JPH0358785A - 核酸増幅反応の汚染を制御する方法 - Google Patents
核酸増幅反応の汚染を制御する方法Info
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- JPH0358785A JPH0358785A JP2143233A JP14323390A JPH0358785A JP H0358785 A JPH0358785 A JP H0358785A JP 2143233 A JP2143233 A JP 2143233A JP 14323390 A JP14323390 A JP 14323390A JP H0358785 A JPH0358785 A JP H0358785A
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-
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、核酸配列を増幅する方法に関する。
特に、本発明は、その後の増幅方法の実施に悪影響を及
ぼず、核酸増幅方法の実施産物を排除する方法を開示す
る。
ぼず、核酸増幅方法の実施産物を排除する方法を開示す
る。
［従来の技術］
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、変性、プライ
マーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによるプ
ライマーの延長を含む一連の操作を通して特定の核酸配
列を増幅する（ムリンス・ケービー等、アメリカ特許第
４ ．６ ８ ３，２ ０ ２号、アメリカ特許第４，
６８３，１９５号、ムリンス・ケービー、ヨーロッパ特
許第２０１，１８４号、エルリッヒ・エイチ、ヨーロッ
パ特許第５０，４２４号、第８４，７９６号、第２ ５
８，０ １ ７号、第２３７，３６２号、エルリッヒ
・エイチ、アメリカ特許第４，５８２，７８８号、ザイ
キ・アール等、アメリカ特許第４，６８３，２０２号、
ムリンス・ケービー等、コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポジウム、クオンティタティブ・バイオロジー
（ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｓｙｍ
ｐ． ＱｕａｎｔＢｉｏｌ． ）、５１巻２６３頁（１
９８６年）、サイキ・アール等、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、２３０巻Ｉ３５０頁（１９８５年）、ザイキ
・アール、ザイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３１巻
４８７頁（１９８８年）、ロー・イーワイ等、ザイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３巻２１７頁（１９８８年
）参照）（上記引用文献は、引用して本明細書に包含さ
せる。）。これらの段階は何回も反復することができ、
原特定配列のコピー数の大きな増幅をもたらすことがで
きる。Ｉ）ＮＡ．！分子でさえも増幅１，て数百ナノグ
ラムの産生物を産生ずることができる（リー・エイヂ等
、ネイヂャ− （Ｎ ａｔｕｒｅ）、３３５巻４１４頁
（１９８８年））。
マーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによるプ
ライマーの延長を含む一連の操作を通して特定の核酸配
列を増幅する（ムリンス・ケービー等、アメリカ特許第
４ ．６ ８ ３，２ ０ ２号、アメリカ特許第４，
６８３，１９５号、ムリンス・ケービー、ヨーロッパ特
許第２０１，１８４号、エルリッヒ・エイチ、ヨーロッ
パ特許第５０，４２４号、第８４，７９６号、第２ ５
８，０ １ ７号、第２３７，３６２号、エルリッヒ
・エイチ、アメリカ特許第４，５８２，７８８号、ザイ
キ・アール等、アメリカ特許第４，６８３，２０２号、
ムリンス・ケービー等、コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポジウム、クオンティタティブ・バイオロジー
（ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｓｙｍ
ｐ． ＱｕａｎｔＢｉｏｌ． ）、５１巻２６３頁（１
９８６年）、サイキ・アール等、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、２３０巻Ｉ３５０頁（１９８５年）、ザイキ
・アール、ザイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３１巻
４８７頁（１９８８年）、ロー・イーワイ等、ザイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３巻２１７頁（１９８８年
）参照）（上記引用文献は、引用して本明細書に包含さ
せる。）。これらの段階は何回も反復することができ、
原特定配列のコピー数の大きな増幅をもたらすことがで
きる。Ｉ）ＮＡ．！分子でさえも増幅１，て数百ナノグ
ラムの産生物を産生ずることができる（リー・エイヂ等
、ネイヂャ− （Ｎ ａｔｕｒｅ）、３３５巻４１４頁
（１９８８年））。
他の既知核酸増幅方法はコウ・ディー等、プ〔ｌシーデ
インダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
ザイエンシーズ・ユーエスーエイ（ ＩＩ”ｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、８６巻
