CN101671672A

CN101671672A - 用于改进的核酸扩增的聚阴离子

Info

Publication number: CN101671672A
Application number: CN200910171180A
Authority: CN
Inventors: W·安肯鲍尔; D·海因德尔; R·科尔布; F·劳; E·沃尔特
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2029-09-08
Also published as: US20100255547A1; EP2163556A1; CN101671672B; ATE517116T1; CA2678229A1; JP5436105B2; CA2678229C; HK1142362A1; US7910720B2; EP2163556B1; ES2367469T3; JP2010063456A

Abstract

本发明涉及包含结构[Xx－(CH₂)m－磷酸基－Yy]n的新颖化合物，其特征在于3≤m≤6，30≤n≤60，每个x和y彼此独立地为0或1，每个X和Y彼此独立地为任意的可光度测量的实体，条件是末端X也可为－OH基或磷酸基，进一步的条件是末端Y也可为－OH基。这种化合物可用作基于核酸扩增的合适的热启动PCR添加剂。

Description

用于改进的核酸扩增的聚阴离子

技术领域

本发明涉及模板依赖性聚合酶催化的引物延伸反应(如聚合酶链反应(PCR))领域，。更确切地说，本发明提供进行热启动PCR的新方法，其特征在于，通过在扩增反应之前加入规定的聚阴离子来避免非特异性引物二聚体扩增。

背景技术

核酸扩增(尤其是PCR)的一个主要问题在于非特异性扩增产物的生成。在很多情况下，这归因于实际的热循环程序本身之前的非特异性寡核苷酸引导(priming)和随后的引物延伸事件(event)，因为热稳定DNA聚合酶在环境温度下也有适度的活性。例如，经常观察到由于最后偶然发生的引物二聚和随后的延伸而产生的扩增产物。为了克服这个问题，本领域众所周知进行所谓的“热启动”PCR，其中将对于扩增反应必需的一种成分或者从反应混合物中分离，或者保持失活状态直至反应混合物的温度第一次升高。因为聚合酶不能在这些条件下起作用，所以在引物能非特异性结合的期间不发生引物延伸。为了达到这个效果，应用以下几种方法：

a)DNA聚合酶的物理分离

物理分离例如可通过固体蜡形成的屏障来实现，固体蜡形成的屏障把含有DNA聚合酶的部分和含有大多数其它试剂的部分分隔。首次加热步骤中，蜡自动熔融，各流体部分混合(Chou，Q.等人，Nucleic Acids Res 20(1992)1717-23，US 5,411,876)。或者，在扩增反应前使DNA聚合酶亲合固定在固体载体上，并仅通过热介导释放将其释放到反应混合物中(Nilsson，J.等人，Biotechniques 22(1997)744-51)。然而，两种方法都是费时的，且不便操作。

b)DNA聚合酶的化学修饰

对于这种热启动PCR，通过化学修饰使DNA聚合酶可逆地失活。更确切地，将热不稳定保护基团引入到Taq DNA聚合酶中，这使酶在室温下失活(US 5,773,258)。在PCR预处理步骤中于高温下除去这些保护基团，以使酶变成有活性的。例如可通过使柠康酐或乌头酐(Aconitric Anhydride)与酶的赖氨酸残基偶合来获得这种热不稳定修饰(US 5,677,152)。带有此类修饰的酶同时是市售的，如Amplitaq Gold(Motetti，T.等人，Biotechniques 25(1998)716-22)或FastStart DNA聚合酶(Roche MolecularBiochemicals)。然而，保护基团的引入是一种化学反应，它可任意发生在酶的所有空间可用(sterically available)的赖氨酸残基。所以，化学修饰酶制备的可再现性和质量可变化，几乎不能控制。

c)DNA聚合酶的重组修饰

已通过基因工程制备Taq聚合酶的冷敏感突变体。这些突变体与野生型酶的差别在于它们缺少N端(US 6,241,557)。与天然或野生型重组Taq聚合酶相反，这些突变体在低于35℃时完全没有活性，所以在一些情况下可用于进行热启动PCR。然而，N端截短的冷敏感突变体形式需要低盐缓冲剂条件，与野生型酶相比具有较低的持续合成能力，所以只能用于短的目标核酸的扩增。另外，由于截短形式缺乏5’-3’核酸外切酶活性，它不能用于基于TaqMan检测设计(TaqMan detection format)的实时PCR(real timePCR)实验。

d)通过核酸添加剂抑制DNA聚合酶

已证实通过添加短双链DNA片段来抑制非特异性退火引物(annealedprimers)的延伸(Kainz，P.等人，Biotechniques 28(2000)278-82)。在这种情况下，引物延伸在低于短双链DNA片段的熔点温度下受抑制，但是与竞争剂(competitor)DNA本身的序列无关。然而，尚不知，竞争剂DNA过剩至何种程度会影响核酸扩增反应的产率。

或者，可以使用具有形成确定二级结构的特定序列的寡核苷酸适配体。此类适配体因其与DNA聚合酶具有很高的亲合性，已利用SELEX技术选择(US 5,693,502，Lin，Y.和Jayasena，S.，D.，J.Mol.Biol.271(1997)100-11)。在实际的热循环过程本身之前，此类适配体于扩增混合物中的存在又导致了结合DNA聚合酶的高亲合性，随后形成对该酶活性的热不稳定抑制(US 6,020,130)。然而，由于该选择过程，目前所有可用的适配体只能用于与一种特定DNA聚合酶种类结合。

e)Taq DNA抗体

实现对Taq DNA聚合酶的热不稳定抑制的一种另选途径是：添加用于(raised)抗纯化酶的单克隆抗体(Kellogg，D.，E.等人，Biotechniques 16(1994)1134-7；Sharkey，D.，J.等人，Biotechnology(N Y)12(1994)506-9)。像寡核苷酸适配体一样，抗体在环境温度下以抑制方式通过高亲合性结合Taq DNA聚合酶(US 5,338,671)。复合物在热循环过程本身之前，在预热步骤中分解。总的来说，这导致扩增中明显费时的延伸，应用快速热循环的规程(protocols)尤其如此(WO 97/46706)。

f)US 5,985,619公开了使用热启动抗体进行PCR的具体实施方式，其中除Taq聚合酶外，向扩增混合物中加入诸如来自大肠杆菌的核酸外切酶III作为补充物，以便消化非特异性引物二聚体中间体。如上述公开的，核酸外切酶III识别双链DNA作为底物，例如，靶标/引物杂交或靶标/引物延伸产物杂交。通过切割3’端脱氧核苷酸残基的5’末端处的磷酸二酯键来进行消化。因为这种核酸外切酶在环境温度下是活化的，所以所有非特异性退火引物和引物延伸产物都被消化。在一些实施方式中，这甚至造成扩增反应的特异性增强。然而依赖预孵育时间的对非特异引物的消化可导致引物浓度大量、不受控制的降低，这反过来可影响扩增反应本身。单独使用或与外切核酸酶结合使用修饰的引物

