JP2003510011A - カップル性ポリメラーゼ連鎖反応−制限エンドヌクレアーゼ消化−リガーゼ検出反応法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、複数の標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列（high abundance sequence）から、1つもしくは複数の単塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数の少量存在配列（low abundance sequence）を同定するための方法を提供する。大量存在野生型配列は、最適な緩衝液条件によって促進される、高忠実度ポリメラーゼ連鎖反応類似変換を使用して選択的に除去されて、大量存在野生型遺伝子に制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するが、少量存在突然変異遺伝子では形成しない。これにより、大量存在DNAの消化が可能になる。その後、少量存在突然変異DNAが増幅され、リガーゼ検出反応アッセイ法によって検出される。本発明はまた、本発明の手法を実施するためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本願は、1999年3月19日に出願された米国仮特許出願第60/125,251号の恩典を
主張するものである。

【０００２】 本発明は、国立保健研究所、助成金第GM-41337-06号、同第GM-43552-05号、同
第GM-42722-07号および同第GM-51628-02号に準拠した政府基金を用いて開発され
た。米国政府は一定の権利を有する。

【０００３】 発明の分野 本発明は、カップル型ポリメラーゼ連鎖反応（coupled polymerase chain rea
ction）（「PCR」）、制限エンドヌクレアーゼ消化（「RE」）およびリガーゼ検
出反応（「LDR」）に関係する方法に関する。

【０００４】 発明の背景 癌の検出 本国の第二の死因として、ほぼ600,000人が年間癌で死亡しており、癌を全て
の医学的診断の最も憂慮すべきものの1つにしている。男性および女性に浸潤癌
を発生する生涯リスクはそれぞれ50パーセントおよび33パーセントである。1995
年には120万例以上の新たな癌の症例が米国において診断されると予測される。1
994年の癌の医療費支出は約1040億ドルであった。しかし、癌が家族や社会に与
える影響の全ては、診断および治療に支払われた金額によってだけでははかれな
い。かなりの数の人々が生産年齢に癌に襲われる。癌は1985年には早死にの18パ
ーセントを占め、1991年では米国の9,200人以上の女性が55歳前に乳癌で死亡し
た。

【０００５】 現在、癌の診断は、病理学者による腫瘍組織の組織学的評価に基づいている。
癌が診断されると、主に腫瘍の程度または病期によって治療が決定される。腫瘍
の病期は臨床的、放射線的および臨床試験的方法によって規定される。腫瘍を病
期段階わけする標準的な分類システムは、癌患者の臨床情報を明確に伝えるよう
に開発されている。病期段階わけは重要な予知情報を提供し、新たな治療方法の
試験を可能にする臨床検討の基礎となる。原発腫瘍のサイズ、癌が見つかる所属
リンパ節および他の身体部位への転移の有無により腫瘍を分類する病期段階わけ
システムが開発された（TNM病期段階わけシステム）。リンパ節への影響がなく
、遠隔転移のない小さい癌は早期癌と考えられ、外科的切除によって治癒可能で
あることが多い。予後の一般的な判定は5-年生存率、すなわち所定の病期の癌の
診断後5年生存する患者の割合である。多くの癌の5-年生存率はこの数十年で改
善されたが、いくつかの早期病期の癌が5年以内またはそれ以降に再発するとい
う事実により、研究者は、組織学的段階分け、血球計算結果、ホルモン受容体の
状態および多数の他の腫瘍マーカーを含む他の別の予後マーカーを調査している
。さらに最近では、研究者は、予後指標として癌の分子的変更の使用を調査して
いる。

【０００６】 点変異およびわずかな欠失などの癌において見いだされる遺伝的変更は悪性腫
瘍細胞のマーカーとして作用することができる。

【０００７】 少数核酸配列の検出 PCRを使用して癌を検出するために数多くの手法が開示されている。シドラン
スキー(Sidransky)ら、「検出可能な結腸直腸腫瘍患者の糞便におけるras癌遺伝
子変異の同定（Identification of ras Oncogene Mutaions in the Stool of Pa
tients with Curable Colorectal Tumors）」,Science 256: 102-05(1992)は、K
-ras変異を同定することによって、結腸癌を検出している。これは、全DNAのPCR
増幅、ファージベクターへのクローニング、ファージの培養、いくつかの異なる
K-ras変異に特異的な個々のオリゴヌクレオチドによる反復プロービングおよび
所定の培養皿上の陽性プラーク割合の計算を含む。これは、完了するのに3日か
かり、それによって糞便試料中の野生型DNAに対する変異体の比を測定する技術
的に困難な手法である。ブレナン（Brennan）ら、「頭部と頸部の扁平上皮細胞
癌腫における組織病理学段階わけの分子レベルでの評価（Molecular Assesment
of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of the Head and
Neck）」, N. Eng. J. Med. 332(7):429-35(1995)は、配列決定によってp53突然
変異を見いだしている。次いで、この特定の突然変異を全DNAのPCR増幅を使用し
て辺縁組織においてプロービングし、ファージベクターにクローニングし、ファ
ージを播き、配列決定によって見いだされる変異に特異的である個別のオリゴヌ
クレオチドでプロービングし、所定の培養皿の陽性プラークの割合を計数する。
ベルセレミー（Berthelemy）ら、「膵臓癌の早期診断における膵液中のK-ras変
異同定（Brief Communications--Identification of K-ras Mutations in Pancr
eatic Juice in the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer）」, Ann. Int. M ed. 123(3): 188-91(1995)は、膵臓分泌物中にK-ras突然変異を検出するためにP
CR/制限酵素方法を使用している。しかし、この技法は、突然変異が定量されな
いという点において不十分である。同様に、タダ（Tada）ら、「膵臓腺癌患者の
膵液および末梢血中のras遺伝子変異の検出（Detection of as Gene Mutations
in Pancreatic Juice and Peripheral Blood of Patients with Pancreatic Ade
nocarcinoma）」, Cancer Res. 53: 2472-74(1993)およびタダ（Tada）ら、「膵
臓腺癌の診断のためのras遺伝子変異の臨床的適用（Clinical Application of r
as Gene Mutation for Diagnosis of Pancreatic Adenocarinoma）」, Gastroen t. 100: 233-38(1991)は、膵臓癌を検出するためにこのような試料に対立遺伝子
-特異的PCRを実施している。これは、ポリメラーゼ伸長のない正常な鋳型による
偽陽性を提供する、プライマーダイマーから識別するために産物の電気泳動によ
る分離を必要とする、重複プライマーの妨害により密接に密集する部位を多重化
することができない、小さい反復配列中の1塩基または小さい挿入および欠失を
検出することができない、および正常なDNAの高いバックグラウンド中で突然変
異DNAを定量するのに実際に好適でないという欠点を有する。ハヤシ（Hayashi）
ら、「遺伝的検出は組織病理学法では検出不可能な潜伏リンパ節転移を同定する
（Genetic Detection Identifies Occult Lymph Node Metastases Undetectable
by the Histopathological Method）」, Cancer Res. 54: 3853-56(1994)は、K
-rasまたはp53突然変異を見つけて結腸癌の潜伏リンパ節転移を同定するために
対立遺伝子-特異的PCR技法を使用している。1000個の正常細胞中の1つの腫瘍細
胞の感度が主張されているが、定量的な値を得るには、骨の折れるクローニング
法、プレーティング法、およびプロービング法が必要である。ミツドミ（Mitsud
omi）ら、「ras遺伝子変異は小細胞性肺癌細胞系統由来の非細胞性肺癌細胞系統
の部分集合を認識する（Mutations of ras Genes Distinguish a Subset of Non
-small-cell Lung Cancer Cell Lines from Small-cell Lung Cancer Lines）」
, Oncogene 6: 1353-62(1991)では、ゲノムDNAのPCR増幅中にミスマッチプライ
マーによって作製された制限断片長多型を使用して、K-ras、H-ras、およびN-ra
s遺伝子の点変異についてヒト肺癌細胞系統をスクリーニングしている。このよ
うなプライマー媒介性RFLPの欠点には、正常DNAから突然変異体を識別するため
の電気泳動による分離の必要性、制限酵素切断部位に変換されている可能性があ
る部位への限定的適用性、突然変異の性質を判定するための追加の分析の必要性
、および正常なDNAの高いバックグラウンドにおいて突然変異DNAを定量する際の
困難さが含まれる。さらに、これらの手法は面倒で、不正確である傾向がある。

【０００８】 カップル型PCR/ライゲーション方法は、大多数のヌクレオチド配列の存在下に
おいて少数のヌクレオチド配列を検出するために使用されている。PCR/LDR方法
は、HIV突然変異体を検出するために、フレンケル（Frenkel）,「ジドブジンお
よびジダノシン抵抗性に関連するヒト免疫不全症ウイルス1型pol変異についての
特異的高感度迅速アッセイ法（Specific, Sensitive, and Rapid Assay for Hum
an Immunodeficiency Virus Type 1 pol Mutations Associated with Resistanc
e to Zidovudine and Didanosine）」, J. Clin. Microbiol. 33(2): 342-47(19
95)において使用されている。しかし、このアッセイ法は多重検出に使用するこ
とができない。アブラバヤ（Abravaya）ら、「改変型リガーゼ鎖を用いた点変異
の検出（Detection of Point Mutaions With a Modified Ligase Chain ）(Gap-
LCR)」,Nucl. Acids Res. 23(4)675-82(1995)およびバレス（Balles）ら、「リ
ガーゼ鎖反応によるまれば組換え体の容易な単離：ドロソフィラ・オプトモアbl
ind遺伝子における遺伝子内交差の選抜（Facilitated Isolation of Rare Recom
binants by Ligase Chain Reaction: Selection for Intragenic Crossover Eve
nts in the Drosophila optomotor-blind Gene）」, Molec. Gen. Genet. 245:
734-40(1994)も参照。

【０００９】 結腸直腸病変は、PCR増幅およびその後のオリゴヌクレオチドライゲーション
アッセイ法含む方法によって検出されている。ジェン（Jen）ら、「結腸直腸病
変における形成異常の分子的決定（Molecular Determinations of Dysplasia in
Colorectal Lesions）」, Cancer Res. 54: 5523-26(1994)およびレッドストン
（Redston)ら、「大腸炎関連新生物形成スペクトル中のAPC遺伝子およびK-ras遺
伝子変異の共通出現（Common Occurrence of APC and K-ras Gene Mutations in
the Spectrum of Colitis-Associated Neoplasias）」, Gastroenter. 108: 38
2-92(1995)を参照。この方法は、ポウウェル(Powell)ら、「家族性腺腫ポリープ
病の分子診断（Molecular Diagnosis of Familial Adenomatous Polyposis）」,
N. Eng. J. Med. 329(27): 1982-87(1993)を進歩させたものとして開発された
。これらの技法は実施が限定され、困難である傾向がある。

【００１０】 少数のヌクレオチド配列を検出するために他の手法が開発されている。ル（Lu
）ら、「PCRと制限酵素切断による変異解析の定量的側面（Quantitative Aspect
s of the Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage）(MAPREC
)」PCR Methods and Appl. 3: 176-80(1993)は、PCRおよび制限酵素切断により
ウィルスの復帰突然変異体を検出している。MAPRECの欠点には、正常なDNAから
突然変異体を識別するために電気泳動による分離を必要とする、制限酵素切断部
位に変換されている可能性がある部位への制限的適用性、突然変異の性質を判定
するための追加の分析の必要性、および正常なDNAの高いバックグラウンドにお
いて突然変異DNAを定量する際の困難さが含まれる。クプスワミー（Kuppuswamy
）ら、「遺伝病検出のための一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長：血友病G（IX
因子）嚢胞性線維症遺伝子への実験的適用（Single Nucleotide Primer Extensi
on to Detect Genetic Diseases: Experimental Application to Hemophilia G(
Factor IX) and Cystic Fibrosis Genes）」, Prc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
1143-47(1991)において、一方はプライマーと正常なコード配列に対応する標識
されたヌクレオチドを含有し、もう一方はプライマーと突然変異配列に対応する
標識されたヌクレオチドを含有する混合物を含む、増幅される対象の各々の断片
の2つの反応混合物を使用して、PCR反応が実施されている。このようなミニ配列
決定（すなわち、SNuPe）の欠点は、突然変異が既知でなければならない、重複
プライマーの妨害により密接して密集する部位を多重化することができない、小
さい反復配列において1塩基または小さい挿入および欠失を検出することができ
ないおよび4つの分離反応が必要であるということである。変異原性的に分離す
るPCR方法は、ラスナ（Rust）ら、「変異原性的分離PCR(MS-PCR)：容易な変異検
出のための高い特異性の一段階方法（Mutagenically Separated PCR(MS-PCR): a
Highly Specific One Step Procedure for easy Mutation Detection）」 Nucl . Acids Res. 21(16): 3623-29(1993)において、異なる鎖長の対立遺伝子-特異
的プライマーを使用して、正常対立遺伝子および突然変異対立遺伝子を識別する
ために開示されている。MS-PCRの欠点には、ポリメラーゼ伸長のない正常な鋳型
による偽陽性を与える可能性、プライマーダイマーから識別するための電気泳動
による産物の分離の必要性、重複プライマーの妨害による密接に密集した部位を
多重化することができない、小さい反復配列において1塩基または小さい挿入お
よび欠失を検出することができないおよび正常なDNAの高いバックグラウンドに
おいて突然変異DNAを定量するのに理想的には好適でないことが含まれる。スズ
キ（Suzuki）ら、「ポリメラーゼ連鎖反応産物の一本鎖高次構造によるヒト肺癌
におけるras遺伝子変異の検出（Detection of ras Gene Mutations in Human Lu
ng Cancers by Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polyme
rase Chain Reaction Products）」, Oncogene 5: 1037-43(1990)では、PCR段階
、およびその次の増幅されたDNA断片の一本鎖高次構造多型(single strand conf
ormation polymorphism)、SSCPを含む段階を有する方法において突然変異が検出
されている。SSCPの欠点には、正常な配座異性体から突然変異配座異性体を識別
するために電気泳動による分離を必要とする、生じうる突然変異の30%を検出す
ることができない、突然変異の性質を判定するために追加の分析が必要である、
および沈黙多型から突然変異体を識別することができないことが含まれる。

【００１１】 ヌクレオチド変換の忠実度 ポリヌクレオチド試料中の所定の一つもしくは複数の配列の存在を検出する方
法の多数は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による少数配列の増幅に関係してい
る。ムリス(Mullis)らに付与された米国特許第4,683,202号およびサイキ（R. K.
Saiki）ら、Science 230: 1350(1985)。この方法では、選択された配列の反対
の末端部に相補的なプライマーが、加熱サイクルと併用して、プライマー開始型
複製の連続的なラウンドを促進するために使用される。増幅された配列は種々の
技法によって容易に同定することができる。この方法は、ポリヌクレオチドを含
有する試料中の低コピー数配列の存在を検出するのに、例えば、生液試料中の病
原体配列を検出するのに特に有用である。しかし、非選択的なPCR方法は、ほぼ
等しい効率で突然変異対立遺伝子および野生型対立遺伝子を増幅し、最終産物を
少量しか含まない少量存在突然変異対立遺伝子が生ずる。突然変異配列が25%未
満の増幅産物を含む場合には、DNA配列決定がこのような対立遺伝子の存在を検
出できる可能性は低い。クローニングし、その後対立遺伝子特異的なオリゴヌク
レオチド（ASOs）でクローンをプロービングすることによりPCR産物を最初に分
離することによって少量存在突然変異体を正確に定量することができるが（サイ
キ（Saiki）ら、「Analysis of Enzymatically Amplified Beta-Globin and HLA
-DQ Alpha DNA with Allele-Specific Oligonucleotide Probes」, Nature, 324
(6093): 163-6(1986); シドランスキー（Sidransky）ら、「Identification of
Ras Oncogene Mutations in the Stool of Patients with Curable Colorectal
Tumors」, Science, 256:102-5(1992);およびブレナン（Brennan)ら、「Molecul
ar Assessment of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of
the Head And Neck」, N. Engl. J. Med., 332(7): 429-35(1995))、この方法
は時間がかかる。一方、対立遺伝子特異的PCR方法は突然変異対立遺伝子を迅速
に且つ主に増幅することができる。例えば、10⁵野生型対立遺伝子における1つの
突然変異体の感度でH-ras突然変異を検出するために多重ミスマッチプライマー
が使用されており（チャ（Cha）ら、「Mismatch Amplification Mutation Assay
(MAMA): Application to the C-H-Ras Gene」, PCR Methods Appl., 2(1): 14-2
0(1992))、10⁶野生型対立遺伝子における1つの突然変異体と同等の高感度の主張
が報告されている（ハリアソス（Haliassos）ら、「Detection of Minority Poi
nt Mutations by Modified PCR Technique: A New Approach for a Sensitive D
iagnosis of Tumor-Progression Markers」, Nucleic Acid Res., 17:8093-9(19
89)およびチェン（Chen)ら、「A Nonradioactive, Allele-Specific Polymerase
Chain Reaction for Reproducible Detection of Rare Mutations in Large Am
ounts of Genomic DNA: Application to Human K-ras」, Anal. Biochem., 244:
191-4(1997))。しかし、注意深い評価は、これらの成功は、3'側プリン-プリン
ミスマッチによって識別する対立遺伝子特異的プライマーに限定されることを示
唆している。より一般的な転位突然変異では、3'側プライマー末端の識別用ミス
マッチ（すなわち、G:TまたはC:Aミスマッチ）が、野生型DNAの対向プライマー
からの伸長過程中のポリメラーゼエラーにより少量の産物中では除去される。そ
の後、これらのエラー産物が効率的に増幅され、偽陽性シグナルを生じる。この
ポリメラーゼエラー問題を排除するための方法はPCRの早期に野生型DNAを除去す
ることである。

【００１２】 数人の研究者は、少量存在突然変異配列を濃縮するために、制限エンドヌクレ
アーゼ(RE)消化によって野生型DNAの選択的な除去を調査している。これらのREL
P方法は、ポリメラーゼの感度と制限エンドヌクレアーゼの特異性を組み合わせ
ることによって、10⁶以上の野生型において約1つの突然変異体を検出またはより
効果的に検出する。1つの方法は、H-ras遺伝子およびp53遺伝子の制限酵素切断
部位内の非常に低いレベルの突然変異を検出するために、ゲノムDNAの消化、お
よびその後の未切断の断片のPCR増幅（RFLP-PCR）を使用している（サンディ（S
andy)ら、「Genotypic Analysis of Mutations in Taq I Restriction Recognit
ion Sites by Restriction Fragment Length Polymorphism/Polymerase Chain R
eaction」, Proc. Natl. Acad. USA, 89: 890-4(1992)およびプアザンド(Pourza
nd)ら、「Genotypic Mutation Analysis by RFLP/PCR」, Mutat. Res., 88(1):
113-21(1993)）。同様の結果は、消化とその後の突然変異対立遺伝子が濃縮され
た未切断のDNAのPCRと次の増幅（PCR-RFLP）により得られている(クマー（Kumar
)ら、「Oncogene Detection at the Single Cell Level」, Oncogene, 3(6)647-
51(1988); クマー（Kumar)ら、「Designed Diagnostic Restriction Fragment L
ength Polymorphisms for The Detection of Point Mutations in Ras Oncogens
」, Oncogene Res., 4(3): 235-41(1989)およびヤコブソン（Jacobson)ら、「A
Highly Sensitive Assay for Mutant Ras Genes and its Application to the S
tudy of Presentation and Relapse Genotypes in Acute Leukemia」, Oncogene , 9(2): 553-63(1994))。RFLP検出方法は感度が高く、迅速であるが、突然変異
の位置が制限エンドヌクレアーゼ認識配列に一致しなければならないという必要
条件によって限定されている。この限定を克服するために、新たな制限酵素切断
部位を導入するプライマーが「プライマー媒介型（primer-mediated」RFLPにお
いて使用されている（ヤコブソン（Jacobson)ら、「Rapid, Nonradioactives cr
eening for Activating Ras Oncogene Mutations Using PCR-Primer Intoroduce
d Restriction Analysis(PCR-PIRA)」, PCR Methods Appl.,1(4):299(1992);チ
ェン（Chen）ら、「A Method to Detect Ras Point Mutations in Small Subpop
ulations of Cells」, Anal. Biochem., 195(1):51-6(1991);ジ ギセッペ（Di
Giuseppe)ら、「Detection of K-Ras Mutations in Mucinous Pancreatic Duct
Hyperplasia from a Patient with a Family History of Pancreatic Carcinoma
」, Am. J. Pathol., 144(5):889-95(1994);カーン（Kahn)ら、「Rapid and Sen
sitive Nonradioactive Detection of Mutant K-ras Genes Via 'Enriched' PCR
Amplification」, Oncogene, 6: 1079-83(1991);レビ（Levi)ら、「Multiple K
-Ras Codon 12 Mutations in Cholangiocarcinomas Demonstrated with a Sensi
tive Polymerase Chain Reaction Technique」, Cancer Research, 51(7月）: 3
497-502(1991);およびミツドミ（Mitsudomi)ら、「Mutations of Ras Genes Dis
tinguish a Subset of Non-Small-Cell Lung Cancer Cell Lines from Small-Ce
ll Lung Cancer Cell Lines」, Oncogene, 6(8): 1353-62）。しかし、その後の
研究者は、3'側天然塩基ミスマッチを有するプライマーからのポリメラーゼ伸長
によってエラーはすぐ隣の塩基で生じることを実証している（ハットリ（Hattor
i)ら、「Mismatch PCR RFLP Detection of DRD2 Ser311 Cys Polymorphism and
Schizophrenia」, Biochem. Biophys. Res. Commun., 202(2)757-63(1994); オ
デル（O'Dell)ら、「PCR Induction of a TaqI Restriction Site at Any CpG D
inucleotide Using Two Mismatched Primers（CpG-PCR)」, Genome Res., 6(6):
558-68(1996)およびホダノバ（Hodanoba)ら、「Incorrect Assignment of N370
S Mutation Status by Mismatched PCR/RFLP Method in Two Grauchher Patient
s」,J. Inherit. Metab. Dis.,20(4): 611-2(1997)）。このような鋳型は制限消
化中に切断せず、突然変異鋳型から伸長される真の陽性の産物と識別できない偽
陽性として増幅される。

【００１３】 ヌクレオチド類似物を使用することにより、ポリメラーゼ伸長によって生じる
エラーを低下し、塩基変換忠実度を改善することができる。4種の天然塩基の1つ
以上と塩基対形成するように設計されているヌクレオチド類似物は「コンバータ
イド（convertides)」と呼ばれる。異なるコンバータイドに対する塩基導入が試
験されている（フープス(Hoops)ら、「Template Directed Incorporation of Nu
cleotide Mixtures Using Azole-Nucleobase Analogs」, Nucleic Acids Res.,
25(24): 4866-71(1997)）。各類似物について、Taqポリメラーゼおよび内部ヌク
レオチド類似物を含有するプライマーを使用してPCR産物が作製された。作製さ
れた産物は、類似物に対して導入される4種の塩基の特徴的な分布を示した。重
要なことに、これらの産物は、全ての天然の塩基位置に元の配列を維持した。コ
ンバータイドは、互変異性変化（ブラウン（Brown)ら、「Synthesis and Duplex
Stability of Oligonucleotides Containing Adenine-Guanine Analogues」, C arbohydrate Research , 216: 129-39(1991)）、結合回転（バーグストローム(Be
rgstrom)ら、Nucleosides and Nucleotides, 15(1-3): 59-68(1996))または塩基
スタッキング（バーグストローム(Bergstrom)ら、Journal of the American Che mical Society , 117: 1201-9(1995)およびツアング（Zhang)ら、「Exploratory
Studies on Azole Carboxamides as Nucleobase Analogs: Thermal Denaturatio
n Studies on Oligodexyribonucleotide Duplexes Containg Pyrrole-3-Carboxa
mide」, Nucleic Acids Res., 26: 2208-15(1998))による異なる水素結合パター
ンを取る能力によって縮重増幅産物を容易に作製する。従って、コンバータイド
を含有するPCRプライマーは塩基変換を促進するために使用することができる。
原則として、プライマーの3'側末端においてC-様およびT-様の両互変異性型を示
すことが知られている、6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7
-オン類似物Q₆を使用して（ブラウン(Brown)ら、「Synthesis and Duplex Stabi
lity of Oligonucleotides Containing Adenine-Guanine Analogues」, Cabohyd rate Research , 216: 129-39(1991)）、C-G塩基対をT-A塩基対に変換することが
できる（図1）。よりよい幾何学のために、DNAポリメラーゼは、T-Gミスマッチ
ではなく、Q₆-G対からよりよく「読み取り（read)」または伸長することができ
る（ゆらぎ塩基対）。同様に、DNAポリメラーゼはQ₆に対してG塩基およびA塩基
を「書き込み(write)」または導入することができる（ヒル（Hill)ら、「Polyme
rase Recognition of Synthetic Oligodeoxyribonucleotides Incorporating De
generate Pyrimidine and Purine Bases」, Pro. Natl. Acad. Sci.,USA,95(8）
:4258-63(1998))が、A塩基は常にT塩基に対して挿入される。従って、Q₆類似物
プライマーは中間体として作用し、縮重プールから望ましい産物を選択的に増幅
するために天然の塩基プライマーが添加される前に、「前変換段階（preconvers
ion step)」を提供する。ヌクレオチド類似物は大きな可能性を有するが、それ
らは高感度アッセイ法において試験されていない。PCR方法において類似物の変
換の忠実度を最適化する方法の必要性がある。

【００１４】 PCR/RE/LDRの最適化 上記に考察するように、高忠実度変換方法を用いたPCRは、突然変異遺伝子配
列を増幅するための有用な方法を提供すると思われる。1つ以上のミスマッチを
有するプライマーを設計することによって、突然変異DNA鋳型を効率的に伸長す
ることができるが、野生型DNA鋳型の伸長は悪い。しかし、これらのプライマー
がミスマッチの有無にかかわらず伸長すると、産物はその後のPCRサイクルのプ
ライマーも完全なマッチとなる。従って、偽陽性シグナルがその後のサイクルで
増幅される。さらに、PCRエラーは、プライマーに完全にマッチする鋳型の塩基
変化を作製することがある。AS-PCRは10⁵中1の感度でピリミジン←→プリン塩基
変換を検出することができる（ニュートン（Newton)ら、「Analysis of Any Poi
nt Mutation in DNA. The Amplification Refracttory Mutation System(ARMS)
」, Nucleic Acids Res., 17(7）:2503-16(1989）およびタダ（Tada)ら、「Dete
ction of Ras Gene Mutations in Pancreatic Juice and Peripheral Blood of
Patients with Pancreatic Adenocarcinoma」, Cancer Res., 53(11):2472-4(19
93))。にもかかわらず、癌関連突然変異の大多数はC←→TおよびA←→G転位であ
り、例えば、p53点変異の80%を上回る（デ フロメンテル（de Fromrntel)ら、G enes Chromosomes Cancer , 4(1):1-15(1992)）。DNA診断方法はこの種の少量存
在（low abundance）突然変異を正確に定量するために必要とされる。

【００１５】 PCRと併用したライゲーション検出反応（LDR）は、少量のPCR伸長産物を定量
するために使用されている。LDRは、DNA配列の任意の位置に見いだされる可能性
のある4種の塩基全てを識別するために、2つの隣接するプライマーと熱安定性リ
ガーゼを使用する（バラニー（Barany, F.）、「Genetic Disease Detection an
d DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase」, Pro. Natl. Acad. Sci.,USA , 88: 189-93(1991);バラニー（Barany, F.）、「The Ligase Chain R
eaction in a PCR World」,PCR Methods Appl.,1:5-16(1991);デイ（Day）ら、
「Detection of Steroid 21-Hydroxylase Alleles Using Gene-Specific PCR an
d a Multiplexed Ligation Detection Reaction」, Genomics, 29:152-62(1995)
およびカーナ（Khanna)ら、Oncogene, 18: 27-38(1999)）。熱安定性リガーゼは
、識別用塩基が上流プライマーの3'側末端に配置されると、最も高い忠実度を示
す（ルオ（Luo)ら、「Improving the Fidelity of Thermus Thermophilus DNA L
igase」, Nucleic Acids Res., 24(15):3071-8(1996)）。PCR/LDR(ゲノムDNA由
来の配列PCRおよびその後のLDR)は、4,000の正常な対立遺伝子中で約1つの突然
変異対立遺伝子の感度で突然変異を検出することができる（カーナ(Khanna)ら、 Oncogene , 18: 27-38(1999)）。10⁶中約1の感度は、野生型のPCRに制限エンドヌ
クレアーゼ消化を組み合わせることによって達成された（サンディ（Sandy)ら、 Pro. Natl. Acad. Sci.,USA ,89:890-4(1992）およびプアザンド(Pourzand)ら、
「Genotypic Mutation Analysis by RFLP/PCR」, Mutant. Res., 288(1):113-21
(1993))。制限酵素切断部位内に生じる突然変異は突然変異対立遺伝子を切断さ
せないが、規定の制限酵素切断部位配列を保有する野生型対立遺伝子は欠失され
る。結果として、その後のPCRサイクルは主に突然変異DNAを増幅する。突然変異
部位が野生型DNAに存在するエンドヌクレアーゼ認識部位内に存在しない場合に
は、制限酵素切断部位を導入しなければならない。これは、ミスマッチ塩基を有
するプライマーを使用したPCRによって典型的に実施される。突然変異はプライ
マーが及ぶ制限酵素切断部位のどの部分においても検出できるわけではない。そ
の理由はそれらの塩基はプライマーによって直接導入されるからである。ランダ
ムDNA配列では、塩基の20%以上は既存の4塩基の制限酵素切断部位内に含有され
、塩基の60%は、1塩基変更によって制限酵素切断部位内で変換されることがある
4塩基部分列内にある。これらの小さい部位では、3'側末端塩基ミスマッチプラ
イマーを使用しなければならないことが多い。概念的にはまっすぐであるが、3'
側ミスマッチ伸長は困難であることが証明されている（ニュートン（Newton)ら
、「Analysis of Any Point Mutation in DNA. The Amplification Refractory
Mutation System(ARMS)」, Nucleic Acids Res., 17(7): 2503-16(1989; クウォ
ク（Kwok)ら、「Effects of Primer-Template Mismatches on the Polymerase C
hain Reaction: Human Immunodeficiency Virus Type 1 Model Studies」, Nucl eic Acids Res. ,18(4): 999-1005(1990); オデル（O'Dell)ら、Genome Res., 6(
6): 558-68(1996)およびデイ（Day)ら、Nucleic Acids Res.,(1999)）。分断パ
リンドローム制限酵素切断部位を導入することは、一方の半分の部位から介在塩
基を介してもう一方の半分の部位に及ぶ内部ミスマッチプライマーを使用してさ
らに成功している（クマー（Mumar)ら、「Oncogen Detection at the Single Ce
ll Level」, Oncogene, 3(6)647-51(1988)およびアンダーソン（Anderson)ら、
「Prevalence of RAS Oncogene Mutation in Head and Neck Carscinomas」, J. Otolaryngol. , 21(5): 321-6(1992)）。いくつかの完全にマッチした塩基はミ
スマッチプライマーの3'側末端を安定化する。しかし、この方法は、第2の半分
の部位が野生型DNAに天然に存在する場合にのみ使用することができる。第2の半
分の部位の突然変異は消化されない。認識配列内の塩基に生ずる突然変異だけが
RFLP方法によって検出可能である。野生型DNAの既存の制限酵素切断部位以外の
塩基に生ずる突然変異は、その塩基を含有する新たな制限酵素切断部位を導入す
ることによって検出することができる。

