KR100454172B1

KR100454172B1 - Ｄｎａ 증폭방법 및 그의 키트

Info

Publication number: KR100454172B1
Application number: KR10-2000-7001507A
Authority: KR
Inventors: 야마모또준꼬; 무까이히로유끼; 히노후미쓰구; 가또이꾸노신
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2004-10-26
Also published as: CN1140632C; EP1004676A4; KR20010022902A; DE69833864T2; JP4104285B2; WO1999009213A1; EP1004676B1; EP1004676A1; CN1274389A; ATE320507T1; DE69833864D1

Abstract

본 발명은 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하는 방법에 있어서, 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체의 존재하 또는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법, 혹은 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법, 및 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하기 위한 키트로서, 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트, 혹은 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트를 제공한다. 본 발명에 의해, 미리 시료중의 RNA 를 정제하지 않고 RNA 유래의 DNA 단편을 증폭할 수 있으므로 실험조작의 간략화 및 재현성의 향상을 가져온다.

Description

ＤＮＡ 증폭방법 및 그의 키트{METHODS FOR DNA AMPLIFICATION AND KITS THEREFOR}

DNA 증폭법, 특히 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 법은 시험관내에서 간편하게 원하는 핵산단편을 증폭하는 기술로서, 현재는 유전자에 관한 연구뿐아니라 생물학, 의학, 농업 등 폭넓은 분야에 불가결한 실험방법이다. PCR 법은 본래 DNA 를 증폭하는 기술인데, RNA 에 대응하는 염기배열을 갖는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 법이 개발되어 있으며, RT-PCR 법으로 불리고 있다. 이 방법은 DNA 폴리머라제의 일종이며, RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성, 즉 역전사 활성을 갖는 역전사 효소, 혹은 역전사 활성을 함께 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 RNA 에 상보적인 DNA 전사물 (cDNA) 을 합성하고, 이어서 이것을 주형으로서 PCR 을 실시함으로써 RNA 유래 cDNA 를 특이적으로 증폭하는 방법이다. RT-PCR 법은 mRNA 유래의 cDNA 의 클로닝이나 라이브러리의 제작에 이용되는 외에 특정한 mRNA 의 발현상태를 조사하는 방법으로서도 유용하다.

그러나 RT-PCR 에 사용되는 RNA 시료중에 DNA 가 혼재하고 있는 경우에는 RNA 를 코딩하고 있는 DNA 상의 영역이나 위유전자가 PCR 의 주형으로 사용된 산물이 동시에 증폭되기 때문에 RNA 를 주형으로 한 증폭산물만을 선택적으로 취득하기는 어렵다. 이 같은 RNA 시료중에 혼재한 DNA 유래의 증폭산물의 생성을 방지하기 위하여 정제된 RNA 를 시료로 사용하거나, 혹은 DNA 분해효소처리 등에 의해 혼재 DNA 를 제거한 시료를 사용할 필요가 있어서 조작이 번잡해진다.

상기 문제를 해결하는 방법으로서 뉴클레오티드 유사체인 dITP 존재하의 역전사 반응에 의해 Tm 값, 즉 융해온도가 낮은 RNA-cDNA 이중가닥 핵산을 합성하고, 나아가 동일한 뉴클레오티드 유사체의 존재하, 저온의 변성온도에서 PCR 반응을 실시하여 시료중에 혼재하는 DNA 에 기인하는 산물의 증폭을 억제하여, RNA 에 상보적인 cDNA 유래의 DNA 단편을 선택적으로 증폭시키는 방법이 제안되어 있다[Nucl. Acids Res. 제 24 권, 제 5021 내지 5025 페이지 (1996)]. 그러나, 이 방법은 증폭되는 염기배열의 GC 함량에 따라 dITP 의 첨가량이나 반응온도를 변화시킬 필요가 있어서 최적 조건을 찾기 힘들다. 또한, 반응성도 만족스럽지 못하며, 표적이 되는 염기배열에 따라서는 선택적 증폭이 일어나지 않는 경우도 있다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 종래기술의 방법의 결점을 극복하여 DNA 의 혼재하에서도 RNA 에 대응하는 염기배열을 갖는 DNA 단편만을 선택적으로 얻을 수 있으며, 또한 범용성, 재현성, 및 검출민감성이 우수한 DNA 증폭방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 상기 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 방법의 문제점 중 하나가 통상의 이중가닥 DNA는 변성시키지 않으면서 뉴클레오티드 유사체가 삽입된 cDNA 와 주형 RNA 로 이루어지는 RNA-cDNA 이중가닥 핵산은 변성시키는 온도조건을 설정하기 어려운 점에 있음을 분명히 했다. 그리고 이 문제가 DNA 증폭반응시에 RNA-cDNA 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물, 예컨대 포름아미드 등을 첨가함으로써 해결된다는 것을 알아냈다.

또한 본 발명자들은 상기 방법에 있어서 합성되는 DNA 사슬 내로의 뉴클레오티드 유사체의 삽입이 표적 RNA 의 염기배열, 특히 GC 함량에 좌우된다는 것이 상기 방법의 또 하나의 문제점이라고 판단하였다. 본 발명자들은 일정한 빈도로 DNA 에 삽입되는 2 종류 이상의 뉴클레오티드 유사체를 반응액에 첨가함으로써 표적 DNA 의 GC 함량에 상관없이 재현성이 탁월하게 DNA 의 증폭이 일어난다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 요지는

[1] 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하는 방법에 있어서, 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체의 존재하 또는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법,

[2] 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하는 방법에 있어서, 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법,

[3] 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하기 위한 키트로서, 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트, 및

[4] 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하기 위한 키트로서, 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트에 관한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 DNA 증폭방법은 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하고, 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하는 방법에 있어서, 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체의 존재하 및/또는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시하는 것을 하나의 커다란 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서 증폭반응의 주형이 되는 DNA 단편은 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응에 의해 제작된 cDNA 가 사용된다. 역전사 반응은 이중가닥 핵산의 Tm 값을 더욱 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시해도 된다.