EP 0 799 888和GB 2 293 238公开了向PCR反应物中加入3’保护(blocked)的寡核苷酸。由于3’端的保护，这些寡核苷酸不能充当引物。对受保护的寡核苷酸进行设计，以与PCR引物竞争或与PCR引物相互作用，这造成非特异产物的减少。

另一种另选方法(alternative)是在PCR反应混合物中组合使用硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotide)引物和核酸外切酶III(EP0744470)。这种情况下，通常接受双链DNA以及单链DNA底物的3’核酸外切酶降解诸如引物二聚体的双链体人工产物，以及继续降解(carryover)扩增子，但不降解单链扩增引物。相似地，已提出使用带有碱基修饰的3’端的引物和通过大肠杆菌核酸外切酶IV进行模板依赖性去修饰(removal)(US 5,792,607)。

EP 1275735提出了总体思想的具体实施方式。它的说明书公开了用于进行核酸扩增反应的组合物，其包含：(i)热稳定DNA聚合酶，(ii)热稳定3’-5’核酸外切酶，和(iii)至少一种用于核酸扩增的引物，其具有不被所述热稳定DNA聚合酶延伸的修饰的3’端残基；还公开了使用这种组合物进行PCR反应的方法。

然而，所公开的另选方法的主要缺点在于，对每一次PCR反应均需要修饰的引物，这导致对于每一单独分析的成本需求增加。

g)其它PCR添加剂

本领域已知其它有机添加剂(如DMSO、甜菜碱和甲酰胺)(WO99/46400；Hengen，P.，N.，Trends Biochem Sci 22(1997)225-6；Chakrabarti，R.和Schutt，C.，E.，Nucleic Acids Res 29(2001)2377-81)导致富含GC片段扩增的提高，而不是防止引物二聚体的形成。类似地，肝素(heparin)推测通过除去蛋白质(如组蛋白)来使染色体DNA可用来促进体外发生的连缀转录(Hildebrand，C.，等人，Biochimica et Biopysica Acta 477(1977)295-311)。

还已知，单链结合蛋白(US 5,449,603)或tRNA(Sturzenbaum，S.，R.，Biotechniques 27(1999)50-2)的添加导致这些添加剂与引物的非共价结合。在PCR期间，这种结合在加热时被破坏。也已发现，DNA解旋酶的添加防止引物的随机退火(Kaboev，O.，K.等人，Bioorg Khim 25(1999)398-400)。此外，为了抑制聚合酶在低温下的活性，在数种情况下可使用多聚谷氨酸盐(polyglutamate)(WO 00/68411)。

h)此外已知，聚阴离子型聚合酶抑制剂可以根据所应用的孵育温度控制热稳定DNA聚合酶的活性。US 6,667,165公开了热启动实施方式，其特征在于，在低于40℃的温度下形成失活的聚合酶-抑制剂复合物。在40℃和55℃之间，抑制剂与模板DNA竞争结合到Taq聚合酶，然而在超过55℃的温度下，抑制剂从聚合酶的活性位点被置换。然而，当使用较低退火温度的引物时，抑制剂倾向于减少可得产物的产率。镁螯合

由于长期以来，已知热稳定聚合酶只有在Mg²⁺阳离子的存在才具有活性，因此为了避免错误引导或非特异(unspecifying)引物延伸，尝试在热循环规程开始前进行镁螯合。如US 6,403,341中所公开的，在扩增反应开始时Mg²⁺可以沉淀物的形式存在，从而不可用。在第一轮热循环期间，一旦温度升高，沉淀物溶解，Mg²⁺在头3个循环中变得完全可用。这种溶液已证实相当实用，并能提供良好的热启动结果。另一方面，这种溶液不允许制备含有除了引物和目标核酸以外的所有试剂的反应混合物(mastermixes)，引物和目标核酸对进行核酸扩增反应是必需的。结果，分析间(inter-assay)数据再现性和数据比较是复杂的。此外，还公开了为了产生所需的热启动效果，向扩增溶液中加入Mg²⁺结合肽(PCT/EP2007/001585)。

发明内容

考虑到现有技术概况，本发明的一个目的在于提供用于热启动PCR的改进的另选组合物和方法，其允许不仅在扩增过程本身之前，而且在热循环过程中抑制非特异性引导和引物延伸。更确切地说，本发明的一个目的在于提供用于热启动PCR的另选组合物和方法，其中不发生非特异性退火引物的延伸。

在第一方面中，本发明提供化合物，其包含以下结构：

[X x-(CH₂)m-磷酸基(phosphate)-Yy]n

其特征在于，

3≤m≤6，

30≤n≤60，

每个x和y彼此独立地为0或1，

每个X和Y彼此独立地为选自如下的实体(entity)：核苷残基、(脱氧-)核苷残基、衍生的核苷或(脱氧-)核苷残基和核苷或(脱氧-)核苷类似物，

条件是针对每个[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy ]单元独立地选择每个m、x和y，进一步的条件是末端X也可为-OH基或磷酸基，进一步的条件是末端Y也可为-H或(CH₂)m-OH基。

