-

ле.

Как видно из табл. 10, продукты амплификации, представляющие интерес, получают в случае реакционной системы, когда как для ΚΑΝ, так и для ПЦР используют вытяжку горячей водой, соответствующую 1 клетке. Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов амплификации методом дотблоттинга с использованием олигонуклеотидного зонда УТ1 с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕЦ ΙΌ № 115, меченного биотином по 5'-концу. Гибридизацию осуществляют так, как описывается в примере 19. Результаты совпадают с результатами, полученными электрофорезом. Таким образом, подтверждается, что чувствительность детекции при IСΑN и ПЦР эквивалентна. Кроме того, общее время, требуемое для реакции амплификации с использованием IСΑN настоящего изобретения, составляет 1/2 или меньше по сравнению со временем, требуемым для ПЦР. Таким образом, подтверждается, что IСΑN настоящего изобретения эффективен как способ детекции патогенных бактерий и т.п.

Пример 25. Проверяют способ детекции гена ботулинического токсина типа А. В качестве матрицы используют ДНК, полученную из штамма С1ок1пбшт ЬоШйпцт, тип А-190, выделенного при случае пищевого отравления. Указанный штамм хранится в ОераПтеШ о! Нуд1епе, Кадара МПгйюп итуегкйу. В качестве праймеров для детекции синтезируют праймеры Во1А 82 и Во1А А2 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕЦ ΙΌ N3 116 и 117. Размер продукта амплификации, полученного с использованием пары праймеров, составляет примерно 150 п.о. Получают растворы, содержащие 100 фг, 1 пг, 10 пг или 100 пг ДНК из продуцирующей токсин типа А С1ок1пбшт ЬоШйпцт в 1 мкл стерильной воды, для использования в качестве матриц. Реакцию осуществляют следующим образом.

Готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и 1 мкл одного из растворов ДНК в качестве матрицы. Смеси подвергают IСΑN с использованием состава реакционной смеси и условий реакции, описанных в примере 19. В качестве контроля осуществляют ПЦР в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 с использованием набора праймеров для детекции гена ботулинического токсина типа А ВА8-1 и ВА8-2 (Такага 8йнхо) согласно инструкции. Ожидаемый размер продукта амплификации 284 п.о.

После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле М.18|еуеагароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 23 А. Фиг. 23 А показывает результаты детекции гена ботулинического токсина типа А способами IСΑN и ПЦР. Полоса М1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса М2: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса 1: без матрицы; полоса 2: 100 фг матрицы; полоса 3: 10 пг матрицы; и полоса 4: 100 пг матрицы.

Как видно из фиг. 23А, продукт амплификации способом ΚΑΝ, представляющий интерес, отмеча

- 57 007414 ют в реакции, в которой используют 100 фг матричной ДНК. С другой стороны, продукт амплификации способом ПЦР, представляющий интерес, в реакции с использованием 100 фг матричной ДНК не отмечают. Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов реакции методом дот-блоттинга с использованием зонда Во!А с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Еф ΙΌ № 118. Гибридизацию дот-блоттингом осуществляют так, как описывается в примере 9. Результаты приводятся на фиг. 23В. Как видно на фиг. 23В, сигналы наблюдают, когда используют 100 фг матрицы в случае ΚΆΝ, и когда используют 10 пг матрицы в случае ПЦР, соответственно. Такие результаты согласуются с результатами электрофореза.

Пример 26. Проверяют детекцию вироида хризантемы. Готовят 10-кратные серийные разведения низкомолекулярной РНК, полученной по способу экстрагирования низкомолекулярных РНК из вироида карликовости хризантемы (С8У6), описанному в примере 1 в 1Р-А 9-140383. Реакцию обратной транскрипции осуществляют с использованием набора ЯNΑ РСЯ кй (АМ^) уаг. 2.1 (Такага 8Ннхо). Конкретно, готовят 20 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции, содержащей 1-кратный буфер ЯNΑ РСЯ, 5 мМ МдС1₂, 1 мМ каждого из άΝΊΤ, 10 Е ингибитора РНКазы, 5 Е обратной транскриптазы ХЬ АМУ, 50 пмоль случайного 9-мера, 1 мкл одного из серийных разведений РНК. Смеси нагревают при 30°С в течение 10 мин, проводят реакцию при 55°С в течение 30 мин, и затем смеси нагревают при 99°С в течение 5 мин для инактивации обратной транскриптазы. После охлаждения проводят Ιί,ΆΝ. Используют 1 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции в качестве матрицы для Ιί,ΆΝ. В данном примере в качестве праймеров используют праймеры С8УБ-Е4 и С8УО-Я3 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8Еф ΙΌ № 119 и 120. Реакцию осуществляют так, как описывается в примере 19, за исключением того, что температура реакции составляет 60°С и используют термоциклер Тйегта1 Сус1ег МР. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №81еуе-агароза 3:1.

С другой стороны, проводят ПЦР-амплификацию в реакционной системе объемом 50-мкл с использованием в качестве матрицы 1 мкл той же самой реакционной смеси для обратной транскрипции. В качестве праймеров используют праймеры Е94 и Я264, представленные 8Еф ΙΌ № 109 и 110. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят реакционную смесь с использованием набора ТаКаЯа РСЯ АтрНПсаВоп кй согласно протоколу. Добавляют к смеси по 10 пмоль каждого праймера и 1 мкл одной из реакционных смесей для обратной транскрипции, и доводят общий объем до 50 мкл. Реакцию амплификации осуществляют с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег МР. Реакцию осуществляют следующим образом: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №81еуеагароза 3:1. Результаты приводятся в табл. 11.

Таблица 11

Степень разведения РНК как матрицы	х10²	х10³
ЯТ-IСΑN	++	+
ОТ-ПЦР	+	-

-: нет амплификации; + : есть амплификация; ++ : хорошая амплификация.

Как видно из табл. 11, продукт амплификации способом IСΑN отмечают реакции, в которой в качестве матрицы используют образец РНК 10³-кратного разведения. С другой стороны, продукт амплификации способом ПЦР отмечают в реакции, в которой в качестве матрицы используют образец РНК 10² кратного разведения.

Кроме того, гибридизацией дот-блоттингом подтверждают, что ГСА^амплифицированные продукты и ПЦР-амплифицированные продукты являются продуктами, представляющими интерес. Гибридизацию дот-блоттингом осуществляют с использованием зонда С8У6 с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Еф ΙΌ N 121, меченного биотином по 5'-концу. Гибридизацию осуществляют так, как описывается в примере 9. Результаты согласуются с результатами электрофореза. Сигналы наблюдают при использованием образца РНК 10³-кратного разведения в случае IСΑN и при использовании образца 10-кратного разведения в случае ПЦР, соответственно, что показывает, что IСΑN более чувствителен, чем ПЦР.

Пример 27.

Проверяют детекцию гена вироида в хризантеме, инфицированной вироидом карликовости хризантемы (С8У6), с использованием РГи РНКазы Н. Смесь (60 мкл), содержащую 3 мкл одного из 10-кратных серийных разведений РНК, полученных в примере 26, 10 мМ Трис-гидрохлоридный буфер (рН 8,3), 50 мМ хлорид калия, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ каждого из άΝΊΤ, 150 пмоль случайного 6-мера, 60 Е ингибитора РНКазы (Такага 811ихо) и 15 Е обратной транскриптазы ХЬ (АМУ), инкубируют с целью получения кДНК с использованием термоциклера (ОепеАтр РСЯ 8уз!ет 9600, Аррйеб Вюзуз!етз) при 30°С в течение 10 мин и при 42°С в течение 1 ч, и затем нагревают при 99°С в течение 5 мин для инактивации фермента. Синтезируют праймеры У61, У62, У63 и У64, представленные 8Еф ΙΌ № 122-125, на основе нуклеотидной последовательности мРНК вироида.

- 58 007414

Смесь (50 мкл), содержащую по 50 пмоль каждого из праймеров Уб1 и Уб2, в качестве матрицы - 1 мкл раствора кДНК, синтезированной так, как описано выше, его 10-, 100-, 1000- или 10000-кратного разведения водой или воды в случае отрицательного контроля, 0,5 мМ каждого из άΝΊ'Ρ, буфер 32 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% ВЗА, 1% ДМСО, 0,0156 мкг РГи РНКазы Н и 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, инкубируют при 57°С в течение 1 ч в термоциклере. Прореагировавшие образцы до анализа хранят замороженными при -20°С.

В качестве контроля осуществляют ПЦР. Коротко, в 50 мкл реакционной системы, содержащей по 50 пмоль каждого из праймеров Уб3 и Уб4, 1 мкл раствора кДНК или его 10-, 100-, 1000- или 10000кратного разведения водой или воды в случае отрицательного контроля, 5 мкл 10-кратного Ех Тадбуфера, 1,25 Е ТаКаВа Ех Тад-полимеразы и 0,2 мМ каждого из бЭТР, проводят реакцию в термоциклере. Программа следующая: 1 цикл -94°С в течение 2 мин; 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. Прореагировавшие образцы до анализа хранят замороженными при -20°С.

По 5 мкл каждой реакционной смеси ПСАN и ПЦР подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 24. Фиг. 24 показывает результаты детекции вироида способом ПСАN с использованием РГи РНКазы Н и способом ПЦР. Полоса 1: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль; полоса 3: 10000-кратное разведение кДНК; полоса 4: 1000-кратное разведение кДНК; полоса 5: 100-кратное разведение кДНК; полоса 6: 10-кратное разведение кДНК; и полоса 7: исходный раствор ДНК.

Как видно из фиг. 24, продукты амплификации, представляющие интерес, наблюдают при использовании 100-кратного разведения кДНК как в случае 1СЛН так и в случае ПЦР.

Пример 28. Проверяют детекцию гена К-газ.

(1) Обнаружение в геномной ДНК.

Конструируют праймеры с-К1-газ-1 и с-К1-газ-2, представленные ЗЕО ΙΩ № 126 и 127, на основе нуклеотидной последовательности с-К1-газ человека.

Готовят 10 мкл смеси, содержащей 60 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,25% водного раствора пропилендиамина и от 1 до 100 нг геномной ДНК человека (С1оп1есй) в качестве матрицы. Смеси в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регзопа1 нагревают при 98°С в течение 2 мин и затем при 53°С для отжига праймеров к матрице.

После отжига к смеси добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бЫТР, буфер 40 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 5 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 53°С в течение 1 ч. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле.

С другой стороны, в качестве контроля проводят ПЦР. В качестве праймеров используют праймеры с-К1-газ-3 и с-К1-газ-4, представленных ЗЕО ΙΩ № 128 и 129. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей 60 пмоль каждого праймера, от 0,1 до 100 нг матрицы, 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера, 1,25 Е ТаКаВа Ех Тад-ДНК-полимеразы и 0,2 мМ каждого из бЭТР. В смеси проводят реакцию с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег Регзопа1 в следующих условиях: 30 или 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 25. Фиг. 25 показывает результаты детекции гена с-К1-газ способами ПСАN и ПЦР. Для ΙΕΆΝ: полоса 1: маркер молекулярной массы; полоса 2: 100 нг матрицы; полоса 3: 10 нг матрицы; полоса 4: 1 нг матрицы; и полоса 5: без матрицы. Для ПЦР: полоса 1: 100 нг матрицы; полоса 2: 10 нг матрицы; полоса 3: 1 нг матрицы; и полоса 4: без матрицы.

Как видно из фиг. 25, продукты амплификации, представляющие интерес, отмечают при использовании 1 нг матрицы в случае ПСАN и при использовании 10 нг матрицы в случае ПЦР из 30 циклов. Результаты сравнения количеств амплифицированных продуктов, полученных способами ПСАN и ПЦР с использованием от 1 нг до 100 нг матрицы, приводятся на фиг. 30. На данной фигуре заштрихованные столбцы представляют результаты ПЦР из 30 циклов, темные в белую крапинку столбцы представляют результаты ПЦР из 35 циклов и сплошные черные столбцы представляют результаты ПСА^ соответственно. Как видно из фиг. 30, подтверждается, что количество амплифицированного продукта, полученного методом ΙΕΆΝ, больше, чем количество, полученное ПЦР.

(2) Детекция в образцах крови.

Получают геномные ДНК с использованием набора Ог. ОепТЬЕ™ (для цельной крови) (Такага Зйнхо) из 100 мкл каждого образца крови, взятого у здорового индивидуума, с использованием цитрата натрия или гепарина в качестве антикоагулянта. Осуществляют детекцию гена с-К1-газ методом ПСАN так, как описывается выше в (1), с использованием полученной ДНК, соответствующей 0,04-5 мкл крови. Кроме того, осуществляют детекцию с использованием ДНК из 0,04-5 мкл образцов крови, так, как описывается выше в (1), для того, чтобы сравнить чувствительность детекции ДНК методами ПСАN и ПЦР. Результаты приводятся на фиг. 26. Фиг. 26 показывает результаты детекции гена с-К1-газ в образцах крови методами ПСАN и ПЦР. Для ПСАN: полоса 1: маркер молекулярной массы; полоса 2: 5 мкл цитратной

- 59 007414 крови; полоса 3: 1 мкл цитратной крови; полоса 4: 0,2 мкл цитратной крови; полоса 5: 0,04 мкл цитратной крови; полоса 6: 5 мкл гепаринизированной крови; полоса 7: 1 мкл гепаринизированной крови; полоса 8: 0,2 мкл гепаринизированной крови; и полоса 9: 0,04 мкл гепаринизированной крови. Для ПЦР: полоса 1: маркер молекулярной массы; полоса 2: 5 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 3: 1 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 4: 0,2 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 5: 0,04 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 6: 5 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 7: 1 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 8: 0,2 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 9: 0,04 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 10: 5 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 11: 1 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 12: 0,2 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 13: 0,04 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 14: 5 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов; полоса 15: 1 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов; полоса 16: 0,2 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов; и полоса 17: 0,04 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов.

Как видно из фиг. 26, продукты амплификации, представляющие интерес, отмечают при использовании геномной ДНК, соответствующей 0,2 мкл любого образца крови в случае ΚΆΝ и геномной ДНК, соответствующей 0,2 мкл любого образца крови (цитратной или гепаринизированной) в случае ПЦР из 30 циклов, соответственно.

Пример 29. Проверяют детекцию гена веротоксина 2 (УТ-2) ЕксйейсЫа сой О-157 с использованием Вса РНКазы НШ. Энтерогеморрагическую ЕксйейсЫа сой О-157 культивируют в среде тЕС, содержащей новобиоцин, при 42°С в течение 18 ч и затем прогревают при 95°С в течение 10 мин. Готовят разведения в стерильной воде, соответствующие 0, 1, 10, 10² или 10³ клеткам и используют в качестве матриц. В качестве праймеров для детекции синтезируют праймеры УТ2-ГЕ4 и УΤ2-IΒ3 с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕф ΙΌ Ж 130 и 131. Размер амплифицированного продукта, полученного с использованием такой пары праймеров, составляет 146 п.о. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и одну из вытяжек горячей водой. Смеси в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Рег8ог1а1 прогревают при 98°С в течение 2 мин и инкубируют при 55°С в течение 1 мин, и затем помещают на лед. К смеси добавляют, в конечных концентрациях, буфер 34 мМ Трицинового (рН 8,7), 10 мМ хлорид калия, 10 мМ сульфат аммония, 1% ДМСО, 0,01% Β3Α, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из дЭТР, 32 Е Вса РНКазы НШ, полученной так, как в ссылочном примере 3(5), и 5,5 Е ДНК-полимеразы ΒсаΒЕЗΤ, и доводят до конечного объема 50 мкл. Реакционные смеси помещают в термоциклер, установленный на 55°С, и проводят реакцию при указанной температуре в течение 60 мин. После реакции по 3 мл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле ЖЗ1еуе-агароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 27. Фиг. 27 показывает результаты детекции гена веротоксина ΙΙ (УТ2) ЕксйепсЫа сой О-157 с использованием Вса РНКазы НШ. Полоса М: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса Ν: стерлизованная вода в качестве матрицы; полоса 1: матрица, соответствующая 1 клетке; полоса 2: матрица, соответствующая 10 клеткам; полоса 3: матрица, соответствующая 10² клеткам; и полоса 4: матрица, соответствующая 10³ клеткам.

Как видно из фиг. 27, ген УТ2 обнаруживают способом ΚΆΝ с использованием вытяжки горячей водой, соответствующей 1 клетке. Такие результаты равнозначны результатам реакций детекции способом Ιί'ΆΝ с использованием РНКазы Н Е. сой и ПЦР, полученным в примере 9. Таким образом, подтверждается, что Ιί'ΆΝ с использованием термостойкой РНКазы Н, Вса РНКазы НШ, также эффективен при обнаружении вирусов, бактерий и т.п.

