CN107002067A - 利用热稳定性错配内切核酸酶的方法 - Google Patents

利用热稳定性错配内切核酸酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107002067A
CN107002067A CN201580048826.8A CN201580048826A CN107002067A CN 107002067 A CN107002067 A CN 107002067A CN 201580048826 A CN201580048826 A CN 201580048826A CN 107002067 A CN107002067 A CN 107002067A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
polypeptide
nucleic acid
acid sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580048826.8A
Other languages
English (en)
Inventor
上森隆司
石野良纯
相良武宏
石野园子
山上健
白井刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Takara Bio Inc
Kansai Bunri Sogo Gakuen
Original Assignee
Kyushu University NUC
Takara Bio Inc
Kansai Bunri Sogo Gakuen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyushu University NUC, Takara Bio Inc, Kansai Bunri Sogo Gakuen filed Critical Kyushu University NUC
Publication of CN107002067A publication Critical patent/CN107002067A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及具有识别错配并切割错配的错配内切核酸酶活性的多肽；使用所述多肽的错配特异性切割反应；使用所述多肽去除核酸扩增反应中的错误的方法；在核酸扩增反应期间抑制包含特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法；以及利用该抑制方法检测具有单核苷酸多态性突变的核酸的方法。

Description

利用热稳定性错配内切核酸酶的方法
技术领域
本发明涉及识别和切割双链核酸中错配的碱基对的新型耐热错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，以及使用所述错配内切核酸酶的方法。
背景技术
近年来，突变分析方法得到显著发展。突变分析方法已用于人类的遗传诊断以及农作物的改良和有用微生物的分离或产生，因此对一般生活有极大的贡献。
许多突变分析方法包括基因组序列的直接分析。然而，存在一些突变分析方法，包括使用识别错配的碱基对的酶。突变分析方法包括用能够特异性结合由突变型DNA和野生型DNA形成的错配碱基对的因子进行检测。突变分析方法的代表性实例包括通过使用来自大肠杆菌的MutS、MutT和MutL复合物检测突变位点（专利文献1）。
包括使用特异性切割错配位点的错配内切核酸酶的突变分析方法也是已知的。在这种方法中，使用错配内切核酸酶切割错配碱基对附近的DNA，并分析如此获得的DNA片段以检测突变的存在或不存在和位置。
作为代表性的例子，已知包括使用来自芹菜的细胞基因产物的方法（专利文献2），实际上该方法用于碱基突变的分析。然而，该酶不耐热，因此不能用于涉及高温反应过程如PCR的技术。因此，为了检测碱基突变，该方法需要扩增、错配形成、错配切割和检测的四个步骤。
近年来，已经开发了耐热错配核酸内切酶，并且已经预期它们的用途。错配内切核酸酶的特征在于识别G-G、G-T、T-G和T-T错配位点，并在错配附近切割DNA的两条链（专利文献3）。
除了突变分析，具有很大影响的生物技术的实例包括核酸扩增技术。
核酸扩增技术的代表性实例是聚合酶链反应（PCR）。PCR是用于在体外容易地扩增期望的核酸片段的技术。PCR是一种实验技术，其在包括生物学、医学和农业领域的广泛领域以及关于基因的研究中是必需的。PCR也适用于突变基因的检测和DNA甲基化的分析。
等温核酸扩增法如LAMP法和ICAN法不需要特殊的设备，因此，它们被用作检测核酸的较便宜的方法。
对于近年来进行的全基因组的结构分析，全基因组扩增方法是一种重要的技术，特别是对于稀少样品的分析。
在这些核酸扩增方法中，不正确碱基的掺入以恒定的概率发生。通过改进DNA聚合酶等已经降低了概率。然而，不正确碱基的掺入仍干扰精确分析。
在构建基因组文库或cDNA文库时，核酸扩增方法优先扩增具有较高含量的DNA分子，这可能干扰各种DNA的分析或筛选。
为了解决上述问题，通过利用自杂交的正常化来降低具有较高含量的DNA的比例（非专利文献1）。还使用其中组合了PCR和自杂交的SSH-PCR（非专利文献2）。然而，使用这些方法，也可以除去与具有较高含量的DNA同源的DNA。
在通过核酸扩增法检测DNA时，靶DNA和非靶DNA可能竞争扩增。换句话说，当非靶DNA随着靶DNA扩增而同时扩增时，难以检测靶DNA。上述问题可以通过使用其中使用诸如循环探针或TaqMan探针的探针仅检测靶DNA的实时PCR来解决。然而，在非靶DNA相对于靶DNA以过高的量存在的情况下，由于与许多相似DNA的假阳性反应，难以精确地检测靶DNA。
这种问题可能在存在正常等位基因的情况下检测少量突变等位基因（例如，检测循环肿瘤DNA），通过表观遗传学测定检测少量甲基化或非甲基化等位基因，检测在母亲的血液中循环的少量胎儿DNA序列等时发生。
为了解决上述问题，已经开发了称为限制性内切核酸酶介导的选择性聚合酶链式反应（REMS PCR）的方法（非专利文献3）。该方法包括使用耐热限制酶。在该方法中，使用引物选择性检测具有突变核苷酸序列的DNA，所述引物例如设计为使得仅当模板具有正常核苷酸序列时才发生限制酶的切割。然而，根据待检测的靶DNA，可能没有具有适合于通过REMS PCR的选择性检测的识别序列的耐热限制酶。因此，REMS PCR缺乏通用性。
如上所述，对于涉及核酸扩增的突变检测方法，需要一种即使当非靶DNA相对于靶DNA以过高的量存在时避免与许多相似DNA的假阳性反应的方法。
引文列表
专利文献
专利文献1: US 5922539 B
专利文献2: WO 01/062974
专利文献3: WO 2014/142261
非专利文献
非专利文献1: "核酸研究（Nucleic Acids Research）", 2004年二月, 卷2, NO:3,e37
非专利文献2: "分子生物学方法（Methods in Molecular Biology）", 2009年, 卷496, No. 2, pp. 223-243
非专利文献3: "美国研究病理学学会（American Society for InvestigativePathology）", 1998年八月, 卷153, No.2, pp. 373-379
发明概述
技术问题
本发明的目的包括提供新的错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，和所述错配内切核酸酶的用途。
问题的解决方案
作为在上述情况下的深入努力的结果，本发明人已经发现来自Thermococcikodakarensis的多肽，其已被认为是复制机制中的一个因子，具有耐热错配内切核酸酶活性。在下文中，将具有酶活性的该多肽称为TKO NucS。
此外，本发明人已经成功地创建了耐热错配内切核酸酶的突变体，其具有不同于野生型错配内切核酸酶的碱基特异性的增强的碱基特异性。本发明人已经发现，当单独或组合使用突变型错配内切核酸酶和/或野生型错配内切核酸酶时，特异性错配碱基对以外的碱基对的切割受到抑制，允许更特异性抑制扩增。从而完成了本发明。
具体地，本发明的第一方面涉及切割双链核酸的方法，包括用选自以下（i）至（iii）的至少一种多肽处理具有错配碱基对的双链核酸，以在G-G、G-T或T-T错配的碱基对的位置上识别并切割双链核酸的两条链：
（i）具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
（ii）具有通过1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别并切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（iii）具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列共有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有识别和切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽，其。
本发明的第二方面涉及包含以下（a）至（c）的组合物：
（a）DNA聚合酶；
（b）至少一对寡核苷酸引物；和
（c）选自下列（i）至（iii）的至少一种多肽：
（i）具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
（ii）具有通过1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别并切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（iii）具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列共有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有识别和切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
本发明的第三方面涉及扩增核酸的方法，包括以下步骤（a）和（b）：
（a）制备包含根据本发明的第二方面的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和
（b）使步骤（a）获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增。
本发明的第四方面涉及选自下列（A）至（C）的多肽：
（A）具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
（B）具有通过并非第47和76位的氨基酸残基的1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于（A）的多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，并具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（C）具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应于在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第47位的丝氨酸和第76位的天冬酰胺的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，并且具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
本发明的第五方面涉及包含以下（a）至（c）的组合物：
（a）DNA聚合酶；
（b）至少一对寡核苷酸引物；和
（c）选自下列（i）至（iii）的至少一种多肽：
（i）具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
