CN108913736B

CN108913736B - 单链寡核苷酸的制备方法

Info

Publication number: CN108913736B
Application number: CN201810748988.8A
Authority: CN
Inventors: 梁兴国; 曹娟娟; 安然
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-07-10
Also published as: CN108913736A

Abstract

本发明涉及一种单链寡核苷酸的制备方法，首先进行PEAR反应，模板为N’‑X’‑R’‑N’‑X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’‑X’‑R’‑N’‑X’/N‑X‑R‑N‑X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到片段(N‑X/N’‑X’)；没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，目的产物持续指数增长。然后进行切口引物延伸反应，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N‑X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

Description

单链寡核苷酸的制备方法

技术领域

本发明属于寡核苷酸的合成技术领域，具体涉及一种单链寡核苷酸的制备方法。

背景技术

单链寡核苷酸通常是指一条单链DNA、RNA或其他修饰核酸，其长度一般为20～60nt。根据碱基互补配对原则，寡核苷酸能够与靶序列特异性的形成互补双链结构，体现出重要的生理功能，并且在食品安全检测、临床诊断以及药物治疗等领域也具有广泛的应用。随着寡核苷酸需求量的日益增加，一些领域对寡核苷酸的纯度要求很高。

目前，寡核苷酸的制备方式主要有两种，一种是化学合成，另一种是酶法制备。化学合成方法是利用DNA合成仪进行固相合成，合成规模难以扩大，合成量有限；固相合成制备的产物纯化较为困难；设备及原料成本偏高；使用大量的有机试剂，产生有机废料。酶法制备是以核酸聚合酶及dNTPs(或NTPs，修饰dNTPs等)为原料，通过各种酶促反应来获得寡核苷酸。与化学合成相比，酶法制备具有不使用有毒试剂、合成效率高、保真性好等优点，具有良好的发展前景。

目前最有效的酶法合成方法为聚合酶内切酶扩增技术(polymerase endo-nuclease amplification reaction，PEAR)，是以一段带有2个串联重复的寡核苷酸(用X’R’X’表示)序列作为模板，中间的R’为限制性内切酶的识别位点序列，并根据寡核苷酸的序列组成设计相应的反义探针(X)，通过变性、退火、延伸以及切割等几个步骤，完成对寡核苷酸的制备。如图1所示，PEAR技术的基本原理为：首先高温变性，使模板与其反义探针处于单链的状态，在退火的温度条件下，模板与反义探针结合，当探针结合到模板的3’端时，探针在聚合酶的作用下进行延伸，延伸产物为双链DNA；由于产物中带有限制性内切酶的识别位点，延伸得到的双链被内切酶酶切，得到较短的片段(X/X’)。在下一轮变性退火过程中，酶切的小片段也可以作为引物进行延伸反应；同时由于酶切不完全，没有被酶切双链产物会作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长，即图1中右边的循环过程。

PEAR作为一种新型的合成寡核苷酸的方法，能够快速、准确、简单的扩增寡核苷酸，但由于PEAR反应为制备寡核苷酸双链的技术，难以制备具有生物学活性的寡核苷酸单链，使其应用得到限制；此外，由于PEAR扩增产物不可避免地带有限制性内切酶的酶切位点，如图2所示，使制备的寡核苷酸序列受到极大的限制。因此，开发一种新型的基于PEAR技术的寡核苷酸单链制备技术尤为重要。

发明内容

针对现有的PEAR反应产物为双链寡核苷酸，且制备的产物带有酶切位点，后续反应去除比较繁琐的问题，本发明旨在提供一种单链寡核苷酸的制备方法，该方法利用产生3’突出末端的限制性内切酶(如TspRI)得到的产物进行PEAR扩增得到特异性的扩增产物；利用切刻内切酶(如Nt.BstNBI)对PEAR的扩增产物进行切刻，聚合酶以缺口为起点进行延伸，同时通过置换下游的寡核苷酸链，得到游离的单链。该方法能够制得大量的特异性的单链寡核苷酸。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计模板N’-X’-R’-N’-X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；

