JPS63500006A - エキソヌクレア−ゼ阻害による核酸の塩基配列決定法 - Google Patents
エキソヌクレア−ゼ阻害による核酸の塩基配列決定法Info
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- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
エキンヌクレアーゼ阻害による核酸の
塩基配列決定法
RNAおよびDNAの現在の塩基配列決定法はすべて同一の基本的方法:すなわ
ち共通の予め定められた一端をもつ数組の標識化一本領核酸フラグメント群のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による分離に依存している。塩基特異的反応(化
学反応または酵素反応)を使用することによシ、不特定末端が特定の既知種類の
塩基にのみ現れるようにし、また上記反応を制御することによシ、すべての適当
な終止位置が分子集団中に見出されるようにする。それぞれの種類の塩基の特定
末端からの距離は、末端がその塩基で終る核酸フラグメントの長さから明らかに
なる。すべての塩基特異的反応を並列して行うとき、特定末端からの塩基配列は
次第に増加する鎖長のフラグメントの末端に付いた塩基を同定することによシ読
み取ることができる。
核酸の塩基配列を決定する慣用方法では次の3つのタイプの塩基特異的反応が用
いられる:
1)適当なポリメラーゼ酵素による核酸合成中に鎖伸長停止用のヌクレオチドを
取シ込ませる;
2)塩基特異的化学反応により核酸を切断する;3)塩基特異的エンド5ヌクレ
アーゼ酵素によシ核酸を切断する。
これらの方法はそれぞれいくつかの塩基配列決定の応用面においてその有用性を
制限する特徴を有している。
サンガー(Sanger)および共同研究者は塩基配列決定のために鎖伸長停止
用ヌクレオチドを使用する途を開いた。彼らの方法は一本鎖鋳型DNA、プライ
マー、適当なポリメラーゼ酵素、および普通のヌクレオチドと鎖伸長停止用ヌク
レオチドの混合物(放射性標識を含む)を必要とする。
DNA塩基配列決定用の一本鎖鋳型DNAは通常、一本領バクテリオファージM
13に挿入物DNAをクローニングすることにより得られる。プライマーは一
般に塩基配列を決めようとする挿入物に隣接するM 13−<フタ−の領域とハ
イブリダイズすることができる合成オリゴヌクレオチドである。ポリメラーゼ酵
素は鎖伸長停止用ヌクレオチドが取シ込まれるまで、挿入物DNAを鋳型として
用いてプライマーの3′末端にヌクレオチド(そのうちの1種は標識される)を
付加する。
プライマーは混合物中のすべての標識フラグメントのための共通の5′末端を定
め、そして鎖伸長停止用ヌクレオチドの性質はその停止位置の塩基を定める。
一本鎖鋳型DNAはまた線状二本鎖プラスミドDNAを加熱することによっても
得られるが、これらの二本のDNA鎖の再アニーリングのために塩基配列決定反
応が妨害される。二本鎖プラスミドは最も日常的なりNA操作法において使用さ
れており、そしてその結果を塩基配列の決定によシ調べることが往々にして必要
である。従って、対象となるフラグメントをM13にクローニングすることは不
利である。M13によるサンガーの塩基配列決定法はまた、特別の措置を講じな
い限シ、もともと無方向性である。本発明は一本鎖または二本鎖の鋳型を使用す
ることができ、且つどちらの方向にも等しく容易に二本鎖鋳型の塩基配列の決定
を可能にする。
マクサム(Maxam)およびギルバート(G11bert)はDNA塩基配列
決定のだめの塩基特異的化学切断の使用を確立し、フラグメント群の分画化によ
る塩基配列決定の原理を定めた。また、比較的最近になって、RNAの塩基特異
的化学切断を可能にする諸条件が定められた。多くの化学的切断法が使用され、
これらはすべて核酸修飾工程と鎖切断工程を含む。それぞれの修飾工程は1つの
塩基または塩基の種類に対して特異的でちり、ある種の条件下において修飾塩基
を不安定寿状態へ導く。
多くの応用に対してサンが一法をより好ましいものにしているいくつかの面がマ
クサム−ギルバート法には存在する。核酸と反応する化学薬剤は一般にきわめて
毒性であり、発癌性がある。また、一般に使用されている数種の化学薬剤は非常
に不安定である。それらは厳密に制御された条件下で貯蔵され、使用されねばな