【００１６】 分断パリンドロームを認識制限エンドヌクレアーゼは近接する4塩基および6塩
基部位を認識するエンドヌクレアーゼより存在度が低い。分断パリンドロームを
制限酵素切断部位に導入して任意の塩基の突然変異を同定するためには、多重の
塩基変更を必要とすることが多い。

【００１７】 さらに最近では、プローブライゲーション方法によって既知の標的配列を同定
する方法が報告されている。ウィテリー（M. N. Whiteley）らに付与された米国
特許第4,883,750号、ウ（D. Y. Wu)ら、Genomics 4: 560(1989)、ランデグラン
（U. Landegren）ら、Science 241: 1077(1988)およびウィン-ディーン（E. Win
n-Deen）ら、Clin. Chem. 37: 1522(1991)。オリゴヌクレオチドライゲーション
アッセイ法（「OLA」）として周知の1つの方法では、対象となる標的領域におよ
ぶ2つのプローブまたはプローブ要素を標的領域にハイブリダイゼーションする
。プローブ要素が隣接標的塩基と塩基対形成する場合には、プローブ要素の直面
する末端は、例えば、リガーゼで処理することによってライゲーションされるこ
とにより結合することができる。次いで、リガンドプローブ要素がアッセイされ
、標的配列の存在を示す。

【００１８】 この方法の改良法では、リガンドプローブ要素は、相補的なプローブ要素の塩
基対形成のための鋳型としてはたらく。プローブ要素の塩基対の存在下におて変
性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのサイクルを継続すると、標
的配列が鎖状に増幅され、ごく少量の標的配列の検出および/または増幅を可能
にする。この方法はリガーゼ検出反応と呼ばれる。プローブ要素の2つの相補的
な塩基対を使用する場合には、この方法はリガーゼ連鎖反応と呼ばれ、標的配列
を指数的に増幅する。バラニー（F. Barany),「Genetic Disease Detection and
DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase」,Pro. Natl. Acad. S ci.,USA , 88: 189-93(1991）およびバラニー(F. Barany)、「The Ligase Chain
Reaction(LCR) in a PCR World」, PCR Methods and Applications, 1: 5-16(19
91); バラニー（Barany）、1999年3月19日に提出された米国特許出願第S/N60/12
5,251号。突然変異濃縮を使用するPCR/LDRなどの技法は、ランダムPCRエラーを
最小にするために、反応条件の最適化を必要とする。これらのエラーは、臨床試
料に最初に存在する突然変異と識別できないと思われる。エラー-最小化の1つの
方法はPCRの緩衝液条件の最適化に見いだすことができる。標準的なPCR緩衝液は
トリスを含有するが、トリスのpK_aは温度に強く依存する。pH 8.3(23℃において
測定)のトリスを含有するPCR反応液は約65℃（伸長温度）において約pH7であり
、約95℃（鋳型融解温度）において約pH6に低下する。PCRエラーは鋳型分解およ
びポリメラーゼ誤導入（misincorporation)によって生じることがある。鋳型の
分解は、各PCRサイクルの高温および低pH期間に生じ、「long」PCRではサイズを
制限する（バーンズ（Barnes)、「PCR Amplification of up to 35-Kb DNA with
High Fidelity and High Yield from Lambda Bacteriophage Tmplates」,Pro. Natl. Acad. Sci.,USA , 91(6): 2216-20(1994);チェン（Cheng)ら、「Effective
Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA
」,Pro. Natl. Acad. Sci.,USA, 91(12):5695-9(1994)およびサン（Sang)ら、「
Generation of Site-Directed Mutagenesis by Extralong, High-Fedelity Poly
merase Chain Reaction」,Anal. Biochem., 233(1):142-4(1996)）。ロングPCR
（long PCR）の緩衝液（トリス9.1を使用）のpHを上昇させると鋳型切断量を低
下し、PCR効率を増加する（バーンズ（Barnes)、「PCR Amplification of up to
35-Kb DNA with High Fidelity and High Yield from Lambda Bacteriophage T
emplates」,Pro. Natl. Acad. Sci.,USA, 91(6）:2216-20(1994))。ロングPCRの
効率はpHが上昇すると増加するが、高pHはTaqおよびPfuポリメラーゼの忠実度を
低下するので、これらのPCR産物内の突然変異レベルが増加することがある（エ
カート（Eckert）ら、「High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquqtic
us DNA Polymerase」,Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990);エカート（E
ckert）ら、「DNA Polymerase Fidelity and the Polymerase Chain Reaction」
, PCR Methods Appl., 1(1):17-24(1991)およびクリン（Cline)ら、「PCR Fidel
ity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases」,Nucle ic Acids Res. , 24(18):3546-51(1996))。より低い｜ΔpKa｜の別のPCR緩衝液を
使用すると、より広い温度範囲にわたってより中性のpHを維持することによって
忠実度を改善し、さらに鋳型の損傷を低下することができる（エカート（Eckert
)ら、「DNA Polymerase Fidelity and the Polymerase Chain Reaction」, PCR Methods appl. , 1(1):17-24(1991)およびブレイル（Brail)ら、「Improved Poly
merase Fidelity in PCR-SSCPA」, Mutat. Res., 303(4): 171-5(1993)）。グリ
セロールまたはホルムアミドを添加すると、PCRサイクル中の鋳型の損傷によっ
て生ずる突然変異を低下することができ、ミス塩基対形成プライマーからのミス
伸長を回避する働きをすることができる（ボテマ（Bottema)ら、「PCR Amplific
ation of Specific Alleles: Rapid Detection Of Known Mutaions and Polymor
phisms」,Mutat. Res., 288(1):93-102(1993)およびチャ（Cha)ら、「Mismatch
Amplification Mutation Assay(MAMA): Application to the C-H-Ras Gene」,PC R Methods Appl. ,2(1): 14-20(1992)）。

【００１９】 従って、PCRエラーによって生ずるミスマッチの機会を最小にするために、PCR
に現在使用されている緩衝液反応条件を改善する必要がある。類似物の変換忠実
度だけでは突然変異DNA検出の方法の改善の必要性を解決しない。また、ランダ
ムPCRエラーを低下させるためにPCR反応条件を最適化する必要性があり、最後に
PCR伸長産物を感度の高く検出する方法が必要とされる。

【００２０】 発明の概要 本発明は、複数の標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列から、1つま
たは複数の単塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数の少
量存在配列を同定するための方法に関する。本発明の方法は、第1のポリメラー
ゼ連鎖反応段階、第2のポリメラーゼ連鎖反応段階、および制限エンドヌクレア
ーゼ消化反応段階およびその次の第3のポリメラーゼ連鎖反応段階およびリガー
ゼ検出反応段階を含む。

【００２１】 本発明の出発試料は、試料に存在する大量存在標的配列との少なくとも1配列
の差を各々有する1つ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列を含有する可能性の
ある試料である。

【００２２】 第1のポリメラーゼ連鎖反応段階では、一次オリゴヌクレオチドプライマーセ
ットが提供される。一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、標的特異的部
分を含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分を含有
する第2のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。一次オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする対応する大量存在お
よび少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖のハイブリダイゼーションに好適で
ある。しかし、プライマーは各々、試料に存在する任意の他のヌクレオチド配列
にハイブリダイゼーションされる場合には、このようなポリメラーゼ連鎖反応産
物の形成を分断するミスマッチを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマー、
試料およびポリメラーゼを混和して、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成す
る。

【００２３】 一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、変性処理、ハイブリダイゼーション処理
および伸長処理を含む1サイクル以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施す
る。変性処理はハイブリダイゼーションされる核酸配列を分離する。ハイブリダ
イゼーション処理は、一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分を標
的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせる。伸長処理は、ハイブリダ
イゼーションした一次オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、一次オリゴ
ヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする標的ヌクレオチド配列に
相補的な一次伸長産物を形成させる。

【００２４】 次に、第2のポリメラーゼ連鎖反応段階が継続する。この段階は、標的特異的
部分と5'側上流二次プライマー特異的部分を有する第1のヌクレオチドプライマ
ーおよび標的特異的部分と5'側上流二次プライマー特異的部分を有する第2のヌ
クレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。特定のセットの二次オリゴ
ヌクレオチドプライマーは、大量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を含有または作製し、1つ以上の少量存在標的を増幅する場合に
は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有または作製しない二次ポリメラーゼ連
鎖反応産物の形成を可能にする一次伸長産物の相補鎖のハイブリダイゼーション
に好適である。一次伸長産物、二次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメ
ラーゼを混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。

【００２５】 二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、変性処理、ハイブリダイゼーション処理
および伸長処理を含む1サイクル以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施す
る。変性処理はハイブリダイゼーションされる核酸配列を分離する。ハイブリダ
イゼーション処理では、二次オリゴヌクレオチドプライマーを一次伸長産物にハ
イブリダイゼーションする。伸長処理により、ハイブリダイゼーションした一次
伸長産物は、ハイブリダイゼーションした一次伸長産物に相補的な二次伸長産物
を作製する。大量存在二次伸長産物は制限酵素切断部位を含有するが、少量存在
二次伸長産物は制限酵素切断部位を含有しない。

【００２６】 次の段階は、制限エンドヌクレアーゼを二次伸長産物と混和して、エンドヌク
レアーゼ消化反応混合物を形成する。制限エンドヌクレアーゼは、特異的に、制
限エンドヌクレアーゼ認識部位を切断する、または二次伸長産物中の大量存在標
的を増幅する場合に作製されるが、少量存在標的の場合には作製されないもので
ある。制限エンドヌクレアーゼ消化は、大量存在二次伸長産物を選択的に切断す
る。

【００２７】 次に、第3のポリメラーゼ連鎖反応段階が継続する。この段階は、二次オリゴ
ヌクレオチドプライマーセットの第1のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上
流部分と同じ配列を含有する第1の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチ
ドプライマーセットの第2のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上流部分と同
じ配列を含有する第2の三次プライマーを有する三次オリゴヌクレオチドプライ
マーセットを提供する段階を含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは
二次伸長産物の全てを増幅するために使用することができる。二次伸長産物を三
次オリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混和し、三次ポリ
メラーゼ連鎖反応混合物を形成する。

【００２８】 三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、変性処理、ハイブリダイゼーション処理
および伸長処理を含む1サイクル以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施す
る。変性処理はハイブリダイゼーションされる核酸配列を分離し、ハイブリダイ
ゼーション処理は、二次伸長産物にハイブリダイゼーションするために、三次オ
リゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイゼーションすることを含む。伸長処
理中、ハイブリダイゼーションした三次オリゴヌクレオチドプライマーは伸長さ
れて、未切断の二次伸長産物に相補的な三次伸長産物を作製する。

【００２９】 次に、三次伸長産物にリガーゼ検出反応を実施する。これは、各セットが、三
次伸長産物特異的部分と検出可能なレポーター標識を有する第1のオリゴヌクレ
オチドプローブおよび三次伸長産物特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチ
ドプローブを有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階
を含む。特定のLDRプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的な
三次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイゼーションされる場合の
ライゲーションに好適である。しかし、試料に存在する任意の他のヌクレオチド
配列にハイブリダイゼーションする場合には、このようなライゲーションを分断
するミスマッチが存在する。

【００３０】 三次伸長産物、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混
和して、リガーゼ検出反応混合物を形成する。

【００３１】 リガーゼ検出反応混合物に、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を有
する1サイクル以上のリガーゼ検出反応サイクルを実施する。変性処理は、三次
伸長産物からハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドを分離する段階を
含む。ハイブリダイゼーション処理では、オリゴヌクレオチドプローブセットが
、三次伸長産物が存在する場合には、それらのそれぞれの三次伸長産物に塩基特
異的に隣接部位にハイブリダイゼーションする。結果として、隣接するプローブ
が互いにライゲーションして、一体として結合している検出可能なレポーター標
識および三次伸長産物特異的部分を含有するライゲーション産物配列を形成する
。オリゴヌクレオチドプローブセットは、それぞれの相補的な三次伸長産物では
なくヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることがあるが、1つ以上の
ミスマッチの存在により一体としてライゲーションされず、変性処理中個別に分
離する。このライゲーション検出反応サイクルにより、試料中の1つ以上の少量
存在標的ヌクレオチド配列の存在を示すライゲーション産物配列のレポーター標
識が検出される。

【００３２】 本発明はまた、複数の標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列から、1
つまたは複数の単塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数
の少量存在配列を同定するためのキットに関する。本発明のキットは、一次オリ
ゴヌクレオチドプライマーセットと、二次オリゴヌクレオチドプライマーセット
と、三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、複数のオリゴヌクレオチドプ
ローブセットとを提供する。

【００３３】 本発明に提供される一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、(a)標的特
異的部分を含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、(b)標的特異的部分
を含有する第2のオリゴヌクレオチドプライマーとを有する。一次オリゴヌクレ
オチドプライマーは、対応する高および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖
にハイブリダイゼーションして一次伸長産物を作製するのに好適である。しかし
、プライマーは、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイ
ゼーションするとき、このようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミ
スマッチを有する。

【００３４】 本発明のキットに提供される二次オリゴヌクレオチドプライマーは、(a)標的
特異的部分と5'側上流二次プライマー特異的部分とを含有する第1のオリゴヌク
レオチドプライマーおよび(b)標的特異的部分と5'側上流二次特異的部分とを含
有する第2のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。二次オリゴヌクレオチド
プライマーは、大量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を含有または作製し、1つ以上の少量存在標的を増幅する場合には制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を含有または作製しない二次伸長産物の形成を可能にする
一次伸長産物の相補鎖のハイブリダイゼーションに好適である。

【００３５】 本発明のキットに提供される三次オリゴヌクレオチドプライマーは、(a)二次
オリゴヌクレオチドプライマーセットの第1のオリゴヌクレオチドプライマーの5
'側上流部分と同じ配列を含有する第1の三次プライマーおよび(b)二次オリゴヌ
クレオチドプライマーセットの第2のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上流
部分と同じ配列を含有する第2の三次プライマーを有する三次オリゴヌクレオチ
ドプライマーセットを有する。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは二次
伸長産物の全てを増幅するために使用することができる。

【００３６】 本発明のキットはまた、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する
。各セットは、(a)三次伸長産物特異的部分と検出可能なレポーター標識とを含
有する第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび(b)三次伸長産物特異的部分を含
有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する。特定のセットのオリゴヌク
レオチドプローブは、相補的な三次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブ
リダイゼーションされるとき、一体としてライゲーションされるのに好適である
。しかし、プローブは、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブ
リダイゼーションするとき、このようなライゲーションを妨害するミスマッチを
有する。

【００３７】 増幅および検出段階において多数のエラーの可能性を生ずることなく、複数の
標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列から、1つまたは複数の単塩基の
変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数の少量存在配列を検出し
、同定するのに十分な感度のある現在利用可能な生物学的技法はない。本発明は
、ポリメラーゼ連鎖反応および制限エンドヌクレアーゼ消化により少量存在DNA
標的を選択的に増幅する条件を最適化する方法および、組み合わせたとき、突然
変異遺伝子などの少量存在ヌクレオチド配列を増幅し、検出するための高感度な
方法となるヌクレオチド検出方法に関する。本発明の手法は臨床および研究用途
に有用である。

【００３８】 発明の詳細な説明 本発明は、多数の標的ヌクレオチド配列の中で、大量存在配列と1以上の1塩基
変化、挿入、または欠失により異なる1以上の少量存在配列を同定する方法に関
するものである。本方法はポリメラーゼ連鎖反応第1相、ポリメラーゼ連鎖反応
第2相、制限エンドヌクレアーゼ消化反応相、続くポリメラーゼ連鎖反応第3相お
よびリガーゼ検出反応相を含む。

【００３９】 本発明の開始試料は、試料中に存在する大量存在標的配列の各々と少なくとも
1つの配列差異を有する1以上の少量存在標的ヌクレオチドを潜在的に含んでいる
。

【００４０】 ポリメラーゼ連鎖反応第1相において、一次オリゴヌクレオチドプライマーセ
ットが与えられる。一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、標的特異的部
分を含む1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分を含む2番
目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、相当する高および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイ
ゼーションするために適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にす
る。しかしながら各プライマーは試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配
列にハイブリダイズした時も、そのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を阻
害するミスマッチを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマー、試料およびポ
リメラーゼが一次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成するために混和される。

【００４１】 一次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理
、および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。変
性処理はハイブリダイズしている核酸配列を分離する。ハイブリダイゼーション
処理は一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド
配列にハイブリダイズさせる。伸長処理は一次オリゴヌクレオチドプライマーが
ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列に相補的な一次伸長産物を形成するた
めに、ハイブリダイズした一次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長される。

【００４２】 高頻度の一次ポリメラーゼ連鎖反応産物を、制限エンドヌクレアーゼ部位を含
む二次ポリメラーゼ連鎖反応産物に変換する効率および忠実度は、二次オリゴヌ
クレオチドプライマーセットを与える前にある操作（前変換という）を実施する
ことにより改善されるかもしれない。この操作は（a）標的特異的部分を有する1
番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（b）標的特異的部分を有する2番目
のオリゴヌクレオチドプライマー、を有する前二次オリゴヌクレオチドプライマ
ーセットを与えることからなる。標的特異的部分は二次オリゴヌクレオチドプラ
イマーセットと同一または実質的に同一であるが、少なくとも1つのプライマー
は1以上のヌクレオチド類似体を含む。特定の前二次プライマーセットのオリゴ
ヌクレオチドは一次伸長産物の相補鎖へのハイブリダイゼーションに適している
。一次伸長産物は変性され、そして一次伸長産物はポリメラーゼおよび前二次オ
リゴヌクレオチドプライマーと混合され、前二次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を
形成する。混合液は前二次ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする2以上
のPCRサイクルに供される。この産物は1以上のヌクレオチド類似体および反対鎖
の塩基変化を含み、続く二次ポリメラーゼ連鎖反応において、一次ポリメラーゼ
連鎖反応産物配列を制限エンドヌクレアーゼ認識部位に変換することを容易にす
る。

【００４３】 次に、ポリメラーゼ連鎖反応第2相である。この相は標的特異的部分および5'
上流二次プライマー特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマー
および標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する2番目の
オリゴヌクレオチドプライマーを有する二次オリゴヌクレオチドプライマーセッ
トを提供することを含む。特定の組において二次オリゴヌクレオチドプライマー
は一次伸長産物の相補鎖へのハイブリダイゼーションに適しており、大量存在標
的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むまたは創生するが、
1以上の少量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含ま
ないまたは創生しない二次ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする。一次
伸長産物、二次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが二次ポリ
メラーゼ連鎖反応混合液を形成するために混和される。

【００４４】 二次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理
、および伸長処理を備える2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。
変性処理はハイブリダイズしている核酸配列の分離を含む。ハイブリダイゼーシ
ョン処理では二次オリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長産物にハイブリダイ
ズする。伸長処理はハイブリダイズされた一次伸長産物に、一次伸長産物に相補
的な二次伸長産物を形成させる。大量存在二次伸長産物は制限酵素切断部位を含
むが、少量存在二次伸長産物は含まない。

【００４５】 次の相は制限エンドヌクレアーゼを二次伸長産物と混合し、エンドヌクレアー
ゼ消化反応混合液を形成することを含む。制限エンドヌクレアーゼは、内部のま
たは大量存在標的が増幅された際に創生された制限エンドヌクレアーゼ認識部位
を認識および切断するが、二次伸長産物中の少量存在標的に対しては行わないも
のである。制限エンドヌクレアーゼ消化は選択的に大量存在二次伸長産物を破壊
する。

【００４６】 次に、ポリメラーゼ連鎖反応第3相である。これは、二次オリゴヌクレオチド
プライマーセットの1番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同一
の配列を含む1番目の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチドプライマー
セットの2番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同一の配列を含
む2番目の三次プライマーを有する三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを
提供することを含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは全二次伸長産
物を増幅するために使用されてもよい。二次伸長産物は三次オリゴヌクレオチド
プライマーセットおよびポリメラーゼと混和され、三次ポリメラーゼ連鎖反応混
合液を形成する。

【００４７】 三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理
、および伸長処理を備える2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。
変性処理はハイブリダイズしている核酸配列を分離し、一方ハイブリダイゼーシ
ョン処理では三次オリゴヌクレオチドプライマーが二次伸長産物にハイブリダイ
ズするためのハイブリダイゼーションを含む。伸長処理中には、ハイブリダイズ
された三次オリゴヌクレオチドプライマーが二次伸長産物に相補的な三次伸長産
物を形成さるために伸長される。

【００４８】 次に三次伸長産物はリガーゼ検出反応に供される。これは各組が三次伸長産物
特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する1番目のオリゴヌクレオチ
ドプローブ、および三次伸長産物特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチ
ドプローブを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供すること
を含む。特定の組のオリゴヌクレオチドプローブは相補的三次伸長産物特異的部
分上でお互いに隣接してハイブリダイズされる時、共にライゲーションされるこ
とに適する。しかしながら試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配列にハ
イブリダイズした時もそのようなライゲーションを阻害するミスマッチが存在す
る。

【００４９】 三次伸長産物、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼが
リガーゼ検出反応混合液を形成するために混和される。

【００５０】 リガーゼ検出反応混合液は、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含
む1以上のリガーゼ検出反応サイクルに供される。変性処理はハイブリダイズし
ているオリゴヌクレオチドの三次伸長産物からの分離を含む。ハイブリダイゼー
ション処理においては、オリゴヌクレオチドプローブセットは、もし存在するな
らば、各々の三次伸長産物に塩基特異的様式で隣接部位にハイブリダイズする。
結果として隣接プローブはお互いに連結され、検出可能レポーター標識および互
いに連結された三次伸長産物特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成す
る。オリゴヌクレオチドプローブセットは各々の相補的三次伸長産物以外のヌク
レオチド配列にハイブリダイズするかもしれないが、1以上のミスマッチが存在
するために互いに連結されず、変性処理の間に各々が分離される。リガーゼ検出
反応サイクルに続いて、ライゲーション産物配列のレポーター標識が検出され、
それは試料中に1以上の少量存在標的ヌクレオチド配列が存在することを示して
いる。

【００５１】 図1は本発明の方法に従ったPCR/RE/LDRによる変異DNAの増幅および検出の概略
図である。その過程は正常、すなわち野生型の大量存在配列および、あるいはガ
ン遺伝子等の低頻度のその配列の変異体を含む試料を用いて開始される。図1で
は変異型および野生型の配列を比較しており、それらは1塩基に関してのみ異な
ることが明らかである。野生型配列では識別塩基は「C」であり一方変異型配列
は相当する場所に「T」を有する。

【００５２】 最初に、試料は改変型標的配列を創生する一次PCR段階に供される。図1の段階
1および2に示される一次PCR操作では、野生型および変異型DNAが94℃の変性を受
け、1重鎖DNA鋳型を創生する。図1の段階1に示されるように、各々3'末端ヌクレ
オチド類似体を含むプライマーAおよびBがその1重鎖DNA鋳型にアニールする。ポ
リメラーゼにより促進され、類似体プライマーは図1の段階2で示される伸長操作
を受ける。2重鎖核酸を変性し、結果として生じる1重鎖核酸にプライマーをハイ
ブリダイズさせ、プライマーを伸長するこの過程が定法のPCR操作に従って繰り
返され、ヌクレオチド類似体を含む改変型標的配列体の形で伸長産物を大量に産
生する。ポリメラーゼ連鎖反応過程は、これにより参考文献により組み入れられ
た、H.Erlichら「ポリメラーゼ連鎖反応最近の進展（Recent Advances in Po
lymerase Chain Reaction）」Science 252：1643〜50（1991）、M.Innisら「 PCR実験法：方法および応用入門書（PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications） 」Academic Press：ニューヨーク（1990）、およびR.Sa
ikiら「熱安定性DNAポリメラーゼを用いたプライマー指向性のDNAの酵素増幅（P
rimer-directed Enzymatic Amplification of DNA with Thermostable D
NA Polymerase）」Science 239：487〜91（1998）に完全に記載されている。
本発明に従ったPCR使用のさらなる詳細は以下の実施例で提供される。

【００５３】 図1の段階1に示されるように野生型および変異型配列はこれら配列の識別塩基
の近位に相補的なX：WおよびY：Z塩基対を有する。これらの配列が一次PCR操作
において変成されると、プライマーAおよびBは、QがYおよびW塩基に結合するよ
うにこれらの配列にハイブリダイズするように構成される。一次PCR段階の引き
続くサイクルではポリメラーゼは今度は鋳型鎖となっている中に存在するQ類似
体に遭遇する。ポリメラーゼは類似体をいくつかの塩基のなかの1つとして「読
み取る」ことができ、Qの反対側に事実上は相同体に「相補的である」いくつか
の異なる塩基の1つを「書き込む」だろう。そのような部位では異なる塩基が取
りこまれうるので、産物は縮重され、理想的には産物プールの中でQ類似体の反
対側の同一部位にG、A、TおよびCを有する。これらの縮重塩基は「N」で示され
る。図1の段階2に示されるように、野生型および変異型配列両者において形成さ
れるミスマッチは塩基「N」で示される。

【００５４】 本発明に適するヌクレオチド類似体は以下のものを含み、ただしそれに限定し
ない：Q1、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボアミ
ド；Q2、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-3-ニトロピロール；Q5、2'-
デオキシイノシン；Q6、6-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-6H,8H-3,4-ジ
ヒドロピリミド[4,5-c][1,2] オキサジン-7-ワン；Q7、2-アミノ-7-（2'-デオキ
シ-β-D-リボフラノシル）-6-メトキシアミノプリン、Q16；1-（2'-デオキシ-β
-D-リボフラノシル）-4-ヨードピラゾール；Q18、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフ
ラノシル）ピロール-3-カルボキサミド；Q19、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラ
ノシル）-4-ニトロピラゾール。

【００５５】 次に図1の段階3に示されるように二次PCR相が実施される。二次PCR相のオリゴ
ヌクレオチドプライマーセットは標的特異的部分および5'上流二次プライマー特
異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分
および5'上流二次プライマー特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを有する。これらは図1の段階3においてプライマー「C」および「D」に
より表される。二次PCR相中に、二次PCRプライマーの標的特異的部分は一次伸長
産物の相補鎖にハイブリダイズするであろう。図1の段階3に示されるようにこれ
らのハイブリダイズされたプライマーは続いてポリメラーゼを用いて図1の段階3
に示されるような二次PCR伸長産物を形成するために伸長される。2重鎖核酸の変
性、プライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を含む、二次PCR
相は、一次PCR伸長産物が十分に増幅されるまで2〜20PCRサイクル繰り返される
。

【００５６】 図1に示されるように変異型配列対野生型配列における「T」対「C」の各差異
のために、野生型配列に由来する二次伸長産物内の制限エンドヌクレアーゼ（RE
）部位を認識する適切なREを用いて二次伸長産物は処理することができる。しか
しながら変異型核酸配列に由来して形成される二次PCR伸長産物は制限エンドヌ
クレアーゼ部位を含まない。図1の実施態様では野生型配列に由来する二次伸長
産物内に組み入れられた制限エンドヌクレアーゼ認識部位はTaqI認識部位5'-TCG
A-3'である。TaqIは2重鎖DNA二次伸長産物の各鎖において認識部位内のTおよびC
の間で特異的に切断する。しかしながら他の制限エンドヌクレアーゼ部位および
それらの相当する制限エンドヌクレアーゼが代わりに用いられることができるで
あろう。

【００５７】 大量存在標的に制限酵素切断部位が組み入れられると、制限酵素切断部位ヌク
レオチド配列が消化されうる条件下で、適切な制限エンドヌクレアーゼが添加さ
れる。微生物に由来する制限エンドヌクレアーゼはヌクレオチド鎖内でDNAを切
断する酵素である。各制限エンドヌクレアーゼはDNA配列内の4から8残基長の特
異的な短いオリゴヌクレオチドを認識する。適切な条件下でREは制限酵素切断部
位内のリン酸ジエステル結合において各鎖を切断する。制限エンドヌクレアーゼ
は純粋なDNA試料をゲル電気泳動により容易に分離できる一貫して再現性の高い
断片に切断する。数百の制限エンドヌクレアーゼが同定され、商業的に利用可能
である。これにより参考文献により組み入れられたDarnellら「高分子操作（Man ipulating Macromolecules） 」Molecular Cell Biology第2版、ニューヨーク
、W.H.Freeman and Companyの189〜225ページ（1990）を参照されたい。本発
明の方法にしたがってどのようなREも使用することができる。使用されるREの選
択は開始試料中のDNAに対して利用可能な情報に基づいて行われる。遺伝子内に
生じるRE部位は本発明の方法を使用する前に、ゲンバンク等の資源、DNAが商業
的に得られたならばメーカーを通じて容易に利用可能であり、または遺伝子研究
の一部として同定されているであろう。本発明のPCR相のプライマー設計は遺伝
子内の制限酵素切断部位の知識に基づいて行われる。RE部位の同定はDNAマッピ
ングおよびDNAクローン化により容易に決定される。これにより参考文献により
組み入れられたWatsonら「インビトロ変異導入（In Vitro Mutagenesis）」組 換えDNA（Recombinant DNA） 第2版、ニューヨーク、ニューヨーク、W.H.Freema
n and Companyの191〜194ページ（1983）を参照されたい。制限エンドヌクレ
アーゼによる完全切断のための最適条件は特異的である。消化は特定のREに対す
るメーカーの推奨またはこれにより参考文献により組み入れられたSambrookら「 分子クローン化（Molecular Cloning）研究室便覧（A Laboratory Manual）
」第2版、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク（1989）により実施
されるべきであろう。