Пример 30. Проверяют детекцию гена энтеротоксина А Зίаρйу1οсοсси8 аигеик. На основе нуклеотидной последовательности области гена энтеротоксина А Зΐаρйу1οсοсси8 аигеик синтезируют праймеры ЗЕА-1 и ЗЕА-2, представленные ЗЕф ΙΌ Ж 136 и 137. Реакционную смесь (50 мкл), содержащую 1 мкл раствора, содержащего 115 пг или 1,15 нг геномной ДНК Зΐаρйу1οсοсси8 аигеик (АТСТ, инвентарный № 13565) или 1 мкл воды в случае отрицательного контроля, 50 пмоль каждого праймера, 0,5 мМ каждого из άΝΊΒ, буфер 32 мМ ЧЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% ΒЗΑ, 1% ДМСО, 0,0156 мкг Р£ц РНКазы Н и 1 Е ДНК-полимеразы ΒсаΒЕЗΤ, инкубируют при 58°С в течение 1 ч в термоциклере. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 29. Фиг. 29 показывает результаты электрофореза при детекции гена энтеротоксина А Зΐаρйу1οсοсси8 аигеик. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: отрицательный контроль (стерильная вода); полоса 3: 115 пг матрицы; и полоса 4: 1,15 нг матрицы.

Как видно из фиг. 29, продукт амплификации, представляющий интерес, отмечают при использовании примерно 1,15 нг матрицы.

Пример 31. Проверяют детекцию вируса гепатита С (ΗΟΫ).

На основе нуклеотидной последовательности ΗСУ синтезируют праймеры ΗСУ-Ε3 и ΗСУ-Β1 с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕф ΙΌ Ж 138 и 139. Матричную ДНК получают следующим образом. Коротко, с использованием термоциклера (Семе Αтρ ΡСΒ Зу81ет 9600, Αρρйеά Β^ο8у8ΐет8), 4 мкл смеси, содержащей РНК, полученную из 100 мкл сыворотки здорового индивидуума или пациента, инфицированного ΗСУ, так, как описывается в примере 21, 10 мМ Трис

- 60 007414 гидрохлоридный буфер (рН 8,3), 5 мМ МдСЬ, 1 мМ каждого из бЭТР, 10 пмоль случайного 6-мера и 10 Е обратной транскриптазы ХЬ (Такага Зйи/о), инкубируют при 30°С в течение 10 мин и при 42°С в течение 1 ч, и затем прогревают при 99°С для инактивации фермента, для получения кДНК.

Осуществляют IСАN при 55°С в течение 1 ч, как описывается в примере 13, за исключением того, что используют 1 мкл реакционной смеси, в которой проводился синтез кДНК, и по 100 пмоль каждого из праймеров НСУ-Е3 и НСУ-К1. После реакции по 2,5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 31. Фиг. 31 показывает результаты электрофореза при обнаружении вируса гепатита С. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: матрица, полученная из сыворотки здорового индивидуума; и полосы 3-6: матрицы, полученные из сыворотки пациентов, инфицированных НСУ.

Как видно из фиг. 31, подтверждается, что НСУ можно специфически обнаруживать в образцах сыворотки пациентов, инфицированных НСУ.

Пример 32. Проверяют способ амплификации настоящего изобретения.

(1) Осуществляют ПЦР с использованием плазмидной ДНК рИС19-150, полученной так, как описывается в примере 2(2), в качестве матрицы и праймеров МСЗ-Е и МСЗ-К, представленных ЗЕф ГО Νο 35 и 36. ПЦР-амплифицированный фрагмент длиной 534 п.о. получают путем очистки реакционной смеси с использованием Мюгосоп-100 (М1Шроге). Готовят реакционную смесь, содержащую 15 нг ПЦРфрагмента и 30 пмоль праймера МК2 с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕф ГО Νο 140, меченного [у-³²Р]АТР по 5'-концу путем фосфорилирования, и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и реакционную смесь, также содержащую 30 пмоль праймера МК1 с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕф ГО Νο 141. Реакционные смеси денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С. К реакционной смеси добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ Трицин-буфер (рН 8,7), 12,5 мМ хлорид калия, 12,5 мМ сульфат аммония, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из άΝΙΚ), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. В полученной реакционной смеси проводят реакцию при 55°С в течение 15 мин. После реакции к 5 мкл реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для остановки реакции (95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромофеноловый синий, 0,5% ксиленцианол). Смесь денатурируют нагреванием при 94°С в течение 3 мин. По 1,6 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину, и регистрируют сигналы с использованием ВАЗ2000 (Еирх) для обнаружения продуктов, достроенных с праймера МК1. Результаты приводятся на фиг. 32А. Ступенчатую последовательность полос на фиг. 32А получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М13тр18 (Такага Зйи/о) с использованием праймера МЕ2, меченного [у-³²Р]АТР путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: комбинация праймеров МЕ2 и МК1; и полоса 2:МК1.

Как видно из фиг. 32А, фрагмент длиной 448 п.о., достроенный с праймера МК1 до конца матрицы, обнаруживается, когда реакцию достраивания осуществляют путем добавления к матрице только праймера МК1. С другой стороны, при добавлении также МЕ2, кроме вышеуказанной полосы, отмечают фрагмент длиной 373 п.о., ограниченный праймерами МК1 и МЕ2. Таким образом, доказывается, что достраивание с праймера МК1 с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве матрицы под действием ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ переключается, из-за переключения матрицы, на достраивание с использованием в качестве матрицы цепи, достроенной с праймера МЕ2. Кроме того, переключение матрицы отмечают, когда в сходных условиях в качестве мезофильной ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи используют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы. С другой стороны, переключения матрицы не отмечают, когда используют ТаКаКа Тад ДНК-полимеразу (Такага Зйи/о) или ДНК-полимеразу РугоВЕЗТ (Такага Зйи/о) без активности замещения цепи.

(2) Проверяют реакцию переключения матрицы с использованием цепи матричной ДНК с отожженным к ней праймером. Фрагменты ДНК, к которым могут отжигаться праймеры МЕ2 и МК1, получают следующим образом. Проводят ПЦР с использованием плазмиды рИС19 в качестве матрицы и праймеров МСЗЕ и КУ (Такага Зйи/о) или праймеров М4 (Такага Зйи/о) и МСЗК. Реакционные смеси очищают с использованием М1сгосоп-100 для получения ПЦР-амплифицированных фрагментов МСЗЕКУ (236 п.о.) и М4-МСЗК (271 п.о.). Участок, ограниченный праймерами М4 и КУ, как правило, присутствует в обоих ПЦР-амплифицированных фрагментах.

Затем следующим образом готовят комплекс матрица-праймер (1), в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, не отжигаются одна с другой, и комплекс матрица-праймер (2), в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, отжигаются одна с другой.

(1) Реакционную смесь, содержащую 30 нг фрагмента МСЗЕ-КУ, 40 пмоль праймера МЕ2, меченного [у-³²Р]АТР по 5'-концу путем фосфорилирования, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и смесь, содержащую 30 нг фрагмента М4-МСЗК, 40 пмоль праймера МК1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, по отдельности денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С. По 2,5 мкл реакционных смесей смешивают вместе, получая комплекс матрица-праймер.

- 61 007414 (2) Реакционную смесь, содержащую 15 нг фрагмента МСЗЕ-КУ, 15 нг фрагмента М4-МСЗК, 20 пмоль праймера МЕ2, меченного [у-^З2Р]АТР по 5'-концу путем фосфорилирования, 20 пмоль праймера МК1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С, получая комплекс матрица-праймер.

К 5 мкл реакционной смеси для получения комплекса матрица-праймер добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ Трицин-буфер (рН 8,7), 12,5 мМ хлорид калия, 12,5 мМ сульфат аммония, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из бКТР), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. В полученной смеси проводят реакцию при 55°С в течение 15 мин. После реакции к 5 мкл реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для остановки реакции (95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромофеноловый синий, 0,5% ксиленцианол). Смесь денатурируют нагреванием при 94°С в течение З мин. По 1,6 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину, и регистрируют сигналы с использованием ВАЗ2000 (Ецрх) для обнаружения продуктов, достроенных с праймера МЕ2. Результаты приводятся на фиг. З2В. Ступенчатую последовательность полос на фиг. З2В получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М1Зтр18 с использованием праймера МК1, меченного [у-^З2Р]АТР путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: цепи матричной ДНК не отожжены одна с другой; и полоса 2: цепи матричной ДНК отожжены одна с другой.

Как видно из фиг. З2В, только фрагмент длиной 161 п.о., достроенных с праймера МЕ2 до конца матрицы, обнаруживается в случае комплекса матрица-праймер, в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами не отжигаются одна с другой. С другой стороны, в случае комплекса матрица-праймер, в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, отжигаются одна с другой, кроме вышеуказанного фрагмента отмечают фрагмент длиной 22З п.о., ограниченный праймерами МЕ2 и МК1. Таким образом, доказывается, что реакция переключения цепи происходит, если цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, отжигаются одна с другой.

Пример ЗЗ.

(1) Проверяют детекцию МусоЬас1епит 1иЬегси1ок1к с использованием РНКазы Н, полученной из Агсйаеод1оЬик £и1д1бик (АЕи), описанной в примере 7. На основе нуклеотидной последовательности генома МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к, зарегистрированной в СепеВапк под инвентарным № АЬ12З456, синтезируют праймеры МТК2Е (ЗЕС ГО № 155) и МТ^К. (ЗЕС ГО № 156). Длина фрагмента, ограниченного парой праймеров, включая сами праймерные участки, составляет 10З п.о. Геномную ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к для использования как матрицы экстрагируют из сухой вакцины БЦЖ (№рроп ВСС Зе1/о) обычным способом. Готовят растворы, содержащие 100 пг, 10 пг, 1 пг, 100 фг, 10 фг или 1 фг геномной ДНК на мкл стерильной воды. Реакции проводят следующим образом. Коротко, смешивают, в конечных концентрациях, буфер З2 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВЗА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бКГР, 50 пмоль каждого из праймеров МГОЗ2Е и МТ^В, 8,75 Е РНКазы Н из АЕц и 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ и 1 мкл одной из матриц, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер ТНегта1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по З мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле.

С другой стороны, в качестве контроля проводят ПЦР. В качестве праймеров используют праймеры МГОЗ РСК-Е и МГОЗ РСК-К, описанные в Кгак1ю Вуоп (Т1е 1араиеке 1оигиа1 оЕ С11шса1 Ра1йо1о§у), 4З(9):941-947 (1995). С использованием этой пары праймеров получают продукт амплификации размером 276 п.о. Реакционную смесь (50 мкл) готовят, используя 10 пмоль каждого праймера согласно руководству, прилагаемому к Ех Тад ДНК-полимеразе (Такага З1шхо). Реакционную смесь помещают в термоциклер и проводят реакцию, состоящую из 40 циклов, включающих 94°С в течение З0 с, 50°С в течение З0 с и 72°С в течение З0 с. После реакции по З мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле.

В результате образования продуктов амплификации, представляющих интерес, наблюдают в обоих случаях с использованием 100 фг матрицы.

(2) Проверяют детекцию СЫатШа 1гасйотабк с использованием РНКазы Н из АЕц или РНКазы Н из Ругососсик 1юпкок1ш (Рйо). На основании нуклеотидной последовательности плазмиды СЫатШа 1гасйотайк, зарегистрированной в СепеВапк под инвентарным № Х06707, синтезируют праймеры СТ2Е (ЗЕС ГО Ν 157) и СТ2К (ЗЕС ГО Ν 158). Длина фрагмента, ограниченного парой праймеров, включая собственно праймерные участки, составляет 109 п. о. Образцы матричной ДНК получают, подвергая полученный с информационного согласия пациента, клинический образец обработке фенолом и хлороформом и осаждению этанолом. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, смешивают, в конечных концентрациях, буфер З2 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВЗА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из άNТР, 50 пмоль каждого из праймеров СТ2Е и СТ2К, 46,4 Е РНКазы Н из Р1о или 8,75 Е РНКазы Н из АЕц, 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ и 1 мкл образца, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термо

- 62 007414 циклер Т11егша1 Сус1ег Рег§опа1, установленный на 55°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате получают продукты амплификации, представляющие интерес. Полученные результаты показывают, что СЫат1Н1а ЦасйотаЮ можно обнаружить с использованием РНКазы Н из А£и или Р1о способом настоящего изобретения.

(3) Кроме того, проверяют детекцию с использованием магнитных бус при помощи коммерчески доступного детектирующего устройства. Коротко, осуществляют реакцию амплификации так, как описывается выше в (1), с использованием праймера МТ1Б2К, используемого выше в (1), меченного биотином по его 5'-концу, в качестве праймера и 100 нг геномной ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о818 в качестве матрицы. Полученный амплифицированный фрагмент разводят 30-кратно, 300-кратно или 3000-кратно и подвергают детекции с использованием магнитных бус, покрытых стрептавидином (Р1егсе), в автоматическом детектирующем устройстве Ьит1р1и8 (ЕицгеЬю).

Магнитные бусы с иммобилизованным стрептавидином, способные связывать 100 пмоль биотина, вводят в реакцию с биотинилированным амплифицированным фрагментом в течение 5 мин на первом слое кюветы. Затем добавляют 0,1 Ν раствор Ыа0Н. Гибридизацию с зондом МТ1БВЕ, меченным Е1ТС, осуществляют в течение 5 мин. После промывки добавляют антитела против Е1ТС, меченные Р0Б. После взаимодействия в течение 5 мин и промывки добавляют люминесцентный субстрат. В результате демонстрируется, что в обычном автоматизированном детектирующем устройстве с использованием магнитных бус можно полуколичественно осуществить детекцию за короткий промежуток времени (20 мин). Детекцию осуществляют, измеряя уровень люминесценции методом счета фотонов. Результаты приводятся в табл. 12.

Таблица 12

Ампликон МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818	Число фотонов	Отношение сигнал/шум
х30	3,55 х 10⁷	29,6
х300	1,21 х 10⁷	10,0
х3000	0,21 х10⁷	1,75
0	0,12 х 10⁷	-

Результаты в табл. 12 показывают, что можно осуществить детекцию с чувствительностью, равной чувствительности обычного метода измерения люминесценции в планшетах.

(4) Проверяют метод гибридной хроматографии как способ детекции вышеуказанного амплифицированного фрагмента. Стрептавидин (ЫасаЫ Теэдие) иммобилизуют на нитроцеллюлозной мембране. Соединяют с ней водопоглощающую прокладку для получения полоски для гибридной хроматографии. Такую полоску используют для детекции амплифицированного фрагмента, используемого выше в (3), согласно способу гибридной хроматографии. Детекцию осуществляют, проявляя окраску с использованием 1-стадийного ТМВ-блоттинга (Р1егсе). Конкретно, реакционную смесь, содержащую амплифицированный фрагмент, хроматографируют на нитроцеллюлозной мембране. Затем осуществляют хроматографию с использованием раствора 0,1 Ν №0Н, меченного Е1ТС зонда, раствора для промывки и раствора для проявления окраски в указанном порядке. В результате обнаруживают синюю полосу в случае амплифицированного фрагмента, полученного из образца, положительного на МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818. Это показывает, что данный способ полезен в качестве быстрого способа анализа генов, поскольку применяя его за 5-10 мин способом настоящего изобретения получают результаты, видимые невооруженным глазом.

Пример 34.

(1) Анализ методом гибридизации по Саузерну амплифицированных продуктов, содержащих мультимерные фрагменты.

В некоторых случаях при способе амплификации настоящего изобретения кроме трех фрагментов, представляющих интерес, можно обнаружить несколько других высокомолекулярных мультимерных фрагментов. Проверяют мультимерные фрагменты. В качестве мишени выбирают энтерогеморрагическую Е. со11 0-157. Матричная ДНК, химерные праймеры и условия реакций для IСΑN такие же, какие описаны в примере 9. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №Б1еуе-агароза, 3:1. Результаты приводятся на фиг. 37. На фиг. 37 полосы представляют результаты для следующего: полоса М: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 1: отрицательный контроль; полоса 2: прогретый экстракт, соответствующий 1 клетке; полоса 3: прогретый экстракт, соответствующий 10 клеткам; полоса 4: прогретый экстракт, соответствующий 10² клеткам; полоса 5: прогретый экстракт, соответствующий 10³ клеткам; полоса 6: прогретый экстракт, соответствующий 10⁴клеткам; и полоса 7: прогретый экстракт, соответствующий 10⁵ клеткам. Наблюдаются мультимерные фрагменты, как видно на фиг. 37.

(2) Анализ мультимерных амплифицированных фрагментов.

