CN114250278A - 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒。例如，本发明提供了用于捕获、检测和定量成熟小RNA的方法、组合物与试剂盒。所述方法的实施例包括通过将一个5'连接衔接子连接至5'端并且使3'端聚腺苷酸化以对成熟小RNA的5'端和3'端加尾。其他实施例包括通过一个通用反转录引物反转录连接衔接子的聚腺苷酸化成熟小RNA以及通过通用引物扩增cDNA。

Description

捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒
本申请是申请日为2016年3月10日，申请号为201680015631.8，发明名称为“捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒”的申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2015年3月13日提交的美国临时专利申请No.62/133,185的权益，该美国临时专利申请的全部内容完整并入本文作为参考。
技术领域
本教导内容涉及分子及细胞生物学领域，具体地涉及检测目标多核苷酸诸如小RNA种类的领域。
引言
小分子、非编码调控RNA种类诸如微小RNA(miRNA)是一系列丰富的调控元件，已被证明影响植物和动物正常细胞过程的各个方面，包括细胞死亡、分化和增殖。miRNA还涉及许多疾病，包括癌症、心脏病和神经疾病，因此，miRNA被作为诊断和预后生物标志物进行研究。包括miRNA在内的小RNA通过特异性酶复合物由较大的RNA前体产生。一般来讲，成熟miRNA由一段包含20-30个核苷酸的高度保守的核心序列组成，并且通常具有一种5'-末端单磷酸酯和一个3'-末端羟基基团。miRNA通常通过结合至目标mRNA的所述3'-UTR内的靶位点来诱导基因沉默。此交互作用抑制蛋白质合成和/或引发mRNA降解。
检测、定量和分析成熟小RNA诸如miRNA的尝试受到过若干因素的阻碍，其中包括小RNA较小的尺寸以及相关但不同种类之间的相似性。密切相关的miRNA家族成员可能只有一个核苷酸存在差异，因此需要高特异性和区分单一核苷酸错配的能力。
核酸微阵列法已被用于定量成熟小RNA，但是此方法需要高浓度的输入标靶以实现高效杂交。尽管所述较大的前体可以通过PCR进行扩增，但成熟小RNA的所述较小的尺寸妨碍了通过定量或反转录酶聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增。已开发出有利于成熟小RNA的PCR扩增的方法。例如，通过添加至少一个寡核苷酸衔接子延长成熟小RNA。仍然需要一种捕获、检测和分析小RNA的方法，在关于下列属性中的至少一者上改善现有技术：灵敏度、速度、效率和成本效益。
发明概述
本文提供了用于捕获和检测成熟小RNA的方法、组合物与试剂盒。在某些实施例中，本教导内容提供了用于从样本中捕获、检测和定量成熟小RNA诸如微小RNA(miRNA)的方法，该方法包括使所述RNA的3'端聚腺苷酸化、将单链通用衔接子连接至所述RNA的5'端，以及通过通用反转录(RT)引物反转录所述连接衔接子的聚腺苷酸化RNA。所得的反转录产物包含所述成熟小RNA的cDNA以及连接的衔接子，该连接的衔接子在所述5'端具有通用RT引物。此cDNA产物可被捕获和/或检测，或使用添加至所述5'端和3'端两者的通用序列，可使用单配对通用正向和反向引物对cDNA产物进行通用预扩增和/或扩增。在此类扩增反应后，可捕获和/或检测基于所述成熟小RNA的扩增子。在某些实施例中，该目标成熟小RNA为一个miRNA。
在某些实施例中，本文提供了一种用于检测成熟小RNA的方法，该方法包括：对于包含成熟小RNA的样本，使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化并且在单链RNA连接酶存在下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端以形成一个RNA连接产物，其中该衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物以形成该RNA连接产物的一个cDNA产物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物。
在某些实施例中，本教导内容提供了一种用于检测成熟小RNA的方法，该方法包括：对于包含一个成熟小RNA的样本，使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化并且在单链RNA连接酶存在下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端以形成一个RNA连接产物，其中该衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物以形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对预扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过qPCR检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物，其中该qPCR包含一组第二正向和反向引物对，其中所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的一个部分。
在某些实施例中，可使用封闭剂。所述目标多核苷酸的检测可使用诸如所述聚合酶链反应(PCR)等扩增方法进行，所述PCR方法例如定量实时PCR、定量终点PCR和标准PCR。在某些实施例中，所述扩增方法包括使用多磷酸分解作用(APP)反应和多磷酸分解试剂进行活化。
在某些实施例中，本文提供了试剂盒，该试剂盒包含：一个单链衔接子，该单链衔接子包含一个3'末端–OH基团和一个通用正向引物部分；一个反转录(RT)引物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且其中该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；一种单链RNA连接酶；以及一种反转录酶。在某些实施例中，所述反转录酶为一种热启动反转录酶。在某些实施例中，所述试剂盒还包含一种DNA聚合酶以及一个通用正向和反向引物对，其中该通用正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且该通用反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交。
在某些实施例中，提供了组合物诸如反应组合物，该组合物包含：一个单链衔接子，该单链衔接子包含一个3'末端–OH基团和一个通用正向引物部分；一个反转录(RT)引物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且其中该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；一种poly(A)聚合酶；一种单链RNA连接酶；以及一种反转录酶。在某些实施例中，组合物还包含一个成熟小RNA的cDNA，该cDNA包含位于所述5'端的RT引物序列和位于所述3'端的衔接子序列。
某些实施例提供了使用本文所公开的任何方法来鉴定和/或确认可用于疾病检测和监控、治疗选择和监控以及患者诊断和/或预后方法的成熟小RNA生物标志物。
具体地，本申请提供了以下方案：
一种用于检测成熟小RNA的方法，所述方法包括：
提供包含成熟小RNA的样本；
使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成RNA连接产物，其中所述衔接子包含通用正向引物部分；
使用反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物，从而形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分；
使用第一正向引物和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及
通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物。
2.根据方案1所述的方法，其中所述cDNA产物扩增为预扩增步骤。
3.根据方案2所述的方法，其中所述预扩增步骤包含2至14个扩增循环。
4.根据方案1所述的方法，其中所述检测包括使用标记的检测器探针的qPCR，其中所述检测器探针包含特异于所述成熟小RNA的部分。
5.根据方案1所述的方法，其中所述检测包含使用第二正向引物和反向引物对的qPCR，其中所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的部分。
6.根据方案1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化、连接、反转录和扩增步骤在不干扰所述反应产物的纯化的情况下进行。
7.根据方案1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化步骤在所述连接步骤之前进行。
8.根据方案1所述的方法，其中所述连接步骤在所述聚腺苷酸化步骤之前进行。
9.根据方案1所述的方法，其中所述反转录步骤和所述预扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
10.根据方案1所述的方法，其中所述连接步骤和反转录步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
11.根据方案1所述的方法，其中所述连接步骤、反转录步骤和扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
12.根据方案1所述的方法，其中所述成熟小RNA选自由微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复序列相关siRNA(rasiRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)和21-U RNA所组成的组。
13.根据方案1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本选自由单独制备的总RNA、细胞提取物、完整细胞、来自体外转录反应的样本和来自化学合成的样本组成的组。
14.根据方案1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本由生物组织、全血、血清、血浆和尿液组成的组来制备。
15.根据方案1所述的方法，其中所述衔接子为RNA分子。
16.根据方案1所述的方法，所述方法还包括在所述连接和/或扩增步骤中增加封闭寡核苷酸。
17.根据方案16所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸选自由3'-MGB封闭寡核苷酸、5'-MGB封闭寡核苷酸、2'-O-甲基封闭寡核苷酸、3'-吖啶封闭寡核苷酸、5'-吖啶封闭寡核苷酸、STAR封闭寡核苷酸和包含poly(A)序列的封闭寡核苷酸组成的组。
18.一种用于检测成熟小RNA的方法，所述方法包括：
提供包含成熟小RNA的样本；
使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成RNA连接产物，其中所述衔接子包含通用正向引物部分；
使用反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物，从而形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分；
使用第一正向引物和反向引物对预扩增所述cDNA产物以形成扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及
通过qPCR检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物，其中所述qPCR包含第二正向引物和反向引物对，其中所述第二正向引物和所述第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的部分。
19.根据方案18所述的方法，其中所述qPCR还包含标记的检测器探针，所述标记的检测器探针包含特异于所述成熟小RNA的部分。
20.根据方案18所述的方法，其中所述预扩增包括2至14个扩增循环。
21.根据方案18所述的方法，其中所述聚腺苷酸化、连接、反转录和预扩增步骤在不干扰所述反应产物的纯化的情况下进行。
22.根据方案18所述的方法，其中所述聚腺苷酸化步骤在所述连接步骤之前进行。
23.根据方案18所述的方法，其中所述连接步骤在所述聚腺苷酸化步骤之前进行。
24.根据方案18所述的方法，其中所述反转录步骤和预扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
25.根据方案18所述的方法，其中所述连接步骤和反转录步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
26.根据方案18所述的方法，其中所述连接步骤、反转录步骤和预扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
27.根据方案18所述的方法，其中所述成熟小RNA选自由微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复序列相关siRNA(rasiRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)和21-U RNA所组成的组。
28.根据方案18所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本选自由单独制备的总RNA、细胞提取物、完整细胞、来自体外转录反应的样本和来自化学合成的样本所组成的组。
29.根据方案18所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本由生物组织、全血、血清、血浆和尿液组成的组来制备。
30.根据方案18所述的方法，其中所述通用衔接子为RNA分子。
31.根据方案18所述的方法，所述方法还包括在所述连接和/或扩增步骤中增加封闭寡核苷酸。
32.根据方案31所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸选自由3'-MGB封闭寡核苷酸、5'-MGB封闭寡核苷酸、2'-O-甲基封闭寡核苷酸、3'-吖啶封闭寡核苷酸、5'-吖啶封闭寡核苷酸、STAR封闭寡核苷酸和包含poly(A)序列的封闭寡核苷酸所组成的组。
33.一种用于合成和扩增成熟小RNA cDNA的试剂盒，所述试剂盒包含：
单链衔接子，所述单链衔接子包含3'末端–OH基团和通用正向引物部分；
反转录(RT)引物，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，并且其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分；
单链RNA连接酶；
反转录酶；
DNA聚合酶；以及
通用正向引物和反向引物对，其中所述通用正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述通用反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交。
34.根据方案33所述的试剂盒，还包含一种或多种dNTP、ATP、缓冲液和二价阳离子的盐。
35.一种用于检测成熟小RNA的组合物，所述组合物包含：
成熟小RNA的cDNA，所述cDNA包含位于5'端的反转录(RT)引物序列和位于3'端的衔接子序列，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，并且其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分，且其中所述衔接子包含通用正向引物部分；