(2)PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到较短的片段(N’-X’/N-X)，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；

(3)切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

所述能产生3’粘性末端的耐高温限制性内切酶包括但不限于BsiHKAI，BsLI，KpnI，KpnI-HF，PstI-HF，TspRI，优选TspRI。

所述切刻内切酶包括但不限于Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI，Nb.BtsI，优选Nt.BstNBI。

所述步骤(2)的PEAR延伸反应，模板的浓度为10nM-1uM，优选100nM；所述聚合酶为适用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，包括但不限于Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶，优选Vent(exo-)DNA聚合酶；聚合酶浓度为0.02-0.06U/μL，优选0.04U/μL；循环数为10-30个，其中优选30个循环；每个循环反应时间为3-10min，其中优选5min。

所述步骤(2)的限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶的浓度为0.025-0.2U/μL，优选浓度为0.04U/μL。

所述步骤(3)切刻内切酶酶切反应，切刻内切酶包括但不限于Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI，Nb.BtsI，优选Nt.BstNBI；酶浓度为0.08-0.8U/μL，优选0.8U/μL；反应时间为1-30min，优选5min；温度为45-60℃，优选55℃。

所述步骤(3)切口延伸反应，聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，包括但不限于Bst 2.0DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶，优选Bst 2.0DNA聚合酶；酶浓度为0.08-0.8U/μL，优选0.32U/μL。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用能产生3’突出末端的限制性内切酶进行PEAR扩增，PEAR扩增产物带有3’端突出的粘性末端，避免高温中与聚合酶的进一步反应，产生非特异性的扩增产物；

(2)PEAR的扩增产物经完全酶切后可直接用于切口引物延伸反应，酶切产物中带有切刻内切酶的识别位点，切刻内切酶识别产物中的酶切位点产生缺口，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，同时通过置换下游的DNA链，得到游离的单链；这一聚合延伸反应使切刻内切酶的识别位点重新形成，使酶切-延伸的过程反复进行，从而可以直接产生大量的目的单链；无需外切酶酶切、连接酶连接等步骤，简化了反应过程。

(3)本发明实现了简单条件下的快速大量扩增，反应时间短，5分钟即可获得大量的目的产物；通过酶切的方法验证产物具有特异性。

(4)本发明通过改变目的产物的序列，成功制备了多种长度、不同碱基的目的反义寡核苷酸，说明本方法具有通用性，可广泛用于合成反义寡核苷酸。

附图说明

图1为PEAR反应的原理图。

图2为PEAR酶切产物结构示意图；图中1为目的单链产物；2和3为酶切位点。

图3为本发明实施例1PEAR及切口引物延伸反应原理图。

图4为本发明实施例1TspRI酶切产物结构示意图；图中4为切刻酶识别位点，5和6为TspRI位点。

图5为实施例2 PEAR扩增产物及酶切产物电泳图；图5-A L：LR Ladder；图5-B和图5-C L：ULR Ladder；图A Lane 1～3分别为L-1、L-2在不同时间下的延伸产物作为模板进行PEAR扩增反应的产物，图5-B、5-C Lane 1～3分别为不同的延伸产物的PEAR扩增产物对应的TspRI酶切产物(图B10％PAGE、EB染色；图5-C 10％变性PAGE、SYBR Green II染色)，反应条件为65℃、过夜。图5-C Lane 4为长度在47nt的一段单链。

图6为实施例3切口引物延伸反应在不同聚合酶和内切酶浓度时扩增产物；图6-AL：DNA Ladder-ULR；Lane 1：21nt目的ssDNA；Lane 2～6为当切刻内切酶的量为0.8U/μL，聚合酶浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0U/μL时的扩增产物；图6-B L：DNA Ladder-ULR；Lane1：21nt目的ssDNA；Lane 2～6为当聚合酶的量为0.6U/μL，聚合酶浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8U/μL时的扩增产物。