【００５８】 二次伸長産物の制限エンドヌクレアーゼ処理後、三次PCR過程が実施される。
図1段階6に示されるように、これは、二次オリゴヌクレオチド組の1番目のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む普遍的プライマー（U1
）である1番目の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチド組の2番目のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む2番目の三次プライマ
ーを提供することを含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは制限エン
ドヌクレアーゼ処理された二次伸長産物の増幅に使用することができる。二次伸
長産物は、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成するために、三次オリゴヌク
レオチドプライマーセットおよびポリメラーゼとともに混和される。

【００５９】 三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、2重鎖核酸の変性、結果として生じる1重
鎖核酸に対する三次オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション、
およびハイブリダイズしたプライマーの伸長を含むポリメラーゼ連鎖反応条件に
供される。この操作は、三次PCR伸長産物を適切量産生するために、これらの段
階を含む十分な数のサイクルを介して繰り返される。二次PCR伸長産物は制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて処理されるので、野生型核酸配列由来の三次PCR伸長
産物は識別塩基に相当するヌクレオチドの近傍でそれらが切断される結果として
短い。一方変異型核酸配列由来の三次PCR伸長産物はより大きく、そして識別塩
基に相当するヌクレオチドの近傍で切断されない。図1段階6を参照されたい。結
果として変異型核酸配列由来の三次PCR伸長産物は、続くLDR段階において野生型
核酸配列由来の産物からは容易に識別される。

【００６０】 別の制限エンドヌクレアーゼ消化はまた、最初のRE段階においてPCRエラーま
たは不完全消化のために増幅されたかもしれないいかなる大量存在標的を除去す
ることためにも三次PCR相に続いて使用されるかもしれない。

【００６１】 三次PCR伸長操作に続いて、結果として生じる三次伸長産物は図1段階7Aまたは
7BのいずれかにしたがってLDR操作に供される。これらの選択肢のいずれにおい
てもLDR操作は最初に1重鎖DNA（ssDNA）を産生するために三次PCR伸長産物を最
初に変性することにより開始される。識別プローブは3'末端に異なるヌクレオチ
ドおよび5'末端に異なる数のアデニン塩基を有することにより識別される。結果
として各識別プローブより産生されるライゲーション産物は蛍光標識検出により
同定され、そして異なる電気泳動度によりゲル上でお互いに識別される。

【００６２】 図1段階7AにおいてLDRプローブセットは4種の選択可能な識別プローブおよび4
種の識別プローブのいずれとも連結可能な共通プローブを含む。共通プローブは
その3'末端に蛍光標識を含む。三次伸長産物、これらのオリゴヌクレオチドプロ
ーブ、および熱安定性リガーゼがリガーゼ検出反応混合液を形成するために混合
され、一連のリガーゼ検出反応サイクルに供される。

【００６３】 リガーゼ検出反応は一般的には、その開示内容がこれにより参考文献により組
み入れられたBaranyらの国際公開公報第90/17239号、「熱安定性DNAリガーゼを
コードする遺伝子のクローン化、過剰発現およびヌクレオチド配列（Cloning、O
verexpression and Nucleotide Sequence of Thermostable DNA Ligase-
encoding Gene）」Gene、109：1〜11（1991）、およびF.Barany「クローン化熱
安定性リガーゼを用いた遺伝子病同定およびDNA増幅（Genetic Disease Detec
tion and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase）」米 国科学アカデミー紀要（Proc.Natl.Acad.Sci.USA） 、88：189〜193（1991）およ
びBaranyらの米国特許第5,494,810号、米国特許第5,830,711号および米国特許第
6,027,889号に記載されている。本発明に基づきリガーゼ検出反応は2組の相補性
オリゴヌクレオチドを使用することができる。これはリガーゼ連鎖反応として知
られ、これにより参考文献により組み入れられた直前の参考文献中に記載されて
いる。またはリガーゼ検出反応はオリゴヌクレオチドライゲーション分析として
知られる単一サイクルを含むことができる。これにより参考文献により組み入れ
られた、Landegrenら「リガーゼ媒介性遺伝子検出技術（A Ligase-Mediated G
ene Detection Technique）」、Science 241：1077〜80（1988）、Landegren
ら「DNA診断-分子技術および自動化（DNA Diagnostics-Molecular Techniques
and Automation）」、Science 242：229〜37（1988）およびLandegrenらの
米国特許第4,988,617号を参照されたい。

【００６４】 リガーゼ検出反応相中、変性処理は80℃〜105℃の温度で実施され、ハイブリ
ダイゼーションは50℃〜85℃で行われる。各サイクルは全体で約1分から5分の長
さである変性処理および熱的ハイブリダイゼーション処理を備える。典型的には
リガーゼ検出反応は、繰り返し2サイクルから50サイクルの間変性およびハイブ
リダイズを実施することを含む。リガーゼ検出反応段階の総時間は1分から250分
である。

【００６５】 好ましい耐熱性リガーゼはサーマスアクアティカス（Thermus aquaticus）由
来のものである。本酵素はその生物より単離することができる。これにより参考
文献により組み入れられた、M.Takahashiら「好熱性DNAリガーゼ（Thermophilic
DNA Ligase）」、J.Biol.Chem.259：10041〜47（1984）。またはそれは組換
え的に調整することができる。（Thermus thermophiliusリガーゼと同様に）サ
ーマス アクアティカスリガーゼの組換え体調整と同様にそのような単離手順も
、これにより参考文献により組み入れられた、Baranyらの国際公開公報第90/172
39号、F.Baranyらの「耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローン化、過
剰発現およびヌクレオチド配列（Cloning、Overexpression and Nucleotide
Sequence of Thermostable DNA Ligase-encoding Gene）」Gene、109：1〜
11（1991）およびBaranyらの米国特許第5,494,810号および米国特許第5,830,711
号に開示されている。これらの参考文献はコードするDNAと同様に本リガーゼの
完全配列情報を含む。他の適切なリガーゼはイーコリのリガーゼ、T4リガーゼ、
およびピロコッカス（Pyrococcus）リガーゼを含む。

【００６６】 ライゲーション検出反応混合液はサケ精子DNA等のキャリアーDNAを含んでもよ
い。

【００６７】 好ましくは熱的ハイブリダイゼーション処理であるリガーゼ検出反応のハイブ
リダイゼーション段階はライゲーション接合点におけるヌクレオチドを識別する
ことに基づいてヌクレオチド配列を識別する。標的ヌクレオチド配列間の差異は
、例えば、1核酸塩基差異、核酸欠失、核酸挿入、または転位であることができ
る。1より多くの塩基を含むそのような配列差異もまた検出することができる。

【００６８】 上述されたオリゴヌクレオチドプローブセットは検出に適したレポーター標識
を有してもよい。有用な標識は発色基、蛍光性部分、酵素、抗原、重金属、磁性
プローブ、色素、りん光性基、放射性物質、化学発光性部分、および電気化学検
出部分を含む。マトリックス支援レーザ脱離イオン化法-飛行時間型質量分析法
（MALDI-TOF）アレイシステム等の質量分析法による識別のための分子量標識も
また適切であろう。

【００６９】 オリゴヌクレオチドプローブセットはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレ
オチド、改変型リボヌクレオチド、改変型デオキシリボヌクレオチド、ペプチド
ヌクレオチド類似体、改変型ペプチドヌクレオチド類似体、改変型リン酸-糖-バ
ックボーンオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物の形
態であることができる。

【００７０】 オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドは各々66℃〜70℃の
ハイブリダイゼーションまたは融解温度（すなわちT_m）を有する。これらのオリ
ゴヌクレオチドは20ヌクレオチド長〜28ヌクレオチド長である。

【００７１】 図1段階7Aに示されるように変異核酸配列由来のライゲーション産物はその5'
末端に2個のアデニン塩基を有する識別プローブから形成される。他の識別プロ
ーブは変異核酸配列が存在する結果として共通プローブに連結されないであろう
。

【００７２】 一方多くの場合には上述されたプローブセットを用いて野生型配列よりライゲ
ーション産物が形成されることはないであろう。エンドヌクレアーゼ消化は野生
型核酸配列由来の三次伸長産物を切断するため、その結果として、そのプローブ
セットの共通および識別プローブの両者は共に連結されることが可能な様式では
そのような三次伸長産物にハイブリダイズしないであろうから、これが生じるの
である。しかしながら野生型配列由来二次伸長産物のエンドヌクレアーゼ消化は
ある程度には不完全であり、野生型配列由来の少量の残存未切断三次伸長産物が
リガーゼ検出反応混合液中に存在するかもしれない。これは5'末端にアデニンを
有さない識別プローブからのライゲーション産物の生成を引き起こすであろう。

【００７３】 図2は、図1段階7Aのリガーゼ検出反応操作から形成される産物のゲル電気泳動
検出を示している。図2に示されるように、非連結プローブは大きな電気泳動度
を有し、ゲルの底部にバンドを形成する。野生型配列由来のいくらかの少量の三
次伸長産物由来ライゲーション産物は次に大きな電気泳動度を有し、ゲル上の中
間位置にバンドを形成する。変異型配列由来ライゲーション産物は野生型ライゲ
ーション産物よりも小さい電気泳動度を有し、野生型ライゲーション産物の少し
上部に濃いバンドを形成する。変異型配列が試料中に存在しない場合、そのよう
なゲルバンドは形成されない。最上部の2つのバンドは電気泳動度が小さい微量
ライゲーション産物である。これらの高分子量バンドはアーチファクトであり、
おそらくPCR中のポリメラーゼのエラーおよび鋳型分解に起因しているであろう
。PCR緩衝液の組成は増幅後の試料中に存在するこれらのPCRエラー産物の割合に
強い影響を与える。

【００７４】 電気泳動度の差異に基づくDNA産物の検出にキャピラリーおよびゲル電気泳動
法が使用されることはよく知られている。これにより参考文献により組み入れら
れた、例えばGrossmanら「核酸配列の高密度多重検出：オリゴヌクレオチドライ
ゲーション分析および配列コード分離（High-density Multiplex Detection
of Nucleic Acid Sequences：Oligonucleotide Ligation Assay and Seq
uence-coded separations）」Nucleic.Acids Res.22（21）：4527〜34（1994
）を参照されたい。

【００７５】 図1段階7Bに示されているリガーゼ検出反応操作の代替として、識別プローブ
がその5'末端の異なるアドレス特異的部分（すなわちZIP1、ZIP2、ZIP3およびZI
P4）と共に提供されることができる。これは識別プローブのアドレス特異的部分
に相補的な異なる捕捉オリゴヌクレオチドプローブを有する、位置特定可能なア
レイ上でライゲーション産物が検出されることを可能にする。結果として、リガ
ーゼ検出反応相に続くハイブリダイゼーション操作中に各ライゲーション産物は
DNAマイクロアレイの異なるアドレスに向かう。ハイブリダイズされたライゲー
ション産物は全て同一の標識を有するが、ライゲーション産物が固定化された場
所によりお互いに区別することができる。または異なる標識が識別塩基上に存在
することができ、一方アドレス特異的部分は共通プローブ上に存在する。この実
施態様では異なるライゲーション産物は同一の捕捉プローブを有する部位のアレ
イ上に固定化されるであろう。しかしながら異なるライゲーション産物は異なる
標識により識別されるだろう。

【００７６】 図3は位置特定可能なアレイを用いて図1段階7Bの過程から生じるライゲーショ
ン産物を検出することを示している。この場合図1段階7Bに示されるように共通
プローブはある標識を有し、識別プローブはアドレス特異的部分を有する。図3
ではライゲーション産物は、ライゲーション産物中のアドレス特異的部分がアレ
イ上の捕捉オリゴにハイブリダイズすることに効果的な条件下で、位置特定可能
なアレイに接触させられる。図3段階2および3に示されているように、ライゲー
ション産物を形成しない識別プローブ（例えばアドレス特異的部分ZIP4（示さず
）およびZIP3（示す）を有するプローブ）はアレイ上に固定化されるが標識がな
いために検出されない。非結合の共通プローブはアレイにハイブリダイズせず、
続いて洗い流され（例えば65℃〜80℃および低塩濃度において）、シグナルを発
生しない。野生型核酸配列由来の任意の少量のライゲーション産物（上流での不
完全なエンドヌクレアーゼ消化のため）はアドレス特異的部分ZIP1に相補的であ
る捕捉オリゴヌクレオチドに（任意の相当する非結合識別プローブとともに）固
定化される。同様に、変異型配列由来の任意のライゲーション産物はアドレス特
異的部分ZIP2に相補的である捕捉オリゴヌクレオチドに（任意の相当する非結合
プローブとともに）固定化される。変異型配列および/または野生型配列の存在
は本実施態様においてはアレイ上の各々異なる場所での蛍光シグナルの存在によ
り検出される。ヘテロ接合性はアドレス特異的部分ZIP1およびZIP2に相補的な捕
捉オリゴヌクレオチドにおける等量のシグナルで示される。シグナルは蛍光イメ
ージ装置を用いて定量化されてもよい。この様式は各対立遺伝子に独自のアドレ
スを使用し、低レベルシグナル（30アトモルから100アトモルのLDR産物）の非常
に正確な検出を達成するために好ましいかもしれない。

【００７７】 捕捉オリゴヌクレオチドのアレイを有する固体支持体の使用は、これにより参
考文献により組み入れられた、特許仮出願中米国特許出願第60/011359に完全に
開示されている。この方法はオリゴヌクレオチドの固着に適した各々の部位のア
レイを有する固体支持体の提供を伴う。各アレイ部位の固体支持体にオリゴヌク
レオチドを結合させるために適したリンカーまたは支持体（好ましくは加水分解
できない）が固体支持体に固着される。固体支持体上のオリゴヌクレオチドアレ
イは、活性化アレイ部位に1または複数のヌクレオチドを固着させるために、選
択されたアレイ部位を活性化させる一連のサイクルにより形成される。

【００７８】 そのようなアレイを使用する場合に、上記の結合型のPCRおよびLDR相の各々に
おいて使用されるオリゴヌクレオチドプローブは位置特定可能なアレイ特異的部
分を有する。PCRおよびLDR相が完了した後、そのような過程の産物の位置特定可
能なアレイ特異的部分は1重鎖のままで残り、捕捉相中でオリゴヌクレオチドを
捕捉するためにハイブリダイズされる。これにより参考文献により組み入れられ
た、C.Newtonら「新規リン酸アミダイド中間体を取りこむプライマーを用いての
5'1重鎖尾部を有するPCR産物の産生（The Production of PCR Products wi
th 5'Single-Stranded Tails Using Primers That Incorporate Novel
Phosphoramidite Intermediates）」Nucl.Acids Res.21（5）：1155〜62（199
3）。

【００７９】 段階の捕捉相において混合液は45℃〜90℃にて60分までの間、固体支持体に接
触される。陽イオン添加、容積排除、およびカオトロピック試薬はハイブリダイ
ゼーションを加速するかもしれない。アレイが数千のアドレスからなる時には正
しいライゲーション産物配列が適切なアドレスにハイブリダイズする機会を有す
ることが大切である。これは、高温度の使用によるオリゴヌクレオチドの熱運動
、アレイ表面と接触している液体の機械的運動、または電場によりオリゴヌクレ
オチドをアレイ上で移動させることにより達成されるかもしれない。ハイブリダ
イゼーション後、アレイは低ストリンジェンシー洗浄緩衝液および高ストリンジ
ェンシー洗浄緩衝液順を用いて順次洗浄される。

【００８０】 安定した様式でハイブリダイズするであろう捕捉オリゴヌクレオチドおよび位
置特定可能なヌクレオチド配列を選択することが重要である。捕捉オリゴヌクレ
オチドが位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりもより
低い温度で標的ヌクレオチド配列にオリゴヌクレオチド組がハイブリダイズする
ように、オリゴヌクレオチド組および捕捉オリゴヌクレオチドが構成されるべき
ことが必要である。オリゴヌクレオチドがこの様式で設計されない場合、標的に
ハイブリダイズされたのと同じオリゴヌクレオチド組由来の隣接した未反応オリ
ゴヌクレオチドを捕捉するために偽陽性シグナルが生じるかもしれない。

【００８１】 捕捉オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改
変型リボヌクレオチド、改変型デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチ
ド類似体、改変型ペプチドヌクレオチド類似体、改変型リン酸-糖-バックボーン
オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物の形態であるこ
とができる。

【００８２】 位置特定可能なヌクレオチドアレイ特異的部分を含む全未変換非結合LDRオリ
ゴヌクレオチドプローブが、DNAアレイ上にライゲーション産物を捕捉するのに
先立ち、化学的または酵素学的に破壊されることが望ましいかもしれない。その
ような未変換プローブは、そうしなければ、相補的配列を含む固定支持体アレイ
上のアドレスに対する結合をライゲーション産物と競合するであろう。末端を阻
止され、プローブのお互いのライゲーションには関係しないLDRプローブととも
にエクソヌクレアーゼ3（これにより参考文献により組み入れられた、L-H Guo
およびR.Wu、酵素学手法（Methods in Enzymology）100：60〜96（1985））等
のエクソヌクレアーゼを用いて、破壊を達成することができる。阻止部分はレポ
ーター基またはホスホロチオ酸が可能であるだろう。これにより参考文献により
組み入れられた、T.T.Nikiforowら「1重鎖PCR産物の調整および固相ハイブリダ
イゼーションによる検出のためのホスホロチオ酸プライマーおよびエクソヌクレ
アーゼ加水分解の使用（The Use of Phosphorothioate Primers and Exonu
clease Hydrolysis for the Preparation of Single-stranded PCR Pro
ducts and their Detection by Solid-phase Hybridization）PCR方法お
よび応用（PCR Methods and Applications 3：285〜291（1994）。LDR過程後
、反応混合液をエクソヌクレアーゼとともに加温することで非結合プローブは選
択的に破壊される。結合プローブはエクソヌクレアーゼ反応開始に必要な遊離3'
末端を除去しているために保護される。この研究方法は、特にLDR反応がごく少
量の産物のみしか形成しないところでは、シグナル-ノイズ比の増加に繋がる。
未結合オリゴヌクレオチドは捕捉オリゴヌクレオチドによる捕捉に対して競合す
るために、結合オリゴヌクレオチドとのそのような競合はシグナルを低下させる
。本方法の付加的な利点は、ハイブリダイズしていない標識含有配列が分解され
、それらはDNAアレイからより容易に洗浄により除去されることができるので、
従って標的非依存性バックグラウンドシグナルを引き起こすことがよりできにく
くなる。

【００８３】 広範囲の感染症が本発明の方法により検出することができる。典型的にはこれ
らは細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌感染性因子により引き起こされる。様
々な感染性因子の薬剤耐性もまた本発明を用いて決定することができる。

【００８４】 本発明により検出される細菌感染性因子は大腸菌、サルモネラ菌、シゲラ菌、
肺炎杆菌、緑膿菌、リステリア菌、ヒト結核菌、トリ結核菌細胞内型、エルシニ
ア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリジウム菌、百日咳菌、バ
クテロイデス、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、溶血連鎖球菌、コリネバクテリ
ア、レジオネラ、マイコプラズマ、ウレアプラスマ、クラミジア、淋菌、髄膜炎
菌、ヘモフィルスインフルエンザ、エンテロコッカス-フェカーリス、尋常変形
菌、ミラビリス変形菌、ヘリコバクターピロリ、梅毒トレポネーマ、ライム病菌
、回帰熱ボレリア、リケッチア病原微生物、ノカルジアおよび放線菌を含む。

【００８５】 本発明により検出される真菌感染性因子はクリプトコックス-ネオフォルマン
ス、ブラストマイセス-デルマチチジス、ヒストプラスマ-カプスラーツム、コク
シジオイデス-イミチス、パラコクシジオイデス-ブラジリエンシス、カンジダア
ルビカンスアスペルギルス-フミガーツス、藻菌類（リゾープス属）、スポロト
リックス-シェンキィ、クロモミコーシス、およびマズラミコーシスを含む

【００８６】 本発明により検出されるウイルス感染性因子はヒト免疫不全ウイルス、ヒトT
細胞リンパ球栄養性ウイルス、肝炎ウイルス（例えばB型肝炎ウイルスおよびC型
肝炎ウイルス）、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパ
ピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイル
ス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブンヤ
ウイルス、アリーナウイルス、ルベラウイルス、レオウイルスを含む

【００８７】 本発明により検出される寄生虫感染性因子は熱帯熱マラリア原虫、プラスモデ
ィウムマラリア、卵形マラリア原虫、オンコベルバボルブルス（Onchoverva vo
lvulus）、リーシュマニア、トリパノソーマ種、住血吸虫種、赤痢アメーバ、ク
リプトスポリジウム、ジアルジア種、トリコモナス種、大腸バランチジウム、バ
ンクロフト糸状虫、トキソプラズマ種、蟯虫、蛔虫、ヒト鞭虫、メジナ虫、吸虫
、広節裂頭条虫、条虫種、ニューモシスティス-カリニ、およびアメリカ十二指
腸虫を含む。

【００８８】 本発明はまた感染性因子による薬剤耐性の検出にもまた有用である。例えばバ
ンコマイシン耐性エンテロコッカス-フェシウム、メチシリン耐性黄色ブドウ球
菌、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌、多剤耐性結核菌、およびAZT耐性ヒト免疫不
全ウイルス全てが本発明により同定することができる。

【００８９】 遺伝子病もまた本発明の方法により検出することができる。これは出生前また
は出生後の染色体および遺伝子異常または遺伝子病をスクリーニングすることに
より実施することができる。検出可能な遺伝子病の例は、21水酸化酵素欠損症、
嚢胞性繊維症、脆弱X症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィ
ー、ダウン症またはその他のトリソミー、心臓病、単一遺伝子病、HLA型判定、
フェニルケトン尿症、鎌状赤血球性貧血、テイ-サックス病、サラセミア、クラ
インフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リポイド症、肥満障害
、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病を含む。

【００９０】 本発明の方法により検出することができる癌は一般的には癌遺伝子、癌抑制遺
伝子、またはDNA増幅、複製、組換え、または修復に関わる遺伝子を含む。これ
らの例はBRCA1遺伝子、p53遺伝子、APC遺伝子、Her2/Neu増幅、Bcr/Abl、K-ras
遺伝子およびヒトパピローマウイルス16型および18型を含む。本発明の様々な側
面が、下記のよくある癌において上記遺伝子の点変異および小規模欠失/挿入と
同様に増幅、大規模欠失を同定するために使用することができる。白血病、大腸
癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、黒色腫、肝臓
癌、骨肉腫および他の骨癌、精巣および卵巣癌、頭頚部腫、および子宮頚部腫瘍
。

【００９１】 環境モニター領域では、天然および設計された生態系、および市営排水浄化シ
ステム内、貯水槽内、または生物学的修復（Bioremediation）を受けている汚染
地域内等のマイクロコズムにおける、病原微生物および常在微生物を、検出、同
定、およびモニターするために本発明を使用することができる。生体異質物質を
代謝可能な遺伝子を含むプラスミドを検出すること、集団動力学研究における特
定の標的微生物をモニターすること、または環境中および工業装置中の遺伝子改
変微生物を検出、同定、またはモニターすることも可能である。

【００９２】 食物および飼料産業においては本発明は広範囲な応用を有する。例えば、ビー
ル、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン等を生産するための酵母などの生産生物
の同定および特徴づけに使用することができる。他の利用領域は、汚染物質に対
する産物および過程の品質管理および保証に関するものである（例えば家畜、殺
菌、および食肉加工）。他の利用は、育種目的の植物、球根、および種子の特徴
づけ、植物特異的病原体の存在の同定、および家畜感染の検出および同定を含む
。

【００９３】 少量存在配列が大量存在配列の量に対して、同一試料中に1：1,000未満のモル
比で存在する時、好ましくは1：10,000未満のモル比で存在する時、最も好まし
くは1：100,000未満のモル比で存在する時、大量存在配列と1以上の1塩基変化、
挿入、欠失、または転座により異なる1以上の少量存在配列の存在を同定するた
めに本発明は有用である。

【００９４】 本発明の別の局面は試料中の標的ヌクレオチド配列を定量する能力である。こ
れは内部標準を確立することにより達成することができる（すなわち、そこでは
標準確立物質が試料とともに増幅および検出される）。

【００９５】 内部標準を用いた定量では、量既知の1以上の標識標的ヌクレオチド配列が試
料に加えられる。加えて多数の標識特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは
、リガーゼ、以前に議論されたオリゴヌクレオチドプローブセット、および三次
伸長産物とともに混合液に添加される。標識特異的オリゴヌクレオチドプローブ
セットは（1）標識標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する1番
目のオリゴヌクレオチドプローブおよび（2）標識標的ヌクレオチド配列に相補
的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する2番目のオリゴヌ
クレオチドプローブを有する。特定の標識特異的オリゴヌクレオチド組のオリゴ
ヌクレオチドプローブが、相当する標識標的ヌクレオチド配列上で互いに近接し
てハイブリダイズされた時、共にライゲーションされるのに適する。しかしなが
ら、試料または添加された標識配列中に存在するその他のいかなるヌクレオチド
配列にハイブリダイズした時にも、そのようなライゲーションを阻害するミスマ
ッチが存在する。ライゲーション産物配列の存在はレポーター標識の検出により
同定される。試料中の標的ヌクレオチド配列の量はその後、量既知の標識標的ヌ
クレオチド配列から生成されたライゲーション産物配列の量をその他のライゲー
ション産物配列の量と比較することにより決定される。

【００９６】 本発明は、多数の標的ヌクレオチド配列の中で、大量存在配列と1以上の1塩基
変化、挿入、または欠失により異なる1以上の少量存在配列を同定するキットに
関するものでもある。このキットは一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、
二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、三次オリゴヌクレオチドプライマー
セット、および多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含む。

【００９７】 キットで提供される一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは（a）標的特
異的部分を含む1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（b）標的特異的部
分を含む2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。一次オリゴヌクレオ
チドプライマーは、相当する高および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖に
ハイブリダイゼーションするために適しており、一次伸長産物の形成を可能にす
る。しかしながらプライマーは試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配列
にハイブリダイズした時もそのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を阻害す
るミスマッチを有する。

【００９８】 キットで提供される二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは（a）標的特
異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレ
オチドプライマーおよび（b）標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異
的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。二次オリゴヌ
クレオチドプライマーは一次伸長産物の相補鎖へのハイブリダイゼーションに適
しており、大量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含
むまたは創生するが、1以上の少量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を含まないまたは創生せず、二次伸長産物の形成を可能にする。

【００９９】 キットで提供される三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは（a）二次オ
リゴヌクレオチドプライマーセットの1番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5
'上流部分と同一の配列を含む1番目の三次プライマーおよび（b）二次オリゴヌ
クレオチドプライマーセットの2番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流
部分と同一の配列を含む2番目の三次プライマーを有する。三次オリゴヌクレオ
チドプライマーセットは全二次伸長産物を増幅するために使用されてもよい。

【０１００】 キットはまた多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各組は（
a）三次伸長産物特異的部分および検出可能なレポーター標識を含む1番目のオリ
ゴヌクレオチドプローブ、および（b）三次伸長産物特異的部分を含む2番目のオ
リゴヌクレオチドプローブを有する。特定の組のオリゴヌクレオチドプローブは
相補的三次伸長産物特異的部分上でお互いに隣接してハイブリダイズされると、
ともにライゲーションされることに適する。しかしながら試料中に存在する他の
いかなるヌクレオチド配列にハイブリダイズする時もそのようなライゲーション
を阻害するミスマッチが存在する。

【０１０１】 キットはまた上述されたようにポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ制限酵素、
および/またはリガーゼを含んでもよい。

【０１０２】 実施例 PCR条件下での類似体添加の最適化実施例1 -類似体効率のためのオリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドは0.2μmolスケールでシアノエチルリン酸アミダイド化学
によりアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）394DNAシンセサイ
ザーにより合成された。標準500ÅCPGカラムおよび試薬（アプライドバイオシス
テムズ）が以下の例外を除いては使用された。50塩基長のオリゴヌクレオチドが
広孔1000ÅCPGカラム（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。蛍
光色素FAMを5'末端に有するオリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有して、F
AMリン酸アミダイド（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。5'リ
ン酸塩を有するオリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有して、リン酸化試薬
（グレンリサーチ（Glen Research））を用いて合成された。3'ブロッキング基
を有するオリゴヌクレオチドはY-スペーサーCPGカラム（グレンリサーチ）を用
いて合成された。3'ヌクレオチド類似体であるQ₅）2'-デオキシイノシン、Q₆）6
-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-cl[1,2
] オキサジン-7-ワン]、Q₇）2-アミノ-7-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）
-6-メトキシアミノプリン、を有するオリゴヌクレオチドが図5に示すように2'-
デオキシイノシン-CPG、dP-CPGおよびdK-CPGを各々用いて合成された（グレンリ
サーチ）。Y部位にQ₁、Q₂およびQ₁₈を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、Po
nらの方法（Ponら「固相オリゴヌクレオチド合成用調節孔ガラスビーズ誘導体化
（Derivatiztion of Controlled Pore Glass Beads for Solid Phase
Oligonucleotide Synthesis）」、Biotechniques、6：768〜75（1988））によ
りQ₁（Johnsonら「デオキシアデニノシン模倣1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノ
シル）イミダゾール-4-カルボアミドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドの
合成および安定性（The Synthesis and Stability of Oligodeoxyribonucl
eotides Containing the Deoxyadenosine Mimic 1-（2'-Deoxy-Beta-D-Rib
ofuranosyl）Imidazole-4-Carboxamide）」、Nucleic.Acid Res.、25：559〜67
（1997））、Q₂（Bergstromら、Journal of the American Chmistry Socie ty 、117：1201〜9（1995））およびQ₁₈（Zhangら、「ヌクレオベース類似体とし
てのアゾールカルボアミドの探索的研究：ピロール-3-カルボアミドを含むオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド2重鎖に関する熱的変性研究（Exploratory Studie
s on Azole Caroboxamides as Nucleobase Analogs：Thermal Denaturat
ion Studies on Oligodeoxyribonucleotide Duplexes Containing Pyrrol
e-3-Caroboxamide）」、Nucleic.Acid Res.、26：2208〜15（1998））から合成
されたQ₁、Q₂およびQ₁₈由来CPGから合成された。