Анализируют нуклеотидные последовательности мультимерных фрагментов, полученных выше в (1). Коротко, 50 мкл реакционной смеси, полученной в (1), подвергают электрофорезу в 3% агарозном

- 63 007414 геле. После электрофореза мультимерные полосы вырезают из геля. Затем из геля извлекают амплифицированные фрагменты ДНК с использованием ЕА8УТКАР уег.2 (Такага 8йихо). У извлеченных амплифицированных фрагментов тупят концы с использованием набора ЭХА ВйпШпд кй (Такага 8йихо).

Фрагменты ДНК с затупленными концами лигируют с вектором рСЕМ-32 (Рготеда), расщепленным рестриктазой НшсИ (Такага 8йи/о), с использованием набора ЭНА йдайоп кй (Такага 8йихо). Лигазные смеси используют для трансформации компетентных клеток 1М109 (Такага 8йихо). После трансформации клетки культивируют при 37°С в течение ночи на чашках с ЬВ-агаром, содержащим 0,1 мМ ампициллин, 1 мМ [РТС и 0,02% Х-да1.

После культивирования с чашек отбирают несколько колоний белого цвета. Осуществляют ПЦР колоний с использованием праймеров М13-М4 и М13-КУ (оба от Такага 8йихо) для определения присутствия вставки. Колонии, содержащие вставки культивируют при встряхивании в жидкой среде ЬВ, содержащей 0,1 мМ ампициллина, при 37°С в течение ночи. После культивирования плазмиды очищают из клеток с использованием набора ОI АСЕК р1акт1б т1ш Кй Оадеп). Последовательности фрагментов, клонированных в НтсП сайтах плазмид, анализируют в обоих направлениях с использованием праймеров М13-М4 и М13-КУ обычным способом.

В результате демонстрируется, что мультимерный фрагмент, полученный способом настоящего изобретения, имеет структуру, в которой повторяется амплифицируемый участок. Кроме того, доказывается, что повтор имеет место в одном и том же направлении от 5' к 3'.

(3) Кроме трех представляющих интерес амплифицированных фрагментов проверяют другие мультимерные амплифицированные фрагменты, образовавшиеся при осуществлении способа настоящего изобретения в случае детекции МусоЬасРегшт РиЬегси1ок1к, НСУ или Сй1атуб1а РгасйотаИк. НСУ детектируют в условиях, описанных в примере 31. МусоЬасРегшт 1иЬегси1ок1к или Сй1атуб1а РгасйотаИк детектируют в условиях, описанных в примере 33. Полученные мультимерные амплифицированные фрагменты субклонируют и секвенируют так, как описывается выше в (2). В результате демонстрируется, что мультимерный фрагмент, полученный способом настоящего изобретения, имеет структуру, в которой повторяется амплифицируемый участок. Кроме того, доказывается, что повтор имеет место в одном и том же направлении от 5' к 3'.

Пример 35.

(1) Проверяют способ детекции настоящего изобретения для МусоЬас1епит 1иЬегси1ок1к. Сначала синтезируют праймеры К-Р-1033(60) (8ЕД ГО Νο 159) и К-Р-1133(62) (8ЕД ГО Νο 160) для амплификации участка в геноме МусоЬасРегшт 1иЬегси1ок1к с относительно низким содержанием СС. В качестве матриц используют серийные разведения, содержащие от 100 фг до 10 пг геномной ДНК МусоЬасРепит РиЬегси1ок1к, как описано в примере 33(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, смешивают, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из б№ТР, 50 пмоль каждого из праймеров К-Р-1033(60) и К-Р-1133(62), 9,375 Е РНКазы Н из РГи или 4,375 Е РНКазы Н из АГи, 2,75 Е ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т и 1 мкл одной из матриц, и доводят конечный объем до 25 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег РегкопаР установленный на 62°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате демонстрируется, что продукты амплификации можно обнаружить с использованием от 100 фг до 10 пг геномной ДНК в качестве матрицы и любой из использованных РНКаз Н.

(2) Способ, описанный выше в (1), проверяют с использованием праймеров с более высокими величинами Тт. Сначала синтезируют праймеры К-Р-1033(68) (8ЕД ГО Νο 161) и К-Р-1133(68) (8ЕД ГО Νο 162). Реакцию амплификации осуществляют в тех же условиях, какие описаны выше в (1), за исключением того, что температура реакции составляет 63°С. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 38. Фиг. 38 иллюстрирует результаты электрофореза фрагмента генома МусоЬасРегшт 1иЬегси1ок1к, амплифицированного с использованием РНКазы Н из Р£и или РНКазы Н из АГи. Полосы 1-4 представляют результаты, полученные с использованием РНКазы НИ из Р£и и следующих количеств матричной ДНК: полоса 1: 10 пг; полоса 2: 1 пг; полоса 3: 100 фг; и полоса 4: отрицательный контроль. Полосы 5-8 представляют результаты, полученные с использованием РНКазы НИ из АГи и следующих количеств матричной ДНК: полоса 5:10 пг; полоса 6: 1 пг; полоса 7: 100 фг; и полоса 8: отрицательный контроль. Полоса М представляет ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.

Как видно из фиг. 38, показано, что амплифицированный фрагмент, представляющий интерес, можно обнаружить с использованием 100 фг матричной ДНК и любой из РНКаз. Видно, что больше амплифицированного продукта получают при использовании РНКазы Н из АГи. Кроме того, показано, что более устойчивая чувствительность детекции достигается при использовании РНКазы Н из АГи.

(3) Проверяют амплификацию с использованием комбинации праймеров К-Р-1033(68) и К-Р1133(68) и в качестве матрицы плазмиды, содержащей амплифицируемый участок. Сначала для того, чтобы получить плазмиду, содержащую амплифицируемый участок, синтезируют праймеры Р26 (8ЕД ГО Νο 163) и К1310 (8ЕД ГО Νο 164). РСК осуществляют с использованием указанных праймеров и штамма

- 64 007414 вакцины БЦЖ. Затем полученный продукт амплификации вводят в вектор рТ7-В1ие-Т (Такага З1шхо) для получения плазмиды. Состав реакционной смеси такой, какой описывается выше в (2), за исключением того, что используют 4 Е Вса ДНК-полимеразы. В результате подтверждается, что можно осуществить детекцию с использованием 1 фг матрицы.

(4) Сравнивают чувствительность детекции, достигаемой с использованием комбинации праймеров МТ!З2Е и МТ!З2К, приводящей к образованию мультимерных амплифицированных фрагментов, содержащих три амплифицированных фрагмента, представляющих интерес, и чувствительностью, достигаемой с использованием комбинации праймеров К-Е-1033(68) и К-Е-1133(68), приводящей к образованию трех амплифицированных фрагментов, представляющих интерес. В качестве мишени выбирают МусоЬасГепцт ГиЬегси1ок1к. Реакции осуществляют так, как описывается в примере 33(2), когда используют сочетание праймеров МТ!З2Е и МПЗ2К, или выше в (2), когда используют сочетание праймеров К-Е1033(68) и К-Е-1133 (68). В результате в обоих случаях отмечают одинаковую чувствительность детекции.

Пример 36.

Проверяют способ амплификации настоящего изобретения, не включающий денатурацию геномной ДНК как матрицы.

(1) Синтезируют праймеры рПОК-АТ-68-1 (ЗЕЦ ΙΌ Ыо 165) и ρ^ОN-АI-68-2 (ЗЕЦ ΙΌ Ыо 166) в соответствии с нуклеотидной последовательностью упаковывающего участка плазмиды ρ^ОN-АI (Такага Зйц/о).

(2) Готовят реакционную смесь общим объемом 50 мкл, содержащую 1 мкл раствора, содержащего от 10 фг до 1 пг рООК-АЕ 1 мкл раствора, содержащего 1 нг, 10 нг или 100 нг геномной ДНК, полученной из клеток МШ/3Т3, содержащих встроенную ρ^ОN-АI, полученную в примере 23, или 1 мкл воды в качестве отрицательного контроля, 50 пмоль каждого из праймеров, описанных выше в (1), 0,5 мМ каждого из άNΤР, буфер 32 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4 мМ ацетат магния, 0,01% ВЗА, 1% ДМСО, 18,5 Е РНКазы Н из РГи и 4 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Реакционные смеси помещают в термоциклер и инкубируют при 64°С в течение 1 ч. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле с целью обнаружения продуктов амплификации. Результаты приводятся на фиг. 39. На фиг. 39 полосы представляют результаты для следующих матриц: полоса М: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 1: отрицательный контроль; полоса 2: 1 нг геномной ДНК, содержащей встроенную рООМ-А^ полоса 3: 10 нг геномной ДНК, содержащей встроенную рОО^А^ полоса 4: 100 нг геномной ДНК, содержащей встроенную ρ^ОN-АI; полоса 5: 10 фг ДНК рОО^А^ и полоса 6: 1 пг ДНК ρ^ОN-АI.

Как видно из фиг. 39, амплификацию специфических фрагментов ДНК отмечают как в случае рОО^А! так и геномной ДНК, содержащей встроенную ρ^ОN-АI. Таким образом, доказывается, что фрагмент ДНК, представляющий интерес, можно амплифицировать без денатурации ДНК как матрицы перед реакцией, даже если в качестве матрицы используют геномную ДНК.

Пример 37.

Сравнивают надежность (точность) настоящего изобретения с точностью ПЦР с использованием ЬА-технологии, при которой используют ТаКаКа Ех Тад-полимеразу (Такага Зкихо). Сначала получают плазмиду для использования в качестве матрицы следующим образом.

Конкретно, методом ПЦР амплифицируют фрагменты, состоящие, каждый, из 300 п.о., представленные ЗЕЦ ΙΌ № 167-170, из гена протоонкогена человека \Уп1-5а (СепеВапк, инвентарный № Б20861), гена рибосомного белка З5 (СепеВапк, инвентарный № ХМ_009371), гена диафоразы человека (СепеВапк, инвентарный № ХМ_000903) и гена протокадгерина 43 человека (СепеВапк, инвентарный № АИ077347). В данном случае ПЦР осуществляют с использованием специфических праймеров, каждый из которых на 5'-конце содержит сайт для рестриктазы ЗГИ. После реакции амплифицированные фрагменты расщепляют рестриктазой ЗГИ (Такага Зкихо). рИС19 (Такага Зкихо) расщепляют рестриктазами АГ1Ш (ЯЕВ) и NάеI (Такага З1шхо) и подвергают электрофорезу в агарозном геле. Из геля вырезают фрагмент размером около 2 т.п.о. и извлекают с использованием ЕАЗУТКАР (Такага Зкихо). С использованием синтезатора ДНК синтезируют ДНК с последовательностью ЗЕЦ ΙΌ № 171 и комплементарную ей ДНК. Полученные ДНК денатурируют под действием тепла и затем отжигают одну с другой с образованием двухцепочечной ДНК. Такая двухцепочечная ДНК на своих концах имеет липкие концы для ферментов АГНИ и Шек Двухцепочечную синтетическую ДНК с использованием набора ΩΝΛ ЫдаГюп кй, уег. 2 (Такага З1шхо) встраивают в фрагмент, полученный расщеплением рИС19 рестрикционными ферментами. Полученную плазмиду обозначают рЮ62. рЮ62 содержит последовательности, к которым отжигаются праймеры ΟΝ2 (ЗЕЦ ΙΌ № 172) и ГСАШ (ЗЕЦ ΙΩ № 173), а также сайт для рестриктазы ЗИ1. Вышеуказанный ПЦР-амплифицированный фрагмент, расщепленный рестриктазой ЗИ1, лигируют с плазмидой с использованием набора БщаЕоп кй, уег. 2 (Такага Зкихо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйепсЫа сой 1М109 (Такага З1шхо). Полученные транформанты культивируют, выделяют плазмиды со встроенными ДНК длиной около 300 п.о., и определяют последовательности встроенных участков ДНК. Затем плазмиды используют в данном примере в качестве матриц.

(2) Продукты IСАN-амплификации получают следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл рас

- 65 007414 твора, содержащего 10 нг одной из плазмид в качестве матрицы, по 50 пмоль каждого из химерных праймеров ГСАЫ2 (ЗЕф ΙΌ Ыо 172) и ГСАЫ6 (ЗЕф ΙΌ Ыо 173) и 0,01% пропилендиамина. Раствор денатурируют при 98°С в течение 2 мин и инкубируют при 60°С в течение 1 мин в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1 и затем переносят на лед. Затем к раствору добавляют, в конечных концентрациях, буфер 20 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВЗА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из кЫТР, 30 Е РНКазы Н из Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции реакционные смеси подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле ЗеаКет СТС (Такага Зйгао). После электрофореза полосы с продуктами амплификации, представляющими интерес, извлекают из агарозного геля путем вырезания, выделяют продукты с использованием ЗиРКЕС-01 (Такага Зй^о), обрабатывают фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.

(3) Продукты ПЦР-амплификации получают с использованием ТаКаКа Ех Тад ДНК-полимеразы следующим образом. Коротко, готовят реакционную смесь с использованием 10 нг вышеуказанной плазмиды в качестве матрицы, а также 10 пмоль каждого из ДНК-праймеров ГСАЫ2 (ЗЕф ΙΌ Ыо 174) и ГСАЫ6 (ЗЕф ΙΌ Ыо 175), согласно руководству, прилагаемому к ТаКаКа Ех Тад ДНК-полимеразе (Такага Зйцао). Реакционную смесь помещают в термоциклер и проводят реакцию из 30 циклов, причем каждый цикл включает инкубацию при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в агарозном геле, как описывается выше в (2). Продукты амплификации, представляющие интерес, извлекают с использованием М1сгосоп-100 (Такага Зй^о), обрабатывают фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.

(4) Продукты амплификации, полученные выше в (2) и (3), субклонируют следующим образом. Коротко, продукты ГСАЫ-амплификации и продукты ПЦР-амплификации встраивают в вектор рТ7 В1ие (Такага Зйгао) с использованием набора РегГес(1у В1ип! С1ошпд кй (Такага Зйгао) согласно руководству. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток ЫоуаВ1ие Зтд1е§ (Такага Зйцао). Для каждой конструкции отбирают 10 колоний полученных трансформантов и культивируют для получения плазмиды, каждая из которых содержит ДНК-вставку размером примерно в 0,4 т.п.о. Фрагменты, встроенные в плазмиды, секвенируют с использованием праймера к Т7 промотору (Такага Зйлао) и праймера М3 (Такага Зйгао).

Методом секвенирования, как описано выше, анализируют в целом примерно 16000 оснований. В результате обнаруживают одну мутацию на примерно 2500 оснований как в случае фрагментов, амплифицированных способом настоящего изобретения, так и в случае фрагментов, амплифицированных методом ПЦР с использованием ТаКаКа Ех Тад ДНК-полимеразы. Таким образом, доказывается, что надежность (точность) способа настоящего изобретения эквивалента точности ЬА-РСК, которая высока.

Пример 38.

(1) Получение матрицы для ГСАЫ-реакции методом ПЦР.

Получают двухцепочечную кДНК из полиА РНК, полученной из мышиного головного мозга (ОпСепе), с использованием набора для синтеза кДНК (Такага Зйгао). ПЦР-фрагменты амплифицируют с использованием двухцепочечной кДНК в качестве матрицы и комбинаций праймеров с нуклеотидными последовательностями ЗЕф ΙΌ Ыо 176-189. Фрагменты вводят в вектор рТ7 В1ие Т (Такага Зйцао) методом ТА-клонирования для получения плазмидных клонов. Реакционную смесь общим объемом 50 мкл, содержащую 1 мкл (1 нг) одного из плазмидных клонов, 10 пмоль каждого из праймеров МСЗ-Е (ЗЕф ΙΌ Ыо 190) и МСЗ-К (ЗЕф ΙΌ Ыо 191), 1,25 Е Ех Тад (Такага Зй^о), 5 мкл 10-кратного Ех Тад буфера (Такага Зйцао) и 0,2 каждого из кЫТР, подвергают описанной далее реакции с использованием термоциклера ТаКаКа РСК Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1 (Такага Зйцао): 94°С в течение 2 мин, 30 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Полученный амплифицированный фрагмент ДНК используют в качестве матрицы для ГСАЫ-реакции.

(2) Амплификация фрагмента ДНК методом ГСАЫ с использованием в качестве матрицы продукта ПЦР.

Реакцию ГСАЫ осуществляют с использованием аминоаллил-кИТР (З1дта) с целью введения аминогруппы в продукт ГСАЫ-амплификации. Относительное включение аминогруппы в продукт ГСАЫамплификации изучают путем варьирования отношения количества кТТР к количеству аминоаллилкИТР при ГСАЫ-реакции, как указано далее: 10:0, 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4. Реакцию осуществляют следующим образом.