（ii）具有通过并非第47和76位的氨基酸残基的1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于（i）的多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，并具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（iii）具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应于在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第47位的丝氨酸和第76位的天冬酰胺的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，并且具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
本发明的第六方面涉及扩增核酸的方法，包括以下步骤（a）和（b）：
（a）制备包含根据本发明第五方面的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和
（b）使步骤（a）获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增。
本发明的第七方面涉及一种在核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，包括在以下（a）至（d）的存在下进行核酸扩增反应的步骤：
（a）寡脱氧核糖核苷酸，其设计为当所述寡脱氧核糖核苷酸与具有特定核苷酸序列或其互补链的核酸杂交时产生一至数个错配；
（b）DNA聚合酶；
（c）至少一对寡核苷酸引物；和
（d）用于本发明第一方面的多肽和/或根据本发明第四方面的多肽。
在根据本发明第七方面的方法中使用的错配内切核酸酶可以被具有与本发明第一方面中使用的多肽或根据本发明第四方面的多肽等同的错配内切酶活性的另一种耐热微生物来源的多肽替换。
本发明的第八方面涉及优先扩增靶核酸的方法，其包括通过根据本发明第七方面的方法抑制具有在一个至数个核苷酸中与所述靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸的扩增。
在根据本发明第八方面的方法中，可以在源自耐热微生物的增殖细胞核抗原（PCNA）或其同系物的存在下进行扩增。
本发明的第九方面涉及一种检测靶核酸中的突变的方法，其包括使用根据本发明的第一方面的方法中使用的多肽和/或根据本发明的第四方面的多肽。在根据本发明第九方面的方法中使用的错配内切核酸酶可以被具有与本发明第一方面中使用的多肽或根据本发明第四方面的多肽等同的错配内切酶活性的另一种耐热微生物来源的多肽替换。
本发明的效果
根据本发明，提供了在生物技术中具有很大实用性并且识别不同错配序列的错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，以及使用所述错配内切核酸酶的方法。
附图简述
图1显示了SDS-PAGE的结果，显示本发明的错配内切核酸酶的纯化。
图2提供了用于测量本发明的错配内切核酸酶的活性的底物DNA的列表。
图3显示了非变性-PAGE的结果和显示本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割活性的图。
图4提供了显示pH对本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割反应的影响的图。
图5提供了显示氯化钠、氯化钾和谷氨酸钾对本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割反应的影响的图。
图6提供了显示氯化镁对本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割反应的影响的图表。
图7提供了显示氯化锰对本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割反应的影响的图。
图8提供了显示温度对本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割反应的影响的图。
图9提供了显示本发明的错配内切核酸酶对各种错配DNA的切割活性的图。
图10提供了用于测量本发明的错配内切核酸酶的DNA结合活性的探针DNA的列表。
图11显示了非变性-PAGE的结果，显示本发明的错配内切核酸酶的DNA结合活性的测量。
图12提供了显示本发明的错配内切核酸酶的耐热性的图。
图13显示了非变性-PAGE的结果和显示在来自TKO的PCNA1存在下本发明的错配内切核酸酶的错配DNA切割活性的图。
图14显示了非变性-PAGE的结果，显示本发明的错配内切核酸酶对A-A错配DNA的切割活性。
实施方案的描述
在下文中，详细说明本发明。
在本发明中，词语“错配”是指与双链核酸中存在的不同于Watson-Crick碱基对的碱基配对，换言之，并非G（鸟嘌呤碱基）-C（胞嘧啶碱基）和A（腺嘌呤碱基）-T（胸腺嘧啶碱基）或U（尿嘧啶碱基）的碱基配对的组合的碱基结合。
（1）本发明的耐热错配内切核酸酶及其突变体
如本文所用，“具有错配内切核酸酶活性的多肽（有时称为错配内切核酸酶）”是指具有切割双链核酸中存在的错配位点的活性的核酸酶。错配内切核酸酶活性包括切割邻近形成错配碱基对的核苷酸的磷酸二酯键的活性，以及切割与位于距离错配碱基对1至5个，优选1至3个碱基对的核苷酸相邻的磷酸二酯键的活性。在本发明中，错配内切核酸酶优选为具有特异性识别双链核酸中的特异性错配碱基对以切割双链核酸的活性的核酸酶。错配内切核酸酶的实例包括识别和切割至少G-G、G-T或T-T错配的内切核酸酶。内切核酸酶可以仅识别和切割G-G错配，仅识别和切割G-T错配或仅识别和切割T-T错配。内切核酸酶可以识别和切割G-G错配、G-T错配和T-T错配的任何两个错配。内切核酸酶可以识别和切割所有的G-G错配、G-T错配和T-T错配。
在本发明中，还提供了其它错配内切核酸酶。其它错配内切核酸酶的实例包括特异性识别和切割A-A、A-C或C-C错配的内切核酸酶。内切核酸酶可以仅识别和切割A-A错配、仅识别和切割A-C错配或仅识别和切割C-C错配。核酸内切酶可以识别和切割A-A错配、A-C错配和C-C错配的任何两个错配。内切核酸酶可以识别和切割所有的A-A错配、A-C错配和C-C错配。
除了切割存在于双链核酸中的错配位点的活性之外，耐热错配内切核酸酶还可以具有识别单链DNA、单链核酸与双链核酸之间的连接部分、双皮瓣结构（double flapstructure）、复制叉结构、D环结构和/或具有切口的Holliday连接结构以切割核酸的活性。如本文所用，耐热错配内切核酸酶是指在40℃或更高，优选50℃或更高，更优选60℃或更高的温度下显示切割双链核酸中的错配位点的活性的核酸酶。
用于本发明的耐热错配内切核酸酶的实例包括但不限于来自Thermococcuskodakarensis（或Thermococcus Kodakaraensis）的具有耐热错配内切核酸酶活性的多肽。本发明人已经发现来自Thermococcus kodakarensis的多肽（SEQ ID NO：1）是识别和切割G-G、G-T或T-T错配的耐热内切核酸酶。此外，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的同系物也适合作为识别和切割G-G、G-T或T-T错配的本发明的耐热性内切核酸酶。同系物的实例包括具有通过1至数个氨基酸残基（例如1至15个，优选1至9个，更优选1至5个，更优选1至3个氨基酸残基）的取代、缺失、插入和/或添加而不同于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽；和具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列共有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。此外，例如，优选使用具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的核酸内切酶。
此外，本发明人已经发现具有以下氨基酸序列的突变型多肽是特异性识别A-A、A-C或C-C错配的耐热错配内切核酸酶：所述氨基酸序列通过用其它氨基酸残基取代第47位的丝氨酸和第76位的天冬酰胺，优选通过用丙氨酸取代第47位的残基和用丙氨酸取代第76位的残基，而与SEQ ID NO：1的氨基酸序列不同。因此，本发明的一个方面包括具有由此产生的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽及其同系物。具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的同系物的实例包括：具有通过并非第47和76位的氨基酸残基的1至数个氨基酸残基，例如1至15，优选1至9，更优选1至5，更优选1至3个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：3的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的内切核酸酶活性的多肽；具有通过用其它氨基酸残基取代第47位的丙氨酸和第76位的丙氨酸而与SEQ ID NO：3的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的核酸内切酶活性的多肽；具有通过并非第47和76位的氨基酸残基的1至数个氨基酸残基，例如1至15个，优选1至9个，更优选1至5个，更优选1至3个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于上述多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的内切核酸酶活性的多肽；和具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％，优选至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第47位的丙氨酸的氨基酸残基是除丝氨酸以外的氨基酸残基，和对应于SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第76位的丙氨酸的氨基酸残基是除天冬酰胺之外的氨基酸残基，并且识别和切割A-A、A-C或C-C错配的内切核酸酶活性的多肽。此外，例如，可以优选使用具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸内切酶。这种错配内切核酸酶适用于后述的各种用途，例如，包括除去含有特定DNA序列的DNA并扩增和检测其它DNA的方法。
在本发明中，可以通过使用含有错配碱基对的双链核酸作为底物来测量错配内切核酸酶活性。具体地，在制备含有错配碱基对的双链核酸后，使双链核酸与错配内切核酸酶反应，其中双链核酸的量相对于错配内切核酸酶的量是过量的，然后测量每单位时间切割的核酸的量。切割的双链核酸可以与非切割的核酸分开定量，例如通过电泳。可以使用用荧光物质和猝灭剂物质双标记的双链核酸，使得只有当双链核酸被切割时才能检测到荧光强度的增加。使用这样的用荧光物质和淬灭物质双标记的双链核酸，可以通过以适当的时间间隔测量反应混合物中的荧光强度而容易地确定错配内切核酸酶活性。可以通过改变形成存在于用作底物的双链核酸中的错配碱基对的碱基来确定对特定错配碱基对的切割活性。
（2）使用本发明的错配内切核酸酶的双链核酸的切割方法
本发明的切割双链核酸的方法包括用具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物处理具有错配的碱基对的双链核酸。具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的同系物的实例包括但不限于，具有通过1至数个氨基酸残基，例如1至15个，优选1至9个，更优选1至5个，更优选1至3个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有错配内切核酸酶活性的多肽；和具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％氨基酸序列同一性，优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并具有错配核酸内切酶活性的多肽。例如，包括在上文“（1）本发明的耐热错配内切核酸酶及其突变体”部分中所提到的具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的同系物。