【０１０３】実施例2 -PCRポリメラーゼおよび緩衝液 使用されたDNAポリメラーゼはAmpliTaq、AmpliTaq-ストーフル（Stoeffel）断
片、AmpliTaq-蛍光シークエンシング（アプライドバイオシステムズ）、Ventお
よびVent（exo^-）（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）
）およびExpandポリメラーゼ混合物（Expand High FidelityキットのTaqおよ
びPfuポリメラーゼ混合物、ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）
）。使用された商業的に利用可能な緩衝液はAmpliTaqおよびExpand High Fide
lityキットにて供給された。別の緩衝液CiNF、緩衝液G（f）は他所に記載（Day
ら、Nucleic.Acids Res.（1999））。簡単にはCiNF反応は20mMクエン酸塩pH7.6
、200μg/mlウシ血清アルブミン、2.5mM MgCl₂、200μM dNTP（各）および16mM
（NH₄）₂（SO₄）または50mM酢酸カリウム、10％ホルムアミド、プライマー、お
よび鋳型DNAを含む。下記に示す全てのPCRおよびLDR反応はパラフィンオイル下
で実施された。

【０１０４】実施例3 -ミスマッチ伸長効率 天然型塩基およびヌクレオチド類似体を含むプライマーは、コドン284を含むM
spI部位に、MspI（CCGG）、TaqI（TCGA）、HhaI（GCGC）またはTaiI（ACGT）部
位を有する合成2重鎖p53第7エクソン鋳型からの産物生成の効率を比較および測
定するためにPCRにおいて使用された。MspI部位の各々の側上にプライマーの3'
末端が各側に1塩基伸長して、プライマーは野生型配列にハイブリダイズした。
図6Aを参照されたい。4種の各合成鋳型上で平行反応として8種の異なる類似体お
よび4種の天然塩基が試験された。PCRは各ポリメラーゼ用のメーカーにより供給
された緩衝液とともにストーフルTaqまたはTaq-蛍光シークエンシングポリメラ
ーゼを用いて実施された。各プライマー10pmolおよび2重鎖鋳型20fmolおよび各d
NTP 0.2mMおよび4mM MgCl₂が使用された。平行反応は、94℃15秒間、65℃1分間
の10、20、30、40および50PCRサイクルを実施した。効率および収量は6％アガロ
ースゲル上で泳動され、臭化エチジウムで染色された試料より決定された。

【０１０５】実施例4 -ミスマッチ変換産物シークエンシング 各類似体で最も効率よく増幅された産物が水で1000倍希釈された。希釈された
DNA産物は、以前のPCRと同一のポリメラーゼおよび緩衝液を用いて、ただし図6A
に示すように10pmolの「ジップコード（zipcode）」含有プライマーp53zip248お
よびp53zip248を加えて、94℃15秒間、65℃2分間で20サイクル再増幅した。ジッ
プコード配列はいかなる生物のDNA配列に対しても知られている配列類似性を示
さないオリゴヌクレオチドである。ジップコードプライマーを用いた増幅は以前
のPCRのジップコード含有産物を特異的に増幅することを意図している、すなわ
ち（ジップコードを含まない）ほぼ同一の未変換DNAは増幅されず（ジップコー
ドを含む）変換されたDNAのみが増幅されるであろう。変換産物は8％アガロース
ゲルで泳動され予測された大きさのバンドが切り出される。DNAはゲル薄片より0
.45μmHVLPフィルター（ミリポア（Millipore））を通して30分間235Cマイクロ
遠心分離機（フィッシャー（Fisher））内で遠心分離することで抽出される。変
換産物を乾燥し、ABIダイターミネーターサイクルシークエンシング反応混合液
中に、キットの指示（アプライドバイオシステムズ）に従いジップコードプライ
マーの1つとともに再懸濁した。等容量（各3μl）のシークエンシング反応物が
、83％ホルムアミド（イーストマン（Eastman））、4mM EDTAおよび8mg/mlブル
ーデキストラン（シグマ）を含む色素混合物と一緒にされた。試料を7M尿素、10
％アクリルアミドゲル（ゲルおよび泳動緩衝液中19：1ビス、0.6xTBE）にてABI3
73DNAシークエンサーで電気泳動した。データはABI373ADNAシークエンサーデー
タ解析ソフトウェア1.2.0版を用いて解析された。

【０１０６】実施例5 -前変換段階を有する変換産物同定および有さない変換産物同定 変換忠実度を、9種の異なる合成鋳型を用いて、Q₅、Q₆およびQ₇（実施例1を参
照されたい）を含む3種のプライマーを用いた前変換ありおよびなしで試験した
。前変換PCRは、ミスマッチプライマー伸長を避ける努力の中で、所望の天然型
塩基プライマーを添加する前に、3'類似体プライマーを用いて実施された。50塩
基対の2重鎖DNA鋳型は、MspI部位（CCGG）に相当する塩基を除いて、図6Bに示さ
れているコドン248周囲の野生型p53配列を含んでいた。以下の配列はMspI部位に
おいて置換された。1）CCGG（野生型）、2）CTGG、3）CGGG、4）CAGG、5）TCGA
、6）GCGC、7）ACGT、8）ACGT、および9）GCGC。前二次PCR反応（「前変換」）
は、50fmol/μlのp53-248Q_Nおよびp53-248Q_NRプライマーおよびCiNF緩衝液、緩
衝液G（f）中のVent（exo-）、および10fmol/μlの2重鎖鋳型を用いたホットス
タートにより実施された。前変換は94℃15秒間、55℃1分間、60℃1分間の2回のP
CRサイクルを使用した。産物は4℃で保存された。変換反応は同一のポリメラー
ゼおよび緩衝液を含み、別の付加的な鋳型を含まない1μlの前変換反応物を用い
て開始された。各反応は4組のp53zip248Nおよびp53zip248NR（N＝C、T、Gまたは
A）の1つを用い、各プライマー10pmolを必要とした。前変換なしの平行変換反応
は、前変換反応液の分取の代わりに10fmolの合成2重鎖鋳型を加えることにより
ホットスタートを用いて開始された。PCRサイクルは以下の通りであった：94℃1
5秒間、55℃（1サイクルに付き＋1℃上昇）1分間、60℃1分間でにて5サイクル、
その後94℃15秒間および60℃2分間を20サイクル。最終伸長は60℃5分間で実施さ
れた。ポリメラーゼは凍結融解を2度繰り返すことで失活された。産物は水に10
倍希釈され、1μlを20μlのExpandポリメラーゼおよび緩衝液混合液に添加する
ことにより再増幅された。PCRは12pmolのジップコードプライマーZtopおよびZbo
t（図6）を用いて94℃15秒間および65℃2分間の20サイクル（低収率反応では30
サイクル）にて実施された。LDRは、形成された変換産物を同定するため、以下
に記載のように行われた。

【０１０７】実施例6 -リガーゼ検出反応 リガーゼ検出反応は標準LDR緩衝液中で行われた（25mMトリスpH7.6、12mM Mg
Cl₂、65μg/mlウシ血清アルブミン、100mM KCl、10mMジチオトレイトール）。
各20μl反応は、図6Cに示されるように約500fmolの2重鎖DNA（試料1μl）、500f
molの各識別プローブ、および750fmolの共通プローブを含んでいた。識別および
共通プローブセットは予想変換産物上でLDRが実施されるように合成され、セン
ス鎖のMspI部位に相当する塩基（Bi）において異なった（野生型ではB₁B₂B₃B₄＝
CCGG）。識別プローブは野生型配列を有し-B₁B₂（-OH3'）にて終結する。識別プ
ローブはB₂部位に各々順にC、T、GおよびAを有する4種のプローブセットとして
合成された。共通LDRプローブは、野生型配列が続けられる（5'PO₄-）B₃B₄-を有
し、5'塩基が識別プローブの3'塩基に隣接する形で鋳型にハイブリダイズした。
識別プローブはMspI部位のB₂でのエラー産物を同定するために3'末端塩基が異な
っていた。簡単にはB₂のみがモニターされた。LDRプローブは予想変換産物に対
応した。例えば-CCGG-鋳型の-ACGT-への変換は-AC、-AT、-AGおよび-AAで終結す
る識別プローブおよび5'pGT-を有する共通プローブを必要とした。識別プローブ
は異なる長さの5'尾部および蛍光検出のためのFAM標識を有した。尾部長は異な
るLDR産物のアクリルアミドゲル上での物理的分離を可能にし、それゆえLDR産物
の同定を可能にした。

【０１０８】 LDR反応は5nmolのTthリガーゼを添加する前に、94℃にて1.5分間プレインキ
ュベートされ、続いて94℃15秒間、65℃2分間の10回のLDRサイクルが実施され、
最終的に94℃にて短時間保持された。反応物は冷却され-70℃にて保存された。L
DR産物は7M尿素を含む10％アクリルアミドゲル上で、ゲルおよび泳動緩衝液に0.
6xTBE（1xTBEは、90mMトリス塩、90mMホウ酸塩、2mMEDTA）を用いて分離された
。データはABI373DNAシークエンサーをGenescan672ソフトウェアとともに用いて
収集された。

【０１０９】実施例7 -イメージ処理 ゲル画像はABI672解析ソフトウェアを用いて産生された。色素特異的イメージ
はアドビ、フォトショップ3.0（Adobe Photoshop3.0）で開かれ、切り取られ、
サイズ調節され、グレースケールに変換された。グレースケールイメージはNIH Image 1.59で開かれ、白黒反転され、1D垂直バックグラウンドは減算された
。バックグラウンド減算後のイメージは再度白黒反転され、強度差が容易に比較
できるようにフォトショップにより疑似色が与えられた。色置換を除けば、相対
的強度を保存するためにイメージの線形イメージ処理のみが行われた。

【０１１０】 初期の実験は3'末端にヌクレオチド類似体を含むプローブを使用する時にPCR
産物を生成する効率を決定するために設計された（上記実施例を参照されたい）
。配列の特定の場所である塩基を別の塩基に変換するために。8種の異なる類似
体が4種の天然型塩基の2以上と対合するように設計された。ヌクレオチド類似体
および4種の天然型塩基の1つをその3'末端に含むプライマー対が4種の異なる鋳
型を増幅するために使用された（図6A）。各ヌクレオチド類似体または天然型塩
基は、反対鎖の4種の天然型塩基と順番に誤対合（または対合）され、増幅はTaq
ストーフル断片またはTaq蛍光シークエンシングポリメラーゼのいずれかを用い
て試みられた。相対的増幅効率は表1に示すように、臭化エチジウム染色アガロ
ースゲル上で可視産物を生成するために必要なサイクル数により決定された。コ
ドン284周囲のp53配列を含む50塩基対の合成2重鎖DNA鋳型は、示されているよう
にMspI部位を置換する4塩基により識別される。

【０１１１】

【表１】 1 産物低収量 表1：3'天然型塩基およびヌクレオチド類似体プライマーを用いた伸長効率およ
び変換。4種の異なる鋳型が、順にA,G、CおよびTと対合する3'塩基または類似体
からのプライマー伸長を試験するために用いられた。相対的効率はTaqストーフ
ル断片ポリメラーゼを用いて可視産物を生成するために必要なサイクル数により
決定された。10サイクル、20サイクル（＋＋）、30サイクル（＋）、40から50サ
イクル（±）、産物なし（-）。天然型塩基のミスマッチプライマーの2産物がシ
ークエンシングされた。一般的には各類似体において最も効率的に増幅された鋳
型が短縮プライマーにより再増幅され、各類似体の反対側にどの塩基が書き込ま
れたかを決定するためにシークエンシングされた。ある1例（Q₁）において高い
収量を有する低効率伸長産物がシークエンシングのために選択された。いくつか
の類似体に対する混合塩基の書き込み選好性が、最も頻度の高い産物を最初とし
て示されている。

【０１１２】 Taqストーフル（stoeffl）断片およびTaq蛍光シークエンシングポリメラーゼ
は同程度の量の産物を生成した。完全対合した天然型塩基プライマーは10サイク
ルの後可視産物を生成したが、いくつかの類似体プライマーは50サイクル後も産
物を全く生成しなかった。実際、高効率に増幅した類似体は反対鎖を最もよく「
読み取る」ことができる類似体であった。図4を参照されたい。

【０１１３】 各類似体（天然型塩基対照と同様に）に対する1つの産物は再増幅され、表1に
示すように、類似体の反対にヌクレオチド塩基を挿入するポリメラーゼの選好性
を決定するためにシークエンシングされた。Q₁、Q₅、Q₆、Q₁₆およびQ₁₈プライマ
ーが検出可能な真の変換産物を生成したが、しかしながらQ₅だけが真の変換産物
のみほとんど独占的に産生した。どの1つの類似体も一般化された変換能力を有
する「普遍的塩基」（Hillら「縮重ピリミジンおよびプリン塩基を含む合成オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドのポリメラーゼ認識（Polymerase Recognition o
f Synthetic Oligodeoxyribonucleotides Incorporating Degenerate Pyri
midine and Purine Base）」Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95（8）：4258〜63（
1998））としては機能しなかった。予期しなかったことに、いくつかの産物は中
央の4塩基にわたって読み取ることが困難である配列を有しており、PCR伸長中の
1塩基挿入または欠失を示唆した。これはミスマッチした天然型塩基（以下を参
照されたい）から生成された産物において特によく見られた。

【０１１４】 コンバーチドがミスマッチ伸長エラーを減少させる能力を試験するために前変
換PCRサイクルが正確性に与える影響を評価した。天然型塩基変換プライマーの
みを用いて増幅された鋳型から生成されたPCR産物が、特異的天然型塩基プライ
マーを用いた選択的増幅が続けられるコンバーチドを用いた初期の2回のPCRサイ
クルから生じる産物と比較された。これらのコンバーチドが最も効率的に伸長さ
れることが示されていたので、前変換PCRはQ₅、Q₆、およびQ₇類似体を含むプラ
イマーセットを用いて実施された。PCR全体の正確性および3'ミスマッチプライ
マー伸長を改善するために、CiNF緩衝液、緩衝液G（f）が使用された（Dayら、N ucleic.Acids.Res. （1999））。変異型MspI部位を含む9種の異なる合成2重鎖鋳
型は、3'類似体前変換プライマーを用いた前変換あり、または、なしで増幅され
た。図6A〜Bに示されるように、天然型塩基変換プライマーおよび3'類似体前変
換プライマーの両方がMspI部位の外側の塩基CCGGを操作するように設計された。
いくつかの変換は対照として機能することを意図した。これらの場合には鋳型の
元々の塩基は類似体前変換後復原されるか、または全長完全対合プライマーを用
いて決して変化されなかった。前変換反応は2サイクルのコンバーチドPCR産物が
引き続く増幅のために鋳型として用いられ、一方合成2重鎖が非前変換PCRの開始
物質として用いられたことを除いては、全ての段階は前変換および非前変換反応
の間で同一に行われた。両方の場合において3'天然型塩基対が選択的に目的最終
産物を増幅するために使用された。これらのプライマーは非ハイブリダイズジッ
プコード配列を5'末端に含んでおり、図6Bに示すようにそれらは最終的には最終
の20〜30PCRサイクルのプライマー結合部位として機能した。変換産物は図6CのL
DRにより定量された。

【０１１５】 図7は実験産物を示す。全体としては、天然型塩基ミスマッチ変換は図7A第9レ
ーン、図7B第1、3、5、7、15および17レーンに示されるよう80％超の不正確な変
換産物を生成したが、前変換はいくつかの変換の正確性および/または収量を改
善できるであろう。一般的には前変換を用いても、転換を達成することは困難で
あった。G→CおよびA→C変換は、天然型塩基またはQ₆プライマー（図7A第11〜14
レーン）のいずれを用いても予測産物はほとんど生成されなかった。Q₆前変換の
使用はG→TおよびA→T変換産物の収量を改善した（図7B第11、13レーンの天然型
塩基変換と第12および14レーンのQ₆前変換と比較せよ）。塩基転位の場合、C→T
変換はCXGG鋳型上で天然型塩基ミスマッチプライマーを用いた場合予期されなか
った1塩基短縮のアーチファクトを産生したが（図7B第1、3、5、7、15および17
レーン）、図7B第2、4、6、8、16および18レーンに見られるようにQ₆前変換を用
いると正確な産物が生成された。加えて図7A第9および10レーンに示されるよう
にQ₆プライマーは予測T→C変換産物の収量を実際改善した。対照は予測どおり実
施された。全てのC→CおよびT→T非変換反応は図7A第1、3、5、7、15および17レ
ーン、および図5B第9レーンに見られるようにコンバーチドなしで正確に働き、
相当するQ₆前変換産物は、図7A第2、4、6、8、16および18レーン、および図7B第
10レーンに示されるように元々の配列に復元された。要約するとQ₆前変換は天然
型塩基のC→TおよびT→C変換により産生されるアーチファクトを減少または消失
させ、一般的に塩基転位を促進した。転換は部分的に成功しただけであった。G
→TおよびA→T変換は前変換により改善されうるであろうが、G→CおよびA→C変
換は達成され得ないであろう。

【０１１６】 見かけ上正確な変換が、試みられたC→GおよびC→A転換に関して観察されたが
、しかしながら、注意深く設計された対照鋳型はこれらの「変換」がアーチファ
クトであることを示した。C→GおよびC→A変換は中央にCpGジヌクレオチドを含
む鋳型に対して成功したようであった（図8Aおよび図8B、第1〜3、13〜21レーン
）。しかしながら同一の最終変換産物は中央CpGジヌクレオチドを欠く他の鋳型
を用いても観察され、これはもう明らかに不正確である。例えばGCGC産物は、予
測産物がT、GまたはAを2番目の部位に含んでいたであろう反応におけるG変換中
に生じた（図8A第4〜12レーン）。またACGT産物は、予測産物が2番目の部位に非
C塩基を挿入していたであろう変換中に生じた（図8B第4〜12レーンおよび22〜27
レーン）。認識部位の外側の塩基を変更するためのミスマッチプライマーは中央
ジヌクレオチドには到達しなかったが、これらの塩基は変更された。「成功した
」変換が予期した機構を通じて生じたかは疑わしく、したがって偶然のアーチフ
ァクトを表している。LDR産物の収量は効率的なPCRにもかかわらず2つのパリン
ドローム鋳型では低かった（図8Aおよび図8B両方の第22〜27レーン）。これらの
変換反応産物は、現在のLDRプローブセットでは同定することができない大きな
割合の挿入または欠失をおそらく含むであろう。要約すると、C→G変換はQ₅（図
8A、第5、8、11および23レーン）および天然型塩基G（図8A、第4、7、10および2
2）の両者により部分的に達成された。しかしながら、前変換は変換を改善する
ようではなかった。C→G変換は配列依存性を示した。

【０１１７】 前変換研究の結果は、天然型塩基変換においてエラーは多く見られ、しかし前
変換でのQ_5、Q₆およびQ₇コンバーチドの使用はある場合にポリメラーゼエラーを
減少させた。変換反応の点からは塩基転位は転換より容易に達成される。これは
以前の知見と一致している。Newtonらは3'末端にC-T、A-A、およびT-Tミスマッ
チ（転換）を有するプライマーにおいて、プリン-ピリミジンミスマッチ（塩基
転位）を有するプライマーよりも伸長において多くのエラーを観察した（Newton
ら「DNAにおける全ての点突然変異の分析。増幅抵抗性変異系（ARMS）（Analysi
s of Any Point Mutation in DNA.The Amplification Refractory Mut
ation System（ARMS））」Nucleic.Acids Res.17（7）：2503〜16（1989））
。ここでは、ピリミジン-ピリミジン変換は通常、特にコンバーチドを使用した
場合、予測産物を生成した。プリン-ピリミジンおよびピリミジン-プリン変換の
場合は不正確な産物がしばしば生成された。結果の要約が以下の表2に示される
。図9に示されるように、不正確な変換産物の形成は部分的には鋳型上に誤整列
された部位に対するプライマー3'ヌクレオチド（または類似体）の一時的な塩基
対滑りにより説明され得る。結果として、ミスマッチに続く配列は元々の鋳型に
は相補的ではない。初期のシークエンス実験中に類似体直後の不解読配列が観察
されたことはこの仮説と一致する。パリンドローム産物、特にCpGジヌクレオチ
ド自身は滑りおよび伸長を起こしやすい。パリンドローム産物は非パリンドロー
ム鋳型から頻繁に産生された。これらのアーチファクトはPCR緩衝液中に10％ホ
ルムアミドが存在することにより、おそらく誤整列構造を不安定化することを通
じて、減少された。最終的にはヌクレオチド類似体は天然型塩基に比べてより少
ないアーチファクトを生じた。異なる類似体は、おそらく塩基対合および滑り誤
整列安定化の相対的な能力にしたがって、異なる種類および量のアーチファクト
を産生した。したがって鋳型とよく塩基対合していない類似体からのポリメラー
ゼ伸長が遅いならば、滑りにより生成される強固な一時的な塩基対からの伸長は
、弱い塩基対合の3'末端塩基からの伸長を上回ることができるであろう。

【０１１８】

【表２】 ^aコドン248周囲のp53配列を含む50塩基対の合成2重鎖DNA鋳型は示されたMspI部
位を置換する4塩基により識別される。 表2：最も効果的な変換のために、図5および6を参照されたい。9種の2重鎖DNA鋳
型が変換反応に使用された。各々は、MspI部位が異なる4種の塩基配列（B₁B₂B₃B ₄ ）で置換されたことを除いては、コドン248周囲のp53と同一の配列を含んでい
た。B₁およびB₄-（反対鎖）は、天然型塩基プライマーを用いたPCRにより直接、
または天然型塩基プライマーによるPCRが続くヌクレオチド類似体プライマーに
よる前変換PCRのいずれかにより同時に順々にC、T、GおよびAに変換された。非
変換対照反応では変換産物は元々の鋳型と同一である。天然型塩基は対照反応、
および前変換が変換を改善しなかった例を示すために使用された。前変換はCか
らTへの変換を促進するためにQ₆が使用され、CからAへの変換を促進するためにQ ₅ およびQ₇が使用され実施された。変換プライマーはB₁およびB₄を決定する。（
理想的には変換後変化しない）B₂における意図しない塩基変化を検出するために
LDRが実施された。前変換により改善された変換は使用されたヌクレオチド類似
体により示された。対照反応において天然型塩基プライマーと同等に効果的であ
る前変換もまた使用された類似体により示された。低い変換正確性は多くのB₂エ
ラーに繋がる。主要なB₂エラー産物は同定され（例えばerrCはB₂部位がCである
ことを示す）、正しい産物が存在しないことは変換方法が失敗であったことを示
した（Xは正しい産物なし）。おそらく偶然の機構により形成された見かけ上正
しい産物は指摘されている（FPは偽陽性）。

【０１１９】 以前議論されたようにPCR-RFLPは稀な変異を同定するために幅広く用いられて
きた。この技術の限界は野生型または変異型鋳型のいずれかにおいて制限酵素切
断部位を生成するように改変されうる変異を生じる偶然性に依存していることで
ある。本研究方法に課せられた2番目の限界は、3'末端ミスマッチプライマーか
らの伸長はエラーを生じやすいことが知られているので、これらプライマーの使
用をさけなければならないことである。現在までのところ成功した試みの大多数
は3'末端ミスマッチプライマーの使用をさけるために分断型パリンドローム制限
酵素切断部位を使用した。K-rasおよびH-rasを引き起こすガンにおける変異は、
分断型パリンドローム酵素XmnI（Kumarら、「1細胞レベルでのガン遺伝子検出（
Oncogene Detection at the Single Cell Level）」Oncogene、3（6）：64
7〜51（1988））、AlwNI（Andersonら、「頭頚部ガンにおけるRASガン遺伝子変
異の存在率（Prevalence of RAS Oncogene Mutation in Head and Neck
Carcinoma）」、J.Otolaryngol. 21（5）：321〜6（1992））、およびBstNI
またはMvaI（Urbanら「PCR/RFLP解析によるC-Ki-Ras変異の検出および膵腺ガン
診断」（Detection of C-Ki-Ras Mutation by PCR/RFLP Analysis and
Diagnosis of Pancreatic Adenocarcinomas））、J.Natl.Cancer.Inst.85（2
4）：2008〜12（1993）；およびRonaiら、「定量的濃縮PCR（QEPCR）、K-Rasガ
ン遺伝子変異超高感度検出法（Quantitative Enriched PCR（QEPCR）、a Hig
hly Sensitive Method for Detection of K-Ras Oncogene Mutation）」
、Hum.Mutat.10（4）：322〜5（1997））を用いたPCR/RFLPにより10⁵に1個の感
度で検出された。これらのPCR-RFLP実験およびその他（Hattoriら、「DRD2 セ
リン311システイン多型および精神分裂症のミスマッチPCR RFLP検出（Mismatch
PCR RFLP Detection of DRD2 Ser311Cys Porymorphism and Schizophre
nia）」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、202（2）：757〜63（1994）；Beutler
ら「「ミスマッチ」PCRによるグルコセレブロシダーゼNt1226変異の簡単な検出
（The Facile Detection of the Nt 1226 Mutation of Glucocerebros
idase by “Mismatched” PCR）」、Clin.Chim.Acta.、194（2-3）：161〜6
（1990）；Hinogoraniら「1型アンジオテンシン2受容体遺伝子のC1166変異体の
簡単分子分析（A Simple Molecular Assay for the C1166 Variant of
the Angiotensin II Type 1 Receptor Gene）」、Biochem.Biophys.Res .Commun. 、213（2）：725〜9（1995）；Kuwataら、J.Allergy.Clin.Immunol、96
（6Pt2）：1051〜60（1995）；Nishiwakiら、「ミスマッチPCR-RFLPを用いた早
期発症アルツハイマー病を有する患者のAPP遺伝子の変異スクリーニング（Mutat
ional Screening of APP Gene in Patients with Early-Onset Alzheim
er Disease Utilizing Mismatched PCR-RFLP）」、Clin.Genet.49（3）：11
9〜23（1996）；Ishiharaら「サルコイドーシスにおけるTAP2遺伝子の対立遺伝
子変異解析（Analysis of Allelic Variation of the TAP2 Gene in S
arcoidosis）」、Tissue Antigens、49（2）：107〜10（1997））は3'末端ミス
マッチを避けているが、しかしながらほとんどのガン変異は、例えばCpGジヌク
レオチド等の分断型パリンドロームに変換することができない配列中に存在する
。もし連続した認識配列が分断型パリンドローム認識配列と同じ位少ないエラー
で導入することができるならば、大きな割合の変異が検出標的になるであろう。
現時点では、連続した制限酵素切断部位は、エラーを起こしやすい末端3'ミスマ
ッチプライマー伸長により導入されている。オデール（O'Dell）らはミスマッチ
PCRを用いてCpGジヌクレオチドに異なる制限酵素切断部位を導入するための一般
的方法を試験した（オデール（O'Dell）ら、「2つのミスマッチプライマーを用
いたあらゆるCpGジヌクレオチドへのTaqI制限酵素切断部位のPCR誘導（CpG-PCR
）（PCR Induction of a TaqI Restriction Site at Any CpG Dinucl
eotide Using Two Mismatched Primers（CpG-PCR））」、Genome Res.6（6
）：558〜68（1996））。ヒトLDL受容体遺伝子の4つの異なるCpGジヌクレオチド
の外側の塩基がTaqI（TCGA）、MspI（CCGG）、またはRhaI（GCGC）部位を創生す
るように変化させられた。これらの標的ではTaqI部位が3'Tミスマッチプライマ
ーにより生成に成功した。その方法はホモ接合体およびヘテロ接合体の個人を検
出可能であった。しかしながら各対立遺伝子を代表する産物の比は、生殖細胞変
異において予測されるように、同じではなかった。Tミスマッチ変換がTaqI部位
を創生できなかったいくつかの例がここに示されている。したがってその方法は
配列依存的である。オデール（O'Dell）らはCおよびGミスマッチ変換が失敗した
ことを発見した。これらの結果は、より強い塩基対合が鋳型上のプライマー滑り
の安定化をおそらく介してミスプライミングに繋がるというオデール（O'Dell）
の結論と一致する。Gotodaらは、T→C塩基転位を産生するために3'C-Aミスマッ
チ伸長によりMaeII部位（ACGT）を導入するためにPCR-RFLPを使用することに成
功したと主張する（「遺伝子増幅および制限エンドヌクレアーゼ消化によるヒト
リポタンパク質リパーゼ遺伝子の3つの分離DNA多型の検出（Detection of Thr
ee Separate DNA Polymorphisms in the Human Lipoprotien Lipase G
ene by Gene Amplification and Restriction Endonuclease Digestion
）」、J.Lipid.Res.33（7）：1067〜72（1992））。Athmaらは2種類の対立遺伝
子を識別するための制限酵素切断部位を創出するために3'末端ミスマッチプライ
マーのPCR伸長を用いた（Athmaら「運動失調毛細管拡張症座位に連鎖する1塩基
多型はミスマッチPCRにより検出される（Single Base Polymorphism Linked
to the Ataxia-Telangiectasia Locus is detected by Mismatch PCR
）」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、210（3）：982〜6（1995））。G-Tミスマ
ッチはA→G塩基転位を通じてMvaI部位（CC A/T GG）を産生した。A→G変換の
成功は本発明の方法に従って天然型塩基ミスマッチを用いて実施されたが、天然
型塩基プライマーによるT→C変換が困難であることに直面した。塩基転移は転換
よりも容易に達成することができるが、正確な産物の収量は配列依存的でありう
る。他者もまたPCR-RFLPが偽陽性結果を生じる可能性があることを発見した（Ho
danovaら、「2人のゴーシェ病患者におけるミスマッチPCR/RFLP法によるN370S変
異状態の不正確な指定（Incorrect Assignment of N370S Mutation Status
by Mismatched PCR/RFLP Methods in Two Gaucher Patients）」、J.I nherit.Metab.Dis. 、20（4）：611〜2（1997））。この中でのリガーゼ検出反応
の使用は生成された誤伸展産物の正確な量を決定することを可能にする。