본 발명의 방법을 적용할 수 있는 RNA 를 포함하는 시료에는 특별히 국한되는 것은 없지만 예컨대 세포, 조직, 혈액과 같은 생체유래시료, 식품, 토양, 폐수와 같은 생물을 함유할 가능성이 있는 시료를 들 수 있다. 또한, 상기 시료 등을 공지된 방법으로 처리함으로써 얻어지는 핵산 함유 제조물이어도 된다. 이 제조물로는 예컨대 세포파쇄물이나 그것을 분획하여 얻어지는 시료, 이 시료중의 전 RNA, 혹은 특정한 RNA 분자군, 예컨대 mRNA 를 부화한 시료 등이 본 발명에 사용된다. 그리고, 이들 시료는 DNA 를 함유하는 것일지라도 공존하는 DNA 의 영향을 받는 일은 없으며, RNA 에 대응하는 DNA 가 선택적으로 증폭된다. 또한 공지된 방법으로 DNA 가 제거된 시료를 사용해도 된다.

본 발명의 방법으로 증폭되는 RNA 로는 특별한 제한은 없으며, 시료중의 전 RNA, mRNA, tRNA, rRNA 등의 RNA 분자군, 혹은 특정한 RNA 분자를 들 수 있는데, 역전사 및 증폭반응에 사용되는 프라이머를 제작하는데 사용될 수 있는 임의의 RNA 를 들 수 있다. 예컨대 이 표적 RNA 의 유무나 그 양의 증감이 특정한 질환을 지시하는 것이라면 본 발명의 방법에 의해 이 질환의 진단을 실시할 수 있고, 또한 미생물에 특이적인 RNA 를 표적으로 함으로써 시료중의 이 미생물의 존재를 검출할 수 있다. 상기 증폭대상의 RNA 의 1 회의 역전사 반응에서의 사용량은 역전사 반응을 실시하는 데 충분한 양이면 되며, 예컨대 감도의 관점에서 바람직하게는 0.1 ㎍ 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 ㎍ 이상이고, 반응저해의 관점에서 바람직하게는 2 ㎍ 이하, 더욱 바람직하게는 1 ㎍ 이하이다.

본 발명에서 표적 RNA 로부터의 cDNA 합성에 사용되는 프라이머는 표적 RNA 에 상보적인 염기배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드이며, 사용되는 반응조건에 있어서 표적 RNA 에 대하여 어닐링하는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 이 프라이머는 올리고 (dT) 등의 올리고 뉴클레오티드나 랜덤한 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드 (랜덤 프라이머) 일 수도 있다.

상기 프라이머의 길이는 특이적인 어닐링을 실시하는 관점에서 바람직하게는 6 뉴클레오티드 이상, 더욱 바람직하게는 10 뉴클레오티드 이상이고, 올리고 뉴클레오티드의 합성의 관점에서 바람직하게는 100 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게는 30 뉴클레오티드 이하이다. 상기 뉴클레오티드는 예컨대 ABI 사 (Applied Biosystems Inc.) 의 DNA 합성기 394 형을 사용하여 포스포아미다이트법으로 합성할 수 있다. 그밖에도 트리포스페이트법, H-포스포네이트법, 티오포스파이트법 등 어떤 방법으로 합성된 것이어도 좋다. 또한, 생물 시료 유래의 올리고 뉴클레오티드여도 되고, 예컨대 이 시료로 제조한 DNA 의 제한효소 절단물에서 단리하여 제작해도 된다. 역전사 반응액 중의 상기 프라이머의 사용량은 표적 RNA 로부터의 cDNA 합성을 실시하는데 충분한 양이면 되고, 합성효율의 관점에서 바람직하게는 0.1 μM 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 μM 이상이고, 반응저해의 관점에서 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 5 μM 이하이다.

또한, DNA 의 증폭반응 (PCR) 에 사용되는 프라이머도 표적 RNA 에 대응하는 cDNA 를 주형으로 하는 DNA 의 증폭에 사용할 수 있다면 특별히 한정되지 않고 상기와 유사한 여러 가지의 올리고 뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 표적 RNA 로부터의 cDNA 합성에 사용되는 프라이머를 DNA 의 증폭반응에 사용해도 된다. PCR 반응액 중의 상기 프라이머의 사용량은 표적 RNA 를 주형으로 하여 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여 이중가닥 DNA 합성을 실시하는데 충분한 양이면 되며, 합성효율의 관점에서 바람직하게는 0.05 μM 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 μM 이상이고, 반응특이성의 관점에서 바람직하게는 2 μM 이하, 더욱 바람직하게는 1 μM 이하이다.

본 발명에서 사용되는 역전사 활성을 갖는 효소로는 RNA 를 주형으로 한 cDNA 합성 활성을 갖는 것이라면 특별한 제한은 없으며, 예컨대 조류 골수아구증 바이러스 유래 역전사 효소 (AMV-RTase), 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스 유래 역전사효소 (MMLV-RTase), 라우스 (Raus) 관련 바이러스 2 유래 역전사효소 (RAV-2-RTase) 등, 여러 가지의 기원의 역전사효소를 들 수 있다. 그밖에 역전사 활성을 함께 갖는 DNA 폴리머라제를 사용할 수도 있고, 예컨대 써무서 써모필루스 (Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제 (Tth DNA 폴리머라제), 바실루스 칼도테낙스 (Bacillus caldotenax) 유래 DNA 폴리머라제 (Bca DNA 폴리머라제) 등을 사용해도 된다. AMV-RTase 또는 RAV-2-RTase 가 바람직하다. 이들 효소는 그 본래의 기원으로부터 정제하여 취득된 것, 혹은 유전자공학적으로 생산된 재조합 단백질 중 어떤것이라도 좋다. 상기 역전자활성을 갖는 효소의 사용량은 역전사 반응을 실시하는데 충분한 양이면 된다.