poly(A)聚合酶，
RNA连接酶1，
和反转录酶。
36.根据方案35所述的组合物，还包含通用正向引物和反向引物对，其中所述通用正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述通用反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交。
37.根据方案36所述的组合物，还包含DNA聚合酶。
附图简略说明
本领域的技术人员将理解，下文描述的附图仅用于举例说明的目的。所述附图并不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。
图1示意性示出根据本教导内容实施例中一者的两端通用加尾成熟小RNA测定的工作流程。
图2A和2B以图形方式示出根据本教导内容实施例之方法的线性动态范围(图2A)和灵敏度(图2B)。
图3以图形方式示出在各种输入RNA量范围下采用预扩增(PA)和不用预扩增(RT)的48次miRNA测定的平均灵敏度之比较。NTC为无模板对照物。
图4以图形方式示出用于检测来自脑部的总RNA制剂中miRNA之测定方法的灵敏度比较。检测方法：TaqManTM Individual MicroRNA测定(金标)；根据本教导内容实施例包含(+PA)和不含(-PA)一个预扩增步骤的两端通用加尾miRNA测定。
图5A-5D以图形方式示出根据本教导内容实施例的方法评估来自脑组织(图5A和5B)和肾组织(图5C和5D)的总RNA中之4种miRNA的线性动态范围和灵敏度。
图6A和6B以图形方式示出根据本教导内容实施例测得的6种组织中miRNA之2倍ΔCt(图6A)和差异(图6B)。
图7A-7B以图形方式示出由两个供体的血清中分离的RNA中5种miRNA的定量结果。miRNA含量根据本教导内容的实施例测得。
图8A-8B以图形方式示出由两个供体的血浆中分离的RNA中5种miRNA的定量结果。miRNA含量根据本教导内容的实施例测得。
图9A-9B以图形方式示出由两个供体的尿液中分离的RNA中5种miRNA的定量结果。miRNA含量根据本教导内容的实施例测得。
具体实施方式
本文提供了利用所述目标RNA诸如成熟小RNA的一个5'末端磷酸酯基团和一个3'末端羟基基团捕获和检测目标RNA的方法、组合物与试剂盒。在某些实施例中，本教导内容提供了用于从样本中捕获、检测和定量成熟小RNA诸如微小RNA(miRNA)的方法，该方法包括使所述RNA的3'端聚腺苷酸化、将一个单链通用衔接子连接至所述RNA的5'末端磷酸酯基团，以及通过一个通用反转录(RT)引物反转录所述连接衔接子的聚腺苷酸化的RNA。所得的反转录产物包含所述成熟小RNA的cDNA以及连接的衔接子，该连接的衔接子在所述5'端具有通用RT引物。此cDNA产物可以被捕获和/或检测，或使用添加至所述5'端和3'端两者的通用序列，可使用单配对通用正向和反向引物对cDNA产物进行通用预扩增(pre-amp)和/或扩增。在此类扩增反应后，可捕获和/或检测基于所述目标RNA的扩增子。在某些实施例中，该目标RNA为一个成熟小RNA。包括聚腺苷酸化、衔接子连接、通用加尾和反转录、通过qPCR的通用预扩增和目标成熟小RNA检测之工作流程的一个非限制性实例如图1所示。在某些实施例中，该目标成熟小RNA为一个miRNA。
在某些实施例中，所述RNA的聚腺苷酸化可能在所述5'衔接子的连接之前进行。在其他实施例中，该5'衔接子至RNA的连接可能在所述聚腺苷酸化之前进行。在某些实施例中，所述连接和反转录步骤在一个单一反应容器中一起进行(1步连接/RT)。在某些实施例中，反转录由一种热启动反转录酶催化。所述单链通用衔接子的连接后消化是任选的，但并非必要。在某些实施例中，不需要后衔接子连接和/或后反转录提取、沉淀和/或净化。在某些实施例中，执行连续反应的所述工作流程，而不需要在反应步骤之间进行提取、沉淀、纯化和/或以其他方式净化所述反应产物或组分。例如，可连续执行聚腺苷酸化、连接和反转录，而不干扰提取、沉淀、纯化和/或其他净化过程。在其他实施例中，可连续执行所述聚腺苷酸化、连接、反转录和预扩增步骤，而不干扰提取、沉淀、纯化和/或其他净化过程。在某些实施例中，聚腺苷酸化、连接和反转录可在相同反应容器中进行。在某些实施例中，聚腺苷酸化、连接、反转录和预扩增可在相同反应容器中进行。在某些实施例中，所述预扩增和扩增步骤在一个单一反应容器中一起进行(1步预扩增/扩增)。
单链衔接子至所述RNA的5'端的连接由单链RNA连接酶(ssRNA连接酶)诸如RNA连接酶I催化。所述单链5'衔接子的连接在不存在连接夹板寡核苷酸或与该衔接子和所述RNA的5'端两者杂交的其他序列的情况下进行。在某些实施例中，该单链衔接子为一个RNA分子。在该方法的某些实施例中，一个单链RNA通用衔接子被连接至所述成熟小RNA的5'末端磷酸酯基团并且此RNA连接产物的3'末端被聚腺苷酸化。在一些实施例中，所述RNA样本(所述输入RNA)的5'端在所述5'衔接子的连接之前未经修饰。在某些实施例中，该输入RNA未经处理以去除可能存在于所述5'末端的帽子结构或三磷酸酯。
通过使成熟小RNA分子聚腺苷酸化，包含一个poly(T)部分的单个引物被用作通用反转录(RT)引物并且由所述样本中目标多核苷酸的所有cDNA共享。通过使用各自具有通用引物部分的通用5'连接衔接子和通用RT引物，可采用一组通用引物对预扩增和/或扩增(例如，通用正向引物和通用反向引物)已经由所述衔接子和RT引物修饰的成熟小RNA cDNA分子。
所述5'连接衔接子序列至所述成熟小RNA的连接有利于合成连接至所述衔接子之成熟小RNA的一个全长cDNA。对于连接至所述RNA的5'端的衔接子，继续反转录反应以复制所述成熟小RNA的5'末端的完整序列。因此，在某些实施例中，本文所提供的方法和工作流程用于检测所述目标成熟小RNA的5'末端碱基。在一些实施例中，本文所提供的方法和工作流程可区分所述目标成熟小RNA的5'末端异构体。
在某些实施例中，所述5'连接衔接子包含有利于cDNA或扩增产物进入新一代测序(NGS)工作流程中的序列。在一些实施例中，所述5'连接衔接子包括至少一个条形码、识别码或地址序列，能够捕获、排序或以其他方式进一步处理所述cDNA或扩增产物。
在某些实施例中，所述通用RT引物包含有利于所述cDNA或扩增产物进入新一代测序(NGS)工作流程中的序列。在一些实施例中，所述通用RT引物包括至少一个条形码、识别码或地址序列，能够捕获、排序或以其他方式进一步处理所述cDNA或扩增产物。
在某些实施例中，可能使用封闭寡核苷酸。在某些实施例中，在所述连接和/或预扩增步骤中可能使用封闭寡核苷酸。所述目标多核苷酸的检测可使用诸如所述聚合酶链反应(PCR)等扩增方法进行，所述PCR方法例如定量实时PCR、定量终点PCR和标准PCR。
在某些实施例中，包含一个目标RNA诸如成熟小RNA的所述样本可能为一种总RNA制剂、一个细胞或一种组织提取物、一种生物流体(例如，血清)、一个完整细胞、一次体外转录反应或一种化学合成。本文所提供工作流程的实施例特别适用于检测以低丰度存在和/或以低水平表达的成熟小RNA种类，并且适用于分析来自较小的、稀有的和/或有限的生物样本的这种RNA。例如，本文所提供的方法用于检测和/或定量来自组织活检、福尔马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织(FFPE)、血清、血浆和尿液之RNA制剂中的成熟小RNA。如下文所述，本文提供的方法在利用相对较低的拷贝数检测和定量RNA样本中的miRNA方面表现出高灵敏度和特异性。
在某些实施例中，本文提供的方法、组合物与试剂盒用于检测和/或定量生物样本中成熟小RNA的表达。在一些实施例中，本文提供的方法、组合物与试剂盒用于鉴别和/或确认用于疾病检测和监控的小分子成熟RNA生物标志物。本文提供的方法用于筛选来自不同健康状况、年龄或其他条件下的个体或群体的RNA样本中的所述潜在miRNA生物标志物。
本文提供的方法与组合物非常适合用于高通量样本制备和分析。例如，总RNA样本中miRNA的两端通用加尾能够生成反映所述RNA样本中的miRNA群体并且可以被测定以鉴定和/或定量RNA样本中miRNA种类的单一cDNA或预扩增产物。在一些实施例中，所提供的方法可同时用于大量RNA样本，诸如在高通量处理中。在某些实施例中，所述工作流程中所用的反应容器为96孔板。在某些实施例中，所述工作流程中所用的反应容器为384孔板。
在某些实施例中，所提供的方法还适合检测和/或定量相同RNA样本中的成熟小RNA及其他类型RNA诸如mRNA的表达。如本文所述，可在所述连续聚腺苷酸化、连接、反转录和/或扩增反应之间未采用提取或纯化的情况下执行所述工作流程。因此，包含所述成熟小RNA cDNA产物或扩增产物的反应混合物还包含在所述工作流程开始时存在于样本中的RNA。例如，在所述反转录步骤或预扩增步骤后，可移除该反应的一部分并且用以检测和/或定量另一种目标RNA诸如mRNA的表达。利用用于检测和/或定量两种类型RNA的所述工作流程的反应混合物能够在来自相同原始样本的所述成熟小RNA和mRNA的表达之间建立关联。这样可能有利于分析较小的和/或有限的RNA样本或源材料。
描述了延长微小RNA之长度的方法，该方法包括：使所述3'端聚腺苷酸化、反转录所述聚腺苷酸化的miRNA以形成cDNA，以及使用一个互补的夹板寡核苷酸通过双链连接酶将寡核苷酸衔接子连接至微小RNA cDNA的所述3'端。从包含完整一个RNA转录组的样本开始时，双链连接法捕获包括微小RNA、ncRNA、rRNA、mRNA和piRNA的RNA的整体混合物，并且导致连接的制剂具有高复杂性，不便于随后的检测和定量。相比之下，本文提供的方法使用一种单链RNA连接酶，仅连接至具有单磷酸化5'端的RNA分子，排除了5'加帽mRNA和5'-三磷酸化RNA。在本文提供的工作流程中使用一种单链RNA连接酶将总体目标连接效率从不到10％(采用双链连接法)提升至50％以上并且减小了连接副产物背景。因此，使用本文提供的方法与组合物降低了捕获的用于检测和定量的产物之复杂性。当捕获小RNA时，使用衔接子与夹板寡核苷酸一起生成双链连接需要上千个不同的夹板寡核苷酸或序列以确保与所述靶向小RNA的序列互补性。相比之下，在本文提供的方法中，连接过程中无需使用夹板寡核苷酸。
使用本文提供的通用引物和扩增工作流程具有下列一个或多个优点：1)允许一种单重反应；2)减小连接和扩增中的目标特异性偏差；3)消除目标特异性引物诸如小RNA特异性引物的固定或自定义池；4)消除靶位数限制；5)无需基于新发现的成熟小RNA种类进行设计更新；6)无需对小RNA特异性引物池进行开发和验证；7)简化生产过程，因为只需一组通用引物即可扩增目标RNA诸如小RNA的群体。此外，此系统能够提高目标特异性引物设计和探针设计的灵活性，因为可通过诸如实时PCR等测定方法直接检测所述目标RNA诸如成熟小RNA。此外，能够执行连续反应而不干扰净化过程的能力提供了下列优点：1)简化工作流程；2)缩短获得结果所需的时间；3)缩短手动操作时间；和4)减小测定之间的变异。
在某些实施例中，本教导内容提供一种用于检测样本中miRNA的方法，该方法包括：使所述miRNA的3'端聚腺苷酸化并且将一个单链通用衔接子连接至该miRNA的5'端；使用一个通用反转录(RT)引物反转录所述连接衔接子的聚腺苷酸化的miRNA，由此形成一个cDNA产物，其中该通用RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分，该尾巴部分包含一个通用引物部分；使用一对通用正向和反向引物扩增所述cDNA连接产物；以及通过PCR检测所述目标miRNA。在某些实施例中，本教导内容提供一种用于检测样本中miRNA的方法，该方法包括：使所述miRNA的3'端聚腺苷酸化并且将一个单链通用衔接子连接至该miRNA的5'端；使用一个通用反转录(RT)引物反转录所述连接衔接子的聚腺苷酸化的miRNA，由此形成一个cDNA产物，其中该通用RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分，该尾巴部分包含一个通用引物部分；以及通过PCR检测所述目标miRNA。所述目标多核苷酸的检测可使用诸如所述聚合酶链反应(PCR)等扩增方法进行，所述PCR方法例如定量实时PCR、定量终点PCR和标准PCR。
在某些实施例中，提供的组合物包含一个封闭寡核苷酸以阻断连接衔接子-引物的副产物的形成和/或扩增。在某些实施例中，所述封闭寡核苷酸为DNA。在某些实施例中，所述封闭寡核苷酸为RNA。在某些实施例中，所述封闭寡核苷酸包含一个poly(A)部分。在某些实施例中，所述封闭寡核苷酸包含一种封闭剂，该封闭剂包括但不限于2'-O-甲基吖啶、一种小沟结合物(MGB)和一种嵌入染料化合物。
为了更清晰并简明地描述和指出本发明的主题，提供以下描述和所附权利要求书中所用特定术语的以下定义。贯穿本说明书，特定术语的举例说明应该被视为非限制性实例。
除非另外确切地明，否则如本说明书所使用，词语“一个(a/an)”意指至少一个。在本说明书中，除非另外确切地说明，否则单数的使用包括复数。举例来说，但不是作为限制，“一种目标核酸”意指可以存在一种以上目标核酸；举例来说，一个特定目标核酸种类的一个或多个拷贝以及两个或两个以上不同的目标核酸种类。术语“和/或”意指在斜线之前和之后的术语可以连在一起或单独的。为了说明，但不是作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或“X”和“Y”。
应了解，在本发明中讨论的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得微小并且非实质的偏差在本文教导内容的范围内。此外，“包括”、“含有”和“包含”的使用并非旨在进行限制。应理解，以上一般描述和以下详细描述两者仅是示例性和解释性的并且并不限制本教导内容。
除非在以上说明书中专门指出，否则在以上说明书中叙述“包含”各种组分的实施例也涵盖“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；在说明书中叙述“由”各种组分“组成”的实施例也涵盖“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；以及在说明书中叙述“基本上由”各种组分“组成”的实施例也涵盖“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(这种互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。
如本文中所用的术语“或其组合”是指在所述术语前面所列术语的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下各项中的至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情况下顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续此实例，明确地包括含有一或多个项目或术语之重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域的技术人员将理解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语之数量的限制。
本文所用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所要主题。本说明书中引用的所有文献，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍以及论文，全都出于任何目的以其全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入的任何文献与本说明书中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各种实施例描述本教导内容，但是并非旨在将本教导内容限制于此类实施例。相反，本领域的技术人员应当了解，本教导内容涵盖各种替代方案、修改以及等效形式。