【０１２０】 3'天然型塩基およびヌクレオチド類似体を含むプライマーからのポリメラーゼ
伸長の正確性が測定された。天然型ミスマッチプライマー伸長は、ある与えられ
た配列においてRFLP解析のための制限酵素切断部位を創生するための一般的な方
法としては使用することができないことを結果は示していた。プライマー滑りが
ミスマッチプライマー伸長においてエラーを産生する重要な機構であるようであ
る。この原因のエラーはいくつかの対立遺伝子特異的PCRおよびその他の高感度
変異検出法に大きな影響を与えるかもしれない。変換を促進するヌクレオチド類
似体のさらなる開発および試験により、ミスマッチプライマー伸長はほとんどア
ーチファクトなしに目的の変異を効率的に導入することができる技術となるかも
しれない。いくつかのヌクレオチド類似体がミスマッチプライマー伸長を改善す
ることが示された（表3、下を参照されたい）。3'ミスマッチ伸長のさらなる改
善が、転換で見られた高頻度の前後関係依存性エラーを最小限にするために必要
とされるであろう、そしてそれが感度の改善およびより広い範囲のPCR/RFLPを基
礎とする変異検出につながるであろう。

【０１２１】

【表３】 表3：変換戦略の概略。Q_nコンバーチドは、天然型塩基プライマーによる最終変
換の前に示されたコンバーチドを用いた前変換が必要であることを示す。いくつ
かの場合には別の付加的なコンバーチドまたは天然型塩基のみを用いて目的の変
換を生ずることができる。

【０１２２】実施例9 -PCR/RE/LDR用オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドは0.2μmolスケールでシアノエチルリン酸アミダイド化学
によりアプライドバイオシステムズ394DNAシンセサイザーにより合成された。標
準500ÅCPGカラムおよび試薬（アプライドバイオシステムズ）が以下の例外を除
いては使用された。オリゴヌクレオチド50塩基長が広孔1000ÅCPGカラム（アプ
ライドバイオシステムズ）を用いて合成された。蛍光色素FAMを5'末端に有する
オリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有してFAMリン酸アミダイド（アプラ
イドバイオシステムズ）を用いて合成された。5'リン酸塩を有するオリゴヌクレ
オチドは15分間の結合段階を有してリン酸化試薬（グレンリサーチ）を用いて合
成された。3'ブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドは3'-スペーサーCPGカ
ラム（グレンリサーチ）を用いて合成された。3'ヌクレオチド類似体6-（2-デオ
キシ-β-D-リボフラノシル-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2] オキサジ
ン-7-ワン]（Q₆）はdP-CPGカラム（グレンリサーチ）を用いて合成された。

【０１２３】実施例10 -PCR/RE/LDR用PCRポリメラーゼおよび緩衝液 使用されたポリメラーゼはAmpliTaq（アプライドバイオシステムズ）、Ventお
よびVent（exo^-）（ニューイングランドバイオラボ）、およびExpandポリメラー
ゼ混合物（Expand High FidelityキットのTaqおよびPwoIポリメラーゼ混合物
、ベーリンガーマンハイム）であった。使用された商業的に利用可能な緩衝液は
AmpliTaqおよびExpandキットにて供給された。トリスpH9.1（pH値は23℃にて1M
原液を用いて測定された）、トリシンpH8.7、EPPS（N-[2-ヒドロキシエチル]ピ
ペラジン-N'-3-プロパンスルホン酸）pH8.4、およびクエン酸塩pH7.6（シグマ）
が選択可能なPCR緩衝液として使用された。別途記載されない場合、各20μl反応
は20mMトリス、トリシン、またはクエン酸塩、200pg/mlウシ血清アルブミン、2.
5mMMgCl₂、200μM dNTP（各）および16mM（NH₄）₂SO₄または50mM酢酸カリウムを
含んでいた。10％濃度のホルムアルデヒドが示されたように使用された（実施例
11、下を参照されたい）。PCR緩衝液は、必要ならばホルムアミド、dNTPsおよび
オリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型DNAの添加を必要とする10％ストック
として調整された。

【０１２４】実施例11 -酵素緩衝液表記法 試験用PCR緩衝液は、一種類以上の成分を含んでいることが分かるように名前
を付けてある。トリス/酢酸カリウム＝緩衝液A；トリス/硫酸アンモニウム＝緩
衝液B；トリシン/硫酸アンモニウム＝緩衝液D；EPPS/硫酸カリウム＝緩衝液E；E
PPS/硫酸アンモニウム＝緩衝液F；およびクエン酸/硫酸アンモニウム＝緩衝液G
各成分の濃度は上記されている。

【０１２５】実施例12 -ゲノムDNA由来のp53エキソン7の増幅 コドン248の回りにあるp53エキソン7部分を、図10に示したように増幅した。
上流プライマーは、以下の配列番号:1: 5'-GCCTCATCTTGGGCCTGTGTTAT-3' に相当する塩基配列をもっており、その前に存在するイントロンとハイブリダイ
ズし、下流プライマーは、以下の配列番号:2: 5'-GTGGATGGGTAGTAGTATGGAAGAAATC-3' に相当する塩基配列をもっており、エキソン7の中でハイブリダイズする。全体
にわたって記載のあるPCR、制限酵素分解、およびライゲーションの段階はすべ
て、GeneAmp PCR System 2400（パーキン-エルマー（Perkin-Elmer）社製）を用
いて行なわれた。いくつかの緩衝液および酵素は、実施例10および11に示されて
いる通りに使用した。ゲノムDNAからのp53エキソン7の増幅は、50 ngのDNA、2.5
mMの各dNTP、および12.5 pmolの各プライマーを、ポリメラーゼを含まない1×
緩衝液の中に含む20μlの反応混合液から開始させた。この反応混合液をパラフ
ィンオイルで覆い、必要なユニット数のポリメラーゼを導入するために、1×緩
衝液中に希釈した1μlのポリメラーゼを加えてホットスタートを行うために、94
℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした。エキソン7セグメントを、94℃
で15秒間、65℃で2分間というサイクルを40サイクル増幅し、最後のサイクルが
終わったところで、さらに65℃で5分間増幅した。この処理手順とは異なるPCR増
幅を示した通りに行なった。

【０１２６】実施例13 -PCR/RE/LDR：フィデリティー・アッセイ法 コドン248のMspI部位（CCGG）の中央にある2塩基対を挟む変換プライマー対（
conversion primer pairs）を用いて、鋳型を増幅した（図11B）。一反応当たり
10 fmolのPCR増幅したp53エキソン7または野生型合成二本鎖鋳型のいずれか、PC
R緩衝液、およびプライマーを含むチューブを調製した。並行反応においては、2
48番目のコドンのMspI部位に代えてCGGGという配列をもつ、50 pbの合成二本鎖
マーカー鋳型（MK）を、10^-3、10^-4、10^-5および0というモル比で野生型鋳型に
加えた。CiNF緩衝液、緩衝液G(f)に含まれているVent(exo-)ポリメラーゼ以外の
成分をすべて含む反応液を94℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした。1
μlのポリメラーゼを94℃で加えて「ホットスタート」を行なった。予備変換を
行なう場合には、プライマーp53-248Q₆およびp53-248Q₆Rを各々500 fmolととも
に、94℃で15秒間、55℃で1分間、60℃で1分間というサイクルを2サイクル行な
った。その後、1 pmolのp53Taq248Tプライマーとp53Taq248TRプライマーを加え
た。予備変換を行わないときには、反応液には、プライマーp53Taq248Tとp53Taq
248TRを各々1 pmolずつか、対照用プライマーp53Msp248Cおよびp53Msp248CRを加
えた。予備変換を行なったり、行わなかったりして反応を行なった後、予備変換
PCRを以下のようにして行なった。すなわち、94℃で15秒間、55℃＋1°/cyc 1分
間（温度勾配）、60℃で1分間というサイクルを5サイクル、次に、94℃で15秒間
、60℃で2分間というサイクルを20サイクル、そして、最後に、60℃でさらに5分
間置いた。温度勾配を3サイクル行なった後、10 pmolの長いジップコード（zipc
ode）変換プライマー（p53zip248Tおよびp53zip248TR、またはp53zip248Cまたは
p53zip248CR）を加えた。変換後、20サイクルの「ジップコード」PCR（後述）の
間、野生型DNAを定期的に分解した。ポリメラーゼは、凍結融解を2回行なって不
活性化した。最後に、元の鋳型の関与なしに変換産物を検出するためにLDRを行
なった（非変換対照用反応を除く）。

【０１２７】実施例14 -PCR/RE/LDR：「ジップコード」PCR 野生型配列、または野生型変換産物を制限酵素消化によって除去した。適当な
制限エンドヌクレアーゼを反応用チューブに加え、効率的な消化を促すために必
要とされるMgCl₂をさらに添加した。MspI消化は、クエン酸緩衝液を使用すると
き以外はMgCl₂を加えずに37℃で15分間行なった。TaqI消化は、140 mM MgCl₂に
希釈した1μlの酵素を加え、6 mMのMg²⁺存在下、65℃で30分間行なった。10 pmo
lの「ジップコード」プライマーZtopとZbot（図6B）を含む20μlのPCR反応液に1
μlの10×希釈液を加えたものから、制限酵素消化しない変換産物を再増幅した
。これらのジップコードプライマーは、それぞれ、試料中に存在するゲノム配列
とは配列が似ていないDNA配列を含む。そのため、ジップコードプライマー配列
を含むプライマーを用いた以前のPCR産物のみが効率的に増幅される。Expandポ
リメラーゼ混合液および緩衝液を用いて、変換産物を増幅した（実施例10参照）
。最初にRE消化した後、ジップコードPCR再増幅を行なった後、以下のようにし
て再消化を行なった。すなわち、反応液を94℃で少なくとも1.5分間プレインキ
ュベートした後、RE消化した試料（10倍希釈液の1μl）0.1μlを20μlの反応液
に加えてホットスタートを開始させた。94℃で15秒間、60℃で2分間というサイ
クルを10サイクル行なった。上記の記載通り、ジップコードPCR増幅産物を再消
化した。

【０１２８】実施例15 -PCR/RE/LDR：リガーゼ検出反応 リガーゼ検出反応は、標準的なLDR緩衝液（25 mMトリスpH 7.6、12 mM MgCl₂
、65μg/mlウシ血清アルブミン、100 mM KCl、および10 mM DTT）の中で行なっ
た。各20 μlの反応液には、約500 fmolのdsDNA（1 μlのPCR試料）、図11Cに示
す500 fmolの各識別プローブ、および750 fmolの汎用プローブが含まれている。
期待される変換産物、すなわち、MspIの位置でのCNGGまたはTNGAへの変換を検出
するために識別プローブおよび汎用プローブのセットを合成した。3'-スペーサ
ーC3 CPGカラムを用いて汎用プローブを合成し、リン酸化試薬を用いて、カラム
上で5'末端をリン酸化した。各セットの識別プローブは、3'末端側の塩基が変え
てあり、その位置にある塩基を調べられるようになっている。識別プローブには
、さまざまな長さの5'末尾が付いており、また、蛍光検出するためにFMAで標識
されていた。5'末尾の長さによってプローブを同定し、アクリルアミドゲル上で
、異なったLDR産物を物理的に分離することができた。

【０１２９】 LDR反応液を94℃で1.5分間プレインキュベートしてから、ミネラルオイル層の
下に、5 nmolのTthリガーゼ酵素を添加した。94℃で15秒間、65℃で2分間という
10LDRサイクルを用いた。そして、反応液を94℃で保持した後、氷上で急冷して-
70℃で保存した。ゲルおよび泳動緩衝液に使用する0.6×TBE（1×TBEは、90 mM
トリスベース、90 mMホウ酸、2 mM EDTAを含む）とともに7 Mウレアを含む10％
アクリルアミドゲル上でLDR産物を分離した。ABI 373自動化DNAシークエンサー
と、アプライドバイオシステムズ・ジーンスキャン672ソフトウエア（Applied B
iosystems Genescan）（GS回収およびGS解析）を用いてデータを集めた。

【０１３０】実施例16 -PCR/RE/LDRに関する画像処理 ABI GS解析ソフトウエアによって、未加工のゲル図を作成した。染色特異的な
図をアドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）3.0で開き、トリミングし、大
きさを変えてから、グレイスケールに変換した。グレイスケール画像をNIHイメ
ージ（NIH Image）1.59で開き、反転させて、1D垂直方向の背景を除去した。選
択的には、NIHイメージ（NIH Image）1.59は、補正された2-D画像から3-Dプロッ
トを作成することができた。バックグラウンドを補正した画像を再反転させ、比
較がしやすくなるよう、カラーテーブルを入れ換えて微妙な濃度の違いをつける
ことによって、フォトショップでシュードカラーを付けた。色の置換以外には、
相対的な濃度を保存するために、直線画像の処理を行なっただけである。

【０１３１】実施例17 -PCR/RE/LDR最適化 図10では、p53遺伝子のコドン248にあるMspI部位（CCGG）の中で生じた低量の
変異を検出同定するために、PCR/RE/LDRが開発された。最初のPCRで、ゲノムDNA
からエキソン7が増幅されたことが、図10Aに示されている。この産物は、MspI部
位の中央にあるCpGジヌクレオチドを増幅する二回目のPCR行なうための鋳型とし
て役立つ。前から存在する部位をもたない配列の中に制限酵素部位を作出するた
めに、ミスマッチプライマーを用いて、CpGジヌクレオチドに隣接する一個以上
の塩基を変更する。この結果、例えば、図10Bに示すように、制限酵素（NCGN→T
CGA）TaqI部位を作出する変換PCRがもたらされた。連続的なII型制限酵素部位を
導入するための一般化した方法では、変換PCRプライマーは必ず3'末端にミスマ
ッチをもつ。好ましくない自然の塩基ミスマッチによって、隣の部位に間違った
塩基が挿入される（O'Dellら、Genome Res., 6(6):558-68(1996)；およびEiken
ら、「PKU変異を診断するための天然のおよび増幅によって作出した制限酵素部
位（Application of Natural and Amplification Created Restriction Sites f
or the Diagnosis of PKU Mutations）」、Nucleic Acids Res., (1999)）のを
回避するために、3'ヌクレオチドアナログのプライマーによる予備変換を行なう
。しかし、3'アナログプライマーによる伸長によって、縮退産物のプールができ
る（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999)）。したがって、この予備変換段階の
後、自然の塩基プライマーを用いて、所望の産物を選択的に増幅する。

【０１３２】 並行非変換対照反応を行ない、また、予備変換を行なったときと行わないとき
の真の変換反応を行なうことによって、PCRエラーと比較したときのミスマッチ
変換によるエラーを見積もった。非変換反応産物は、MspI部位（CCGG）を保持し
ていた（図10A参照）が、一方、変換産物はTaqI部位（TCGA）を導入していた（
図10B参照）。PCR/RE/LDRの段階はすべて、プライマーと制限用エンドヌクレア
ーゼ（MspIまたはTaqI）だけを変えつつ同じ条件下で行われた。どちらの場合に
も、切断できないDNAが選択的に増幅された。野生型DNAを制限酵素消化によって
選択的に除去するときには、ほぼ100％野生型である、試料中のDNAの最初の量に
対して、産生されたDNAで不正確な配列をもつものの割合を決定する必要がある
。既知の画分であるマーカー（MK）DNA存在下で並行反応を行なった。MK DNAは
、MspI部位が1塩基変化している（CGGG）ため、MspIで切断できなくなっている
。C→Gの転換は、ポリメラーゼのエラーによっては起こりにくい。MKの標準曲線
によって、LDRで検出した変異の定量が可能になる。図10Cは、マーカーを用いた
変異配列のLDR定量法を示すものである。PCRエラーを最小限にするためのPCR条
件（非変換反応に見られる）およびミスマッチ伸長エラー（変換反応で見られる
付加エラー）を調べた。

【０１３３】 ゲノムDNAの標的配列増殖、変換、およびPCR/RE/LDRの再増殖段階では、異な
ったポリメラーゼ特性が必要となるため、校正作用をもつポリメラーゼ、をもた
ないポリメラーゼ、さまざまなポリメラーゼを調べた。PCR/RE/LDR全体にわたっ
て、LDRで測定される塩基の変化を最小限に抑えることが必須であるため、最高
の忠実度を保つためには校正作用をもつポリメラーゼを選ぶのが論理的であると
考えられよう（Keohavongら、PCR Meth. Appl., 2:288-92 (1993)）が、これら
のポリメラーゼは、ミスマッチプライマー伸長によって、変換に干渉する可能性
がある。したがって、非校正作用ポリメラーゼの忠実度を最大にするPCR条件を
見つけだすべきである（Keohavongら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86）23):9
253-7)。

【０１３４】 まず、PCR/RE/LDRを最も感度のよいアッセイ法として用いて、処理全体を通じ
て最高の忠実度を維持するPCR条件を判定した。エラーの主要な原因は以下のも
のと予想される：1）ポリメラーゼによる取り込み間違い、および2）鋳型DNAの
分解。PCR緩衝液のpHを上げると、おそらく、DNA鎖の切断をもたらす脱プリン化
が抑えられるため、ロングPCRが改善された（Barnes、「ラムダバクテリオファ
ージ鋳型からの35-KbまでのDNA増幅法で、高忠実度かつ高収量が得られる方法(P
CR Amplification of up to 35-Kb DNA with High Fidelity and High Yield fr
om Lambda Bacteriophage Templates.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(6):
2216-20 (1994); Chengら、「クロニーングした挿入配列およびヒトのゲノムDNA
からの長いDNA標的配列の効果的な増幅(Effective Amplification of Long Targ
ets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA)」、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91(12):569-9 (1994);およびSang、「非常に長い配列の忠実度が高いポリ
メラーゼ連鎖反応による部位特異的変異誘発(Generation of Site-Directed Mut
agenesis by Extralong, High Fidelity Polymerase Chain Reaction)」、 Anal
. Biochem., 233(1):142-4 (1996))。pHを高くすると、鋳型の損傷を抑えること
ができるが、高pHは、ポリメラーゼの忠実度に悪影響を与えることも知られてい
る（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度に忠
実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA Pol
ymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Eckertら、「DNAポ
リメラーゼの忠実度とポリメラーゼ連鎖反応（DNA Polymerase Fidelity and th
e Polymerase Chain Reaction）」、PCR Methods Appl. 1(1):17-24 (1991); お
よびClineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR
忠実度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Pol
ymerases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996)）。したがって、他
に、トリシン、EPPS、およびクエン酸の各緩衝液も調べたが、これらは、pK_aが7
から8の範囲で、|ΔpK_a|がトリスよりも低い。ほとんどのPCR忠実度とロングPCR
の研究にはトリスを使用するが、トリスは、鋳型の完全性を維持するために、高
い温度では僅かにアルカリ性pHであるべきで、ポリメラーゼの忠実度を維持する
ために、伸長温度ではpHが中性であるべきという二重の制約を満たすことができ
ない。トリスに代わる、より低い|ΔpK_a|をもつ緩衝液の使用を目指す研究者も
いた（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度に
忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA P
olymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Eckertら、「DNA
ポリメラーゼの忠実度とポリメラーゼ連鎖反応（DNA Polymerase Fidelity and
the Polymerase Chain Reaction）」、PCR Methods Appl. 1(1):17-24 (1991);
Brailら、「PCR-PPCPAにおける、改良されたポリメラーゼの忠実度(Improved Po
lymerase Fedility in PCR-PPCPA)」、Mutat. Res., 303(4):171-5 (1993)）。
本発明の緩衝液条件を最適化させる目的で、緩衝用化合物以外は同じ成分を含む
PCR緩衝液を作製して、PCRに対する緩衝液特異的な効果を調べた。硫酸アンモニ
ウムを含む試験用PCR緩衝液のセットを作製し、また、別に酢酸カリウムを含む
セットを作製して、塩の効果を調べた。純粋な溶液の中、および1×PCR緩衝液混
合液の中で各緩衝液のΔpK_aを測定した（データは示さない）。これらの試験結
果は、小さな定数（.005 pHユニット/℃）で補正することによって、純粋な緩衝
液について公表されているΔpK_a値と一致していた（Good、生物学研究に役立つ
アミン緩衝液（Amine Buffers Useful for Biological Research））、Fasman編
「生化学および分子生物学のハンドブック（Handbook of Biochemistry and Mol
ecular Biology）」、オハイオ州クリーブランド（Cleveland, Ohio）: CRCプレ
ス社（CRC Press Inc）、 pp. 367-369 (1976); およびBlanchard、「酵素用緩
衝液(Buffers for Enzymes)」 Meth. Enzymol., 104:404-14 (1984)）が、これ
は、pH検出針そのものに温度依存性があるためであろう。各試験用PCR緩衝液のp
Hを調整して、65℃でほぼ中性のpHになるようにした。しかし、1×PCR緩衝液で
は、純粋な緩衝液に較べるといくらか異なったΔpK_aをもっていた。例えば、緩
衝液Bである1×TsNでは、ΔpK_a＝-.033/℃であるのに対して、100 mMトリスでは
、-.030/℃、また、、緩衝液Cである1×TcKでは、ΔpK_a＝-.022/℃であるのに対
して、100 mMトリシンでは、-.025/℃である。

【０１３５】 トリス、トリシン、EPPSを含む試験用PCR緩衝液を用いて、p53の248番目のコ
ドンにあるMspI部位（CCGG）に変換を起こさないことで、PCRの忠実度を調べた
（図12）。本実験における目的は、さまざまな緩衝液とポリメラーゼ酵素を用い
て、PCRの誤差率を調べることであった。エラーが起きると、選択された制限酵
素によって切断できなくなる鋳型ができるため、このエラーが起きた鋳型が、本
当の変異DNAに沿って増幅されるにつれて、偽陽性が蓄積され続ける。これによ
って、エラーを最小限に抑えつつ、増幅を行なうために必要な条件が設定できた
。ゲノムDNAからのp53エキソン7の予備増幅と、「変換」段階の両方において、
同一のポリメラーゼと緩衝液のセットを用いた。既に述べたように、「変換」段
階では、中央のCpGに隣接するCおよびG塩基で3'末端が終結する、完全一致プラ
イマーを用いることによって、MspI部位が維持される。最初のMspI消化の後、10
サイクル毎定期的に、鋳型と再増幅産物を再消化して、WT配列を取り除いた。CG
GG配列をもつ合成マーカー変異MKを、これらの反応液に10^-3、10^-4、10^-5および
0という割合で野生型（WT）に加えた。MKは、MspI制限酵素消化によっては切断
されないが、各PCRサイクルで増幅され、産物の量を測定するための内部対照を
提供する（下記参照）。また、変換段階における完全一致プライマーが、中央の
GGに隣接するCおよびG塩基上で再び終結すると、MK産物も、自らの配列を維持す
る。MKのPCRによって生じるエラー産物には、通常、MspI部位がなく、一般的に
、鋳型MKと区別することができない。偶然にMspI部位ができると、この産物は消
化によって分解される。偽のLDRエラーが起きたとしても、「マーカーなし」対
照と比較することによって検出することができる。

【０１３６】 各緩衝液について、生起したCGGGエラーのバックグラウンド量を示す0 MK対照
を用いて、4種類の並行反応の各々でLDRによりMKを検出した。LDRによって検出
された、この他のエラー産物の量をMKと比較して、生成された各エラー産物の画
分を評価した。図12Aに示したように、AmpliTaqは、ほとんど転換（C→GまたはC
→A）を起こさなかったが、大量のC→T移行が観察された。Ventは、AmpliTaqに
較べてC→T移行がずっと少なかった（図12B）。AmpliTaqは、緩衝液B、D、およ
びFにおける硫酸アンモニウム（図12A、レーン5〜8、13〜16、21〜24）と対比す
ると、緩衝液A、C、およびEにおいて酢酸カリウムの存在に対し、僅かな依存性
を示した（図12A、レーン1〜4、9〜12、17〜20）。以前説明した（Barnes、「ラ
ムダバクテリオファージ鋳型からの35-KbまでのDNA増幅法で、高忠実度かつ高収
量が得られる方法(PCR Amplification of up to 35-Kb DNA with High Fidelity
and High Yield from Lambda Bacteriophage Templates.)」 Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 91(6):2216-20 (1994); Keohavongら、PCR Meth. Appl., 2:288-92
(1993); Carielloら、「変性勾配ゲル電気泳動によって測定した、サーモコッ
カス・リトラリスのDNAポリメラーゼ（Vent）のPCRにおける忠実度(Fidelity of
Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR Determined by Denat
uring Gradient Gel Electrophoresis)」、Nucleic Acids Tes., 19(15): 4193-
8 (1991); およびMattilaら、「サーモコッカス・リトラリスのDNAポリメラーゼ
のDNA合成の忠実度-校正活性をもった超高温安定性酵素 (Fidelity of DNA Synt
hesis by the Thermococcus Litoralis DNA Polymerase- An Extremely Heat St
able Enzyme with Proofreading Activity)」、Nucelic Acids Res., 19(18):49
67-73(1991)ように、Ventポリメラーゼは、トリス/酢酸カリウム緩衝液Aよりも
トリス/硫酸アンモニウム緩衝液Bにおける方がより効率的に鋳型を増幅した（図
12B、レーン1〜4対レーン5〜8）。しかしながら、Ventは、トリシン/硫酸アンモ
ニウム緩衝液D（図12B、レーン13〜16）およびEPPS/硫酸アンモニウム緩衝液F（
図12B、レーン21〜24）と比較すると、トリシン/酢酸カリウム緩衝液C（図12B、
レーン9〜12）およびEPPS緩衝液E（図12B、レーン17〜20）において忠実度の向
上を示した。

【０１３７】 ポリメラーゼ-緩衝液の異なった組合せの相対的忠実度は、最初に存在したWT
に対するMKの割合のlog₁₀として表される、それらの「感度」によって表示する
ことができる。トリス/酢酸カリウム緩衝液Aにおける、AmpliTaq増幅でのC→Tエ
ラーを例に採ることができる。CTGGエラー産物のシグナル（図12A、レーン2）を
、MKのCGGGエラー（12A、レーン1〜3）と比較すると、シグナルの強さは、10^-3M
K:WT希釈（図12A、レーン1）にもっともよく似ている。すなわち、-log[MK/WT]=
-log[10^-3]=3であるから、C→Tエラー率が10^-3のときには、感度は3となる。こ
のことから、感度が高くなるほど、エラー率が下がることが分かる。各変異に対
する感度が高い反応ほど、全体的な忠実度が高くなる（結果は表1にまとめた）
。Vent反応液の多くは、すべての変異について感度が5であった（すなわち、10⁵ に1回）（図12B）が、図12Aに示すように、AmpliTaq反応液の感度は3であった（
すなわち、10³に1回）（図12A）。感度は、ポリメラーゼの誤差率よりもアッセ
イ法の有用性を表すものである。消化前の65サイクル（D）にわたって蓄積され
た一つに塩基で起きる変異のすべての画分（F）から、各サイクルの各塩基当た
りのエラー（ER）を評価することができる。本発明の目的からすれば、非飽和PC
Rを何回も行なったため、サイクル回数を複製の回数の推定値とする。ER＝F/Dか
ら、Ventポリメラーゼは、トリシン/酢酸カリウム緩衝液Cでは、1×10^-7/塩基/
サイクルよりも小さなエラー率をもち、トリシン/硫酸アンモニウム緩衝液Dでは
、約2×10^-7/塩基/サイクル、また、TsN緩衝液Bでは2×10^-6/塩基/サイクルであ
った。2×10^-5/塩基/サイクルというエラー率も見られた。これは、主に、トリ
ス/酢酸カリウム緩衝液Aにおける、C→T移行のエラーによるものであった。この
アーティファクトを除去すると、AmpliTaqの忠実度を10倍以上に改善することが
できた。クロニーング法およびスクリーニング法を用いて、ポリメラーゼのエラ
ーを評価した者もいた（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラ
ーゼによる高度に忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus
Aquaticus DNA Polymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990);
Clineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR忠実
度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymer
ases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996); Mattilaら、「サーモ
コッカス・リトラリスDNAポリメラーゼのDNA合成の忠実度-校正活性をもった超
高温安定性酵素 (Fidelity of DNA Synthesis by the Thermococcus Litoralis
DNA Polymerase- An Extremely Heat Stable Enzyme with Proofreading Activi
ty)」、Nucelic Acids Res., 19(18):4967-73(1991); Huangら、「インビトロDN
A増幅の過程において、野生型ディープVentおよびエキソヌクレアーゼ欠失DNAポ
リメラーゼが生み出す忠実度と優性変異（Fidelity and Predominant Mutations
Produced by Deep Vent Wild-Type and Exonuclease-Deficient DNA Polymeras
e During in Vitro DNA Amplification）DNA Cell Biol., 15(7):589-94 (1996)
）。また、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用いた者もいた（Keohavongら、PCR
Meth. Appl., 2:288-92 (1993); Keohavongら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86）23):9253-7; Carielloら、「変性勾配ゲル電気泳動によって測定した、サー
モコッカス・リトラリスのDNAポリメラーゼ（Vent）のPCRにおける忠実度(Fidel
ity of Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR Determined by
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)」、Nucleic Acids Tes., 19(15):
4193-8 (1991);およびLingら、「忠実度に関するポリメラーゼ連鎖反応の最適
化：改良T7 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、およびVent DNAポリメラ
ーゼ（Optimization of the Polymerase Chain Reaction with Regard to Fidel
ity: Modified T7, Taq, and Vent DNA Polymerases）」、PCR Methods Appl.,
1(1):63-9 (1991))。しかし、これらの方法は、変異DNAを直接測定するものでは
なく、すべての変異を検出するものでもない。クロニーング法およびDGGE法では
、Ventポリメラーゼは、0.3から4×10^-5/塩基/サイクルと評価されたエラー率を
もつ（Carielloら、「変性勾配ゲル電気泳動によって測定した、サーモコッカス
・リトラリスのDNAポリメラーゼ（Vent）のPCRにおける忠実度(Fidelity of The
rmococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR Determined by Denaturin
g Gradient Gel Electrophoresis)」、Nucleic Acids Tes., 19(15): 4193-8 (1
991);およびLingら、「忠実度に関するポリメラーゼ連鎖反応の最適化：改良T7
DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、およびVent DNAポリメラーゼ（Optimi
zation of the Polymerase Chain Reaction with Regard to Fidelity: Modifie
d T7, Taq, and Vent DNA Polymerases）」、PCR Methods Appl., 1(1):63-9 (1
991))。Taqポリメラーゼのエラー率は、我々が、Tsk、すなわち緩衝液Aで観察し
たAmpliTaqのエラー率に匹敵する0.8から9×10^-5/塩基/サイクルをもつ評価され
ている（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度
に忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA
Polymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Clineら、「Pfu
DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR忠実度(PCR Fidelit
y of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases)」、Nucle
ic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996);および Brailら、「PCR-PPCPAにおける
、改良されたポリメラーゼの忠実度(Improved Polymerase Fedility in PCR-PPC
PA)」、Mutat. Res., 303(4):171-5 (1993)）。熱安定性ポリメラーゼの中で、P
fuが、報告された中で最も低い、0.7から1.6×10^-6/塩基/サイクルと評価された
エラー率をもつ（Clineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリ
メラーゼのPCR忠実度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermos
table DNA Polymerases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996); Lun
dbergラ、「パイロコッカス・フリオサスから単離した熱安定性DNAポリメラーゼ
を用いた高度に忠実な増幅（High-Fedility Amplification Using a Thermostab
le DNA Polymerase Isolated from Pyrococcus Furiosus）」、Gene, 108(1):1-
6 (1991); Andreら、「ヒトミトコンドリアDNA配列に対するPfu DNAポリメラー
ゼの忠実度と変異範囲（Fidelity and Mutational Spectrum of Pfu DNA Polyme
rase on Human Mitochondorial DNA Sequence）」、Genome Res., 7(8):843-52
(1997)）。また、Pfuポリメラーゼは、トリシン、またはその他の低|ΔpK_a|緩衝
液においてより高い忠実度を示す。