らない。さらに、化学的に塩基配列を決めようとする分子は、予め定められた共
通の一端をもつフラグメントのみが視覚化されるように、一端のみを標識するこ
とが必要である。
一本領DNAの場合は、5′末端または3′末端のどちらかを標識して、共通の
5′末端または3′末端をもつフラグメント群を視覚化することは困難でない。
しかしながら、一方の鎖の一端のみを標識した二本鎖DNAを得るためには、い
くつかの操作好ましくは特殊なベクターの使用が必要になる。均一標識化ではな
く末端標識化を使用すると、標識密度が低下し、また結果が出るのに要する時間
も増加する。本発明は危険でしかも不安定な化学薬剤の使用を避け、塩基配列情
報を得るために視覚化されるフラグメント群の容易な均一標識化を可能にする。
塩基特異的エンドヌクレアーゼ酵素は、適当なエンドデオキシリボヌクレアーゼ
がまだ発見されていないので、RNAの塩基配列決定に対してのみ使用できる。
一端で標識された一本鎖RNAが必要となる。
近年、DNAの塩基配列決定法に大きな進歩が見られた。ゲル分画化された非標
識DNA塩基配列決定反応物をポリアクリルアミドケルから膜へ移行させ、ハイ
ズリダイゼーション用ノ標識プローブを用いて関係するDNAバンドを視覚化し
得ることが証明された。チャーチ(Church)およびギルバー) (Gi’
1−bertlこの方法を使用して、全マウスDNAの化学的部分切断、ゲル電
気泳動、ナイロン膜への移行、および標識R,N Aプローブとのハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、クローン化フラグメントを単離することなく直接
にマウスDNAの特定領域の塩基配列を決定した。同様に、ワー)”(Ward
)は開側までのプラスミドクローンの混合物をマクサム−ギルバート化学的切断
法にかけ、クローンに特異的な標識RNAハイブリダイゼーションプローブを用
いて個々のクローンの塩基配列パターンを視覚化した。標識プローグは視覚化の
あとで除かれる。
連続するプローグは非常に都合よく作られ、そして−組の塩基配列決定反応のあ
とに大多数のクローンの塩基配列パターンを視覚化すべく使用される。従って、
単一ゲルから収集される情報量は、標識ハイブリダイゼーションプローブを用い
て塩基配列ノミターンを視覚化することにより非常に増加する。さらに、この方
法は塩基配列決定反応物の標識化に当てはまる制限がハイブリダイゼーションプ
ローブの標識化には当てはまらないので、非放射性標識法を含めたいろいろな標
識法を使用することができる・完全に自動化された大規模塩基配列決定はこの方
法を使用して開発されるかもしれない。
ハイブリダイゼーションに基づく塩基配列決定法には、慣用のフラグメント群形
成法の使用を制限する1つの特徴が存在する。この方法のための標識ハイブリダ
イゼーションプローブは、プラスミ)″イタター上のプロモーターから短鎖挿入
物をRNAに転写することにより作られる。RNA(およびDNA)は51→3
′の方向に合成される必要がある。ハイブリッド−視覚化塩基配列決定を行うた
めに、フィルター上の相補的配列は予め定められた共通の5′末端ではなく、予
め定められた共通の3′末端を共有しなければならない。サンガー法は多くの複
雑な実際的でない操作を行わない限シこの方法に使用することができない。
マクサム−ギルバート法は、ハイブリダイゼーションプローブに相補的である共
通の3′末端をもつフラグメント群を生じさせる条件を用いることができたので
使用された。しかしながら、化学的塩基配列決定法の前記欠点はこの方法に依然
として残されたままである。
本発明は予め定められた共通の3′末端または5′末端をもつ数組のフラグメン
ト群を迅速な一試験管反応(one−tube reac−tion) で等し
く容易に製造することを可能にする。従って、二本鎖鋳型、酵素反応および均一
標識化を使用し得るという前記利点を提供するばかりでなく、本発明はハイブリ
ダイゼーションに基づく塩基配列決定に難なく応用することもできる。
文献
サンガー(Sanger F、)+ =ツクL/7 (Nicklen S、
)およびカールンy(Coulson A、R,)、 Proc、Natl、A
cad。
Sci、USA、Mo1.74,1977.5463〜7頁。
マクサム(Maxam A、 M、 )およびギルバート(Gilbert W
、 )。
Proc、 Natl、Acad、 Sci、’ USA、 Vol、74.