术语“退火(annealing)”和“杂交(hybridizing)”包括(但不限于)词根“杂交(hybridize)”和“退火(anneal)”的变体，可互换地使用并且意指一个核酸与另一个核酸的核苷酸碱基配对相互相用，所述相互作用促使形成双螺旋体、三螺旋体或其他更高的有序结构。根据Watson-Crick和Hoogsteen型氢键结，初级相互相用通常具有核苷酸碱基特异性，例如A:T、A:U和G:C。在某些实施例中，碱基堆积和疏水性相互作用也可以促成双螺旋体稳定性。引物和探针退火到互补序列的条件在本领域中是众所周知的，例如以下文献所述：Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,Hames and Higgins,eds.,IRLPress,Washington,D.C.(1985)and Wetmur and Davidson,Mol.Biol.31:349(1968)(《核酸杂交的实用方法》，Hames和Higgins编,IRL出版社,华盛顿哥伦比亚特区(1985年)；以及Wetmur和Davidson,《分子生物学》，第31卷：第349页(1968年))。
一般来讲，此类退火是否进行尤其受以下因素的影响：是否发生此类退火受到多核苷酸的长度和互补性、pH、温度、一价和二价阳离子的存在情况、杂交区域中G和C核苷酸的比例、培养基的粘度以及变性剂的存在情况。所述变量影响杂交所需的时间。因此，优选的退火条件将取决于特定应用而定。然而，在无过度实验的情况下，所述条件可以常规地由本领域的普通技术人员决定。应当理解，互补性不一定是完美的；可存在少量的碱基对错配，这些错配对本教导内容的目标序列与所述单链核酸之间之杂交的干扰极小。然而，如果碱基对错配的数量非常高以至于在最不严格的条件下不发生杂交，则该序列通常并非互补的目标序列。因此，本文所述的“互补性”意指探针或引物在选定的反应条件下与所述目标序列充分互补以实现本教导内容的目的。优选地，选择以下退火条件：允许所述引物和/或探针选择性地与对应目标旁侧序列或扩增子中的互补序列杂交，但不在第二反应温度下与所述反应组合物中的不同目标核酸或非目标序列杂交达到任何显著程度。
如本文中所用的术语“小沟结合物”或“MGB”是指有时以序列特异性方式嵌入双链DNA的小沟中之小分子。一般来讲，小沟结合物是又长又平的分子，该分子可以采用新月状形状并且因此紧贴地嵌入双螺旋的小沟中，通常转移水。小沟结合分子通常包含若干个通过扭转自由的键连接的芳环，例如(但不限于)呋喃、苯或吡咯环。
如本文中所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换地使用并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物以及相关抗衡离子连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，所述抗衡离子例如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。多核苷酸的大小通常从几个单体单元到几千个单体核苷酸单元不等，例如5-40，当它们有时在本领域中被称为寡核苷酸时。除非另外指出，否则每当呈现多核苷酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。
术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是连接在戊糖的C-5位置的羟基。
术语“核苷”是指由连接到戊糖(包括2'-脱氧和2'-羟基形式)的1'位置的嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱基组成的化合物，所述碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟苷等。当核苷碱基是嘌呤或7-脱氮嘌呤时，所述戊糖连接到嘌呤或脱氮嘌呤的9位核碱基，并且当核碱基是嘧啶时，戊糖连接到嘧啶的1位核碱基。
术语“类似物”包括具有修饰碱基部分、修饰糖部分和/或修饰磷酸酯部分的合成部分。磷酸酯类似物一般包含其中磷原子呈+5氧化态并且氧原子中的一或多个被非氧部分例如硫置换的磷酸酯类似物。示例性磷酸酯类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯、二羟硼基磷酸酯，包括相关抗衡离子，例如H+、NH4+、Na+。示例性碱基类似物包括：2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-硫代嘧啶。示例性糖类似物包括：2'修饰或3'修饰，其中2'位或3'位是氢、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基和苯氧基)、叠氮基、氨基或烷基氨基、氟、氯和溴。
如本文所用，术语“目标多核苷酸”是指欲检测的多核苷酸序列。所述目标多核苷酸可以从任何来源获得，并且可以包含任何数量的不同组成性组分。举例来说，所述目标可以是核酸(例如，DNA或RNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或其他成熟小RNA，并且可以包含核酸类似物或其他核酸模拟物。所述目标可以经甲基化、非甲基化或两者。所述目标可以是经亚硫酸氢盐处理和非甲基化的被转化为尿嘧啶的胞嘧啶。此外，应了解“目标多核苷酸”可以指所述目标多核苷酸本身以及其代替物例如扩增产物以及天然序列。在某些实施例中，所述目标多核苷酸为一个miRNA分子。在某些实施例中，所述目标多核苷酸不含poly-A尾巴。在某些实施例中，所述目标多核苷酸为一个成熟小RNA分子。本教导内容的所述目标多核苷酸可从任何数量的来源中获得，包括但不限于病毒、古细菌、原生生物、原核生物和真核生物，所述真核生物例如但不限于植物、真菌和动物。这些来源可以包括但不限于全血、血浆、血清、组织活检、福尔马林固定的石蜡包埋组织、淋巴、骨髓、羊水、毛发、皮肤、精液、尿液、生物战剂、肛门分泌物、阴道分泌物、汗液、唾液、口腔拭子、各种环境样本(例如，农业、水和土壤)、一般研究样本、一般经纯化样本、经培养细胞以及溶解细胞。应当理解，目标多核苷酸可以使用本领域中已知的各种程序中的任一种从样本中分离，所述程序例如AmbionTM mirVanaTM miRNA分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))、AmbionTM mirVanaTM PARISTM RNA纯化试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))、AmbionTM MagMAXTM mirVanaTM总RNA分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))、AppliedBiosystemsTM TaqManTM MicroRNA Cells-to-CTTM试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Inc.))、Applied BiosystemsTM TaqManTM miRNA ABC纯化试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))等。应当理解，目标多核苷酸可以在分析之前进行切割或剪切，包括使用以下程序：例如机械力、超声处理、限制性核酸内切酶裂解或本领域中已知的任何方法。一般来说，本教导内容的所述目标多核苷酸将是单链，但是在一些实施例中，该目标多核苷酸可以是双链，并且单链可以由变性产生。
如本文所用，术语“成熟小RNA”是指通常包含约20-30个核苷酸的小RNA分子，由较大的RNA前体处理得到。通常，一个成熟小RNA具有一个5'末端磷酸酯基团和一个3'末端羟基基团。利用本文提供的方法可以检测多种不同类型的小RNA分子。可以检测的成熟小RNA的实例包括但不限于微小RNA(miRNA)、短(或小)发夹RNA(shRNA)、重复序列相关siRNA(rasiRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)和21U RNA。所述小RNA可在基因组中编码或可来源于一个外生双链RNA分子。可利用本文所述的方法进行检测的所述成熟小RNA的长度可以改变。在某些实施例中，所述成熟小RNA的长度可以在约10至约50个核苷酸的范围内。在某些实施例中，所述成熟小RNA的长度可以在约15至约35个核苷酸的范围内。在其他实施例中，所述成熟小RNA的长度可以为约17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸。
加入所述连接反应或聚腺苷酸化反应的样本中之成熟小RNA的量可根据包含RNA样本的来源而改变。一般来讲，可连接至一个5'衔接子的任何量的成熟小RNA可用于连接步骤中，并且可聚腺苷酸化的任何量的成熟小RNA可用于聚腺苷酸化步骤中。通常，单位反应体积所用的经纯化的成熟小RNA的量小于单位反应体积所用的总RNA的量。在某些实施例中，总RNA的量在约100ng至约20pg的范围内。在某些实施例中，总RNA的量在约100ng至约2.5ng的范围内。
如本文所用，术语“衔接子”和“连接衔接子”为等同形式并且互换使用，它们是指连接至所述成熟小RNA的5'端的一个寡核苷酸(即，5'连接衔接子)。所述5'连接衔接子的核苷酸可为标准或天然核苷酸(即，腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)以及非标准核苷酸。非标准核苷酸的非限制性实例包括肌苷、黄苷、异鸟苷、异胞苷、二氨基嘧啶和脱氧尿苷。所述连接衔接子可包含经修饰或衍生的核苷酸。核糖或碱基部分修饰的非限制性实例包括加成或脱除乙酰基团、氨基基团、羧基基团、羧甲基基团、羟基基团、甲基基团、磷酰基团和硫醇基团。具体地，包括2'-O-甲基和锁核酸(LNA)核苷酸。衍生化核苷酸的合适实例包括具有共价结合染料例如荧光染料或猝灭染料或其他分子诸如生物素、地高辛或者磁性颗粒或微球的那些。所述连接衔接子还可包含合成的核苷酸类似物，诸如吗啉或肽核酸(PNA)。磷酸二酯键或硫代磷酸酯键可以连接接头的核苷酸或核苷酸类似物。
在某些实施例中，所述5'连接衔接子为一个线性寡核苷酸。在某些实施例中，所述5'连接衔接子包含位于该衔接子的所述3'端之上游的一个通用正向引物部分(在本文中也称为“通用衔接子”或“5'通用衔接子”或者“通用连接衔接子”或“5'通用连接衔接子”)。在某些实施例中，所述5'连接衔接子为一个RNA寡核苷酸。在某些实施例中，所述5'连接衔接子包含一个位于该衔接子的所述5'末端区域的通用正向引物部分。所述5'连接衔接子可能有所述3'端处的任何碱基，只要它适合连接到一个成熟小RNA的所述5'
端即可。在某些实施例中，所述5'连接衔接子的3'末端碱基为A。在某些实施例中，所述5'连接衔接子的3'末端碱基为C。在某些实施例中，所述5'连接衔接子的3'末端碱基为G。在某些实施例中，所述5'连接衔接子的3'末端碱基为T。
所述5'连接衔接子的长度将根据例如期望的连接产物的长度和期望的衔接子的特征而异。一般来讲，所述5'连接衔接子的长度可以在约15至约30个核苷酸的范围内，更优选地在约19个核苷酸至约26个核苷酸的范围内。在某些实施例中，所述5'连接衔接子的长度可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在某些实施例中，所述连接衔接子的Tm在约30℃至约60℃的范围内。
在某些实施例中，所述5'连接衔接子包含一个茎-环结构(在本文中称为“5'茎-环连接衔接子”)，其中该5'茎-环连接衔接子包含一个茎和一个环，其中该衔接子的3'端在连接至所述成熟小RNA的5'端时为单链的。在某些实施例中，所述5'茎-环连接衔接子为一个DNA-RNA杂交寡核苷酸。在某些实施例中，所述通用正向引物部分位于所述5'茎-环连接衔接子的茎部。在某些实施例中，所述通用正向引物部分位于所述5'茎-环连接衔接子的环部。在某些实施例中，所述通用正向引物部分位于所述5'茎-环连接衔接子的茎和环部。
如本文所用，术语“茎”是指茎-环连接衔接子中位于所述3'末端和所述环之间的双链区域。一般来讲，所述茎的长度介于约10个核苷酸和约20个核苷酸之间，更优选地所述茎的长度介于12个核苷酸和约15个核苷酸之间。在某些实施例中，所述茎的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。一般来说，在那些所述通用引物的一个部分编码到所述茎中的实施例中，该茎可能较长。在那些所述通用引物的一个部分未编码到所述茎中的实施例中，该茎可能较短。本领域的技术人员将会知道，短于约10个核苷酸和长于约20个核苷酸的茎可通过常规方法得到鉴定，并且在无过度实验的情况下，可设想本教导内容的较短和较长的茎。
如本文所用，术语“环”是指所述茎-环连接衔接子中位于所述茎的两条互补链之间的单链区域，并且通常该环包含单链核苷酸，但是也可能包含其他部分，诸如经修饰的DNA或RNA、碳间隔基诸如C18和/或聚乙二醇(PEG)。一般来讲，所述环的长度介于约10个核苷酸和约20个核苷酸之间，更优选地，所述环的长度介于17个核苷酸和19个核苷酸之间。在某些实施例中，所述环的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。一般来说，在那些所述通用引物部分编码到所述环中的实施例中，该环通常可以较长。在那些所述通用引物部分未编码到所述环中的实施例中，该环通常可以较短。本领域的技术人员将会知道，短于约10个核苷酸和长于约20个核苷酸的环可以在常规方法的过程中得到鉴定，并且在无过度实验的情况下，可设想本教导内容的较短和较长的环。
如本文所用，术语“连接产物”是指包含至少一个5'连接衔接子和一个成熟小RNA的杂交分子。在不使用与所述连接衔接子和成熟小RNA互补的寡核苷酸夹板的情况下生成所述连接产物。
所述通用5'连接衔接子序列有利于合成连接至该衔接子的所述成熟小RNA的一个全长cDNA。对于连接至所述RNA的5'端的衔接子，继续反转录反应以复制所述成熟小RNA的5'末端的完整序列。所述通用5'连接衔接子序列有利于使用通用引物预扩增和/或PCR扩增所述cDNA产物。为推动所述5'连接衔接子连接至成熟小RNA，使用过量的连接衔接子；因此，两个连接衔接子之间的连接可作为一个非特异性背景副产物而产生。使用在所述5'端和3'端均具有羟基基团的5'连接衔接子阻碍了衔接子-衔接子连接，因此限制了由于两个衔接子连接而引起的非特异性背景。游离(未退火的)通用反转录引物和5'连接衔接子之间的连接可作为本文所提供方法的连接步骤中的副产物产生，此类副产物导致检测过程中的非特异性背景。在某些实施例中，在反转录步骤中使用热启动反转录酶抑制了衔接子-引物副产物。在某些实施例中，利用封闭寡核苷酸选择性抑制衔接子-引物副产物的扩增和/或连接以降低背景。DNA寡核苷酸在所述5'端或3'端带有封闭基团标记，诸如吖啶、MGB、2'-O-甲基、靶序列扩增限制性(STAR)封闭剂和包含一段poly(A)序列的封闭寡核苷酸，可用于连接、延伸和/或扩增步骤中。发现增加此类封闭寡核苷酸大幅减少背景扩增并且利用TaqManTM qPCR测定通过qPCR提高miRNA检测的灵敏度。
STAR封闭剂寡核苷酸包含位于所述核苷酸的5'端处的一段STAR标签序列，该STAR标签序列与用于扩增反应中的另一引物序列中的全部或一个部分互补。当所述STAR封闭剂引物延伸时，所述延伸产物包含位于5'端处的STAR标签序列以及位于所述延伸产物的3'区域中的所述STAR标签序列的互补序列。因此，所述STAR引物延伸产物可以回折自退火，从而形成一个茎-环结构。通过所述延伸的STAR引物形成的茎-环结构不包括用于扩增所述目标分子的其他引物的退火，从而抑制了不需要的目标(例如，衔接子-衔接子连接产物)的扩增。在某些实施例中，所述STAR标签序列可包含所述扩增子内部序列的一部分以阻断另一个引物的退火或DNA聚合酶的延伸。STAR引物可用于在所提供的方法中在连接衔接子的成熟小RNA或cDNA的预扩增中选择性扩增抑制连接的连接衔接子。STAR引物在提交于2013年11月4日的美国专利序列号14/071,444并且公开号为No.2014/0134614的美国专利公布中有所描述，该专利以引用的方式全文并入本文。