【０１３８】 高い忠実度と校正作用をもつ酵素が、ゲノムDNAからの増幅を改善させると考
えられるが、それでもなお、変換段階での校正を避ける必要がある。変換条件を
固定して、高度に忠実なゲノム増幅条件をいくつか変えて調べた。ゲノム増幅は
、Vent(exo-)クエン酸/硫酸アンモニウム緩衝液G、または、Vent(exo-)クエン酸
/硫酸アンモニウム緩衝液Gに10％ホルムアミドを入れた緩衝液G(f)のいずれかで
行なった（表4参照）。ミスマッチプライマー伸長による変換を見越して、PCRの
忠実度を最適化するため、Vent(exo-)とともに非変換プライマーを用いた。もっ
とも忠実度の高い条件は以下の通りであった。Expand/10％ホルムアミド入り緩
衝液Cからのゲノム増幅産物を3サイクル目に加えて、Vent/緩衝液Gによるゲノム
増幅を開始させた。これらのVent/緩衝液G反応には、Mg²⁺およびPCRプライマー
が必要であったが、それ以外にDNAを用意する必要はなかった。その他の調査条
件についてのエラー率の観測値については、表4を参照のこと。

【０１３９】

【表４】 a 最小限全部で50サイクルした結果に基づくから、すなわち観察エラー数÷50
、 b ゲノムDNAからのVent PCR産物は見られなかった。Vent変換PCRに対するTaqに
よる増幅産物を使用した。 c 緩衝液C中のExpandポリメラーゼを用いて行なった並行ゲノムDNA増幅におけ
る反応物から1μlを採って、3回目のPCRサイクルの後に加えた鋳型 表4.標的配列を増幅するためのPCRおよび変換PCRを行なうためのさまざまな緩衝
液における、校正作用をもつポリメラーゼと、その作用をもたないポリメラーゼ
を用いたときの忠実度の比較。まず、ゲノム増幅と変換のために一種類の緩衝液
を用いて、TaqポリメラーゼとVentポリメラーゼを調べた。変換段階で、短い完
全一致プライマーを用いて、ポリメラーゼエラーのバックグラウンドレベルを測
定するために、p53の248番目のコドン近くにあるMspI部位の非変換のみを行なっ
た。LDRによって、MspI部位の2番目の位置（CCGG→CNGG）における変異を定量し
た。校正作用をもつポリメラーゼと、その作用をもたないポリメラーゼを用いた
並行反応によって、ゲノム増幅と変換における忠実度を比較した。まず、Taqポ
リメラーゼに校正機能をもつPfuポリメラーゼを加えたExpandポリメラーゼを用
いて、ゲノムDNAからの標的配列の増幅を開始し、その後、高忠実度Ventポリメ
ラーゼPCRを行なった。Ventポリメラーゼの代わりに校正機能をもたないVent(ex
o-)を用いて、校正機能が必要か否かを決定し、また、校正が許されない変換段
階を行なった。変換用PCR緩衝液における10％ホルムアミドの効果も調べた。す
べての緩衝液には、200 μg/mlのウシ血清アルブミン、2.5 mMのMgCl₂、および2
00 μMのdNTP（各々）が入っていた。具体的な成分は、A（Tsk）20 mMトリス pH
9.1、50 mM酢酸カリウム（標準的Taqポリメラーゼ緩衝液）、B（TsN）20 mMト
リス pH 9.1、16 mM硫酸アンモニウム（標準的Ventポリメラーゼ緩衝液）、C（T
cK）20 mMトリシン pH 8.7、50 mM酢酸カリウム、D（TcN）20 mMトリシン pH 8.
7、16 mM硫酸アンモニウム、E（EpK）20 mM EPPS pH 8.4、50 mM酢酸カリウム、
F（EpN）20 mM EPPS pH 8.4、16 mM硫酸アンモニウム、G（GiN）20 mMクエン酸
pH 7.6、16 mM硫酸アンモニウム、(f)は、10％ホルムアミドが入っていることを
示している。(4)は、4 mM MgCl₂まで上昇させたことを示す。(8)は、8 mM MgCl₂ まで上昇させたことを示す。

【０１４０】 PCR/RE/LDRの各段階について、ミスマッチ変換を行わないときに高忠実度を維
持するPCR条件を見つけた。また、既知の高忠実度PCR条件を用いて、p53の248番
目のコドンにあるMspI部位（CCGG）をTaqI部位（TCGA）に変更して、変換を調べ
た。前に、最初に野生型DNAと対比したときの忠実度を測定するための並行反応
で行なったように、MK（CGGG）を添加した。上記のように高忠実度PCRを行ない
、いくつかの反応（全部ではない）については、予備変換を行なった。図10Bに
示したように、3'末端に縮退ピリミジンヌクレオチドQ₆をもつプライマーを用い
て、予備変換を行なった。最終変換は、天然の塩基である3'Tミスマッチプライ
マーを用いて行なった。LDRを用いて、MspI、TaqI、およびMKの配列における二
番目の塩基、すなわち、CNGGまたはTNGAを調べるために産物の検出を行なった。
予備変換を行なった場合と行わなかった場合の変換の忠実度を、非変換対照と比
較した。変換がうまく起きると、MspI部位（CCGG）がTaqI部位（TCGA）に変わり
、MKも、CGGGからTGGAに変化する。しかし、変換に成功するための主要な問題は
、あらゆる場合に中央部の塩基、すなわち、TaqI変換の場合にはCpG、MKの場合
にはGpGを維持できるかにある。図13は、変換の結果を示すものである。図13の
レーン1〜4（C:G）は、MspIで制限酵素消化された非変換反応であり、レーン5〜
8（Q₆:G）は、TaqIで制限酵素消化された予備変換/変換反応であり、レーン9〜1
2（T:G）は、予備変換を行わなかった変換反応で、TaqIで制限酵素消化したもの
である。図13のC:Gレーン1〜4に示されているように、以前決定した予備増幅お
よび変換にとって最良の条件を用いたとき、変換を行わないPCR/RE/LDRは、10⁴
中1よりも高い感度を示した。図13のT:Gレーン9〜12、Tミスマッチプライマーに
よって、MspI部位がTaqIに変化したPCR/RE/LDRは、一見非常にうまくいったよう
に見えた。変換がうまくいったときに予想されているように、図の_CG_領域にお
いてMspI産物を検出することはできず、そのため、この部位がTaqIに変換してか
ら酵素消化されたように見える。しかし、図13のT:Gレーン9〜11で、添加したMK
との反応によって大量のMK（CGGG）画分が見られ、同じような大量の画分が、図
13のT:Gレーン12の0 MK対照でも観察されている。したがって、MKは全量とも、
天然の塩基プライマーのミスマッチ伸長によって産生されたアーティファクトで
ある。この現象は、伸長反応の過程で、MKの内部配列をまねるように（CCGG→TG GA）、MspI部位の2番目のCがGに変換するというものである。Q₆:Gレーン5〜8、Q ₆ プライマーによる予備変換によって、MKアーティファクトは消失する。

【０１４１】 レーン5〜8のQ₆変換試料と比較して、図13のレーン1〜4の非変換試料に大量に
存在するWTが、ホルムアミドによるMspI消化阻害の原因である可能性がある。C:
Gレーンでは、非変換対照において強い野生型LDRバンド（WT）が存在し、Q₆:Gレ
ーンとT:Gレーンで、変換した配列をTaqI消化した後は、このバンドが存在しな
くなるということが証明しているように、ホルムアミドは、明らかに、MspI酵素
消化を阻害する。

【０１４２】 それぞれの非変換対照用反応（図13、C:Gレーン2、3）と比較して、10^-4およ
び10^-5のMKレーン（図13、Q₆:Gレーン6、7）に見えるMK産物が低量なのは、MKの
変換の効率が低いからであろう。実際、TaqI部位の作出には、中央にあるCpGジ
ヌクレオチドの両側の2箇所で変換が起こる必要がある。MKの濃度を10倍低くす
ると、MK変換は10倍よりもずっと低くなる。したがって、その産物の多くが、MK
配列の片側だけで変化するため、LDRプローブの半分が、この配列に正確にハイ
ブリダイズできなくなり、ライゲーションが起きなくなる。LDR検出は、完全に
変換した少量の鋳型の存在を示すのみである。それにもかかわらず、これら2本
のレーンでは、MK産物の量の方が対照の量よりもずっと多い。図13のレーン8を
図13のレーン6および7と比較されたい。ホルムアミドは、変換効率を低下させる
が、変換の忠実度は大いに向上する。

【０１４３】 Newtonらは、「DNAの点突然変異の解析：増幅不応性変異系（ARMS）（Analysi
s of Any Point Mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation Sy
stem (ARMS)）」、Nucleic Acids Res. 17(7):2503-16 (1989)において、C・T、
A・AおよびT・Tミスマッチはすべて、プリン-ピリミジンミスマッチに較べて、T
aqポリメラーゼで伸長することが非常に難しいことを発見した。また、自然の塩
基ミスマッチを伸長させると忠実度が低くなることを観察した者もいる（O'Dell
ら、Genome Res. 6(6):558-68 (1996); およびEikenら、「PKU変異を診断するた
めの天然のおよび増幅によって作出した制限酵素部位（Application of Natural
and Amplification Created Restriction Sites for the Diagnosis of PKU Mu
tations）」、Nucleic Acids Res., (1999)）。多数の塩基に対して構造的に類
似しているヌクレオチドアナログを使用すると、異なった塩基と対合したときに
、アナログからのポリメラーゼによる伸長（読み取り）が可能になり、アナログ
の反対側に異なった塩基を挿入すること（書き込み）が可能になることがある。
本発明の目的にとって、予備変換処理の効率は、必ずしも高いものである必要は
ない。しかし、変換に成功するには、変換の標的となる塩基のみを確実に変更す
るために、高いPCR忠実度が要求される。変異を検出する対象となる配列の中で
、変換の標的となった塩基以外の塩基に変化が起きると、偽陽性変異というアー
ティファクトが起こる。Q₆:Gミスマッチを生じさせる3'Q₆プライマーを用いた予
備変換によって、G・Tミスマッチによるポリメラーゼ伸長を避けることができる
。その後に続く増幅サイクルにおいて、Q₆の反対側には、明らかにしばしばAが
書き込まれる。この観察結果は、Q₆が、ほぼ同じ頻度でCおよびTと同じように塩
基対合するというヒル（Hill）らの結果と矛盾しない（Hillら、「ポリメラーゼ
による、縮退したピリミジンおよびプリン塩基を取り込んだ合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチドの認識（Polymerase Recognition of Synthetic Oligondeoxyr
ibonucleotides Incorporating Degenerate Pyrimidine and Purine Bases）」
、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(8): 4258-63 (1998)）。互変が容易であれ
ば、Q₆は、塩基対合をしたときにどちらかのピリミジンを模倣して、ミスマッチ
によるゆらぎ（wobble）を避けることが可能になる。予備変換の後で、天然の塩
基プライマーを加えると、既に、相当量の完全一致する鋳型が存在しているか、
そうでなければ、予備変換の有無に関わらず、MKアーティファクトが反応液中に
出現しているはずである。Q₆以外のヌクレオチドアナログを、より効率的な変換
の架橋として使用することも可能である（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999)
）。

【０１４４】 PCRにおいてプライマーからのポリメラーゼ伸長反応の忠実度を測定して、場
合によっては忠実度を向上させる条件を発見した。思うに、より高い忠実度は、
ポリメラーゼによる間違った取り込み、プライマーのずれ、および鋳型の分解を
減少させることによってもたらされる。PCR/RE/LDRによって、野生型配列以外の
配列を選択的に増幅して、非常に低量の「変異」配列を測定することが可能にな
る。本発明に係る方法によって、天然の塩基ミスマッチプライマーによる伸長反
応は、RFLP解析を行なうために、制限酵素部位を配列中に人為的に作出するため
の一般的な技術としては使用できないことが明確に示されている。図13に示した
ように、また、以前から観察されていたように（O'Dellら、Genome Res. 6(6):5
58-68 (1996); およびEikenら、「PKU変異を診断するための天然のおよび増幅に
よって作出した制限酵素部位（Application of Natural and Amplification Cre
ated Restriction Sites for the Diagnosis of PKU Mutations）」、Nucleic A
cids Res., (1999)）、自然の塩基ミスマッチ伸長反応にはエラーが生じやすい
。既存の配列から制限酵素部位を完璧に作出するには、エラーを許さない方法が
必要である。本発明に係る方法を用いた、これらの実施例の結果は、ヌクレオチ
ドアナログを高忠実度PCR条件と組み合わせて用いると、徹底的にエラーを減ら
すことができる。LDRは、特異的なPCRエラーを正確かつ高感度で測定することが
できるため、これらの実験では、プライマー伸長反応の本当の特異性を観察する
ことができた。すなわち、さまざまなポリメラーゼおよび緩衝液の産物を、PCR/
RE/LDRの過程のさまざまな段階で測定して、PCRの効率と忠実度を両方とも最大
にすることができた。その結果、PCR/RE/LDR法をまとめて、10⁵という感度目標
を達成することができた。しかし、このように高い感度は、前から存在していた
MspI部位に変換が起こっていない場合という特別の場合にだけ達成できた。現時
点では、プライマーのずれが、ミスマッチプライマー伸長反応のエラーが生じう
る重要な機構として残っている（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999)）。この
エラー原因の生体内での重要性ははっきりしないが、対立遺伝子特異的なPCRや
、他のインビトロでの変異検出法に重大な影響を与える可能性がある。さらに別
のエラー原因が、ヌクレオチドアナログによる予備変換の後に、天然の塩基プラ
イマーを用いて、増幅するための特異的な配列を選択する場合に生じる。これは
、選択した天然の塩基プライマー画分が、目的の塩基以外の塩基とミスマッチ対
合を形成する可能性があるからである。異なった塩基が反対側に挿入されるヌク
レオチドアナログの特徴的なセットが知られている（Dayら、Nucleic Acids Res
., (1999); Hillら、「ポリメラーゼによる、縮退したピリミジンおよびプリン
塩基を取り込んだ合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの認識（Polymerase Rec
ognition of Synthetic Oligondeoxyribonucleotides Incorporating Degenerat
e Pyrimidine and Purine Bases）」、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(8): 4
258-63 (1998)）。したがって、高忠実度ミスマッチプライマー伸長反応プロト
コールを作成するには、これらの問題を克服することができる新しい変換法の開
発が待たれる。高忠実度PCRと、効率を監視するLDR法を組み合わせるときには、
ミスマッチプライマー伸長反応が、所望の変異をアーティファクトなしに正確に
導入するための技術となる可能性もある。

【０１４５】 具体的に説明するために本発明を詳細に説明してきたが、このような細部は、
単にこの目的のためだけのものであると理解されたい。当業者は、以下の特許請
求の範囲で限定されている発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな
変更を加えることができると思われる。

【配列表】

【配列表】 【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のカップル型ポリメラーゼ連鎖反応（coupled polymerase
chain reaction）-制限エンドヌクレアーゼ消化-リガーゼ検出反応過程の略図
である。

【図２】 ゲル電気泳動を使用した、図１の過程によって生ずるライゲーシ
ョン産物の検出を示す。

【図３】 位置特定可能なアレイを使用した、図１の過程によって生ずるラ
イゲーション産物の検出を示す。

【図４】 ヌクレオチド類似物の事前変換によって促進される変換を示す。
配列中のC:G塩基対はT:A塩基対への変換の標的になる。直接変換を試みるために
3'側天然塩基ミスマッチプライマーを使用しないで、ヌクレオチド類似物（Q₆）
プライマーを事前変換に使用する。Q₆類似物はG塩基を読み、ポリメラーゼに3'
側Q₆プライマーから効率的に伸長させる。PCR中、逆方向のプライマーがQ₆PCR産
物にアニーリングし、ポリメラーゼによって伸長されて、対向鎖を合成する。ポ
リメラーゼが鋳型のQ₆類似物に到達すると、ポリメラーゼは類似物に対してA(ま
たはG、示していない)を書き、鎖の合成を継続する。2,3サイクル後、類似物に
たいする縮重配列を有する産物のプールが作製される。次いで、望ましい塩基変
更を有する産物を選択的に増幅するために、天然の塩基プライマーを添加する。

【図５Ａ〜Ｉ】 PCRプライマーに使用するヌクレオチド類似物を示す。最
終的な脱保護されたオリゴヌクレオチドにおいて、示す塩基類似物を含有するヌ
クレオチドの名前は以下のようである：Q₁、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシ
ル)イミダゾール-4-カルボキサミド（図5A）；Q₂、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフ
ラノシル)-3-ニトロピロール（図5B）；Q₅、2'-デオキシイノシン（図5C)；Q₆、
6-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,
2]オキサジン-7-オン（図5D)；Q₇、2-アミノ-7-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノ
シル)-6-メトキシアミノプリン（図5E)；Q₁₆、1-(21-デオキシ-β-D-リボフラノ
シル)-4-ヨードピラゾール（図5F)；Q₁₈、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル
)ピロール-3-カルボキサミド（図5G)；Q₁₉、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシ
ル)-4-ニトロピラゾール（図5H)。塩基類似物（Q）はデオキシリボフラノースの
1'位に結合する。ヌクレオチド類似物は、スクシニルリンカー（R=CPGのリンカ
ー）を介して制御式細孔ガラス（controlled pore glass(CPG)）カラムに結合さ
れる。オリゴヌクレオチドは、ジメトキシトリチル（DMT）保護基を除去し、3'
側末端に類似物を配置した後、5'側ヒドロキシルから合成される。CPGカラムか
ら切断し、脱保護後、オリゴヌクレオチドは3'側塩基類似物ヒドロキシル基（R=
H）からポリメラーゼによって伸長される（図5I）。

【図６Ａ〜Ｃ】 ミスマッチ伸長および3'側ヌクレオチド類似物変換に使用
されるプライマーを示す。相補的な（-鎖）配列は逆方向（3-5'）、例えば逆方
向の鎖プライマー（名前の最後に「R」をつける）で示す。図6Aでは、9つの異な
る合成50 bpの2本鎖鋳型の1つを融解した状態で示し、プライマーを相補的な配
列に並べて示す。プライマー伸長は、3'側天然塩基およびヌクレオチド類似物プ
ライマー（p53-248Xおよびp53-248XR）を使用して実施した。いくつかの伸長産
物は、切断型ジップコードプライマーp53zip248およびp53zip248Rを使用して再
度増幅し、ジップコードプライマーの一方（ZtopまたはZbot）を使用して配列決
定した。図6Bでは、3'側ヌクレオチド類似物プライマー、例えばp53-248Q₆およ
びp53-248Q₆Rを使用して、9の異なる50 bp合成2本鎖鋳型に事前変換を実施した
。事前変換の有無にかかわらず、変換は、3'側天然塩基、例えばプライマーp53z
ip248Tおよびp53zip248TRを含有するプライマーを使用して実施した。これらの
変換産物を、ジップコードプライマーを使用して再度増幅し、LDRによって同定
した。図6Cでは、変換産物中の特定の塩基の変更を同定するためにLDRプローブ
セットを設計した。LDRプローブは、互いに競合して、変換産物にアニーリング
する。好ましくは、重複またはギャップのない相補的な上流LDRプローブおよび
下流LDRプローブが高い特異性でライゲーションする。識別用プローブは異なる
長さの5'側末端を有し、アクリルアミドゲルでの特定の産物の分離を可能にした
。野生型鋳型の非変換時におけるPCRエラー産物を同定するために使用されるプ
ローブセットを示す。

【図７Ａ〜Ｂ】 天然の塩基およびQ₆コンバータイド（convertide)による
変換の結果を示す。9の鋳型からの変換産物はPCR/LDRによって検出された。各鋳
型は、配列を示してある中央の4塩基を除いて、同一の配列の50-bp塩基対の合成
2本鎖DNAであった。変換はこれらの4塩基内で生じた。示した3'側天然塩基また
はコンバータイドを有する変換プライマーから出発することによって作製される
予測される変換産物を示す。図7Aは、Q₆事前変換の有無にかかわらず、第1の塩
基のCへの変換を示す。図7Bは、Q₆事前変換の有無にかかわらず、第1の塩基のT
への変換を示す。

【図８Ａ〜Ｂ】 天然の塩基、Q₅およびQ₇コンバータイド（convertides)に
よる変換を示す。9個の鋳型からの変換産物はPCR/LDRによって検出された。各鋳
型は、配列を示してある中央の4塩基を除いて、同一の配列の50-bp塩基対の合成
2本鎖DNAであった。変換はこれらの4塩基内で生じた。示した3'側天然塩基また
はコンバータイドを有する変換プライマーから出発することによって作製される
予測される変換産物を示す。図8Aは、Q₅またはQ₇事前変換の有無にかかわらず、
第1の塩基のGへの変換を示す。図8Bは、Q₅またはQ₇事前変換の有無にかかわらず
、第1の塩基のAへの変換を示す。

【図９Ａ〜Ｈ】 ポリメラーゼ伸長の忠実度を示す。プライマーのずれは観
察された伸長産物の多数を占める（図7および図8）。図9Aでは、完全に相補的な
プライマーにより適切な産物が得られる。図9Bでは、第2の塩基のT:Gミスマッチ
がTGGA(または、TGCA)産物を説明している。図9Cでは、CCGG鋳型のマイナス鎖に
ずれがないQ₆:G塩基対からの伸長（その後の3'側T変換プライマー）により、予
測されるTCGA産物が得られた。図9Dは、CTGG鋳型およびいくつかの他の鋳型のマ
イナス鎖にずれがないQ₆:G塩基対からの伸長（その後の3'側T変換プライマー）
により、予測される産物が得られることを示す。図9Eでは、GGミスマッチ伸長に
より、明らかに、1つの鋳型の予測されるGC産物が得られたが、おそらく偶然に
すぎない（図9F参照）。図9Fでは、GGミスマッチからの全ての伸長により、先行
する塩基のずれによって形成されるGTミスマッチに一致する、GC伸長産物が得ら
れた。図9Gでは、Q₅:GおよびQ₇:G伸長産物により、明らかに、1つの鋳型の予期
されるGC産物が得られたが、おそらく偶然にすぎない（図9H参照）。図9Hでは、
Q₅:GおよびQ₇:Gミスマッチからの全ての伸長（その後の3'側G変換プライマー）
により、先行する塩基のQ₅:TミスマッチまたはQ₇:Tミスマッチに一致したGC伸長
産物が得られた。

【図１０Ａ〜Ｃ】 ゲノムDNAからのp53エクソン7の増幅の略図（図10A）お
よび正常なMspI部位のTaqI部位への変換である。まず、鋳型にp53エクソン7のPC
R増幅を実施する（図10B）。次に、PCR変換段階を実施し、コドン248をtheに変
換して(TCGA）TaqI制限酵素切断部位を作製する（図10B）。

【図１１Ａ〜Ｃ】 変換エラーを回避するために、既存の制限酵素切断部位
のPCR/RE/LDRによってポリメラーゼ忠実度を測定するために使用したPCRプライ
マーを示す。使用した方法は、変換段階について図6に記載されているものであ
る。しかし、図11に示す忠実度の実験では、変換過程内の最適な緩衝液条件を試
験するために、緩衝液成分を改良した。図11AはPCR忠実度アッセイ法を示す。合
成50塩基対2本鎖マーカー鋳型（MK）および野生型p53エクソン7PCR産物を平行反
応において既知の比で混合する。完全なマッチプライマーp53-248shortおよびp5
3-248shortRは野生型CCGGおよびCGGGを増幅する。次いで、プライマーp53zip248
shortおよびp53zip248shortRを含有するより長いジップコードを添加した。最後
に、野生型を繰り返し消化し、ジップコードプライマー（ZtopおよびZbot）で再
度増幅した。図11Bでは、3'側コンバータイド、例えばp53-248Q₆を含有するプラ
イマーを使用して事前変換を実施した。事前変換の有無にかかわらず、MspI部位
のTaqI部位への変換は3'側天然塩基プライマーp53zip248Tおよびp53zip248TRを
使用して実施した。上記のように長いプライマーを添加し、変換産物をさらに増
幅した。野生型産物を、新たな部位に適当な制限エンドヌクレアーゼで消化した
。突然変異産物は主にジップコードプライマーで増幅された。図11Cでは、ライ
ゲーション点周囲の鋳型配列を照会するために、LDRプローブセットを設計した
。重複またはギャップのない完全にハイブリダイゼーションされた上流および下
流のLDRプローブは主に高い特異性でライゲーションされた。識別用プローブは
、アクリルアミドゲルでの特定の産物の分離を可能にする異なる鎖長の5'側末端
を有する。示すプローブは、MspI部位の第2の塩基に生じる突然変異を同定する
ために使用した（変換はない）。余分なプローブ（p53LDR248FTCL）は、MspI部
位の第1塩基と第2塩基のC→T転位を比較するために使用した。識別プライマーの
3'側末端前塩基にT、共通プローブの5'側末端前塩基にAを有する変換産物のTaqI
部位の第2塩基の突然変異を同定するために、識別用プローブと共通プローブの
同等のセットを使用した。

【図１２Ａ〜Ｂ】 図11に示すPCR/RE/LDR実験によって検出される緩衝液お
よび酵素依存的PCRエラーを示す。示すポリメラーゼ/緩衝液の組み合わせを使用
して、ゲノムDNAからp53エクソン7を増幅した。同じ緩衝液を完全なマッチプラ
イマーによる反応に使用して、MspI部位を再度増幅した。図12Aでは、Taqポリメ
ラーゼ（T）を種々の試験用PCR緩衝液に使用したが、図12Bでは、Ventポリメラ
ーゼ（V）を種々の試験用緩衝液に使用した。Ventポリメラーゼは、TsK、緩衝液
A、緩衝液でゲノムDNAからp53エクソン7を増幅しなかった。この場合だけでは、
2つの異なる酵素/緩衝液セットを事前増幅および「変換」（完全なマッチプライ
マーを使用したので、実際の変換ではない）に使用した。AmpliTaqT/Tskエクソ
ン7ゲノムDNAPCR産物をVent V/Tskに置換し、緩衝液A中で再度増幅した。「C」
はMKが添加されていないことを示す（対照反応）。

【図１３】 変換の忠実度の比較結果を示す。変換反応産物の相対的な強度
は、3-Dプロットにおける各々のピークの色と高さによって示す。マーカー（MK
）DNA（CGGGがMspI部位で交換されている）を平行反応において野生型（WT）に
既知の比で添加した。-log(MK:WT)は、存在するMKの相対的な画分を示し、例え
ば、-log(MK:WT)=3はMK:WTの比が1:1000であることを意味する。「C」はMKが添
加されていないことを示す（対照反応）。非変換対照反応（C:G）は完全なマッ
チ3'側Cプライマーを使用して実施した。MspI部位(CCGG)のTaqI部位（TCGA）へ
の変換は、3'側Q₆ヌクレオチド類似物プライマーを使用した事前変換の有無にか
かわらず（それぞれ、Q₆:G反応およびT:G反応）、天然の塩基3'側Tプライマー
を使用して実施した。MspI非変換のLDR産物はCNGGを含有し、TaqI変換の産物はT
NGAを含有するが、中央の塩基だけ（第2塩基および第3塩基）を_NG_と示す。LDR
産物は、サイズが2塩基異なることによってアクリルアミドゲルで分離するよう
に設計された。中間サイズの未測定のバンドも観察された。レーン1〜4はPCR/RE
/LDR中にMspIで消化したが、レーン5〜12はTaqIで消化した。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１４５】 具体的に説明するために本発明を詳細に説明してきたが、このような細部は、
単にこの目的のためだけのものであると理解されたい。当業者は、以下の特許請
求の範囲で限定されている発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな
変更を加えることができると思われる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Cornell Research Foundation, Inc. Purdue Research Foundation Board of Supervisors of Louisiana State University コーネル リサーチ ファンデーション インク. ルイジアナ ステイト ユニバーシティ パーデュー リサーチ ファンデーション <120> COUPLED POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION ENDONUCLEASE DIGESTION-LIGASE DETECTION REACTION PROCESS カップル性ポリメラーゼ連鎖反応-制限エンドヌクレアーゼ消化- リガーゼ検出反応 <130> <140> PCT/US00/07133 <141> 2000-03-17 <150> US 60/125,251 <151> 1999-03-19 <160> 36 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 1 tgtgatgatg gtgaggatgg gcctccggtt catgccgccc atcgaggaac 50 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 2 gttcctgcat gggcggcatg aaccggaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <221> N_region <222> (25) <223> Where N is A,C,T,G or Q(n) analog <400> 3 ttcttcctgc atgggcggca tgaan 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <221> N_region <222> (26) <223> Where N is A,C,T,G or Q(n) analog <400> 4 ttctgatgat ggtgaggatg ggcctn 26 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 5 cttggacgag ttcatacgcg ttcctgcatg ggcggcatga 40 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 6 gcaaactggg tcgccacgtg atgatggtga ggatgggc 38 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 7 cttggacgag ttcatacgc 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 8 gcaaactggg tcgccac 17 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 9 cttggacgag ttcatacgcg ttcctgcatg ggcggcatga at 42 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 10 gcaaactggg tcgccacgtg atgatggtga ggatgggcct t 41 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 11 aaaaaagcat gggcggcatg aaca 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 12 aaaagcatgg gcggcatgaa cg 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 13 aagcatgggc ggcatgaact 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 14 gcatgggcgg catgaacc 18 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 15 ggaggcccat cctcaccatc at 22 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <221> N_region <222> (30) <223> Where N is A,C,T,G <400> 16 ccaagtgatg atggtgagga tgggcctccn gttcatgccg cccatgcagg aacgcgtatg 60 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 17 gttcctgcat gggcggcatg aactggaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 18 gttcctgcat gggcggcatg aacgggaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 19 gttcctgcat gggcggcatg aacaggaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 20 gttcctgcat gggcggcatg aatcgaaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 21 gttcctgcat gggcggcatg aagcgcaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 22 gttcctgcat gggcggcatg aaacgtaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 23 gttcctgcat gggcggcatg aacatgaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 24 gttcctgcat gggcggcatg aacgcgaggc ccatcctcac catcatcaca 50 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 25 cttggacgag ttcatacgcg ttcctgcatg ggcggcatga ac 42 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 26 cttggacgag ttcatacgcg ttcctgcatg ggcggcatga ag 42 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 27 cttggacgag ttcatacgcg ttcctgcatg ggcggcatga aa 42 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 28 gttcctgcat gggcggca 18 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 29 gtgatgatgg tgaggatgg 19 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 30 gttcctgcat 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gggcctgtgt tatc 24 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 36 gtggatgggt agtagtatgg aagaaatc 28