Сначала раствор общим объемом 10 мкл, содержащий 1 мкл реакционной смеси ПЦР, полученной выше в (1), по 50 пмоль каждого из праймеров МЕ2Ы3(24) (ЗЕф ΙΌ Ыо 192) и МК1Ы3(24) (ЗЕф ΙΌ Ыо 193) и 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина, в термоциклере ТаКаКа РСК Тйегта1 Сус1ег Рег§опа1 нагревают при 98°С в течение 2 мин, затем при 65°С в течение 30 с и быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице. К прогретому раствору добавляют реакционную смесь общим объемом 40 мкл, содержащую 0,625 мМ каждого из кАТР, кСТР и кСТР, 0,625 мМ смеси кТТР+аминоаллилкИТР, буфер 32 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 5,0 мМ ацетат магния, 0,6 Е РНКазы Н из Е. сой (Такага Зйлао) и 2,75 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Полученную смесь инкубируют в термоциклере при

- 66 007414

65°С в течение 1 ч.

К 50 мкл реакционной смеси добавляют 50 мкл изопропанола и 5 мкл 3 М раствора ацетата натрия (рН 5,2). Полученную смесь охлаждают при -80°С в течение 20 мин и затем центрифугируют для удаления супернатанта. К осадку добавляют 200 мкл 70% этанола. Супернатант удаляют центрифугированием. Осадок сушат на воздухе. Полученную ДНК перерастворяют в воде. Для определения количества продукта измеряют ОИ₂₆₀/280.

(3) Подтверждение включения аминоаллил-бИТР в продукт IСΑЫ-амплификации.

Включение аминогруппы в продукт IСΑЫ подтверждают с помощью флуоресцентного мечения аминогруппы в продукте IСΑЫ с использованием 5-карбоксифлуоресцеинсукцинимидного эфира (Мо1еси1аг РгоЬе). Вышеописанный раствор ДНК разводят для получения концентрации 2 мкг/50 мкл. Добавляют 20 мкл 1 М натрий-карбонатного буфера (рН 9,0). Затем добавляют еще 4 мкл раствора РГГС (Ыаса1а1 Текдне) в Ы,Ы-диметилформамиде с концентрацией 10 мМ. В полученной смеси проводят реакцию при 20°С в течение 16 ч. После удаления избытка ПТС с использованием коммерчески доступной центрифужной колонки 10 мкл реакционной смеси вносят в 2,0% агарозный гель и подвергают электрофорезу. После электрофореза детектируют флуоресцентный краситель с использованием РМ-ВЮ. Кроме того, детектируют IСΑЫ-амплифицированный продукт с помощью окрашивания Е(Вг. В результате подтверждается, что аминогруппу можно ввести в продукт IСΑЫ-амплификации путем проведения IСΑЫ с использованием аминоаллил-бИТР. Также подтверждается, что чувствительность детекции можно еще более повысить, используя в сочетании модифицированный нуклеотид, несущий функциональную группу, и флуоресцентную метку для продукта амплификации.

(4) Способ амплификации настоящего изобретения проверяют с использованием дезокси-ИТР. В качестве мишени выбирают МусоЬас(епит 1иЬегси1ок1к. Сначала синтезируют праймеры МГО82Р-16 (8ЕО ГО Ыо 194) и МТ^К^СС (8ЕО ГО Ыо 195) в соответствии с нуклеотидной последовательностью генома МусоЬас(епит 1иЬегси1ок1к, зарегистрированного в бепеВапк под инвентарным № Α6123456. Длина фрагмента, амплифицируемого с использованием указанной пары праймеров, включая праймерные части, составляет 98 п.о. Матрицу получают следующим образом. Коротко, продукт, полученный ПЦР-амплификацией генома МусоЬас(епит 1иЬегси1ок1к с использованием праймеров МТШ-РСК-Р^ (8ЕО ГО Ыо 196) и МТШ-РСК-К^ (8ЕО ГО Ыо 197), встраивают в рТ7-В1ие-Т-вектор (Такага 811ихо) с использованием набора ПЫЛ Ыдабоп к1( уег.2. Лигированную плазмиду используют для трансформации ЕккепсЫа сой 1М109. Полученные трансформанты культивируют для получения плазмиды с встроенной ДНК размером около 400 п.о. Раствор, содержащий 10³ копий плазмиды на мкл, получают, исходя из концентрации, определяемой путем измерения ОИ260.

Смешивают, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% Β8Α, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бΑТР, бСТР и б6ТР, смеси бТТР/бИТР (500/0, 400/100, 300/200, 200/300, 100/400 или 500/0 мкл), по 50 мкмоль каждого из праймеров МГО8 2Р-16 и МГО8 2Β.-ΑΑίζ 8,75 Е РНКазы Н из Ми, 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т и 1 мкл матрицы (10³ копий), и конечный объем доводят до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Т11егта1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле.

В результате отмечают образование продукта амплификации, представляющего интерес, при всех соотношениях бТТР/бИТР. На основании таких результатов можно утверждать, что модифицированный нуклеотид можно использовать в качестве субстрата в способе настоящего изобретения.

Пример 39.

Проверяют применение способа настоящего изобретения в одностадийном способе амплификации. В качестве мишени выбирают НСУ.

(1) Получение транскрибированной РНК.

Получают транскрибированную РНК как матрицу. Ее получают из 300 мкл сыворотки, полученной с информированного согласия пациента с вирусом гепатита С, с использованием реагента ТК!/о1 (Ы£е Тесбпо1од1ек) согласно инструкциям, прилагаемым к реагенту, с последующим конечным разведением в 20 мкл воды для инъекций (О(/ика Ркагтасеи(1са1). ОТ-ПЦР осуществляют с использованием описанного выше образца РНК в качестве матрицы. Реакцию осуществляют следующим образом. Готовят 50 мкл реакционной смеси с использованием 2 мкл образца РНК и 20 пмоль каждого из праймеров 8Р6-НСУ-Р (8ЕО ГО Ыо 198) и Т7-НСУ-К (8ЕО ГО Ыо 199), согласно руководству, прилагаемому к набору Опе-8(ер КЫΑ РСК кй (Такага 811ихо). Реакционную смесь помещают в термоциклер Тйегша1 Сус1ег Регкопа1 и подвергают реакции в следующем режиме: 50°С в течение 15 мин; 94°С в течение 2 мин; и 40 циклов 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле 8еаР1адие 6Т6. Из геля вырезают продукт амплификации размером 350 п.о., представляющий интерес. Затем выделяют ДНК с использованием ЕΑ8ΥТКΑР, Уег.2, согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Транскрибированную РНК синтезируют с использованием выделенной из геля ДНК в качестве матрицы и набора Сотреббуе КЫΑ Тгапкспрбоп кй (Такага 8бц7о), согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Транскрибированную РНК используют в качестве матрицы для исследования одностадийной КТ-IСΑЫ.

- 67 007414 (2) Исследование одностадийной ΡΤ-Κ'.ΆΝ.

Концентрацию транскрибированной РНК, полученной выше в (1), определяют на основании величины ΘΌ260, и готовят разведения, содержащие 10⁴, 10⁵, 10⁶ или 10⁷ копий на мкл. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечных концентрациях, буфер З2 мМ НЕΡЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ΕΞΑ, 4 мМ ацетат магния, по 500 мкМ каждого άΝΤΡ, по 50 пмоль каждого праймера НСV-Α 8 (8ЕО ΙΌ № 200) и НСV-Α Α (8ЕО ΙΌ № 201), З0 Е РНКазы Н из ΡΓυ, 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Τ, 20 Е ингибитора РНКазы, 0, 1, 2, 5, З или 5 Е ревертазы ХЬ ΑΜν (ЕШага 81шхо) и 1 мкл одного из разведений, содержащих различное число копий транскрибированной РНК. Реакционные смеси помещают в термоциклер Τ1κηηα1 Сус1ег Ρе^коиа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 2 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З% агарозном геле.

В результате образования продукта амплификации, представляющего интерес, при использовании любого разведения матрицы без добавления ревертазы ΑΜν не отмечают. С другой стороны, образование продукта амплификации, представляющего интерес, отмечают при использовании разведения, содержащего 10⁷ копий (добавлена 1 Е ревертазы ХЬ ΑΜν), 10⁶ копий (добавлены 2,5 Е ревертазы ХЬ ΑΜν), 10⁶ копий (добавлены З Е ревертазы ХЬ ΑΜν) или 10⁶ копий (добавлены 5 Е ревертазы ХЬ ΑΜν). Когда реакцию осуществляют при температуре 57°С, продукт амплификации, представляющий интерес, отмечают при использовании разведения, содержащего 10⁵ копий, и 2,5 Е ревертазы ХЬ ΑΜν. Кроме того, когда используют 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Τ и 10 Е РНКазы Н из ΡΓυ, продукт амплификации, представляющий интерес, отмечают при использовании разведения, содержащего 10⁶ копий, даже если ревертазу ΑΜν не добавляют.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение предусматривает способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, включающий амплификацию участка нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, подходящего для специфической амплификации, посредством реакции синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера. Настоящее изобретение также предусматривает способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающий детекцию фрагмента, амплифицированного из нуклеиновой кислоты-мишени, полученного способом амплификации нуклеиновой кислоты-мишени. Кроме того, способ амплификации настоящего изобретения можно использовать в качестве эффективного способа получения нуклеиновой кислоты путем сочетания его с другим способом амплификации нуклеиновой кислоты или способом дупликации нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также предусматривает способ детекции нуклеиновой кислоты для специфической детекции и количественного определения с высокой чувствительностью микроорганизмов, в частности, патогенных микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии, грибы, дрожжи или подобные, а также химерный олигонуклеотидный праймер для способа. Настоящее изобретение также предусматривает систему для амплификации и детекции нуклеиновой кислоты, которая является автоматизированной, применимой к малым количествам и высокоинтегрированной.

Свободный текст к Перечню последовательностей

8ЕО ΙΌ Цо 1: ПЦР-праймер ВкиП-З для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 2: ПЦР-праймер ВкиП-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № З: ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-81 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1еиах.

8ЕО ΙΌ № 4: ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-82 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 5: ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-85 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 6: ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-86 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 7: ПЦР-праймер КХП-Ше для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 8: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в гене РНКазы НН из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 9: аминокислотная последовательность РНКазы НН из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 10: ПЦР-праймер ВкиШ-1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 11: ПЦР-праймер ВкиШ-З для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 12: ПЦР-праймер ВкиШ-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик саШо1епах.

8ЕО ΙΌ № 1З: ПЦР-праймер ВкиШ-8 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладаю- 68 007414 щий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1йо!епах.

8Е0 ГО Νο 14: ПЦР-праймер В№П-§3 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1йо!епах.

8ЕО ГО Νο 15: ПЦР-праймер ВсаВ№П-3 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1йо!епах.

8ЕО ГО Νο 16: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОВЕ) в РНКазе НШ из ВасШик са1йо!епах.

8Е0 ГО Νο 17: аминокислотная последовательность РНКазы НШ из ВасШик са1йо!епах.

8Е0 ГО Νο 18: ПЦР-праймер ΒсаВNИINάе для амплификации гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1йо!епах.

8Е0 ГО Νο 19: нуклеотидная последовательность, являющаяся консервативной для РН1650 и части геномной последовательности Ругососсик Еипокик.

8Е0 ГО Νο 20: ПЦР-праймер 1650Νώ; для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик Еипокик.

8ЕО ГО Νο 21: ПЦР-праймер 1650Ват для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик Еипокик.

8ЕО ГО Νο 22: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОВЕ) в РНКазе НИ из Ругососсик Еипокик.

8ЕО ГО Νο 23: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из Ругососсик Еипокик.

8ЕО ГО Νο 24: ПЦР-праймер 915-Е1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегтоЮда тагШта.

8ЕО ГО Νο 25: ПЦР-праймер 915-Е2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегтоЮда тагШта.

8ЕО ГО Νο 26: ПЦР-праймер 915-В1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегтоЮда тагШта.

8ЕО ГО Νο 27: ПЦР-праймер 915-В2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегтоЮда тагШта.

8ЕО ГО Νο 28: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19. Нуклеотиды 24-25 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 29: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МВШ3, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19. Нуклеотиды 28-30 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 30: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный М13М4.

8ЕО ГО Νο 31: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 32: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 15-17 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 33: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 34: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 35: олигонуклеотидный праймер, названный МСВ-Е, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.

8ЕО ГО Νο 36: олигонуклеотидный праймер, названный МСВ-В, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.

8ЕО ГО Νο 37: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МЕ2N3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 38: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МВШ3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ГО Νο 39: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента

ДНК фага лямбда. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезок- 69 007414 сирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 40: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 41: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда.

8ЕЦ ΙΌ № 42: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда.

8ЕЦ ΙΌ № 43: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1епит крес1ек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 44: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1епит крес1ек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 45: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1егшт креаек.

8ЕЦ ΙΌ № 46: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1егшт креаек.

8ЕЦ ΙΌ № 47: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами -другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 48: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 49: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157.

8ЕЦ ΙΌ № 50: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157.

8ЕЦ ΙΌ № 51: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 52: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 53: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 54: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157.

8ЕЦ ΙΌ № 55: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157.

8ЕЦ ΙΌ № 56: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 57: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.

8ЕЦ ΙΌ № 58: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.

8ЕЦ ΙΌ № 59: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 60: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ № 61: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1епит креаек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- 70 007414

8ΕΡ ΙΌ Νο 62: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЬас1ейит 8рес1ез. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 63: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЬас1ейит 8рес1ез. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 64: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами -нуклеотид 18 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 65: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 66: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 67: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 68: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 69: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 15 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 70: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 9-11 и 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонукл еотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 71: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 8-10 и 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонукл еотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 72: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 73: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйейсЫа той 0-157.

8ΕΡ ΙΌ Νο 74: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 75: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 76: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши.

8ΕΡ ΙΌ Νο 77: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши.

8ΕΡ ΙΌ Νο 78: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный СМ0-РСК-Е, 20-мер.

8ΕΡ ΙΌ Νο 79: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный СМ0-РСК-К, 20-мер.

8ΕΡ ΙΌ Νο 80: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМ0-81, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ΕΡ ΙΌ Νο 81: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМ0-82, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонук- 71 007414 леотидами.

8ЕР ΙΌ Ν 82: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-А1,

20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕР ΙΌ N 83: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-А2, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

Ер ΙΌ № 84: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической Езйепсйна сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

Ер ΙΌ № 85: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 86: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 87: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 88: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши.

8Ер ΙΌ № 89: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши.

8Ер ΙΌ № 90: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 91: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 92: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 93: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 94: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рБО№АЕ Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 95: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рБО№АЕ Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 96: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 97: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 98: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате ампликафиции части ДНК НРУ.

8Ер ΙΌ N 99: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.

8Ер ΙΌ № 100: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.

8Ер ΙΌ № 101: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 102: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Ер ΙΌ № 103: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, полу- 72 007414 чающегося в результате амплификации фрагмента генома НРУ.

ЗЕф ГО Νο 104: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 105: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 106: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 107: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.

ЗЕф ГО Νο 108: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.

ЗЕф ГО Νο 109: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6.

ЗЕф ГО Νο 110: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6.

ЗЕф ГО Νο 111: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рВО^Ай

ЗЕф ГО Νο 112: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рОО^Ай

ЗЕф ГО Νο 113: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 114: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 115: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин-1 из геморрагической ЕкйепсЫа сой О-157.

ЗЕф ГО Νο 116: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1ок1п6шт Ьо1и1йшт. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 117: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1ок1п6шт Ьо1и1йшт. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 118: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1ок1п6шт Ьо1и1йшт.

ЗЕф ГО Νο 119: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 120: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 121: олигонуклеотидный зонд сконструированный, для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части генома вироида СЗУ6.

ЗЕф ГО Νο 122: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 123: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ГО Νο 124: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6.

ЗЕф ГО Νο 125: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУ6.

ЗЕф ГО Νο 126: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-гак. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды явля- 73 007414 ются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 127: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-газ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 128: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-газ.

ЗЕО ГО № 129: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-газ.

ЗЕО ГО № 130: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 131: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 132: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШОЗ мыши.

ЗЕО ГО № 133: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШОЗ мыши.

ЗЕО ГО № 134: олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19.

ЗЕО ГО № 135: олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 1о^ег, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19.

ЗЕО ГО № 136: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЗЕА-1, сконструированный для амплификации фрагмента генома З1арйу1ососсиз аигеиз. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами

- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 137: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЗЕА-2, сконструированный для амплификации фрагмента генома З1арйу1ососсиз аигеиз. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами

ЗЕО ГО № 138: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-Е3, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 139: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-В1, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО № 140: олигонуклеотидный праймер, названный МЕ2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды рИС19.

ЗЕО ГО № 141: олигонуклеотидный праймер, названный МВ1, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды рИС19.

ЗЕО ГО № 142: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.