1977. 560〜4頁。
チャーチ(Church G、 M、 ) およびギルバート(Gilbert
。
W、 )、 Proc、Natl、Acad、、Sc1. USA、 Vo’1
. ’s 1゜1984.1991〜5頁。
発明の開示
本発明は塩基配列を決定しようとする核酸鎖に特定条件下で消化に抵抗するヌク
レオチド誘導体を導入し、次に特定条件下でその核酸鎖を消化して予め定められ
た共通の一端をもつ数組のフラグメント群を得るという概念に基づいている。
従って、本発明は
1)一方の鎖が標的類であり且つ他方の鎖が1つまたはそれ以上の位置に特定条
件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含む合成鎖である二本鎖部分を有す
る核酸鎖を準備し;n)上記の特定条件下でエキソヌクレアーゼを用いて合成鎖
を消化し、それにより上記ヌクレオチド誘導体によって占められる位置での消化
を阻止し;
111)また存在しない場合には、合成鎖のすべてのフラグメントに共通の予め
定められた末端をつくり、工程111)は工程1)の前または後に行い:そして
iv)得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する;ことから成るホ
IJヌクレオチドの塩基配列決定法を提供する。
工程1)で使用するヌクレオチド誘導体は本発明にとってきわめて重要である。
そのヌクレオチド誘導体は原理的には糖、塩基またはリン酸基(ホスホジエステ
ル結合に含まれる)において修飾されたヌクレオチドでありうる。多数のこのよ
うな修飾ヌクレオチドは文献中に開示されている。多くの場合に適するヌクレオ
チド誘導体は、アルファーリン原子に結合した酸素原子が硫黄原子によって置換
されたものであり、例えば次のものである:
アルファーS−デオキシチミジン三リン酸(α−3aTTP)アルファーS−デ
オキシアデノシン三リン酸(α−3aATP)アルファーS−デオキシシチジン
三リン酸(α−3aCTP)アルファーS−デオキシグアノシン三リン酸(α−
8aGTP)ヌクレオチド誘導体は工程11)で使用する特定消化条件(実際に
はしばしば特定のエキソヌクレアーゼを意味する)と関連して選ばれる必要があ
る。1つの適当な酵素は二本鎖DNAを3′末端からだけ消化してデオキシヌク
レオシ)’−5′−−リン酸を遊離させる大腸菌(F2.coli)由来のエキ
ソヌクレアーゼ■である。この酵素はリン原子が硫黄に結合しているとホスホ−
エステル結合を切断できない。異なる情況下において適する別の酵素は、二本鎖
DNAを5′末端からだけ消化してデオキシヌクレオシ)’−5’−−リン酸を
遊離させるファージラムダ−感染大腸菌由来のラムダエキソヌクレアーゼである
。それはリン原子が硫黄に結合しているとホスホジエステル結合を切断すること
ができない。エキソヌクレアーゼ■は二本鎖に対して特異的であり、それ故に突
出する3′末端からは二本鎖DNAを分解しないでちろう。しかしながら、ラム
ダニキンヌクレアーゼは二本鎖DNAよりも遅い速度であるが一本鎖DNAを分
解するであろう。従ってそれは二本鎖DNAを平滑末端または突出末端から分解
するだろう。二本鎖DNAを5′末端から消化し、異なる情況下において有用な
別の酵素はファージT7遺伝子6エキンヌクレアーゼである。
工程iv)におけるフラグメント混合物の大きさによる分画化は、例えば変性ホ
リアクリルアミドゲルの電気泳動により行われる。共通の予め定められた末端を
共有し且つ上記のようなヌクレオチド誘導体によって終止したフラグメントの視
覚化は、合成鎖の合成中に取り込まれた放射性標識またはその他の標識によって
行われる。また別法として、例えばチャーチおよびギルバートによって教示され
たように、標識プローグとのハイブリダイゼーションにより視覚化することもで
きる。
本発明は主として(もつとも限定するものではないが)一本領または二本鎖DN
Aの塩基配列決定に応用することができる。
RNAの塩基配列決定のためには、(1)逆転写酵素により相補的DNA鎖を合
成し、そして(11)エキソヌクレアーゼ消化を阻止させる塩基特異的反応でR
NAを修飾することが必要であるだろう。
本発明はA、Hに示した8つの好適な実施態様と関連させてさらに説明するであ
ろう。この点について、添付の図面を参照されたい(ここで第1. 2. 3.