本发明的切割双链核酸的方法可以在来源于耐热微生物的增殖细胞核抗原（PCNA）的存在下进行。可用于本发明的PCNA的实例包括但不限于来自火球菌属（Pyrococcus），热球菌属（Thermococcus），甲烷嗜热菌属（Methanopyrus）和甲烷球菌属（Methanococcus）的PCNA及其同系物。通过在PCNA的存在下进行具有错配的双链核酸的切割来提高切割效率。
在本发明的双链核酸的切割方法中，错配的碱基对存在于双链核酸内（通过正常碱基配对形成的两个碱基对之间）。双链核酸可以包含一个错配碱基对，或者可以间隔包含多个错配碱基对。本发明的双链核酸的切割方法中的错配碱基对的实例优选包括存在于双链核酸内的1至8个连续错配碱基对，更优选存在于双链核酸内的1至4个连续错配碱基对，还更优选存在于双链核酸内的2个连续错配碱基对或1个错配碱基对。在本发明的双链核酸的切割方法中，当多个错配碱基对存在于双链核酸内时，多个错配碱基对可以是相同种类或不同种类的错配碱基对。
具有待由错配内切核酸酶靶向的错配碱基对的双链核酸的实例包括来自生物样品的核酸，例如PCR产物，基因组DNA或其片段和合成核酸。具有错配碱基对的双链核酸也可以是通过解链和再退火多个生物样品的混合物获得的核酸混合物，或来自生物样品的核酸和合成核酸的混合物。例如，当含有突变的核酸和野生型核酸混合，解链和再退火时，形成错配的碱基对，并且在错配的碱基对的位置发生错配内切核酸酶的切割。在由错配内切核酸酶切割后，可观察如此切割的核酸片段的大小以确定突变的存在或不存在和位置。
（3）使用本发明的错配内切核酸酶的核酸扩增方法
使用本发明的错配内切核酸酶允许通过一步反应进行突变分析，所述一步反应中将错配内切核酸酶简单地加入到用于核酸扩增方法如PCR的反应混合物中。已知当PCR中的循环数增加到超过一定数量时，反应产物不增加。主要原因是加入到反应混合物中的dNTP的耗尽，以及引物和反应产物之间对于退火的竞争。此时，发生反应产物之间的退火。如果含有突变的模板和野生型模板共存，则从它们扩增的反应产物彼此退火，在突变位点产生错配的碱基对。因此，可以通过在本发明的错配内切核酸酶存在下通过比通常更多的循环进行PCR来简单地进行突变分析。具体地，本发明提供了一种突变分析方法，其包括用具有SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物处理双链核酸。
在核酸扩增反应的过程中，可以进行本发明的双链核酸切割方法。通过将本发明的错配内切核酸酶添加到核酸扩增用反应溶液中，在扩增过程中通过掺入不正确的核苷酸而产生的具有错配碱基对的双链核酸被切割。结果，具有与反应开始之前的模板核酸的序列不同的序列的核酸的扩增受到抑制。因此，获得具有降低的错误率的核酸扩增。具体地，本发明提供了一种核酸扩增方法，其包括通过使用具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物来切割具有错配碱基对的双链核酸的步骤。本发明的一个方面还包括核酸扩增方法，其包括制备组合物的步骤，所述组合物包含含有DNA聚合酶，至少一对寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物的组合物，和作为模板的核酸分子；以及使由此获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增的步骤。
核酸扩增法的实例包括但不限于扩增DNA的方法。扩增DNA的方法的实例包括聚合酶链反应（PCR）方法，多重置换扩增（MDA）方法和等温核酸扩增方法如ICAN方法和LAMP方法。
本发明的核酸扩增方法可以与来自耐热微生物的增殖细胞核抗原（PCNA）的使用组合。可用于本发明的PCNA的实例包括但不限于来自火球菌属（Pyrococcus），热球菌属（Thermococcus），甲烷嗜热菌属（Methanopyrus），甲烷球菌属（Methanococcus）的PCNA及其同系物。通过在PCNA的存在下进行具有错配的双链核酸的切割来提高切割效率。
（4）本发明的组合物
本发明的组合物包含DNA聚合酶，至少一对寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物。本发明的组合物用于核酸扩增方法。在核酸扩增方法中使用的本发明的组合物除了DNA聚合酶，至少一对寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物之外，还可以含有选自反应缓冲液、二价金属离子、脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸探针和插入染料的至少一种。当上述组合物用于核酸扩增反应时，组合物可以进一步包含核酸作为核酸扩增反应的模板。用于本发明的反应缓冲液的实例包括Good缓冲液如Tris-HCl和HEPES-KOH，以及磷酸盐缓冲液如磷酸钠缓冲液。反应缓冲液的优选实例包括但不限于pH 6-11磷酸钠缓冲液和pH 6-11 Tris-HCl缓冲液。二价金属离子的实例包括镁离子，锰离子，锌离子和钴离子。二价金属离子可以以盐形式提供，例如盐酸盐，硫酸盐或乙酸盐。例如，本发明的组合物可以含有终浓度范围为0.5-50mM的镁离子或终浓度范围为0.5-15mM的锰离子。如本文所用，终浓度是指进行核酸扩增反应的反应溶液中的浓度（下文中，该术语具有相同的含义）。本发明的组合物还可以含有牛血清白蛋白（BSA），表面活性剂和无机盐。例如，本发明的组合物可以含有范围为0至0.2mg / ml的终浓度的BSA。表面活性剂的实例包括Tween 20，Triton X-100和NP-40。例如，本发明的组合物可以含有范围为0至0.2％的终浓度的表面活性剂。无机盐的实例包括氯化钠，氯化钾，谷氨酸钾和硫酸铵。例如，本发明的组合物可以含有终浓度范围为0至0.3M的氯化钠，终浓度范围为0至0.2M的氯化钾，终浓度范围为0至0.6M的谷氨酸钾，或终浓度范围为0至0.05M的硫酸铵。本发明的组合物还可以含有源自耐热微生物的PCNA。PCNA的优选实例包括但不限于来自火球菌属，热球菌属，甲烷嗜热菌属和甲烷球菌属的PCNA。
在上述核酸扩增反应用组合物中具有错配内切核酸酶活性的多肽的浓度可以通过测定不抑制DNA扩增反应的浓度或在合适时在每个反应系统中对错配碱基对的切割有效的浓度来确定。
作为上述核酸扩增反应用组合物中含有的至少一对引物，选择适于各核酸扩增方法的2种或更多种的引物。这些引物可以是DNA引物，RNA引物或嵌合引物，在嵌合引物中DNA分子的一部分被RNA替换，只要达到所需的扩增。引物也可以是含有已知核酸类似物的引物和标记的引物，例如，具有用于检测目的的荧光染料标记。
（5）具有特定序列的核酸的扩增抑制方法和突变的检测方法
本发明人还发现，通过使用本发明的具有不同底物特异性的错配内切核酸酶和适当设计的寡脱氧核糖核苷酸，可以抑制核酸扩增反应中具有特定核苷酸序列的核酸的扩增。因此，本发明的一个方面还包括在核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，包括在（a）寡脱氧核糖核苷酸(其被设计为当寡脱氧核糖核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时产生一至数个错配)、（b）DNA聚合酶、（c）至少一对引物和（d）至少一种具有错配内切核酸酶活性的多肽的存在下进行核酸扩增反应的步骤。本发明的一个方面还包括优先扩增靶核酸的方法，其包括通过使用在核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的上述方法，抑制具有在一个至数个核苷酸中与靶核酸的核苷酸序列不同的特定核苷酸序列的核酸的扩增。
上述（a）中的寡脱氧核糖核苷酸没有特别限制，只要其是设计为当其与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时产生一至数个错配的寡脱氧核糖核苷酸。寡脱氧核糖核苷酸可以是所谓的嵌合寡脱氧核糖核苷酸，其中DNA分子的一部分被RNA替换。寡脱氧核糖核苷酸的3'末端可以被修饰以抑制通过DNA聚合酶从寡脱氧核糖核苷酸的延伸反应，本发明不特别限制于此。修饰的实例包括胺化。通过硫代磷酸酯化或其它修饰，寡脱氧核糖核苷酸可经保护免于脱氧核糖核酸酶的切割，只要与寡脱氧核糖核苷酸结合的核酸经历用具有错配内切核酸酶活性的多肽的切割。为了检测的目的，可以用荧光染料、猝灭剂等标记寡脱氧核糖核苷酸。
寡脱氧核糖核苷酸的长度可以适当地确定，使得寡脱氧核糖核苷酸可以在所进行的反应的条件下与具有特定核苷酸序列的核酸杂交。当寡脱氧核糖核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时产生的错配的位置优选距离寡脱氧核糖核苷酸的5'末端和3'末端至少3个核苷酸。
对于在本发明的核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，可以使用本发明的具有特异性切割错配位点的活性的错配内切核酸酶。例如，当在包括高温反应的核酸扩增方法例如PCR方法中使用耐热DNA聚合酶时，优选使用耐热错配内切核酸酶。在这种情况下，优选使用识别并切割G-G、G-T或T-T错配的耐热错配内切核酸酶，即（i）具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；（ii）具有通过1至数个氨基酸残基，例如1至15个，优选1至9个，更优选1至5个，更优选1至3个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：1的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有识别和切割G-G、G-T或T-T错配的内切核酸酶活性的多肽；或（iii）具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列共有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有识别和切割G-G、G-T或T-T错配的内切核酸酶活性的多肽；和/或识别和切割A-A、A-C或C-C错配的内切核酸酶，即（iv）具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；（v）具有通过1至数个氨基酸残基，例如1至15个，优选1至9个，更优选1至5个，更优选1至3个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：3的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的内切核酸酶活性的多肽；或（vi）具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％，优选至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有识别和切割A-A、A-C或C-C错配的核酸内切酶活性的多肽。
对于在本发明的核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，更优选使用具有仅特异性切割含有特定错配碱基对的双链核酸的活性的错配内切核酸酶。在这种情况下，扩增被抑制的核苷酸序列可以限于一种核苷酸序列。例如，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物识别并切割含有G-G、G-T或T-T错配，或A-A、A-C或C-C错配的双链核酸。因此，当使用具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物时，包含除上述特异性错配以外的错配的双链核酸不被切割并且不经历扩增的抑制。因此，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其同系物优选用于抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法。这种错配内切核酸酶可以单独使用或组合使用，这取决于其扩增需要被抑制的核苷酸序列。