ЗЕО ГО № 143: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОВЕ) в гене РНКазы НП из ТйегшоЮда шапйта.

ЗЕО ГО Ν 144: аминокислотная последовательность РНКазы НП из ТйегшоЮда тагИта.

ЗЕО ГО Ν 145: нуклеотидная последовательность РН1650 из Ругососсиз йопкозйи.

ЗЕО ГО № 146: ПЦР-праймер РйоНбе для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Ругососсиз йопкозйи.

ЗЕО ГО № 147: ПЦР-праймер РйоВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Ругососсиз йопкозйи.

ЗЕО ГО № 148: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОВЕ) в гене РНКазы НП из Ругососсиз йопкозйи.

ЗЕО ГО Ν 149: аминокислотная последовательность РНКазы НП из Ругососсиз йопкозйи.

ЗЕО ГО Ν 150: нуклеотидная последовательность АЕ0621 из Агсйаеод1оЬиз ГЫфбиз.

ЗЕО ГО № 151: ПЦР-праймер АГцКбе для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Агсйаеод1оЬиз Ги1д1биз.

ЗЕО ГО № 152: ПЦР-праймер АГиВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Агсйаеод1оЬиз ГЫфбиз.

ЗЕО ГО № 153: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОВР) в гене РНКазы НП из Агсйаеод1оЬиз ГЫфбиз.

ЗЕО ГО Ν 154: аминокислотная последовательность РНКазы НП из Агсйаеод1оЬиз ГЫфбиз.

ЗЕО ГО № 155: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МТ!З2Е, сконструированный

- 74 007414 для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 156: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МТ1Б2К, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 157: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2Е, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды СЫатуШа Касйотайк. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 158: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2К, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды СЫатуФа Касйотайк. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 159: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033(60), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 160: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133(62), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 161: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 162: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 163: олигонуклеотидный праймер, названный Е26, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о818.

БЕО ΙΌ № 164: олигонуклеотидный праймер, названный К1310, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт (нЬегсЫочх

БЕО ΙΌ № 165: химерный олигонуклеотидный праймер, названный р^0N-ΑI-68-1, сконструированный для амплификации фрагмента рБ0№АЕ Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 166: химерный олигонуклеотидный праймер, названный р^0N-ΑI-68-2, сконструированный для амплификации фрагмента рБ0№АЕ Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ Ν 167: протоонкоген \Уп1-5а из Ното 8ар1еп8.

БЕО ΙΌ № 168: рибосомальный белок Б5 из Ното 8ар1еп8.

БЕО ГО № 169: диафораза из Ното 8ар1еп8.

БЕО ΙΌ № 170: протокадгерин человека.

БЕО ΙΌ Ν 171: олигонуклеотид, сконструированный для получения рГС62.

БЕО ΙΌ № 172: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный 1СА\2. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ № 173: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный 1СА\6. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

БЕО ΙΌ Ν 174: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер ΙίΑΝ2.

БЕО ΙΌ Ыо 175: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер Ιί.ΆΝ6.

БЕО ΙΌ Но 176: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок Б18 мыши.

БЕО ΙΌ Ко 177: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок Б18 мыши.

БЕО ΙΌ № 178: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕК) мыши.

БЕО ΙΌ № 179: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕК) мыши.

БЕО ΙΌ № 180: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (БНГ4).

БЕО ΙΌ № 181: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (БДГ4).

БЕО ΙΌ № 182: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический бета-актин мыши.

БЕО ΙΌ № 183: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический бета-актин мыши.

- 75 007414

ЗЕф ΙΌ Ж 184: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.

ЗЕф ΙΌ Ж 185: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.

ЗЕф ΙΌ Ж 186: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (ΗΡΒΤ) мыши.

ЗЕф ΙΌ Ж 187: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (ΗΡΒΤ) мыши.

ЗЕф ΙΌ Ж 188: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей тирозин-3-монооксигеназу мыши.

ЗЕф ΙΌ Ж 189: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей тирозин-3-монооксигеназу мыши.

ЗЕф ΙΌ Ж 190: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МСЗ-Е.

ЗЕф ΙΌ Ж 191: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МСЗ-Β.

ЗЕф ΙΌ Ж 192: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΕ2Ν3(24). Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ΙΌ Ж 193: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΒ1Ν3(24). Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ΙΌ Ж 194: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤIЗ2Ε-16, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬаЖгшт 1иЬегси1о818. Нуклеотиды 14-16 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ΙΌ Ж 195: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤIЗ2Β-ΑСС, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬаЖгшт 1иЬегси1о818. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕф ΙΌ Ж 196: олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤIЗ-ΡСΒ-Ε-2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬаЖгшт 1иЬегси1о818.

ЗЕф ΙΌ Ж 197: олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤIЗ-ΡСΒ-Β-2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬаЖгшт 1иЬегси1о818.

ЗЕф ΙΌ Ж 198: олигонуклеотидный праймер, названный ЗΡ6-ΗСУ-Ε, сконструированный для амплификации фрагмента генома ΗСУ.

ЗЕф ΙΌ Ж 199: олигонуклеотидный праймер, названный ЗΡ6-ΗСУ-Β, сконструированный для амплификации фрагмента генома ΗСУ.

ЗЕО ΙΌ Ж 200: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΗСУ-Α З, сконструированный для амплификации фрагмента генома ΗСУ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ΙΌ Ж 201: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΗСУ-Α А, сконструированный для амплификации фрагмента генома ΗСУ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- 76 007414

Перечень последовательностей <110> Такага 81ιιιζο Со., Ы4.

<120> Химерный олигонуклеотидный праймер для способа амплификации нуклеиновой кислоты; продукт для амплификации нуклеиновой кислоты; зонд для способа детекции нуклеиновой кислоты - мишени; материал с иммобилизованной амплифицированной нуклеиновой кислотой и способ его получения; способ определения нуклеотидной последовательности.

<130> 662757 <150> Л* 2000-251981 <151> 2000-08-23 <150> Л³ 2000-284419 <151> 2000-09-19 <150> Л» 2000-288750 <151> 2000-09-22 <150> ТР 2001-104191 <151> 2001-04-03 <160> 201 <210> 1 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 77 007414 <220>

<223> ПЦР-праймер ВзиП-З для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз са14о1епах <400> 1 д1сдсса§с§ садШаШу! 20 <210>2 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ВзиП-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз са14о1епах <400> 2 с§§1ссс1с§ 1сасуШ1§с 20 <210>3 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-81 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз са14о1епах <400> 3 сдсдсййс с§§сд1са§с 20

- 78 007414 <210>4 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223>ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-82 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз саИо!епах <400>4 ас§,§,с§сас§ сйсааШд 20 <210>5 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-85 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз са1йо!епах <400> 5 ас§сс1аШ §сс§§§§сй 20 <210>6 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 79 007414 <220 <223> ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-86 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз са1бо!епах <400>6 а(§асс§ас§ са§с§§с§а( 20 <210> 7 <211> 39 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΚΝΙΙ-Νάε для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШиз са1бо!епах <400> 7

1а§аа§а§§§ а§а§§саШ §аа§с§§1а1 ас§§1§ааа 39 <210> 8 <211> 780 <212>ДНК <213> ВисШиз са1бо1епах <400> 8 а1§аа§с§§1 а!ас§§1§аа а§асай§аа §с§с!§сйс с§аа§сй§§ с§с§§ас§ас 60 сс§с§с1§§§ а§а!цс1§с§ §са§§а!§а§ с§ааааа§с§ 1§са§§с§с11сН§ссс§1 120 т§ааа§£с а£ааа£с§с§ сс§§сас§сс а!с§а§са§с §§1§§§аа§а ас1аа1£С£1 180

1а1§а§а§§§ аас!а1ас§с с§с1§§с£й а§ас§§а1с§ сс§§саН§а 1§а§§сс§££ 240 с£с§§ссс§с 1§§сс§§ссс §§1с§1с§сс цсс§с§§1са 1сН§сс§аа а§ас§сс!а! 300

- 80 007414 йдссддддс Ндасдас!с даадсддс!д асдссддааа адсдсдаддс айдй!дсд 360 сааайдаад сд!дсдссд! сдсса!сддс а!сддса!с§ !садсдсддс ддада!сда! 420 даааддаа!а Шасдаадс дасааддсаа дсда!ддсда аадсдд(даа сдсссШсс 480 ссдссдсс!д аасаШдс!!§!!да!дсд а!ддсдд!дс сд!дсссас! дссдсаасад 540 сдсс!са!аа ааддадасдс саасадсдс!!саа!сдссд с!дсд!сдд! са!сдссааа 600

Шеасцсцсц ассее!е£а! еаааеаас!е еа!с2сс2с! а!ссасаа!а сееайсесе 660 сдсса!а!дд дс!асддаас дссддааса! йсдаддсда !ссдссдс!а сддсд!!асд 720 сс!дадсасс §1с§йс§й сдсассд§!д адддадд!дс !дааддсдад сда§са§с!с 780 <210> 9 <211> 260 <212> Белок <213> ВисШиз са!с1о1епах <400> 9

Ме! Ьуз Агд Туг ТЬг Уа1 Ьуз Азр Не СИи А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз

1015

Ьеи 61у А1а Азр Азр Рго Агд Тгр СИи Ме! Ьеи Агд 61п Азр СИи

2530

Агд Ьуз 8ег Уа1 С1п А1а Ьеи Ьеи А1а Агд РЬе О1и Агд СИи Ьуз

4045

А1а Агд Агд Ыз А1а Не СИи О1п Агд Тгр СИи С1и Ьеи Ме! Агд

5560

Туг СИи Агд (Ии Ьеи Туг А1а А1а СИу Уа1 Агд Агд Не А1а СИу

7075

Не Азр СИи А1а О1у Агд СИу Рго Ьеи А1а СИу Рго Уа1 Уа1 А1а

8590

А1а А1а Уа1 Не Ьеи Рго Ьуз Азр А1а Туг Ьеи Рго С1у Ьеи Азр

100105

Азр 8ег Ьуз Агд Ьеи ТЬг Рго СИи Ьуз Агд СИи А1а Ьеи РЬе А1а

- 81 007414

ПО 115120

61п Не О1и А1а Суз А1а Уа1 А1а Не С1у Не С1у Не Уа1Зег

125 130135

А1а А1а 01 и Не Азр 01и Агд Азп Не Туг 01и А1а Ткг Агд С1п

140 145150

А1а Ме! А1а Ьуз А1а Уа1 Азп А1а Ьеи Зег Рго Рго Рго О1и Н1з

155 160165

Ьеи Ьеи Уа1 Азр А1а Ме! А1а Уа1 Рго Суз Рго Ьеи Рго О1п О1п

170 175180

Агд Ьеи Не Ьуз О1у Азр А1а Азп 8ег А1а 8ег Не А1а А1а А1а

185 190195

8ег Уа1 Не А1а Ьуз Уа1 ТЬг Агд Азр Агд Тгр Ме! Ьуз О1и Ьеи

ΊΑΑ ПАС Э1Л

Ζ,νν Ζ,ΙΜ

Азр Агд Агд Туг Рго О1п Туг О1у Рке А1а Агд Н1з Ме! О1у Туг

215 220225

О1у Ткг Рго О1и Из Рке О1и А1а Не Агд Агд Туг О1у Уа1 Ткг

230 235240

Рго О1и ΗΪ8 Агд Агд Зег Рке А1а Рго Уа1 Агд О1и Уа1 Ьеи Ьуз

245 250255

А1а Зег С1и О1п Ьеи

260 <210> 10 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ВзиШ-1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз са!с!о!епах

- 82 007414 <400> 10 ££1аа§£1с! (дкусагдд 20 <210> 11 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

I I Т I О ΤΤΠΟΤΙΙίαη ТДоиТТТ_Д ТТТТСТ Τ/·ΤΤΓ\ΤΤΤΛΎΛΓ\Έ>αυτΖ<Τ ΓΡΪΐα ТГГ\ ττττννχ ΤΤΓΧΤΤΤεΐΤ-'Ζ-χ ТТЛ ттттггаттггтттт Л^ГГЛ тглтлттттттЧ хххДх -.ыр'мхшхк-'р ^^оилриоиппл д ν-ιιιΧ, χν'χυ,νΐ м 11МЛШ1Ч>Л11Г1Д, ММЛДДсимгЦИм активностью РНКазы НШ, из ВасШиз саМо1епах <400> 11 £§аасс§§а§ а«ауйу§§ 20 <210> 12 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ВзиШ-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз са1бо1епах <400> 12 а!§ай§аа§ са§сп§спас 20 <210> 13 <211> 20

- 83 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ВзиШ-8 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз са!йо1епах <400> 13 дбайддсда аа1§пагуй 20 <210> 14 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΚΝΙΙΙ-83 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из Васй1из саИо1епах <400> 14 сссдайДс д(:сдссдссд 20 <210> 15 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ВсаКМШ-З для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз са!йо1епах

- 84 007414 <400> 15 §а1асд!дда сасШссдс 20 <210> 16 <211> 915 <212>ДНК <213> ВисШиз са1йо!епах <400> 16 §1§айсаа§ ссдассааса §с1§сйдас дссйдсдсд сссас!асса адасдссйа 60

Гссдассддс Йссд§с1д§ а§сдйд!й дссд1саа§с §сссдда1£1 сд1са!сасс 120 §сс1асс§с! саддсааад! §с!д1Йсаа дддааадсдд сддадсаада адсадсдааа 180

1§§а1а1са§ дддсдадсдс с!сааас§аа аса§с!§асс асса§сс§1с сдсШддса 240 §с1са1саас 1с§§§1с1с1 Йсс§сса1с §§йсс§а1§ аа§1сд§сас сддсдайа! 300

Йсддсссда 1сд1с§1сдс с§сс§сс!ас §1§да1сддс сдса!а1с§с саааа!сдс§ 360 дсдсйддсд 1§ааа§айс дааасаайд аас§а1да§§ саа!сааас§ да!с§ссссс 420 §сса1са!дд ааассд!дсс дса!дсд§1с ассд1дйдд асаа!дссда а!асаассдс 480

1§§садс§аа §сддса1§сс дсадасдааа а!§ааа§с§с 1ссйсасаа сс§§ас§с1с 540 §1§ааас1с§ йдасдсса! сдсдсссдсс даассадаад саа!са!са1 сдасдааШ 600

Йаааасддд айс§1аШ ссдйассй 1сс§а1§аа§ а!сдсайа1 ссдсдадсдд 660 §1§сас1§сс Йсссааддс д§ааа§1§1с сасд!а1са§ 1с§сс§сс§с с1сда!са1с 720 §ссс§с1а1§ 1дйй1а§а саайа!ссс §с§ссд!с§§ сс!сс1дсй 780 ссаааа§§с§ ссддсдсса! 1§1с§а1§аа дссдсддсса аса!са1сс§ сдсдсддддд 840 дсддаадсдс Й§а§аса1§ сдссаадсй саШсдсса а1асаааааа §§сдс1§дас 900 а!с§ссааас 915 <210> 17 <211> 305 <212> Белок

- 85 007414 <213> ВисШиз сак!о1епах <400> 17

Ме! Не 61п А1а Азр 61п О1п Ьеи Ьеи Азр А1а Ьеи Агд А1а Н1з

5 1015

Туг С1п Азр А1а Ьеи 8ег Азр Агд Ьеи Рго А1а О1у А1а Ьеи РЬе

2530

А1а Уа1 Ьуз Агд Рго Азр Уа1 Уа1 Не ТЬг А1а Туг Агд Зег С1у

4045

Ьуз Уа1 Ьеи РЬе СНп О1у Ьуз А1а А1а О1и О1п С1и А1а А1а Ьуз

5560

Тгр 11е 8ег 61у А1а 8ег А1а 8ег Азп СЬи ТЬг А1а Азр Ηϊβ С1п

7075

Рго 8ег А1а Ьеи А1а А1а Ηϊβ С1п Ьеи СЬу Зег Ьеи Зег А1а Не

8590

СЬу 8ег Азр СЬи Уа1 СЬу ТЬг СЬу Азр Туг РЬе СЬу Рго Не Уа1

100105

Уа1 АЬа АЬа АЬа Туг Уа1 Азр Агд Рго Ηϊβ Не А1а Ьуз Не АЬа

110 115120

А1а Ьеи СЬу Уа1 Ьуз Азр Зег Ьуз СЬп Ьеи Азп Азр СЬи АЬа Не

125 130135

Ьуз Агд Не А1а Рго АЬа 11е Ме! СЬи ТЬг Уа1 Рго Ηΐβ А1а Уа1

140 145150

ТЬг Уа1 Ьеи Азр Азп А1а СЬи Туг Азп Агд Тгр СЬп Агд Зег СЬу

155 160165

Ме! Рго СЬп ТЬг Ьуз Ме! Ьуз А1а Ьеи Ьеи ΗΪ8 Азп Агд ТЬг Ьеи

170 175180

Уа1 Ьуз Ьеи Уа1 Азр А1а Не А1а Рго А1а СЬи Рго 61 и А1а Не

185 190195

Не Не Азр 61и РЬе Ьеи Ьуз Агд Азр Зег Туг РЬе Агд Туг Ьеи

- 86 007414

200 205210

Зег Азр (Ли Азр Агд Не Не Агд О1и Агд Уа1 Ыз Суз Ьеи Рго

215 220225

Ьуз А1а (Ли Зег Уа1 Ηΐβ Уа1 Зег Уа1 А1а А1а А1а 8ег Не Не

230 235240

А1а Агд Туг Уа1 РЬе Ьеи О1и О1и Ме! (Ли С1п Ьеи 8ег Агд А1а

245 250255

Уа1 (Лу Ьеи Ьеи Ьеи Рго Ьуз (Лу А1а (Лу А1а Не Уа1 Азр 61и

260 265270

А1а А1а А1а Азп Не Не Агд А1а Агд (Лу А1а (Ли А1а Ьеи (Ли

275 280285

ТЬг Суз А1а Ьуз Ьеи Из РЬе А1а Азп ТЬг Ьуз Ьуз А1а Ьеи Азр

290 295300

Не А1а Ьуз Агд Агд

305 <210> 18 <211> 39 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ВсаИЧШМНе для амплификации гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз са14о!епах <400> 18 сдаасдйд! сааасса!а! дайсаадсс дассаасад 39 <210> 19 <211> 663