图7为实施例4不同反应时间的切口引物延伸反应产物；L：DNA Ladder-ULR，Lane2～8为反应时间分别为1、3、5、10、15、20、30min的扩增产物，Lane 1：21nt目的ssDNA。

图8为实施例5切口引物延伸反应产物验证图；L：DNA Ladder-ULR，Lane 1：21nt目的ssDNA的互补单链，Lane 2：21nt目的ssDNA的互补单链与扩增产物的混合，Lane 3：扩增产物。

图9为实施例6PEAR扩增产物及酶切产物电泳图；图9-A Lane 1～5分别为A-30、25、23、20、15作为模板进行PEAR扩增的产物，L为DNA Ladder-ULR；图9-B Lane 1～5分别为A-30、25、23、20、15的扩增产物对应的TspRI酶切产物，L为DNA Ladder-ULR。

图10为实施例7切口引物延伸反应；L：DNA Ladder-ULR，图10-A Lane 1～5分别为模板A-30、25、23、20、15的切口引物延伸反应的产物；图10-B：DNA Ladder-ULR，Lane 1、4、7分别为10μM 25nt、23nt、20nt的与目的产物互补的单链DNA，Lane 2、5、8分别为A-25、23、20的反应产物与其互补单链的混合产物，Lane 3、6、9分别为10μM 25nt、23nt、20nt的目的单链与其互补单链的混合产物；图10-C Lane 1、4分别为10μM 30nt、15nt的与目的产物互补的单链DNA，Lane 2、5分别为A-30、15的反应产物与其互补单链的混合产物，Lane 3、6分别为10μM 30nt、15nt的目的单链与其互补单链的混合产物。

图11为实施例7 PEAR扩增产物及酶切产物电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

本实施例提供一种单链寡核苷酸的制备方法，该方法的原理如图3所示。

1)PEAR反应

首先进行PEAR反应，该反应混合物包括以下材料：

①目的单链X：TGGCTTGAAGATGTACTCGAT；

②模板N’-X’-R’-N’-X’，R’为能产生3’突出末端的限制性内切酶TspRI的识别位点，N’为切刻内切酶Nt.BstNBI的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；

③Bst 2.0DNA聚合酶；

④限制性内切酶TspRI；

⑤dNTPs mix：dATP、dGTP、dCTP和dTTP；

⑥适当的缓冲溶液；

上述混合物在60-80℃预变性0-600s后，再进行热循环处理，热循环包括如下四个步骤：

①变性：温度为90-95℃，持续5-60s；

②退火：温度范围45-65℃，持续30-60s；

③延伸：保温于目标核酸分子T_m值5℃以上的温度，且在DNA聚合酶的最适温度，温度范围45-75℃，持续反应3-5min；

④酶切：与延伸过程同时进行，温度范围45-75℃，持续反应3-5min；

步骤②的温度低于步骤①、③和④的温度至少10℃。经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用限制性内切酶TspRI对双链进行切割，得到较短的片段(N-X/N’-X’)，该片段单链带有3′端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长。

2)酶切

扩增产物利用TspRI在65℃酶切4-8h，得到短的片段(N-X/N’-X’)