在本发明的核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法中，具有错配内切核酸酶活性的多肽的浓度可以通过检测不抑制DNA扩增反应的浓度或适当时在每个反应系统中有效切割错配碱基对的浓度来测定。（a）中寡脱氧核糖核苷酸的浓度可以通过在考虑靶DNA的模板量或扩增效率的同时优化使用浓度来确定。例如，寡脱氧核糖核苷酸的浓度可以是用于扩增反应的引物浓度的0.1至10倍。
在本发明的核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法可以在任何核酸扩增方法中进行。核酸扩增方法的优选实例是，但不限于，扩增DNA的方法。本发明可以例如在PCR法，MDA法或等温核酸扩增法如LAMP法或ICAN法中进行。
在本发明的核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法可以应用于任何核酸的扩增。当DNA用作待扩增的靶时，DNA的实例包括存在于人工制备的DNA混合物，来自环境或生物体的样品或由上述样品制备的DNA混合物中的DNA。来自生物体的样品的实例包括但不限于来自哺乳动物例如人的样品。DNA混合物的实例包括但不限于基因组DNA片段的混合物，通过逆转录反应由mRNA产生的cDNA的混合物，以及多种PCR产物的混合物。具有进行扩增抑制的特定核苷酸序列的DNA的实例包括未分离并保留的来自rRNA的逆转录产物和通过引物之间的配对产生的小分子DNA。当扩增功能性筛选后的基因文库时，可以通过抑制具有显示阳性信号的已知基因序列的DNA的扩增来制备能够更有效地搜索未知基因的文库。
本发明的优先扩增靶核酸的方法还可以包括检测扩增的靶核酸的步骤。如本文所使用的，本发明的这个方面有时被称为“本发明的检测方法”。例如，根据本发明的检测方法，其中DNA用作待检测的靶，即使当不是待检测靶的DNA（具有特定核苷酸序列的DNA）相对于是待检测靶的DNA（靶DNA）以过高的量存在时，依靠在本发明的核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法的（d）中具有错配内切核酸酶活性的多肽和（a）中寡脱氧核糖核苷酸，作为模板的非靶DNA的扩增得到抑制，因此可以检测待检测的靶DNA。
此外，本发明的检测方法能够区别性地检测例如核酸的野生型和突变型(对应于其中已知基因中存在突变的基因)。当使用含有野生型核苷酸序列的DNA作为具有特定核苷酸序列的核酸进行本发明的检测方法时，可以在存在过高量的正常等位基因（即，具有野生型核苷酸序列的DNA）的情况下检测少量的突变等位基因。例如，本发明的方法可用于检测循环肿瘤DNA，或检测母体血液中含有的少量胎儿DNA序列。因此，本发明的一个方面还包括突变检测方法，其包括使用本发明的错配内切核酸酶。突变的实例包括微缺失和点突变。通过点突变产生的多态性称为单核苷酸多态性（SNP）。如本文所使用的，在SNP中具有突变核苷酸序列的DNA有时被称为具有单核苷酸多态性突变的DNA。
可以进行本发明的检测方法的核酸的优选实例包括但不限于，含有至少一种选自用作肿瘤标记物的单核苷酸多态性突变、与用于治疗癌症的剂的治疗效果相关的单核苷酸多态性突变、以及已知与细胞癌变相关的单核苷酸多态性突变的单核苷酸多态性的核酸。SNP的实例包括在肿瘤细胞中经常发现的那些，以及已知与用于治疗癌症或癌发生的剂的治疗效果相关的那些。这种SNP的实例包括K-ras基因、B-raf基因和表皮生长因子受体（EGFR）基因的SNP。K-ras基因中的体细胞突变常见于结肠直肠癌、肺腺癌、甲状腺癌等。B-raf基因中的体细胞突变常见于结肠直肠癌、恶性黑素瘤、乳头状甲状腺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌等。EGFR基因中的体细胞突变常见于各种实体瘤中。已知当癌组织中的EGFR基因具有特定的单核苷酸多态性突变时，用EGFR抑制剂例如吉非替尼或厄洛替尼治疗癌症可能是有效的。相比之下，已知当癌组织中的K-ras基因具有单核苷酸多态性突变时，癌症可能对EGFR抑制剂具有抗性。
本发明的错配内切核酸酶可以用于突变检测方法。本发明的检测方法可以使用用亚硫酸氢盐处理含有自生物的样品提取的甲基化DNA的组合物后获得的DNA作为材料进行。根据本发明的检测方法，可以进行在存在过多量的非甲基化等位基因的情况下少量甲基化等位基因的检测，或在存在过多量的甲基化等位基因的情况下少量非甲基化等位基因的检测。
作为用亚硫酸氢盐处理，可以使用用于检测甲基化DNA的已知的亚硫酸氢盐方法。通过处理，非甲基化胞嘧啶变为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不变。当用亚硫酸氢盐处理的反应溶液通过PCR进行扩增时，尿嘧啶变为胸腺嘧啶，甲基化的胞嘧啶变为胞嘧啶。换句话说，在特定位点存在过多量非甲基化等位基因的情况下检测少量甲基化等位基因，和在存在过多量甲基化等位基因的情况下检测少量非甲基化等位基因分别对应于在过多量胸腺嘧啶的存在下检查胞嘧啶的存在，以及在过多量胞嘧啶的存在下检查胸腺嘧啶的存在。当过多量的含有胸腺嘧啶或胞嘧啶的DNA的扩增被抑制时，很容易检查少量甲基化等位基因或非甲基化等位基因的存在。
对于在本发明的检测方法中检测靶核酸的步骤，可以使用电泳，核苷酸序列分析或使用探针如循环探针或TaqMan探针的实时PCR。对于这些检测方法，可以直接使用常规技术。特别地，使用高分辨率熔解（HRM）分析方法允许通过一步扩增和检测目的DNA，从而获得目的DNA的快速和简单检查。
本发明的具有特定序列的核酸的扩增抑制方法和突变检测方法可以与来自耐热微生物的PCNA的使用组合。可用于本发明的PCNA的实例包括但不限于来自火球菌属（Pyrococcus），热球菌属（Thermococcus），甲烷嗜热菌属（Methanopyrus）和甲烷球菌属（Methanococcus）的PCNA及其同系物。
本发明的一个方面还包括用于核酸扩增反应的组合物，其包含（a）寡脱氧核糖核苷酸，其设计为当寡脱氧核糖核苷酸与具有特定核苷酸序列的核酸杂交时产生一至数个错配；（b） DNA聚合酶；（c）至少一对引物；和（d）至少一种具有错配内切核酸酶活性的多肽。所述组合物还可以含有选自反应缓冲液、二价金属离子、脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸探针和嵌入染料中的至少一种。当组合物用于核酸扩增反应时，组合物可以进一步包含核酸作为核酸扩增反应的模板。组合物还可以含有牛血清白蛋白（BSA）、表面活性剂和无机盐。所述组合物还可以含有源自耐热微生物的PCNA。
实施例
本发明将通过实施例更具体地解释，但本发明不限于此。
制备实施例1：基因组DNA的制备
Thermococcus kodakarensis KOD1（JCM 12380T，以下称为TKO）由Haruyuki Atomi教授供给（京都大学工程研究生院（Kyoto University Graduate School ofEngineering））。根据以下方法培养KOD1。将亚硫酸钠加入含有5g丙酮酸钠（由Nacalaitesque制造）的1L人工海水（以下称为ASW）-YT培养基[0.8×ASW，5g / L Bacto酵母提取物（DIFCO公司制造），5g / L Bacto胰蛋白胨（由Becton，Dickinson and Company制造），0.1％刃天青（由Nacalai tesque制造）]，直到培养基变成无色。然后，将KOD1接种到培养基中，在85℃下厌氧培养16小时，并收集。收集的KOD1用于随后的实验。这里，包含在ASW-YT培养基中的“0.8×ASW”包含16 g/L NaCl, 2.4 g/L MgCl2·6H2O, 4.8 g/L MgSO4·7H2O,0.8 g/L (NH4)2SO4, 0.16 g/L NaHCO3, 0.24 g/L CaCl2·2H2O, 0.4 g/L KCl, 0.336 g/L KH2PO4, 0.04 g/L NaBr, 0.016 g/L SrCl2·6H2O和0.008 g/L Fe(NH4)柠檬酸盐。将约2g如上所述培养的微生物悬浮于100ml缓冲液L [10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA，100mMNaCl]中，并向悬浮液中加入1ml 10％SDS。搅拌如此获得的微生物悬浮液，然后向悬浮液中加入1ml 20mg / mL蛋白酶K（由TAKARA BIO INC.制造）。将悬浮液在55℃下静置60分钟。用蛋白酶K处理的微生物悬浮液依次进行苯酚提取，苯酚/氯仿提取和氯仿提取。向由此获得的水层中加入乙醇以沉淀DNA。
收集DNA，并溶解于100ml TE溶液[10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA]中。向如此获得的溶液中加入0.75mg RNA酶A（Nacalai tesque制造），并在37℃下反应60分钟。然后，反应溶液依次进行苯酚提取，苯酚/氯仿提取和氯仿提取，得到水层。然后，通过乙醇沉淀从水层收集DNA。最后得到7.5mg的DNA。
实施例1：TKO NucS的制备
（1）制备用于表达TKO NucS的质粒
通过以下方法克隆编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的基因，即TKO nucS基因。首先，使用100ng由制备实施例1制备的TKO基因组DNA作为模板，具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的TK1898-F和具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的TK1898-R作为引物，进行PCR。TK1898-F具有被限制酶NdeI识别的序列，TK1898-R具有被限制酶NotI识别的序列。反应溶液含有0.5μM的各引物，2.5mM dNTP，1.5mM MgCl2，1U KOD-Plus-Neo DNA聚合酶（TOYOBOCO., LTD.制造），反应体积为50μL。通过30个循环的反应进行PCR，其中一个循环由98℃10秒，55℃30秒和68℃1分钟组成。
让反应溶液在琼脂糖上电泳，切出对应于TKO nucS基因的约800bp的条带。通过常规方法从条带中纯化DNA。用限制酶NdeI和NotI（由TAKARA BIO INC.制造）消化DNA，并再次进行琼脂糖电泳。从凝胶中纯化DNA片段。将该DNA片段与预先用NdeI和NotI消化的pET21a（Novagen制造）混合。将混合物进行连接反应，然后转导到大肠杆菌（以下简称为大肠杆菌(E. coli)）JM109中，得到转化子。将转化子在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。然后，形成菌落。将菌落在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养以获得细菌细胞。使用PureLink（注册商标）HiPure Plasmid Midiprep试剂盒（Life Technologies制造）从细菌细胞中纯化质粒。通过常规方法测定插入质粒中的片段的核苷酸序列，以证实TKO nucS基因被正确克隆。含TKO nucS基因的质粒命名为pET21a-TkoNucS。
（2）TKO NucS的表达
使用实施例1（1）制备的作为TKO NucS表达质粒的pET21a-TkoNucS。为了生产重组蛋白，使用可从Novagen获得的大肠杆菌重组蛋白表达系统（pET系统）。首先，通过所附说明书中描述的方法，用pET21a-TkoNucS转化大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL（由AgilentTechnologies制造）。将转化的细菌细胞培养在100ml含有50μg/ mL氨苄青霉素和34μg/ mL氯霉素的LB培养基中直至汇合。将由此得到的培养溶液接种到1L含有50μg/ mL氨苄青霉素和34μg/ mL氯霉素的LB培养基中，使OD600为0.01，在37℃振荡培养至OD600达到0.4。然后，通过向培养溶液中加入IPTG（终浓度：1mM）诱导目标蛋白质的产生。加入IPTG后，将培养溶液在25℃下振荡培养16小时，离心（5000×g，10分钟，4℃），收集细菌细胞。