Ｉ＋７３頁（１９８９年）の転写に基づく増幅システム
を含んでいる。
インダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
ザイエンシーズ・ユーエスーエイ（ ＩＩ”ｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、８６巻
Ｉ＋７３頁（１９８９年）の転写に基づく増幅システム
を含んでいる。
技術用語である「ウラシルＩ） Ｎ Ａクリコシラーゼ
−１（ＵＤＧ）は塩基ウラソルおよび糖デオキンリボー
ス間のグリ：】シト結合を開裂する酵素を意味し、単量
体ヌクレオヂドｄＵＴＰがＩ） Ｎ Ａ分子に相み入れ
られているときだ＋３１デオキシウリジン部分の組み入
れをもたらす（デコカン・ビー、ザ・エンザイｌ，ズ（
Ｔ ｈｅ Ｅ ｎｚｙｍｅｓ）、１４巻５６５頁（１
９８１年）、編集ホイヤー・ピー）。この酵素は遊離ｄ
Ｕ’ＦＰ，遊離デオキンウリジンまたはＲ． Ｎ Ａに
は作用しノ，柔い（デコカノ、前掲）３、Ｐ Ｃ Ｒの
ような増幅方法の１１１、果は、増幅産生物自体かその
後のＩ） Ｃ Ｉ１法の姑質となることがてきることで
ある。さらに、増幅産生物の量か大きくなり得ろノこめ
、実験室の中でのＩ） Ｃ Ｒ反応のようｂ゛反応のご
く小さし）分画の赦乱でざえも、その後の他のサンプル
を増幅ずろ試みの汚染を導くことかあり得ろ。
−１（ＵＤＧ）は塩基ウラソルおよび糖デオキンリボー
ス間のグリ：】シト結合を開裂する酵素を意味し、単量
体ヌクレオヂドｄＵＴＰがＩ） Ｎ Ａ分子に相み入れ
られているときだ＋３１デオキシウリジン部分の組み入
れをもたらす（デコカン・ビー、ザ・エンザイｌ，ズ（
Ｔ ｈｅ Ｅ ｎｚｙｍｅｓ）、１４巻５６５頁（１
９８１年）、編集ホイヤー・ピー）。この酵素は遊離ｄ
Ｕ’ＦＰ，遊離デオキンウリジンまたはＲ． Ｎ Ａに
は作用しノ，柔い（デコカノ、前掲）３、Ｐ Ｃ Ｒの
ような増幅方法の１１１、果は、増幅産生物自体かその
後のＩ） Ｃ Ｉ１法の姑質となることがてきることで
ある。さらに、増幅産生物の量か大きくなり得ろノこめ
、実験室の中でのＩ） Ｃ Ｒ反応のようｂ゛反応のご
く小さし）分画の赦乱でざえも、その後の他のサンプル
を増幅ずろ試みの汚染を導くことかあり得ろ。
本発明（」、天然に産するＤＮＡを増幅産生物から識別
可能と−４゛ろことに３Ｌり一般にインビ１・口核酸増
幅法にお１ｊる改善を表す。したかー・て、上記産生物
は次の増幅反応の開姶１）｛ｊにその後の増ｌｌｌ１．
ｉｊに対ずる鋳型と（７て不活性化さイ１ろ。
可能と−４゛ろことに３Ｌり一般にインビ１・口核酸増
幅法にお１ｊる改善を表す。したかー・て、上記産生物
は次の増幅反応の開姶１）｛ｊにその後の増ｌｌｌ１．
ｉｊに対ずる鋳型と（７て不活性化さイ１ろ。
［発明の構威］
本発明は増幅法の間のＩ．’） Ｎ Ａ才たＬＬ Ｒ
Ｎ Ａの中へエキソサンプルヌクレオチドを組め入れる
方法を含む。本発明（Ｊ、サンプルからの核酸を増幅す
る能力に影響を受ｔｅｌないまま残す処理によって、以
前の増幅生成物を以後の増幅から除去する。この処理（
Ｊ核酸の増幅に関連４゛る主な問題、才なわ１１ ち、以前増幅方法の最終産生物による出発原籾の汚染を
大きく減少させる。言い替えれば、本発明は増幅産生物
に対する識別方法であって、一般に次の１曽幅反応の出
発．ｋり前に行なうもので、天然に見られる核酸を有利
に扱うものである３，さらに具体的に、本発明は特定の
核酸配列の増幅に酵素を利用するインビ１・口製法に関
する。上記製法の１つの例としてポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）が知られている。ＰＣＲ法および他の同様な
方法の重要な制限因子は、それぞれの反応の最終産生で
ある増幅核酸による実験環境の汚染である。」一記汚染
は一般に関心のあるサンプル中に存在することのできる
標準核酸の増幅だ１ノでなく、前の反応の汚染最終産生
物の増幅をももｉコらず。
Ｎ Ａの中へエキソサンプルヌクレオチドを組め入れる
方法を含む。本発明（Ｊ、サンプルからの核酸を増幅す
る能力に影響を受ｔｅｌないまま残す処理によって、以
前の増幅生成物を以後の増幅から除去する。この処理（
Ｊ核酸の増幅に関連４゛る主な問題、才なわ１１ ち、以前増幅方法の最終産生物による出発原籾の汚染を
大きく減少させる。言い替えれば、本発明は増幅産生物
に対する識別方法であって、一般に次の１曽幅反応の出
発．ｋり前に行なうもので、天然に見られる核酸を有利
に扱うものである３，さらに具体的に、本発明は特定の
核酸配列の増幅に酵素を利用するインビ１・口製法に関
する。上記製法の１つの例としてポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）が知られている。ＰＣＲ法および他の同様な
方法の重要な制限因子は、それぞれの反応の最終産生で
ある増幅核酸による実験環境の汚染である。」一記汚染
は一般に関心のあるサンプル中に存在することのできる
標準核酸の増幅だ１ノでなく、前の反応の汚染最終産生
物の増幅をももｉコらず。
本発明は標準核酸の望ましい増幅に影饗しないでこの型
の汚染をできるだけ除去する方法を提供する。
の汚染をできるだけ除去する方法を提供する。
本発明は、増幅が望まれているサンプル中に見られる核
酸中では一般的に欠如しているかまたはまれに１７か存
在しない１つまたはそれ以上のエキ２ ？サンプルヌクレオチトにより、４−）の止笥リボヌク
レオンドトリホスフーｒ． ｌ■ （ｒＮ Ｔ Ｐ
ｓ）まノこはデオキンリホヌクレオノド１・リホスフｒ