4. 5. 6. 7および8図はそれぞれ実施態様A、B、C,D、E、F
、 GおよびHに関係する)。
第1〜6図において、DNAは適宜に環状の一本鎖または二本鎖として示されて
おり、塩基配列を決定すべき部分は10時から2時まで伸長している。制限部位
はローマ数字I、I[および■で示す。ダッシュで示した線は伸長もしくは分解
の結果としてのDNA鎖の不確定な広がシを示す。
第7および8図において、DNAは線状として示されており、プライマーは3′
方向に伸びる合成鎖とプライマーとを区別するために太い線で示される。
記号(Slはヌクレオチドまたはチオヌクレオチドのようなヌクレオチド誘導体
である単位を示す。実施態様EおよびFにおいて、ニックはニラキング反応直後
にはギャップによって示し、どは以下で説明するような対応する工程を意味する
。
A、この実施態様は塩基配列を決定しようとする部分を含む二本鎖DNAから出
発し、次の工程:
1)a)塩基配列を決定しようとする部分の一端に近接した位置でDNAを切断
して、二本鎖DNAの3′末端に特異的なエキソヌクレアーゼ(例えばエキソヌ
クレアーゼIII)により消化される1つのDNA鎖の3′末端をつくシ;1)
b)塩基配列決定部分を一本鎖にするのに十分な時間特異的エキソヌクレアーゼ
でその切断DNAを消化し;+)C)その反応混合物に、特定条件下で消化に抵
抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせ
て工程b)で除かれたDNAを再合成し且つ1つまたはそれ以上の位置にヌクレ
オチド誘導体を含む合成鎖を形成し;tila)ヌクレオチド誘導体によって占
められた位置での消化が阻止されるような特定条件下で、DNA鎖の3′末端を
攻撃するエキソヌクレアーゼによりその合成鎖を消化し;1ii)e)そのDN
Aを切断して合成鎖の全フラグメントに共通する所定の5′末端をつくり;そし
て1v)f)工程e)から得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化す
る;ことから成る。
工程a)において、制限酵素は一本鎖末端が工程b)でのエキソヌクレアーゼ■
消化に抵抗するので3′突出部分を残さないべきである。
工程C)において、標的を含む反応混合物は好ましくは4つの部分に分割し、そ
れぞれの部分にヌクレオチド類および異なるヌクレオチド誘導体を添加する。4
種類すべてのヌクレオチドが1種類のヌクレオチド誘導体と共にそれぞれの部分
に加えられる。関係するヌクレオチド(例えばaATP)に対するヌクレオチド
誘導体(例えばα−3aATP)の割合は、合成鎖のいくつか(全部でなくても
よい)のA位置がその誘導体によって占められるようにすべく選ばれる。また工
程C)では、添加されるヌクレオチドの1種は好ましくは工程で)から生ずる分
画化フラグメントを視覚化する手段を提供するように、例えば32−Pで標識さ
れる。これとは別に、35−8−標識チオヌクレオチドをヌクレオチド誘導体と
して使用することもできる。
工程d)では、ヌクレオチド誘導体がチオ−ヌクレオチドである場合、合成りN
A鎖を例えばエキソヌクレアーゼ■で消化する。消化後、4種類のチオ−ヌクレ
オチドのうちの1種類を含む合成鎖はすべてこの種のチオ−ヌクレオチドを有す
るそれらの3′末端で終止する。
工程θ)では、好ましくは塩基配列決定部分の他端〔工程a)における一端に対
して〕に近接した位置でDNAを切断するように選ばれた制限酵素で消化するこ
とにより、共通の予め定められた5′末端が生成する。
B、この実施態様は塩基配列決定部分を含む二本@DNAから出発する。実施態
様Aと同様に、これも共通の予め定められた3′末端をもつフラグメント群を生
ずる。これはワード(Ward)の方法によるフラグメントと標識プローブとの
その後のハイブリダイゼーションを容易にするという利点を有している。この方
法は次の工程:
1)a)塩基配列決定部分の一端に近接した位置でDNAを切断して、二本鎖D
NAの3′末端に特異的なエキソヌクレアーゼ(例えばエキソヌクレアーゼ■)
により消化される1つのDNA鎖の3′末端をつくり;
1)b)塩基配列決定部分を一本鎖にするのに十分な時間特異的エキソヌクレア
ーゼでその切断DNAを消化し;1)e)その反応混合物に、特定条件下で消化
に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行
わせて工程b)で除かれたDN八を再合成し且つ1つまたはそれ以上の位置にヌ
クレオチド誘導体を含む合成鎖を形成し;1f)d)例えば制限酵素で消化する
ことによシ、塩基配列決定部分の両末端に近接した位置でそのDNAを切断し;
1ii)e)ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特
定条件下で、DNA鎖の5′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼ(例えばラムダ
エキソヌクレアーゼ)によりその合成鎖を消化し;
1ν)f>工程e)から得られたフラグメント混合物を大きさによシ分画化する
:ことから成る。
この場合も工程a)で使用する制限酵素は3′突出部分を残さないようにすべき
である。
工程C)では、実施態様Aで説明したように、好ましくは反応混合物が4つの部
分に分けられる。この工程で使用するヌクレオチドの1種は標識されるか、ある