在第二个方面中，本发明涉及组合物，其包含：

-如上所公开的化合物

-DNA聚合酶，以及

-脱氧寡核苷酸。

在第三个方面中，本发明涉及组合物，其包含：

-如上所公开的化合物

-DNA聚合酶，以及

-三磷酸脱氧寡核苷(desoxy-oligonucleoside triphosphates)。

在具体实施方式中，所述组合物进一步包含随机5-8聚体寡核苷酸(randomized 5-8mer oligonucleotide)，其特征在于，所述寡核苷酸包含具有有机疏水部分的修饰(a modification with an organic hydrophobicmoiety)。

在第四个方面中，本发明提供试剂盒，其包含：

-如上所公开的化合物

-DNA聚合酶，以及

-脱氧寡核苷酸。

在第五个方面中，本发明提供试剂盒，其包含：

-如上所公开的化合物

-DNA聚合酶，以及

-三磷酸脱氧寡核苷。

在具体实施方式中，所述试剂盒进一步包含随机5-8聚体寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含具有有机疏水部分的修饰。

在第六方面中，本发明提供包括如下步骤的方法：

-提供含有核酸的样品

-提供如上所公开的组合物，

-至少提供第一寡核苷酸引物，

-进行聚合酶催化的引物延伸反应。

在一种实施方式中，所述核酸为DNA。在另一种实施方式中，所述核酸是RNA，其中所述DNA聚合酶含有逆转录酶活性。

在具体实施方式中，所述聚合酶是热稳定聚合酶，对所述反应进行实时监测。随后可进行解链曲线分析。

附图说明

图1示出了各种量的目标DNA在各种量的化合物X40的存在下的PCR扩增(实施例2)

第1至6泳道：不存在添加剂下的对照反应，分别含有50ng、25ng、10ng、5ng、1ng、0ng模板DNA。

第7至12泳道：_X40_(0.3mM)存在下的PCR反应，分别含有50ng、25ng、10ng、5ng、1ng、0ng模板DNA。

第13至18泳道：_X40_(0.15mM)存在下的PCR反应，分别含有50ng、25ng、10ng、5ng、1ng、0ng模板DNA。

第19至24泳道：_X40_(0.075mM)存在下的PCR反应，分别含有50ng、25ng、10ng、5ng、1ng、0ng模板DNA。

第25至30泳道：_X40_(0.0375mM)存在下的PCR反应，分别含有50ng、25ng、10ng、5ng、1ng、0ng模板DNA。

第31至36泳道：_X40_(0.018mM)存在下的PCR反应，分别含有50ng、25ng、10ng、5ng、1ng、0ng模板DNA。

图2示出了RT-PCR之后的解链曲线分析(实施例5)

_a：存在_X40_下进行第一链cDNA合成，不存在_X40_下进行后续的PCR，

_b：存在_X40_下进行第一链cDNA合成，存在_X40_下进行后续的PCR，

_c：不存在_X40_下进行第一链cDNA合成，不存在_X40_下进行后续的PCR，

-d：不存在_X40_下进行第一链cDNA合成，存在_X40_下进行后续的PCR，

具体实施方式

本发明提供用于进行特异性提高的引物延伸反应的新的改进溶液。具体来说，本发明提供用于进行特异性提高的核酸扩增反应的新的改进溶液。所谓的热启动效应有效抑制不需要的引物延伸。不需要的引物延伸由偶然杂交事件引起，其中引物至少部分杂交至核酸样品中的任何序列，其与核酸靶标的实际引物结合位点不同。

根据本发明的化合物

本发明提供包含如下结构的化合物：

[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy]n

其特征在于，

3≤m≤6，

30≤n≤60，

每个x和y彼此独立地为0或1，

每个X和Y彼此独立地为可光度测量的实体，

条件是针对每个[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy]单元独立地选择每个m、x和y，进一步的条件是末端X也可为-OH基或磷酸基，进一步的条件是末端Y也可为-H或Cm-OH基。

已将本发明的化合物设计，以在低温下充当Mg²⁺离子的可逆结合伴侣(binding partner)。相比之下，所述化合物似乎对结合DNA聚合酶不具有合理的亲和性。在BIAcore仪器上所进行的旨在确定Taq聚合酶对数种具有本发明结构的固定化合物的结合率的各个实验未能显示任何可测的特异性结合亲和性。

一经温度升高，Mg²⁺离子再次释放到溶液中。关于聚合酶催化的引物延伸反应，众所周知Mg²⁺离子浓度对反应的特异性和持续合成能力起至关重要作用。因此，如果在聚合酶链反应开始时，通过与存在于样品中的本发明化合物进行时间依赖性非共价结合，将Mg²⁺离子可逆地从溶液中去除，则产生所需的热启动效应：在低温下基于引物延伸的不需要的聚合酶活性受到抑制，所述引物非特异性地与所述核酸样品的错误目标区域结合。当Mg²⁺离子从本发明化合物中可逆释放时，Mg²⁺离子的有效浓度再次增加，可发生通过聚合酶的特异性引物延伸。

此外，由于以下事实：在本发明化合物和Mg²⁺之间以温度依赖性方式进行的结合是可逆的，所需的热启动效应不仅在聚合酶链反应开始时的第一次温度升高之前实现，而且在整个扩增规程期间的随后的循环中的每次退火阶段(annealing phase)产生。

对于每个“[Xx-(CH₂)m-磷酸基-Yy]”单元，X和Y可不存在，或代表可光度测量的实体。然而，为了使合成变得容易，优选本发明化合物的大部分或全部单元是相同的。此外，如果所有单元相同，那么当每个单元中仅存在X或仅存在Y时，其是有利的。

根据本发明，本发明化合物优选由30至60个所述单元组成。而为了产生所需的热启动效应，需要至少30个单元，60个单元的上限使得本发明化合物通过如下所公开的方法容易地合成。

本发明化合物具有可光度测量的实体，以便通过UV或可见光谱促进浓度调节。因此，原则上，在标准寡核苷酸合成条件下是稳定的，且具有大于250nm的吸收的任何部分都是合适的。

这样的可光度测量的实体优选例如是(脱氧)-核苷残基，例如脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞嘧啶、脱氧胸苷或脱氧尿苷；或衍生的核苷酸残基或核苷酸类似物，在260nm的各个UV吸收测量中可检测到所述实体的存在。

