JP2007319096A - エンドヌクレアーゼのニッキング活性を利用した核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
【課題】増幅効率および配列特異性の高い核酸増幅を可能とするプライマーセットの提供。
【解決手段】標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、(i)鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られるプライマー伸長鎖において、該プライマー伸長鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ(ii)該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセット。
【選択図】なし
【解決手段】標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、(i)鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られるプライマー伸長鎖において、該プライマー伸長鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ(ii)該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセット。
【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の増幅法、ならびにこれらの方法を利用した変異検出法に関するものである。
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の増幅法、ならびにこれらの方法を利用した変異検出法に関するものである。
背景技術
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
近年、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平7−114718号公報に記載の鎖置換型増幅(SDA;strand displacement amplification)法、自立複製(3SR;self-sustained sequence replication)法、日本国特許第2650159号公報に記載の核酸配列増幅(NASBA;nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(transcription-mediated amplification)法、日本国特許第2710159号公報に記載のQベータレプリカーゼ法、米国特許第5824517号明細書、国際公開第99/09211号パンフレットまたは国際公開第95/25180号パンフレットに記載の種々の改良SDA法、国際公開第00/28082号パンフレットに記載のLAMP法(Loop-Mediated Isothermal Amplification)、国際公開第02/16639号パンフレットに記載のICAN法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、国際公開第2004/040019号パンフレットに記載の方法、国際公開第2005/063977号パンフレットに記載のSMAP法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。
特公平7−114718号公報(特許文献1)に記載のSDA法では、最終的にDNAが増幅される系において、DNAポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置換により、試料中の目的核酸(およびその相補鎖)の増幅が可能となる。該方法では、4種類のプライマーが必要とされ、その内の2種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように設計する必要がある。また、該方法では、核酸合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば三リン酸部分のα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子(S)に置換されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が必要とされる。さらに該方法では、増幅された核酸断片中にαS置換デオキシヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅断片を制限酵素断片長多型(RFLP;restriction enzyme fragment length polymorphism)解析に供しようとする場合に、該増幅断片が制限酵素で切断できないことがあり、よって、そのような解析を実施できない場合がある。
米国特許第5824517号明細書(特許文献2)に記載の改良SDA法は、RNAとDNAから構成され、3’末端側がDNAであるキメラプライマーを必要とする。そのようなRNAとDNAから構成されるキメラプライマーはその合成が困難であり、また、RNAを含むプライマーはその取り扱いに専門的な知識を必要とする。また、国際公開第99/09211号パンフレット(特許文献3)に記載の改良SDA法は、5’突出末端を生じさせる制限酵素を必要とし、さらに、国際公開第95/25180号パンフレット(特許文献4)に記載の改良SDA法は、少なくとも2組のプライマー対を必要とするため、これらの方法は高いランニングコストを必要とする。
国際公開第00/28082号パンフレット(特許文献5)に記載のLAMP法では、4種類のプライマーが必要とされ、それらが6個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こり、次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応により第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。この時に、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の構成に起因して伸長鎖の5’末端部分でステムループ構造が形成される。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖、もしくは、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の3’末端側についても行なわれ、これらの反応が繰り返されることにより、標的核酸が増幅される。この方法では、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により3’末端においてステムループ構造を形成する増幅産物が得られ、その3’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
国際公開第2004/040019号パンフレット(特許文献6)に記載の方法では、プライマー伸長鎖の5’末端部分においてステムループ構造を形成しうるループ形成プライマーのペアが用いられる。このループ形成プライマーは、鋳型にアニーリングしてプライマー伸長反応を経た後、その伸長鎖の5’末端において自動的に同伸長鎖に折り返してループを形成し、これにより一本鎖の状態となった鋳型上の領域に同じプライマーがアニーリングすることを可能とする。この方法でも、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により3’末端においてステムループ構造を形成する増幅産物が得られ、その3’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
国際公開第2005/063977号パンフレット(特許文献7)に記載のSMAP法では、国際公開第2004/040019号パンフレットに記載のループ形成プライマーと、相互に相補的な配列を一本鎖上に連結した折り畳み配列を5’末端部分に含む折り畳みプライマーとからなるプライマーペアが用いられる。この方法では、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により3’末端においてステムループ構造または折り畳み構造を形成する増幅産物が得られ、その3’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
近年、遺伝子の挿入、欠失などの遺伝子情報を迅速に検出する診断技術は非常に重要視されており、例えば、癌細胞などに特異的に発現されるmRNAや遺伝子マーカーの迅速かつ特異的な検出などに利用可能な技術が重要視されている。よって、配列特異性が高く、増幅効率の高い核酸増幅法が依然として求められている。
本発明者らは、プライマー伸長鎖の5’末端部分が同一鎖上に折り返すことを可能とする折り返しプライマー中に、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼの認識配列を組み込み、該プライマーを用いた核酸増幅反応を前記エンドヌクレアーゼの存在下で行うことにより、該プライマーによって増幅産物中に新たに生じる認識部位の片方の鎖が前記エンドヌクレアーゼによって切断され、これにより新たな相補鎖合成の起点が生成し、増幅効率が顕著に向上することを見出した。さらに、本発明者らは、このようなプライマーおよびエンドヌクレアーゼを用いる核酸増幅法が高い配列特異性を有し、例えば、標的核酸配列中の一塩基変異の検出を可能とすることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
従って、本発明の目的は、増幅効率および配列特異性の高い核酸増幅を可能とするプライマーセットおよび核酸増幅法を提供することにある。
そして、本発明によるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、(i)鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ(ii)該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセットである。
さらに、本発明による核酸増幅法は、試料中の標的核酸を増幅する方法であって、(a)標的核酸を含む試料を用意する工程、(b)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、(c)本発明によるプライマーセットを用意する工程、および(d)前記試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程を含んでなるものである。
本発明によれば、鋳型に含まれる標的核酸配列を迅速かつ正確に増幅することが可能となる。本発明による核酸増幅法は、等温下で行うこともできる。これらのことから、本発明によれば、核酸試料における標的核酸の検出、遺伝子中の変異、特に一塩基変異の検出などを、迅速、簡便かつ正確に行うことが可能となる。
本発明によるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるものである。該プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーは、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするもの(以下「折り返しプライマー」という)である。ここで、「核酸鎖」とは、DNA鎖、RNA鎖およびDNA/RNA鎖のいずれをも意味し、好ましくはDNA鎖を意味する。本発明によるプライマーセットは複数種の折り返しプライマーを含んでいてもよいが、その場合には、少なくとも一種の折り返しプライマーは、該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものとされる。こうして提供されるエンドヌクレアーゼ認識部位は、鋳型となる二本鎖核酸中に存在していなかった新たな認識部位であることが好ましい。前記エンドヌクレアーゼはニッキング活性を示すことのできるものとされる。
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸をも意味する。
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Tm(℃)およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research社製)などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
本発明において「ニッキング活性」とは、二本鎖核酸のいずれか一方の鎖のみを切断する酵素活性をいう。
本発明に用いられるエンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸部分においてニッキング活性を示すことのできるものである。このような活性を示す多くのエンドヌクレアーゼがその認識配列とともに知られており、当業者であれば、これらのエンドヌクレアーゼの中から適宜選択して使用することができる。このようなエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ニッキング酵素、制限酵素、ホーミング酵素、RNアーゼ、リボザイム、配列特異的にギャップを形成できるヌクレアーゼ等が挙げられ、好ましくはニッキング酵素、制限酵素、およびホーミング酵素とされる。
制限酵素は、通常、二本鎖核酸の両方の鎖を切断するが、特定の組成を有する反応溶液を核酸増幅反応に用いることにより、ニッキング活性を示すことができる(例えば、Barany et al., Gene 65(2), 149, 1988を参照のこと)。また、制限酵素によって切断されない修飾塩基を二本鎖核酸の一方の鎖に導入することにより、他方の鎖のみを切断するニッキング活性を示すことができる(特公平7−114718号公報を参照のこと)。
ホーミング酵素は、一般的に、制限酵素やニッキング酵素よりも長い配列を認識してDNAを切断する。多くのホーミング酵素は二本鎖核酸の両方の鎖を切断するが、片方の鎖のみを切断する例も報告されている(Goodrch-Blair H. and Shub D.A., Cell 84(2), 211, 1996)。また、二本鎖核酸の両方の鎖を切断するホーミング酵素のアミノ酸配列を置換することにより、片方の鎖のみの切断が優位となるように該酵素を改変する方法も報告されている(Silva G.H. and Belfort M., Nucleic Acids Research 32(10), 3156, 2004)。さらに、特定の組成からなる反応液中では、ホーミング酵素がニッキング活性を示すことも報告されている(Belfort M. and Roberts R.J., Nucleic Acids Research 25(17), 3379,1997)。
本発明の特に好ましい実施態様によれば、エンドヌクレアーゼとしてニッキング酵素が用いられる。ニッキング酵素は、特定の配列を有する二本鎖DNAの片方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼである。このニッキング酵素により、二本鎖DNAの一方の鎖のホスホジエステル結合が開裂して、開裂部位の5’側にリン酸基が生じ、3'側にヒドロキシル基が生じる。天然のニッキング酵素としては、N.BstNBIが報告されている(Morgan R.D. et al., Biol. Chem. 381(11), 1123, 2000)。また、制限酵素のアミノ酸配列を改変してニッキング酵素を作製する方法として、ホモダイマーとして機能する制限酵素のダイマー化ドメインを改変してダイマーの形成を妨げる方法(Xu Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(23), 12990, 2001)、ヘテロダイマーとして機能する制限酵素の一方のサブニユットの切断活性を破壊する方法(Heiter D.F. et al., J. Mol. Biol. 348(3), 631, 2005)などがある。ニッキング酵素の例としては、N.MlyI(5'-/NNNNNGAGTC-3';Caroline E. et al., EMBO Rep. 2(9), 782, 2001)、Nt.CviPII(5'-/CCR-3';Chan S.H. et al., Nucleic Acids Res. 32(21), 6187, 2004)、N.AlwI(5'-GGATCNNN/NN-3';New England Biolabs社)、N.BstNBI(5'-GAGTCNNNN/N-3';New England Biolabs社)、N.BbvCIA(5'-GC/TGAGG-3';New England Biolabs社)、N.BbvCIB(5'-CC/TCAGC-3';New England Biolabs社)、Nb.BsmI(5'-NG/CATTC-3';New England Biolabs社)、Nb.Bpu10I(5'-GC/TNAGG-3';Fermentas社)などが挙げられる。ここで、括弧内の配列はそれぞれの酵素の認識配列を示し、「/」は切断部位を示す。また、この配列中の「N」はA、T、CおよびGのいずれかのヌクレオチドを表し、「R」はAまたはGを表す。
本発明によるプライマーセットに含まれる折り返しプライマーは、当業者であれば適宜設計することができる。折り返しプライマーは、典型的には、鋳型にハイブリダイズする配列をその3’末端部分に含んでなり、該プライマーの伸長鎖上のいずれかの領域にハイブリダイズする配列を5’側に含んでなるものとすることができる。このような折り返しプライマーは、例えば、国際公開第00/28082号パンフレット、国際公開第2004/040019号パンフレット、国際公開第2005/063977号パンフレット等の記載に従って、適切に設計することができる。
折り返しプライマーは、当業者に公知の手段によって、該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるように設計することができる。典型的には、折り返しプライマーの配列中に、エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖配列のうちの少なくとも一方の鎖を組み込むことにより、上述のような折り返しプライマーを設計することができる。プライマー中に導入される配列は、二本鎖の認識配列のうちのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよい。その際、折り返しプライマー中の鋳型に由来する配列に、二本鎖認識配列の片方の鎖の全てが含まれることは避けることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものとされる。このプライマーは前記折り返しプライマーの一例であり、以下「ループ形成プライマー」という。
ループ形成プライマーによる核酸合成の作用機序を図1に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)、および配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)を決定する。ループ形成プライマーは、配列(Ac')を含んでなり、さらにその5’側に配列(B')を含んでなる。配列(Ac')は、配列(A)にハイブリダイズするものであり、配列(B')は、配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズするものである。ここで、ループ形成プライマーは、前記配列(Ac')と前記配列(B')の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列(Ac')が標的核酸配列の配列(A)にハイブリダイズした状態となる(図1(a))。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の5’末端側に存在する配列(B')が、同核酸中に存在する配列(Bc)にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の5’末端部分においてステムループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列(A)が一本鎖となり、この部分に先のループ形成プライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする(図1(b))。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズしたループ形成プライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される(図1(c))。
上記の作用機序において、配列(B')が配列(Bc)にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記ループ形成プライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステムループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分(鋳型核酸上の配列(A))に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
本発明のさらに好ましい実施態様におけるループ形成プライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の5’末端におけるステムループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列(A)の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列(Ac')の塩基数Xと標的核酸配列中における前記配列(A)と前記配列(B)に挟まれた領域の塩基数Yとの差(X−Y)の、Xに対する割合(X−Y)/Xが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列(A)よりも5’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステムループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステムループ構造形成、すなわち、効率の良い配列(B')と配列(Bc)とのハイブリダイゼーションには、前記配列(B')と前記配列(Bc)との間の距離(X+Y)が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも72℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列(B')が配列(Bc)に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列(B')が配列(Bc)にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列(A)の部分を一本鎖とするためには、配列(B')と配列(Bc)との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
以上のような観点から、本発明のさらに好ましい実施態様による前記ループ形成プライマーは、プライマーを構成する配列(Ac')と配列(B')の間に介在配列が存在しない場合において、(X−Y)/Xが−1.00以上、好ましくは0.00以上、さらに好ましくは0.05以上、さらに好ましくは0.10以上となり、また、1.00以下、好ましくは0.75以下、さらに好ましくは0.50以下、さらに好ましくは0.25以下となるように設計される。さらに、(X+Y)は、好ましくは15以上、さらに好ましくは20以上、さらに好ましくは30以上とされ、また、好ましくは50以下、さらに好ましくは48以下、さらに好ましくは42以下とされる。
また、プライマーを構成する配列(Ac')と配列(B')の間に介在配列(塩基数はY’)が存在する場合には、本発明のさらに好ましい実施態様による前記ループ形成プライマーは、{X−(Y−Y’)}/Xが−1.00以上、好ましくは0.00以上、さらに好ましくは0.05以上、さらに好ましくは0.10以上となり、また、1.00以下、好ましくは0.75以下、さらに好ましくは0.50以下、さらに好ましくは0.25以下となるように設計される。さらに、(X+Y+Y’)は、好ましくは15以上、さらに好ましくは20以上、さらに好ましくは30以上とされ、また、好ましくは100以下、さらに好ましくは75以下、さらに好ましくは50以下とされる。