본 발명의 DNA 증폭방법은 상기 역전사 반응에 의해 생성된 cDNA 를 주형으로 한 DNA 증폭반응을 실시하여 이 DNA 를 증폭하는 것을 하나의 커다란 특징으로 한다. DNA 증폭반응으로는 PCR 법 (일본 특허공보 평4-67957 호, 일본 특허공보 평4-67960 호) 이 바람직하다.

PCR 법에 사용하는 DNA 폴리머라제로는 여러 가지의 내열성 DNA 폴리머라제, 예컨대 써무스 써모필루스 유래 DNA 폴리머라제 (Tth DNA 폴리머라제), 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 유래의 DNA 폴리머라제 (Taq DNA 폴리머라제), 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 유래의 DNA 폴리머라제 (Pfu DNA 폴리머라제) 등의 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있고, 이들 효소는 단독으로 또는 혼합하여 사용해도 된다. 이들 효소는 그 본래의 기원으로부터 정제하여 취득된 단백질, 혹은 유전자공학적으로 생산된 재조합 단백질 중 어떤것이라도 좋다.

또한, 역전사효소로서 상기한 역전사 활성을 함께 갖는 DNA 폴리머라제를 사용한 경우, PCR 반응에서도 다시 동일한 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있어서 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응튜브를 사용하여 실시할 수 있다.

상기 DNA 폴리머라제의 양은 통상 폴리머라제 반응을 실시할 때에 사용되는 양이면 된다.

본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 유사체란 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 이외의 물질로서, RNA 를 주형으로 하는 cDNA 합성반응, 및 이 cDNA 를 주형으로 하는 DNA 증폭반응에서 신규로 합성되는 cDNA 중에 삽입되고, 또한 이 반응을 정지시키지 않는 것이다. 특히, 이것들이 삽입됨으로써 DNA 의 Tm 값을 저하시키는 성질을 갖는 것이 본 발명에 사용된다. 본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 유사체로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 7-데아자(Deaza)-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 히드록시메틸 dUTP 등을 사용할 수 있다.

1 종의 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 cDNA 합성, 및 DNA 증폭에서는 표적이 되는 RNA 의 GC 함량에 의해 뉴클레오티드 유사체의 삽입빈도가 좌우되는 경우가 있다. 예컨대 dITP 는 dGTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되고, 동일한 반응조건하에서는 표적 RNA 의 GC 함량이 높을수록 그 삽입빈도는 높아지는 경우가 있다. 본 발명에서는 적당한 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 조합하여 사용하고, 이들 뉴클레오티드 유사체를 합친 삽입빈도가 표적 RNA 의 GC 함량의 영향을 받지 않도록 함으로써 상기 RNA 에 대응하는 산물의 선택적 증폭이 일어나는 조건을 용이하게 설정할 수 있게 된다.

이 같은 뉴클레오티드 유사체의 조합에는 특별히 한정되는 것은 없지만 균일한 삽입이 일어나도록 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 적절히 조합하여 사용할 수 있다. 예컨대 dATP 혹은 dTTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되는 뉴클레오티드 유사체와 dCTP 혹은 dGTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되는 뉴클레오티드 유사체와의 조합을 본 발명에 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 7-데아자-dATP 와 7-데아자-dGTP 의 조합을 사용할 수 있다.

역전사 반응액 중의 뉴클레오티드 유사체의 함량은 Tm 값을 저하시키는 효과를 충분하게 발휘시키는 관점에서 바람직하게는 50 μM 이상, 더욱 바람직하게는 55 μM 이상이고, 반응효율의 관점에서 바람직하게는 1.5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 200 μM 이하이다. 이 때, dNTP 의 함유량은 각 200 μM 이상, 1 mM 이하인 것이 바람직하다.

PCR 반응액 중의 뉴클레오티드 유사체의 함유량은 Tm 값을 저하시키는 효과를 충분하게 발휘시키는 관점에서 바람직하게는 10 μM 이상, 더욱 바람직하게는 11 μM 이상이고, 반응효율의 관점에서 바람직하게는 1.5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 200 μM 이하이다. 이 때, dNTP 의 함유량은 각 200 μM 이상, 1 mM 이하인 것이 바람직하다.

본 명세서에서「이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물」이란 cDNA 합성 및 DNA 증폭반응시에 기질로서 핵산중에 삽입되는 물질 이외의 것으로서, 그DML 존재하에 이중가닥 핵산, 예컨대 이중가닥 DNA, RNA 와 DNA 로 형성된 RNA-DNA 이중가닥 핵산 등이 단일가닥으로 변성되는 해리온도 (Tm 값) 를 저하시키는 작용을 갖는 것을 의미한다. 이 같은 화합물로는 포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO) 등의 유기용제, 트리메틸글리신으로 대표되는 양전해물질 (베타인류) 을 사용할 수 있다. 특히 포름아미드는 DNA 폴리머라제의 신장활성에 악영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있어 본 발명에 적합하다. 또한, 이들 화합물을 2 종 이상 혼합하여 사용해도 되고, 예컨대 포름아미드와 디메틸술폭시드를 조합하여 사용함으로써 양호한 결과를 얻을 수 있다.

또한, 이 뉴클레오티드 유사체가 1 종일지라도 주형으로 사용하는 RNA 의 종류에 따라서는 GC 함량의 영향을 받지 않는 경우도 있다. 이러한 경우에는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 더욱 저하시키는 화합물을 사용함으로써 보다 양호한 결과를 얻을 수 있고, 이 같은 태양도 본 발명의 범위내이다.

