JP4942160B2 - RecAタンパク質を利用した核酸の等温増幅法 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の等温増幅法、ならびにこの方法を利用した変異検出法に関するものである。
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
本例では、ループ形成プライマーのペアおよびThermus thermophilus由来のRecAタンパク質を用いて、ヒトゲノム中に含まれるEGFR(epidermal growth factor receptor)遺伝子内の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
EGFR18R-06:5'-CGGCACGGTGAGCCCAGAGGCCTGTGCCAG-3'(配列番号3)。
本例では、本発明による核酸増幅反応の特異性を確認するため、標的核酸配列中に一塩基変異を有する配列に対して設計したループ形成プライマーを用いて核酸増幅反応を行い、その結果を、一塩基変異の無い配列に対するループ形成プライマーによる核酸増幅反応の結果と比較した。
FIP-W:5'-CCGGGAAATAATCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3'(配列番号5)、
BIP-W:5'-CGGGAACCCGTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'(配列番号6)。
FIP-M:5'-CTGGGAAATAATCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3'(配列番号7)、
BIP-M:5'-CAGGAACCCGTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'(配列番号8)。
LOOP-F:5'-GATAGTGGGAAAATTATTGC-3'(配列番号9)、
LOOP-B:5'-CAAATTACTTAAAAACCTTGCTT-3'(配列番号10)、
F3:5'-CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3'(配列番号11)、
B3:5'-AGGGTTGTTGATGTCCAT-3'(配列番号12)。
本例では、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとからなるプライマーペアおよびT.thermophilus由来RecAタンパク質を用いて、ヒトゲノム中の標的核酸配列増幅するための核酸増幅反応を行った。
2D6*44-F1:5’−CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA―3’(配列番号14)
2D6*44-SR2:5’−TTTATATATATATAAACCCCTGCACTGTTTCCCAGA−3’(配列番号15)
Claims (48)
- 鎖置換反応を利用した等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
(a)標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、
(b)RecAタンパク質を用意する工程、
(c)標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットを用意する工程、および
(d)前記鋳型核酸および前記RecAタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程
を含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、方法。 - 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(C)よりも5’側に存在する配列(D)の相補配列(Dc)にハイブリダイズする配列(D')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載の方法。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載の方法。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項1に記載の方法。 - 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする1種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも3’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応がATPおよび/またはATP類似体の存在下で行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項11に記載の方法。
- 鎖置換反応を利用した等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、
(a)RecAタンパク質、および
(b)標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセット
を含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、キット。 - 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項13に記載のキット。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項13に記載のキット。
- 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(C)よりも5’側に存在する配列(D)の相補配列(Dc)にハイブリダイズする配列(D')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項13に記載のキット。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項13に記載のキット。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項13に記載のキット。 - 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする1種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項13〜18のいずれか一項に記載のキット。
- 前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも3’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項13〜18のいずれか一項に記載のキット。
- ATPおよび/またはATP類似体をさらに含んでなる、請求項13〜18のいずれか一項に記載のキット。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項13〜18のいずれか一項に記載のキット。
- 融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項13〜18のいずれか一項に記載のキット。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項23に記載のキット。
- 鎖置換反応を利用した等温下での核酸増幅反応により核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
(a)核酸試料を用意する工程、
(b)RecAタンパク質を用意する工程、
(c)標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および
(d)前記核酸試料および前記RecAタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程
を含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、方法。 - 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項25に記載の方法。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項25に記載の方法。
- 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(C)よりも5’側に存在する配列(D)の相補配列(Dc)にハイブリダイズする配列(D')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項25に記載の方法。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項25に記載の方法。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項25に記載の方法。 - 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする1種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも3’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応がATPおよび/またはATP類似体の存在下で行われる、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項35に記載の方法。
- 鎖置換反応を利用した等温下での核酸増幅反応により核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、
(a)RecAタンパク質、および
(b)標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセット
を含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の5’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、キット。 - 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項37に記載のキット。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものである、請求項37に記載のキット。
- 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(C)よりも5’側に存在する配列(D)の相補配列(Dc)にハイブリダイズする配列(D')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項37に記載のキット。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(B-Bc')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項37に記載のキット。 - 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac')を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B')を前記配列(Ac')の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc')を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc')を前記配列(Cc')の5’側に含んでなるものである、請求項37に記載のキット。 - 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする1種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項37〜42のいずれか一項に記載のキット。
- 前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも3’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項37〜42のいずれか一項に記載のキット。
- ATPおよび/またはATP類似体をさらに含んでなる、請求項37〜42のいずれか一項に記載のキット。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項37〜42のいずれか一項に記載のキット。
- 融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項37〜42のいずれか一項に記載のキット。
- 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項47に記載のキット。
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