3)切口引物延伸反应

切口引物延伸反应反应体系如下：

反应条件：55℃下温育10min。

切刻内切酶Nt.BstNBI对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

表1实施例1中使用的序列

注：“波浪线”为TspRI酶切位点，“双下划线”为切刻内切酶Nt.BstNBI酶切位点，“下划线”为目的产物(下同)。

实施例2 PEAR扩增及特异性验证

将不同延伸时间的延伸产物稀释10倍后作为模板进行PEAR反应，为了验证扩增产物的特异性，利用能产生3’突出末端的内切酶TspRI对扩增产物进行酶切，结果如图5。

由图5-A可知，在延伸产物稀释10倍(即10nM)的浓度条件下，PEAR扩增产物集中于胶孔，分析原因是由于扩增过程中延伸作用远超过酶切作用，因此产物链较长。

PEAR的扩增产物经TspRI酶切后，根据序列分析，完全酶切产物的长度应为9nt+39bp+9nt，39bp为酶切产物双链长度，9nt为酶切产物3’端的9个碱基长的粘性末端，因此在电泳中的位置应在57bp(9bp+39bp+9bp)左右，与图5-B中的电泳结果相符。在完全酶切产物的上方的产物应为未完全酶切产物，长度应为9nt+87bp+9nt，稍许的位置差异是由于粘性末端导致的。由图5-C可知，其主要产物集中于48nt左右，根据序列分析，TspRI酶切产物在变性胶中应为48nt，电泳结果与理论分析相符，在主要产物上方的长片段是为PEAR产物未完全酶切产物，因此通过酶切证明了PEAR产物的特异性。

实施例3切刻内切酶与聚合酶比例的探究

将PRAR反应的酶切产物纯化作为切口引物延伸反应的模板，目的产物即目的反义寡核苷酸的长度为21nt。首先探究聚合酶浓度对反应的影响，将切刻内切酶的浓度定为0.8U/μL，聚合酶浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0U/μL，在55℃的反应条件下反应20min，取4μL的酶切产物进行10％的PAGE电泳，结果如图6所示。

由图6-A可知，随着聚合酶浓度增加，扩增效率增加、产物逐渐增多，在聚合酶浓度较高(0.6、0.8、1.0U/μL)时，可以得到目的产物，但是有许多非特异性扩增产物生成。因此选择聚合酶的浓度为0.4U/μL，可实现目的产物的扩增，且副产物较少。

之后，探究切刻内切酶的浓度对反应的影响。将聚合酶的浓度定为0.6U/μL，切刻内切酶浓度分别为0.1、02、0.4、0.6、0.8U/μL，在55℃的反应条件下反应20min，取4μL的酶切产物进行10％的PAGE电泳，结果如图6-B所示。

由图6-B可知，随着切刻内切酶浓度增加，副产物逐渐减少，在切刻内切酶浓度为0.8U/μL时，可以得到较纯的目的产物，与图6-A的结果对比可以看出，由于2次实验内切酶与聚合酶的加入顺序不一样，导致结果有差别，因此在后续实验中应注意切刻内切酶与聚合酶的加样顺序，应先加入切刻内切酶，再加入聚合酶。因此，综合两次实验结果，将聚合酶和切刻内切酶的浓度定为0.4U/μL、0.8U/μL。

实施例4切口引物延伸反应时间的选择

在已探究得到的聚合酶和内切酶的浓度的基础上进行反应时间的探究，在55℃的温度条件下反应不同时间。取4μL的酶切产物进行10％的PAGE电泳，结果如图7所示。

由图7可知，扩增1min即可得到目的单链，根据电泳图定量检测，扩增5min即可实现10³倍的扩增，且产物纯度高，副产物较少，扩增15min后产物将不再增加，且有副产物逐渐增多，因此选择切口引物延伸反应的最佳反应时间为10min，可实现反义寡核苷酸短时间的大量扩增。

实施例5反应产物验证

在切口引物延伸反应的产物中加入与目的产物互补的单链DNA，取4μL的混合产物进行10％的PAGE电泳，结果如图8所示。

由图8 Lane 2可以看出得到了21bp双链产物，证明扩增产物为目的产物，说明切口引物延伸反应具有特异性，可用于制备反义寡核苷酸。

表2实施例5中使用的序列

实施例6 PEAR-切口引物延伸反应的通用性

为了增加PEAR-切口引物延伸反应的通用性，设计含有不同目的产物的序列，通过改变目的单链的序列实现对不同单链的扩增。

(一)PEAR扩增

在已探究的PEAR反应条件的基础上，选用序列A-30、25、23、20、15为模板进行PEAR反应，利用TspRI酶切验证反应产物的特异性，分别取2μL的扩增产物和6μL的酶切产物进行10％PAGE电泳，结果如图9。