いは工程f)からのフラグメントが標識プローブにより視覚化される。ヌクレオ
チド誘導体は好ましくはチオ−ヌクレオチドであシ、エキソヌクレアーゼは好ま
しくはラムダエキソヌクレアーゼである。この場合に、4種のチオヌクレオチド
のうちの1種を含む合成鎖はすべてチオヌクレオチドから正確に1ヌクレオチド
離れたそれらの5′末端で終止する。■程C)での再合成が完了した場合、ある
いは任意に工程e)の後に制限酵素でさらに消化した後、合成鎖の全フラグメン
トは共通の予め定められた3′末端を有する。
チオヌクレオチドの位置は消化フラグメントの長さによって示される。
C0この実施態様において、塩基配列を決定しようとする鋳型は一本鎖DNAで
あって、例えばM13にクローニングされた挿入物である。この方法は次の工程
:
1)a)挿入物の3′末端に近接した(フタ−にオリゴヌクレオチドプライマー
をアニーリングし:
1)b)その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を
含めたヌクレオチド類を添加し、そして1つまたはそれ以上の位置にヌクレオチ
ド誘導体を含み且つ挿入物に相補的である合成鎖を形成すべく重合反応を行わせ
iii)c)ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特
定条件下で、DNA鎖の3′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼによりその合成
鎖を消化し:そしてtv)d)工程C)から得られたフラグメント混合物を大き
さによυ分画化する;ことから成る。
工程C)で生じたフラグメントは共通の予め定められた5′末端を有するので、
−7エ程C)およびd)の間で切断を行う必要がない。
ラベイト(S、 Labei t )ら(DNA、 Mol 5. 陥2. 1
986゜173〜7頁)はこの実施態様に関する情報をさらに提供するだろう。
D、この実施態様は一本鎖DNA、例えばM13にクローニングされた挿入物か
ら出発する。実施態様Cと異なって、これは共通の予め定められた3′末端をも
つフラグメント群を生成する。
この方法はその工程:
1)a)挿入物の3′末端に近接したベクターにオリゴヌクレオチドプライマー
をアニーリングし;
1)b)その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を
含めたヌクレオチド類を添加し、そして1つまたはそれ以上の位置にヌクレオチ
ド誘導体を含み且つ挿入物に相補的である合成鎖を形成すべく重合反応を行わせ
;1ife)ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特
定条件下で、DNA鎖の5′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼでその合成鎖を
消化し;jil ) d )挿入物の5′末端に近接した位置で、例えば制限酵
素で消化することにより、そのDNA1切断し、それにより合成鎖の全フラグメ
ントに共通した所定の3′末端をつくり;そして1v)e)工程d)から得られ
たフラグメント混合物を大きさにより分画化する;ことから成る。
工程b)における鎖伸長は、挿入物を越えて伸びる標識フラグメントが塩基配列
パターンを妨害しないように十分長くするべきである。
E、この実施態様は二本鎖DNAから出発し、次の工程:1)a)塩基配列を決
定しようとする部分の一端に近接した、例えばファージf1タンパク質Aの認識
配列によって定められる位置で該タンパク質を用いて、一方のDNA鎖にニック
を形成し;
1)b)その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を
含めたヌクレオチド類を添加し、そして塩基配列決定部分の鎖長を伸ばし且つ1
つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含む合成鎖を形成すべくニック
トランスレーションを行わせ;
1)C)工程a)でニックが形成された位置に近接した位置で、例えば制限酵素
で消化することによシ、そのDNAを切断し:
1i)d)ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定
条件下で、5′末端を攻撃する酵素(例えばラムダエキソヌクレアーゼ)により
その合成鎖を消化し;iii ) e )塩基配列決定部分の他端(工程a)に
おける一端に対して)に近接した位置でそのDNAを切断し;そして1v)f)
工程e)から得られた共通の予め定められた3′末端工程b)は好ましくは大部
分のニックが塩基配列決定部分を完全に越えるまで継続すべきである。ちるいは
、工程e)が工程a)に先立って行われるだろう。
F、この実施態様は二本鎖DNAから出発する。実施態様Eと異なり、共通した
所定の5′末端をもつフラグメント混合物が生成する。この実施態様は次の工程
:
1)a)塩基配列を決定しようとする部分の一端に隣接した、例えばファージf
1タンパク質Aの認識配列によって定められる位置でそのタン・ξり質を用いる
ことにより、一方のDNA鎖にニックを形成し;
1)b)その反応混合物に特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含