- 87 007414 <212>ДНК <213> Ругососсик йопкокйй <400> 19 а(еааеейе с!ееаейеа (еааесееее аееееессее 1аайеессс ейаеЕаай: 60 §§а§1а§сс§ «а!а§а!§а §ааааа(ай §а§а§§йас £1§асай§§ §§йааа§ас 120 {ссааасаа!1аас1сс1§§ §саас§1цаа ааас!аШа §сааайаа1 а§а!а!сс1а 180 §ас§айай а1§йсйс1 с§Иассссс аа§§ааа!а§ а!§а§а§§са 1сайс1а1§ 240 аа!§аас!а§ аа§с1§а§аа айс§й§1а §ссй§аай сШаа§§а1 саа§сс§са§ 300 аа§а!а!а1§ 1§§ас1с1§с с§а1§1а§а! сс(аа§а§§1 И§с1а§1с1 аа!ааа§§с1 360 §§§й§ааа! а!§аа§ссас §§йа!с§сс §а§са1ааа§ сс§а!§сааа §1а1§а§а1а 420 §1а1с§§са§ са!саа1аа! 1§сааа§§1с ас!а§§§а!а §а§а§а!а§а §аа§с!ааа§ 480 саааа§1а!§ §§§ааШ§§ Дс1§§сШ сс§а§1§а!с с§а§аас1аа §§а§1§§сй 540 §аа§аа1ай асааасаа1а 1§§1§асШ сс!ссаа1а§ йа§§а§аас й§§§ааасс 600 §с1а§§аа§а 1а§а§§ааа§ §Ша§аааа аа!са§с1аа с§сй§а!аа айссйаа§ 660 1§а 663 <210>20 <211> 33 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер 1650Νάε для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик {ипокик <400>20 са§§а§§а§а §аса1а1£аа аа1а§£§§§а ай 33

- 88 007414 <210> 21 <211> 33 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер 1650Ват для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Ругососсиз йдпозиз <400>21 §аа§§й§1§ §а!ссасШ с!аа§§Шс На 33 <210 22 <211>672 <212>ДНК <213> Ругососсиз Гипозиз <400 22

АТОААААТАС ССООААТТСА ССЛАССАССА АСАССАССА6 СОАТЛССОСС

АТТАОТАОТА 60

6СТАСТОТСО ТСОТТОАТОА ОАААААСАТТ ОАОААОСТСА ОАААСАТТОО

А ОТ ААА АОЛ С 120

ТССАААСААС ТААСАССССА ТОАААСОААО ААТТТАТТТТ СССАОАТААС

СТСААТА0С6 180

О АТ О АТТ АС А АААТАОТСАТ АОТАТССССА ОААОАААТСО АСААТАОАТС

АООААСААТО 240

ААСОАОТТАО АСОТАОАОАА ОТТТОСТСТС 6ССТТАААТТ СОСТТСАСАТ

ААААССАССТ 300

СТТАТАТАСО СТОАТССАОС ССАТОТАОАТ ОССААТАСАТ ТТССААССТТ

САТА6АОАОА 360

- 89 007414

АСАСТСААТТ АТААССССАА ОАТТАТТССС ОААСАСААСС СССАТССААА

СТАТССАОТА 420

СТТ'ГСАССАС СТТСААТАСТ ТССАААОСТТ ОТТАСССАТС АСОАААТТОА

ААААТТАААА 480

ААССААТАТС ОАСАСТТТОС СТСТСССТАТ ССААСТСАТС САААААССАА

6АААТСССГГ 540

СААСАСТАСТ АСААААААСА СААСТСТТТС ССТССААТАС ТСАОАССААС

СТСССАААСТ 600

СТААСААААА ТА6АССААА0 САТТАААОСС ААААААТССС АССТААСОСТ

ТОАТАААТТС 660

ТТТААСАААС СТ 672 <210>23 <211>224 <212> Белок <213>Ругососсиз Гипозиз <400> 23

Ме1 Ьуз Пе СИу СИу Пе Азр С1и А1а СИу Аг§ СИу Рго А1а Не

1015

СИу Рго Ьеи Уа1 Уа1 А1а ТЬг Уа1 Уа1 Уа1 Азр СИи Ьуз Азп 11е

2530

СИи Ьуз Ьеи Аг§ Азп Пе СИу Уа1 Ьуз Азр Зег Ьуз С1п Ьеи ТЬг

4045

Рго ΗΪ8 СИи Аг§ Ьуз Азп Ьеи РЬе Зег С1п Пе ТЬг Зег Пе А1а

5560

Азр Азр Туг Ьуз Пе Уа1 Пе Уа1 Зег Рго СИи СИи Пе Азр Азп

7075

Аг§ Зег СИу ТЬг Ме1 Азп СИи Ьеи СИи Уа1 СИи Ьуз РЬе А1а Ьеи

8590

- 90 007414

А1а Ьеи Азп 8ег Ьеи О1п Не Ьуз Рго А1а Ьеи Не Туг А1а Азр

100105

А1а А1а Азр Уа1 Азр А1а Азп Агд РЬе А1а 8ег Ьеи Не 61и Агд

110 115120

Агд Ьеи Азп Туг Ьуз А1а Ьуз Не Не А1а С1и ΗΪ8 Ьуз А1а Азр

125 130135

А1а Ьуз Туг Рго Уа1 Уа18ег А1а А1а 8ег Не Ьеи А1а Ьуз Уа1

140 145150

Уа1 Агд Азр С1и О1и Не 61и Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз С1п Туг С1у Азр

155 160165

РЬе О1у 8ег СИу Туг Рго 8ег Азр Рго Ьуз ТЬг Ьуз Ьуз Тгр Ьеи

170 175180

С1и С1и Туг Туг Ьуз Ьуз ΗΪ8 Азп 8ег РЬе Рго Рго Не Уа1 Агд

185 190195

Агд ТЬг Тгр С1и ТЬг Уа1 Агд Ьуз Не 61и О1и Зет Не Ьуз А1а

200 205210

Ьуз Ьуз 8ег О1п Ьеи ТЬг Ьеи Азр Ьуз РЬе РЬе Ьуз Ьуз Рго

215220 <210> 24 <211> 28 <2Г2> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер 915-Р1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТЬеппо1ода тапйта <400> 24 ааааадсйд ддаа!ада!д адсШас 28

- 91 007414 <210>25 <211>26 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер 915-Р2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из 1Ъегто1о§а тапбта <400>25 ааасса1§§§ аа1а§а1§а§ сШас 26 <210>26 <211> 29 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР-праймер 915-К1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ^гГЪегто1ода тапбта <400 26 ааа1с!а§а1 сс!саасШ §1с§а1§1§ 29 <210>27 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 92 007414 <220>

<223> ПЦР-праймер 915-К2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из ТЬеппо1о§а тапйта <400> 27 аа1с1а§ай аааааа§а§£ 30 <210>28 <211> 25 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный риС19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19. “Нуклеотиды 24-25 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 28 §§1§1сас§с 1с§1с§й1§ §1аи§ 25 <210>29 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΚ1Ν3, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19. “Нуклеотиды 28-30 являются рибонуклеотидами

- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 93 007414 <400> 29

ШасасШ а!дскссдд с!сд!а!дии 30 <210>30 <211> 17 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный М13М4.

<400> 30 дййсссад 1сас§ас 17 <210> 31 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсйепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 31

1§1сайс§с 1с1§саа1а§ §иа 23 <210>32 <211> 23

- 94 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсИепсЫа со11 0-157. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 32 сассадасаа !§!аасс§с! §ии 23 <210>33 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами. ” <400> 33 !ас!д§§Ш йсйсддиа 20 <210>34 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 95 007414 <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 34 а(адаса!са адссс1сдиа 20 <210> 35 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МСК-Е, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК <400> 35 ссайсаддс 1дс§саас1§ й 22 <210> 36 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МСК-К, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.

- 96 007414 <400> 36 !§дсас§аса ддШсссда с! 22 <210> 37 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΡ2Ν3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. “Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 37 §с1§сааддс дайаадйд §§иа 24 <210> 38 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΚ.1Ν3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. “Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 38 сШа!§сй ссд§с1сд1а 1§ии 24

- 97 007414 <210> 39 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 39 сс1йс1с1§ 1Ш1д1ссд 20 <210>40 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>40 аа§сасс!са ИасссШдс 20 <210> 41 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 98 007414 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда.

<400>41 §§§с§§сдас с1с§сд§§П йс§ 24 <210>42 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 42 §с1§сйа1д с!с1а1ааа§ 1а§£ 24 <210>43 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЪас1епит зрес1е8. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 99 007414 <400 43 а§§аа!сШ аШассаи§ <210> 44 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЬас1епиш зресхез. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 44 <210>45 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1епит зрес1ез.

<400>45

<210>46 <211> 24

- 100 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК

Р1ауоЬас1епшп зреоез.

<400> 46

1§Ш1§асс аааса!а§1а а!§с 24 <210> 47 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами. ” <400> 47 {с§Цааа(а §1а!ас§§ас а 21 <210>48 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 101 007414 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами. ” <400>48 !дс!саа!аа !са§асдаад 20 <210>49 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа соП 0-157.

<400> 49 ааа!д§дд!а с1д1дсс!д! !ас! 24 <210> 50 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа соН 0-157.

<400> 50

- 102 007414 с1с1д(а1с1 §сс1даа§сд 1аа§ 24 <210> 51 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>51

1асс1дддй Шсйсдди а 20 <210> 52 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 52 а!адасйй сдасссааса 20

- 103 007414 <210> 53 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами. ” <400> 53 а!а§аса1са а§ссс!сдиа 20 <210>54 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа соИ 0-157.

<400> 54

1сдйааа!а §1а1ас§дас а 21 <210> 55 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 104 007414 <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой 0-157.

СС а1а§аса!са а§ссс!с§1а 20 <210>56 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 56 §аасаа!§§а а§1саасааа 20 <210> 57 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.

- 105 007414 <400> 57

1асй§1дд1 1сс1д1дд1§ <210>58 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУй.

<400> 58

<210> 59 <211>18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У0. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 59 ддааасадд аддаадис <210> 60 <211> 20

- 106 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУй. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 60 §1даааассс 1дШа§даи 20 <210> 61 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1епит зреаез. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 61 асс!ада1а1 аадс!с1аса 20 <210> 62 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 107 007414 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЬас1епит зрес1ез. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 62 ааа1а§а1§1 Шадсадад 20 <210>63 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЬас1епиш зрес1ез. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 63 а!ада!аааа аааас!ссас 20 <210 64 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 18 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 108 007414 <400> 64 !сдйааа!а д!а!ас§1ас а 21 <210> 65 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 65 !сдйааа!а д!а!ас1дас а 21 <210 66 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзспепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 66

- 109 007414

1с§йааа1а §1а1а1§§ас а <210>67 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 67

1§с1саа1аа 1са§ас1аа§ <210>68 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>68

1§с1саа1аа 1са§ащаа§

- 110 007414 <210 69 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 15 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 69

1§с1саа1аа 1са§1с§аа§ 20 <210>70 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 9-11 и 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 70

1асс1§§§ии ийсПс§§и а 21 <210> 71 <211> 20

- 111 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 8-10 и 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 71 а1а§асаиса а§ссс(с§ца 20 <210>72 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются /Д,Ч/.->Ч»АХЧ/ХА^ХАк7Х/АА АХ^АЧ/Ч/ А ХА/ Ц4Л1УАДА.

<400>72 §(сссс1§а§ а1а(а(£иис 20 <210> 73 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 112 007414 <220>

<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157.

<400> 73 ссаасааа§11а1§1с1сй с§йааа!а§ 30 <210>74 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1ΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 74 а1£ссай£а §йса!саас 20 <210>75 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΪΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 17-19 являются

- 113 007414 рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 75 <210> 76 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΪΝΟ8 мыши.

<400> 76

<210>77 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 77 ааа§а1§а§ <210> 78

- 114 007414 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-РСК.-Р 20-мер.

<400>78 а1с§йдаа§ а!дсс!с1§с 20 <210>79 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный СМО-РСК.-К 20-мер.

<400> 79

1ссд1а1§а1 сдс§сд!са1 20 <210>80 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-81 20мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 115 007414 <400> 80

Ыддададд асасдс!§ас <210> 81 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-82 20мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 81

<210>82 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМО-А1 20мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 82

- 116 007414 <210> 83 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-А1 20мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 83 йссддааад дссададдаи 20 <210> 84 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 84

1ас1§ддЦ ШсПсдди а 20 <210> 85 <211> 20 <212>ДНК

- 117 007414 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 85 а!а§аса1са адссс!сдиа 20 <210> 86 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 86

1са1§ссай §адйса!са ас 22 <210>87 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 118 007414 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 87

1§§кад§йс ск§Й£Шс иа 22 <210> 88 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши.

<400> 88

1са1§ссаИ §а§йсакса ас 22 <210 89 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши.

<400 89

1§£1а§£йс ск§й£кйс ка 22

- 119 007414 <210>90 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 90 с1§сдаддс§ §1§дсаа§§§ 20 <210> 91 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>91 с1§сс1с§с1 ддсс§1§ссд с 21 <210>92 <211> 23 <212>ДНК

- 120 007414 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 92 с1са1§сса1 аас <210 93 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝ08 мыши. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 93 §с!§§1а§§!1сс1§й§Щ ис 22 <210> 94 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации

- 121 007414 фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ. “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 94 а§с1с1§1а1 с1§§с§§ас 19 <210> 95 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 95 §а!с§§§а« Ш§§ас1са § 21 <210 96 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ типа 16. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 96

- 122 007414 саааададаа с!дсаа!дии и 21 <210>97 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ типа 16. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 97 дйдсйдса д!асасасаи и 21 <210>98 <211> 27 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части ДНК НРУ.

<400> 98 даддасссас аддадсдасс садааад 27 <210> 99 <211> 20 <212>ДНК

- 12З 007414 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.

<400> 99 сас1ссасса 1£аа1сас1с 20 <210> 100 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 100 §§1§сас§§1 с!ас§а§асс 20 <210> 101 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 124 007414 <400> 101 с1§1§аддаа с!ас1§1сии с 21 <210> 102 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 102 дсадассас! а!§§сиси 18 <210> 103 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации фрагмента генома ДНК НРУ.

<400> 103 §1а1да§1§1 с§1§са§сс1 ссаддасссс 30 <210> 104

- 125 007414 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 104

1£а§аса1а11а1с1§ссас § 21 <210> 105 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 105 ааа1§§с1а§ §а§§1§§аа§ а 21 <210> 106 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 126 007414 <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 106 йа!садсса д!асс!с!ис д 21 <210> 107 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.

<400> 107 !дадаса!а! !а!с!дссас д 21 <210> 108 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 108

- 127 007414 ааа1§§с!а§ §а§§1§§аа§ а 21 <210> 109 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У4.

<400> 109 §§§§ааасс1 §§а§§аа§1с 20 <210> 110 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уд.

<400>110 с§§§1а§1а§ ссааа§§аа§ 20 <210> 111 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 128 007414 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρΟΟΝ-ΑΙ.

<400> 111 а§с1с1д!а1 с1§дсд§ас 19 <210> 112 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ.