由图9-A可知，5种模板均可进行PEAR扩增。由图9-B可知，Lane 1显示，在60bp左右处，有大量产物生成，由序列分析可知，经能产生3’突出末端的限制性内切酶TspRI酶切，序列A-30的完全酶切产物长度应为9nt+48bp+9nt，序列分析结果与电泳结果相符，判定该产物为目的产物，同样对于Lane 2～5，根据序列分析，序列A-25、23、20、15完全酶切后的长度分别为9nt+43bp+9nt、9nt+41bp+9nt、9nt+38bp+9nt、9nt+33bp+9nt，序列分析结果与电泳结果相符，说明序列A-30、25、23、20、15的扩增均为特异性扩增。在图中有大于100bp的产物，该产物为PEAR产物未完全酶切产物。

(二)切口引物延伸反应

在上述已探究的的反应条件下，将序列A-30、25、23、20、15的TspRI酶切产物利用蛋白酶K纯化后用于切口引物延伸反应，模板A-30、25、23、20、15的单链产物长度分别为30nt、25nt、23nt、20nt、15nt，取4μL的酶切产物进行10％的PAGE电泳，结果如图10所示。

由图10可知，在同样的反应条件下，5种模板均可以获得目的产物，且扩增效率高、副产物较少。之后在扩增产物加入目的产物的互补单链，根据产物能否与其互补证明扩增产物是否为目的产物，反应结果如图10-B、10-C所示。图10-B Lane 3、6、9以及4C Lane 3、6为目的单链与其互补单链DNA的混合物，长度分别为25bp、23bp、20bp、30bp、15bp，图10-BLane 2、5、8以及图10-C Lane 2、5分别为加入互补单链的扩增产物，与图10-B Lane 3、6、9以及10-C Lane 3、6对比可以看出长度相同，证明扩增产物为目的产物，说明切口引物延伸反应具有较高的特异性需求。因此本实验证明PEAR-切口引物延伸反应具有通用性，可以通过改变目的产物的序列扩增不同长度、不同类型的单链DNA。

表3实施例6中使用的序列

实施例7

为了研究其他的限制性内切酶和切刻内切酶对于本方法的适用性，本实施应用其他酶进行了单链寡核苷酸的制备。

1)PEAR反应

首先进行PEAR反应，该反应混合物包括以下材料：

①目的单链X：AGGCTCGAAGATGTACTCGA；

②模板N’-X’-R’-N’-X’，R’为能产生3’突出末端的限制性内切酶BsiHKAI的识别位点，N’为切刻内切酶Nb.BvCI的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；

③Bst 2.0DNA聚合酶；

④限制性内切酶BsiHKAI；

⑤dNTPs mix：dATP、dGTP、dCTP和dTTP；

⑥适当的缓冲溶液；

①变性：温度为90-95℃，持续5-60s；

②退火：温度范围45-65℃，持续30-60s；

步骤②的温度低于步骤①、③和④的温度至少10℃。经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用限制性内切酶BsiHKAI对双链进行切割，得到较短的片段(N-X/N’-X’)，该片段单链带有3′端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长。

2)酶切

扩增产物利用BsiHKAI在65℃酶切4-8h，得到短的片段(N-X/N’-X’)

3)切口引物延伸反应

切口引物延伸反应反应体系如下：

反应条件：55℃下温育10min。

切刻内切酶Nb.BvCI对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

表4实施例7中使用的序列

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 单链寡核苷酸的制备方法

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgcacatg agtccagatg gcttgaagat gtactcgatc acagtgacct cgcacatgag 60

tccagatggc ttgaagatgt actcgat 87

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgagtaca tcttcaagcc atctggactc atgtgcgagg tcactgtgat cgagtacatc 60

ttcaagccat ctggactcat gtgcgag 87

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgagtaca tcttcaagcc a 21

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcacatg agtccagact ccaacatcaa ggaagatggc atttctagca cagtgacctc 60

gcacatgagt ccagactcca acatcaagga agatggcatt tctag 105

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagaaatgc catcttcctt gatgttggag tctggactca tgtgcgaggt cactgtgcta 60

gaaatgccat cttccttgat gttggagtct ggactcatgt gcgag 105

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagaaatgc catcttcctt gatgttggag 30