可光度测量的实体的其它实例可选自：芳族基(aromates)，如二硝基苯基或苯基；多芳族基(polyaromates)，如芘；或杂芳族基(heteroaromates)，如吖啶和荧光或非荧光染料。例如，荧光素、罗丹明、噁嗪、花菁或偶氮染料。

因此，在本发明的上下文中，X或Y彼此独立地可不存在或为染料或任选衍生的核苷。在其中X或Y代表所述化合物的内部实体(internalentities)的那些情况下，所述X和Y部分优选为(脱氧-)核苷残基，如，脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞嘧啶、脱氧胸苷或脱氧尿苷。

在一个实施方式中，所述化合物包含以下结构：

X-[(CH₂)m-磷酸基]n-Y

其特征在于

3≤m≤6，

30≤n≤60，

X为羟基或磷酸基，以及

Y为羟基或可光度测量的实体，如任选衍生的(脱氧-)核苷残基。

优选所有单元[(CH₂)m-磷酸基]是相同的。

在另一实施方式中，所述化合物包含以下结构：

X-[CH₂)m-磷酸基-Y]n

其特征在于

3＜m＜6，

30＜n＜60，

X为羟基或磷酸基，以及

优选所有单元-[(CH₂)m-磷酸基-Y]是相同的。

在又一实施方式中，所述化合物包含以下结构：

[X-(CH₂)m-磷酸基]-Yn

其特征在于

3≤m≤6，

30≤n≤60，

每个X为可光度测量的实体，如任选衍生的(脱氧-)核苷残基，以及

Y为羟基。

优选所有的单元-[X-(CH₂)m-磷酸基]是相同的。

不同单元的磷酸基之间的间距取决于C原子数目以及内部X或和Y部分的存在与否。根据本发明，对所述间距进行选择，以有效允许某种配合键合，即，一个Mg²⁺离子和本发明化合物中存在的两个邻接的磷酸基部分之间的非共价相互作用。

本发明化合物为聚阴离子，其主要表征为中心单元(CH₂)m-磷酸基，其中m是3和6之间的自然数，即，中心单元包含3至6个C原子，其定义了两个邻接的磷酸基部分之间的最小间距的下限。

然而，也证实有可能插入更多X或Y部分，其延伸连接磷酸基部分的原子链的长度，籍此乍一看延伸所述部分之间的距离。然而，如实例中所示，X和Y部分的存在对Mg²⁺离子的配合结合没有负面影响。这最可能是因为本发明化合物的空间挠性(sterical flexibility)。

本发明化合物可用标准亚磷酰胺(phosphoramidite)化学来合成，如同用于本领域的寡核苷酸的化学合成。更确切地说，通过使用市售的含有受保护的末端羟基部分的C原子接头(linker)亚磷酰胺来实现[(CH₂)m-磷酸基]单元的并入(incorporation)。通过使用市售的标准核苷亚磷酰胺来实现作为可光度测量实体的核苷残基的并入。使用常规的市售对照有孔玻璃颗粒(Control Pored Glass Particles)作为原料。然后可根据标准方法切割出本发明化合物，得到末端磷酸基或OH或末端核苷部分。

根据本发明的组合物

在第二个方面中，本发明涉及组合物，其包含：

-如上所公开的化合物

-DNA聚合酶，以及

-三磷酸脱氧寡核苷。

此类组合物特别有用于进行PCR扩增反应，因为避免了人工扩增产物(如引物二聚体)的形成。

对本发明化合物的浓度进行选择，以使PCR扩增反应的特异性和产率最优化。优选地，本发明化合物的终浓度为低于0.1mM，以避免特异性目标核酸扩增的任何抑制。同样优选地，本发明化合物的终浓度为超过0.01mM，以便达到实质的热启动效应。

DNA聚合酶一般可为能进行模板依赖性引物延伸反应的任何酶。此类模板依赖性引物延伸反应可在所有部分双链核酸杂交体(hybrids)上发生，所述杂交体表征为具有游离3’羟基的引物核酸与具有单链5’突出端的模板核酸杂交。然后模板依赖性聚合酶通过并入总是与在模板链内相对位置的核苷酸互补的核苷酸残基催化引物3’末端的延伸。该反应使用dNTP作为底物，使焦磷酸盐(酯)释放。

在一种实施方式中，所述DNA聚合酶是RNA模板依赖性聚合酶或其任何修饰型(modification)。此类酶通常称为逆转录酶。其实例为AMV逆转录酶或MMLV逆转录酶。具体而言，转录因子(transcriptor)逆转录酶(Roche Applied Science目录号：03 531 317 001)在本发明上下文中是适用的酶。含有此类RNA依赖的DNA聚合酶的本发明组合物特别有用于制备和分析型cDNA合成的所有类型和应用，尤其有用于2-步RT-PCR。

在另一种实施方式中，所述DNA聚合酶是DNA模板依赖性DNA聚合酶或其任何突变体或修饰型。一个突出的实例是Klenow聚合酶(RocheApplied Science目录号11 008 404 001)。该DNA聚合酶优选是热稳定DNA聚合酶或其任何突变体或修饰型。一个典型的实例是来自水生栖热菌的TaqDNA聚合酶(Roche Applied Science目录号：11 647 679 001)。所述DNA依赖性DNA聚合酶可具有或可不具有3’-5’校正读码活性，如Pwo聚合酶(Roche Applied Science目录号：11 644 947 001)。此外，本发明的DNA聚合酶组分可为具有和不具有校正读码活性的酶混合物，如展开高度保真性系统(Expand High Fidelity system)(Roche Applied Science目录号：11 732641 001)。包含任何种类的热稳定聚合酶的本发明组合物特别有用于进行聚合酶链反应(PCR)的各种制备或分析实施方式。

在又一种实施方式中，本发明的DNA聚合酶组分为具有额外的RNA模板依赖性逆转录酶活性的热稳定DNA依赖性DNA聚合酶，如来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的聚合酶(Roche Applied Science目录号：11 480 014 001)，或RNA依赖性DNA聚合酶(即，逆转录酶)和热稳定DNA依赖性DNA聚合酶的混合物。包含这些组分的本发明组合物特别有用于进行一步RT-PCR分析。