めたヌクレオチド類を添加し、ニックトランスレーションを行わせて塩基配列決
定部分の鎖長を伸ばし且つ1つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含
む合成鎖を形成し;
1)C)ニックトランスレーション後にヌクレオチド誘導体によって占められた
位置での消化tm止する特定条件下で、ニックの3′末端を攻撃する酵素(例え
ばエキソヌクレアーゼ■)でその合成鎖を消化し;
tit)d)工程a)でニックが形成された位置に近接した位置でそのDNAを
切断し;そして
1v)e)工程d)から得られた共通の所定5′末端を有するフラグメント混合
物を大きさにより分画化する;ことから成る。
G、この実施態様は標的領域を含む二本鎖DNAから出発する。この方法は上記
Cの方法と似ており、次の工程:1)a)二本鎖出発DNAを変性し;
1)b)1つのDNA鎖の標的領域の3′末端に近接してオリゴヌクレオチドプ
ライマーをアニーリングし;1)C)その反応混合物に、特定条件下で消化に抵
抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせ
て1つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含み且つ標的領域に相補的
である合成鎖を形成し;+t1dlヌクレオチド誘導体によって占められた位置
での消化を阻止する特定条件下で、DNA鎖の3′末端を攻撃するエキソヌクレ
アーゼで合成鎖を消化し;そして1v)e)工程d)から得られたフラグメント
混合物を大きさにより分画化する;ことから成る。
この方法は原則としてクローニングによって精製されたDNAよりもむしろゲノ
ムDNAの塩基配列決定に適している。この反応中に放射性標識を組み込むこと
は、この種の標識が折シ返された反復配列のアニーリングのために多くの位置に
挿入されるので、はとんど実行できないだろう。しかしながら、フラグメント群
は電気泳動、固体支持体へのプロッティング、およびプライマーに相補的な標識
プローブとのハイブリダイゼーションにより視覚化されるだろう。上記のWar
d プロット塩基配列決定法と相違して、同一クローンから塩基配列を決定する
必要がなく、また同一クローンからプローブを作る必要もない。プライマーの向
きとプローブの向きとの不一致は存在せず、5′−3′エキソヌクレアーゼを必
要としない。5P5−またはT7プロモーターを含むはフタ−中の適当なりロー
ンを使用することにより、プライマーに相補的な高い比活性のRNAプローブを
作ることができる。
H,サイキ(R,K、 5aiki )らはゲノムDNAの特定領域の増幅方法
について開示した(Science、 230 (4732)。
1985年12月、1350〜1354頁参照)。標的配列の両末端で相対する
DNA鎖にアニーリングする2つのプライマーを用いて、aNTPおよび1クレ
ノウ(Klenow)’ #?リメラーゼの存在下に、変性ゲノムDNA上でD
NA合成を開始する。
この反応後、混合物を加熱して新しいI)HAを変性し、同じプライマーをもと
の2つのDNA鎖と新しいDNA鎖の両方にアニーリングさせ、より多くの酊素
を加えて、再び標的配列の量を2倍にする(第2図参照)。この変性−合成サイ
クルは所望によシ燥り返し行われ、105以上の増幅へ導くことができる。
第1の伸長反応後、多か九少なかれ完全に再合成される分子(次回の合成のため
の開始部位がコピーされねばならない)のみがさらに増幅されることに注意すべ
きである。
本実施態様はこの増幅方法を利用する上記Gの変法である。
この方法は次の工程:
1)a)二本鎖出発DNAを変性し;
1)b)両方のDNA鎖の標的領域の3′末端に近接してオリゴヌクレオチドプ
ライマーをアニーリングさせ;1)C)その反応混合物、特定条件下で消化に抵
抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせ
て1つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含み且つ測鎖の標的領域に
相補的である合成鎖を形成し;1)d)得られた二本鎖DNAを変性し;1)e
)必要に応じて工程1)b)および1) C)および1)d)を燥シ返し行って
標的領域の所望濃度を達成し;1t)f)ヌクレオチド誘導体によって占められ
た位置での消化を阻止する特定条件下に、DNA鎖の3′末端を攻撃するエキソ
ヌクレアーゼでその合成鎖を消化し;iv)g)工程f)から得られたフラグメ
ント混合物を大きさにより分画化する;ことから成る。
このような増幅反応中に適当なレベルの特定5aNTPを組み入れて、その後エ
キソヌクレアーゼ■で消化すると、増幅反応において用いた2つのプライマーに
より定められる5′末端と特定5aNTPにより定められる3′末端をもつ高度
に増幅された分子集団が形成される。大量の標的DN八は、電気泳動およびプロ
ッティング後に、プライマーの一方または他方に相補的な末端標識化オリゴヌク
レオチド・・イズリダイゼーションプローブによるフラグメント群の視覚化を可
能にする。別法として、標識された(恐らくは非放射性標識によシ)プライマー
の一方または他方を増幅反応中番で使用して、プロッティングおよびハイブリダ
イゼーション工程を省くことが可能である。