<210> 7

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcgcacatg agtccagatc cagggaccac ttggcatggt ggacacagtg acctcgcaca 60

tgagtccaga tccagggacc acttggcatg gtgga 95

<210> 8

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccaccatgc caagtggtcc ctggatctgg actcatgtgc gaggtcactg tgtccaccat 60

gccaagtggt ccctggatct ggactcatgt gcgag 95

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccaccatgc caagtggtcc ctgga 25

<210> 10

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcgcacatg agtccagagt caacatcagt ctgataagct acacagtgac ctcgcacatg 60

agtccagagt caacatcagt ctgataagct a 91

<210> 11

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tagcttatca gactgatgtt gactctggac tcatgtgcga ggtcactgtg tagcttatca 60

gactgatgtt gactctggac tcatgtgcga g 91

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagcttatca gactgatgtt gac 23

<210> 13

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcgcacatg agtccagaat cttcctgcag tccatagcca cagtgacctc gcacatgagt 60

ccagaatctt cctgcagtcc atagc 85

<210> 14

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctatggact gcaggaagat tctggactca tgtgcgaggt cactgtggct atggactgca 60

ggaagattct ggactcatgt gcgag 85

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctatggact gcaggaagat 20

<210> 16

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgcacatg agtccagata cggggagttg caacacagtg acctcgcaca tgagtccaga 60

tacggggagt tgcaa 75

<210> 17

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttgcaactcc ccgtatctgg actcatgtgc gaggtcactg tgttgcaact ccccgtatct 60

ggactcatgt gcgag 75

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgcaactcc ccgta 15

<210> 19

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctcgcacatg ctcttcaagg ctcgaagatg tactcgagag ctcctcgcac atgctcttca 60

aggctcgaag atgtactcga 80

<210> 20

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcgagtacat cttcgagcct tgaagagcat gtgcgaggag ctctcgagta catcttcgag 60

ccttgaagag catgtgcgag 80

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgagtacat cttcgagcct 20

Claims

1.一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计模板3’-N’-X’-R’-N’-X’-5’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；

（2）PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶对双链进行切割，得到PEAR酶切产物N’-X’/N-X，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；

（3）切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后具有链置换活性的DNA聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成，使酶切-延伸的过程反复进行；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链X。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中能产生3’粘性末端的耐高温限制性内切酶为BsiHKAI，BsLI，KpnI，KpnI-HF，PstI-HF或者TspRI。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中切刻内切酶为Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI或者Nb.BtsI。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的PEAR延伸反应，模板的浓度为10 nM-1 μM，聚合酶为适用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，其浓度为0.02-0.06 U/μL，循环数为10-30个，每个循环反应时间为3-10 min。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的PEAR延伸反应，聚合酶为用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，选自Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent（exo-）DNA聚合酶或者Deep Vent（exo-）DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶的浓度为0.025-0.2 U/μL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的PEAR延伸反应，模板的浓度100 nM，聚合酶采用Vent（exo-）DNA聚合酶，其浓度为0.04 U/μL，循环数为30个，每个循环反应时间为5min；限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶为TspRI，其浓度为0.04 U/μL。

8.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）切刻内切酶酶切反应，切刻内切酶的浓度为0.08-0.8 U/μL；反应时间为1-30min，温度为45-60℃。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）切口延伸反应，聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，选自Bst 2.0 DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶或者phi29 DNA聚合酶，其浓度为0.08-0.8 U/μL。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）切刻内切酶为Nt.BstNBI，其浓度为0.8 U/μL；反应时间为5min；温度为55℃；聚合酶为Bst 2.0 DNA聚合酶，其浓度为0.32 U/μL。