将收集的细菌细胞悬浮于含有0.5M氯化钠和1mM PMSF的25ml溶液A [50mM Tris-HCl（pH 8.0），0.5mM DTT，0.1mM EDTA，10％甘油]中，在冰上超声处理(总共10分钟，通过重复“开”10秒/“关”10秒），然后离心（24,000×g，10分钟，4℃），得到上清液。将上清液热处理（80℃，30分钟），然后离心（24,000×g，4℃，10分钟），除去来源于大肠杆菌的热变性蛋白质。
（3）TKO NucS的纯化
为了纯化在如上述（2）中所述的热处理和离心后获得的上清液中含有的TKO NucS蛋白，将聚乙烯亚胺以0.15％的终浓度加入上清液中，以使污染上清液的核酸不溶解。通过离心（24,000×g，4℃，10分钟）除去核酸，得到上清液。向上清液中加入(NH4)2SO4直至80％饱和，并将混合物在4℃下搅拌过夜以盐析出目标蛋白。由此获得的溶液（24,000×g，10分钟，4℃），得到沉淀。将沉淀物溶解在20ml含有1.5M (NH4)2SO4的溶液A中，并使用AKTA纯化器系统（由GE Healthcare制造）加载到疏水相互作用层析柱HiTrap Phenyl HP 5mL（GEHealthcare制造）上。通过1.5至0 M (NH4)2SO4的浓度梯度洗脱蛋白质，并收集对应于1.4至0.73M (NH4)2SO4的洗脱级分。将这些级分对含有0.3M氯化钠的溶液A透析过夜。将透析后获得的溶液离心（23,708×g，4℃，10分钟），得到上清液。将上清液加载到亲和色谱柱HisTrapHeparin HP 1ml（由GE Healthcare制造）上。通过0.3M至1M氯化钠的浓度梯度洗脱蛋白质，并收集对应于0.58至0.8M氯化钠的洗脱级分。将这些级分对含有0.35M氯化钠的溶液A透析过夜。将透析后得到的溶液离心（24,000×g，4℃，10分钟），得到上清液。将上清液加载到阳离子交换色谱柱HiTrap SP HP 1ml（由GE Healthcare制造）上。通过0.35M至1M氯化钠的浓度梯度洗脱蛋白质，收集洗脱级分作为最终纯化的产物。将最终纯化的产物进行12％SDS-PAGE以确认纯度。结果示于图1中。使用ProtParam工具获得的摩尔吸光系数ε280= 12950M- 1cm-1，由280nm处的吸光度计算纯化蛋白质的浓度（http://web.expasy.org/protparam/）。
实施例2：TKO NucS的酶性质
（1）错配DNA切割反应的底物的制备
进行TKO NucS的错配切割活性的实验。本实施例中使用的寡核苷酸的核苷酸序列示于SEQ ID NO：7-16。SEQ ID NO：7-9显示在其5'端用Cy5荧光标记的寡核苷酸。
如图2所示，将SEQ ID NO：7-16所示的寡核苷酸组合以制备不含错配的45bp双链DNA（全匹配dsDNA）和8种含有一个错配位点的双链DNA底物[含有腺嘌呤与腺嘌呤之间错配的双链DNA（A-A dsDNA），含有腺嘌呤与胞嘧啶之间错配的双链DNA（A-C dsDNA），含有腺嘌呤与鸟嘌呤之间错配的双链DNA（A-G dsDNA），含有鸟嘌呤与胸腺嘧啶之间错配的双链DNA（G-T dsDNA），含有鸟嘌呤与鸟嘌呤之间错配的双链DNA（G-G dsDNA），含有胸腺嘧啶与胞嘧啶之间错配的双链DNA（T-C dsDNA），含有胸腺嘧啶和胸腺嘧啶之间错配的双链DNA（T-TdsDNA）和含有胞嘧啶和胞嘧啶之间错配的双链DNA（C-C dsDNA）]。在含有比率为1比1.6的用Cy5荧光标记的寡核苷酸和未标记寡核苷酸的50μl退火溶液A [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 6 mM (NH4)SO4, 2 mM MgCl2]中，错配的寡核苷酸退火以制备含有荧光标记的DNA的50nM底物溶液。退火在98℃5分钟，80℃30秒，80℃至60℃30分钟，60℃30秒，60℃至40℃30分钟，25℃30秒的条件下进行。此外，将上述标记和未标记的寡核苷酸的组合在50μl退火溶液B [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 6 mM (NH4)SO4]中在上述退火条件下退火，以制备不含二价金属离子的50nM荧光标记的DNA底物溶液。
（2）错配DNA切割活性的测量
在20μl反应溶液[20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 6 mM (NH4)SO4, 2 mMMgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg/mL BSA]中，将每种浓度（0、1、2、5、10、20、50和100nM，作为单体）的TKO NucS和5nM的底物（G-T dsDNA）在55℃反应5分钟。然后，向反应溶液中加入1μl 0.5M EDTA以终止反应。在反应停止后，向反应溶液中加入0.5μl 5mg / mL蛋白酶K，并将反应溶液保持30分钟以降解蛋白质。向用蛋白酶K处理的反应溶液中加入4μl凝胶上样缓冲液[15％Ficoll，10mM Tris-HCl（pH8.0），0.1％Orange G]。将由此获得的溶液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳在1X TBE中在25mA下运行30分钟。结果示于图3-A中。在图3-A中，泳道1至8分别对应于0至100nM TKO NucS。电泳后，使用Typhoon Trio +成像仪（GE Healthcare制造）从凝胶中检测反应产物，并使用Image Quant TL定量对应于切割的寡核苷酸的条带。结果示于图3-B中。在图3-B中，纵轴表示切割效率（％），横轴表示TKO NucS的浓度。
（3）研究通过TKO NucS进行错配DNA切割反应的最佳pH
如下所述检查由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的最佳pH。具体而言，将2nM TKONucS和5nM在图2中所示的G-T dsDNA（由具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列的Cy5-45错配寡核苷酸和具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列的temp45-正常寡核苷酸组成的双链DNA）加入20mM Glycine-HCl缓冲液(pH 3.0)、20 mM CH3COOH-CH3COONa缓冲液(pH 4.0和pH 5.0)、20mM MES-HCl缓冲液(pH 6.0)、20 mM Bis-Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、20 mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0和pH 10.0)、20 mM CAPS-NaOH缓冲液(pH11.0)和20 mM磷酸盐-NaOH缓冲液(pH 12.0)的各缓冲液，以及0.1 M NaOH溶液(pH 13.0)中，其中缓冲液和NaOH溶液含有40 mM NaCl, 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgCl2,0.1% Triton X-100和0.1 mg/mL BSA，然后在55℃下孵育5分钟。孵育后，用蛋白酶K处理反应溶液，然后进行电泳以测定切割活性。结果示于图4中。图4显示了反应的最佳pH。在图4中，纵轴表示相对活性，横轴表示pH。
（4）盐的种类和浓度对由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的影响
检查了盐的种类和浓度对由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的影响。首先，使用含有6 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100和0.1 mg/mL BSA的20mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0），制备含有0、50、100、150、200、300、400、600、800或1000 mM NaCl、KCl或K-Glu（谷氨酸钾）的反应溶液。向反应溶液中加入2nM TKO NucS和5nM G-T dsDNA，然后在55℃孵育5分钟。孵育后，用蛋白酶K处理反应溶液，然后进行电泳以测定切割活性。结果示于图5中。图5（A）显示氯化钠浓度的影响，纵轴显示相对活性，横轴显示盐浓度。图5（B）表示氯化钾浓度的影响，纵轴表示相对活性，横轴表示盐浓度。图5（C）表示谷氨酸钾浓度的影响，纵轴表示相对活性，横轴表示盐浓度。
（5）二价金属离子对由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的影响
检查了二价金属离子对由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的影响。使用含有6 mM(NH4)2SO4, 200 mM NaCl, 0.1% Triton X-100和0.1 mg/mL BSA的20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）制备含有0、0.5、1、2、5、10、20、50、100或200 mM MgCl2，或0、0.5、1、2、5、10或20mM MnCl2的反应溶液。向反应溶液中加入2nM TKO NucS和5nM G-T dsDNA，然后在55℃孵育5分钟。孵育后，用蛋白酶K处理反应溶液，然后进行电泳以测定切割活性。结果示于图6和图7中。图6显示氯化镁浓度的影响，纵轴显示相对活性，横轴显示0-200mM的浓度（A）和0-20mM的浓度（B）。图7示出氯化锰的影响，纵轴表示相对活性，横轴表示锰浓度。
（6）由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的最适温度的研究
如下所述检查由TKO NucS进行的错配DNA切割反应的最佳温度。具体地，制备含有20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0), 6 mM (NH4)2SO4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.1%Triton X-100和0.1 mg/mL BSA的反应溶液。向反应溶液中加入2nM TKO NucS和5nM G-TdsDNA，然后在30℃至95℃的反应温度范围下孵育5分钟。孵育后，用蛋白酶K处理反应溶液，然后进行电泳以测定切割活性。结果示于图8中。图8显示最佳温度。在图8中，纵轴表示相对活性，横轴表示反应温度。
实施例3：TKO NucS的错配切割活性的确认
（1）对各种错配的DNA的切割活性
使用如实施例2（1）中所述通过退火制备的不含错配的45bp双链DNA（全匹配dsDNA）和含有一个错配位点的8种45bp双链DNA底物来检查TKO NucS对各种错配DNA的切割活性。具体地，在20μl反应溶液[20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 6 mM (NH4)SO4, 2 mMMgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg/mL BSA]中，各浓度（0、1、2、5、10、20、50和100nM，作为单体）的TKO NucS和5 nM底物（全匹配dsDNA、A-A dsDNA、A-C dsDNA、A-G dsDNA、G-TdsDNA、G-G dsDNA、T-C dsDNA、T-T dsDNA和C-C dsDNA）在55℃下反应5分钟。然后，向反应溶液中加入1μl 0.5M EDTA以终止反应。在反应停止后，向反应溶液中加入0.5μl 5mg / mL蛋白酶K，并将反应溶液保持30分钟以降解蛋白质。向用蛋白酶K处理的反应溶液中加入4μl凝胶上样缓冲液。将由此获得的溶液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳在1X TBE中在25mA下运行30分钟。电泳后，使用Typhoon Trio + 成像仪（GE Healthcare制造）从凝胶中检测反应产物，并使用Image Quant TL定量对应于切割的寡核苷酸的条带。结果示于图9。在图9中，纵轴表示切割效率（％），横轴表示TKO NucS的浓度。通过使用如图例所示的不同标记来绘制每个错配底物的切割效率。如图9所示，TKO NucS切割G-T dsDNA，G-GdsDNA，T-T dsDNA，T-C dsDNA和A-G dsDNA。