三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)通常为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物，然而，在一些具体情况下，可仅用3种或更少的不同种类的dNTP。此外，此类dNTP可以任何方式被化学修饰，只要所述结构单元(buildingblock)仍然能通过聚合酶并入新生多核苷酸链中。例如，所述修饰的核苷酸化合物可在各个碱基部分带有生物素或荧光化合物修饰。此外，dNTP混合物的至少一个成员可被dNTP类似物(如7-脱氮-2-脱氧鸟苷三磷酸)部分或完全取代。

所述至少一个引物寡核苷酸通常为与目标核酸的特定区域完全或几乎完全互补的脱氧寡核苷酸。此外，所述引物部分必需有游离3’羟基，以便其可通过DNA聚合酶延伸。就具体目的而言，此类引物可被化学修饰，例如，内部修饰或在其5’端修饰。经常使用的修饰的实例是生物素标记、地高辛配基(Digoxygenin)标记和荧光标记。此外，所述引物可包含修饰的核苷或核苷类似物，其已知改善PCR结果，如等位基因特异性扩增中的例如4’修饰的碱基或通用碱基如肌苷(inosin)，以便扩增可在相同样品中存在的不同等位基因。

将如果热稳定DNA依赖性DNA聚合酶设计用于PCR反应，则本发明组合物通常包含在相反方向与目标核酸的相反链杂交的两个引物寡核苷酸，该相反链与应得到扩增的目标序列邻接。本发明组合物也有可能包含用于多重PCR扩增的多对寡核苷酸PCR引物。

在一种具体实施方式中，所述组合物进一步包含随机5-8聚体寡核苷酸，其特征为所述寡核苷酸包含具有机疏水部分的修饰。更确切而言，术语“随机寡核苷酸”意指寡核苷酸库(a pool of oligonucleotides)，其序列代表4种不同核苷酸残基的或多或少相等的所有可能的组合。虽然已证实添加5聚体(mer)以及添加8聚体具有所需热启动效应，但如果使用随机六聚体寡核苷酸，则其结果特别有利。可将浓度范围为10μM和1mM之间，优选25μM和400μM之间，最优选浓度为约100μM的所述随机的寡核苷酸加入至引物延伸反应或PCR反应中。如果随机的寡核苷酸具有不可延伸的3’末端，例如可被磷酸基部分阻断，也已证实其特别有利。在样品核酸的任何区域的任何寡核苷酸偶然杂交的情况下，这避免了通过聚合酶的不需要的延伸。

随机寡核苷酸经有机疏水部分化学修饰。所述部分通常不干扰任何类型的引物延伸反应。例如，此类有机疏水部分可选自由诸如以下缩聚芳环或杂芳环组成的部分：萘、蒽、菲、芘、蒽醌、咔唑菲咯啉、喹啉等，或选自茋(stilbens)，或选自类固醇，如胆固醇。此类疏水部分可被诸如以下的较小体积的(non bulky substituent)取代基取代：氰基、甲氧基、甲基、硝基和卤素，以及部分已知作为所谓的“帽”以稳定末端碱基对。Narayanan，S.等人，Nucleic Acids Research 32(9)(2004)2901-2911；Dogan，Z.，等人，Journal of the American Chemical Society 126(15)(2004)4762-4763。

此类有机疏水部分最优选为具有如下化学结构的任选取代的芘或任选取代的茋：

最优选此类芘或茋附着在随机寡核苷酸的5’端，其中这种寡核苷酸的5’端具有如下结构：

所述有机疏水部分可置于所述随机寡核苷酸的任何部分。然而优选在所述随机寡核苷酸的5’端引入所述修饰。其原因是根据本领域熟知的标准方法可用亚磷酰胺化学与合适的末端亚磷酰胺将此类5’端修饰引入寡核苷酸，且芘和茋亚磷酰胺是市售的。

随机寡核苷酸可包含带有修饰碱基的核碱基(nucleobase)类似物，如7-脱氮类似物，如7-脱氮dG；7-脱氮-8-氮杂类似物，如7-溴-7-脱氮-8-氮杂-2-氨基dA；或取代的碱基，如丙炔基U、丙炔基C；或带有修饰的糖的类似物，如2’-甲氧基核糖；或锁定糖(locked sugars)如在LNA中；或带有核糖类似物，如己糖醇和阿卓糖醇(altritol)。代替随机化，使用通用碱基(universal base)，如硝基吲哚或N8核糖基化-7脱氮-8-氮杂dA，然而优选仅在随机寡核苷酸的一个位置使用通用碱基代替随机寡核苷酸。核苷间磷酸酯(internucleoside phosphate)可被磷酸酯模拟物(phosphatemimetikum)(如硫代磷酸酯或磷酸甲酯或氨基磷酸酯)取代。该随机寡核苷酸优选具有一个疏水部分，但可另外被其他疏水部分取代，但对所述疏水部分彼此独立地选择。

总之，包含如上所公开的本发明聚阴离子化合物连同DNA依赖性热稳定DNA聚合酶，以及至少一对扩增引物的组合物特别有用于实施PCR扩增反应，其原因是所述聚阴离子的存在有效抑制在低于各个扩增引物的退火温度的温度下聚合酶催化的人工扩增产物(如引物二聚体)的形成，因此产生热启动效应。

如果如上所定义的任何组合物进一步包含目标核酸样品，其也在本发明的范围内。所述样品通常可例如含有基因组DNA或片段基因组DNA，以及DNA依赖性DNA聚合酶，或总细胞RNA或聚腺苷酸化(poly-A+RNA)RNA和RNA依赖性DNA聚合酶。

根据本发明的试剂盒

在一具体方面中，本发明还提供制备如上详细公开的组合物的试剂盒。因此，本发明也涉及至少包含DNA聚合酶和具有如下结构的化合物的试剂盒：

[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy]n

其特征在于

3≤m≤6，

30≤n≤60，

每个x和y彼此独立地为0或1，

每个X和Y彼此独立地为可光度测量的实体，

条件是针对每个[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy]单元独立地选择每个m、x和y，进一步的条件是末端X也可为-OH基或磷酸基，进一步的条件是末端Y也可为-H或(CH₂)m-OH基。