이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 역전사 반응액중의 함유량은 반응저해의 관점에서 바람직하게는 20 중량% 이하이고, 더욱 바람직하게는 10 중량% 이하이다. 또한, PCR 반응시에는 상기 화합물의 PCR 반응액중의 함유량은 Tm 값 저하의 관점에서 바람직하게는 0.5 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 1 중량% 이상이고, 반응저해의 관점에서 바람직하게는 20 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 15 중량% 이하이다.

구체적으로는 포름아미드를 사용하는 경우에는 역전사 반응액 중의 함유량은 반응저해의 관점에서 바람직하게는 20 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 10 중량% 이하이다. 또한 포름아미드의 PCR 반응액중의 함유량은 Tm 값 저하의 관점에서 바람직하게는 1 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 1.5 중량% 이상이고, 반응저해의 관점에서 바람직하게는 20 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 15 중량% 이하이다.

RNA 에서 cDNA 로의 역전사는 표적 RNA 를 포함하는 시료, 이 표적에 상보적인 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드인 프라이머, 4 종의 데옥시뉴클레오티드트리포스페이트, 역전사 활성을 갖는 효소 및 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 반응액중에서 이루어진다. 이 반응에 의해 뉴클레오티드 유사체를 함유하고, 상기 표적 RNA 배열에 대하여 상보적인 염기배열을 갖는 DNA (cDNA) 를 합성할 수 있다. 또한, 얻어진 cDNA 와 표적 RNA 로 형성되는 주형 RNA-cDNA 이중가닥 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 함유하지 않는 이중가닥 핵산에 비하여 Tm 값이 저하되어 있고, 예컨대 뉴클레오티드 유사체를 함유하지 않는 통상의 이중가닥 DNA 에 비하여 낮은 온도에서 단일가닥으로 해리하는 우수한 성질을 발현한다.

다음에, 상기 cDNA 를 주형으로 한 DNA 증폭반응, 예컨대 PCR 을 실시하여 이 cDNA 유래의 DNA 단편을 증폭할 수 있다. 이 때, 상기 주형 RNA-cDNA 이중가닥 핵산은 변성되고, 또한 반응액중에 혼재하는 뉴클레이티드 유사체를 포함하지 않는 이중가닥 DNA 는 변성되지 않는 조건, 예컨대 PCR 에 있어서는 변성공정의 온도를 설정하고, 상기 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 증폭반응을 실시함으로써, cDNA 에 대응하는 DNA 단편, 즉 표적 RNA 에 대응하는 DNA 단편을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 단, 염기배열이나 사슬의 길이가 다른 여러 가지의 RNA 를 표적으로 하는 경우에는 역전사 반응시의 뉴클레오티드 유사체 삽입빈도가 표적 RNA 마다 변동하기 때문에 보편성이 있는 조건설정은 어려운 경우가 있다. 이 같은 경우에는 DNA 증폭반응액에 상기와 같은 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물, 예컨대 포름아미드를 더 첨가함으로써 상기 선택적인 증폭이 일어나는 조건을 용이하게 설정할 수 있게 된다. 예컨대 최종농도 1 중량% 내지 20 중량% 의 포름아미드를 첨가하여 PCR 을 실시할 때에는 변성온도를 80 ℃ 내지 85 ℃ 로 설정함으로써 RNA 에 대응하는 증폭산물만을 얻을 수 있다. 즉 본 발명의 DNA 증폭방법의 태양으로서 DNA 증폭반응액에 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 존재시켜, 혹은 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 존재시켜 실시하지만, 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 유사체와 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함께 존재시키는 태양이다. 이 경우 존재시키는 뉴클레오티드 유사체는 1 종이어도 2 종 이상이어도 된다. 뉴클레오티드 유사체는 PCR 반응액을 제조할 때에 상기 농도가 되도록 첨가한다. 역전사 반응후에 얻어진 용액의 일부를 가지고 PCR 반응액을 제조하는 경우, 필요량의 뉴클레오티드 유사체가 역전사 반응액 중에 함유되어 있으면 그 이외의 성분만을 첨가하여 PCR 반응액으로 하여도 된다.

본 발명의 방법에서는 상기 RNA 를 주형으로 하는 cDNA 의 합성반응, 및 이 cDNA 를 주형으로 하는 DNA 증폭반응을 연속하여 동일한 반응액을 사용하여 실시할수도 있다. 이 경우에는 역전사 활성을 갖는 효소와 PCR 에 사용되는 DNA 폴리머라제가 함께 함유되어 있는 반응액을 사용한다. 이 같은 반응액은 공지된 방법으로 제작하여 사용할 수 있다 [Bio Techniques, 제 18 권, 제 678 페이지 내지 687 페이지 (1995)]. 또한, 역전사 활성을 갖는 내열성 DNA 폴리머라제를 사용함으로써 cDNA 합성반응, DNA 증폭반응을 역전사 반응에 사용한 효소와 동일한 효소로 실시할 수도 있다.

본 발명의 키트는 상기 방법에 사용되는 키트로서, RNA 에 대응하는 염기배열을 갖는 DNA 를 선택적으로 증폭하는 키트이다. 이 같은 키트로는 상기 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체와 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것, 혹은 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것 등을 들 수 있다. 그 중에서도 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체와 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 키트가 특히 바람직하다. 이 키트는 역전사효소활성을 갖는 효소, 이 효소의 반응에 사용하는 반응완충액, DNA 증폭반응에 사용되는 DNA 폴리머라제나 기타 시약을 함유하는 것이라도 된다. 또한, 상기 뉴클레오티드 유사체나 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물은 사용시에 적당한 농도가 되도록 반응용 완충액 등에 첨가된 상태라도 된다. 이 같은 키트를 사용함으로써 DNA 가 혼재하는 RNA 시료로부터 RNA 에 대응하는 염기배열을 갖는 DNA 단편만을 선택적으로 증폭하는 것이 용이하게 이루어지게 된다.