在某些实施例中，所述封闭寡核苷酸包含一个poly(A)部分并且在所述连接反应过程中存在。在其中一个聚腺苷酸化的成熟小RNA具有连接于所述5'端处的一个衔接子并且使用一个通用反转录引物反转录以生成一个cDNA的方法中，在所述连接反应过程中包括一个封闭寡核苷酸可选择性抑制衔接子-通用RT引物副产物的形成。在某些实施例中，一个封闭寡核苷酸具有一个茎-环结构和在其3'端处包含单链悬垂部分的一个poly(A)。在其他实施例中，所述封闭寡核苷酸为一个线性寡核苷酸并且具有位于其5'端处的一个poly(A)部分以及互补于其3'端处的所述通用反转录引物的序列。在某些实施例中，所述封闭寡核苷酸的非poly(A)部分包含脱氧尿苷。在某些实施例中，包含一个poly(A)部分的所述RT引物和封闭剂的Tm在约30℃至约60℃、约35℃至约50℃、或约38℃至约42℃的范围内。
“封闭基团”为可加入核苷酸或核酸中以避免或最大程度减少DNA聚合酶的核苷酸加成的化学部分。通过将一个封闭基团添加至末端3'-OH，所述核苷酸不再能够参与由所述DNA聚合酶催化的磷酸二酯键形成过程。一些非限制性实例包括烷基基团、非核苷酸接头、硫代磷酸酯、烷二醇残基、PNA、LNA、包含取代所述3'-OH基团的3'-氨基基团的核苷酸类似物、包含取代所述5'-磷酸酯基团的5'-OH基团的核苷酸类似物、不含3'-OH基团的核苷酸衍生物、生物素、核酸嵌入体、吖啶和小沟结合物。烷基封闭基团为饱和烃，其可为直链、支链、环状或它们的组合。不可延伸的核苷酸的一些非限制性实例包括具有已被修饰的3'-羟基基团的核苷酸，诸如通过用氢或氟取代或通过形成酯、酰胺、硫酸盐或苷进行修饰。这些核苷酸的链通常不可延伸。可使用的不可延伸的核苷酸的其他实例包括具有经修饰的核糖部分的核苷酸。在某些实施例中，核糖核苷酸可用作不可延伸的核苷酸，因为终止核糖核苷酸的寡核苷酸无法由某些DNA聚合酶进行延伸。所述核糖可以被修饰为包括3'-脱氧衍生物，该3'-脱氧衍生物包括其中3'-羟基被氢以外的官能基团诸如叠氮基团取代的那些化合物。在某些实施例中，不可延伸的核苷酸包括双脱氧核苷酸(ddN)，例如但不限于双脱氧腺苷(ddA)、双脱氧胞嘧啶(ddC)、双脱氧鸟苷(ddG)、双脱氧胸苷(ddT)或双脱氧尿苷(ddU)。在一些优选的实施例中，所述封闭基团选自小沟结合物、2'-O-甲基基团、生物素、吖啶和硫代磷酸酯基团。
所述连接衔接子至所述成熟小RNA的连接由一个单链RNA连接酶例如RNA连接酶I催化。在某些实施例中，本文提供的方法、试剂盒与组合物包括一种单链RNA连接酶，诸如RNA连接酶I。在某些实施例中，本文提供的方法、试剂盒与组合物包括RNA连接酶I。
所述连接反应的条件通常被调节为使得所述连接酶功能接近其最佳活性水平。可利用缓冲剂将pH调节和维持在期望的水平。合适的缓冲液的代表性实例包括但不限于MOPS、HEPES、TAPS、Bicine、Tricine、TES、PIPES、MES、乙酸钠和Tris缓冲液。所述连接混合物还可包含一个二价阳离子。合适的二价阳离子包括但不限于钙、镁和锰。所述反应混合物还可包含一份还原剂。非限制性实例包括二硫苏糖醇和β-巯基乙醇。还可以将一份核糖核酸酶(RNase)抑制剂加入所述连接混合物中。所述连接混合物还可包含ATP。
如本文所用，术语“延伸反应”是指其中杂交到一段目标序列的一个引物序列的所述3'端延伸以形成包含与所述目标多核苷酸互补的一个链的“延伸反应产物”的一次延长反应。如本文所用，“反转录”也可以称为一次延伸反应。在某些实施例中，所述延伸反应为包含一个聚合酶诸如反转录酶的一次反转录反应。在一些实施例中，所述目标多核苷酸为在其所述5'端处具有一个连接的RNA衔接子的一个聚腺苷酸化miRNA分子，并且所述延伸反应为包含一种反转录酶的一次反转录反应，从而制得所述miRNA连接产物的一个DNA拷贝。
反转录酶包括具有反转录酶活性的任何酶。此类酶包括但不限于逆转录病毒反转录酶(例如，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或劳斯氏肉瘤病毒(RSV)反转录酶)、Superscript ITM、Superscript IITM、Superscript IIITM、逆转录转座子反转录酶、乙肝反转录酶、花椰菜花叶病毒反转录酶、细菌反转录酶、Tth DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶以及其突变体、变异体或衍生物。在某些实施例中，所述反转录酶为一种热启动反转录酶。
在一个实施例中，反转录酶包括具有降低的、大幅降低的或消除的RNase H活性的那些。所谓具有“大幅降低的RNase H活性”的酶意指所述酶的RNase H活性相对于对应的野生型或RNase H+酶诸如莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或劳斯氏肉瘤病毒(RSV)反转录酶降低约20％、15％、10％、5％或2％。任何酶的RNase H活性均可通过各种测定来确定，例如在以下文献中有所描述的那些测定：美国专利No.5,244,797；Kotewicz,M.L.,et al,Nucl.Acids Res.16:265(1988)(Kotewicz,M.L.等人，《核酸研究》，第16卷：第265页(1988年))和Gerard,G.F.,et al.,FOCUS 14:91(1992)(Gerard,G.F.等人，《焦点》，第14卷：第91页(1992年))，所述文献的公开内容以引用方式全文并入本文。适用于本文所述组合物和方法的多肽包括但不限于M-MLV H-反转录酶、RSV H-反转录酶、AMVH-反转录酶，RAV(Rous相关病毒)H-反转录酶、MAV(成髓细胞瘤相关病毒)H-反转录酶、HIVH-反转录酶和Superscript
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以及其突变体、变异体或衍生物。但是，普通技术人员将会知道，能够由一个核糖核酸分子生成一个DNA分子(即具有反转录酶活性)的任何酶同样可以用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中。
具有反转录酶和/或聚合酶活性的酶可通过商购获得，例如购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的InvitrogenTM或Applied BiosystemsTM、美国新泽西州的珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer(Branchburg,NJ))、美国马萨诸塞州贝弗利的纽英伦生物技术公司(New England BioLabs(Beverly,MA))或美国印第安纳州印第安纳波利斯的宝灵曼生物化学公司(Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,IN))。另选地，聚合酶或具有聚合酶活性的反转录酶可以根据本领域普通技术人员所熟知的用于分离和纯化天然蛋白质的标准程序从其天然病毒或细菌来源中分离(参见例如Houts,G.E.,etal.,J.Virol.29:517(1979)(Houts,G.E.等人，《病毒学杂志》，第29卷：第517页(1979年)))。此外，此类聚合酶和/或反转录酶可通过本领域技术人员所熟知的常规重组DNA技术制得(参见例如，Kotewicz,M.L.,et al.,Nucl.Acids Res.16:265(1988)(Kotewicz,M.L.等人，《核酸研究》，第16卷：第265页(1988年))；美国专利No.5,244,797；PCT专利申请公布No.WO 98/47912；Soltis,D.A.,and Skalka,A.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3372-3376(1988)(Soltis,D.A.和Skalka,A.M.，《美国国家科学院院刊》，第85卷：第3372-3376页(1988年)))。
根据一些实施例，使用适当的缓冲液、盐、pH、温度以及包括其类似物在内的核苷酸三磷酸酯，即在适当的条件下，聚合酶使核苷酸结合为互补于所述模板链，起始于退火的连接产物的所述3'端处，以生成一条互补链。在一些实施例中，用于延伸的聚合酶缺乏或实质上缺乏5'核酸外切酶活性。在本教导内容的一些实施例中，可以将非常规核苷酸碱基引入所述扩增反应产物和通过酶促(例如，糖基化酶)和/或物理化学手段处理的所述产物中，以便使该产物无法用作后续扩增的模板。在一些实施例中，尿嘧啶可作为碱基包含于所述反应混合物中，从而使后续的反应通过使用尿嘧啶-N-糖基化酶消除此前包含尿嘧啶的产物的交叉污染(参见例如PCT专利申请公布No.WO 92/01814A2)。在本教导内容的一些实施例中，在扩增之前可采用各种技术中的任一种以便成功扩增，例如下列文献中所述：Radstrom et al.,Mol Biotechnol.26:133-46(2004)(Radstrom等人，《分子生物技术》，第26卷，第133-146页(2004年))。在一些实施例中，可使用包括样本制备和检测的独立的综合方法实现扩增，如美国专利No.6,153,425和6,649,378所述。经可逆修饰的酶例如但不限于美国专利No.5,773,258中所述的那些，这些酶也处于本发明所公开之教导内容的范围内。本教导内容还设想了各种基于尿嘧啶的净化策略，其中例如可以将尿嘧啶结合到扩增反应中，随后通过各种糖基化酶处理除去交叉污染产物(参见例如美国专利No.5,536,649)。本领域的技术人员将会知道，在本发明所公开的方法、组合物与试剂盒中可使用任何具有所述期望的酶活性的蛋白质。
在某些实施例中，所述目标多核苷酸为一个miRNA或其他成熟小RNA分子，并且由此应当理解，使用同样包含反转录性质的聚合酶可使得本教导内容的一些实施例包括第一反转录反应，随后是一次扩增反应，从而使得两个反应基本上合并成一次单一反应。在某些实施例中，本教导内容还可以设想所述延伸反应及随后的扩增反应的合并。
如本文所用，术语“通用引物部分”是指连接衔接子或通用反转录(RT)引物中可直接地或借助其互补序列用作模板的区域，通用引物可利用该模板杂交以实现本领域中已知的各种引物核苷酸延伸反应中的任一种(例如，PCR或RT-PCR)。本领域的技术人员将会知道，当一个单一多核苷酸上存在两个引物部分时，这两个引物部分的方向一般是不同的。例如，一个PCR引物可能直接杂交到第一引物部分，而其他PCR引物可能杂交到第二引物部分的互补序列。此外，本文所用的“通用”引物和引物部分通常被选择为对于给定的具体测定和宿主基因组尽可能独特以确保测定的特异性。
如本文所用，术语“通用引物”是指可用于多个不同反应中的引物，用于查询不同的目标多核苷酸并且杂交到所述连接衔接子或通用RT引物的通用引物部分。一般来讲，杂交到所述连接衔接子或通用RT引物的通用引物的区域长度介于约15和约25个核苷酸之间，更优选地长度介于约18个核苷酸和约22个核苷酸之间。在某些实施例中，杂交到所述连接衔接子或通用RT引物的区域长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。本领域的技术人员将会知道，所述通用引物的连接衔接子或通用RT引物部分的长度可能短于约15个核苷酸并且长于约25个核苷酸，并且可通过常规方法得到鉴定，并且在无过度实验的情况下，本教导内容可设想此类更长或更短的通用引物的连接衔接子或通用RT引物部分。所述通用引物可包含标准、非标准、衍生化的和经修饰的核苷酸，如本文所述。
如本文所用，术语“通用反转录(RT)引物”是指可用于查询不同目标多核苷酸的多个不同反应中的引物。所述通用RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分，其中尾巴部分包含一个通用引物部分。通常，所述poly(T)部分位于所述通用RT引物的3'端。在某些实施例中，位于所述引物的3'端处的所述poly(T)序列之后是非T的一个另外的核苷酸碱基。通常，所述通用RT引物的长度介于约15和25个核苷酸之间，更优选地长度介于约18个核苷酸和约22个核苷酸之间。在某些实施例中，所述通用RT引物的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。所述通用RT引物可包含标准、非标准、衍生化的和经修饰的核苷酸，如上文所述。
如本文所用，术语“通用正向引物”是指可用于查询不同目标多核苷酸的多个不同反应中的引物。如本文所用，术语“通用反向引物”是指可用于查询不同目标多核苷酸的多个不同反应中的引物。在典型的PCR扩增中，使用正向和反向引物优先靶向并且扩增目标DNA序列。如本文提供的方法中所用，单配对通用正向和反向引物能够扩增不同的目标多核苷酸，因为所述目标多核苷酸被修饰为包括通用引物部分，这些通用引物部分可直接地或借助其互补序列用作通用正向或反向引物可杂交的模板。
在某些实施例中，所述通用正向引物杂交到所述5'连接衔接子的一个部分，该部分包含所述通用引物部分或该通用引物部分的互补序列。一般来讲，杂交到所述5'连接衔接子的通用正向引物的区域长度介于约15和约25个核苷酸之间，更优选地长度介于约18个核苷酸和约22个核苷酸之间。在某些实施例中，杂交到所述5'连接衔接子的区域长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。本领域的技术人员将会知道，所述通用正向引物的5'连接衔接子部分的长度可以短于约15个核苷酸并且长于约25个核苷酸，并且可通过常规方法得到鉴定，而且在无过度实验的情况下，本教导内容可设想此类更长或更短的通用正向引物的5'连接衔接子部分。所述通用正向引物可包含标准、非标准、衍生化的和经修饰的核苷酸，如上文所述。
在某些实施例中，所述通用反向引物杂交到所述通用RT引物的一个部分，该部分包含该通用引物部分或其互补序列。在所述反转录反应后，可延伸所述通用正向引物以形成一个第二链产物。所述通用反向引物可能与此第二链杂交并且可延伸以继续所述扩增反应。一般来讲，该通用反向引物的长度介于约15和25个核苷酸之间，更优选地长度介于约18个核苷酸和约22个核苷酸之间。在某些实施例中，所述通用反向引物的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。所述通用反向引物可包含标准、非标准、衍生化的和经修饰的核苷酸，如上文所述。
本文所用的术语“上游”取其在分子生物学中的习惯性含义，是指处于“下游”区域的5'侧的一个多核苷酸之区域的位置。相应地，术语“下游”是指位于“上游”区域的3'侧的一个多核苷酸的位置。
如本文中所用的术语“扩增子”和“扩增产物”一般是指扩增反应的产物。扩增子可以是双链的或单链的，并且可以包括通过使一个双链扩增产物变性获得的分离的组分链。在某些实施例中，一个扩增循环的扩增子可以充当后一扩增循环中的模板。
如本文所用，术语“扩增”是指复制目标多核苷酸、目标多核苷酸替代物或它们的组合的至少一部分的任何手段，通常采用依赖于模板的方式进行复制，包括但不限于各种用于以线性或指数形式扩增核酸序列的技术。若干方法中的任一种均可用于扩增所述目标多核苷酸。可采用使一段核酸目标序列的拷贝倍增的任何体外手段。这些手段包括线性、对数或任何其他扩增方法。示例性方法包括聚合酶链反应(PCR；参见例如美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,965,188；和5,035,996)、等温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参见例如PCT专利公布No.WO 2006/081222)、链置换(参见例如美国专利No.RE39,007)、引物分子的部分破坏(参见例如PCT专利公布No.WO 2006/087574))、连接酶链式反应(LCR)(参见例如Wu,et al.Genomics 4:560-569(1990)(Wu等人，《基因组学》，第4卷：第560-569页(1990年))和Barany,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193(1991)(Barany等人，《美国国家科学院院刊》，第88卷：第189-193页(1991年))、QβRNA复制酶系统(参见例如WO 1994/016108)、基于RNA转录的系统(例如，TAS、3SR)、滚环扩增(RCA)(参见例如美国专利No.5,854,033；美国专利申请公布No.