（2）TKO NucS的DNA结合活性的测定
检查了TKO NucS的DNA结合活性。首先，为了检测底物特异性，在20μl结合溶液[20 mMTris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 6 mM (NH4)SO4, 2 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100,0.1 mg/mL BSA, 1 mM DTT]中，各浓度的TKO NucS（0、1、2、5、10和20nM，作为单体）和通过使用具有SEQ ID NO：17的核苷酸序列并在其5'端具有Cy5荧光标记的Cy5-15结合寡核苷酸制备的探针DNA序列，以及5 nM的如图10所示的具有SEQ ID NO:18-26的核苷酸序列的组合的各15结合寡核苷酸[ssDNA (Cy5-15结合), 全匹配(15 bp) dsDNA, A-A (15 bp)dsDNA, A-C (15 bp) dsDNA, A-G (15 bp) dsDNA, G-T (15 bp) dsDNA, G-G (15 bp)dsDNA, T-C (15 bp) dsDNA, T-T (15 bp) dsDNA和C-C (15 bp) dsDNA]在37℃下孵育5分钟。向孵育后的反应溶液中加入4μl凝胶上样缓冲液。将由此获得的溶液上样到8％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳在0.5×TBE中在25mA下运行30分钟。电泳后，通过使用TyphoonTrio +成像仪检测结合活性。结果示于图11中。在图11中，泳道1-6和泳道7-12分别对应于0-20nM TKO NucS。如图11所示，TKO NucS与G-T（15bp）dsDNA，G-G（15bp）dsDNA和T-T（15bp）dsDNA结合。
（3）TKO NucS的耐热性研究
如下所述检查耐热性。具体地，如实施例3（2）所述，制备18μl含有作为单体的2nM的TKONucS并且不含有底物的反应溶液。将反应溶液在各温度（50、60、70、80、85、90和95℃）下保持30分钟。然后，以5nM加入底物（G-T错配dsDNA），反应溶液在55℃下反应5分钟。然后，向反应溶液中加入1μl 0.5M EDTA以终止反应。在反应停止后，向反应溶液中加入0.5μl 5mg /mL蛋白酶K，并将反应溶液保持30分钟以降解蛋白质。向用蛋白酶K处理的反应溶液中加入4μl凝胶上样缓冲液。将由此获得的溶液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳在1XTBE中在25mA下运行30分钟。电泳后，通过使用Typhoon Trio +成像仪从凝胶中检测反应产物，并使用Image Quant TL定量对应于切割的寡核苷酸的条带。结果示于图12中。图12显示了耐热性。在图12中，纵轴表示残留活性，横轴表示处理温度。如图12所示，即使在80℃处理30分钟后，TKO NucS仍具有约80％的错配切割活性。
实施例4：通过源自Thermococci kodakarensis的PCNA1促进TKO NucS的切割活性
检查了源自T.kodakarensis的PCNA1（以下称为TKO PCNA; Genes to Cells，2012，第1卷，第2期，第923-937页）对TKO NucS的错配DNA切割反应的影响。具体而言，在含有400mM氯化钠的20μl切割反应液C中，2.5nM的作为二聚体的野生型TKO NucS，5nM的底物DNA（G-TdsDNA）和各浓度的TKO PCNA（0、5、10、25、50、125、250、500和1250nM，作为三聚体）在55℃下反应5分钟。然后，向反应溶液中加入1μl 0.5M EDTA以终止反应。反应停止后，向反应溶液中加入1μl 5mg / mL蛋白酶K和1μl 10％SDS，将反应溶液在50℃保持1小时以降解蛋白质。
向用蛋白酶K / SDS处理的反应溶液中加入4.5μl凝胶上样缓冲液。将由此获得的溶液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳在1X TBE中在25mA下运行20分钟。
电泳后，通过使用Typhoon Trio +成像仪从凝胶中检测反应产物，并使用ImageQuant TL定量对应于切割的寡核苷酸的条带。结果示于图13中。在图13中，（A）显示了非变性PAGE的照片。（B）显示了通过Image Quant TL定量的对应于底物和切割产物的条带的强度，并且垂直轴显示相对活性。相对活性是相对于在不存在PCNA的情况下定义为1的活性，在不同浓度的PCNA存在下的活性。从图13可以看出，发现TKO PCNA的存在促进错配切割活性，即使在引起反应抑制的400mM NaCl的存在下。
实施例5：突变型TKO NucS的制备
（1）用于表达突变型TKO NucS的质粒的制备
为了构建用于表达TKO NucS的各位点定向突变体的质粒，制备具有SEQ ID NO:27至30的核苷酸序列的引物。然后，为了构建用于产生突变型TKO NucS的质粒，使用利用PCR的诱变。
为了在位置47和位置76引入突变，进行两轮下列程序。向各自(25ul)分别包含用于KOD-Plus-Neo（TOYOBO CO., LTD.制造）的1×PCR缓冲液、0.2mM各dNTP、1.5mM镁离子和0.02U /μL KOD-Plus-Neo的两种反应溶液中，加入25ng用于第一轮的TKO NucS（pET21a-TkoNucS）表达的质粒和25ng用于第二轮的由第一轮制备的质粒作为模板，以及各7.5pmol具有SEQ ID NO：27和28的核苷酸序列的用于第一轮的引物，和各7.5pmol具有SEQ ID NO：29和30的核苷酸序列的用于第二轮的引物。反应在包括98℃下1分钟；14个循环，其中一个循环由98℃10秒，55℃30秒和68℃5分钟组成；在68℃下5分钟；然后在25℃下5秒的条件下进行。
PCR后，向反应溶液中加入0.5ul 20U /μl DpnI（由TAKARA BIO INC.制造），并在37℃下反应1小时。用DpnI处理的反应溶液用于转化大肠杆菌JM109。将由此得到的细菌细胞在25ml含有50μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养，然后使用PureLink（注册商标）HiPure Plasmid Midiprep试剂盒进行质粒提取。通过常规方法测定提取的质粒中编码TKONucS的核苷酸序列。因此，证实了用于产生突变型TKO NucS蛋白的质粒被制备。由此获得的质粒命名为pET21a-TkoNucS_S47A/N76A。通过实施例1（2）和（3）中描述的方法进行突变型TKO NucS S47A/N76A的表达和纯化。
实施例6：突变型TKO NucS S47A/N76A的错配DNA切割活性
分析了突变型TKO NucS S47A/N76A的错配DNA切割活性。具体地，在20μl反应溶液[20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 6 mM (NH4)SO4, 2 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg/mL BSA]中，5nM底物（A-A dsDNA）和50nM作为二聚体的野生型TKO NucS或突变型TKO NucS S47A/N76A在55℃下反应5分钟。然后，向反应溶液中加入1μl 0.5M EDTA以终止反应。在反应停止后，向反应溶液中加入0.5μl 5mg / mL蛋白酶K，并将反应溶液保持30分钟以降解蛋白质。向用蛋白酶K处理的反应溶液中加入4μl凝胶上样缓冲液。将由此获得的溶液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳在1X TBE中在25mA下运行30分钟。
结果示于图14中。在图14中，泳道1至3分别对应于不含任何TKO NucS蛋白的反应溶液，含有野生型TKO NucS的反应溶液和含有突变型TKO NucS S47A/N76A的反应溶液。结果，发现突变型TKO NucS S47A/N76A识别并切割A-A错配。因此，获得识别和切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶以及识别并切割至少A-A错配的错配内切核酸酶两者。
工业适用性
本发明可用于广泛的领域，包括遗传技术、生物学、医学和农业领域。
序列表自由文本
SEQ ID NO：1：来自Thermococcus kodakarensis的野生型内切核酸酶NucS的氨基酸序列
SEQ ID NO：2：来自Thermococcus kodakarensis的野生型内切核酸酶NucS的核苷酸序列
SEQ ID NO：3：来自Thermococcus kodakarensis的突变内切核酸酶NucS的氨基酸序列
SEQ ID NO：4：来自Thermococcus kodakarensis的突变内切核酸酶NucS的核苷酸序列
SEQ ID NO：5：TK1898-F引物
SEQ ID NO：6：TK1898-R引物
SEQ ID NO：7：TKO NucS的底物，命名为Cy5-45非破坏的。“5'-末端用Cy5标记”
SEQ ID NO：8：TKO NucS的底物，命名为Cy5-45-错配。“5'-末端用Cy5标记”
SEQ ID NO：9：TKO NucS的底物，命名为Cy5-temp45。“5'-末端用Cy5标记”
SEQ ID NO：10：TKO NucS的底物，命名为temp45-正常。
SEQ ID NO：11：TKO NucS的底物，命名为temp45-21A。
SEQ ID NO：12：TKO NucS的底物，命名为temp45-21C。
SEQ ID NO：13：TKO NucS的底物，命名为temp45-21G。
SEQ ID NO：14：TKO NucS的底物，命名为45-错配25C。
SEQ ID NO：15：TKO NucS的底物，命名为45-错配25T。
SEQ ID NO：16：TKO NucS的底物，命名为非破坏的-22C。
SEQ ID NO：17：TKO NucS的底物，命名为Cy5-15结合。“5'-末端用Cy5标记”
SEQ ID NO：18：TKO NucS的底物，命名为15结合_AT。
SEQ ID NO：19：TKO NucS的底物，命名为15结合_AA。
SEQ ID NO：20：TKO NucS的底物，命名为15结合_CA。
SEQ ID NO：21：TKO NucS的底物，命名为15结合_GA。
SEQ ID NO：22：TKO NucS的底物，命名为15结合_GT。
SEQ ID NO：23：TKO NucS的底物，命名为15结合_GG。
SEQ ID NO：24：TKO NucS的底物，命名为15结合_CT。
SEQ ID NO：25：TKO NucS的底物，命名为15结合_TT。
SEQ ID NO：26：TKO NucS的底物，命名为15结合_CC。
SEQ ID NO：27：A47-F引物
SEQ ID NO：28：A47-R引物
SEQ ID NO：29：A76-F引物
SEQ ID NO：30：A76-R引物。

Claims (10)

1.一种切割双链核酸的方法，包括用选自下列（i）至（iii）的至少一种多肽处理具有错配碱基对的双链核酸以在G-G、G-T或T-T错配碱基对的位置处识别并切割双链核酸的两条链：
（i）具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