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５１】 図1Aから図1Cは本発明の方法に従ったPCR/RE/LDRによる変異DNAの増幅および
検出の概略図である。その過程は正常、すなわち野生型の大量存在配列および、
あるいはガン遺伝子等の低頻度のその配列の変異体を含む試料を用いて開始され
る。図1Aから図1Cでは変異型および野生型の配列を比較しており、それらは1塩
基に関してのみ異なることが明らかである。野生型配列では識別塩基は「C」で
あり一方変異型配列は相当する場所に「T」を有する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５２】 最初に、試料は改変型標的配列を創生する一次PCR段階に供される。図1Aの段
階1および2に示される一次PCR操作では、野生型および変異型DNAが94℃の変性を
受け、1重鎖DNA鋳型を創生する。図1Aの段階1に示されるように、各々3'末端ヌ
クレオチド類似体を含むプライマーAおよびBがその1重鎖DNA鋳型にアニールする
。ポリメラーゼにより促進され、類似体プライマーは図1Aの段階2で示される伸
長操作を受ける。2重鎖核酸を変性し、結果として生じる1重鎖核酸にプライマー
をハイブリダイズさせ、プライマーを伸長するこの過程が定法のPCR操作に従っ
て繰り返され、ヌクレオチド類似体を含む改変型標的配列体の形で伸長産物を大
量に産生する。ポリメラーゼ連鎖反応過程は、これにより参考文献により組み入
れられた、H.Erlichら「ポリメラーゼ連鎖反応最近の進展（Recent Advances
in Polymerase Chain Reaction）」Science 252：1643〜50（1991）、M.Inn
isら「PCR実験法：方法および応用入門書（PCR Protocols： A Guide to M ethods and Applications） 」Academic Press：ニューヨーク（1990）、およ
びR.Saikiら「熱安定性DNAポリメラーゼを用いたプライマー指向性のDNAの酵素
増幅（Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with Thermost
able DNA Polymerase）」Science 239：487〜91（1998）に完全に記載されて
いる。本発明に従ったPCR使用のさらなる詳細は以下の実施例で提供される。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５３】 図1Aの段階1に示されるように野生型および変異型配列はこれら配列の識別塩
基の近位に相補的なX：WおよびY：Z塩基対を有する。これらの配列が一次PCR操
作において変成されると、プライマーAおよびBは、QがYおよびW塩基に結合する
ようにこれらの配列にハイブリダイズするように構成される。一次PCR段階の引
き続くサイクルではポリメラーゼは今度は鋳型鎖となっている中に存在するQ類
似体に遭遇する。ポリメラーゼは類似体をいくつかの塩基のなかの1つとして「
読み取る」ことができ、Qの反対側に事実上は相同体に「相補的である」いくつ
かの異なる塩基の1つを「書き込む」だろう。そのような部位では異なる塩基が
取りこまれうるので、産物は縮重され、理想的には産物プールの中でQ類似体の
反対側の同一部位にG、A、TおよびCを有する。これらの縮重塩基は「N」で示さ
れる。図1Aの段階2に示されるように、野生型および変異型配列両者において形
成されるミスマッチは塩基「N」で示される。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５５】 次に図1Aの段階3に示されるように二次PCR相が実施される。二次PCR相のオリ
ゴヌクレオチドプライマーセットは標的特異的部分および5'上流二次プライマー
特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部
分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチド
プライマーを有する。これらは図1Aの段階3においてプライマー「C」および「D
」により表される。二次PCR相中に、二次PCRプライマーの標的特異的部分は一次
伸長産物の相補鎖にハイブリダイズするであろう。図1Aの段階3に示されるよう
にこれらのハイブリダイズされたプライマーは続いてポリメラーゼを用いて図1A の段階3に示されるような二次PCR伸長産物を形成するために伸長される。2重鎖
核酸の変性、プライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を含む、
二次PCR相は、一次PCR伸長産物が十分に増幅されるまで2〜20PCRサイクル繰り返
される。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５６】 図1Aから図1Cに示されるように変異型配列対野生型配列における「T」対「C」
の各差異のために、野生型配列に由来する二次伸長産物内の制限エンドヌクレア
ーゼ（RE）部位を認識する適切なREを用いて二次伸長産物は処理することができ
る。しかしながら変異型核酸配列に由来して形成される二次PCR伸長産物は制限
エンドヌクレアーゼ部位を含まない。図1Aから図1Cの実施態様では野生型配列に
由来する二次伸長産物内に組み入れられた制限エンドヌクレアーゼ認識部位はTa
qI認識部位5'-TCGA-3'である。TaqIは2重鎖DNA二次伸長産物の各鎖において認識
部位内のTおよびCの間で特異的に切断する。しかしながら他の制限エンドヌクレ
アーゼ部位およびそれらの相当する制限エンドヌクレアーゼが代わりに用いられ
ることができるであろう。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５８】 二次伸長産物の制限エンドヌクレアーゼ処理後、三次PCR過程が実施される。
図1B段階6に示されるように、これは、二次オリゴヌクレオチド組の1番目のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む普遍的プライマー（U1
）である1番目の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチド組の2番目のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む2番目の三次プライマ
ーを提供することを含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは制限エン
ドヌクレアーゼ処理された二次伸長産物の増幅に使用することができる。二次伸
長産物は、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成するために、三次オリゴヌク
レオチドプライマーセットおよびポリメラーゼとともに混和される。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５９】 三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、2重鎖核酸の変性、結果として生じる1重
鎖核酸に対する三次オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション、
およびハイブリダイズしたプライマーの伸長を含むポリメラーゼ連鎖反応条件に
供される。この操作は、三次PCR伸長産物を適切量産生するために、これらの段
階を含む十分な数のサイクルを介して繰り返される。二次PCR伸長産物は制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて処理されるので、野生型核酸配列由来の三次PCR伸長
産物は識別塩基に相当するヌクレオチドの近傍でそれらが切断される結果として
短い。一方変異型核酸配列由来の三次PCR伸長産物はより大きく、そして識別塩
基に相当するヌクレオチドの近傍で切断されない。図1B段階6を参照されたい。
結果として変異型核酸配列由来の三次PCR伸長産物は、続くLDR段階において野生
型核酸配列由来の産物からは容易に識別される。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００６１】 三次PCR伸長操作に続いて、結果として生じる三次伸長産物は図1C段階7Aまた
は7BのいずれかにしたがってLDR操作に供される。これらの選択肢のいずれにお
いてもLDR操作は最初に1重鎖DNA（ssDNA）を産生するために三次PCR伸長産物を
最初に変性することにより開始される。識別プローブは3'末端に異なるヌクレオ
チドおよび5'末端に異なる数のアデニン塩基を有することにより識別される。結
果として各識別プローブより産生されるライゲーション産物は蛍光標識検出によ
り同定され、そして異なる電気泳動度によりゲル上でお互いに識別される。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００６２】 図1C段階7AにおいてLDRプローブセットは4種の選択可能な識別プローブおよび
4種の識別プローブのいずれとも連結可能な共通プローブを含む。共通プローブ
はその3'末端に蛍光標識を含む。三次伸長産物、これらのオリゴヌクレオチドプ
ローブ、および熱安定性リガーゼがリガーゼ検出反応混合液を形成するために混
合され、一連のリガーゼ検出反応サイクルに供される。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７１】 図1C段階7Aに示されるように変異核酸配列由来のライゲーション産物はその5'
末端に2個のアデニン塩基を有する識別プローブから形成される。他の識別プロ
ーブは変異核酸配列が存在する結果として共通プローブに連結されないであろう
。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７３】 図2は、図1C段階7Aのリガーゼ検出反応操作から形成される産物のゲル電気泳
動検出を示している。図2に示されるように、非連結プローブは大きな電気泳動
度を有し、ゲルの底部にバンドを形成する。野生型配列由来のいくらかの少量の
三次伸長産物由来ライゲーション産物は次に大きな電気泳動度を有し、ゲル上の
中間位置にバンドを形成する。変異型配列由来ライゲーション産物は野生型ライ
ゲーション産物よりも小さい電気泳動度を有し、野生型ライゲーション産物の少
し上部に濃いバンドを形成する。変異型配列が試料中に存在しない場合、そのよ
うなゲルバンドは形成されない。最上部の2つのバンドは電気泳動度が小さい微
量ライゲーション産物である。これらの高分子量バンドはアーチファクトであり
、おそらくPCR中のポリメラーゼのエラーおよび鋳型分解に起因しているであろ
う。PCR緩衝液の組成は増幅後の試料中に存在するこれらのPCRエラー産物の割合
に強い影響を与える。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７５】 図1C段階7Bに示されているリガーゼ検出反応操作の代替として、識別プローブ
がその5'末端の異なるアドレス特異的部分（すなわちZIP1、ZIP2、ZIP3およびZI
P4）と共に提供されることができる。これは識別プローブのアドレス特異的部分
に相補的な異なる捕捉オリゴヌクレオチドプローブを有する、位置特定可能なア
レイ上でライゲーション産物が検出されることを可能にする。結果として、リガ
ーゼ検出反応相に続くハイブリダイゼーション操作中に各ライゲーション産物は
DNAマイクロアレイの異なるアドレスに向かう。ハイブリダイズされたライゲー
ション産物は全て同一の標識を有するが、ライゲーション産物が固定化された場
所によりお互いに区別することができる。または異なる標識が識別塩基上に存在
することができ、一方アドレス特異的部分は共通プローブ上に存在する。この実
施態様では異なるライゲーション産物は同一の捕捉プローブを有する部位のアレ
イ上に固定化されるであろう。しかしながら異なるライゲーション産物は異なる
標識により識別されるだろう。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７６】 図3は位置特定可能なアレイを用いて図1C段階7Bの過程から生じるライゲーシ
ョン産物を検出することを示している。この場合図1C段階7Bに示されるように共
通プローブはある標識を有し、識別プローブはアドレス特異的部分を有する。図
3ではライゲーション産物は、ライゲーション産物中のアドレス特異的部分がア
レイ上の捕捉オリゴにハイブリダイズすることに効果的な条件下で、位置特定可
能なアレイに接触させられる。図3段階2および3に示されているように、ライゲ
ーション産物を形成しない識別プローブ（例えばアドレス特異的部分ZIP4（示さ
ず）およびZIP3（示す）を有するプローブ）はアレイ上に固定化されるが標識が
ないために検出されない。非結合の共通プローブはアレイにハイブリダイズせず
、続いて洗い流され（例えば65℃〜80℃および低塩濃度において）、シグナルを
発生しない。野生型核酸配列由来の任意の少量のライゲーション産物（上流での
不完全なエンドヌクレアーゼ消化のため）はアドレス特異的部分ZIP1に相補的で
ある捕捉オリゴヌクレオチドに（任意の相当する非結合識別プローブとともに）
固定化される。同様に、変異型配列由来の任意のライゲーション産物はアドレス
特異的部分ZIP2に相補的である捕捉オリゴヌクレオチドに（任意の相当する非結
合プローブとともに）固定化される。変異型配列および/または野生型配列の存
在は本実施態様においてはアレイ上の各々異なる場所での蛍光シグナルの存在に
より検出される。ヘテロ接合性はアドレス特異的部分ZIP1およびZIP2に相補的な
捕捉オリゴヌクレオチドにおける等量のシグナルで示される。シグナルは蛍光イ
メージ装置を用いて定量化されてもよい。この様式は各対立遺伝子に独自のアド
レスを使用し、低レベルシグナル（30アトモルから100アトモルのLDR産物）の非
常に正確な検出を達成するために好ましいかもしれない。

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０５】実施例4 -ミスマッチ変換産物シークエンシング 各類似体で最も効率よく増幅された産物が水で1000倍希釈された。希釈された
DNA産物は、以前のPCRと同一のポリメラーゼおよび緩衝液を用いて、ただし図6A
に示すように10pmolの「ジップコード（zipcode）」含有プライマーp53zip248（ 配列番号：5） およびp53zip248R（配列番号：6）を加えて、94℃15秒間、65℃2
分間で20サイクル再増幅した。ジップコード配列はいかなる生物のDNA配列に対
しても知られている配列類似性を示さないオリゴヌクレオチドである。ジップコ
ードプライマーを用いた増幅は以前のPCRのジップコード含有産物を特異的に増
幅することを意図している、すなわち（ジップコードを含まない）ほぼ同一の未
変換DNAは増幅されず（ジップコードを含む）変換されたDNAのみが増幅されるで
あろう。変換産物は8％アガロースゲルで泳動され予測された大きさのバンドが
切り出される。DNAはゲル薄片より0.45μmHVLPフィルター（ミリポア（Millipor
e））を通して30分間235Cマイクロ遠心分離機（フィッシャー（Fisher））内で
遠心分離することで抽出される。変換産物を乾燥し、ABIダイターミネーターサ
イクルシークエンシング反応混合液中に、キットの指示（アプライドバイオシス
テムズ）に従いジップコードプライマーの1つとともに再懸濁した。等容量（各3
μl）のシークエンシング反応物が、83％ホルムアミド（イーストマン（Eastman
））、4mM EDTAおよび8mg/mlブルーデキストラン（シグマ）を含む色素混合物と
一緒にされた。試料を7M尿素、10％アクリルアミドゲル（ゲルおよび泳動緩衝液
中19：1ビス、0.6xTBE）にてABI373DNAシークエンサーで電気泳動した。データ
はABI373ADNAシークエンサーデータ解析ソフトウェア1.2.0版を用いて解析され
た。

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０６】実施例5 -前変換段階を有する変換産物同定および有さない変換産物同定 変換忠実度を、9種の異なる合成鋳型を用いて、Q₅、Q₆およびQ₇（実施例1を参
照されたい）を含む3種のプライマーを用いた前変換ありおよびなしで試験した
。前変換PCRは、ミスマッチプライマー伸長を避ける努力の中で、所望の天然型
塩基プライマーを添加する前に、3'類似体プライマーを用いて実施された。50塩
基対の2重鎖DNA鋳型は、MspI部位（CCGG）に相当する塩基を除いて、図6Bに示さ
れているコドン248周囲の野生型p53配列を含んでいた。以下の配列はMspI部位に
おいて置換された。1）CCGG（野生型、配列番号：2）、2）CTGG（配列番号：17
）、3）CGGG（配列番号：18）、4）CAGG（配列番号：19）、5）TCGA（配列番号
：20）、6）GCGC（配列番号：21）、7）ACGT（配列番号：22）、8）CAGT（配列
番号：23）、および9）GCGC（配列番号：24）。前二次PCR反応（「前変換」）は
、50fmol/μlのp53-248Q_N （配列番号：3）およびp53-248Q_NRプライマー（配列番 号：4） およびCiNF緩衝液、緩衝液G（f）中のVent（exo-）、および10fmol/μl
の2重鎖鋳型を用いたホットスタートにより実施された。前変換は94℃15秒間、5
5℃1分間、60℃1分間の2回のPCRサイクルを使用した。産物は4℃で保存された。
変換反応は同一のポリメラーゼおよび緩衝液を含み、別の付加的な鋳型を含まな
い1μlの前変換反応物を用いて開始された。各反応は4組のp53zip248Nおよびp53
zip248NR（N＝C（配列番号：25）、T（配列番号：9）、G（配列番号：26）また
はA（配列番号：27））の1つを用い、各プライマー10pmolを必要とした。前変換
なしの平行変換反応は、前変換反応液の分取の代わりに10fmolの合成2重鎖鋳型
を加えることによりホットスタートを用いて開始された。PCRサイクルは以下の
通りであった：94℃15秒間、55℃（1サイクルに付き＋1℃上昇）1分間、60℃1分
間でにて5サイクル、その後94℃15秒間および60℃2分間を20サイクル。最終伸長
は60℃5分間で実施された。ポリメラーゼは凍結融解を2度繰り返すことで失活さ
れた。産物は水に10倍希釈され、1μlを20μlのExpandポリメラーゼおよび緩衝
液混合液に添加することにより再増幅された。PCRは12pmolのジップコードプラ
イマーZtop（配列番号：7）およびZbot（配列番号：8）（図6）を用いて94℃15
秒間および65℃2分間の20サイクル（低収率反応では30サイクル）にて実施され
た。LDRは、形成された変換産物を同定するため、以下に記載のように行われた
。

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０７】実施例6 -リガーゼ検出反応 リガーゼ検出反応は標準LDR緩衝液中で行われた（25mMトリスpH7.6、12mM Mg
Cl₂、65μg/mlウシ血清アルブミン、100mM KCl、10mMジチオトレイトール）。
各20μl反応は、図6Cに示されるように約500fmolの2重鎖DNA（試料1μl）、500f
molの各識別プローブ（配列番号：11から配列番号：14）、および750fmolの共通
プローブ（配列番号：15）を含んでいた。識別および共通プローブセットは予想
変換産物上でLDRが実施されるように合成され、センス鎖のMspI部位に相当する
塩基（Bi）において異なった（野生型ではB₁B₂B₃B₄＝CCGG）。識別プローブは野
生型配列を有し-B₁B₂（-OH3'）にて終結する。識別プローブはB₂部位に各々順に
C、T、GおよびAを有する4種のプローブセットとして合成された。共通LDRプロー
ブは、野生型配列が続けられる（5'PO₄-）B₃B₄-を有し、5'塩基が識別プローブ
の3'塩基に隣接する形で鋳型にハイブリダイズした。識別プローブはMspI部位の
B₂でのエラー産物を同定するために3'末端塩基が異なっていた。簡単にはB₂のみ
がモニターされた。LDRプローブは予想変換産物に対応した。例えば-CCGG-鋳型
の-ACGT-への変換は-AC、-AT、-AGおよび-AAで終結する識別プローブおよび5'pG
T-を有する共通プローブを必要とした。識別プローブは異なる長さの5'尾部およ
び蛍光検出のためのFAM標識を有した。尾部長は異なるLDR産物のアクリルアミド
ゲル上での物理的分離を可能にし、それゆえLDR産物の同定を可能にした。

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１１４】 コンバーチドがミスマッチ伸長エラーを減少させる能力を試験するために前変
換PCRサイクルが正確性に与える影響を評価した。天然型塩基変換プライマーの
みを用いて増幅された鋳型から生成されたPCR産物が、特異的天然型塩基プライ
マーを用いた選択的増幅が続けられるコンバーチドを用いた初期の2回のPCRサイ
クルから生じる産物と比較された。これらのコンバーチドが最も効率的に伸長さ
れることが示されていたので、前変換PCRはQ₅、Q₆、およびQ₇類似体を含むプラ
イマーセットを用いて実施された。PCR全体の正確性および3'ミスマッチプライ
マー伸長を改善するために、CiNF緩衝液、緩衝液G（f）が使用された（Dayら、N ucleic.Acids.Res. （1999））。変異型MspI部位を含む9種の異なる合成2重鎖鋳
型（配列番号：17から配列番号：24）は、3'類似体前変換プライマーを用いた前
変換あり、または、なしで増幅された。図6A〜Bに示されるように、天然型塩基
変換プライマーおよび3'類似体前変換プライマーの両方がMspI部位の外側の塩基 C CGGを操作するように設計された。いくつかの変換は対照として機能することを
意図した。これらの場合には鋳型の元々の塩基は類似体前変換後復原されるか、
または全長完全対合プライマーを用いて決して変化されなかった。前変換反応は
2サイクルのコンバーチドPCR産物が引き続く増幅のために鋳型として用いられ、
一方合成2重鎖が非前変換PCRの開始物質として用いられたことを除いては、全て
の段階は前変換および非前変換反応の間で同一に行われた。両方の場合において
3'天然型塩基対が選択的に目的最終産物を増幅するために使用された。これらの
プライマーは非ハイブリダイズジップコード配列を5'末端に含んでおり、図6Bに
示すようにそれらは最終的には最終の20〜30PCRサイクルのプライマー結合部位
として機能した。変換産物は図6CのLDRにより定量された

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２５】 実施例12-ゲノムDNA由来のp53エキソン7の増幅 コドン248の回りにあるp53エキソン7部分を、図10に示したように増幅した。
上流プライマーは、以下の配列番号:35: 5'-GCCTCATCTTGGGCCTGTGTTATC-3' に相当する塩基配列をもっており、その前に存在するイントロンとハイブリダイ
ズし、下流プライマーは、以下の配列番号:36: 5'-GTGGATGGGTAGTAGTATGGAAGAAATC-3' に相当する塩基配列をもっており、エキソン7の中でハイブリダイズする。全体
にわたって記載のあるPCR、制限酵素分解、およびライゲーションの段階はすべ
て、GeneAmp PCR System 2400（パーキン-エルマー（Perkin-Elmer）社製）を用
いて行なわれた。いくつかの緩衝液および酵素は、実施例10および11に示されて
いる通りに使用した。ゲノムDNAからのp53エキソン7の増幅は、50 ngのDNA、2.5
mMの各dNTP、および12.5 pmolの各プライマーを、ポリメラーゼを含まない1×
緩衝液の中に含む20μlの反応混合液から開始させた。この反応混合液をパラフ
ィンオイルで覆い、必要なユニット数のポリメラーゼを導入するために、1×緩
衝液中に希釈した1μlのポリメラーゼを加えてホットスタートを行うために、94
℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした。エキソン7セグメントを、94℃
で15秒間、65℃で2分間というサイクルを40サイクル増幅し、最後のサイクルが
終わったところで、さらに65℃で5分間増幅した。この処理手順とは異なるPCR増
幅を示した通りに行なった。

【手続補正２０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２６】実施例13 -PCR/RE/LDR：フィデリティー・アッセイ法 コドン248のMspI部位（CCGG）の中央にある2塩基対を挟む変換プライマー対（
conversion primer pairs）を用いて、鋳型を増幅した（図11B）。一反応当たり
10 fmolのPCR増幅したp53エキソン7または野生型合成二本鎖鋳型のいずれか、PC
R緩衝液、およびプライマーを含むチューブを調製した。並行反応においては、2
48番目のコドンのMspI部位に代えてCGGGという配列をもつ、50 pbの合成二本鎖
マーカー鋳型（MK）を、10^-3、10^-4、10^-5および0というモル比で野生型鋳型に
加えた。CiNF緩衝液、緩衝液G(f)に含まれているVent(exo-)ポリメラーゼ以外の
成分をすべて含む反応液を94℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした。1
μlのポリメラーゼを94℃で加えて「ホットスタート」を行なった。予備変換を
行なう場合には、プライマーp53-248Q₆およびp53-248Q₆Rを各々500 fmolととも
に、94℃で15秒間、55℃で1分間、60℃で1分間というサイクルを2サイクル行な
った。その後、1 pmolのp53Taq248Tプライマーとp53Taq248TRプライマーを加え
た。予備変換を行わないときには、反応液には、プライマーp53Taq248T（配列番 号：30） とp53Taq248TR（配列番号：31）を各々1 pmolずつか、対照用プライマ
ーp53Msp248Cおよびp53Msp248CRを加えた。予備変換を行なったり、行わなかっ
たりして反応を行なった後、予備変換PCRを以下のようにして行なった。すなわ
ち、94℃で15秒間、55℃＋1°/cyc 1分間（温度勾配）、60℃で1分間というサイ
クルを5サイクル、次に、94℃で15秒間、60℃で2分間というサイクルを20サイク
ル、そして、最後に、60℃でさらに5分間置いた。温度勾配を3サイクル行なった
後、10 pmolの長いジップコード（zipcode）変換プライマーp53zip248T（配列番 号：9） およびp53zip248TR（配列番号：10）、またはp53zip248Cまたはp53zip24
8CRを加えた。変換後、20サイクルの「ジップコード」PCR（後述）の間、野生型
DNAを定期的に分解した。ポリメラーゼは、凍結融解を2回行なって不活性化した
。最後に、元の鋳型の関与なしに変換産物を検出するためにLDRを行なった（非
変換対照用反応を除く）。

【手続補正２１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２７】実施例14 -PCR/RE/LDR：「ジップコード」PCR 野生型配列、または野生型変換産物を制限酵素消化によって除去した。適当な
制限エンドヌクレアーゼを反応用チューブに加え、効率的な消化を促すために必
要とされるMgCl₂をさらに添加した。MspI消化は、クエン酸緩衝液を使用すると
き以外はMgCl₂を加えずに37℃で15分間行なった。TaqI消化は、140 mM MgCl₂に
希釈した1μlの酵素を加え、6 mMのMg²⁺存在下、65℃で30分間行なった。10 pmo
lの「ジップコード」プライマーZtop（配列番号：7）とZbot（配列番号：8）（
図6B）を含む20μlのPCR反応液に1μlの10×希釈液を加えたものから、制限酵素
消化しない変換産物を再増幅した。これらのジップコードプライマーは、それぞ
れ、試料中に存在するゲノム配列とは配列が似ていないDNA配列を含む。そのた
め、ジップコードプライマー配列を含むプライマーを用いた以前のPCR産物のみ
が効率的に増幅される。Expandポリメラーゼ混合液および緩衝液を用いて、変換
産物を増幅した（実施例10参照）。最初にRE消化した後、ジップコードPCR再増
幅を行なった後、以下のようにして再消化を行なった。すなわち、反応液を94℃
で少なくとも1.5分間プレインキュベートした後、RE消化した試料（10倍希釈液
の1μl）0.1μlを20μlの反応液に加えてホットスタートを開始させた。94℃で1
5秒間、60℃で2分間というサイクルを10サイクル行なった。上記の記載通り、ジ
ップコードPCR増幅産物を再消化した。

【手続補正２２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２８】実施例15 -PCR/RE/LDR：リガーゼ検出反応 リガーゼ検出反応は、標準的なLDR緩衝液（25 mMトリスpH 7.6、12 mM MgCl₂
、65μg/mlウシ血清アルブミン、100 mM KCl、および10 mM DTT）の中で行なっ
た。各20 μlの反応液には、約500 fmolのdsDNA（1 μlのPCR試料）、図11Cに示
す500 fmolの各識別プローブ（配列番号：11から配列番号：14）、および750 fm
olの汎用プローブ（配列番号：15）が含まれている。期待される変換産物、すな
わち、MspIの位置でのCNGGまたはTNGAへの変換を検出するために識別プローブお
よび汎用プローブのセットを合成した。3'-スペーサーC3 CPGカラムを用いて汎
用プローブを合成し、リン酸化試薬を用いて、カラム上で5'末端をリン酸化した
。各セットの識別プローブは、3'末端側の塩基が変えてあり、その位置にある塩
基を調べられるようになっている。識別プローブには、さまざまな長さの5'末尾
が付いており、また、蛍光検出するためにFMAで標識されていた。5'末尾の長さ
によってプローブを同定し、アクリルアミドゲル上で、異なったLDR産物を物理
的に分離することができた。

【手続補正２３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ〜Ｃ】 本発明のカップル型ポリメラーゼ連鎖反応（coupled poly
merase chain reaction）-制限エンドヌクレアーゼ消化-リガーゼ検出反応過程
の略図である。

【図２】 ゲル電気泳動を使用した、図1A〜Cの過程によって生ずるライゲ
ーション産物の検出を示す。

【図３】 位置特定可能なアレイを使用した、図1A〜Cの過程によって生ず
るライゲーション産物の検出を示す。

【図４】 ヌクレオチド類似物の事前変換によって促進される変換を示す。
配列中のC:G塩基対はT:A塩基対への変換の標的になる。直接変換を試みるために
3'側天然塩基ミスマッチプライマーを使用しないで、ヌクレオチド類似物（Q₆）
プライマーを事前変換に使用する。Q₆類似物はG塩基を読み、ポリメラーゼに3'
側Q₆プライマーから効率的に伸長させる。PCR中、逆方向のプライマーがQ₆PCR産
物にアニーリングし、ポリメラーゼによって伸長されて、対向鎖を合成する。ポ
リメラーゼが鋳型のQ₆類似物に到達すると、ポリメラーゼは類似物に対してA(ま
たはG、示していない)を書き、鎖の合成を継続する。2,3サイクル後、類似物に
たいする縮重配列を有する産物のプールが作製される。次いで、望ましい塩基変
更を有する産物を選択的に増幅するために、天然の塩基プライマーを添加する。