<400>112 §а(сд§§ай Ш§§ас1са § 21 <210> 113 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 129 007414 <400> 113 ёёё&йааИ 1£1И§са§и <210> 114

1 ОА

I Ι<212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсИепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 114

<210> 115 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157.

<400> 115

- 130 007414 <210> 116 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из СЬзйтйшт ЬоШйпит. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

<400> 116 сассадаадс аааасаадии с 21 <210> 117 <211>23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность ^ζζυ^ <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1о51пс1шт ЬоШНпит. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 117 с1ай§а1д11аасаасай сии 23 <210> 118

- 1З1 007414 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1о81псНит ЬоШйпит.

<400> 118 дддадйаса ааайаШд ададааШа 30 <210> 119 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У4. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 119 сасссйсс! йадЩсси и 21 <210> 120 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 132 007414 <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У6. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 120 сдйдаадс! 1са§йдиии 20 <210> 121

1-^ оп

1 V <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный зонд сконструированный, для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части генома вироида С8У6.

<400> 121 ссйсс!с1с С1§§ада§д1 сйс1§ссс1 30 <210> 122 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уд. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 133 007414 <400> 122 сасссйсс! йа§Шсси и 21 <210> 123 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 123 с£й§аа§ск кса§й§1ии с 21 <210> 124 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8УП.

<400> 124 сасссйсс! На^Шсск I 21 <210> 125 <211> 21

- 134 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У6.

<400> 125 с§Н§аа§с! 1са§й§1й с 21 <210> 126 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-кьгаз. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 126 §ас!§аа1а! ааасй§и§§ 20 <210> 127 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 135 007414 фрагмента онкогена с-кТгаз. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 127 с1ай§11§§ а!са!а1ис§ 20 <210> 128 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-кьгаз.

<400> 128 §ас1§аа!а! аааск§1§§ 20 <210> 129 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-И-газ.

<400> 129 с1ай§Н§§а1са1айс§ 20

- 136 007414 <210> 130 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзНепсЫа соН ^ΐ-Тж ГТ7· ΓΤΛΖ-ντΤΤ ТТТ Т 1 О ОЛ ГТТ» ГТГТТ/'Л'Т'Г'ГГ *ЛТТ^Г\ТТХГТЛТТЛГЧ^Г¥ТТТТО‘Ж ГТТ ТТ··^·» ИПТЖЛ Τ'ηΤΤΧΤΤαΓΐ'ηϊΤΎΤ Т ГТТ» ГГГТТГ^'Т'Г»^» . 11 у гул ν ν 1 пДхм 1О^_ди лааллауу α νζι ρηυυπ^ινΗνυ ага/дсыуага - Др^А пу, ггДгэа /ншлплил дезоксирибонуклеотидами.” <400> 130 дасййсда сссаасааад 20 <210> 131 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзЬепсЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400131 а!а!ссаса§ саааа!ааси 20 <210> 132 <211>21

- 137 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 132 сасааддсса саюддаш с 21 <210> 133 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 133

1§са1ассас йсаасссда § 21 <210> 134 <211> 25 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 цррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19.

- 1З8 007414 <400> 134 §§1§1сас§с 1сд1сдШ§ §1а1§ <210> 135 <211> 25 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 ΙοχνβΓ, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19.

<400> 135

<210> 136 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный 8ЕА-1, сконструированный для амплификации фрагмента генома 81арйу1ососсиз аигеиз. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 136 <210> 137

- 139 007414 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный 8ЕА-1, сконструированный для амплификации фрагмента генома 81арЬу1ососсиз аигеиз. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 137

1аасс§Шс сааа§§1аси § 21 <210> 138 <211>19 гТГЭз ΤΠ4ΊΓ <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-ЕЗ, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 138 §с§1с1а§сс а(§§с£ииа 19 <210 139 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 140 007414 <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-К1, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 139 §са§ассас1 а!§дсиси 18 <210> 140 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МР2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды рНС 19.

<400> 140 £§а1£1§с1£ сааддсдай аадйдддЕа 30 <210> 141 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МК1, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды рНС 19.

<400> 141

- 141 007414

Й1асасй1 а1§сйсс§§ с!с§1а1§й 30 <210> 142 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 142

Йа1са§сса §1асс1сйс § 21 <210> 143 <211> 714 <212>ДНК <213> Т11егто1о§а тагйпиа <400> 143 а!з§§аа(а§ а1§а§сШа саааааа§а§ Ш§§аа1с§ 1а§са§§1§1 §§а1§аа§с§ 60 §§аа§а§§§1 §сс!с§са§§ 1ссс§й§1§ §с§§сс§с!§ 1с§йс1§§а аааа§ааа!а 120 §аа§§аа!аа ас§айсааа аса§с1йсс сс!§с§аа§а §§§ааа§ас( Й1а§а1§аа 180 а1аа(§§а§а а§§са§са§11§§§йа§§а ай§с§1с1с са§а§§ааа! а§а1с!с1ас 240 ааса!айса а!§ссасааа асй§с1а!§ аа!с§а§сас 1§§а§аасс1 §1с1§1§ааа 300 сса!сай!§ 1ас1с§й§а с§§§ааа§§а а!с§а§й§а §с§йссс§§ 1аса1§сНа 360 §Г§аа§§§а§ асса§аааа§ сааай§а!а §§а§са§сй ссай§й§с §аа§§1сйс 420 а§а§а1а§а( 1§а1§а§с§а §й!саса§§ а!§1а!ссас а§1Шссй ссасааасас 480 ааа§§йас§ ссасаааа§а аса!с!§аас §ааа!са§аа а§аас§§а§1 Шассаа1с 540 сасс§§с!§а §1Ш§аасс 1§ййа§аа сйс!§асс§ а!§ай!§й §а§§§а§йс 600

- 142 007414

Ис§ааааа§ §сс!са!с!с с§аааа1с§а Пс§аас§аа !ай§аа!с!1с1§§§§§с§ 660 а§ааааа§1§ 1§§Ш1сс§ §ааа§ааа§а асааасса!а а!с!ссс!с!Ш! 714 <210> 144 <211> 238 <212>Белок <213> ТИегшо!о§а шапЬта <400> 144

Ме!01у Не Акр О1и Ьеи Туг Ьук Ьук С1и РЬе С1у Не Уа1 А1а

1015

О1у Уа1 Акр (Ии А1а С1у Аг§ С1у Сук Ьеи А1а С1у Рго Уа1 Уа1

2530

А1а А1а А1а Уа1 Уа1 Ьеи С1и Ьук О1и Не С1и (Ну Не Акп Акр

4045

Зег Ьук СИп Ьеи Зег Рго А1а Ьук Аг§ С1и Аг§ Ьеи Ьеи Акр (Ли

5560

Не Ме! СИи Ьук А1а А1а Уа1 О1у Ьеи С1у Не А1а Зег Рго О1и

7075

О1и Не Акр Ьеи Туг Акп Не РЬе Акп А1а ТЬг Ьук Ьеи А1а Ме!

8590

Акп Аг§ А1а Ьеи С1и Акп Ьеи Зег Уа1 Ьук Рго Зег РЬе Уа1 Ьеи

100105

Уа1 Акр С1у Ьук СИу Не С1и Ьеи Зег Уа1 Рго С1у ТЬг Сук Ьеи

110 115120

Уа1 Ьук (Лу Акр О1п Ьук Зег Ьук Ьеи Не СИу А1а А1а Зег Не

125 130135

Уа1 А1а Ьук Уа1 РЬе Аг§ Акр Аг§ Ьеи Ме! Зег СИи РЬе Ηϊκ Аг§

140 145150

Ме! Туг Рго СИп РЬе Зег РЬе Ηϊκ Ьук Ηϊκ Ьук (Ну Туг А1а ТЬг

- 143 007414

155 160165

Ьуз С1и ΗΪ8 Ьеи Азп С1и Не Агд Ьуз Азп С1у Уа1 Ьеи Рго Не

170 175180

ΗΪ8 Агд Ьеи 8ег РЬе С1и Рго Уа1 Ьеи 61и Ьеи Ьеи ТЬг Азр Азр

185 190195

Ьеи Ьеи Агд (Ии РЬе РЬе О1и Ьуз О1у Ьеи Не 8ег (Ии Азп Агд

200 205210

РЬе О1и Агд Не Ьеи Азп Ьеи Ьеи (Иу А1а Агд Ьуз Зег Уа1 Уа1

215 220225

РЬе Агд Ьуз (Ии Агд ТЬг Азп Из Азп Ьеи Рго Ьеи РЬе

230235 <210> 145 <211> 663 <212>ДНК <213> Ругососсиз 1юпко811й <400> 145 а1дааддйд с1ддадйда 1даадсдддд адддддссдд 1аайддссс дйад1аай 60 ддад1адссд йа1ада!да дааааа1ай дададдйас д(дасайдд ддйааадас 120

1ссааасаа11аас1сс1дд дсаасд1даа ааас1аШа дсааайаа! ада1а!сс!а 180 дасдайай а1дйсйс! сдйассссс ааддааа!ад а!дададдса 1сайс1а1д 240 аа!даас1ад аадс1дадаа айсдйд1а дссйдаай сШаадда! саадссдсад 300 аада1а!а!д 1ддас1с1дс сда1д!ада! сс!аададд1 йдс!ад1с1 аа!аааддс! 360 дддйдааа! а!даадссас ддйа!сдсс дадса!ааад ссда!дсааа д!а!дада!а 420 дШсддсад са1саа!аа! 1дсааадд1с ас!аддда!а дадада!ада даадс!ааад 480 саааад!а!д дддааШдд Йс1ддс1а1 ссдад1да1с сдадаас!аа ддад!ддсй 540 даадаа!ай асааасаа!а 1дд1дасй1 сс!ссаа!ад йаддадаас йдддааасс 600 дс(аддаада (ададдааад дШадаааа аа!садс!аа сдсйда!аа айссйаад 660

1да 663

- 144 007414 <210> 146 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΡΙιοΝάε для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсиз ЬопкозЫ!.

<400> 146 аддаддаааа 1са1а!§аа§ §йдс1д§ад 30 <210> 147 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер РйоВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсиз Ьопкозйй.

<400> 147

Йаса1§аа§ §а!ссаада1 сасйаадда 30 <210> 148 <211> 663 <212>ДНК <213> Ругососсиз йопкозйй

- 145 007414 <400> 148 ак§аа§як1§ ск§§а§Ь§а к§аа§с§§§§ а§§§§§сс§§ каакк§§ссс §Па§каа1к 60 §§а§ка§сс§ Ьака§ак§а §ааааа!ай §а§ад§ккас §1§асай§§ §§Пааа§ас 120 кссааасаак каасксск§§ §саас§к§аа аааскаШа §сааа11аак а§акаксска 180 §ас§айакк ак^кксЬск с§ккассссс аа§§ааака§ ак§а§а§§са ксаккскак§ 240 аак§ааска§ аа§ск§а§аа аккс§кк§ка §сскк§аакк скккаа§§ак саа§сс§са§ 300 аа§акакак§ к§£аскск§с с§ак§ка§ак сскаа§а§§к кк§ска§кск аакааа§§ск 360 §£§кк§ааак ак§аа§ссас §§ккакс§сс §а§сакааа£ сс^ак§сааа £как§а§ака 420 §какс§§са§ саксаакаакк§сааа§§кс аска§§§ака £а§а§ака§а §аа&скааа§ 480 саааа£как§ §§§ааккк§§ ккск§§скак сс§а§к§акс с§а§ааскаа §§а§к§§скк 540 §аа§аакакк асааасаака к§§к§асккк сскссаака§ кка§§а§аас кк§§§ааасс 600 §ска§§аа§а ка§а§§ааа§ %Ша§аааа аакса§скаа с§скк§акаа аккссккаа§ 660 к§акскк§§а ксс 663 <210> 149 <211>220 <212>Белок <213> Ругососсиз ЬопкозЬп <400> 149

Мек Ьуз Уа1 А1а СИу Уа1 Азр СИи А1а СИу Аг§ СИу Рго Уа1 Пе

1015

СИу Рго Ьеи Уа1 Пе СИу Уа1 А1а Уа1 Пе Азр СИи Ьуз Азп Пе

2530

О1и Аг§ Ьеи Аг§ Азр Пе СИу Уа1 Ьуз Азр 8ег Ьуз СИп Ьеи ТЬг

4045

Рго СИу СИп Аг§ СИи Ьуз Ьеи РЬе 8ег Ьуз Ьеи Пе Азр Пе Ьеи

5560

Азр Азр Туг Туг Уа1 Ьеи Ьеи Уа1 ТЬг Рго Ьуз СИи Пе Азр О1и

7075

- 146 007414

Агд Ηίδ ΗΪ8 Зег Ме1 Азп С1и Ьей 61и А1а Сг1и Ьуз РЬе Уа1 Уа1

8590

А1а Ьей Αδη Зег Ьей Агд Не Ьуз Рго О1п Ьуз Не Туг Уа1 Азр

100105

8ег А1а Азр Уа1 Азр Рго Ьуз Агд РЬе А1а Зег Ьей Не Ьуз А1а

110 115120 (31у Ьей Ьуз Туг С1и А1а ТЬг Уа1 Не А1а С1и ΗΪ8 Ьуз А1а Азр

125 130135

А1а Ьуз Туг С1и Не Уа1 Зег А1а А1а 8ег Не Не А1а Ьуз Уа1

140 145150

ТЬг Агд Азр Агд С1и Не С1и Ьуз Ьей Ьуз О1п Ьуз Туг С1у О1и

155 160165

РЬе О1у 8ег О1у Туг Рго 8ег Азр Рго Агд ТЬг Ьуз С1и Тгр Ьей

170 175180

С1и О1и Туг Туг Ьуз 61п Туг С1у Азр РЬе Рго Рго Не Уа1 Агд

185 190195

Агд ТЬг Тгр С1и ТЬг А1а Агд Ьуз Не С1и Сг1и Агд РЬе Агд Ьуз

200 205210

Азп С1п Ьей ТЬг Ьей Азр Ьуз РЬе Ьей Ьуз

215220 <210> 150 <211>626 <212>ДНК <213> АгсЬаеод1оЬиз Ь11д1Низ <400> 150 а(дааддсад дса1сда!да ддс!ддааад ддс!дсд!са 1сддсссас1 ддйдйдса 60 ддад1ддс« дсадсда1да дда!аддс!д адааадсйд д!д!дааада с1ссааааад 120 с!аад!садд ддаддадада ддаас!адсс даддааа!аа ддаааа!с!д садаасддад 180

- 147 007414 дййдааад Шс1ссс§а ааа!с!сдас §ааадда1§§ с1§с!аааас са!ааас§а§ 240 аййдаадд ад!дс1асдс 1§ааа1аай с!саддс1да адссддааа! 1дсйа1дй 300 §аса§1сс1§ афдаПсс сдададасй Юдадддадс йдаддада! 1ас§§ддП§ 360 а§а§41§4§§ ссдадсасаа ддсддасдад аа§1а1сссс 1§д1а§с1§с §§сйсаа1с 420 аШдсааадд 1ддааа§д§а дсдддадай да§аддс1да аадааааай сддддаШс 480 §дсадсд§с1 а1§сдадс§а Юсдаддаса ада§аа§1дс 1§ааддад1§ §а1а§сНса 540 ддсадаайс сда§с1дс§1 §адаа1дс§с 1§§аадасд§ 1д1сааа1с1 даддсадаад 600 ас§сИ§ас§ аИ1с1ааас дааасс 626 <210> 151 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΑίύΝάε для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из АгсЬаеод1оЬиз ГЫдШиз.

<400> 151 аадс1§д§й 1са1а1§аа§ §сад§са1с§ 30 <210> 152 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер А&Ват для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из АгсйаеодЬЬиз ййфйиз.