． ｌ・（ｄＮＴ ］）Ｓ ）の１つまたはそれ以上
が置換さイ１る、増幅法をまず実施づーることを含む。
酸中では一般的に欠如しているかまたはまれに１７か存
在しない１つまたはそれ以上のエキ２ ？サンプルヌクレオチトにより、４−）の止笥リボヌク
レオンドトリホスフーｒ． ｌ■ （ｒＮ Ｔ Ｐ
ｓ）まノこはデオキンリホヌクレオノド１・リホスフｒ
． ｌ・（ｄＮＴ ］）Ｓ ）の１つまたはそれ以上
が置換さイ１る、増幅法をまず実施づーることを含む。
−Ｌ記増幅方法の間で製造されたＩ） Ｎ ＡまたはＲ
Ｎ Ａ ｆＪサンプル核醗から区別ずることがてきろ
。すなわち、増幅方法の前または次の増幅方法の間にサ
ンプルＩ）ｌ’ＪＡまたはＲＮΔを目的として増幅で産
生じた核酸にたい１，て区別し、その結果ｉ［ｊの増幅
１刀コ核酸（」これ以上増幅することかできないが、サ
ンプルＩＩ） ＮＡまたはＲ Ｎ Ａ ＩＩ増幅し続（
Ｊるようにオろことかできる。
Ｎ Ａ ｆＪサンプル核醗から区別ずることがてきろ
。すなわち、増幅方法の前または次の増幅方法の間にサ
ンプルＩ）ｌ’ＪＡまたはＲＮΔを目的として増幅で産
生じた核酸にたい１，て区別し、その結果ｉ［ｊの増幅
１刀コ核酸（」これ以上増幅することかできないが、サ
ンプルＩＩ） ＮＡまたはＲ Ｎ Ａ ＩＩ増幅し続（
Ｊるようにオろことかできる。
様ｋな核酸増幅方法の発明以来、増幅の前回路の産生物
によりインプソト核酸の汚染を除夫ずる方法を開示した
ものは今まてにない。
によりインプソト核酸の汚染を除夫ずる方法を開示した
ものは今まてにない。
［発明の記載］
ここで使われる用語「増幅」はヌクレオチ１・配列また
（』複数の配列のコピー数を増加する任きのインビＩ・
［１方法を表していろ。核酸増幅ｉｊＤ ＮＡまたはＲ
ＮＡの中へのヌクレオヂドの組み入れをもたらす。
（』複数の配列のコピー数を増加する任きのインビＩ・
［１方法を表していろ。核酸増幅ｉｊＤ ＮＡまたはＲ
ＮＡの中へのヌクレオヂドの組み入れをもたらす。
「ヌクレオチド」は塩基一糖−りん酸塩結合物を表す技
術用語てある。ヌクレオチドは核酸ボリマ、ずなわちＤ
ＮＡおよびＲＮＡの単量体ユニットである。この語はｒ
ＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＧＴＰまたはｒＵＴＰのようなり
ボヌクレオシドトリホスフェートおよびｄＡＴＰＸｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰのようなデオキシリボヌ
クレオシトトリホスフェートを含む。
術用語てある。ヌクレオチドは核酸ボリマ、ずなわちＤ
ＮＡおよびＲＮＡの単量体ユニットである。この語はｒ
ＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＧＴＰまたはｒＵＴＰのようなり
ボヌクレオシドトリホスフェートおよびｄＡＴＰＸｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰのようなデオキシリボヌ
クレオシトトリホスフェートを含む。
「ヌクレオシド」は、塩基一糖結合物、すなわちりん酸
部分を欠失しているヌクレオヂドを表す技術用語である
。ヌクレオンドおよびヌクレオチドという用語の使用に
おいてある種の交換可能性があることが当分野で認めら
れている。例えば、ヌクレオヂドであるデオキシウリジ
ントリホスフェート、ｄＵＴＰはデオキンリボヌクレオ
シドトリホスフェートである。ＤＮＡに組み入られた後
、それはＤＮＡモノマーとして働き、形式的にデオキシ
ウリジレート、すなわちｄＵＭＰまたはデオキンウリジ
ンモノホスフェートである。結果として生ずるＤＮＡ中
にｄＵＴＰ部分がなくても、ＤＮＡの中に（ＩＵＴＰを
組み入れたということができる。同様に、基質分子の１
部分にずぎないとしても、ＤＮＡの中にデオキノウリジ
ンを組み入れたということができる。
部分を欠失しているヌクレオヂドを表す技術用語である
。ヌクレオンドおよびヌクレオチドという用語の使用に
おいてある種の交換可能性があることが当分野で認めら
れている。例えば、ヌクレオヂドであるデオキシウリジ
ントリホスフェート、ｄＵＴＰはデオキンリボヌクレオ
シドトリホスフェートである。ＤＮＡに組み入られた後
、それはＤＮＡモノマーとして働き、形式的にデオキシ
ウリジレート、すなわちｄＵＭＰまたはデオキンウリジ
ンモノホスフェートである。結果として生ずるＤＮＡ中
にｄＵＴＰ部分がなくても、ＤＮＡの中に（ＩＵＴＰを
組み入れたということができる。同様に、基質分子の１
部分にずぎないとしても、ＤＮＡの中にデオキノウリジ
ンを組み入れたということができる。
ここで使われる用語「エキソサンプルヌクレオチド」は
一般に増幅すべきサンプル中に見られないヌクレオヂド
を表している。ほとんどのＤＮＡサンプルでは、デオキ
ンウリジンがエキソサンプルヌクレオチドの例である。
一般に増幅すべきサンプル中に見られないヌクレオヂド
を表している。ほとんどのＤＮＡサンプルでは、デオキ
ンウリジンがエキソサンプルヌクレオチドの例である。
デオキンウリジン｝・リホスフェート型、ｄＵＴＰは代
謝中間体として生物体に存在しているが、ほとんどＤＮ
Ａ中に組み入れられない。ｄＵＴＰが偶然ＤＮＡ中に組
み入れられると、結果として生ずるデオキシウリジンは
例えば酵素ＵＤＧが関与ずる方法のような正常過程によ
りインビトロで索早く除去される。すなわち、デオキン
ウリジンは天然ＤＮＡ中ではほとんどまたは決して存在
しない。ある種の生物体はＤＮＡ中にデオキンウリジン
を自然に組み入れ１５ ることかできることが認められている。これらの生物体