（ii）具有通过1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别并切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（iii）具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列共有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并具有识别并切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
2.一种包含以下（a）至（c）的组合物：
（a）DNA聚合酶；
（b）至少一对寡核苷酸引物；和
（c）选自下列（i）至（iii）的至少一种多肽：
（i）具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
（ii）具有通过1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别并切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（iii）具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列共有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有识别并切割G-G、G-T或T-T错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
3. 一种扩增核酸的方法，包括以下步骤（a）和（b）：
（a）制备包含根据权利要求2所述的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和
（b）使步骤（a）获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增。
4.选自下列（A）至（C）的多肽：
（A）具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
（B）具有通过并非第47和76位的氨基酸残基的1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于（A）的多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别并切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（C）具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第47位的丝氨酸和第76位的天冬酰胺的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，并且具有识别并切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
5.一种包含以下（a）至（c）的组合物：
（a）DNA聚合酶；
（b）至少一对寡核苷酸引物；和
（c）选自下列（i）至（iii）的至少一种多肽：
（i）具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
（ii）具有通过并非第47和76位的氨基酸残基的1至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而不同于（i）的多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有识别并切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽；和
（iii）具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列共有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第47位的丝氨酸和第76位的天冬酰胺的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，并且具有识别并切割A-A、A-C或C-C错配的错配内切核酸酶活性的多肽。
6. 一种扩增核酸的方法，包括以下步骤（a）和（b）：
（a）制备包含根据权利要求5所述的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和
（b）使步骤（a）获得的组合物在合适的条件下反应以进行核酸扩增。
7.一种在核酸扩增反应中抑制具有特定核苷酸序列的核酸的扩增的方法，包括在以下（a）至（d）的存在下进行核酸扩增反应的步骤：
（a）寡脱氧核糖核苷酸，其设计为当所述寡脱氧核糖核苷酸与具有特定核苷酸序列或其互补链的核酸杂交时产生一至数个错配；
（b）DNA聚合酶；
（c）至少一对寡核苷酸引物；和
（d）在根据权利要求1的方法中使用的多肽和/或根据权利要求4的多肽。
8.一种优先扩增靶核酸的方法，包括通过根据权利要求7所述的方法抑制具有在一至数个核苷酸中与所述靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸的扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述靶核酸的扩增在源自耐热微生物的增殖细胞核抗原（PCNA）或其同系物的存在下进行。
10.一种检测靶核酸中的突变的方法，包括使用在根据权利要求1所述的方法中使用的多肽和/或根据权利要求4所述的多肽。
CN201580048826.8A 2014-09-11 2015-09-09 利用热稳定性错配内切核酸酶的方法 Pending CN107002067A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-184934 2014-09-11
JP2014184934 2014-09-11
PCT/JP2015/075603 WO2016039377A1 (ja) 2014-09-11 2015-09-09 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107002067A true CN107002067A (zh) 2017-08-01

Family

ID=55459121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580048826.8A Pending CN107002067A (zh) 2014-09-11 2015-09-09 利用热稳定性错配内切核酸酶的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10975415B2 (zh)
EP (1) EP3192868A4 (zh)
JP (1) JP6550649B2 (zh)
KR (1) KR20170053636A (zh)
CN (1) CN107002067A (zh)
WO (1) WO2016039377A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111748610A (zh) * 2020-06-24 2020-10-09 西北农林科技大学 T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用
CN115210380A (zh) * 2020-03-19 2022-10-18 宝生物工程株式会社 耐热的错配核酸内切酶变体
WO2023240564A1 (zh) * 2022-06-16 2023-12-21 深圳华大智造科技股份有限公司 含甘氨酸-NaOH缓冲液的切除试剂及其在核酸测序中的应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10131890B2 (en) 2013-03-14 2018-11-20 Takara Bio Inc. Method for using heat-resistant mismatch endonuclease
AU2015280069B2 (en) 2014-06-23 2021-08-12 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
US10975415B2 (en) 2014-09-11 2021-04-13 Takara Bio Inc. Methods of utilizing thermostable mismatch endonuclease
CN107614681A (zh) * 2015-03-20 2018-01-19 宝生物工程株式会社 用于检测靶核酸的高灵敏度方法
EP3645744B1 (en) * 2017-06-28 2022-04-06 New England Biolabs, Inc. Method for removing and/or detecting nucleic acids having mismatched nucleotides
EP3694993A4 (en) * 2017-10-11 2021-10-13 The General Hospital Corporation SITE-SPECIFIC AND PARASITIC GENOMIC DESAMINATION DETECTION METHODS INDUCED BY BASIC EDITING TECHNOLOGIES
EP3781585A4 (en) 2018-04-17 2022-01-26 The General Hospital Corporation SENSITIVE IN VITRO ASSAYS FOR SUBSTRATE AND SITE PREFERENCES OF NUCLEIC ACID BINDERS, MODIFIERS AND CLEAVATORS
AU2020333968A1 (en) * 2019-08-22 2022-03-31 New England Biolabs, Inc. Cleavage of single stranded DNA having a modified nucleotide
WO2021178809A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Life Technologies Corporation High sequence fidelity nucleic acid synthesis and assembly
JP7511832B2 (ja) * 2020-03-13 2024-07-08 国立大学法人九州大学 耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼによる核酸の切断方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602011A (en) * 1995-01-18 1997-02-11 Pharmacia Biotech Inc. Purified Thermococcus barossii DNA polymerase
US20030165898A1 (en) * 2000-01-05 2003-09-04 Alison Todd Method for concurrent amplification and real time detection of polymorphic nucleic acid sequences

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3395021A (en) 1964-10-14 1968-07-30 Gen Foods Corp Beverage powder producing pulpy mouth feel when dissolved
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