- 148 007414 <400> 152

1§§1аа1аас §§а!сс§Д1 а§ааа!с§1с 30 <210> 153 <211>638 <?!?-> ЛТПГ <213> Агскаео§1оЪиз ίτιΐ^ίάιΐδ <400> 153 са!а!§аа§§ са§§са!с§а !§а§§с(§§а аа§§§с!§с§ 1са1с§§ссс ас!§§й§й 60 §са§да£1§§ сй§са§с§а 1§а§§а1а§§ с!§а§ааа§с й§§!§1§аа а§ас!ссааа 120 аа§с1аа§1с а§§§§а§§а§ а§а§§аас!а §сс§а§§ааа 1аа§§аааа1 с!§са§аас§ 180 §а§§йй§а аа§Шс!сс с§аааа!с!с §ас§ааа§§а 1§§с1§с!аа аасса!ааас 240 §а§айй§а а§§а§1§с1а с§с!§ааа!а айс!са§§с 1§аа§сс§§а аай§сйа! 300 §й§аса§1с С1§а1§1§а11ссс§а§а§а сй!с§а§§§ а§сй§а§§а йайасавдй 360 й§а§а^й§ 1§§сс£а£са саа££с§§ас §а§аа§1а(с ссс!§§1а§с !§с§§сйса 420 а!са!с§саа а£§1§§ааа§ §§а§с§§§а§ ай§а§а§§с !§ааа§аааа аНс§§ё§а1 480 йс§§са§с£ §с!а!§с£а§ с§а!сс§а§§ асаа§а§аа§ 1§с!§аа§§а §1§§а1а§с! 540

1са§§са§аа йсс§а§с!§ с§!§а§аа1§ с§с!§§аа§а с§§1£1сааа !с1§а§£са§ 600 аа§ас§сй§ ас§ай1с1а аас§£а1ссс с§§§!асс 638 <210> 154 <211> 205 <212> Белок <213> АгсЬаео§1оЪиз ййдйиз <400> 154

Ме! Ьуз А1а 01 у 11е Азр С1и А1а 61у Ьуз С1у Суз Уа1 Не С1у

10 15

Рго Ьеи Уа1 Уа1 А1а О1у Уа1 А1а Суз 8ег Азр С1и Азр Аг§ Ьеи

- 149 007414

2530

Агд Ьуз Ьеи (Иу Уа1 Ьуз Азр 8ег Ьуз Ьуз Ьеи 8ег С1п (Иу Агд

4045

Агд (Ли (Ли Ьеи А1а С1и С1и Не Агд Ьуз Не Суз Агд ТЬг С1и

5560

Уа1 Ьеи Ьуз Уа18ег Рго (Ии Азп Ьеи Азр О1и Агд Ме1 А1а А1а

7075

Ьуз ТЬг Не Азп СЛи Не Ьеи Ьуз (Ли Суз Туг А1а Ои Не Не

8590

Ьеи Агд Ьеи Ьуз Рго (Ли Не А1а Туг Уа1 Азр 8ег Рго Азр Уа1

100105

Не Рго (Ли Агд Ьеи 8ег Агд (Ли Ьеи (Ли (Ли Не ТЬг (Лу Ьеи

110 115120

Агд Уа1 Уа1 А1а С1и ШзЬуз А1а Азр (Ли Ьуз Туг Рго Ьеи Уа1

125 130135

А1а А1а А1а 8ег Не Не А1а Ьуз Уа1 (Ли Агд (Ли Агд (Ли Не

140 145150

61и Агд Ьеи Ьуз (Ии Ьуз РЬе (Иу Азр РЬе (Иу 8ег О1у Туг А1а

155 160165

8ег Азр Рго Агд ТЬг Агд (Ии Уа1 Ьеи Ьуз 61и Тгр Не А1а 8ег

170 175180 (Иу Агд Не Рго 8ег Суз Уа1 Агд Ме( Агд Тгр Ьуз ТЬг Уа1 8ег

185 190195

Азп Ьеи Агд О1п Ьуз ТЬг Ьеи Азр Азр РЬе

200205 <210> 155 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 150 007414 <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤΙ82Γ, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епшп 1иЬегси1о818. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 155

1с1с§1сса§ сдссдсии 18 <210> 156 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΊΊ82Κ, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о818. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 156 дасаааддсс ас§1ад§с§а а 21 <210> 157 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2Р, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды СЫатусНа 1гасЬотайз. “Нуклеотиды

- 151 007414

18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 157 с!§§аШа1 сддааассии 20 <210> 158 <211>18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2К, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК критической плазмиды СЫатусНа йгасЬотайз. “Нуклеотиды

16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 158 ад§сс!с!§а аасдасии 18 <210> 159 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Р-1033(60), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о518. “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

- 152 007414 <400> 159 саса!сда1с сддйсадс 19 <210> 160 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133(62), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о818. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 160

1§а1сд1с1с ддс!ад!дса 20 <210> 161 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о818. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 161 §1асаса1сд а!ссддйса дс 22 <210> 162

- 153 007414 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас(епит 1иЬегси1о818. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 162 §й§а1с§1с 1с§дс1а§1§ са 22 <210> 163 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный Р26, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епшп ШЪегси1оз18.

<400> 163 сс§§а§ас!с садйсйдд 20 <210> 164 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 154 007414 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный К.1310, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит 1иЬегси1о81з.

<400> 164 §1с1с1§§с£ «§а§с§1а§ 20 <210> 165 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ρΟΟΝ-ΑΙ-68-Ι, сконструированный для амплификации фрагмента ρϋΟΝ-ΑΙ. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 165 ас!а§с1с!§ 1а1с1§§с§§ ас 22 <210> 166 <211>23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ρϋΟΝ-ΑΙ-68-2, сконструированный для амплификации фрагмента ρϋΟΝ-ΑΙ. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 166

- 155 007414 асда!сддда йШддас! сад 23 <210> 167 <211> 300 <212>ДНК <213> Протоонкоген \Уп1-5а из Ното зар1епз <400> 167 сас!адай1 ШдШддд даддйддс! 1дааса1ааа 1дааа1а1сс 1д1аййс1 60

1аддда1ас11ддйад1аа айа!аа!ад 1адааа1аа1 аса!даа!сс сайсасадд 120 йййсадсс саадсаасаа дд!аайдсд 1дссайсад сас!дсасса дадсадасаа 180 сс!ай1дад дааааасад! дааа!ссасс йсс1сйса сас!дадссс 1с1с1дайс 240 с!ссд!дйд 1да1д1да1д с!ддссасд! йссааасдд садсйхас! дд§1ссссй 300 <210> 168 <211> 300 <212>ДНК <213> Рибосомальный белок 85 из Ното зарЬепз <400> 168 сдссдад!да сададасдс! саддс1д!д! 1с1садда1д ассдад!ддд адасадсадс 60 ассадсдд!д дсададассс садаса!саа дс1сй!ддд аад!ддадса ссда1да!д! 120 дсада!саа! дасаШссс 1дсаддайа сайдсад1д ааддадаад! а!дссаад!а 180 сс1ссс!сас ад!дсадддс дд!а!дссдс ааасдсШс сдсааадс!с ад!д!ссса1 240

1§1ддадсдс с1сас1аас! сса!да!да! дсасддссдс аасаасддса адаадс!са! 300 <210> 169 <211> 300 <212>ДНК <213> Диафораза из Ното зарЬепз

- 156 007414 <400> 169

1с1а1асааа ййсадаад дйаййс! йа!сайдс 1ааас1да1д асйасса!д 60 дда!дддд1с сад!ссса!д ассйдддд! асаайд!аа асс1ададй йа!саасй 120 (ддСдаасад ййддса!а а!ад!саай 1с1асйс1д даад1са1с! сайссас!д 180 йдд(айа1 а1аайсаад дадаа1а1да 1аааасас1д ссс!сйд1д д!дсайдаа 240 аеааеаеа1е аеааа1еа1£ ааааеейес с1еааааа!е ееаеасаесс 1сйасйес 300 <210> 170 <211> 300 <212>ДНК <213> Протокадгерин человека <400> 170 ад!с!сйдд да1сссс1аа ссададссй Й1дсса1ад ддс!дсасас 1дд1сааа1с 60 ад1ас(дссс д1ссад!сса адасасада! (сасссаддс адасййсас дд!сйда1с 120 ааадасаа!д дддадссйс дсййссасс ас1дс1ассс 1сас1д1д1с ад!аассдад 180 дас1с1сс1д аадсссдадс сдадйсссс 1с1ддс1с1д ссссссддда дсадаааааа 240 аа1с!сасс11йа1с1ас11сШссс1а айхйддй! с!д!ддддй 1д1дд1саса 300 <210> 171 <211> 80 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид, сконструированный для получения р1С62.

<400> 171 са1д!аса1с асад1ад!сд йсасаддд! Шссддсса 1аа1ддссй 1сс1д1д1д1 60

- 157 007414 §1§с1асадс 1а§!са§1са 80 <210> 172 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΙΟΑΝ2.

“Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 172 ас1§ас!а§с 1§1а§сасас 20 <210> 173 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный 1САМ6.

“Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами. ” ζ-ΊΠΑχ 1 ΊΊ ''ТУМ'' аса!саса§1 а§1сдйсас 20 <210> 174 <211> 20

- 158 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер Ι0ΑΝ2, <400 174 ас!§ас1а§с 1§1а§сасас 20 <210> 175 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер Ι0ΑΝ6.

<400> 175 аса1сасад! а§1сдйсас 20 <210> 176 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок 818 мыши.

<400> 176

- 159 007414 §1с1с1а§1§ а!ссс!§а§а а§1 <210> 177 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 177

<210> 178 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕК) мыши.

<400> 178 сс§с§с!сс§ асаа§!а§а! §§а <210> 179 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 160 007414 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕК.) мыши.

<400> 179 ссааадад1д саадд1с1дс с!с 23 <210> 180 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (8с1Г4).

<400> 180 дсаасс§с!а дас 23 <210> 181 <211>23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (8ά£4).

<400> 181

- 161 007414 даас!сйса 1дсасдйдс ддд 23 <210> 182 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический бета-актин мыши.

<400>182

1да1дд1§дд аа!ддд!сад аад 23 <210 183 <211>23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический бета-актин мыши.

<400 183 адаадсасй дсдд1дсасд а1д 23 <210> 184 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность

- 162 007414 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.

о л ют §а1§ааа§1с §сса§а§сас а!с <210> 185 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мьптти.

<400> 185

Д§а1сс1а§ садаадсаса §§с <210> 186 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 186

- 163 007414 §§аса§§ас1 §ааа§асй§ с1с 23 <210> 187 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазу (НБелок) мыши.

<400> 187 §1с1§§сс1§ 1а1ссаасас йс 23 <210> 188 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 188 а!§а§с1§§1 §са§аа§§сс аа§ 23 <210> 189 <211> 23

- 164 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей тирозин-3-монооксигеназу мыши.

<400> 189

Йсссс1сс11с1сс1дсй с1д 23 <210> 190 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МС8-Р.

<400> 190 ссайсаддс 1дсдсаа1д11 21 <210> 191 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МС8-К..

<400> 191

- 165 007414

1§§сас§аса §§1йссс§а с1 22 <210> 192 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΡ2Ν3(24).

“Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 192 §с!§саа§§с §айаа§й§ §§иа 24 <210> 193 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΚ1Ν3(24).

“Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами. ” <400> 193 сШа1§сй сс§§сЮ§1а 1§ци 24 <210> 194 <211> 16

- 166 007414 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤΙ82Ε-16, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬаЫепиш 1иЪегси1о81з. “Нуклеотиды 14-16 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 194

1с§1сса§с§ ссдсии 16 <210> 195 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МТ182В.-АСС, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епиш 1иЬегси1о818. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 195 саааддссас §1ад§сдаас 20 <210> 196 <211 >20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 167 007414 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный МТ18-РСК-Р-2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас!епшп 1иЬегси1о81з.

<400> 196 сдассдса!с аассдддадс 20 <210> 197 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МТ18-РСК-К-2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬасГепит 1иЬегси1о81з.

<400> 197 сссадда!сс 1дсдадсд1а 20 <210> 198 <211> 45 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

ГАтгТЛ-'Г'ГЧЧХГТГΤΤ^/ΥΓΤΧΤΓΕΤτ-ΤΤ* иоэтэаттгггтт» Т? гтт,„

ч.-'ллгхх ν/χχхклкху/ххх/дххиххх ххрьихшч^/, ххм-ихлсхххххиххх к_»х. ν-χχν- у ^_А _? νΐ\.ΜΠν П^КДОЛМИЫМ ДЛИ амплификации фрагмента генома НСУ, <400> 198 ссаШадд! дасас!а!ад аа1ас!да!д ддддсдасас 1ссас 45

- 168 007414 <210> 199 <211> 45 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный 8Р6-НСУ-К, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.

<400 199 адс!с1аа!а сдас!сас!а !аддд!сдса адсассс!а! саддс 45 <210>200 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А 8, сконструированный для спкгттття/Ктххгаттт^тл грппмй ^ςζΐ-Γ\τνтт^гх’ттгттч 1 Й-ОЛ «готтсгхгч'т'г'ст гчл^лтпп/тталтлтттги/тт хитххх^ххххрххх\.хиДхххх ψ|^*ιΐ’ΐνχχιν* х ν/χχνζχνχν*. χχχ_χ ▼ · χ х^ χχνχχ^ζ ххх^хлх χυ ζιχυιτηνινΛ /х/π^ ι\ а ιχ^χ > ι κιι ιηινι η — другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 200 ддд!ссШс йдда!саас 20 <210> 201 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А А, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами

- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 201 дасссаасас !ас!сддсиа 20

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Зонд, гибридизующийся с фрагментом, амплифицированным с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, выбранного из следующей группы:

(a) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции энтерогеморрагической ЕксйепсЫа со11, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 и 131;

(b) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вироида, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 59, 60, 119, 120, 122 и 123;

(c) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции С1ок1п6шт ЬоЫБпит, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 116 или 117;

(ά) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса папилломы, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 96 или 97;

(е) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса гепатита С, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 101, 102, 138, 139, 200 и 201;

(ί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции З1арйу1ососсик аигеик, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 136 или 137;

(д) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции МусоЬайегшт 1иЬегси1ок1к, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 155, 156, 159-162, 194 и 195;

(й) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции СЫатуШа, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 157 или 158.
2. Зонд по п.1, выбранный из группы, состоящей из:

(a) зонда для детекции энтерогеморрагической ЕксйепсЫа со11, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 73 или 115;

(b) зонда для детекции вироида, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную З1Б) ΙΌ Νο 121;

(c) зонда для детекции С1ок1п6шт ЬоЫБпит, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 118;

(ά) зонда для детекции вируса папилломы, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 98;

(е) зонда для детекции вируса гепатита С, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 103.
3. Зонд по любому из пп.1 или 2, меченный веществом-меткой.
4. Зонд по п.1 или 2, представляющий собой РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, пространственно разнесенных, что приводит к состоянию тушения.
5. Набор для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, содержащий:

(a) химерный олигонуклеотидный праймер, выбранный из следующей группы:

(ί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции энтерогеморрагической ЕксйепсЫа со11, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 и 131;

(ίί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вироида, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 59, 60, 119, 120, 122 и 123;

(ΐϊϊ) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции С1ок1п6шт ЬоЫБпит, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 116 или 117;

(ίν) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса папилломы, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 96 или 97;

(ν) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса гепатита С, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 101, 102, 138, 139, 200 и 201;

(νί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции З1арйу1ососсик аигеик, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 136 или 137;

(νίί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции МусоЬайегшт 1иЬегси1ок1к, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ Νο 155, 156, 159-162, 194 и 195;

(νίίί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции Сй1ату61а, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕф ΙΌ Νο 157 или 158;

(b) зонд по п.1 или 2;

(c) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, для осуществления реакции переключения матрицы; и (ά) РНКазу Н.
6. Композиция для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, содержащая:

(а) химерный олигонуклеотидный праймер, выбранный из следующей группы:

- 170 007414 (ΐ) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции энтерогеморрагической ЕксйепсЫа οοΐί, имеющий нуклеотиднуюпоследовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕО ΙΌ Νο 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 и 131;

(ίί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вироида, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕО ΙΌ Νο 59, 60, 119, 120, 122 и 123;

(ш) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции ΟοδΙπάίιιιη Ьо1и1шит, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную БЕО ΙΌ Νο 116 или 117;

(ίν) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса папилломы, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную БЕО ΙΌ Νο 96 или 97;

(ν) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса гепатита С, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕО ΙΌ Νο 101, 102, 138, 139, 200 и 201;

(νί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции Бίаρйу1οсοсси8 аитеик, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную БЕО ΙΌ Νο 136 или 137;

(νίί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции ΜусοЬасΐе^^ит ШЬетсиЕак, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕО ΙΌ Νο 155, 156, 159-162, 194 и 195;

(νίίί) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции СЫатуФа, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную БЕО ΙΌ Νο 157 или 158;

(b) зонд по п.1 или 2;

(c) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, для осуществления реакции переключения матрицы; и (ά) РНКазу Н.
7. Способ получения материала с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, включающий:

(a) амплификацию иммобилизуемой нуклеиновой кислотой способом амплификации нуклеиновой кислоты, включающим:

(ί) получение реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи для осуществления реакции переключения матрицы, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера; и (ίί) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, так что происходит переключение матрицы;

(b) нанесение в виде упорядоченного массива и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (а), в предварительно заданном месте.
8. Способ определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающий амплификацию нуклеиновой кислоты способом, включающим:

(ί) получение реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера; и (ίί) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции; и (ш) секвенирование продукта реакции, полученного на стадии (ίί).