前記ループ形成プライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは15〜100ヌクレオチド、より好ましくは20〜60ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列(Ac')と配列(B')の長さは、それぞれ、好ましくは5〜50ヌクレオチド、より好ましくは7〜30ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列(Ac')と配列(B')の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
本発明の一つの実施態様によれば、ループ形成プライマーは、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものとされ、例えば、このループ形成プライマー中にエンドヌクレアーゼの認識配列またはその一部が組み込まれる。プライマー中に導入される配列は、二本鎖の認識配列のうちのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよい。この実施態様では、このループ形成プライマーは、配列(Ac')と配列(B')との間に、前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの少なくとも一本鎖の配列(塩基数はY')を含んでなるものとすることが好ましい。その場合には、前記ループ形成プライマーは、{X−(Y−Y')}/Xが−1.00以上、好ましくは0.00以上、さらに好ましくは0.05以上、さらに好ましくは0.10以上となり、また、1.00以下、好ましくは0.75以下、さらに好ましくは0.50以下、さらに好ましくは0.25以下となるように設計することが好ましい。さらに、(X+Y+Y')は、好ましくは15以上、さらに好ましくは20以上、さらに好ましくは30以上とされ、また、好ましくは100以下、さらに好ましくは75以下、さらに好ましくは50以下とされる。また、この実施態様によるループ形成プライマーの鎖長は、好ましくは15〜100ヌクレオチド、より好ましくは30〜60ヌクレオチドとする。さらに、この実施態様によるループ形成プライマーを構成する配列(Ac')と配列(B')の長さは、それぞれ、好ましくは5〜50ヌクレオチド、より好ましくは10〜30ヌクレオチドである。あるいは、このループ形成プライマーは、配列(Ac')の3’末端部分に前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの一本鎖の部分配列を含んでなるか、または配列(Ac')の5’末端部分と前記介在配列の3’末端部分とからなる部分もしくは前記介在配列の5’末端部分と配列(B')の3’末端部分とからなる部分に前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの一本鎖の全配列を含んでなるものとしてもよい。
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものとされる。このプライマーは前記折り返しプライマーの一例であり、以下「折り畳みプライマー」という。
このような折り畳みプライマーの構造は、例えば、図2に示すようなものであるが、図2に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。折り畳みプライマーを構成する配列(Ac')の長さは、好ましくは5〜50ヌクレオチド、より好ましくは10〜30ヌクレオチドである。また、前記折返し配列(B-Bc')の長さは、好ましくは2〜1000ヌクレオチド、より好ましくは2〜100ヌクレオチド、さらに好ましくは4〜60ヌクレオチド、さらに好ましくは6〜40ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは2〜500bp、より好ましくは2〜50bp、さらに好ましくは2〜30bp、さらに好ましくは3〜20bpである。折返し配列(B-Bc')のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列(Ac')と折返し配列(B-Bc')の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
折り畳みプライマーは、ループ形成プライマーについて説明した作用機序と同様に作用することが可能である。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。折り畳みプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。このように解離した末端部分において、新たな折り畳みプライマーが鋳型にアニーリングし、そこから鎖置換を伴う相補鎖合成が進行する。
本発明の一つの実施態様によれば、折り畳みプライマーは、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものとされ、例えば、この折り畳みプライマー中にエンドヌクレアーゼの認識配列またはその一部が組み込まれる。プライマー中に導入される配列は、二本鎖の認識配列のうちのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよい。この実施態様では、折り畳みプライマーは、配列(Ac')以外の部分に、前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの少なくとも一本鎖の配列を含んでなるものとすることが好ましい。このような一本鎖の認識配列は、例えば、配列(Ac')と配列(B-Bc')との間、配列(B-Bc')の内部、配列(B)と配列(Bc')との間、配列(Ac')の5’末端部分と配列(B-Bc')の3’末端部分とからなる部分、配列(Ac')の5’末端部分と前記介在配列の3’末端部分とからなる部分、前記介在配列の5’末端部分と配列(B-Bc')の3’末端部分とからなる部分などに導入することができる。あるいは、この折り畳みプライマーは、配列(Ac')の3’末端部分または配列(B-Bc')の5’末端部分に、前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの一本鎖の部分配列を含んでなるものとしてもよい。この実施態様では、折り畳みプライマーを構成する配列(Ac')の長さは、好ましくは5〜50ヌクレオチド、より好ましくは10〜30ヌクレオチドである。また、前記折返し配列(B-Bc')の長さは、好ましくは2〜1000ヌクレオチド、より好ましくは2〜100ヌクレオチド、さらに好ましくは4〜60ヌクレオチド、さらに好ましくは6〜40ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは2〜500bp、より好ましくは2〜50bp、さらに好ましくは2〜30bp、さらに好ましくは3〜20bpである。折返し配列(B-Bc')のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列(Ac')と折返し配列(B-Bc')の間に、反応に影響を与えない前記認識配列以外の介在配列を挿入してもよい。
本発明の一つの具体的な実施態様によれば、折り畳みプライマーは、折返し配列(B-Bc')中にエンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むように設計される。この場合、増幅産物が十分に長く伸長されるまでエンドヌクレアーゼのニッキング活性が機能しないように、折り畳みプライマーを設計することができる。例えば、前記センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを折り畳みプライマーの5’末端部分に配置し、その末端の塩基を欠失させることができる。さらに、折返し配列(B-Bc')の3’末端部分に配置された他方の鎖の配列中に、本来の認識配列とは異なるミスマッチ塩基を導入することができる。このような折り畳みプライマーを用いて核酸増幅反応を行った場合の作用機序を、図3を用いて説明する。図3に記載されている10塩基以上のヌクレオチド配列(二本鎖核酸の配列については、いずれか一方の鎖)は、配列表中の配列番号10〜13にも示されている。
図3には、エンドヌクレアーゼの認識配列およびこれを組み込んだ折り畳みプライマーの配列が示されている。ここでは、エンドヌクレアーゼとしてNb.BsmIが用いられている。図3に示される認識配列は、矢印の位置でNb.BsmIにより切断される。また、プライマー配列中の下線部は前記認識配列に由来する配列を示し、囲み線を付した部分は鋳型にハイブリダイズする配列を示す。まず、この折り畳みプライマーが鋳型にアニールしてプライマー伸長鎖が形成され(図3a、上側の配列)、その後、一本鎖となった該伸長鎖に他方のプライマーがアニールして相補鎖が合成される(図3a、下側の配列)。こうして得られる二本鎖核酸の一方の末端部分には、前記折り畳みプライマーの配列が二本鎖の状態で存在するが、この段階でNb.BsmIが機能することはない。すなわち、この二本鎖の折り畳みプライマー配列は、その末端部分と折返し配列(B-Bc')の3’末端に対応する部分とにNb.BsmI認識配列に由来する配列を含んでいるが(図3a、下線部)、これらの配列は、上述の末端塩基の欠失またはミスマッチ塩基の存在により完全な認識配列を形成しておらず、よって、Nb.BsmIは作用しない。次に、得られた二本鎖核酸の末端に存在する折返し配列(B-Bc')の相補鎖が折り返して図2に示す構造を形成する。折り返した該相補鎖の末端は3’末端であるため、その後、これが起点となって相補鎖合成が進行する(図3b)。この相補鎖合成により、欠失していた認識配列の塩基が補完されるために認識配列の一方の鎖は完全なものとなるが(図3c、下側の下線部)、これにハイブリダイズしている他方の鎖に依然としてミスマッチ塩基が含まれるため(図3c、上側の下線部)、ここでもNb.BsmIは作用しない。次いで、図3cに示される二本鎖の状態の一本鎖核酸を鋳型とする相補鎖合成がなされる(図3d)。これにより得られる二本鎖の状態の核酸は、図3eに示すとおり、上述のように補完された完全な認識配列を二本鎖の状態で含んでいるため(囲み線)、矢印の位置でNb.BsmIにより切断される。このように、折り畳みプライマーは、増幅産物が十分に長く伸長されるまでエンドヌクレアーゼのニッキング活性が機能しないように設計することができる。
これらのループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーは、任意の組み合わせで用いることができる。すなわち、2種類のループ形成プライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよいし、2種類の折り畳みプライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよいし、あるいは、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよい。
本発明の一つの実施態様によれば、本発明によるプライマーセットは、2種類のループ形成プライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(C)よりも5’側に存在する配列(D)の相補配列(Dc)にハイブリダイズする配列(D')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものとされる。
本発明の他の実施態様によれば、本発明によるプライマーセットは、2種類の折り畳みプライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものとされる。
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットは、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとの組み合わせをプライマーペアとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものとされる。