본 발명은 DNA 증폭법, 특히 DNA 의 혼재하에서도 RNA 에 대응하는 염기배열만을 선택적으로 증폭할 수 있는 RT-PCR 법, 및 이 DNA 증폭방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.

다음에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하겠지만 본 발명은 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: RNA, 및 DNA 의 제조

다음의 실험에 사용하는 RNA, 및 DNA 는 인간 배양세포 HL-60 (ATCC CRL-1964), 혹은 인간 배양세포 HT-29 (ATCC HTB-38) 로부터 트라이졸 시약 (라이프텍사 제조) 을 사용하여 이 시약에 첨부된 설명서에 기재된 조작에 따라 각각 제조한다. 인간 배양세포 HL-60 유래의 RNA 의 순도는 OD₂₆₀/OD₂₈₀이 1.8 이상, DNA 의 순도는 OD₂₆₀/OD₂₈₀이 1.7 이상이다. 또한, 인간 배양세포 HT-29 유래의 RNA 의 순도는 OD₂₆₀/OD₂₈₀이 1.8 이상, DNA 의 순도는 OD₂₆₀/OD₂₈₀이 1.7 이상이다.

실시예 2 여러 가지의 RNA 를 표적으로 한 RT-PCR

사슬의 길이나 GC 함량이 다른 mRNA 를 표적으로 한 선택적인 증폭을 시도한다. 표적으로서 트랜스페린 수용체 mRNA 중의 621개의 염기의 영역 (GC 함량 38 %), 사이토케라틴 mRNA 중의 252개의 염기의 영역 (GC 함량 45%), 및 β-액틴 mRNA 중의 275개의 염기의 영역 (GC 함량 58 %) 을 선택한다. 트랜스페린 수용체 mRNA 와 β-액틴 mRNA 의 증폭에는 인간 배양세포 HL-60 유래의 RNA, 사이토케라틴 mRNA 의 증폭에는 인간 배양세포 HT-29 유래의 DNA 를 각각 주형으로 사용한다.

상기 표적을 증폭하기 위한 프라이머로서 트랜스페린 수용체에 대하여 프라이머 P5 및 프라이머 P6 (배열표의 배열번호 : 1 및 2 에 각각 프라이머 P5 및 프라이머 P6 의 염기배열을 나타낸다), 사이토케라틴에 대하여 프라이머 P1 및 프라이머 P2 (배열표의 배열번호 : 3 및 4 에 각각 프라이머 P1 및 프라이머 P2 의 염기배열을 나타낸다), β-액틴에 대하여 프라이머 P7 및 프라이머 P8 (배열표의 배열번호 : 5 및 6 에 각각 프라이머 P7 및 프라이머 8 의 염기배열을 나타낸다) 을 각각 합성한다.

RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2. 1 (타카라슈조사 제조) 을 사용하여 50 ng 의 RNA, 혹은 50 ng 의 DNA 와 상기 키트에 첨부된 올리고 dT 어댑터 프라이머를 포함하는 20 ㎕ 의 역전사 반응액을 제조한다. 기질 뉴클레오티드는 상기 키트 설명서에 기재된대로의 것 (반응액 1), dGTP 를 표 1 조성의 dGTP 와 dITP (베링거·맨하임사 제조) 의 혼합물로 치환한 것 (반응액 2 내지 6, 하기 표 1) 및 반응액 1 에 62.5 μM 씩의 7-데아자-dATP 와 7-데아자-dGTP (모두 베링거·맨하임사 제조) 를 첨가한 것 (반응액 7) 의 7 가지의 조성으로 한다. 이들 반응액을 PCR 서멀사이클러 (Thermal Cycler) 퍼스널 (타카라슈조사 제조) 에 세팅하고, 50 ℃, 20 분 - 5 ℃, 5 분의 역전사 반응을 실시한다.

	dGTP	dITP
반응액 2	1.75 mM	0.25 mM
반응액 3	1.5 mM	0.5 mM
반응액 4	1 mM	1 mM
반응액 5	0.5 mM	1.5 mM
반응액 6	0.25 mM	1.75 mM

이어서 상기 키트를 사용하여 각 표적 mRNA 에 대응하는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 반응액을 제조한다. 또한, PCR 반응액에 대하여 포름아미드를 첨가한것도 준비한다 (각 PCR 반응액중의 포름아미드의 농도는 트랜스페린 수용체에 대하여는 6.25 중량%, 사이토케라틴에 대하여는 7.5 중량%, β-액틴에 대하여는 13.75 중량% 로 한다). 이들의 80 ㎕ 를 상기 역전사 반응후에 얻어진 용액에 첨가하여 총량 100 ㎕ 의 반응액으로 하고, 이것을 PCR 서멀사이클러퍼스널에 세팅하여 82 ℃, 1 분간 - 45 ℃, 1 분간 - 72 ℃, 1 분간을 1 사이클로 하는 30 사이클의 PCR 을 실시한다.

이 같은 방법으로 얻어진 반응액의 8 ㎕ 를 누시브 (NuSieve) 3 : 1 아가로스 (FMC 사 제조) 를 사용한 3 % 아가로스겔 전기영동에 제공한다. 반응종료후의 각 반응액중의 산물의 양은 전기영동후의 아가로스겔을 에티듐 브로마이드 염색한 후, 자외선 조사함으로써 발한 형광의 강도를 비교함으로써 평가한다. 얻어진 결과중, 역전사 반응액에 주형으로서 RNA 를 첨가한 것에 대한 결과를 표 2 에 나타낸다.