优选可光度测量的实体例如为(脱氧-)核苷残基，如脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞嘧啶、脱氧胸苷或脱氧尿苷，或衍生的核苷残基或核苷类似物，在260nm的各个UV吸收测量中可检测到所述实体的存在。因此，在本发明的上下文中，X或Y彼此独立地可不存在或为任选衍生的核苷。在其中X或Y代表化合物的内部部分的情况中，所述X和Y部分优选为(脱氧-)核苷残基，如，脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞嘧啶、脱氧胸苷或脱氧尿苷。

此外，所述试剂盒可包含其他组分，如脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和合适的缓冲液以及用于进行各个引物延伸反应的其他试剂添加剂。此外，参数特异性试剂盒可包含至少一种目标特异性引物寡核苷酸。

另外，所述试剂盒可包含随机5-8聚体寡核苷酸，其特征在于所述寡核苷酸包含如上所公开的具有有机疏水部分的修饰。具体而言，所述疏水部分可为芘。

在第一种具体实施方式中，将所述试剂盒设计用于cDNA合成，其包含如上所公开的逆转录酶。作为引物组分，所述试剂盒可包含参数特异性引物用于特异性cDNA的扩增。

在第二种具体实施方式中，将所述试剂盒设计用于PCR，其包含DNA依赖性热稳定聚合酶或DNA依赖性热稳定聚合酶的混合物。然后所述试剂盒可另外包含例如dNTP和/或缓冲溶液和/或至少一对或多对扩增引物。更具体而言，如果将所述试剂盒设计用于一步RT-PCR，则所述的酶组分可为还具有逆转录酶活性的DNA依赖性热稳定DNA聚合酶。

在第三种具体实施方式中，将所述试剂盒设计用于2步RT-PCR，其可包含选自如上所公开的第一和第二种实施方式组分的组分的各种组合。

此外，根据本发明第二和第三种具体实施方式的试剂盒可包含有用于检测PCR扩增产物的组分。例如，如果将所述试剂盒设计用于实时PCT(＝qPCR)，则这种试剂盒可额外包含双链DNA结合染料组分，如SybrGreen(Roche Applied Science目录号：04 707 516 001)或LC480 ResoLight dye(Roche Applied Science目录号：04 909 640 001)。或者，这种试剂盒可额外包含荧光标记的杂交探针，如TaqMan探针(US 5,804,375)、分子信标(US 5,118,801)、FRET杂交探针(US 6,174,670)或简单探针(WO02/14555)。

根据本发明的方法

本发明不仅涉及组合物和试剂盒，还涉及进行引物延伸反应的通用方法和进行PCR或逆转录反应的具体方法。因此，按其最广义来说，根据本发明的方法包括如下步骤：

-提供怀疑含有所述目标核酸的样品

-加入如上所公开的任何组合物，以及

-至少进行第一引物延伸反应。

更确切而言，根据本发明的方法包括如下步骤：

-提供怀疑含有所述目标核酸的样品

-加入

-DNA聚合酶

-脱氧核苷酸

-至少一种引物寡核苷酸，以及

-包含如下结构的化合物：

[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy]n

其特征在于

3≤m≤6，

30≤n≤60，

每个x和y彼此独立地为0或1，

每个X和Y彼此独立地为可光度测量的实体，

条件是针对每个[X x-(CH₂)m-磷酸基-Yy]单元独立地选择每个m、x和y，进一步的条件是末端X也可为-OH基或磷酸基，更进一步的条件是末端Y也可为-H或(CH₂)m-OH基。

-至少进行第一引物延伸反应。

优选可光度测量的实体例如是(脱氧-)核苷残基，例如脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞嘧啶、脱氧胸苷或脱氧尿苷，或衍生的核苷残基或核苷类似物，在260nm处的各个UV吸收测量中可检测到所述实体的存在。因此，在本发明的上下文中，X或Y彼此独立地可不存在或为任选衍生的核苷。在其中X或Y代表化合物的内部部分的情况中，所述X和Y部分优选为(脱氧-)核苷残基，如，脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞嘧啶、脱氧胸苷或脱氧尿苷。

对化合物的浓度进行选择，以使PCR扩增反应的特异性和产率最优化。优选地，本发明化合物的终浓度为低于0.1mM，以避免特异性目标核酸扩增的任何抑制。同样优选地，本发明化合物的终浓度为超过0.01mM，以便达到实质的热启动效应。

在第一种实施方式中，所述样品是总RNA或聚腺苷酸化RNA，所述DNA聚合酶是逆转录酶，所述引物寡核苷酸是与特定类型cDNA互补的特异性引物。

在第二种实施方式中，所述样品衍生自基因组DNA，所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶的混合物和在PCR扩增反应之前加入的至少一对或多对扩增引物。优选所述核酸扩增反应为根据本领域已知的标准方法实时监测的聚合酶链反应(参见，例如US 5,210,015，US 5,338,848，US 5,487,972，WO 97/46707，WO 97/46712，WO 97/46714)。

在具体实施方式中，通过使扩增产物对随时间的热梯度画图，将生成的扩增产物进行解链曲线分析(US 6,174,670，US 6,569,627)。在这一类型的实验中，监测荧光强度，其由于分别标记的杂交探针的结合或因为从DNA结合染料生成的荧光而产生。然后，将因为杂交探针或扩增子的两条链分别解链而降低的第一衍生物荧光强度对温度梯度绘图。

总之，可指出，本发明方法与本领域已公开的方法相比包含数个优点。在引物延伸反应(如逆转录或PCR或RT-PCR)期间，根据本发明的化合物的存在明显使得各个反应的特异性增加。