【図５Ａ〜Ｉ】 PCRプライマーに使用するヌクレオチド類似物を示す。最
終的な脱保護されたオリゴヌクレオチドにおいて、示す塩基類似物を含有するヌ
クレオチドの名前は以下のようである：Q₁、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシ
ル)イミダゾール-4-カルボキサミド（図5A）；Q₂、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフ
ラノシル)-3-ニトロピロール（図5B）；Q₅、2'-デオキシイノシン（図5C)；Q₆、
6-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,
2]オキサジン-7-オン（図5D)；Q₇、2-アミノ-7-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノ
シル)-6-メトキシアミノプリン（図5E)；Q₁₆、1-(21-デオキシ-β-D-リボフラノ
シル)-4-ヨードピラゾール（図5F)；Q₁₈、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル
)ピロール-3-カルボキサミド（図5G)；Q₁₉、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシ
ル)-4-ニトロピラゾール（図5H)。塩基類似物（Q）はデオキシリボフラノースの
1'位に結合する。ヌクレオチド類似物は、スクシニルリンカー（R=CPGのリンカ
ー）を介して制御式細孔ガラス（controlled pore glass(CPG)）カラムに結合さ
れる。オリゴヌクレオチドは、ジメトキシトリチル（DMT）保護基を除去し、3'
側末端に類似物を配置した後、5'側ヒドロキシルから合成される。CPGカラムか
ら切断し、脱保護後、オリゴヌクレオチドは3'側塩基類似物ヒドロキシル基（R=
H）からポリメラーゼによって伸長される（図5I）。

【図６Ａ〜Ｃ】 ミスマッチ伸長および3'側ヌクレオチド類似物変換に使用
されるプライマーを示す。相補的な（-鎖）配列は逆方向（3-5'）、例えば逆方
向の鎖プライマー（名前の最後に「R」をつける）で示す。図6Aでは、9つの異な
る合成50 bpの2本鎖（-鎖、配列番号：1；+鎖、配列番号：2）の1つを融解した
状態で示し、プライマーを相補的な配列に並べて示す。プライマー伸長は、3'側
天然塩基およびヌクレオチド類似物プライマー（p53-248X（配列番号：3）およ
びp53-248XR（配列番号：4））を使用して実施した。いくつかの伸長産物は、切
断型ジップコードプライマーp53zip248（配列番号：5）およびp53zip248R（配列 番号：6） を使用して再度増幅し、ジップコードプライマーの一方である、Ztop
（配列番号：7）またはZbot（配列番号：8）を使用して配列決定した。図6Bでは
、3'側ヌクレオチド類似物プライマー、例えばp53-248Q₆ （配列番号：3）および
p53-248Q₆R（配列番号：4）を使用して、9の異なる50 bp合成2本鎖鋳型（唯一の 鋳型である、配列番号：1および配列番号：2を示す） に事前変換を実施した。事
前変換の有無にかかわらず、変換は、3'側天然塩基、例えばプライマーp53zip24
8T（配列番号：9）およびp53zip248TR（配列番号：10）を含有するプライマーを
使用して実施した。これらの変換産物を、ジップコードプライマーを使用して再
度増幅し、LDRによって同定した。図6Cでは、変換産物中の特定の塩基の変更を
同定するためにLDRプローブセットを設計した。LDRプローブは、互いに競合して
、変換産物にアニーリングする。好ましくは、重複またはギャップのない相補的
な上流LDRプローブおよび下流LDRプローブが高い特異性でライゲーションする。
識別用プローブは異なる長さの5'側末端を有し、アクリルアミドゲルでの特定の
産物の分離を可能にした。野生型鋳型の非変換時におけるPCRエラー産物を同定
するために使用されるプローブセットを示す。そのようなプローブを、p53LDR24 8FCA（配列番号：11）、p53LDR248FCG（配列番号：12）、p53LDR248FCT（配列番 号：13）、p53LDR248FCC（配列番号：14）、およびp53LDR248PGG（配列番号：15 ）と命名する。

【図７Ａ〜Ｂ】 天然の塩基およびQ₆コンバータイド（convertide)による
変換の結果を示す。9の鋳型からの変換産物はPCR/LDRによって検出された。各鋳
型は、配列を示してある中央の4塩基を除いて、同一の配列の50-bp塩基対の合成
2本鎖DNAであった。図7Aおよび図7Bに示されたように、鋳型CCGGは配列番号：2
を、鋳型CTGGは配列番号：17を、鋳型CGGGは配列番号：18を、鋳型CAGGは配列番 号：19を、鋳型TCGAは配列番号：20を、鋳型GCGCは配列番号：21を、鋳型ACGTは 配列番号：22を、鋳型CATGは配列番号：23を、および鋳型CGCGは配列番号：24を 指す。 変換はこれらの4塩基内で生じた。示した3'側天然塩基またはコンバータ
イドを有する変換プライマーから出発することによって作製される予測される変
換産物を示す。図7Aは、Q₆事前変換の有無にかかわらず、プライマーp53zip248C （配列番号：25）を用いた 第1の塩基のCへの変換を示す。図7Bは、Q₆事前変換の
有無にかかわらず、プライマーp53zip248T（配列番号：9）を用いた第1の塩基の
Tへの変換を示す。

【図８Ａ〜Ｂ】 天然の塩基、Q₅およびQ₇コンバータイド（convertides)に
よる変換を示す。配列番号：2および配列番号：17から24に対応する9個の鋳型か
らの変換産物はPCR/LDRによって検出された。各鋳型は、配列を示してある中央
の4塩基を除いて、同一の配列の50-bp塩基対の合成2本鎖DNAであった。変換はこ
れらの4塩基内で生じた。示した3'側天然塩基またはコンバータイドを有する変
換プライマーから出発することによって作製される予測される変換産物を示す。
図8Aは、Q₅またはQ₇事前変換の有無にかかわらず、プライマーp53zip248G（配列 番号：26）を用いた 第1の塩基のGへの変換を示す。図8Bは、Q₅またはQ₇事前変換
の有無にかかわらず、プライマーp53zip248A（配列番号：27）を用いた第1の塩
基のAへの変換を示す。

【図９Ａ〜Ｈ】 ポリメラーゼ伸長の忠実度を示す。プライマーのずれは観
察された伸長産物の多数を占める（図7および図8）。図9Aでは、完全に相補的な
プライマーにより適切な産物が得られる。図9Bでは、第2の塩基のT:Gミスマッチ
がTGGA(または、TGCA)産物を説明している。図9Cでは、CCGG鋳型のマイナス鎖に
ずれがないQ₆:G塩基対からの伸長（その後の3'側T変換プライマー）により、予
測されるTCGA産物が得られた。図9Dは、CTGG鋳型およびいくつかの他の鋳型のマ
イナス鎖にずれがないQ₆:G塩基対からの伸長（その後の3'側T変換プライマー）
により、予測される産物が得られることを示す。図9Eでは、GGミスマッチ伸長に
より、明らかに、1つの鋳型の予測されるGC産物が得られたが、おそらく偶然に
すぎない（図9F参照）。図9Fでは、GGミスマッチからの全ての伸長により、先行
する塩基のずれによって形成されるGTミスマッチに一致する、GC伸長産物が得ら
れた。図9Gでは、Q₅:GおよびQ₇:G伸長産物により、明らかに、1つの鋳型の予期
されるGC産物が得られたが、おそらく偶然にすぎない（図9H参照）。図9Hでは、
Q₅:GおよびQ₇:Gミスマッチからの全ての伸長（その後の3'側G変換プライマー）
により、先行する塩基のQ₅:TミスマッチまたはQ₇:Tミスマッチに一致したGC伸長
産物が得られた。

【図１０Ａ〜Ｃ】 ゲノムDNAからのp53エクソン7の増幅の略図（図10A）お
よび正常なMspI部位のTaqI部位への変換である。まず、鋳型にp53エクソン7のPC
R増幅を実施する（図10B）。次に、PCR変換段階を実施し、コドン248をtheに変
換して(TCGA）TaqI制限酵素切断部位を作製する（図10B）。

【図１１Ａ〜Ｃ】 変換エラーを回避するために、既存の制限酵素切断部位
のPCR/RE/LDRによってポリメラーゼ忠実度を測定するために使用したPCRプライ
マーを示す。使用した方法は、変換段階について図6に記載されているものであ
る。しかし、図11に示す忠実度の実験では、変換過程内の最適な緩衝液条件を試
験するために、緩衝液成分を改良した。図11AはPCR忠実度アッセイ法を示す。合
成50塩基対2本鎖マーカー鋳型（MK）および野生型p53エクソン7PCR産物を平行反
応において既知の比で混合する。完全なマッチプライマーp53-248short（配列番 号：28） およびp53-248shortR（配列番号：29）は野生型CCGGおよびCGGGを増幅
する。次いで、プライマーp53zip248short（配列番号：5）およびp53zip248shor
tR（配列番号：6）を含有するより長いジップコードを添加した。最後に、野生
型を繰り返し消化し、ジップコードプライマーであるZtop（配列番号：7）およ
びZbot（配列番号：8）で再度増幅した。図11Bでは、3'側コンバータイド、例え
ばp53-248Q₆ （配列番号：3）を含有するプライマーを使用して事前変換を実施し
た。事前変換の有無にかかわらず、MspI部位のTaqI部位への変換は3'側天然塩基
プライマーp53zip248T（配列番号：9）およびp53zip248TR（配列番号：10）を使
用して実施した。上記のように長いプライマーを添加し、変換産物をさらに増幅
した。野生型産物を、新たな部位に適当な制限エンドヌクレアーゼで消化した。
突然変異産物は主にジップコードプライマーで増幅された。図11Bにおけるその
他のプライマーには、p53Taq248T（配列番号：30）、p53Taq248TR（配列番号：3 1）、p53Taq248Q₆（配列番号：32）、およびp53Taq248Q₆R（配列番号：4）が含
まれる。 図11Cでは、ライゲーション点周囲の鋳型配列を照会するために、LDRプ
ローブセットを設計した。重複またはギャップのない完全にハイブリダイゼーシ
ョンされた上流および下流のLDRプローブは主に高い特異性でライゲーションさ
れた。識別用プローブは、アクリルアミドゲルでの特定の産物の分離を可能にす
る異なる鎖長の5'側末端を有する。示されたプローブ（配列番号：11から14）は
、MspI部位の第2の塩基に生じる突然変異を同定するために使用した（変換はな
い）。余分なプローブp53LDR248FTCL（配列番号：33）は、MspI部位の第1塩基と
第2塩基のC→T転位を比較するために使用した。識別プライマーの3'側末端前塩
基にT、共通プローブの5'側末端前塩基にAを有する変換産物のTaqI部位の第2塩
基の突然変異を同定するために、識別用プローブと共通プローブの同等のセット
を使用した。

【図１２Ａ〜Ｂ】 図11に示すPCR/RE/LDR実験によって検出される緩衝液お
よび酵素依存的PCRエラーを示す。示すポリメラーゼ/緩衝液の組み合わせを使用
して、ゲノムDNAからp53エクソン7を増幅した。同じ緩衝液を完全なマッチプラ
イマーによる反応に使用して、MspI部位を再度増幅した。図12Aでは、Taqポリメ
ラーゼ（T）を種々の試験用PCR緩衝液に使用したが、図12Bでは、Ventポリメラ
ーゼ（V）を種々の試験用緩衝液に使用した。Ventポリメラーゼは、TsK、緩衝液
A、緩衝液でゲノムDNAからp53エクソン7を増幅しなかった。この場合だけでは、
2つの異なる酵素/緩衝液セットを事前増幅および「変換」（完全なマッチプライ
マーを使用したので、実際の変換ではない）に使用した。AmpliTaqT/Tskエクソ
ン7ゲノムDNAPCR産物をVent V/Tskに置換し、緩衝液A中で再度増幅した。「C」
はMKが添加されていないことを示す（対照反応）。

【図１３】 変換の忠実度の比較結果を示す。変換反応産物の相対的な強度
は、3-Dプロットにおける各々のピークの色と高さによって示す。マーカー（MK
）DNA（CGGGがMspI部位で交換されている）を平行反応において野生型（WT）に
既知の比で添加した。-log(MK:WT)は、存在するMKの相対的な画分を示し、例え
ば、-log(MK:WT)=3はMK:WTの比が1:1000であることを意味する。「C」はMKが添
加されていないことを示す（対照反応）。非変換対照反応（C:G）は完全なマッ
チ3'側Cプライマーを使用して実施した。MspI部位(CCGG)のTaqI部位（TCGA）へ
の変換は、3'側Q₆ヌクレオチド類似物プライマーを使用した事前変換の有無にか
かわらず（それぞれ、Q₆:G反応およびT:G反応）、天然の塩基3'側Tプライマー
を使用して実施した。MspI非変換のLDR産物はCNGGを含有し、TaqI変換の産物はT
NGAを含有するが、中央の塩基だけ（第2塩基および第3塩基）を_NG_と示す。LDR
産物は、サイズが2塩基異なることによってアクリルアミドゲルで分離するよう
に設計された。中間サイズの未測定のバンドも観察された。レーン1〜4はPCR/RE
/LDR中にMspIで消化したが、レーン5〜12はTaqIで消化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 パーデュー・リサーチ・ファンデーション ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵ ＮＤＡＴＩＯＮ アメリカ合衆国 インディアナ 47907− 1063，ウエスト ラファイエット，ホーブ ド ホール1063 1063 Ｈｏｖｄｅ Ｈａｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｉｎｄｉａｎａ 47907−1063，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 バラニー フランシス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ニュー ヨーク イースト 63ド ストリート 450 アパートメント 12シー． (72)発明者 デイ ジョセフ ピー． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 パシ フィカ アルカディア ドライブ 106 (72)発明者 ハンマー ロバート ピー． アメリカ合衆国 ルイジアナ州 バトン ルージュ トゥレイン ドライブ 4967 (72)発明者 バーグストローム ドナルド イー． アメリカ合衆国 インディアナ州 ウエス ト ラファイエット ハミルトン ストリ ート 3416 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR20 QS25 QS34

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の段階を含む、複数の標的ヌクレオチド配列において大
   量存在配列（high abundance sequence）から、一つまたはそれ以上の単一塩基
   の変化、挿入、または欠失のために異なる一つまたはそれ以上の少量存在配列（
   low abundance sequence）を同定する方法： それぞれが大量存在標的配列と少なくとも一つの配列の差を有する、一つまた
   はそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列を含む可能性がある試料を提供する
   段階； 一次オリゴヌクレオチドプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応産物が形成され
   るように、対応する大量存在および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖上で
   のハイブリダイゼーションに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド
   配列とハイブリダイズする場合にそのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を
   妨害するミスマッチを有する、（a）標的特異的部分を含む第一のオリゴヌクレ
   オチドプライマーと、（b）標的特異的部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプ
   ライマーとを特徴とする一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段
   階； ポリメラーゼを提供する段階； 試料、一次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混和して、
   一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階； 一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離され
   る変性処理と、一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌク
   レオチド配列とハイブリダイズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダ
   イズした一次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、それに対して一次オ
   リゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列と相補
   的な一次伸長産物を形成する伸長処理とを含む、二回またはそれ以上のポリメラ
   ーゼ連鎖反応サイクルを行う段階； 特定のセットにおける二次オリゴヌクレオチドプライマーが、大量に存在する
   標的を増幅する場合に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むもしくは作製する
   が、一つもしくはそれ以上の少量存在する標的を増幅する場合には制限エンドヌ
   クレアーゼ認識部位を含まないもしくは作製しない、二次ポリメラーゼ連鎖反応
   産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖上でのハイブリダイゼーション
   に適している、（a）標的特異的部分と5'上流の二次プライマー特異的部分とを
   有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分と5'上流
   の二次プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプライマーと
   を特徴とする、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階； ポリメラーゼを提供する段階； 一次伸長産物、二次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混
   和して、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階； 二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離され
   る変性処理と、二次オリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長産物とハイブリダ
   イズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした二次オリゴヌクレ
   オチドプライマーが伸長されて、一次伸長産物と相補的な二次伸長産物を形成す
   る伸長処理とを含み、大量に存在する二次伸長産物が制限酵素切断部位を含むが
   、少量存在する二次伸長産物は含まない、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連
   鎖反応サイクルを行う段階； 制限エンドヌクレアーゼを提供する段階； 二次伸長産物と制限エンドヌクレアーゼとを混和して、エンドヌクレアーゼ消
   化反応混合物を形成する段階； 制限エンドヌクレアーゼが、二次伸長産物において大量に存在する標的を増幅
   する場合にはその中に含まれるもしくは作製される制限エンドヌクレアーゼ認識
   部位を認識して切断するが、少量存在する標的を増幅する場合には認識して切断
   せず、このようにして、大量に存在する二次伸長産物が選択的に破壊されるよう
   に、エンドヌクレアーゼ消化反応混合物にエンドヌクレアーゼ消化反応を行う段
   階； 三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、二次伸長産物の全てを増
   幅してもよい、（a）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第一のオリゴ
   ヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第一の三次プライマーと
   、（b）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第二のオリゴヌクレオチド
   プライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第二の三次プライマーとを特徴とする
   三次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階； 二次伸長産物、三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、およびポリメラー
   ゼを混和して、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階； 三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離され
   る変性処理と、三次オリゴヌクレオチドプライマーが二次伸長産物とハイブリダ
   イズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした三次オリゴヌクレ
   オチドプライマーが伸長されて、二次伸長産物と相補的な三次伸長産物を形成す
   る伸長処理とを含む、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行
   う段階； 特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、相補的な三次伸長産物
   特異的部分上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に共にライゲーションさ
   れることに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダ
   イズする場合にそのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、各セ
   ットが、（a）三次伸長産物特異的部分と検出可能なリポーター標識とを有する
   第一のオリゴヌクレオチドプローブと、（b）三次伸長産物特異的部分を有する
   第二のオリゴヌクレオチドプローブとを特徴とする、複数のオリゴヌクレオチド
   プローブセットを提供する段階； リガーゼを提供する段階； 三次伸長産物、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼを
   混和して、リガーゼ検出反応混合物を形成する段階； オリゴヌクレオチドプローブセットが、それぞれの相補的三次伸長産物以外の
   ヌクレオチド配列とハイブリダイズしてもよいが、一つまたはそれ以上のミスマ
   ッチが存在するために互いにライゲーションせず、変性処理において個々に分離
   したままである、リガーゼ検出反応混合物を、ハイブリダイズした任意のオリゴ
   ヌクレオチドを三次伸長産物から分離する変性処理と、オリゴヌクレオチドプロ
   ーブセットが、それぞれの三次伸長産物が存在すれば、それらに対して隣接する
   位置で塩基特異的にハイブリダイズして、互いにライゲーションして、（a）検
   出可能なレポーター標識、および（b）互いに結合した三次伸長産物特異的部分
   を含むライゲーション産物配列を形成するハイブリダイゼーション処理とを含む
   、一回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイクルを行う段階；ならびに ライゲーション産物配列のレポーター標識を検出することによって、試料中に
   一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列が存在することが示される
   段階。
2. 【請求項２】 以下の段階を含む、特定のオリゴヌクレオチドプローブセッ
   トにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、それらが形成するライゲーション産
   物配列が他の核酸と区別されうるように、独自の長さを有する、請求項１記載の
   方法： ライゲーション産物配列を、上記の検出段階の前に電気泳動移動度によって分
   離する段階；および 上記の検出段階の後、電気泳動移動度が異なるライゲーション産物配列を識別
   する段階。
3. 【請求項３】 以下の段階をさらに含む、各オリゴヌクレオチドプローブセ
   ットの第二のオリゴヌクレオチドプローブが、位置特定可能なアレイ特異的部分
   を有する、請求項１記載の方法： 捕捉オリゴヌクレオチドが位置特異的可能なアレイ特異的部分と相補的なヌク
   レオチド配列を有する、異なる特定の部位に異なる捕捉オリゴヌクレオチドが固
   定された固相支持体を提供する段階、および 検出段階が、位置特定可能なアレイ特異的部分を用いて捕捉され、固相支持体
   の特定の部位に固定されたライゲーション産物配列が存在することを示し、それ
   によって試料中に一つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列が存在することが
   示される、ライゲーション産物配列が捕捉オリゴヌクレオチドと塩基特異的にハ
   イブリダイズするために有効な条件で、リガーゼ検出反応混合物を、一回または
   それ以上のリガーゼ検出反応サイクルに供した後に、固相支持体と接触させて、
   それによって位置特定可能なアレイ特異的部分を、固相支持体の相補的捕捉オリ
   ゴヌクレオチドを有する部位で捕捉する段階。
4. 【請求項４】 以下の段階をさらに含む、複数の標的ヌクレオチドにおける
   一つまたはそれ以上の大量存在配列に対する、一つまたはそれ以上の単一塩基の
   変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、試料中に未知量で存在する少量
   存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が定量される、請求項１記載の方法： 一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に一回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反
   応サイクルを行った後に、一次伸長産物の量を定量する段階； 既知量の一つまたはそれ以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階
   ； マーカー標的ヌクレオチド配列のために特にデザインされたプローブセットを
   含む、一つまたはそれ以上の配列特異的プローブセットを提供する段階； マーカー標的ヌクレオチド配列と、マーカー標的ヌクレオチド配列のために特
   にデザインされたプローブセットを、リガーゼ検出反応混合物と共に混和する段
   階； ライゲーション産物配列の量を定量する段階；および 試料中の一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列の相対的レベル
   の定量的測定を提供するために、未知の少量存在試料から生成されたライゲーシ
   ョン産物配列の量を、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生成されたラ
   イゲーション産物の量と比較する段階。
5. 【請求項５】 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転
   位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以
   上の相対量が、複数の標的ヌクレオチドにおける大量存在配列の量と比較して１
   ：1,000モル比未満で存在する、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転
   位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以
   上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：10,000モル比未満で存
   在する、請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転
   位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以
   上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：100,000モル比未満で
   存在する、請求項４記載の方法。
8. 【請求項８】 大量存在一次ポリメラーゼ連鎖反応産物を、制限エンドヌク
   レアーゼ部位を含む二次ポリメラーゼ連鎖反応産物に変換する効率と精度が、二
   次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階の前に以下の段階を実施
   することによって改善される、請求項１記載の方法： 標的特異的部分が二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと同一または実質
   的に同一であるが、少なくとも一つのプライマーが一つまたはそれ以上のヌクレ
   オチド類似体を含み、特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプライマーが、
   一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体と反対鎖塩基変化とを含む前二次ポリ
   メラーゼ連鎖反応産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖とのハイブリ
   ダイゼーションに適しており、前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
   一次ポリメラーゼ連鎖反応産物配列をその後の二次ポリメラーゼ連鎖反応におけ
   る制限エンドヌクレアーゼ部位へ変換することを促進する、（a）標的特異的部
   分を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分を有
   する第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを特徴とする前二次オリゴヌクレオ
   チドプライマーセットを提供する段階； ポリメラーゼを提供する段階； 一次伸長産物、前二次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを
   混和して、前二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階； 前二次伸長産物が、その後の二次ポリメラーゼ連鎖反応における制限エンドヌ
   クレアーゼ認識部位への一次ポリメラーゼ連鎖反応産物配列の変換を促進する、
   一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体と反対鎖塩基変化とを含み、前二次伸
   長産物が二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物において一次伸長産物の代わりに用い
   られる、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分
   離される変性処理と、二次オリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長産物とハイ
   ブリダイズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした二次オリゴ
   ヌクレオチドプライマーが伸長されて、一次伸長産物と相補的な前二次伸長産物
   を形成する伸長処理とを含む、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイ
   クルを行う段階。
9. 【請求項９】 以下の段階を含む、特定のオリゴヌクレオチドプローブセッ
   トにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、それらが形成するライゲーション産
   物配列が他の核酸と区別されうるように独自の長さを有する、請求項８記載の方
   法： 上記の検出段階の前に電気泳動移動度によってライゲーション産物配列を分離
   する段階；および 上記の検出段階の後に、電気泳動移動度が異なるライゲーション産物配列を区
   別する段階。
10. 【請求項１０】 以下の段階をさらに含む、各セットの第二のオリゴヌクレ
    オチドプローブが位置特定可能なアレイ特異的部分を有する、請求項８記載の方
    法： 捕捉オリゴヌクレオチドが、位置特定可能なアレイ特異的部分と相補的なヌク
    レオチド配列を有する、異なる捕捉オリゴヌクレオチドが異なる特定の部位に固
    定された固相支持体を提供する段階；および 検出する段階が、位置特定可能なアレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の
    部位で固相支持体に固定されたライゲーション産物配列の存在を示し、それによ
    って試料中に一つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列が存在することが示さ
    れる、リガーゼ検出反応混合物に一回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイク
    ルを行った後、ライゲーション産物配列が捕捉オリゴヌクレオチドと塩基特異的
    にハイブリダイズするために有効な条件で、固相支持体と接触させ、それによっ
    て固相支持体の相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で位置特定可能なア
    レイ特異的部分を捕捉する段階。
11. 【請求項１１】 以下の段階をさらに含む、１つまたはそれ以上の単一塩基
    の変化、挿入、置換または転位のために異なり、試料中に未知量で存在する一つ
    またはそれ以上の少量存在配列の、複数の標的ヌクレオチドにおける一つまたは
    それ以上の大量存在配列に対する相対量が定量される、請求項８記載の方法： 一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に一回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反
    応サイクルを行った後、一次伸長産物の量を定量する段階； 一つまたはそれ以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を提供する段階
    ； マーカー標的ヌクレオチド配列のために特にデザインされたプローブセットを
    含む一つまたはそれ以上の配列特異的プローブセットを提供する段階； マーカー標的ヌクレオチド配列、およびマーカー標的ヌクレオチド配列のため
    に特にデザインされたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と共に混和する
    段階； ライゲーション産物配列の量を定量する段階；および 試料中の一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列の相対レベルの
    定量的測定を提供するために、未知の少量存在試料から生成されたライゲーショ
    ン産物配列の量を、既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成されたライ
    ゲーション産物の量と比較する段階。
12. 【請求項１２】 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または
    転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ
    以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：1,000モル比未満で
    存在する、請求項11記載の方法。
13. 【請求項１３】 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または
    転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ
    以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：10,000モル比未満で
    存在する、請求項11記載の方法。
14. 【請求項１４】 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または
    転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ
    以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：100,000モル比未満
    で存在する、請求項11記載の方法。
15. 【請求項１５】 前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの少なくとも
    １つのオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド類似体がプライマーの3'末
    端である、請求項８記載の方法。
16. 【請求項１６】 ヌクレオチド類似体が、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノ
    シル)イミダゾール-4-カルボキサミド、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-
    3-ニトロピロール、2'-デオキシイノシン、6-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシ
    ル)-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン、2-アミノ-7-
    (2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6-メトキシアミノプリン、1-(2'-デオキシ
    -β-D-リボフラノシル)-4-ヨードピラゾール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノ
    シル)ピロール-3-カルボキサミド、および1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル
    )-4-ニトロピラゾールからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
17. 【請求項１７】 以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法： エンドヌクレアーゼ消化反応を繰り返すあいだに、制限エンドヌクレアーゼが
    残っている任意の大量存在標的の中に含まれる制限エンドヌクレアーゼ認識部位
    も認識して切断し、それによって、大量に存在する三次伸長産物が選択的に破壊
    される、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に二回またはそれ以上のポリメラーゼ
    連鎖反応サイクルを行う段階の後、そしてリガーゼ検出反応混合物に一回または
    それ以上のリガーゼ検出反応サイクルを行う段階の後に、エンドヌクレアーゼ消
    化反応を繰り返す段階。
18. 【請求項１８】 以下の段階を含む、複数の標的ヌクレオチド配列における
    大量存在配列から、一つまたはそれ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失の
    ために異なる一つまたはそれ以上の少量存在配列を同定するキット： 一次オリゴヌクレオチドプライマーが、一次伸長産物が形成されるように、対
    応する大量存在および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖上でのハイブリダ
    イゼーションに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブ
    リダイズする場合にそのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミス
    マッチを有する、（a）標的特異的部分を含む第一のオリゴヌクレオチドプライ
    マーと、（b）標的特異的部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを
    特徴とする一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階； 特定のセットにおける二次オリゴヌクレオチドプライマーが、大量存在標的を
    増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むまたは作製するが、一
    つまたはそれ以上の少量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認
    識部位を含まないまたは作製しない、二次伸長産物が形成されるように、一次伸
    長産物の相補鎖上でのハイブリダイゼーションに適している（a）標的特異的部
    分と5'上流二次プライマー特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプラ
    イマー、および（b）標的特異的部分と5'上流二次プライマー特異的部分とを有
    する第二のオリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする二次オリゴヌクレオチド
    プライマーセットを提供する段階； 三次オリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、二次伸長産物の全てを
    増幅してもよい、（a）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第一のオリ
    ゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第一の三次プライマー
    と、（b）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第二のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第二の三次プライマーとを特徴とす
    る三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；ならびに 特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、相補的三次伸長産物特
    異的部分上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に共にライゲーションされ
    ることに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイ
    ズする場合にそのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、各セッ
    トが、（a）三次伸長産物特異的部分と検出可能なレポーター標識とを有する第
    一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（b）三次伸長産物特異的部分を有す
    る第二のオリゴヌクレオチドプローブを特徴とする、複数のオリゴヌクレオチド
    プローブセットを提供する段階。
19. 【請求項１９】 以下の段階をさらに含む、請求項18記載のキット： 標的特異的部分が二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと同一または実質
    的に同一であるが、少なくとも一つのプライマーが一つまたはそれ以上のヌクレ
    オチド類似体を含み、特定のセットにおける前二次オリゴヌクレオチドプライマ
    ーが、一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体と反対鎖塩基変化とを含む前二
    次伸長産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖上でのハイブリダイゼー
    ションに適している、前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、その後の
    二次ポリメラーゼ連鎖反応における制限エンドヌクレアーゼ認識部位への一次伸
    長産物配列の変換を促進する、（a）標的特異的部分を有する第一のオリゴヌク
    レオチドプライマーと、（b）標的特異的部分を有する第二のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーとを特徴とする前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供
    する段階。
20. 【請求項２０】 リガーゼをさらに含む請求項18記載のキット。
21. 【請求項２１】 ポリメラーゼをさらに含む、請求項18記載のキット。
22. 【請求項２２】 制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項18記載のキ
    ット。