표적	역전사 반응액	포름아미드 －	포름아미드 ＋
트랜스페린 수용체	반응액 1	－	＋＋
	반응액 2	－	＋
	반응액 3	－	＋＋
	반응액 4	＋	＋＋
	반응액 5	＋	＋
	반응액 6	－	±
	반응액 7	－	＋＋
사이토케라틴	반응액 1	－	－
	반응액 2	－	－
	반응액 3	－	－
	반응액 4	－	＋
	반응액 5	－	±
	반응액 6	±	±
	반응액 7	－	＋
β-액틴	반응액 1	－	＋＋
	반응액 2	－	±
	반응액 3	－	＋＋
	반응액 4	－	＋＋
	반응액 5	－	±
	반응액 6	－	－
	반응액 7	－	＋＋
－ : 증폭은 관찰되지 않음± : 약간 증폭이 관찰됨＋ : 증폭이 관찰됨＋＋ : 강한 증폭이 관찰됨

포름아미드를 첨가하지 않은 반응계에서 PCR 을 실시한 경우에는 극히 국한된 반응액에서만 약간의 증폭산물이 얻어지는데 비해 포름아미드를 첨가한 반응계에서는 역전사 반응에 반응액 4 를 사용함으로써 어떤 표적 RNA 에 대하여도 증폭산물을 얻을 수 있다. 또한 포름아미드를 첨가한 반응에서는 2 종의 뉴클레오티드를 함유하는 반응액 7 을 사용함으로써 모든 표적 RNA 에 대하여 증폭산물을 얻을 수 있다. 또한 표적이 사이토케라틴인 경우, 뉴클레오티드 유사체를 사용하지 않고 PCR 시에 포름아미드를 첨가하였을 때에는 목적으로 하는 증폭산물을 얻을 수 없다. 그리고, 역전사 반응액에 주형으로서 DNA 를 첨가한 것에서는 반응액의 조성에 상관없이 증폭산물을 얻어지지 않았다.

이러한 관점에서 PCR 시에 포름아미드를 첨가하고 뉴클레오티드 유사체로서어느 일정량의 dITP 또는 7-데아자-dATP 와 7-데아자-dGTP 의 조합을 사용함으로써 여러 가지의 RNA 유래의 DNA 단편을 일정한 온도조건으로 또한 효율적으로 증폭할 수 있음이 확인되었다. 또한 이 조건에서는 DNA 를 주형으로 한 증폭은 일어나지 않는다는 점에서 RNA 를 주형으로 하는 DNA 단편이 선택적으로 증폭됨도 판명되었다.

실시예 3: 뉴클레오티드 유사체의 조합의 비교

인간 트랜스페린 수용체 mRNA 중의 약 2 kb 의 영역을 표적으로서 다음의 실험을 실시한다.

RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2.1 을 사용하고, 인간 HL-60 세포 유래의 50 ng 의 RNA, 혹은 50 ng 의 DNA 와 상기 프라이머 P4 (배열표의 배열번호 : 7 에 프라이머 P4 의 염기배열을 나타낸다), 및 하기에 기재된 뉴클레오티드 유사체를 각각 62.5 μM 의 농도로 함유하는 20 ㎕ 의 역전사 반응액을 제조한다.

반응액 1 : 7-데아자-dGTP

반응액 2 : 7-데아자-dATP

반응액 3 : dITP

반응액 4 : dITP, 7-데아자-dATP

반응액 5 : 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP

이들 반응액을 PCR 서멀사이클러 퍼스널에 세팅하고, 50 ℃, 20 분 - 5 ℃, 5 분의 역전사 반응을 실시한다.

다음에 상기 RNA PCR 키트를 사용하여 프라이머 P4, 프라이머 P9 (배열표의배열번호 : 8 에 프라이머 P9 의 염기배열을 나타낸다) 를 함유하는 PCR 반응액을 제조한다. 이들의 80 ㎕ 을 상기에서 얻어진 역전사 반응후의 용액에 첨가하여 총량 100 ㎕ 의 반응액으로 하고, 이것을 PCR 서멀사이클러 퍼스널에 세팅하여 84 ℃, 1 분간 - 60 ℃, 30 초간 - 72 ℃, 2 분간을 1 사이클로 하는 30 사이클의 PCR 을 실시한다.

얻어진 반응액의 8 ㎕ 을 아가로스 L03 (타카라슈조사 제조) 을 사용한 1 % 아가로스겔 전기영동에 제공하여 실시예 2 와 동일한 방법으로 평가한다. 그 결과, 모든 반응조건에서 RNA 를 주형으로 하는 증폭단편만이 확인되고, 뉴클레오티드 유사체를 1 종만 첨가한 반응계 중에서는 반응액 2 를 사용하였을 때에 가장 높은 증폭효율이 얻어진다. 따라서 사용하는 뉴클레오티드 유사체의 종류에 따라 증폭효율이 다르다는 것이 확인되었다. 또한 2 종의 뉴클레오티드 유사체를 사용한 반응액 4 및 5 는 모두 1 종의 뉴클레오티드 유사체를 첨가한 어떤 반응액 보다 높은 증폭효율이 나타낸다. 또한, 주형으로서 DNA 가 첨가된 반응액에서는 그 조성에 상관없이 증폭산물은 관찰되지 않는다.