の核酸サンプルではデオキシウリジンはエキソサンプル
ヌクレオチドと考えられない。デオキシウリジンまたは
他のエキソサンプルヌクレオチドの存在は当業者によく
知られた方法により容易に測定することができる。他の
エキソサンプルヌクレオチドも想像することができる。
謝中間体として生物体に存在しているが、ほとんどＤＮ
Ａ中に組み入れられない。ｄＵＴＰが偶然ＤＮＡ中に組
み入れられると、結果として生ずるデオキシウリジンは
例えば酵素ＵＤＧが関与ずる方法のような正常過程によ
りインビトロで索早く除去される。すなわち、デオキン
ウリジンは天然ＤＮＡ中ではほとんどまたは決して存在
しない。ある種の生物体はＤＮＡ中にデオキンウリジン
を自然に組み入れ１５ ることかできることが認められている。これらの生物体
の核酸サンプルではデオキシウリジンはエキソサンプル
ヌクレオチドと考えられない。デオキシウリジンまたは
他のエキソサンプルヌクレオチドの存在は当業者によく
知られた方法により容易に測定することができる。他の
エキソサンプルヌクレオチドも想像することができる。
多くのＤＮＡグリコシラーゼは当業者には知られている
。
。
増幅の間にＤＮＡに組み入れることのできるエキソサン
プルヌクレオチドおよびそれに作用するＤＮＡグリコシ
ラーゼは本発明中で使うことができる。同様に、プロモ
デオキシウリジン（Ｂ ｄｕＲ ）はＤＮＡに組み入れ
得ることが当業者に知られている。ＢｄｕＲを含むＤＮ
Ａは適当な条件下光にさらすことにより分解することが
できる。
プルヌクレオチドおよびそれに作用するＤＮＡグリコシ
ラーゼは本発明中で使うことができる。同様に、プロモ
デオキシウリジン（Ｂ ｄｕＲ ）はＤＮＡに組み入れ
得ることが当業者に知られている。ＢｄｕＲを含むＤＮ
Ａは適当な条件下光にさらすことにより分解することが
できる。
「組み入れる」という用語は、核酸ポリマーの部分にな
っていくことを表す。
っていくことを表す。
「終結する」という用語は、ここでは処理の停止をひき
起こすことを表す。この用語は永久的および条件イ」き
の両方の停止方法を含む。例えば処理■６ が酵素的ならば、永久的熱変性および酵素活性範囲の範
囲外の温度のための酵素活性喪失の両方がこの用語の範
囲内にある。
起こすことを表す。この用語は永久的および条件イ」き
の両方の停止方法を含む。例えば処理■６ が酵素的ならば、永久的熱変性および酵素活性範囲の範
囲外の温度のための酵素活性喪失の両方がこの用語の範
囲内にある。
本発明の方法では、増幅法は、４つの正常リボヌクレオ
シドトトリホスフェート（ｒＮＴＰｓ）またはデオキン
リボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）の１
つまたはそれ以」一がエキソサンプルヌクレオチドで置
きかえられている第１サンプルで実施する。増幅後、残
っている可能性がある汚染増幅産生は、エキソサンプル
ヌクレオチドを含む核酸を実質的に増幅できなくする物
理的、化学的、酵素的または生物学的処理に付ずる。処
理は分割した段階として行なうことができ、または好ま
しくは増幅すべき核酸配列を含む第２サンプルの存在下
でなされることができる。第２サンプルを汚染ずる第ｌ
サンプルから由来した増幅核酸配列は、第２サンプルの
核酸配列の増幅間に実質的にこれ以」二壜幅しない。
シドトトリホスフェート（ｒＮＴＰｓ）またはデオキン
リボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）の１
つまたはそれ以」一がエキソサンプルヌクレオチドで置
きかえられている第１サンプルで実施する。増幅後、残
っている可能性がある汚染増幅産生は、エキソサンプル
ヌクレオチドを含む核酸を実質的に増幅できなくする物
理的、化学的、酵素的または生物学的処理に付ずる。処
理は分割した段階として行なうことができ、または好ま
しくは増幅すべき核酸配列を含む第２サンプルの存在下
でなされることができる。第２サンプルを汚染ずる第ｌ
サンプルから由来した増幅核酸配列は、第２サンプルの
核酸配列の増幅間に実質的にこれ以」二壜幅しない。
デオキシリポヌクレオシドトリホスフェートであるｄ
Ｕ Ｔ ］’は、ここでＰ Ｃ ｒ｛により例示された
酵素的１） Ｎ Ａ増幅製法を都合よく組み人２１るこ
とかでき、それにより、デオキソウリジン−含｛９ １
）ＮＡをもたら゛４−エキソサンプルヌクレオチドの例
である。４−記反応のＤＮＡ産生け曹通多くのウラシル
塩基を含む。天然ＤＮＡおよび生威物てある、増幅法の
デオキシウリジン含有産生物の識別は、ウラシルＤＮＡ
グリコシラーゼ（ＵＤＧ）という酵素で得られる。ウラ
シノｌ川）ＮΔクリコンラーセによるウラシル塩基含有
１） Ｎ Ａの処理はＤＮＡ糖りん酸塩骨核およびウラ
ノル塩基の間のグリコンド結合の開裂をもたらす。ウラ
シルの欠失によりＤＮＡ中に非ピリミノン部位を一ノく
ることにムリ、これが相補ＤＮＡ鎖の合成鋳型として使
用されるＤＮＡ鎖からＤＮＡポリメラーセを遮断４゛る
（シャッパー・アール笠、プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オフ・ザイエンノーズ・
ユーエスエイ（丁’ｒｏｃ． Ｎａｉｌ． Ａｃａｃｌ
． ＳｃｉＵ Ｓ Ａ． ）、第８０巻４８７頁（１９
８３年））。、各ｒ）ＮＡ標的分ｒ中のｊ１ピリミジン
部佇の実質的な数の存／１：は、標的ＤＮＡの１ビーを
合成する＋）Ｎハボリメラーセを使用する増幅法を妨げ
る。
Ｕ Ｔ ］’は、ここでＰ Ｃ ｒ｛により例示された
酵素的１） Ｎ Ａ増幅製法を都合よく組み人２１るこ
とかでき、それにより、デオキソウリジン−含｛９ １
）ＮＡをもたら゛４−エキソサンプルヌクレオチドの例