これらループ形成プライマー(第一のプライマー)および折り畳みプライマー(第二のプライマー)による核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図4(図4aおよび図4b)を用いて説明する。ここでは、エンドヌクレアーゼを用いない核酸増幅反応について説明する。なお、図4では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする2つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる(図4(a))。次いで、伸長鎖(−)上においてステムループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列(A)に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし(図4(b))、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖(−)が脱離する。次に、脱離した伸長鎖(−)上の配列(C)に第二のプライマーがハイブリダイズし(図4(c))、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖(+)が合成される(図4(d))。生成した伸長鎖(+)の3’末端と伸長鎖(−)の5’末端ではステムループ構造が形成され(図4(e))、遊離型の3’末端である伸長鎖(+)のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖(−)が脱離する(図4(f))。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖(+)の3’側に配列(A)および配列(Bc)を介して伸長鎖(−)が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列(A)および配列(Bc)に第一のプライマーがハイブリダイズし(図4(g))、その伸長反応により伸長鎖(−)が生成する(図4(h)および(i))。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の3’末端に存在する折返し配列によって遊離型の3’末端が提供され(図4(h))、そこからの伸長反応により(図4(i))、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖(+)と伸長鎖(−)とを交互に含む一本鎖核酸が生成する(図4(j))。この一本鎖核酸では、その3’末端に存在する折返し配列により遊離型の3’末端(相補鎖合成起点)が提供されるため(図4(k))、同様の伸長反応が繰り返され、1回の伸長反応あたり2倍の鎖長となる(図4(l)および(m))。また、図4(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖(−)では、その3’末端に存在する折返し配列により遊離型の3’末端(相補鎖合成起点)が提供されるため(図4(n))、そこからの伸長反応により、両端にステムループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖(+)と伸長鎖(−)とを交互に含む一本鎖核酸が生成する(図4(o))。この一本鎖核酸においても、3’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖(+)と伸長鎖(−)との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
本発明によるプライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマー以外に、1種以上の第三のプライマーを含むものとすることができる。第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであればよいが、好ましくは、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
折り返しプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、図4に例示されるように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の3’末端には折り返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
第三のプライマーは必ずしも1種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには2種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には折り返しプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは2〜100ヌクレオチド、より好ましくは5〜50ヌクレオチド、さらに好ましくは7〜30ヌクレオチドとされる。
第三のプライマーは、折り返しプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、折り返しプライマーの各3’末端のTmよりも低いTmを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、折り返しプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
第三のプライマーとしては、国際公開第02/24902号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
本発明によるプライマーセットは、さらに、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも3’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものとしてもよい。
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシリボヌクレオチドおよび/またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」(単に「N」ということもある)とは、リボヌクレオシド三リン酸をいい、例えば、ATP,UTP,CTP,GTP等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド(α−チオ−リボヌクレオチド)等がある。
また、前記プライマーには、未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾デオキシリボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾デオキシリボヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ABI社(Applied Biosystem Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
本発明による核酸増幅法では、標的核酸を含む試料を鋳型として、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応が行なわれる。この核酸増幅反応は、ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において行われる。このような反応条件は、当業者であれば適宜決定することができる。
核酸増幅反応において鋳型となる、試料中の標的核酸配列を含む核酸分子(鋳型核酸)は、DNAまたはRNAのどちらでもよい。DNAには、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAのいずれもが含まれる。RNAには、全RNA、mRNA、rRNA、siRNA、hnRNAおよび合成RNAのいずれもが含まれる。核酸増幅反応に用いられる試料は、例えば、血液、組織、細胞、動物および植物などの生体に由来する試料、ならびに生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料などであってよいが、これらの試料を精製して得られる精製試料であってもよく、さらには、これらの試料から単離された鋳型核酸とすることもできる。
鋳型核酸の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
より具体的には、前記鋳型核酸としては、上記方法により単離したゲノムDNAやPCRフラグメントのような二本鎖核酸、全RNAもしくはmRNAから逆転写反応で調製されたcDNAのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程(denaturing)を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、RNAを鋳型としたcDNA合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素(AMV RTase)、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素(RAV−2 RTase)、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素(MMLV RTase)等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ(TthDNAポリメラーゼ等)、バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼとして、B.st由来DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ)、およびB.ca由来DNAポリメラーゼ(Bca DNAポリメラーゼ)、例えばBcaBEST DNAポリメラーゼ、Bca(exo−)DNAポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Bca DNAポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型RNAの二次構造形成を抑制しながらcDNAを合成することが可能である。
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約95℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、pHを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにpHを低下させる必要がある。
核酸増幅反応に用いられるエンドヌクレアーゼは、折り返しプライマー中に組み込まれた認識配列に対応するものとされる。反応溶液中におけるエンドヌクレアーゼの濃度は、酵素の種類に応じて当業者により適宜決定されるが、好ましくは0.0001単位/μl〜100単位/μl、さらに好ましくは0.001単位/μl〜10単位/μl、さらに好ましくは0.01単位/μl〜1単位/μlとされる。
本発明によるプライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされる場合には、核酸増幅反応は等温下で行なうことが好ましい。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度(Tm)付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度(Tm)を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約20℃〜約75℃であり、さらに好ましくは、約35℃〜約65℃とする。