2004/265897；Lizardi,et al.Nat.Genet.19:225-232(1998)(Lizardi等人，《自然·遗传学》，第19卷：第225-232页(1998年))；和Banér,et al.Nucleic Acid Res.26:5073-5078(1998)(Banér等人，《核酸研究》，第26卷：第5073-5078页(1998年))以及链置换扩增(SDA)(Little,et al.Clin.Chem.45:777-784(1999)(Little等人，《临床化学》，第45卷：第777-784页(1999年))等等。本领域的技术人员将会知道，许多系统适用于扩增目标核酸，并且在本文中可设想这些系统。
如本文所述，在某些实施例中，本教导内容提供一种用于检测成熟小RNA的方法，该方法的工作流程中包括一个预扩增步骤。在所述预扩增步骤中，发生有限次数的扩增循环(例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个扩增循环)。一般来讲，然后可稀释所得的扩增子，并且使稀释的扩增子的部分在随后的扩增步骤中经历额外的扩增循环(参见例如美国专利No.6,606,451和8,815,546)，或通过其他方式分析预扩增的标靶。在某些实施例中，利用一对通用正向和反向引物执行预扩增步骤2-18个循环。在某些实施例中，利用一对通用正向和反向引物执行预扩增步骤2-14个循环。在一些实施例中，执行5-12个预扩增循环。在一些实施例中，执行10-14个预扩增循环。
如本文所述，在提供的用于检测和/或定量一个成熟小RNA的方法中包括一个预扩增步骤相比于执行的不含所述预扩增步骤的方法可显著改善检测灵敏度。在一些实施例中，工作流程中在实时PCR检测之前包括一个预扩增步骤相比于不含预扩增的工作流程和测定使所述测定的灵敏度改善了约3至10Ct's。在一些实施例中，工作流程中在实时PCR检测之前包括一个预扩增步骤相比于不含预扩增的工作流程和测定使所述测定的灵敏度改善了约6至10Ct's。在一些实施例中，工作流程中在实时PCR检测之前包括一个预扩增步骤相比于不含预扩增的工作流程和测定使所述测定的灵敏度改善了高达约1000倍。在一些实施例中，工作流程中在实时PCR检测之前包括一个预扩增步骤相比于不含预扩增的工作流程和测定使所述测定的灵敏度改善了高达约10倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1000倍。
在某些实施例中，本文提供的方法还包括测定所述包含成熟小RNA和5'连接衔接子之cDNA的cDNA产物或所述包含cDNA产物之扩增子的预扩增产物，使得所述成熟小RNA的cDNA或cDNA扩增子得到检测。所述测定可为定量的，使得可测定样本中所述成熟小RNA的量或拷贝数。或者，所述测定可为定性的，使得可测定样本中一个成熟小RNA的存在情况，但是可能无法测得其含量。此外，所述测定可能使得所述成熟小RNA或其cDNA或cDNA扩增子可以与样本分离以备进一步研究。
在某些实施例中，可能使用扩增方法测定所述cDNA或预扩增产物。合适的扩增方法的非限制性实例包括定量实时PCR、定量终点PCR和标准PCR。在某些实施例中，为测定cDNA或预扩增产物，所述扩增方法可使用一个具有特异于小RNA的部分之正向引物和一个通用反向引物，并且可通过使用一个具有特异于小RNA的部分之探针检测所述扩增cDNA。在某些实施例中，所述测定扩增方法可使用一个通用正向引物和一个具有特异于小RNA的部分之反向引物，并且可通过使用一个特异于小RNA的探针检测所述扩增cDNA。在某些实施例中，所述测定扩增方法可使用通用正向和反向引物，并且可通过使用一个特异于小RNA的探针检测所述扩增cDNA。在某些实施例中，所述测定扩增可使用一个具有特异于小RNA的部分之正向引物和一个通用反向引物，并且可通过使用一个通用探针检测所述扩增cDNA。在某些实施例中，所述测定扩增方法可使用一个具有特异于小RNA的部分之正向引物和一个具有特异于小RNA的部分之反向引物，并且可通过使用一个特异于小RNA的探针检测所述扩增cDNA。
在某些实施例中，用于测定所述cDNA或预扩增产物的引物和探针的组被配置用以检测所述目标成熟小RNA的5'端和/或3'端。例如，在某些实施例中，所述正向引物或探针杂交到包含介于所述连接的衔接子和所述成熟小RNA的5'端之间的接合点之所述cDNA的部分。在某些实施例中，所述反向引物或探针杂交到包含介于所述poly(A)加成和所述成熟小RNA的3'端之间的接合点之所述cDNA的部分。在此类实施例中，可查询所述成熟小RNA的5'和/或3'端的序列并且检测末端异构体。本文提供的工作流程和检测测定方法中所述成熟小RNA的5'端和3'端之延伸允许成熟小RNA异构体的差异，包括其末端处不同的异构体。
所述通用正向和反向引物及探针以及所述特异于小RNA的正向和反向引物及探针可包含标准、非标准、衍生化的和经修饰的核苷酸，如上文所详述。所述正向和反向引物的长度可各自在约15至约25个核苷酸的范围内，而在某些实施例中，长度在约18个核苷酸至约22个核苷酸的范围内。
在某些实施例中，可能使用定量实时PCR(qPCR)测定所述连接产物。在此方法中，实时逐个循环地跟踪PCR产物的量。为测定PCR产物的量，可在荧光染料存在下执行所述反应，该荧光染料在结合到双链DNA时，其荧光大大增强。合适的荧光染料的非限制性实例包括SYBRTM Green I、PicoGreenTM I、EvaGreenTM、溴化乙锭和吖啶橙。还可以利用特异于待扩增的DNA之荧光报告探针执行所述反应。报告探针的非限制性实例包括TaqManTM探针、分子信标和ScorpionTM引物。上述探针取决于
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共振能量转移(FRET)，通过在相同或不同的寡核苷酸底物上之荧光染料分子和猝灭剂部分的偶联来猝灭荧光信号。当所述荧光染料分子和猝灭剂通过酶促或物理手段去偶时，产生所述荧光信号。通常记录每个循环中的荧光值并且该荧光值代表扩增至所述扩增反应中相应点处之产物的量。其中荧光超出规定阈值的循环被定义为阈值循环(Ct)。一般来讲，可通过测定所述样本的Ct值并且将该值与对照样本的Ct值进行比较来计算原料的量。
在某些实施例中，还可以使用定量终点PCR测定所述连接产物。此方法类似于qPCR，如此所述反应通常在荧光染料或荧光探针和/或引物存在下执行，但并非逐个循环地跟踪PCR产物的量。相反，通过在DNA芯片、琼脂糖凝胶或毛细管上电泳解析所述扩增产物，然后测量该产物的荧光，在所述反应结束时分析PCR产物。该反应通常包括一个共同扩增的内部对照物或一个共同扩增的用于样本归一化的合成核酸。
在某些实施例中，还可以使用一种标准PCR方法测定所述连接产物。标准PCR程序在本领域中是熟知的，并且有关这些程序的信息可参见：Ausubel et al.CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NY,1998(Ausubel等人，《分子生物学实验室指南》，约翰威立出版社，纽约，1998年)；Ausubel et al,PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Academic Press,NY,1990(Ausubel等人，《PCR方案：方法与应用指南》，美国学术出版社，纽约，1990年)或Sambrook et al.MolecularProtocols:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,NY,2001(Sambrook等人，《分子实验方案：实验室手册》，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约，2001年)。
在一个实施例中，所述扩增反应是一种使用一种核酸聚合酶诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和反转录酶、至少一种能够特异性杂交到一个目标多核苷酸的寡核苷酸引物(据此实现扩增的目标核酸的扩增)、至少一个杂交到所述扩增的目标核酸之可检测的探针(其可以结合到所述至少一种引物)以及至少一种可在扩增之前、扩增期间或扩增之后引入的可检测的核酸结合剂(例如，嵌入或非嵌入染料)执行的5'-核酸酶测定(在商业上也称为TaqManTM测定)。所述探针通常包含发出信号的一个可检测的标签，该信号可以被监测以确定所述目标核酸是否已被扩增。在一些实施例中，该探针为杂交到相对于所述至少一种引物的目标核酸3'
端的一个寡核苷酸。在一些实施例中，所述聚合酶具有使探针从扩增的核酸上释放的核酸酶活性(即，5'到3'核酸酶活性)。在一些实施例中，从所述扩增的核酸上的释放使得该探针可检测。在一些实施例中，所述探针包含一个可检测标记和一个猝灭剂分子，该猝灭剂分子在游离时猝灭可检测标记，但是在该探针杂交到所述扩增的核酸时不使其猝灭。在一些实施例中，可使用两个或更多个探针，其中至少一个探针具有一个可检测标记，并且至少一个其他探针具有一个猝灭剂分子。当所述猝灭剂分子彼此充分靠近时，通常抑制其他探针上所述可检测标记的信号。在一些实施例中，可使用两个或更多个各自具有一个不同可检测标记的探针，而无需使用猝灭剂分子。在此类实施例中，当探针彼此充分靠近时，通过重新或表现出一个与单探针不同的信号，使得所述探针可检测。通常，所述可检测标记和猝灭剂分子是单探针的一部分。随着扩增进行，所述聚合酶消化探针以分离所述可检测标记与猝灭剂分子。在所述反应期间监测可检测标记(例如，荧光)，其中该标记的检测对应于核酸扩增的发生(即，信号越高，扩增量越大)。TaqManTM测定的变体(例如，LNATM外加TaqManTM测定)在本领域中是已知的，并且将适用于本文所述的方法中。
可使用多种方法中的任一种通过引物或探针的使用来检测扩增的目标核酸。许多不同的试剂、系统或可检测标记均可用于本文所述的方法中。这些包括例如：TaqManTM系统，可检测的标记-猝灭剂系统(例如，FRET、水杨酸盐/DTPA配体系统(参见例如Oser,etal.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29:1167-1169(1990)(Oser等人，《德国应用化学(英文版)》，第29卷：第1167-1169页(1990年))、置换杂交、同源探针、EP 070685中描述的测定)、分子信标(例如，NASBATM)、锁核酸(LNA)碱基(Singh,et al.Chem.Commun.4:455-456(1998)(Singh等人，《化学通讯》，第4卷：第455-456页(1998年))、肽核酸(PNA)探针(Pellestor,etal.Eur.J.Hum.Gen.12:694-700(2004)(Pellestor等人，《欧洲人类遗传学杂志》，第12卷：第694-700页(2004年))、Eclipse探针(Afonina,et al.Biotechniques 32:940-949(2002)(Afonina等人，《生物技术》，第32卷：第940-949页(2002年))、发光探针(Svanvik,etal.Anal.Biochem.281:26-35(2000)(Svanvik等人，《分析生物化学》，第281卷：第26-35页(2000年))、分子信标(Tyagi,et al.Nat.Biotechnol.14:303-308(1996)(Tyagi等人，《自然·生物技术》，第14卷：第303-308页(1996年))、三重分子信标(Nutiu,et al.NucleicAcids Res.30:E94(2002)(Nutiu等人，《核酸研究》，第30卷：第E94页(2002年))、QuantiProbes(www.qiagen.com)、HyBeacons(French,et al.Mol.Cell.Probes 15:363-374(2001)(French等人，《分子与细胞探针》，第15卷：第363-374页(2001年))、置换探针(Li,et al.Nucleic Acids Res.30:E5(2002)(Li等人，《核酸研究》，第30卷：第E5页(2002年))、HybProbes(Cardullo,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988)(Cardullo等人，《美国国家科学院院刊》，第85卷：第8790-8794页(1988年))、MGB Alert(www.nanogen.com)、Q-PNA(Fiandaca,et al.Genome Res.11:609-613(2001)(Fiandaca等人，《基因组研究》，第11卷：第609-613页(2001年))、Plexor(普洛麦格公司(Promega))、LUXTM引物(Nazarenko,et al.Nucleic Acids Res.30:E37(2002)(Nazarenko等人，《核酸研究》，第30卷：第E37页(2002年))、ScorpionTM引物(Whitcombe,et al.Nat.Biotechnol.17:804-807(1999)(Whitcomb等人，《自然·生物技术》，第17卷：第804-807页(1999年))、AmpliFluorTM(Sunrise)引物(Nazarenko,et al.Nucleic Acids Res.25:2516-2521(1997)((Nazarenko等人，《核酸研究》，第25卷：第2516-2521页(1997年))、DzyNA引物(Todd,etal.Clin.Chem.46:625-630(2000)(Todd等人，《临床化学》，第46卷：第625-630页(2000年))等等。在这些测定中的每种测定中，可在所述反应进行过程中监测生成的扩增产物。用于检测由所述可检测标记产生之信号的装置可用于检测、测量和定量扩增之前、扩增期间或扩增之后的信号。具体的信号类型可决定检测方法的选择。例如，在一些实施例中，利用荧光染料标记探针或扩增产物。所述探针结合到单链或双链扩增产物，或所述染料嵌入到该双链扩增产物中，并且由此使得所得的荧光随扩增产物之量的增加而增强。本领域的技术人员应了解，本文还可设想使用其他方法或试剂。
另一种示例性系统在置换杂交方法中利用双链探针(参见例如Morrison,etal.Anal.Biochem.183:231-244(1989)(Morrison等人，《分析生物化学》，第183卷：第231-244页(1989年)；和Li等人(同上))。在此类方法中，所述探针通常包括两个具有不同长度的互补寡核苷酸，其中一个包括一个可检测标记并且另一个包括一个猝灭剂分子。当未结合到目标核酸时，所述猝灭剂抑制可检测标记的信号。在与目标核酸置换杂交之后，所述探针变成可检测的。可使用多个探针，每个含有不同的可检测标记，以使得可在单一反应中查询多个目标核酸。
用于扩增和检测目标核酸的其他示例性方法涉及“分子信标”，该分子信标为单链发夹状寡核苷酸探针。在存在所述目标序列的情况下，该探针展开、结合并且发射一个信号(例如，发荧光)。分子信标通常包括至少四种组分：1)所述“环”，18-30个核苷酸的区域，它与所述目标序列互补；2)两个包含5-7个核苷酸的“茎”，其存在于所述环的任一端上并且彼此互补；3)位于5'端处的一个可检测标记；以及4)位于3'端处的一个猝灭剂分子，其在探针呈闭环形状时(即，未结合到目标核酸)防止所述可检测标记发射信号。因此，在存在一个互补目标的情况下，所述信标的“茎”部分分离出来，促使所述探针杂交到标靶。还已知其他类型的分子信标并且它们可以适用于本文所述的方法中。分子信标可用于各种分析系统中。一种此类系统是基于核酸序列的扩增(NASBATM)，用于在无温度循环的情况下将RNA扩增为双链DNA的一个单步等温过程。NASBATM反应通常需要禽成髓细胞瘤病毒(AMV)、反转录酶(RT)、T7 RNA聚合酶、RNase H以及两个寡核苷酸引物。在扩增之后，可使用一个分子信标检测所述经扩增的目标核酸。分子信标的其他用途在本领域中是已知的，并且将适用于本文所述的方法中。
所述ScorpionTM系统是可以用于本文所述方法中的另一种示例性分析形式。ScorpionTM引物为双官能分子，其中引物与可检测标记(例如，荧光团)和猝灭剂一起共价连接到所述探针。在目标核酸存在下，所述可检测标记和猝灭剂分离，这导致从可检测标记发射的信号增强。通常，所述扩增反应中所用的一个引物包括位于5'端处的一个探针元件以及位于所述发夹环始端处的一个“PCR封闭剂”元件(诸如HEG单体)。所述探针通常包括在一个末端处含一个可检测标记，并且在另一个末端处含一份猝灭剂的自我互补茎序列。在初始扩增循环中，所述引物杂交到目标并且由于聚合酶的作用而发生延伸。所述ScorpionTM系统可使用多个探针检查和鉴别点突变，所述多个探针具有不同标记以区分不同探针。以PCR作为实例，在完成一个延伸循环之后，新合成的靶区将连接到与所述探针相同的链。在第二个变性和退火循环之后，所述探针和标靶杂交。然后所述发夹序列杂交到新产生的PCR产物的一部分。这导致所述可检测标记与猝灭剂分离并引起信号的发射。ScorpionTM引物的其他用途在本领域中是已知的，并且将适用于本文所述的方法中。
一种或多种可检测标记或猝灭剂通常连接至一个引物或探针。所述可检测标记可在游离时或在结合到目标核酸时发射一个信号。所述可检测标记还可以在接近另一种可检测标记时发射一个信号。可检测标记还可能与猝灭剂分子一起使用以使得所述信号仅在与猝灭剂分子不够接近时才可得到检测。例如，在一些实施例中，分析系统可能引起所述可检测标记从猝灭分子释放。可使用若干可检测标记中的任一个来标记在本文所述方法中使用的引物和探针。如上文所述，在一些实施例中，所述可检测标记可连接到可能结合到引物中的一个探针，或可能按其他方式结合到经扩增的目标核酸(例如，可检测核酸结合剂诸如嵌入或非嵌入染料)。当使用一个以上可检测标记时，每个标记的光谱特性应相异以使得所述标记可以彼此区分，或以使得所述可检测标记合起来发射任一单独的可检测标记不发射的信号。示例性可检测标记包括但不限于荧光染料或荧光团(即，可以由光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够猝灭荧光供体染料之荧光信号的“受体染料”等等。