である。４−記反応のＤＮＡ産生け曹通多くのウラシル
塩基を含む。天然ＤＮＡおよび生威物てある、増幅法の
デオキシウリジン含有産生物の識別は、ウラシルＤＮＡ
グリコシラーゼ（ＵＤＧ）という酵素で得られる。ウラ
シノｌ川）ＮΔクリコンラーセによるウラシル塩基含有
１） Ｎ Ａの処理はＤＮＡ糖りん酸塩骨核およびウラ
ノル塩基の間のグリコンド結合の開裂をもたらす。ウラ
シルの欠失によりＤＮＡ中に非ピリミノン部位を一ノく
ることにムリ、これが相補ＤＮＡ鎖の合成鋳型として使
用されるＤＮＡ鎖からＤＮＡポリメラーセを遮断４゛る
（シャッパー・アール笠、プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オフ・ザイエンノーズ・
ユーエスエイ（丁’ｒｏｃ． Ｎａｉｌ． Ａｃａｃｌ
． ＳｃｉＵ Ｓ Ａ． ）、第８０巻４８７頁（１９
８３年））。、各ｒ）ＮＡ標的分ｒ中のｊ１ピリミジン
部佇の実質的な数の存／１：は、標的ＤＮＡの１ビーを
合成する＋）Ｎハボリメラーセを使用する増幅法を妨げ
る。
ここに例小したように、基礎的／Ｓ増幅プロｌ・コール
はＰ Ｃ Ｒ方法として，Ｌく知られてし）る。Ｐ Ｃ
Ｒは次の３つの方法で修飾さ２］ていろ。（１）ｄＬＪ
′１゛ＰはｄＴＴＰで１ｄ換され、（２）ＵＤＧが最初
のＰ Ｃ Ｒ反応混合物に加えられ、４３よび（３）最
初のインキ，，ベーン−７ン時間が、Ｕ １１） Ｇが
前のＰ Ｃ Ｒ反応のｌ１５染庇生を破壊！Ｉ−るため
に加えられる。ＵＩ）Ｇ自体は最初のＰ Ｃ Ｒザイク
ルでＳ石温により永久的に不活竹化さＵろか、現在望ま
しいＰＣＲブ［ｌ１・コールではユ）名ポリメラーセで
使一）た高温で活性でないかのどららかである。この不
活外化のためにＵ Ｄ Ｇは最近合成されたＰ Ｃ Ｒ
産生物を破壊することができない。Ｕ Ｄ Ｇ活性を除
央１，ない核酸増幅プロトコールは普通別のｔＪ Ｉ）
Ｇ不活性段階を必要とオろ。
はＰ Ｃ Ｒ方法として，Ｌく知られてし）る。Ｐ Ｃ
Ｒは次の３つの方法で修飾さ２］ていろ。（１）ｄＬＪ
′１゛ＰはｄＴＴＰで１ｄ換され、（２）ＵＤＧが最初
のＰ Ｃ Ｒ反応混合物に加えられ、４３よび（３）最
初のインキ，，ベーン−７ン時間が、Ｕ １１） Ｇが
前のＰ Ｃ Ｒ反応のｌ１５染庇生を破壊！Ｉ−るため
に加えられる。ＵＩ）Ｇ自体は最初のＰ Ｃ Ｒザイク
ルでＳ石温により永久的に不活竹化さＵろか、現在望ま
しいＰＣＲブ［ｌ１・コールではユ）名ポリメラーセで
使一）た高温で活性でないかのどららかである。この不
活外化のためにＵ Ｄ Ｇは最近合成されたＰ Ｃ Ｒ
産生物を破壊することができない。Ｕ Ｄ Ｇ活性を除
央１，ない核酸増幅プロトコールは普通別のｔＪ Ｉ）
Ｇ不活性段階を必要とオろ。
エキソサンプルヌクレオヂ｝・を含む核酸に増幅方法に
抵抗性をイ・ｊ−りオる物理的、化学的、酵素的または
生物学的処理の終結が望ましいが（ここに例示した、Ｕ
ｌ） Ｇの熱不活性化のように）、本発明は終結段階
が欠失１，た具体例を含む。例えば出発原粕の予期され
る汚染を除くのに充分高いが増殖速度に張りあうには不
充分な量の酵素４３よび処理時間を使うことができる。
抵抗性をイ・ｊ−りオる物理的、化学的、酵素的または
生物学的処理の終結が望ましいが（ここに例示した、Ｕ
ｌ） Ｇの熱不活性化のように）、本発明は終結段階
が欠失１，た具体例を含む。例えば出発原粕の予期され
る汚染を除くのに充分高いが増殖速度に張りあうには不
充分な量の酵素４３よび処理時間を使うことができる。
すなわち、処理は汚染核酸を破壊することができるが、
増幅方法は、処理が最近合成された核酸を破壊するより
速く新しい核酸を製造し得ることである。
増幅方法は、処理が最近合成された核酸を破壊するより
速く新しい核酸を製造し得ることである。
ここで記載した本発明に様々な変形を考えることができ
る。例えば増幅はエキソサンプルヌクレオチドなしで、
正常ヌクレオヂドを用いてなされる。増幅したＤＮＡの
正常ヌクレオヂドはその後エキソサンプルヌクレオチド
に変換される。変換したｉ．：） Ｎ Ａはその後それ
が後に汚染ケるサンプルから除表する，二とができる。
る。例えば増幅はエキソサンプルヌクレオチドなしで、
正常ヌクレオヂドを用いてなされる。増幅したＤＮＡの
正常ヌクレオヂドはその後エキソサンプルヌクレオチド
に変換される。変換したｉ．：） Ｎ Ａはその後それ
が後に汚染ケるサンプルから除表する，二とができる。
その例は隣りのピリミノン残基、特にチミジンをビリミ
ジンニ量体（ヂミンンニ量体）に変換することで、これ
はＤＮＡを鋳型どして不適当にする。ヂミジン−ｌ量体
はＪ，クソヌクレアーゼ■わよびｒｅｃＢＣのような酵
素２０ により除去され得る。
ジンニ量体（ヂミンンニ量体）に変換することで、これ
はＤＮＡを鋳型どして不適当にする。ヂミジン−ｌ量体
はＪ，クソヌクレアーゼ■わよびｒｅｃＢＣのような酵
素２０ により除去され得る。
実施例
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はヒ１・乳頭腫ウイル
型１ ６（ＨＰＶ ｌ ６）ＤＮＡの１領域を増幅干る
ために実施した（デコルス１・・エム等、プロンーデイ
ンダス・オフ・ザ・ナノヨナル・アカデミー・オブ・ザ
イエンンーズ・ユーエスエイＣＰｒｏｃＮａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第８０巻３８１２頁（
１９８３年））。使用したプライマーの配列（ま５ＧＧ
ＴＣＧＡＴＧ’ｌ”Ａｉ’ＧＴＣＴ’ｌｌ’Ｇ’丁゛Ｔ
Ｇ３および５ ＧＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧ’ｌ’ＧＣＴ
Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ３ である。
型１ ６（ＨＰＶ ｌ ６）ＤＮＡの１領域を増幅干る
ために実施した（デコルス１・・エム等、プロンーデイ
ンダス・オフ・ザ・ナノヨナル・アカデミー・オブ・ザ
イエンンーズ・ユーエスエイＣＰｒｏｃＮａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第８０巻３８１２頁（
１９８３年））。使用したプライマーの配列（ま５ＧＧ
ＴＣＧＡＴＧ’ｌ”Ａｉ’ＧＴＣＴ’ｌｌ’Ｇ’丁゛Ｔ
Ｇ３および５ ＧＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧ’ｌ’ＧＣＴ
Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ３ である。
１｛ＰＶｌ６ＤＮＡは制限酵素Ｂａｍｉ｛Ｉで完全な長
さのプラスミ｝・クローンｐＴ７１’｛ＰＶｌ６から切
り出した（本発明の目的としてンー｝・フ・ケイ等、パ
イ口口シー（Ｖｉｒｏｌ． ）、１４５巻１８１頁（１
９８５年）記載のｐＵＣ８プラスミドと均等）。
さのプラスミ｝・クローンｐＴ７１’｛ＰＶｌ６から切
り出した（本発明の目的としてンー｝・フ・ケイ等、パ
イ口口シー（Ｖｉｒｏｌ． ）、１４５巻１８１頁（１
９８５年）記載のｐＵＣ８プラスミドと均等）。
直！ＩＤＮＡ（１０ピ：１グラノ、）を、５０マイクロ
リッｌ・ルの２５ｍＭ｝リス−１｛ＣｌｐＨ８．３、Ｍ
ｇＣＬ５ｍＭ，ＮａＣ１５ ０ｍＭ，Ｏ．Ｏ ｌ％セラ
チン、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰをそれぞれ０．２
ｍＭ，ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかをＯ。２ｍＭ
，それぞれのプライマーを１マイクロモルおよびテルム
ス・アクアテイクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉ
ｃｕｓ）（シータス／パーキン−エルマー社）からの熱
安定ＤＮＡポリメラーゼ１２．５ユニットを含むＰＣＲ
反応物に加える。反応は次の温度表を使ってザーマルン
ルザー（シータス／パーキン−エルマー社）で増幅した
。９４８Ｃ５分間、その後９４°ＣＩ分を（変性）、５
５℃で２分間（アニーリング）および７２°Ｃ３分間（
プライマー延長）を３０サイクル。温度ザイクル完了後
、７２℃１０分間、最後の延長をした。ＰＣＲ反応産生
物（レイン当り各反応物５マイクロリットル）のアガロ
ース／臭化エヂジウムゲル電気泳動（マニアナイス・テ
ィー等、モレキコラー・クローニンク（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトＩＪ−（１９８２年））テ２ ８
４塩基対ＨＰＶＩ６ＤＮＡフラグメントの増幅を確認し
た。全反応物は実質的増幅を示した。ＨＰＶＩ６ＤＮＡ
のない陰性対照反応ではＤＮＡ産生物は製造されなかっ
た。
リッｌ・ルの２５ｍＭ｝リス−１｛ＣｌｐＨ８．３、Ｍ
ｇＣＬ５ｍＭ，ＮａＣ１５ ０ｍＭ，Ｏ．Ｏ ｌ％セラ
チン、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰをそれぞれ０．２
ｍＭ，ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかをＯ。２ｍＭ
，それぞれのプライマーを１マイクロモルおよびテルム
ス・アクアテイクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉ
ｃｕｓ）（シータス／パーキン−エルマー社）からの熱
安定ＤＮＡポリメラーゼ１２．５ユニットを含むＰＣＲ
反応物に加える。反応は次の温度表を使ってザーマルン
ルザー（シータス／パーキン−エルマー社）で増幅した
。９４８Ｃ５分間、その後９４°ＣＩ分を（変性）、５
５℃で２分間（アニーリング）および７２°Ｃ３分間（
プライマー延長）を３０サイクル。温度ザイクル完了後
、７２℃１０分間、最後の延長をした。ＰＣＲ反応産生
物（レイン当り各反応物５マイクロリットル）のアガロ
ース／臭化エヂジウムゲル電気泳動（マニアナイス・テ
ィー等、モレキコラー・クローニンク（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトＩＪ−（１９８２年））テ２ ８
４塩基対ＨＰＶＩ６ＤＮＡフラグメントの増幅を確認し
た。全反応物は実質的増幅を示した。ＨＰＶＩ６ＤＮＡ
のない陰性対照反応ではＤＮＡ産生物は製造されなかっ
た。
ＰＣＲ増幅産生物の濃度はアガロースゲルから推定した
。新規ＰＣＲ反応物はｄＴＴＰの相み入れから生ずるデ
オキンチミノンまたはｄＵＴＰ含有反応から生ずるデオ
ギンウリジンのいずれかを含む増幅産生物の１０フェン
トクラム量で汚染されていた。陽性対照反応物は直鎖Ｈ
ＰＶＩ６ＤＮＡＩＯピコグラムを含む。新規Ｐ（，Ｒ反
応物はｄＴＴＰのかわりにｄＴＴＰＳＵＤＧ５ナノグラ
ム（ファン・デ・ザンデ・イエー、ユニバーシティー・
オブ・カルガリー、デ，カン・ラボラトリーズ（Ｄｕｃ
ａｎ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アメリカ合衆
国１０３０１ ペンシルバニア、パオリ、イー・セント
ラル・アベニ，− １９番）を含むかまたはＵＤＧなし
であった。全反応物は３７℃１５分間インキユベートし
、デオキシウリジン含有ＤＮＡに対してしてＵＤＧを作