要約すると、チオシーフェンシング法は増幅なしでゲノムの塩基配列決定に利用
できる(実施態様G)が、その利用可能性は増幅により大いに高められるだろう
(実施態様H)。とりわけ、増幅はゲノムの非放射性塩基配列決定を可能にする
。
多くの場合に、これらの方法は反応を同時に行うことにより単純化することがで
きる。
8つの実施態様において説明したこれらの方法の多くの変法が本発明に従って可
能であり、当業者には容易に考えつくであろう。
実施例1
0.5 μ9のp A T 153 を4単位のBamH1および10 単位の
エキソヌクレアーゼ■と共に(9)μEの125 mM NaCl、 50 m
MトリスH(J(pH7,5) 、10 mM M9C71!2および5mMジ
チオトレイトール中で混合し、室温で45分間インキュベートした。この試験管
ヲ70℃で100間加熱した。15μeを別の試験管に移し、ヌクレオチド類を
加えて18μeの最終容量中で次の最終濃度とした: 200μM aGTP、
200μM aTTP、200μM dATP。
50μM ctSdATP、この容量はまた10マイクロキユリーのα32P−
dCTP(比活性的3000 C1/mmo6 ) オよび4単位の大腸菌DN
Aポリメラーゼ■1クレノウ1フラグメントを含んでいた。
この混合物を室温で10分間インキュベートした。1μlの5mM aCTPを
加え、この混合物を室温でさらに15分間インキュベートした。
この試験管を70℃で105+間加熱し、10単位のエキソヌクレアーゼ■を1
μlの容量中に加えた。この混合物を室温で1時間インキュベートした。熱失活
工程(70℃、10分)の後5単位を含むC1a1溶液1Agを加え、この混合
物を37℃で15分間インキュベートした。
加μlの次の溶液:3■ブロモフエノールブルー、3m7キシL/7シ7/ −
ル、 2Dttl 0.5M EDTA(p)f8)、1wt1脱イオンホルム
アミビを加えた。
1μlアリコートは7M尿素を含む5%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に
かけ、富士X線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。得られたオ
ートラジオグラフはゲルの最下部に存在するp A T 153のC6a1 部
位に近いところからBamH1部位の方へ伸びる1A−トラック”を表し、この
部分の既知塩基配列を正確に示していた。
実施例2
SaNTPおよびエキソヌクレアーゼ■を使用するスーパーコイルプラスミド□
BR322のBamJ部位とHinalI[部位の間の部分的塩基配列を次の方
法により決定した。
1.3μ9のpBR322を6単位の制限エンドヌクレアーゼB a m HI
および加単位の大腸菌エキソヌクレアーゼ■と共に加pgの50mM)すxHC
l(PH7,5)、75mMNaCji’、10mMMgCJzおよび5mMジ
チオトレイトールの存在下に混合した。この混合物’e37℃ で45分間イン
キュベートした。
2、反応を停止させ、70℃で10分間加熱することによシ酵素を失活させた。
3、工程2からの混合物10μgを6μlの100mM )リスHC6(pHs
、o ) 、50 mM MgC62、4jfL位ノ大kM D N A d”
!j メラーゼ1クレノウ1フラグメントと混合し、水を加えて60μlとし
た。
4、工程3からの混合物をA、G、CおよびTと指定した15μgずつの4つの
部分に分けた。各反応混合物に15マイクロキュリーノα32P−+1cTP
(3000Ci/mmo#)を加え、続いて下記の適当なヌクレオチド混合物2
μlを加えた:1mMaGTP ’ 1mMdATP 1mMdATP 1mM
dATPi mMTTP 1 mMTTP 1 mMaGTP 1 mMaGT
P50 μMacTP 50A1MdCTP 1 mMTTP 50 BMdc
TP850μMdATP 850μMdGTP 42.5mMdCTP 950
μMTTP150μMaATPαS 150μMdGTPαS 7.5mMaC
TPaS50μMTTPαSこれらの混合物を室温で10分間インキュベートし
た。
5、A、GおよびTの反応混合物に1Agの2mMdCTPを加え、そしてC反
応混合物に1Agの1.4mM aCTPおよび0.6mM aCTPαS を
加えた。これらの混合物を室温でさらに10分間インキュベートLi。
6、反応を停止させ、70℃で10分間インキュベートすることにより酵素を失
活させた。
7、L5μlJの750mM NaCjl!、500mM )すy、 H(J
(pH7,5) 。
100 rrM MgCl2 、50 mMジチオトレイトールおよび2単位の
エキソヌクレアーゼ■を加えた。これらの混合物ヲ37℃でI分間インキユイー
トシた。
8、工程7からの反応混合物は酵素を失活させるために70℃で10分間インキ
ユベートシた。
9、工程8からの各反応混合物に5単位の制限エンドヌクレアーゼHina [
1を加え、37℃で15分間インキュベートした。
10、その後各試験管にホルムアミド含有泳動用染料を加え、アリコートを変性
条件下に6%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。
11、ゲル上の標識DNAフラグメントを視覚化するためにオートラジオグラフ
ィーを行った。プラスミド’pBR322のBamHI部位とHind I[[