本发明方法的一个主要优点是易于使用和在低温下消除聚合酶的抑制的激活时间短。简言之，包含结构[X x-(CH2)m-磷酸根-Yy ]n的化合物，其特征在于3≤m≤6，30≤n≤60，每个x和y彼此独立地为0或1，每个X和Y彼此独立地为任何可光度测量的实体，条件是末端X也可为-OH基或磷酸基，进一步的条件是末端Y也可为需要加至所建立的PCR反应中的-OH基。任选地，随机5-8聚体寡核苷酸表征为所述寡核苷酸包含具有机疏水部分的修饰，可加入该修饰，以便进一步最优化所需热启动效应。

在PCR热循环期间，通常需要将双链DNA模板分离成单链的每个循环之前的变性时间足以从发明化合物中解离Mg²⁺离子。因此，非特异性引物延伸不仅在PCR反应开始之前受到抑制，而且在整个完全热循环过程中受到抑制。

此外，所述本发明化合物可根据本领域充分建立的标准氨基磷酸酯化学方法合成。可在合成具有无限挠性的本发明化合物过程中引入接头亚磷酰胺和核苷残基。因此，与其它热启动溶液相比，本发明PCR添加剂的生产成本相当低。

此外，本发明的方法、组合物和试剂盒可一般用于任何种类的引物延伸、逆转录或PCR扩增，不管应制备、扩增、检测或分析什么具体目标核酸序列。

实施例

实施例1

根据本发明的3种化合物的合成

_X40_化合物：含有8个[C₃-磷酸基]₅单元的化合物，每个单元被胸苷核苷中断，在两端均有另外的胸苷残基。

_X30_化合物：含有6个[C₃-磷酸基]₅单元的化合物，每个单元被胸苷核苷中断，在两端均有另外的胸苷残基。

_X20_化合物：含有4个[C₃-磷酸基]₅单元的化合物，每个单元被胸苷核苷中断，在两端均有另外的胸苷残基(未被本发明所要求的范围涵盖)。

在与寡核苷酸合成相似的条件下，在4倍10μmol比例尺(scle)下在ABI 394合成仪中进行合成。用于标准合成的所有其它化学品得自GlenResearch。用市售的dT CPG作为支持材料dT亚磷酰胺(5’-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧胸苷，3’-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺，间隔基亚磷酰胺C3(3-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)用于固相合成。

标准寡核苷酸合成规程用于合成。在室温下将产物从支持物上用浓氨水切割2h。在MonoQ柱上通过IEX色谱纯化粗制寡聚体(crude oligo)。色谱：缓冲液A：10mM NaOH水溶液，缓冲液B：10mM NaOH 1M NaCl水溶液。测量洗脱液在260nm处的UV吸收。得到含有所需全长产物的主要级分。通过透析去除盐，通过使用旋转蒸发仪去除溶剂。通过测量260nm处的吸收来调节浓度(根据标准程序计算消光系数)。

实施例2

在各种浓度的X40存在下的PCR

在PCR中分析各种浓度的_X40_。在50μl体积含有50ng、25ng、10ng、5ng或1ng人基因组DNA；30mM Tris-HCl，pH 8.6；50mM KCl；1.5mM MgCl₂；0.4μM引物(SEQ.ID.No：1：CTG AGA ATC GGC AAG AGACC和SEQ.ID.No：2CTG CAC AGT AAT GCA TGC CG)；0.2mM脱氧核苷酸和2.5单位的Taq DNA聚合酶中，在存在或不存在_X40_下进行PCR反应。DNA在如下循环条件下扩增：在94℃下起始变性4分钟；并在94℃下变性20秒，在62℃下退火30秒以及在72℃下延伸60秒，进行35个循环。在琼脂糖凝胶上分离扩增产物，通过溴化乙锭染色显现。结果显示于图1中。

不存在添加剂的对照反应显示：随着目标浓度降低，引物二聚体的形成增加。在超过0.1mM_X40_的高浓度的存在下，DNA合成受到抑制。在低于0.1mM或更低浓度的_X40_的浓度下，引物二聚体的形成大大减少。

实施例3

在_X40_、_X30_和_X20_存在下的实时PCR

在实时PCR中分析_X40_、_X30_和_X20_。在存在_X40_(40μM或70μM终浓度)、_X30_(70μM或100μM终浓度)、_X20_(在40μM和100μM之间的各种浓度)或不存在添加剂的情况下进行PCR反应。反应物含有30ng、3ng或0.3ng人基因组DNA；50mM Tris-HCl，pH 8.6；0.2mMCHAPS；1mM BigChap；20mM KCl；3mM MgCl₂；0.5μM每种引物(SEQ.ID.No：3：GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT和SEQ.ID.No：4：GAA TCT CCA TTC ATT CTC AAA AGG ACT)；0.2mM脱氧核苷酸；1∶20000稀释的SYBR Green(Molecular Probes)和2.4单位Taq DNA聚合酶。PCR在

480仪器(Roche Applied Science目录号05015 278 001)上以20μl体积进行，具有如下循环条件：在95℃下起始变性2分钟；并在95℃下变性1秒，在65℃下退火5秒以及在72℃下延伸15秒，进行45个循环。按照制造商的说明书测量解链曲线图形(melting profile)：95℃下持续1秒，60℃下持续30秒，并连续加热至95℃，5个取数(acquisitions)/℃。使用SybrGreen形式(modus)进行实时PCR检测。

解链曲线分析揭示，在不存在添加剂的情况下，形成具有较低解链温度的第二产物。在_X40_或_X30_的存在下，非特异性产物的形成减少，而在_X20_(不受本发明的范围涵盖)的存在下，没有引起减少非特异性产物的形成。

实施例4

X40与芘封闭的六聚体(pyren capped hexamers)的组合作为RT-PCR用添加剂

在包含引物对的一步实时RT-PCR中，测试_X40_与芘封闭的六聚体组合的效应，所述引物对除了特异性产物之外还产生一系列非特异性产物。

反应混合物由以下成分组成：0.5μM每种引物(SEQ.ID.No：5：CCCTCT TCA CCC TGG CTA A和SEQ.ID.No：6：ACC CTC TTC ACC CTGGCT A)；0.2μM dATP；0.2μM dCTP；0.2μM dGTP；0.6μM dUTP；30mM Tris-HCl，pH 8.5；30mM KCl；3mM MgCl₂；0.1mg/ml BSA；0.01％吐温(Tween)；SYBR Green 1∶20000；1.2U Taq DNA聚合酶和0.6单位的转录因子逆转录酶(Roche Applied Science目录号04 379 012 001)。X40以75μM浓度加入。含有添加剂组合的分析混合物含有40μM X40和40μM芘封闭的六聚体。来自HeLa细胞的总RNA用作模板，其分别为：1ng、100pg、10pg和1pg。水用作无模板的对照。RT-PCR在