用させ、その後上記と同じ熱ザイクルプロトコール通り
に行う。各反応の一定量をアガロース／臭化エヂジウム
ゲル電気泳動によりｚｌ＋ 分析した。
。新規ＰＣＲ反応物はｄＴＴＰの相み入れから生ずるデ
オキンチミノンまたはｄＵＴＰ含有反応から生ずるデオ
ギンウリジンのいずれかを含む増幅産生物の１０フェン
トクラム量で汚染されていた。陽性対照反応物は直鎖Ｈ
ＰＶＩ６ＤＮＡＩＯピコグラムを含む。新規Ｐ（，Ｒ反
応物はｄＴＴＰのかわりにｄＴＴＰＳＵＤＧ５ナノグラ
ム（ファン・デ・ザンデ・イエー、ユニバーシティー・
オブ・カルガリー、デ，カン・ラボラトリーズ（Ｄｕｃ
ａｎ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アメリカ合衆
国１０３０１ ペンシルバニア、パオリ、イー・セント
ラル・アベニ，− １９番）を含むかまたはＵＤＧなし
であった。全反応物は３７℃１５分間インキユベートし
、デオキシウリジン含有ＤＮＡに対してしてＵＤＧを作
用させ、その後上記と同じ熱ザイクルプロトコール通り
に行う。各反応の一定量をアガロース／臭化エヂジウム
ゲル電気泳動によりｚｌ＋ 分析した。
アガロースゲル分析では、ＵＤＧ処理なしでデオキンウ
リジン含有ＰＣＲ産生物は再増幅することができ、ゲル
電気泳動で明らかなように正常ＨＰＶＩ６ＤＮＡを増幅
することにより得られる産生物から大きさでは区別する
ことのできないＤＮＡ産生物を得ることが示された。デ
オキシウリジン含有ＤＮＡをＰＣＲより前にＵＤＧとイ
ンキユベートする反応でアガロースゲル上で可視産生物
を与えなかった。デオキシチミジンを含むＰＣＲ増幅産
生物はＵＤＧとインキユベートしてもしなくてもうまく
増幅する。この実験はＵＤＧが実質的にデオキシウリジ
ンを含むＰＣＲ産生物の増幅を停止するが、デオキシヂ
ミジンを含むＤＮＡの増幅に実質的に影饗を与えないこ
とを示した。
リジン含有ＰＣＲ産生物は再増幅することができ、ゲル
電気泳動で明らかなように正常ＨＰＶＩ６ＤＮＡを増幅
することにより得られる産生物から大きさでは区別する
ことのできないＤＮＡ産生物を得ることが示された。デ
オキシウリジン含有ＤＮＡをＰＣＲより前にＵＤＧとイ
ンキユベートする反応でアガロースゲル上で可視産生物
を与えなかった。デオキシチミジンを含むＰＣＲ増幅産
生物はＵＤＧとインキユベートしてもしなくてもうまく
増幅する。この実験はＵＤＧが実質的にデオキシウリジ
ンを含むＰＣＲ産生物の増幅を停止するが、デオキシヂ
ミジンを含むＤＮＡの増幅に実質的に影饗を与えないこ
とを示した。
上記は特に好ましい実施例を述べたが、それにより本発
明が制限されるものではないことは理解できる。様々な
修飾は記載した実施態様についてなされ、上記修飾は本
発明の範囲内であることが当業者に理解される。
明が制限されるものではないことは理解できる。様々な
修飾は記載した実施態様についてなされ、上記修飾は本
発明の範囲内であることが当業者に理解される。
Claims (17)
- （１） ａ）核酸配列の増幅の間に第１サンプルの核酸にエキソ
サンプルヌククレオチドを組み入 れ、 ｂ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を実質的に
非増幅性にし、エキソサンプルヌ クレオチドを含まない核酸増幅に実質的に 作用しない処理を第２サンプルの核酸に施 す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染する第１サ
ンプルから由来する増幅核酸配列が第２サンプルの核酸
配列の増幅の間に実質的にこれ以上増幅しないようにす
ることからなる、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅
する方法。 - （２）エキソサンプルヌクレオチドがデオキシウリジン
である請求項１記載の方法。 - （３）処理が物理的、化学的、酵素的または生物学的処
理からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。 - （４）処理が酵素的処理である請求項３記載の方法。
- （５）酵素的処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理
である請求項４記載の方法。 - （６）さらに ｃ）第２サンプルの核酸配列を増幅する 段階を含む請求項１記載の方法。
- （７）さらに ｄ）段階ｂ）の処理を終結させる 段階を含む請求項１記載の方法。
- （８）終結を熱により達成する請求項７記載の方法。
- （９）増幅が、１種の核酸または核酸の混合物（各核酸
は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖を含む）
中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅す
る方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的 なそれぞれのプライマーの延長産生物が合 成されるような条件下で、増幅されている それぞれの異なった特定配列に対する２種 のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の 異なった鎖に充分相補的で相手とハイブリ ダイズし、その結果１種のプライマーから 合成された延長産生物がその相補体から分 離するとき、他方のプライマーの延長産生 物の合成の鋳型として働くように選ばれた ものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合 成される条件下において段階ｅ）のプライマーで段階ｆ