AUPN245295A0 (en) 1995-04-13 1995-05-11 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Assay for genetic abnormalities
WO1997021837A1 (en) 1995-12-15 1997-06-19 Amersham Life Science, Inc. Methods for the detection and removal of mutant sequences that arise during enzymatic amplification using mismatch repair systems
ATE280245T1 (de) 1996-06-05 2004-11-15 Fox Chase Cancer Ct Fehlpaarungen erkennende endonukleasen und deren verwendung zur erkennung von mutationen in ziel- polynukleotidsträngen
AU2766499A (en) 1998-02-19 1999-09-06 Trevigen, Inc. Mismatch cleavage enzymes from extreme thermophiles and uses thereof
EP1165838B1 (en) 1999-03-19 2006-10-11 Cornell Research Foundation, Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction endonuclease digestion-ligase detection reaction process
US20020128215A1 (en) 2000-02-02 2002-09-12 Hans-Ulrich Thomann Novel sequence variants of the human N-acetyltransferase -2 (NAT -2) gene and use thereof
EP1257671B1 (en) * 2000-02-22 2015-01-14 Fox Chase Cancer Center Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof
US6391557B1 (en) 2000-02-22 2002-05-21 Fox Chase Cancer Center Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof
WO2002044335A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid differences using combined endonuclease cleavage and ligation reactions
US20040185455A1 (en) 2000-12-26 2004-09-23 Masamitsu Shimada Method of detecting pathogenic microorganism
AU2002232177B2 (en) 2001-02-15 2006-11-09 Takara Bio Inc. Method of detecting nucleotide polymorphism
KR20040007620A (ko) 2001-06-12 2004-01-24 다카라 바이오 가부시키가이샤 핵산 증폭 또는 검출용 시약의 안정화 방법 및 보존 방법
US20030143605A1 (en) 2001-12-03 2003-07-31 Si Lok Methods for the selection and cloning of nucleic acid molecules free of unwanted nucleotide sequence alterations
JPWO2004022736A1 (ja) * 2002-08-30 2005-12-22 独立行政法人科学技術振興機構 遺伝子のターゲティング破壊法および超耐熱菌ゲノム、ならびにこれらを利用したゲノムチップ
CA2588865A1 (en) 2004-11-23 2006-06-01 Xiao Bing Wang Detection of nucleic acid variation by cleavage-amplification method
WO2007117832A2 (en) 2006-03-12 2007-10-18 Applera Corporation Methods of detecting target nucleic acids
JP2007295838A (ja) 2006-04-28 2007-11-15 Fujifilm Corp 核酸増幅を利用した核酸ミスマッチ検出方法
JP2007319096A (ja) 2006-06-01 2007-12-13 Institute Of Physical & Chemical Research エンドヌクレアーゼのニッキング活性を利用した核酸増幅法
JP4918409B2 (ja) 2006-07-26 2012-04-18 西川ゴム工業株式会社 核酸配列の増幅方法
WO2011102802A1 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Agency For Science, Technology And Research Method for reducing mismatches in double-stranded dna molecules
KR101312241B1 (ko) 2010-04-27 2013-09-27 사회복지법인 삼성생명공익재단 증폭억제시발체를 이용하는 유전자 돌연변이 검출 방법
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2809795B1 (en) 2012-02-01 2019-09-18 SGI-DNA, Inc. Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules
US20150353921A9 (en) 2012-04-16 2015-12-10 Jingdong Tian Method of on-chip nucleic acid molecule synthesis
JPWO2013175815A1 (ja) 2012-05-22 2016-01-12 国立研究開発法人理化学研究所 核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法
US10131890B2 (en) 2013-03-14 2018-11-20 Takara Bio Inc. Method for using heat-resistant mismatch endonuclease
US10975415B2 (en) 2014-09-11 2021-04-13 Takara Bio Inc. Methods of utilizing thermostable mismatch endonuclease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602011A (en) * 1995-01-18 1997-02-11 Pharmacia Biotech Inc. Purified Thermococcus barossii DNA polymerase
US20030165898A1 (en) * 2000-01-05 2003-09-04 Alison Todd Method for concurrent amplification and real time detection of polymorphic nucleic acid sequences

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATSUHIRO SHIMADA等: "MutS stimulates the endonuclease activity of MutL in an ATP-hydrolysis-dependent manner", 《FEBS J》 *
BIN REN等: "Structure and function of a novel endonuclease acting on branched DNA substrates", 《EMBO J》 *
FUKUI,T.等: "Endonuclease NucS，Q5JER9.1", 《NCBI GENBANK》 *
向生光 等: "增殖细胞核抗原PCNA在DNA修复中的作用", 《生命的化学》 *
王冬梅 等: "DNA化学合成中的错误去除", 《生命的化学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115210380A (zh) * 2020-03-19 2022-10-18 宝生物工程株式会社 耐热的错配核酸内切酶变体
CN115210380B (zh) * 2020-03-19 2024-10-15 宝生物工程株式会社 耐热的错配核酸内切酶变体
CN111748610A (zh) * 2020-06-24 2020-10-09 西北农林科技大学 T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用
WO2023240564A1 (zh) * 2022-06-16 2023-12-21 深圳华大智造科技股份有限公司 含甘氨酸-NaOH缓冲液的切除试剂及其在核酸测序中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP6550649B2 (ja) 2019-07-31
US10975415B2 (en) 2021-04-13
EP3192868A1 (en) 2017-07-19
US20170253909A1 (en) 2017-09-07
EP3192868A4 (en) 2018-03-14
JPWO2016039377A1 (ja) 2017-06-22
WO2016039377A1 (ja) 2016-03-17
KR20170053636A (ko) 2017-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6550649B2 (ja) 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法
US11692213B2 (en) Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using CRISPR/Cas system proteins
JP6216416B2 (ja) 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法
EP2825645B1 (en) Methods and compositions for discrimination between cytosine and modifications thereof, and for methylome analysis
JP4918409B2 (ja) 核酸配列の増幅方法
US9243233B2 (en) Restriction endonucleases and their uses
WO2016152812A1 (ja) 標的核酸の高感度検出方法
JP6074036B2 (ja) 拡大された基質範囲を有する新規のｄｎａポリメラーゼ
CN115210380B (zh) 耐热的错配核酸内切酶变体
JP2010088446A (ja) 新規ｄｎａ分解酵素

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170801