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換(strand displacement)活性(鎖置換能)を有するものであることが好ましく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、DNAポリメラーゼが挙げられる。さらに、このDNAポリメラーゼは、実質的に5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなDNAポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus、以下「B.st」という)、バチルス・カルドテナックス(Bacillus caldotenax、以下「B.ca」という)等の好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌(E.coli)由来DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するDNAポリメラーゼとしては、さらに、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ29ファージDNAポリメラーゼ、MS−2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminator DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、dNTPミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン(N,N,N-trimethylglycine)等の添加物、国際公開第99/54455号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度(Tm)は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、2本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するGCの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド(DMSO)、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド(DMSO)とされる。
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
さらに、核酸増幅反応において、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼなどの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの2種以上の混合物とされる。
核酸増幅反応によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出することができる。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている(イムノクロマトグラフィー法)。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬(例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等)を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
本発明による核酸増幅法は、高い配列特異性を有し、なおかつ顕著に高い増幅効率を有するものである。このような増幅効率が実現される理由は、特定の理論に拘束されるものではないが、次のように考えられる。まず、折り返しプライマーが鋳型にアニーリングしてプライマー伸長反応が生じると、5’末端部分が同一鎖上に折り返すことのできる鋳型の相補鎖が合成される。次に、このような相補鎖に対して何らかのプライマーがアニーリングし、さらにその相補鎖が合成されると、3’末端部分が同一鎖上に折り返すことのできる鎖が得られる。こうして得られた鎖においては、折り返した3’末端が相補鎖合成の起点となって、次々に相補鎖合成が進行し、図4に例示したような長鎖の増幅産物が形成される。この増幅産物は、多くの標的核酸配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とが交互に並んだ二本鎖の構造を有し、そのセンス鎖とアンチセンス鎖との間には、折り返しプライマーの配列が二本鎖の状態で存在する。よって、この折り返しプライマーの配列中にエンドヌクレアーゼの認識配列が存在し、そのエンドヌクレアーゼのニッキング活性によって片方の鎖が切断されれば、その切断部位が起点となって3’方向に相補鎖合成が進行する。さらに、このような切断部位が増幅産物の内部に数多く存在することが利点であると考えられる。
本発明による高い配列特異性および高い増幅効率を有する核酸増幅法は、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するのに適している。よって、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、(a)核酸試料を用意する工程、(b)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、(c)本発明によるプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および(d)前記核酸試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。ここで、「変異」という用語は、1以上のヌクレオチドの置換、欠失および挿入のいずれをも包含する。
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびチミン(T)(RNAの場合はウラシル(U))から選択される一組の塩基対が正常な塩基対(AとTの組み合わせ、またはGとCの組み合わせ)ではないことを意味する。ミスマッチには、1つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、1または複数の塩基の挿入および/または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
上記の1以上のミスマッチは、1塩基のミスマッチ、連続した複数のミスマッチ、または非連続的な複数のミスマッチとすることができる。
変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記のプライマーは、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら2つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記プライマーを設計すればよい。その際、前記プライマーは、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。
ループ形成プライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(A)と前記配列(Ac')との間で1以上のミスマッチを生じるように設計することができる。あるいは、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(Bc)と前記配列(B')との間で1以上のミスマッチを生じるように設計することもできる。
折り畳みプライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(C)と前記配列(Cc')との間で1以上のミスマッチを生じるように設計することができる。
第三のプライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計することができる。
本発明の一つの実施態様によれば、本発明による変異検出法における核酸増幅反応は、ミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確に変異を検出することが可能となる。
DNAの二本鎖において部分的に対合できない(ミスマッチ)塩基対が生じたときに、細菌や酵母等には、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」(「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される)と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、MutSタンパク質(特表平9−504699号公報)、MutMタンパク質(特開2000−300265号公報)、GFP(Green Fluorescence Protein)に結合したMutSタンパク質(国際公開第99/06591号パンフレット)などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている(M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-50, 1997)。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。
本発明による変異検出法においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性(正確さ)を向上させることができる。本発明による変異検出法では、核酸試料に含まれる被検核酸が、変異部位において標的核酸配列と異なるヌクレオチドを有する場合には、プライマーに含まれる配列の被検核酸へのハイブリダイゼーションが妨げられるため、増幅産物が得られないか、または増幅産物の量が減少することとなる。しかしながら、これらのハイブリダイゼーションが完全には妨げられない場合もあり、その場合には、これらの配列において少量のヘテロ二本鎖構造が生ずる。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、1または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質(変異体)であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 W.P. DengとJ.A. Nickoloffの方法(Anal. Biochem., 200, 81, 1992)、K.L. MakamayeとF. Ecksteinの方法(Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698, 1986)などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 XL1-Red 株(Stratagene社)を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法(J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1991)などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、MutM、MutSおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている(Radman,M.et al.,Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989); Lahue,R.S. et al.,Science 245:160-164(1988);Jiricny,J.et al,.Nucl.Acids Res.16:7843-7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263;6829-6835(1988);Lahue,R.S.et al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.et al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987); Jones,M.et al.,Gentics 115:605-610(1987); Salmonella typhimuriumのMuts(Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);HaberL.T. et al.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985));およびPriebe S.D.et al.,J.Bacterilo.170:190-196(1988))。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはMutS、MutH、MutL、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはMutS、MutH、またはMutLとされる。
ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質(SSB)は、当技術分野において公知の任意のSSBとすることができる。好ましいSSBとしては、エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびT4バクテリオファージ由来の遺伝子32タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、MutS、MutH、MutL、HexA、MSH1〜6、Rep3、RNaseA、ウラシル−DNAグリコシダーゼ、T4エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはMutS、MSH2もしくはMSH6、またはこれらの2種以上の混合物とされ、より好ましくはMutSとされる。
ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ATP(アデノシン5'−三リン酸)、ADP(アデノシン5'−二リン酸)、ATP−γ−S(アデノシン5'−O−(3−チオ三リン酸))、AMP−PNP(アデノシン5'−[β,γ−イミド]三リン酸)などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
上記核酸増幅反応の他の条件は、本発明による核酸増幅法と同様に設定することができる。例えば、上記核酸増幅反応では、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される。また、必要に応じて、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤などを用いてもよい。
本発明による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。
本発明による核酸増幅法または変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、(a)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および(b)本発明によるプライマーセットを含んでなるキットが提供される。さらに、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、(a)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および(b)本発明によるプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものであるプライマーセット、を含んでなるキットが提供される。本発明によるキットはさらに、鎖置換能を有するポリメラーゼ、dNTP、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
以上に説明してきたように、本発明による核酸増幅法の主要な特徴の一つは、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応において、エンドヌクレアーゼの認識部位を含み、かつ、両端にループ構造または折り返し構造を有する一本鎖核酸が形成される点にある。このような一本鎖核酸にエンドヌクレアーゼと鎖置換能を有するポリメラーゼとを作用させると、一本鎖核酸の3’末端側のループ部分を合成起点とする相補鎖合成が生じて、一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が次々に伸長される。これと同時に、前記エンドヌクレアーゼのニッキング活性によって二本鎖のうちの一方だけが切断された部分を合成起点とする相補鎖合成が生じて、標的核酸の増幅が顕著に促進される。上述の核酸増幅法の説明では、一本鎖核酸上のエンドヌクレアーゼ認識部位の位置はプライマーに由来する配列の近辺に限定されているが、該認識部位が一本鎖核酸上のいずれの位置にあっても同様の反応が生じることは、当業者には明らかであろう。
従って、本発明の他の態様によれば、一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を増幅する方法が提供され、該方法は、(a)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、(b)前記エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖配列の少なくとも一方の鎖の配列を含んでなる一本鎖の鋳型核酸であって、その3’末端と5’末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによりループ構造または折り返し構造を形成しうる、鋳型核酸を用意する工程、(c)核酸増幅反応に用いられる、鎖置換能を有するポリメラーゼを用意する工程、および(d)前記エンドヌクレアーゼ、前記鋳型核酸および前記ポリメラーゼを含んでなる核酸増幅反応溶液を調製し、この溶液を、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下においてインキュベートする工程を含んでなる。エンドヌクレアーゼについては、既に説明したとおりである。また、核酸増幅反応溶液は、融解温度調整剤など、上述したような様々な試薬を含んでいてもよい。さらに、前記溶液のインキュベートは、等温下で行われることが好ましい。
さらに、本発明による核酸増幅法または変異検出法を用いることにより、試料中の標的核酸を特異的に検出することが可能となるが、これは、専用の装置を用いて行うことができる。従って、本発明の他の態様によれば、試料中の標的核酸を検出するための装置が提供され、該装置は、(a)本発明による核酸増幅法または変異検出法を行うための反応室と、(b)前記反応室の内部の温度を調節するための温度調節手段と、(c)前記反応室中の反応混合物からの、増幅産物の生成を示すシグナルを検出するためのシグナル検出手段とを少なくとも備えてなるものである。さらに、この装置は、前記シグナルが検出された場合に試料中の標的核酸が検出されたことを表示するための表示手段をさらに含んでいてもよい。
前記シグナルとしては、蛍光、電気化学的発光、色素など、核酸増幅反応における増幅産物の検出に利用可能な公知のシグナルを用いることができ、選択されたシグナルに応じてその検出手段を選択することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記シグナル検出手段は、前記反応混合物からの発光量を測定するための発光量測定手段を含んでなるものとされる。この実施態様では、前記反応混合物は、増幅産物の生成により発光する物質を予め含んでいるものとされ、このような物質としては、インターカレーターなどの公知の物質を用いることができる。発光量測定手段は、発光強度を測定しうる手段であればよく、例えば、当技術分野において周知の様々な発光量測定装置(例えば、フォトンカウンター)を挙げることができる。
前記反応室は、その内部に反応混合物を保持することのできるものであればよく、その形状等は特に制限されないが、好ましくはその外部からのシグナル検出、例えば発光量の測定を可能とする透明部分または開口部を有するものとされる。このような透明部分または開口部により、反応混合物からのシグナルの検出が容易となる。
前記反応混合物は、薄型のチップ上に担持された状態で前記反応室中に投入することができる。この場合、反応混合物を調製した後にこれをチップ上に配置してもよいし、あるいは、ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および本発明によるプライマーセットなどの反応に必要な試薬群を予めチップ上に固定化しておき、そこに液体の試料を滴下してもよい。あるいは、前記反応混合物は、反応溶液として前記反応室中に投入してもよく、この場合、前記反応室は、その内部に液体を保持することができる容器とすることができる。このような容器としては、反応溶液に溶解しない素材からなるものであれば、いかなる容器を用いてもよい。
前記温度調節手段は、反応室内部の温度を予め設定された温度に保つことのできる装置を含むことができる。このような装置は当技術分野において周知であり、当業者であれば適宜選択して使用することができる。
前記表示手段は、検出結果を表示できるものであればいかなる手段であってもよく、例えば、文字情報を表示するためのパネル等であってよい。この表示手段により表示される情報は、標的核酸が検出されたことだけでなく、該標的核酸の遺伝子配列、該標的核酸に関連する他の情報も含むことができる。例えば、標的核酸が疾患に関連する配列を有するものである場合には、その疾患に関する情報を表示することができる。また、標的核酸がその個体における治療薬の有効性に関連する場合には、その個体にとって最適な治療薬の情報を表示することができる。
さらに、本発明による装置は、標的核酸およびシグナル検出の情報を携帯用端末、コンピュータ等の通信機器に入力するためのインターフェイスを含んでいてもよい。これにより、標的核酸およびシグナル検出の情報を、医療機関の検査センター、中央検査部、薬剤部などに送信することが可能となる。
本発明の好ましい実施態様による装置およびチップを図5に示す。図5に示される核酸検出装置1は反応室2を備えており、そこに反応混合物4を担持したチップ3が挿入される。反応室2の周囲には温度調節手段5が備えられており、これにより反応室の内部温度が調節され、反応混合物4による核酸増幅反応が進行する。この核酸増幅反応により増幅産物が得られた場合には、反応混合物4から増幅産物の生成を示すシグナルが発生し、このシグナルはシグナル検出器6により検出される。そして、シグナル検出の信号がシグナル検出器6から表示部7に送られ、表示部7において標的核酸に関する情報が表示される。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
例1:プライマーの設計および合成
本例では、ヒトCYP2D6遺伝子(CYP2D6*1)の特定の領域を増幅するためのプライマーを設計し、合成した。また、その領域において一塩基変異を有する同遺伝子のアレル(CYP2D6*44)についても、同様のプライマーを設計し、合成した。CYP2D6*1中の増幅領域周辺の配列(配列番号1)と各プライマーとの位置関係は、図6に示すとおりである。また、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーについては、ニッキング酵素であるNb.BsmIの認識配列:NG/CATTC(「/」が切断部位。「N」はA、T、CおよびGのいずれか一つを意味する。)を組み込んだものも用意した。具体的には、以下の配列を有するプライマーを設計した。
本例では、ヒトCYP2D6遺伝子(CYP2D6*1)の特定の領域を増幅するためのプライマーを設計し、合成した。また、その領域において一塩基変異を有する同遺伝子のアレル(CYP2D6*44)についても、同様のプライマーを設計し、合成した。CYP2D6*1中の増幅領域周辺の配列(配列番号1)と各プライマーとの位置関係は、図6に示すとおりである。また、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーについては、ニッキング酵素であるNb.BsmIの認識配列:NG/CATTC(「/」が切断部位。「N」はA、T、CおよびGのいずれか一つを意味する。)を組み込んだものも用意した。具体的には、以下の配列を有するプライマーを設計した。
(1)ループ形成プライマー
2D6*44-F1:5'-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'(配列番号2)
2D6*44-F1m:5'-GGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'(配列番号3)
2D6*44-F1m-BsmT01:5'-GGCTGCACATGAATGCGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'(配列番号4)
2D6*44-F1:5'-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'(配列番号2)
2D6*44-F1m:5'-GGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'(配列番号3)
2D6*44-F1m-BsmT01:5'-GGCTGCACATGAATGCGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'(配列番号4)