合适的可检测标记包括例如：荧光素(例如，5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-HAT(羟色胺)；6-HAT；6-JOE；6-羧基荧光素(6-FAM)；FITC)；Alexa fluors(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；BODIPYTM荧光团(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X偶联物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素类(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素鬼笔环肽、羟基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素AM、钙黄绿素蓝、钙染料(例如，CalciumCrimson、Calcium Green、Calcium Orange、荧光增白剂)、瀑布蓝、瀑布黄；CyTM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色GFP、环状AMP Fluorosensor(FiCRhR)、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如，GFP.EGFP)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如，荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/dabcyl、荧光素/荧光素、BODIPYTM FL/BODIPYTM FL、荧光素/QSY7和QSY9)、LysoTrackerTM和LysoSensorTM(例如，LysoTrackerTM Blue DND-22、LysoTrackerTM Blue-White DPX、LysoTrackerTM Yellow HCK-123、LysoTrackerTM Green DND-26、LysoTrackerTM Red DND-99、LysoSensorTM Blue DND-167、LysoSensorTM Green DND-189、LysoSensorTM Green DND-153、LysoSensorTM Yellow/Blue DND-160、LysoSensor Yellow/Blue 10,000MW葡聚糖)、俄勒冈绿(例如，488、488-X、500、514)；罗丹明(例如，110、123、B、B 200、BB、BG、B+、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺、丽丝胺罗丹明B、罗丹明毒伞素(Phallicidine)、罗丹明鬼笔环肽(Phalloidine)、罗丹明红、Rhod-2、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、磺酰罗丹明B和C、磺酰罗丹明G+、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、VIC以及描述于例如美国专利No.2009/0197254中的其他标记)，其中包括那些本领域的技术人员所已知的。也可使用其他可检测标记(参见例如美国专利申请公布No.
2009/0197254)，如那些本领域的技术人员所已知的。
如本文所用，“聚合酶”是指具有一种核苷酸聚合活性的任何酶。根据本教导内容可用的聚合酶(包括DNA聚合酶和RNA聚合酶)包括但不限于可商购获得的或天然DNA介导的DNA聚合酶、DNA介导的RNA聚合酶、RNA介导的DNA聚合酶和RNA介导的RNA聚合酶。根据本发明使用的聚合酶可能是可以通常沿着5'到3'的方向从核酸模板合成核酸分子的任何酶。
本文提供的方法、试剂盒与组合物中可以使用的示例性DNA聚合酶包括但不限于：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus；Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus；Taq)DNA聚合酶、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neopolitana；Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima；Tma)DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis；Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus；Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTM DNA聚合酶、沃斯火球菌(Pyrococcus woosii；Pwo)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussterothermophilus；Bst)DNA聚合酶、极端芽孢杆菌(Bacillus caldophilus；Bca)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfobus acidocaldarius；Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum；Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus；Tfl/Tub)DNA聚合酶、红色栖热菌(Thermus ruber；Tru)DNA聚合酶、布氏栖热菌(Thermus brockianus；DYNAZYMETM)DNA聚合酶、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum；Mth)DNA聚合酶、分枝杆菌(mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb、Mlep)以及其突变体、变异体和衍生物。根据本教导内容还可以使用RNA聚合酶，诸如T3、T5和SP6以及其突变体、变异体和衍生物。一般来讲，可以根据本教导内容使用任何I型DNA聚合酶，尽管可能使用其他DNA聚合酶，包括但不限于III型或家族A、B、C等DNA聚合酶。
本文提供的方法、试剂盒与组合物中所用的核酸聚合酶可以是嗜温性或嗜热性的。示例性嗜温性DNA聚合酶包括T7 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、克列诺(Klenow)片段DNA聚合酶、DNA聚合酶III等。示例性热稳定DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、斯托菲尔片段(Stoffel fragment)、VENTTM和DEEPVENTTM DNA聚合酶以及其突变体、变异体和衍生物(美国专利No.5,436,149；4,889,818；4,965,188；5,079,352；5,614,365；5,374,553；5,270,179；5,047,342；和5,512,462；PCT专利公布No.WO 92/06188、WO 92/06200和WO 96/10640；Barnes,Gene 112:29-35(1992)(Barnes，《基因》，第112卷：第29-35页(1992年))；Lawyer,et al.,PCR Meth.Appl.2:275-287(1993)(Lawyer等人，《PCR方法和应用》，第2卷：第275-287页(1993年))；Flaman,et al.,Nucl.Acids Res.22:3259-3260(1994)(Flaman等人，《核酸研究》，第22卷：第3259-3260页(1994年)))。实质上缺乏3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶的实例包括但不限于Taq、Tne(exo-)、Tma(exo-)、Pfu(exo-)、Pwo(exo-)和Tth DNA聚合酶以及其突变体、变异体和衍生物。
适用于本教导内容的DNA聚合酶可以从例如InvitrogenTM(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Carlsbad,CA))、美国新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia(Piscataway,N.J.))、美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma(St.Louis,Mo.))以及宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)商购获得。适用于本公开的示例性可商购获得的DNA聚合酶包括但不限于购自InvitrogenTM(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Carlsbad,CA))的Tsp DNA聚合酶。
在某些实施例中，提供的方法可用于检测一个样本中稀有成熟小RNA，和/或区分该样本中小RNA与其他类似或高度同源的一种小RNA。在某些实施例中，用于扩增目标核酸的方法使用通过多磷酸分解作用(APP)反应进行活化以提供所述目标成熟小RNA或其cDNA的高特异性扩增。多磷酸分解作用是指在一种或多种多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解活性的酶存在下去除核酸中一个不可延伸的核苷酸(例如，寡核苷酸)。在某些实施例中，所述多磷酸分解作用可激活的寡核苷酸(APP寡核苷酸)为3'末端处具有一个双脱氧核苷酸的目标特异性寡核苷酸。该3'末端双脱氧核苷酸抑制由聚合酶引起的直接延伸，但是在多磷酸分解试剂和标靶的互补链存在下可通过多磷酸分解作用去除。一般来讲，如果APP寡核苷酸与其杂交配偶体之间存在错配，则所述双脱氧核苷酸无法被去除。通常，该APP寡核苷酸被设计成具有靠近3'端的一个核苷酸，该核苷酸用于区分一种标靶与另一种标靶，例如区分一种miRNA与另一种miRNA。APP可用于聚合和/或扩增核酸分子，包括但不限于核糖核酸(例如，RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如，DNA)或它们的混合物。APP反应及它们的此类用途在美国专利No.8,932,813中有所描述，该专利以引用方式全文并入本文。
APP通过将一个不可延伸的寡核苷酸转变为一个可延伸的寡核苷酸来提供寡核苷酸的延伸，延伸该寡核苷酸以产生一条期望的核酸链(例如，目标核酸的互补拷贝)，并且任选地扩增和检测所述期望的核酸链。不可延伸的核苷酸是指在结合到核酸时例如通过至少一种生物催化剂(例如，酶)阻止核酸的进一步延伸的核苷酸。核苷酸可能在一种酶的作用下可延伸，但是在另一种酶的作用下不可延伸。对于一种酶不可延伸的核苷酸在不同条件下可变得可延伸或部分可延伸。可延伸的核苷酸可以指可通过反应中存在的生物催化剂(例如酶)在所述可延伸核苷酸的糖部分的3'位上加入或共价连接至少一个其他核苷酸的核苷酸。延伸也可以从核苷酸的2'–OH开始，该核苷酸可能具有或可能不具有可延伸的3'-OH。延伸一个核酸是指向给定的核酸中加入或结合一个或多个核苷酸。经延伸的寡核苷酸通常为已经加入或以其他方式结合(例如，共价结合)一个或多个附加核苷酸的寡核苷酸(例如，引物核酸)。APP通常使用下列步骤来执行：(a)将具有可通过多磷酸分解作用去除(即，可活化)的不可延伸的3'末端(“P*”)的第一寡核苷酸退火到一个核酸；(b)使用多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解活性的生物催化剂(即，DNA聚合酶)去除该不可延伸的3'末端以产生一个未封闭的寡核苷酸；以及(c)延伸该未封闭的寡核苷酸以得到一条期望的核酸链。还可包括检测所述期望的核酸链的附加步骤，如下文所述。
在某些实施例中，利用APP方法进行miRNA特异性扩增。所述核酸模板链通常为一种miRNA的正义或反义cDNA链，并且与其他miRNA种类的对应的(正义或反义)cDNA链一起存在于混合物中。所述可活化(例如，不可延伸)的寡核苷酸P*在靠近目标miRNA cDNA序列的3'末端无错配，并且在其3'末端处或3'末端附近具有至少一个核苷酸，所述至少一个核苷酸错配非目标miRNA种类cDNA的对应核苷酸。由于该错配，在APP方法的步骤(a)中，寡核苷酸P*的末端不可延伸的核苷酸不杂交到所述非目标miRNA cDNA。在步骤(b)中，多磷酸分解作用基本上不去除退火到所述非目标miRNA的可活化的寡核苷酸P*中未杂交末端或靠近末端的核苷酸。因此，在步骤(c)中，所述寡核苷酸P*基本上不由非目标miRNA cDNA的聚合而延伸。结果，在所述模板链上合成的目标miRNA cDNA之期望的核酸链优选在针对非目标miRNA cDNA合成的任何核酸链上扩增。在一个实施例中，利用APP方法对包含一种或多种其他(非目标)miRNA种类的混合物中特定(目标)miRNA种类进行指数扩增。在生成聚腺苷酸化的miRNA连接产物和随后通过反转录形成如本文所述的一个cDNA后，可以在连续步骤(a)-(e)后分离所述cDNA的链以提供单链DNA：
(a)将在其3'末端处具有一个不可延伸的2',3'-双脱氧核苷酸的互补的可活化2'-脱氧寡核苷酸P*退火到所述目标cDNA及非目标cDNA的正义链或反义链。P*在其3'末端处或3'末端附近不具有错配所述目标cDNA上对应的2'-脱氧核苷酸的核苷酸，但是在其3'末端处或3'末端附近具有至少一个核苷酸，所述至少一个核苷酸错配所述非目标cDNA上对应的2'-脱氧核苷酸。因此，当所述寡核苷酸P*被退火时，末端2',3'-双脱氧核苷酸杂交到所述目标链，但是不杂交到所述非目标链。同时，与每个cDNA的反向平行链互补的第二2'-脱氧寡核苷酸被退火到所述反向平行链。所述可活化的2'-脱氧寡核苷酸P*和第二2'-脱氧寡核苷酸侧面与待扩增的cDNA的区域相接。
(b)利用至少一种多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解活性的酶使退火到一条目标cDNA链的可活化的P*发生多磷酸分解。这将通过去除所述杂交的末端2',3'-双脱氧核苷酸，使退火到所述目标链的P*活化。它基本上不活化退火到所述非目标cDNA链的P*，因为未杂交的末端2',3'-双脱氧核苷酸基本上未通过多磷酸分解作用去除。
(c)通过在四种核苷三磷酸酯和一种DNA聚合酶存在下延伸所述目标链上活化的寡核苷酸P*，并且同时延伸目标cDNA及非目标cDNA反向平行链上的第二2'-脱氧寡核苷酸，实现聚合。
(d)分离步骤(c)的所述延伸产物；
(e)重复步骤(a)-(d)直至获得期望水平的所述目标cDNA的指数扩增。
在用于扩增DNA时，所述不可延伸的可活化寡核苷酸P*通常为2'-脱氧寡核苷酸，末端脱氧核苷酸可以为2',3'-双脱氧核苷酸，四种核苷三磷酸酯为2'-脱氧核苷三磷酸酯，并且核酸聚合酶为DNA聚合酶。步骤(c)中所用的DNA聚合酶也可为步骤(b)中具有多磷酸分解活性的酶。通过APP实现的扩增可为线性扩增或指数扩增。当所述可活化的寡核苷酸P*为所用的唯一互补的寡核苷酸时，获得线性扩增。当存在互补于所述期望的核酸链的第二寡核苷酸时(例如，在PCR中)，获得指数扩增。所述第二寡核苷酸可为一个可延伸的寡核苷酸或一个可活化的不可延伸寡核苷酸。所述可活化的寡核苷酸P*和第二寡核苷酸侧面与目标区域相接以实现扩增。在步骤(a)中，所述第二寡核苷酸退火到步骤(d)的分离的期望核酸链产物。在步骤(c)中，聚合使所述期望的核酸链上之第二寡核苷酸延伸以合成所述核酸模板链的拷贝。在步骤(d)中，将所述合成的核酸模板链与期望的核酸链分离。然后可以重复步骤(a)至步骤(d)，直至实现期望水平的指数扩增。
美国专利No.8,932,813中所述的用于其中的APP方法、反应和组合物以引用方式并入本文。在使用APP的一些实施例中，所述一种或多种多磷酸分解试剂包括美国专利No.8,932,813中式I或式II表示的那些，其包括但不限于二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。例如，亚氨二磷酸酯使用氮链接所述磷酸部分；类似的二磷酸酯化合物可以用硫取代氮。在一些实施例中，多磷酸酯可能是具有两个或多个磷酸部分的任意磷酸酯。在一些实施例中，多磷酸酯可能是具有三个或多个磷酸部分的任意磷酸酯。
本文所述的任意多磷酸分解试剂可能与任意其他多磷酸分解试剂结合。在一些实施例中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可能是焦磷酸酯(PPi)与至少一种或多种其他多磷酸分解试剂的结合。所述一种或多种多磷酸分解试剂中的任一种可以以盐(例如钠盐)的形式使用。
通常，本文所述的APP反应还包括一种或多种具有多磷酸分解作用活性以形成一种或多种核苷三磷酸酯的生物催化剂(例如，酶)。可用于APP中的示例性一种或多种生物催化剂为DNA聚合酶，其在如本文所述的一种或多种多磷酸分解试剂存在下催化核苷三磷酸酯的聚合作用与DNA双链体的多磷酸分解作用。具有多磷酸分解作用活性的示例性DNA聚合酶包括但不限于热稳定的Tfl、Taq和/或经遗传工程改造的DNA聚合酶(例如，AMPLITAQFS、THERMOSEQUENASE)，那些具有活性位点突变F667Y或F667Y的等价物(例如，在Tth中)以表现出对作为增殖的核苷酸(例如，ddNTP的较小Km)的双脱氧核苷酸之改进的亲和力，如美国专利No.7,422,872所述的RQ1及其突变体(例如，RQY，其中669被酪氨酸取代，后者可提供RNA的反转录和/或直接测序)、THERMINATOR I(NEB公司)、THERMINATOR II、THERMINATOR III、和/或THERMINATOR GAMMA(均购自NEB公司)等等。这些及其他可能合适的DNA聚合酶可描述于以下文献中，例如：美国专利公布2008/0254525A1、美国专利公布2007/0020622A1、美国专利公布2007/0009924A1、美国专利No.4,889,818、美国专利No.4,965,188、美国专利No.5,047,342、美国专利No.