部位の間にある領域の大部分の塩基配列を正確に読み取ることができた。
実施例3
SaNTPおよびエキソヌクレアーゼ■を使用するこの実験方法は実施例2と同
様であったが、実施例2の工程4および5の代わりに次の工程を行った。
4.5.工程3からの混合物t−A、、 G、CおよびTと指定した15μgず
つの4つの反応混合物に分けた。15マイクロキユリーの((I−5)aATP
S (比活性1000 C1/mmol)るA反応混合物に加え、そして同量
の〔α−35S)aGTP S、(α−35S〕aCTP Sおよび〔α−35
S)TTP SをそれぞれG、CおよびT反応混合物に加えた。また、2μlの
次の混合物を添加した(A混合物はA反応混合物へ)。
1 mM dGTP 1 mMd ATP 1 mMa ATP 1 mMd
ATPlmMTTP 1mMTTP 1mMTTP 1mMdGTP1 mMd
CTP 1 mMdcTP 1 mMdGTP 1 mMdCTP40μMaA
TP 80μMaGTP 20μMaCTP 200μMTTPこれらの反応混
合物は室温で10分間インキュベートした。
実施例2の工程11のようにオートラジオグラフィーを行った後、プラスミド#
pBR322のBamH工 部位とHind[[部位の間にある領域の大部分の
塩基配列を正確に解読することができた。
坤X句
神\カ
国際調査報告
一4智I西t−り1111ム帥噂會−xNo、PCT/GB86100349
Claims (14)
- 1.1)一方の鎖が標的であり且つ他方の鎖が特定条件下で消化に抵抗するヌク レオチド誘導体を1つ以上の位置に含む合成鎖である塩基配列を決定しようとす る二本鎖部分を有する核酸鎖を準備し; ii)上記ヌクレオチド誘導体によって占められる位置での消化を阻止する特定 条件下でエキソヌクレアーゼにより該合成鎖を消化し; iii)まだ存在しない場合には、合成鎖のすべてのフラグメントに共通する予 め定められた末端をつくり、工程iii)は工程ii)の前または後に行い; iv)得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する; ことから成るポリヌクレオチドの塩基配列決定法。
- 2.ヌクレオチド誘導体はチオーヌクレオチドである、請求の範囲第1項記載の 方法。
- 3.エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIまたはラムダエキソヌクレ アーゼである、請求の範囲第2項記載の方法。
- 4.合成鎖は重合条件下でヌクレオチド誘導体を含むヌクレオチド類を使用する ことにより形成される、請求の範囲第1〜3項のいずれか1項に記載の方法。
- 5.標的を含む反応混合物を4つの部分に分け、それぞれの部分にヌクレオチド 類および異なるヌクレオチド誘導体を加える請求の範囲第4項記載の方法。
- 6.塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは二本鎖D Aであり、その 二本鎖DNAをエキソヌクレアーゼ酵素で消化して標的を得る、請求の範囲第1 〜5項のいずれか1項に記載の方法。
- 7.塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは一本鎖DNAであり、その 3′末端に近接してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする、請求の 範囲第1〜5項のいずれか1項に記載の方法。
- 8.塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは二本鎖DNAであり、合成 鎖はヌクレオチド誘導体を含むヌクレオチド類の存在下でニックトランスレーシ ョンを行うことにより導入する、請求の範囲第1〜5項のいずれか1項に記載の 方法。
- 9.塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは標的領域を含む二本鎖DN Aであり、その二本鎖DNAを変性して、一方の鎖またはそれぞれの鎖の3′末 端に近接してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする、請求の範囲第 1〜5項のいずれか1項に記載の方法。
- 10.オリゴヌクレオチドプライマーを両鎖の3′末端に近接してアニーリング し、重合条件下でヌクレオチド誘導体を含むヌクレオチド類を使用することによ り合成鎖を形成し、得られた二本鎖DNAを変性し、アニーリング、重合および 変性の各工程を繰り返し行って標的領域を増幅する、請求の範囲第9項記載の方 法。
- 11.塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドはゲノムDNAである、請 求の範囲第9項または第10項記載の方法。
- 12.工程iv)におけるフラグメント混合物の大きさによる分画化は変性ゲル 電気泳動により行う、請求の範囲第1〜11項のいずれか1項に記載の方法。
- 13.フラグメントの視覚化は合成鎖の合成中に取り込まれた標識を用いて行う 、請求の範囲第12項記載の方法。
- 14.フラグメントの視覚化は標識プローブとのハイブリダイゼーシヨンにより 行う、請求の範囲第12項記載の方法。
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