2D6*44-F1はCYP2D6*1に特異的なプライマーである。2D6*44-F1は、その3’末端側にある配列(20mer:下線部以外)が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、5’末端側にある配列(10mer:下線部)が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの3’末端塩基の16塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。2D6*44-F1mはCYP2D6*44に特異的なプライマーであり、CYP2D6*1に対する一塩基変異に対応する塩基をその5’末端部分に含んでいる(下線部)。2D6*44-F1m-BsmT01はCYP2D6*44に特異的で、かつ、Nb.BsmI認識配列(下線部)を組み込んだプライマーである。
(2)折り畳みプライマー
2D6*44-SR2-Bsm17b:5'-TACGGTATATACCGTATCCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'(配列番号5)
2D6*44-SR2-Bsm17:5'-ATGCGTATATACGCATTCCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'(配列番号6)
2D6*44-SR2-Bsm17b:5'-TACGGTATATACCGTATCCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'(配列番号5)
2D6*44-SR2-Bsm17:5'-ATGCGTATATACGCATTCCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'(配列番号6)
2D6*44-SR2-Bsm17bは、CYP2D6*1とCYP2D6*44の双方に特異的なプライマーである。2D6*44-SR2-Bsm17bは、その3’末端側にある配列(20mer)が鋳型にアニーリングし、5’末端側にある配列(16mer:下線部)がその領域内で折り畳まれて図2に示す構造をとるように設計されている。2D6*44-SR2-Bsm17は、2D6*44-SR2-Bsm17bと同様に設計されているが、このプライマーは、増幅産物にNb.BsmI認識配列を導入するための配列(下線部)が組み込まれている。
(3)インナープライマーおよびアウタープライマー
2D6*44-LF4:5'-ATCCGGATGTAGGATC-3'(配列番号7)
2D6*44OF4:5'-GATGGTGACCACCTCGAC-3'(配列番号8)
2D6*44OR4:5'-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3'(配列番号9)
2D6*44-LF4:5'-ATCCGGATGTAGGATC-3'(配列番号7)
2D6*44OF4:5'-GATGGTGACCACCTCGAC-3'(配列番号8)
2D6*44OR4:5'-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3'(配列番号9)
2D6*44-LF4(インナープライマー)、2D6*44OF4(上流アウタープライマー)および2D6*44OR4(下流アウタープライマー)は、図6に示される領域において鋳型にハイブリダイズする配列のみからなっている。
例2:ニッキング酵素およびその認識配列を含む折り畳みプライマーを利用した標的核酸配列の増幅
本例では、ニッキング酵素であるNb.BsmIおよびその認識配列を含む折り畳みプライマーを用いて、ヒトゲノム中の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
本例では、ニッキング酵素であるNb.BsmIおよびその認識配列を含む折り畳みプライマーを用いて、ヒトゲノム中の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
具体的には、次の組成を有する反応液:1×NEBuffer3(New England BioLabs)、Tween20(0.1%)、dNTP(各1.4mM)、ベタイン(0.8M)、ループ形成プライマー2D6*44-F1(2.4μM)、折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17(2.4μM)、インナープライマー2D6*44-LF4(1.2μM)、上流アウタープライマー2D6*44OF4(0.3μM)、下流アウタープライマー2D6*44OR4(0.3μM)、ヒトゲノムDNA(10ng/μl)、SYBR Green I(10万倍希釈)、Bst DNAポリメラーゼ(0.32unit/μl、New England BioLabs)およびNb.BsmI(0.08unit/μl)を含有;を調製し、これを60℃で70分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムPCR装置Mx3000P(Stratagene)を用いて行った。
核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図7に示す。図7において、四角は鋳型(ヒトゲノムDNA)およびニッキング酵素(Nb.BsmI)をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示し、菱形は鋳型を含有せず、ニッキング酵素を含有するサンプルを示し、三角は鋳型とニッキング酵素をともに含有しないサンプルを示す。
図7によれば、鋳型を含有するサンプルでは増幅産物が得られたが(四角および丸)、ニッキング酵素をさらに含有するサンプルにおいて増幅効率が顕著に高いことが示された(四角)。鋳型を含有しないサンプルでは、ニッキング酵素の有無にかかわらず増幅産物は得られなかった(菱形および三角)。
上記の折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17に代えて、Nb.BsmIの認識配列を含まない折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17bを用いて同様に行った核酸増幅反応の結果を図8に示す。図8において、四角は鋳型(ヒトゲノムDNA)およびニッキング酵素(Nb.BsmI)をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示し、菱形は鋳型を含有せず、ニッキング酵素を含有するサンプルを示し、三角は鋳型とニッキング酵素をともに含有しないサンプルを示す。
図8によれば、ニッキング酵素の認識配列を含むプライマーが存在しない場合には、ニッキング酵素の有無による増幅効率の相違は見られないことが示された(四角および丸)。よって、図7において見られるニッキング酵素による増幅効率の顕著な上昇は、プライマーに含まれる該酵素の認識配列に起因することが示された。
例3:ニッキング酵素およびその認識配列を含むループ形成プライマーを利用した標的核酸配列の増幅
本例では、ニッキング酵素であるNb.BsmIおよびその認識配列を含むループ形成プライマーを用いて、CYP2D6*44中の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
本例では、ニッキング酵素であるNb.BsmIおよびその認識配列を含むループ形成プライマーを用いて、CYP2D6*44中の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
具体的には、次の組成を有する反応液:1×NEBuffer3(New England BioLabs)、Tween20(0.1%)、dNTP(各1.4mM)、ベタイン(0.8M)、ループ形成プライマー2D6*44-F1m-BsmT01(2.4μM)、折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17b(2.4μM)、インナープライマー2D6*44-LF4(1.2μM)、上流アウタープライマー2D6*44OF4(0.3μM)、下流アウタープライマー2D6*44OR4(0.3μM)、CYP2D6*44断片を含むプラスミド(5000コピー/μl)、SYBR Green I(10万倍希釈)、Bst DNAポリメラーゼ(0.32unit/μl、New England BioLabs)およびNb.BsmI(0.067unit/μl)を含有;を調製し、これを60℃で120分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムPCR装置Mx3000P(Stratagene)を用いて行った。
核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図9に示す。図9において、四角は鋳型(プラスミド)およびニッキング酵素(Nb.BsmI)をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示す。
図9によれば、ニッキング酵素の有無にかかわらず増幅産物が得られたが、ニッキング酵素を含有するサンプルにおいて増幅効率が顕著に高いことが示された(四角)。
例4:ニッキング酵素およびその認識配列を含むプライマーを用いた標的核酸配列の増幅における一塩基変異の影響
本例では、本発明による核酸増幅反応の特異性を確認するため、標的核酸配列に対して一塩基変異を有する配列を鋳型としたときの増幅効率を調べた。この目的で、CYP2D6*44断片を含むプラスミドおよびCYP2D6*1断片を含むプラスミドのいずれか一方を鋳型とし、CYP2D6*44に特異的なプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行った。
本例では、本発明による核酸増幅反応の特異性を確認するため、標的核酸配列に対して一塩基変異を有する配列を鋳型としたときの増幅効率を調べた。この目的で、CYP2D6*44断片を含むプラスミドおよびCYP2D6*1断片を含むプラスミドのいずれか一方を鋳型とし、CYP2D6*44に特異的なプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行った。
具体的には、次の組成を有する反応液:1×NEBuffer3(New England BioLabs)、Tween20(0.1%)、dNTP(各1.4mM)、ベタイン(0.8M)、ループ形成プライマー2D6*44-F1m(2.4μM)、折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17(2.4μM)、インナープライマー2D6*44-LF4(1.2μM)、上流アウタープライマー2D6*44OF4(0.3μM)、下流アウタープライマー2D6*44OR4(0.3μM)、鋳型プラスミド(5000コピー/μl)、SYBR Green I(10万倍希釈)、Bst DNAポリメラーゼ(0.32unit/μl、New England BioLabs)およびNb.BsmI(0.1unit/μl)を含有;を調製し、これを60℃で80分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムPCR装置Mx3000P(Stratagene)を用いて行った。
核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図10に示す。図10において、菱形は鋳型としてのCYP2D6*44プラスミドおよびニッキング酵素(Nb.BsmI)を含有するサンプルを示し、四角は鋳型としてCYP2D6*44プラスミドを含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示し、三角は鋳型としてのCYP2D6*1プラスミドおよびニッキング酵素(Nb.BsmI)を含有するサンプルを示し、丸は鋳型としてCYP2D6*1プラスミドを含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示す。
図10によれば、標的核酸であるCYP2D6*44プラスミドを鋳型として用いた場合には増幅産物が得られ(菱形および四角)、特にニッキング酵素を添加した場合に増幅効率が顕著に高くなることが示された(菱形)。一方で、標的核酸配列との間で一塩基のミスマッチを有するCYP2D6*1プラスミドを鋳型として用いた場合には、ニッキング酵素の有無にかかわらず増幅産物がほとんど得られなかった(三角および丸)。これらの結果から、本発明による核酸増幅法は顕著に高い配列特異性を示し、例えば、鋳型における一塩基のミスマッチをも識別できることが示された。
1 核酸検出装置
2 反応室
3 チップ
4 反応混合物
5 温度調節手段
6 シグナル検出器
7 表示部
2 反応室
3 チップ
4 反応混合物
5 温度調節手段