5,079,352、美国专利No.5,270,179、美国专利No.5,374,553、美国专利No.5,436,149、美国专利No.5,512,462、美国专利No.5,614,365和/或美国专利No.6,228,628B1。已发现，使用此类经遗传工程改造的DNA聚合酶可以提高APP的效率。
在使用APP的一些实施例中，所述多磷酸分解试剂在一定浓度条件下与生物催化剂，以及美国专利No.8,932,813中所述的其他反应组分一起使用，该专利的全部公开内容以引用方式并入本文。
在某些实施例中，提供的用于检测和/或定量miRNA的方法包含使用在至少一种多磷酸分解试剂存在下，通过多磷酸分解作用(APP)活化目标cDNA扩增的所述步骤。在某些实施例中，所述至少一种多磷酸分解试剂为二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。在所提供方法的某些实施例中，所述多磷酸分解试剂为三磷酸酯。在所提供方法的某些实施例中，所述多磷酸分解试剂为六磷酸酯。在一些实施例中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可能是焦磷酸酯(PPi)与至少一种或多种其他多磷酸分解试剂的结合。
在某些实施例中，用于扩增目标核酸的方法使用由焦磷酸解活化的聚合(PAP)反应进行活化。PAP可用以聚合和/或扩增核酸分子，包括但不限于核糖核酸(例如，RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如，DNA)或它们的混合物。PAP反应及其在聚合和扩增反应中的用途描述于例如美国专利No.7,033,763中，该专利以引用方式全文并入本文。在PAP中，所述经退火的可活化寡核苷酸P*通过焦磷酸酯和具有焦磷酸解活性的酶发生焦磷酸解。这通过去除杂交的不可延伸的3'末端活化所述寡核苷酸P*。因此，在某些实施例中，所述目标miRNA cDNA的扩增使用PAP和焦磷酸酯作为焦磷酸解试剂。
在某些实施例中，对于使用APP或PAP的目标cDNA扩增反应，正向引物或反向引物在其3'末端处包含一个不可延伸的核苷酸。在某些实施例中，对于使用APP或PAP的目标cDNA扩增反应，正向引物和反向引物两者在其3'末端处均包含不可延伸的核苷酸。
还可以使用杂交方法测定所述连接产物。合适的杂交方法的非限制性实例包括核酸微阵列。可以使用可商购获得的设备并且按照制造商的方案进行微阵列分析。通常，单链核酸被连接(排列)到一个微芯片表面。然后所述排列状序列与核酸杂交(探针探查)，该核酸可能被荧光标记。经严格清洗以除去所述非特异性结合的核酸后，通常通过共焦激光显微镜或另一种检测方法诸如CCD相机对所述芯片表面进行扫描。原始荧光数据的分析方法在本领域中是已知的。可以使用各种排列状核酸和探针组合检测本教导内容的所述连接产物。
溶液中可能不含所述5'连接衔接子，使得可检测溶液中的成熟小RNA或其cDNA。或者，所述5'连接衔接子可能被连接到一个固相载体，由此不含该5'连接衔接子的3'-末端。因此，在此实施例中，所述成熟小RNA被连接到连接衔接子，该连接衔接子被连接至所述固相载体。在其他实施例中，包含一个poly(T)部分的所述通用RT引物可以被连接至一个固相载体，由此不含该通用RT引物的3'-末端。因此，在此实施例中，从所述通用引物延伸的小RNA的cDNA被连接至所述固相载体。合适的固相载体的非限制性实例包括玻璃表面、二氧化硅表面、塑料表面、聚合物表面、共聚物表面或金属表面。
如本文所用，术语“新一代测序”或“NGS”一般是指高通量测序技术，包括但不限于大规模平行签名测序、高通量测序、连接测序(例如，SOLiD测序)、质子离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子测序和纳米孔测序。在某些实施例中，所述连接衔接子和/或通用RT引物包含适用于特定NGS化学过程或工作流程的核苷酸序列。在某些实施例中，使用具有互补于特定NGS反应中所用序列之序列的一个连接衔接子和/或通用RT引物能够使所述聚腺苷酸化的连接衔接子的成熟小RNA的cDNA或其扩增产物经历NGS分析和测序。
如本文中所用，术语“反应容器”一般是指根据本教导内容可以在其中发生反应的任何容器。在一些实施例中，反应容器可以为微量离心管或现代分子生物学实验室中常用的其他类型的容器。在一些实施例中，反应容器可为微量滴定板(例如，96孔板、384孔板)中的孔、载玻片上的斑点、Applied BiosystemsTM TaqManTM阵列卡(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))中的孔或Applied BiosystemsTM TaqManTMOpenArrayTM板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))的通孔。例如，多个反应容器可以存在于同一载体上。在一些实施例中，可购自例如卡立泊公司(Caliper)和富鲁达公司(Fluidigm)的芯片实验室类装置可提供反应容器。在一些实施例中，可以采用各种微流控方法。应当理解，各种反应容器是本领域中可得的，并且落入本教导内容的范围内。
如上文所述，本文提供了包含位于5'末端区域的通用一个正向引物部分的一个通用5'连接衔接子。还提供了包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分的一个通用RT引物，该尾巴部分包含一个通用反向引物部分。在某些实施例中，提供了包含所述通用5'连接衔接子的组合物。在某些实施例中，提供了同时包含所述通用5'连接衔接子和通用RT引物的组合物。在某些实施例中，提供了还包含一个通用正向和反向引物对的组合物，该引物对特异于所述5'衔接子的正向引物部分以及所述RT引物的反向引物部分。在某些实施例中，提供了还包含一个封闭寡核苷酸的组合物。在某些实施例中，此类组合物为反应组合物。
在某些实施例中，本教导内容还提供了设计用于加快执行某些方法的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒用于通过将执行所述方法所用的两种或更多种组分组合在一起，来提升目标方法的性能。在一些实施例中，试剂盒可能包含预先测量单位量的组分以最大程度减小最终用户的测量需求。在一些实施例中，试剂盒可能包括用于执行本教导内容的一种或多种方法的说明。在某些实施例中，所述试剂盒组分经优化用于彼此一起操作。
在某些实施例中，本教导内容提供包含一个5'连接衔接子和一个通用RT引物的试剂盒，其中通用RT引物包含一个poly(T)部分。在某些实施例中，所述试剂盒还可能包含连接酶、反转录酶和DNA聚合酶中的一种或多种。在一些实施例中，所述试剂盒可能包含一组通用引物对，该引物对特异于所述5'衔接子的正向引物部分以及所述RT引物的反向引物部分。在一些实施例中，所述试剂盒还可能包含特异于一种或多种成熟小RNA的引物对。在一些实施例中，所述试剂盒可能包含多个引物对，其中每个引物对处于多个反应容器中的一个反应容器中。在一些实施例中，所述试剂盒还包含一个检测器探针。在一些实施例中，所述检测器探针包含扩增产物中5'衔接子或通用RT引物的一个核苷酸或扩增产物中5'衔接子或通用RT引物互补序列的一个核苷酸，并且该检测器探针还包含扩增产物中成熟小RNA之3'端区域的一个核苷酸或成熟小RNA之5'端区域的一个核苷酸，或者扩增产物中成熟小RNA之3'端区域的一个核苷酸或成熟小RNA互补序列之5'端区域的一个核苷酸。在某些实施例中，所述试剂盒还可能包含一个封闭寡核苷酸。
本文所提供的方法适用于检测或定量样本中的成熟小RNA。在一些实施例中，提供的方法可能用于检测和/或区分样本中特定种类的成熟小RNA与其他种类的小RNA。在一些实施例中，提供的方法可能用于在单次测定中基本上同时区分样本中的几种miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中极低量的成熟小RNA。例如，在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少于约1500个拷贝的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少于约1000个拷贝、少于约800个拷贝、少于约600个拷贝、少于约400个拷贝、少于约300个拷贝、少于约200个拷贝、少于约100个拷贝、少于约60个拷贝、少于约30个拷贝的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少至约20个拷贝至约1500个拷贝的miRNA。所提供方法的某些实施例的其他灵敏度范围包括但不限于检测样本中约20个拷贝至约1000个拷贝、约20个拷贝至约600个拷贝、约20个拷贝至约300个拷贝、约20个拷贝至约100个拷贝、以及约20个拷贝至约60个拷贝的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少至：约1000个拷贝至约1500个拷贝、约500个拷贝至约1000个拷贝、约50个拷贝至约500个拷贝、约50个拷贝至约200个拷贝、或约50个拷贝至约100个拷贝的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少至约600个拷贝的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少至约60个拷贝的miRNA。
在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少于约0.01pM的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少于约0.001pM的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中少于约0.0001pM的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中处于约0.0001pM至约0.01pM范围内的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中处于约0.0001pM至约0.001pM范围内的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中处于约0.001pM至约0.01pM范围内的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中约0.01pM的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中约0.001pM的miRNA。在某些实施例中，提供的方法可检测样本中约0.0001pM的miRNA。
在一些实施例中，本文提供的方法可能被用于鉴别和/或确认可用于疾病检测和监控、治疗选择和监控以及患者诊断和/或预后方法的成熟小RNA生物标志物。在用于鉴别和/或确认成熟小RNA生物标志物的方法中，RNA样本可能由细胞、组织(冷冻或新鲜)、福尔马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织(FFPE)、尿液、全血、血浆、血清、淋巴、骨髓、汗水、唾液和/或其他生物分泌物制得。鉴别易于获取的生物样本例如血液、血液组分和尿液中的生物标志物是迫切需要的，并且已知成熟小RNA(如miRNA)在血液中循环并且存在于其他体液中。如下文所述，本文提供的方法在利用相对较低的拷贝数检测和定量RNA样本中的miRNA方面表现出高灵敏度和特异性。提供的方法还可适用于高样本通量。本文提供的方法用于筛选来自不同健康状况、年龄或其他条件下的个体或群体的RNA样本中所述潜在miRNA生物标志物。
所提供方法的高灵敏度和特异性还适合检测和/或定量相同RNA样本中的成熟小RNA及其他RNA诸如mRNA或rRNA的表达。在一些实施例中，例如，利用所述RNA样本的一个部分检测和/或定量该样本中成熟小RNA的表达，并且利用所述RNA样本的另一个部分检测和/或定量mRNA的表达，从而允许在所述成熟小RNA和mRNA的表达之间建立关联。这可能有利于较小的和/或有限的RNA样本。
根据本教导内容的另一个实施例，本文所公开的方法可用于诊断和/或预后方法，所述诊断和/或预后方法用于鉴别疾病和/或确定病人对某些药物、药物治疗或治疗方法的反应。可与成熟小RNA诸如miRNA相关联的一种示例性病症是癌症。因此，本教导内容提供了一种基于所述样本的miRNA谱诊断癌症的易感性、预后癌症治疗的效果或癌症的阶段和/或特性的方法。
某些实施例提供了利用本文所公开方法中的任何一种进行疾病的诊断和/或预后，所述疾病例如癌症，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌、生殖道癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、血癌(例如，白血病和淋巴瘤)、肉瘤、黑素瘤等；心血管疾病；自身免疫性疾病和紊乱；以及代谢疾病和紊乱。另一个实施例提供了利用本文所公开方法中的任何一种诊断或确定对药物或治疗的反应度。
虽然本教导内容根据这些示例性实施例进行描述，但是本领域的技术人员将易于理解，在无过度实验的情况下，这些示例性实施例具有许多变型和修改形式。所有此类变型和修改形式均处于当前教导内容的范围内。可以根据以下实例来进一步理解本教导内容的方面，所述实例不应该理解为以任何方式限制本教导内容的范围。
实例
实例1：使用两端通用加尾RT-qPCR分析miRNA
来自人脑的总RNA购自AmbionTM(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific,Inc.))。合成miRNA寡核苷酸购自集成DNA技术公司(IDT，美国爱荷华州克拉尔维尔)(Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville,IA))。连接衔接子、反转录引物和预扩增引物以及TaqManTM测定购自Applied BiosystemsTM(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Inc.))。
第1步：Poly(A)加尾
通过混合下列组分，对合成miRNA或总RNA进行所述poly A加尾：
Figure BDA0003454252530000381
Poly(A)反应总体积5μL
将poly(A)反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在37℃下温育45分钟，在65℃下温育10分钟，并且保持在4℃下。
第2步：连接反应
执行所述连接反应，将一个5'RNA衔接子连接至具有一种5'-末端单磷酸酯的polyA加尾的RNA(包括polyA加尾的miRNA)。通过混合下列组分，进行该连接反应：
3μL 5X T4 DNA连接酶缓冲液
4.5μL 50％PEG8000
0.15μL 50μM连接衔接子
0.075μL 40U/μL RNase抑制剂
1.5μL 10U/μL RNA连接酶I
0.775μL不含核酸酶的水
总体积10μL