실시예 4: 여러 가지의 효소를 역전사 반응에 사용한 RT-PCR

RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2.1 (AMV-RTase), BcaBEST RNA PCR Kit [바실루스·카루도테나쿠스 유래 DNA 폴리머라제 (BcaBEST) 타카라슈조사 제조], MMLV-RTase (라인테크사 제조) 를 사용하여 각각의 효소의 설명서에 준거하여 인간 HL-60 세포로부터 제조한 RNA 500 ng 또는 DNA 250 ng 와 프라이머 P4 를 포함하여 최종농도 62.5 μM 의 7-데아자-dATP, 7-데아자-dGTP 를 첨가한 20 ㎕ 의 역전사 반응액을제조한다. 이들 반응액을 PCR 서멀사이클러 퍼스널에 세팅하고, 다음의 프로그램으로 역전사 반응을 실시한다.

역전사 반응 프로그램

AMV RTase : 50 ℃, 20 분 - 5 ℃, 5 분

BcaBEST : 65 ℃, 1 분 - 30 ℃, 1 분의 반응후, 15 분간에 걸쳐 65 ℃ 로 만들고, 65 ℃, 15 분 - 80 ℃, 2 분 - 5 ℃, 5 분

MMLV-RTase : 42 ℃, 50 분 - 70 ℃, 15 분 - 5 ℃, 5 분

다음에, 얻어진 역전사 반응후의 용액을 사용하여 PCR 반응액을 제조한다. BcaBEST 를 사용하여 역전사 반응을 실시한 경우에는 BcaBEST RNA PCR Kit 를, 그 이외의 역전사효소를 사용한 경우에는 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2.1 사용하여 각 키트의 설명서를 참고로 프라이머 P4 와 P3 (배열표의 배열번호 : 7 및 9 에 각각 프라이머 P4 및 프라이머 P3 의 염기배열을 나타낸다) 을 포함하고, 포름아미드를 더 첨가한 PCR 반응액을 제조한다. PCR 반응액중의 포름아미드 농도는 BcaBEST RNA PCR 키트를 사용한 경우에는 2.5 중량%, RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2.1 을 사용한 경우에는 6.25 중량% 로 한다. 이들 PCR 반응액 80 ㎕ 를 상기 역전사 반응후의 용액에 첨가하여 총량 100 ㎕ 의 반응액으로 하고, 이것들을 PCR 서멀사이클러 퍼스널에 세팅하여 82 ℃, 30 초 - 60 ℃, 30 초 - 72 ℃, 1 분을 1 사이클로 하는 30 사이클의 PCR 을 실시한다.

반응종료후, 반응액에서 8 ㎕ 을 취하여 아가로스 L03 (타카라슈조사 제조) 을 사용한 1 % 아가로스겔 전기영동에 제공하여 실시예 2 와 동일한 방법으로 평가한다. 그 결과, 사용한 효소에 상관없이 주형으로서 DNA 가 첨가된 반응액에서는 증폭단편이 관찰되지 않고, 또한 RNA 가 첨가된 반응액에서는 모두 동일한 사이즈 (964 bp) 의 증폭단편이 관찰되었다.

실시예 5: 1 반응액에 의한 RT-PCR 로의 응용

인간 사이토케라틴 mRNA 중의 252개의 염기의 영역을 표적으로 하여 역전사 반응과 PCR 을 1 반응액 중에서 실시하는 RT-PCR 을 실시한다.

GeneAmp EZ rTth RNA PCR Kit (퍼킨엘마사 제조) 를 사용하여 (1) 이 키트의 명세서에 기재된 조성, (2) 최종농도 300 μM 의 dITP 첨가, (3) 최종농도 150 μM 의 7-데아자-dATP 및 7-데아자-dGTP, 최종농도 2 중량% 포름아미드를 첨가, 의 세가지의 반응액을 제조한다. 각 반응액에는 상기 프라이머 P1 과 프라이머 P2, 인간 HT-29 세포 유래의 RNA 1 ㎍, 및 이 세포 유래의 DNA 0, 50, 100, 200 ng 를 첨가한다. 이들 반응액의 각각에 대하여 PCR 서멀사이클러 퍼스널을 사용하여 다음의 두가지의 조건으로 RT-PCR 을 실시한다.

조건 1 :

역전사 반응 (60 ℃, 30 분간) 1 회

변성 (94 ℃, 2 분간) 1 회

PCR (94 ℃, 30 초간 - 60 ℃, 30 초간 - 72 ℃, 1 분간) 30 회

조건 2 :

역전사 반응 (60 ℃, 30 분간) 1 회

변성 (82 ℃, 2 분간) 1 회

PCR (82 ℃, 30 초간 - 60 ℃, 30 초간 - 72 ℃, 1 분간) 30 회

이 같은 방법으로 얻어진 PCR 반응액의 8 ㎕ 을 누시브 3 : 1 아가로스를 사용한 3 % 아가로스겔 전기영동에 제공하여 생성된 증폭산물을 분석한다. 그 결과 조건 1 에서는 반응액의 조성에 상관없이 RNA 유래의 증폭산물 (251 bp) 과 함께 DNA 유래의 증폭산물 (604 bp) 이 출현하고, 그 증폭량은 첨가된 DNA 의 농도에 의존하고 있다. 조건 2 에서는 (1) 의 반응액에서는 어떤 증폭산물도 얻어지지 않았으나, (2) 및 (3) 의 반응액에서는 RNA 를 주형으로 하는 증폭산물만이 얻어졌다. 이 경우, (2) 의 반응액에 비해 (3) 의 반응액이 높은 증폭효율을 나타낸다.

실시예 6: 포름아미드와 디메틸술폭시드를 병용한 RT-PCR

반응액에 포름아미드만을 첨가한 경우와 포름아미드와 디메틸술폭시드를 병용한 경우의 RT-PCR 에 대한 효과를 비교한다.