）から発生した一本鎖分子を処理する ことからなる請求項１記載の方法。 - （１０） （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補 的でエキソサンプルヌクレオチドを組み込 んでいるそれぞれのプライマーの延長産生 物が合成されるような条件下で、増幅され ているそれぞれの異なった特定配列に対す る２種のオリゴヌクレオチドプライマーで 処理し、上記プライマーは、それぞれの特 定配列の異なった鎖に充分相補的で相手と ハイブリダイズし、その結果１種のプライ マーから合成された延長産生物がその相補 体から分離するとき、他方のプライマーの 延長産生物の合成の鋳型として働くように 選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合 成される条件下において段階ａ）のプライマーで段階ｂ
）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核 酸配列を増幅し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を実質
的に増幅しなくし、エキソサンプ ルヌクレオチドを含まない核酸の増幅に作 用しない物理的、化学的、酵素的または生 物学的処理を上記第２サンプルの核酸に施 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。 - （１１）エキソサンプルヌクレオチドがデオキシウリジ
ンである請求項１０記載の方法。 - （１２）物理的、化学的、酵素的または生物学的処理が
酵素的処理である請求項１０記載の方法。 - （１３）酵素的処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処
理である請求項１２記載の方法。 - （１４）段階（Ｂ）の間に ｆ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特異核 酸配列の任意のものを増幅する 段階を含む請求項１０記載の方法。 - （１５）さらに段階（Ｂ）の間に ｇ）物理的、化学的、酵素的または生物学的処置を終結
する 段階を含む請求項１０記載の方法。 - （１６）物理的、化学的、酵素的または生物学的処理が
熱により達成される請求項１５記載の方法。 - （１７） （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補 的でデオキシウリジンを組み込んでいるそ れぞれのプライマーの延長産生物が合成さ れるような条件下で、増幅されているそれ ぞれの異なった特定配列に対する２種のオ リゴヌクレオチドプライマーで処理し、上 記プライマーは、それぞれの特定配列の異 なった鎖に充分相補的で相手とハイブリダ イズし、その結果１種のプライマーから合 成された延長産生物がその相補体から分離 するとき、他方のプライマーの延長産生物 の合成の鋳型として働くように選ばれたも のであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合 成される条件下において段階ａ）のプライマーで段階ｂ
）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核 酸配列を増幅し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの鎖上における作用
を熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核 酸配列を増幅し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/360,120 US5035996A (en) | 1989-06-01 | 1989-06-01 | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| US360,120 | 1989-06-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0358785A true JPH0358785A (ja) | 1991-03-13 |
| JPH074248B2 JPH074248B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=23416675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2143233A Expired - Fee Related JPH074248B2 (ja) | 1989-06-01 | 1990-05-31 | 核酸増幅反応の汚染を制御する方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5035996A (ja) |
| EP (1) | EP0401037B1 (ja) |
| JP (1) | JPH074248B2 (ja) |
| AT (1) | ATE127855T1 (ja) |
| CA (1) | CA2017522C (ja) |
| DE (2) | DE69022291T2 (ja) |
| DK (1) | DK0401037T3 (ja) |
| ES (1) | ES2040199T3 (ja) |
| GR (2) | GR920300019T1 (ja) |
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