480仪器(Roche Applied Science目录号05 015 278 001)上以20μl体积进行，具有如下循环条件：在50℃下逆转录10分钟，PCR在95℃下起始变性5分钟；并在95℃下变性10秒，在57℃下退火10秒，在72℃下延伸13秒，进行45个循环。按照制造商的说明书测量解链曲线图形：95℃下持续1秒，40℃下持续10秒并连续加热至95℃，5个取数/℃。

在不存在添加剂下，生成很多非特异性PCR扩增产物。在_X40_的存在下，该产物的数量显著减少，而在_X40_和芘封闭的六聚体组合存在下，仅形成一种特异性扩增产物。

实施例5

实时RT-PCR

为了评估特异性增加是否也能在PCR扩增步骤之前的cDNA合成中观察到，在与一步RT-PCR相近条件建立的反应中进行两步RT-PCR实验。四个反应平行进行：

(a)存在_X40_下进行第一链cDNA合成，不存在_X40_下进行后续PCR，

(b)存在_X40_下进行第一链cDNA合成，存在_X40_下进行后续PCR，

(c)不存在_X40_下进行第一链cDNA合成，不存在_X40_下进行后续PCR，

(d)不存在_X40_下进行第一链cDNA合成，存在_X40_下进行后续PCR。

选择G6PDH正向(SEQ.ID.NO：7：GCA AAC AGA GTG AGCCCT TC)和G6PDH反向(SEQ.ID.NO：8：GGG CAA AGA AGT CCTCCA G)作为当低量RNA存在于RT-PCR反应中时引起非特异性产物形成的引物对。cDNA在20μl反应物中合成，所述反应物含有0.5μM引物；0.6单位的转录因子(Roche Applied Sciences，目录号：03531317001)；30mM Tris.HCl，pH 8.6；3mM MgCl₂；200μM dATP；200μM dGTP，200μMdCTP；600μM dUTP；20mM KCl；0.2mM CHAPSO；1mM BigChap；125ng/ml T4基因32蛋白；最终稀释倍数为1∶20000的SYBR Green和10pg来自HeLa细胞的总RNA。制备两种用于cDNA合成的样品，一种含有100μM _X40_，另一种不含_X40_。反应物在50℃下孵育10分钟，在95℃下孵育2分钟，并在冰上冷冻。然后裂解(splitted)两种反应物，随后PCR在20μl反应体积中进行，使用如cDNA反应混合物中所述的相同缓冲液中的2μl cDNA反应混合物、0.5μM引物、1.2单位的Taq聚合酶，其中所述的反应混合物中存在或不存在额外的_X40_100μM终浓度。将四种不同的反应物在

480仪器(Roche Applied Science目录号05015278001)中在95℃下孵育2分钟；并在95℃/10秒，60℃/10秒以及72℃/13秒，进行45个循环。按照制造商的说明书测定扩增产物的解链曲线图形，如图2a-d所示。在反应中，当cDNA合成和后续的PCR过程中存在_X40_时(图2b)，仅形成一个代表单种产物的解链峰，具有所预期的熔点(melting point)。当在PCR过程中在不存在_X40_下进行cDNA合成时(图2c和2d)，生成具有与特异产物不同的解链温度的树种产物。甚至当_X40_仅存在于cDNA合成过程中，但在后续的扩增过程中不存在(图2a)时，也产生比完全不存在_X40_好的结果。因此，这个结果显示_X40_在PCRDNA扩增过程中以及在RNA逆转录过程中能抑制非特异性产物形成。

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

<120>用于改进的核酸扩增的聚阴离子

<130>25350

<150>08015812

<151>2008-09-09

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>1

ctgagaatcg gcaagagacc 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>2

ctgcacagta atgcatgccg 20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>3

ggaagtacag ctcagagttc t 21

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>4

gaatctccat tcattctcaa aaggact 27

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>5

ccctcttcac cctggctaa 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>6

accctcttca ccctggcta 19

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>7

gcaaacagag tgagcccttc 20

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>单链DNA，引物

<400>8

gggcaaagaa gtcctccag 19

Claims

1、化合物，其包含如下结构：

[Xx-(CH₂)m-磷酸基-Yy]n

其特征在于：

3≤m≤6，

30≤n≤60，

每个x和y彼此独立地为0或1，

每个X和Y彼此独立地为选自如下的实体：核苷残基、(脱氧-)核苷残基、衍生的核苷或(脱氧-)核苷残基和核苷或(脱氧-)核苷类似物，

条件是针对每个[Xx-(CH₂)m-磷酸基-Yy]单元独立地选择每个m、x和y，进一步的条件是末端X也可为-OH基或磷酸基，进一步的条件是末端Y也可为-H或(CH₂)m-OH基。

2、组合物，其包含：

-权利要求1所述的化合物，

-DNA聚合酶，以及

-脱氧寡核苷酸。

3、根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含随机5-8聚体寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含具有有机疏水部分的修饰。

4、试剂盒，其包含：

-权利要求2-3所述的化合物或组合物，

-DNA聚合酶，以及

-脱氧寡核苷酸。

5、根据权利要求4所述的试剂盒，其进一步包含随机5-8聚体寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含具有有机疏水部分的修饰。

6、包括如下步骤的方法：

-提供含有核酸的样品，

-提供权利要求3所述的组合物，

-至少提供第一寡核苷酸引物，

-进行聚合酶催化的引物延伸反应。

7、根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸为RNA，且其中所述DNA聚合酶含有逆转录酶活性。

8、根据权利要求6-7所述的方法，其中所述的聚合酶为热稳定聚合酶，并对所述反应进行实时监测。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对通过所述扩增生成的扩增产物进行解链曲线分析。