표적으로 한 mRNA, 및 그의 증폭에 사용한 프라이머는 다음과 같다. β-액틴 mRNA 중의 275개의 염기의 영역 (GC 함량 58 %) : 프라이머-P7 및 프라이머 P8. 종양괴사인자 (TNF) mRNA 중의 325개의 염기의 영역 (GC 함량 61 %) : 프라이머 P 10 및 프라이머 P11 (배열표의 배열번호 : 10 및 11 에 각각 프라이머 P10 및 프라이머 P11 의 염기배열을 나타냄). 아폽토시스 (apoptosis) 관련 사이토카인인 Mcl mRNA 중의 448의 염기의 영역 (GC 함량 51 %) : 프라이머 P12 및 프라이머 P13 (배열표의 배열번호 : 12 및 13 에 각각 프라이머 P12 및 프라이머 P13 의 염기배열을 나타냄).

일단계 RNA PCR Kit (타카라슈조사 제조) 를 사용하여 이 키트의 설명서에 따라 인간 배양세포 HL-60 유래의 RNA 1 ㎍ 과 상기 각 표적에 대응하는 프라이머를 포함하여 각 100 μM 의 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP 가 첨가된 반응액을 제작한다. 또한 이 반응액 외에 각 반응액에 각각 최종농도 2, 4, 6, 8, 10 중량% 가 되도록 포름아미드를 첨가한 것, 및 포름아미드를 농도 2 중량% 및 디메틸술폭시드를 최종농도 3 중량% 가 되도록 첨가한 것, 계 7 가지의 반응액을 각 표적의 각각에 대하여 준비한다. 이들 반응액을 PCR 서멀사이클러 퍼스널에 세팅하여 다음의 조건으로 RT-PCR 을 실시한다.

역전사 반응 (50 ℃, 20 분간) 1 회

변성 (85 ℃, 2 분간) 1 회

PCR (85 ℃, 1 분간 - 45 ℃, 1 분간 - 72 ℃, 1 분간) 30 회

이 같은 방법으로 얻어진 반응액의 8 ㎕ 을 누시브 3 : 1 아가로스를 사용한 3 % 아가로스겔 전기영동에 제공하여 실시예 2 와 동일한 방법으로 생성된 증폭산물을 분석한다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.

표적	β-액틴	TNF	Mcl
유기용제 무첨가	－	－	－
포름아미드 2 중량%4 중량%6 중량%8 중량%10 중량%	＋＋＋±－	－±＋－－	－＋－－－
포름아미드 2 중량% 및 디메틸술폭시드 3 중량%	＋＋	＋＋	＋＋
－ : 증폭은 관찰되지 않음± : 약간 증폭이 관찰됨＋ : 증폭이 관찰됨＋＋ : 강한 증폭이 관찰됨

표 3 에 나타내는 바와 같이 포름아미드만을 사용하여 양호한 증폭효율을 얻기 위하여는 그 농도를 표적 RNA 마다 조절할 필요가 있는데 비하여 포름아미드와 디메틸술폭시드를 병용한 경우에는 1 종류의 반응액으로 어떤 표적도 효율적으로 증폭됨이 판명되었다.

실시예 7: 키트

본 발명의 DNA 증폭방법에 사용되는 키트로서 다음과 같은 20회 반응분의 키트를 제작한다.

10 ×역전사 반응 완충액 40 ㎕

100 mM Tris-HCl (pH 8.3)

500 mM KCl

100 mM MgCl₂

100 mM DTT

500 μM 7-데아자-dGTP

500 μM 7-데아자-dATP

10 mM dNTP

AMV 역전사효소 (5 U/㎕) 20 ㎕

2 ×PCR 반응완충액 800 ㎕

20 ㎜ Tris-HCl (pH 8.3)

100 ㎜ KCl

5 중량% 포름아미드

5 중량% 디메틸술폭시드

Taq DNA 폴리머라제 (5 U/㎕) 20 ㎕

본 발명은 RNA 유래의 염기배열을 갖는 DNA 의 선택적인 증폭을 가능하게 하는 것이다. 본 발명의 방법을 이용함으로써 미리 시료중의 RNA 를 정제하지 않고 RNA 유래의 DNA 단편을 증폭할 수 있으므로 실험조작의 간략화 및 재현성의 향상을 가져온다.

<110> TAKARA SHUZO CO., LTD <120> METHODS FOR DNA AMPLIFICATION AND KITS THEREFOR <130> 1 <150> JP 97-231885 <151> 1997-08-14 <150> JP 97-305016 <151> 1997-10-21 <160> 13 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 1 ccacagtgtc tgtatcggag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 2 gtttccaact gccctatgac 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 3 cgtctaacag tggaagctga tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 4 catgacttca tacttctgcc tc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 5 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 tccttctgca tcctgtcggc a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 gagactgtga gtagtgacac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 8 ccatcccatc atcttggtac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 9 ctaagaagcg agcactgacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 cagagggaag agttccccag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 ccttggtctg gtaggagacg 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 cggcagtcgc tggagattat c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 tctaggtcct ctacatggaa g 21

Claims

7-데아자(Deaza)-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하는 방법에 있어서, 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하는 방법에 있어서, 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, DNA 의 증폭을 폴리머라제 연쇄 반응법으로 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, DNA 단편이 상기 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응에 의해 제작된 cDNA 인 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
제 4 항에 있어서, DNA 단편이 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응에 의해 제작된 cDNA 인 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, dATP 또는 dTTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되는 뉴클레오티드 유사체 및 dCTP 또는 dGTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되는 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
삭제
삭제
7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하기 위한 키트로서, 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하여 뉴클레오티드 유사체의 존재하에 DNA 를 증폭하기 위한 키트로서, 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP, dITP, 및 히드록시메틸 dUTP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 이중가닥 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 존재하에서 RNA 에 상보적인 cDNA 를 합성하기 위한 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
삭제
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, dATP 또는 dTTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되는 뉴클레오티드 유사체 및 dCTP 또는 dGTP 대신에 DNA 사슬에 삽입되는 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
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