6 シグナル検出器
7 表示部
Claims (43)
- 標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、(i)鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ(ii)該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、
前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセット。 - 前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項1に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーが、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものである、請求項3に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーが、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものである、請求項5に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(C)よりも5’側に存在する配列(D)の相補配列(Dc)にハイブリダイズする配列(D')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載のプライマーセット。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載のプライマーセット。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載のプライマーセット。 - 前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの一方または両方が、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものである、請求項7〜9のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする1種以上の第三のプライマーを含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも3’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなる、請求項1〜11のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 試料中の標的核酸を増幅する方法であって、
(a)標的核酸を含む試料を用意する工程、
(b)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、
(c)請求項1〜12のいずれか一項に記載のプライマーセットを用意する工程、および
(d)前記試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項13に記載の方法。
- 核酸増幅反応が等温で行われる、請求項13または14に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項17に記載の方法。
- 試料中の標的核酸を増幅するためのキットであって、
(a)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および
(b)請求項1〜12のいずれか一項に記載のプライマーセット
を含んでなる、キット。 - 前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項19に記載のキット。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項19または20に記載のキット。
- 融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項19〜21のいずれか一項に記載のキット。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項22に記載のキット。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
(a)核酸試料を用意する工程、
(b)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、
(c)請求項1〜12のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および
(d)前記核酸試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項24に記載の方法。
- 核酸増幅反応が等温で行われる、請求項24または25に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項24〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項28に記載の方法。
- 核酸増幅反応がミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、
(a)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および
(b)請求項1〜12のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセット
を含んでなる、キット。 - 前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項31に記載のキット。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項31または32に記載のキット。
- 融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項31〜33のいずれか一項に記載のキット。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項34に記載のキット。
- ミスマッチ結合タンパク質をさらに含んでなる、請求項31〜35のいずれか一項に記載のキット。
- 一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を増幅する方法であって、
(a)ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、
(b)前記エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖配列の少なくとも一方の鎖の配列を含んでなる一本鎖の鋳型核酸であって、その3’末端と5’末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによりループ構造または折り返し構造を形成しうる、鋳型核酸を用意する工程、
(c)核酸増幅反応に用いられる、鎖置換能を有するポリメラーゼを用意する工程、および
(d)前記エンドヌクレアーゼ、前記鋳型核酸および前記ポリメラーゼを含んでなる核酸増幅反応溶液を調製し、この溶液を、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下においてインキュベートする工程
を含んでなる、方法。 - 前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項37に記載の方法。
- 前記溶液が等温下でインキュベートされる、請求項37または38に記載の方法。
- 前記溶液が融解温度調整剤を含んでなる、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項40に記載の方法。
- 試料中の標的核酸を検出するための装置であって、
(a)請求項13〜18、24〜30および37〜41のいずれか一項に記載の方法を行うための反応室と、
(b)前記反応室の内部の温度を調節するための温度調節手段と、
(c)前記反応室中の反応混合物からの、増幅産物の生成を示すシグナルを検出するためのシグナル検出手段と
を少なくとも備えてなる、装置。 - 前記シグナルが検出された場合に試料中の標的核酸が検出されたことを表示するための表示手段をさらに含んでなる、請求項42に記載の装置。
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Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
JP2008136436A (ja) * | 2006-12-04 | 2008-06-19 | Fujifilm Corp | 1本鎖dna結合蛋白質を用いた核酸の変異検出方法 |
WO2016152812A1 (ja) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | タカラバイオ株式会社 | 標的核酸の高感度検出方法 |
US10131890B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-20 | Takara Bio Inc. | Method for using heat-resistant mismatch endonuclease |
US10975415B2 (en) | 2014-09-11 | 2021-04-13 | Takara Bio Inc. | Methods of utilizing thermostable mismatch endonuclease |
-
2006
- 2006-06-01 JP JP2006153837A patent/JP2007319096A/ja active Pending
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008136436A (ja) * | 2006-12-04 | 2008-06-19 | Fujifilm Corp | 1本鎖dna結合蛋白質を用いた核酸の変異検出方法 |
US10131890B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-20 | Takara Bio Inc. | Method for using heat-resistant mismatch endonuclease |
US10196618B1 (en) | 2013-03-14 | 2019-02-05 | Takara Bio Inc. | Method for using heat-resistant mismatch endonuclease |
US10280412B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-05-07 | Takara Bio Inc. | Method for using heat-resistant mismatch endonuclease |
US10294465B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-05-21 | Takara Bio Inc. | Method for using heat-resistant mismatch endonuclease |
US10975415B2 (en) | 2014-09-11 | 2021-04-13 | Takara Bio Inc. | Methods of utilizing thermostable mismatch endonuclease |
WO2016152812A1 (ja) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | タカラバイオ株式会社 | 標的核酸の高感度検出方法 |
CN107614681A (zh) * | 2015-03-20 | 2018-01-19 | 宝生物工程株式会社 | 用于检测靶核酸的高灵敏度方法 |
JPWO2016152812A1 (ja) * | 2015-03-20 | 2018-01-25 | タカラバイオ株式会社 | 標的核酸の高感度検出方法 |
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