将上述组分混合，然后加入到5μL上述步骤1的poly(A)反应中，得到连接反应总体积15μL。将连接反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在16℃下温育60分钟，并且保持在4℃下。
第3步：反转录反应
所述反转录(RT)步骤由步骤2的连接产物合成第一链cDNA并且将通用RT引物结合到所述产物中。通过混合下列组分，进行所述RT反应：
6μL 5X RT缓冲液
1.2μL 100mM dNTP混合物(各25mM)
1.5μL 5μM通用RT引物
3μL 10X SuperScript<sup>TM</sup>酶混合物
3.3μL不含核酸酶的水
总体积15μL
将上述组分混合，然后加入到15μL步骤2的连接反应中，得到RT反应总体积30μL。将RT反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在42℃下温育15分钟，在85℃下温育5分钟，保持在4℃下。
第4步：预扩增反应(任选)
预扩增(pre-amp)为提高检测灵敏度的任选步骤。通过混合下列组分，进行所述预扩增反应：
5μL来自RT反应(来自步骤3)的cDNA
25μL 2X TaqMan<sup>TM</sup>预扩增主混合物
0.25μL 50μM预扩增正向和反向通用引物
19.75μL不含核酸酶的水
预扩增反应总体积50μL
将预扩增反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在95℃下温育10分钟，之后执行12次在95℃下温育15秒并在60℃下温育2分钟的循环，此外在99℃下温育10分钟并且保持在4℃下。
第5步：实时聚合酶链反应(qPCR)
执行实时PCR以检测miRNA。利用0.1X TE缓冲液按1:10的比例对RT或预扩增反应进行稀释。通过混合下列组分，进行qPCR制备：
10μL 2X TaqMan<sup>TM</sup> Fast Advanced主混合物
1μL 20X TaqMan<sup>TM</sup>测定
4μL不含核酸酶的水
5μL稀释的RT或预扩增反应
PCR反应总体积20μL
将PCR混合并且轻轻旋转。在实时PCR系统诸如ViiATM7实时PCR系统或ABI PRISMTM7900HT序列检测系统上运行所述反应。根据仪器说明书和指南对数据进行分析。
使用上文所概述的工作流程，设计并且执行两端通用加尾RT-qPCR测定以检测48种miRNA。在包含和不含预扩增步骤的情况下进行工作流程。在合成模板滴定中获得了非常出色的线性响应，其6-log线性动态范围涵盖从60个拷贝至6000万个拷贝，并且在包含预扩增的情况下，检测极限为60个拷贝(图2A和2B)。图3示出在不含预扩增(“RT”)和包含预扩增(“PA”)的情况下执行的所有48次miRNA测定中，平均循环阈值(“Ct”)与输入RNA量(“ATconc.”)的比较。如图3所示，在48次测定中获得紧凑的Ct分布，在整个工作流程中获得一致的结果，并且连接偏差极小。
实例2：miRNA检测测定的比较
将使用本文所述测定和方法所获得的miRNA检测数据与使用市场上金标TaqManTMIndividual MicroRNA测定所获得的数据进行比较。本文所述的两端通用加尾测定按照实例1所述来执行，其中不含或包含12次循环预扩增步骤。根据产品说明书和指南执行TaqManTM Individual MicroRNA测定。
利用来自正常人脑的总RNA检测4种高表达、4种中等水平表达和3种低表达miRNA的表达水平。考虑稀释因子，使得本文所述通用加尾测定与TaqManTM Individual MicroRNA测定的PCR输入量和拷贝数保持一致。采用25ng总RNA和2.5ng总RNA的输入量进行测定，同时无模板对照物(NTC)。
从图4中可以看到，在不含预扩增步骤(“-PA”)时，本文提供的测定至少与市场上的金标miRNA检测方法(“金标”)具有相同的灵敏度。在本文提供的测定中包含预扩增步骤显著提高了检测灵敏度(图4“+PA”)。
实例3：组织样本中总RNA的miRNA分析
来自人类组织(脑、肾脏、结肠、心脏、肝脏和肺)的总RNA购自AmbionTM(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))。反应组分为购自Applied BiosystemsTM(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))的TaqManTM Advanced miRNA cDNA合成试剂盒和TaqManTM Advanced miRNA测定。
第1步：Poly(A)加尾
通过混合下列组分，对总RNA进行所述poly A加尾：
0.5μL 10X Poly(A)聚合酶反应缓冲液
0.5μL 10mM ATP
0.3μL 5U/μL Poly(A)聚合酶
2μL总RNA(例如，在1ng至25ng的范围内)
1.7μL不含核酸酶的水
Poly(A)反应总体积5μL
将poly(A)反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在37℃下温育45分钟，在65℃下温育10分钟，并且保持在4℃下。
第2步：连接反应
执行所述连接反应，将一个5'RNA衔接子连接至具有一种5'-末端单磷酸酯的polyA加尾的RNA(包括polyA加尾的miRNA)。通过混合下列组分，进行该连接反应：
3μL 5X连接酶缓冲液
4.5μL 50％PEG8000
0.6μL 25X连接衔接子
1.5μL 10U/μL RNA连接酶I
0.4μL不含核酸酶的水
总体积10μL
将上述组分混合，然后加入到5μL上述步骤1的poly(A)反应中，得到连接反应总体积15μL。将连接反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在16℃下温育60分钟，并且保持在4℃下。
第3步：反转录反应
所述反转录(RT)步骤由步骤2的连接产物合成第一链cDNA并且将通用RT引物结合到所述产物中。通过混合下列组分，进行所述RT反应：
6μL 5X RT缓冲液
1.2μL 100mM dNTP混合物(各25mM)
1.5μL 5μM通用RT引物
3μL 10X RT酶混合物
3.3μL不含核酸酶的水
总体积15μL
将上述组分混合，然后加入到15μL步骤2的连接反应中，得到RT反应总体积30μL。将RT反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在42℃下温育15分钟，在85℃下温育5分钟，保持在4℃下。
第4步：预扩增反应(任选)
通过混合下列组分，进行任选的所述预扩增(pre-amp)反应：
5μL来自RT反应(来自步骤3)的cDNA
25μL 2X miR-Amp主混合物
2.5μL 20X miR-Amp引物混合物(正向和反向通用引物)
17.5μL不含核酸酶的水
总体积50μL
将预扩增反应混合，轻轻旋转，然后放入热循环仪中在95℃下温育10分钟，之后执行14次在95℃下温育3秒并在60℃下温育30秒的循环，此外在99℃下温育10分钟并且保持在4℃下。
第5步：实时聚合酶链反应(qPCR)
执行快速循环实时PCR以检测所述miRNA。利用0.1X TE缓冲液按1:10的比例对RT或预扩增反应进行稀释。通过混合下列组分，进行qPCR制备：
5μL 2X TaqMan<sup>TM</sup> Fast Advanced主混合物
0.5μL 20X TaqMan<sup>TM</sup> Advanced miRNA测定
2μL不含核酸酶的水
2.5μL稀释的RT或预扩增反应
PCR反应总体积20μL
将PCR混合并且轻轻旋转。在实时PCR系统诸如ViiATM7实时PCR系统或QuantStudio实时PCR系统上运行所述反应。将反应放入实时PCR仪器中在95℃下温育20秒，之后执行40次在95℃下温育1秒并在60℃下温育20秒的循环，然后保持在4℃下。根据仪器说明书和指南对数据进行分析。
这些测定经过设计以及执行以检测来自不同组织的各种miRNA。在工作流程中使用涵盖5-log范围的来自脑组织和肾组织的总RNA(1pg至1μg)，并各自测定4种miRNA。如图5A-5D所示的结果表明，对于所有4种miRNA，在5-log范围内RNA输入获得了良好的线性响应。测量脑组织总RNA中的miRNA let-7a-5p、miR16-5p、miR23a-3p和miR361-5p(图5A-5B)，并测量肾组织总RNA中的miRNA miR16-5p、miR199ab-3p、miR21a-5p和miR23-3p(图5C-5D)。对于不经预扩增的cDNA制剂(图5A和5C)和经过预扩增的制剂(图5B和5D)进行所述miRNA检测测定。包含预扩增步骤使得检测灵敏度显著提高。
对来自人类六种组织(脑、肾脏、结肠、心脏、肝脏和肺)的总RNA进行上述RNA加尾工作流程和miRNA检测测定。对所述cDNA和预扩增的反应产物进行2倍ΔCt和2倍稀释差异分析(图6A和6B；菱形＝不含预扩增(RT)；正方形＝含预扩增)。图6B所示的结果表明该工作流程满足基因表达研究的2倍差异检测要求。
实例4：血液和尿液样本中总RNA中的miRNA分析
使用两种不同的程序由健康供体的人类血清(100微升)、血浆(100微升)和尿液(250微升)制得总RNA(包括miRNA)。在高通量程序中，根据制造商的说明，使用MagMAXTMmirVanaTM总RNA分离试剂盒(AmbionTM，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))和Thermo ScientificTM KingFisherTM FLEX仪器(96孔深孔头部)的血清特异性方案将总RNA与样本分离(一式两份)。在其他程序中，根据制造商的说明，使用mirVanaTMPARISTM RNA纯化试剂盒(AmbionTM，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))将总RNA与样本分离。
利用TaqManTM Advanced cDNA合成试剂盒由2微升分离的总RNA生成通用加尾miRNA cDNA，并执行如实例3所述程序通过miR-Amp预扩增对所述cDNA进行扩增。在预扩增后，在qPCR扩增反应中使用TaqManTM Advanced miRNA测定和TaqManTM Fast Advanced主混合物进行miRNA检测和定量，如实例3所述。对所述预扩增的cDNA进行miRNA测定，以检测5种miRNA：let7c、miR16、miR221、miR21和miR26a。
图7A和7B示出对由两个供体的血清中分离的RNA中5种miRNA的检测。图8A和8B示出对由两个供体的血浆中分离的RNA中5种miRNA的检测。图9A和9B示出对由两个供体的尿液中分离的RNA中5种miRNA的检测。图7A、图7B、图8A、图8B、图9A和图9B示出利用高通量程序(菱形，MagMAXTM mirVanaTM试剂盒)分离的RNA以及利用金标(但并非高通量)RNA分离程序(正方形，mirVanaTM PARISTM试剂盒)分离的RNA的结果。

Claims (38)

1.一种用于检测成熟小RNA的非治疗和非诊断方法，所述方法包括：
提供包含成熟小RNA的样本；
使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成RNA连接产物，其中所述衔接子包含通用正向引物部分；
使用反转录引物反转录所述RNA连接产物，从而形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中所述反转录引物包含poly(T)部分和尾巴部分，其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分；
使用第一正向引物和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成扩增产物，其中所述第一正向引物能够与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物能够与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及
检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述cDNA产物扩增是预扩增步骤，任选地其中所述预扩增步骤包含2至14个扩增循环。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括使用标记的检测器探针的qPCR，其中所述检测器探针包含特异于所述成熟小RNA的部分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包含使用第二正向引物和反向引物对的qPCR，
其中所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的部分。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化、连接、反转录和扩增步骤在不干扰所述反应产物的纯化的情况下进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化步骤在所述连接步骤之前进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤在所述聚腺苷酸化步骤之前进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述反转录步骤和所述预扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤和反转录步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤、反转录步骤和扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述成熟小RNA选自由微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复序列相关siRNA(rasiRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)和21-URNA所组成的组。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本选自由单独制备的总RNA、细胞提取物、完整细胞、来自体外转录反应的样本和来自化学合成的样本组成的组。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本由生物组织、全血、血清、血浆和尿液组成的组来制备。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子为RNA分子。
16.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述连接和/或扩增步骤中增加封闭寡核苷酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸选自由3'-MGB封闭寡核苷酸、5'-MGB封闭寡核苷酸、2'-O-甲基封闭寡核苷酸、3'-吖啶封闭寡核苷酸、5'-吖啶封闭寡核苷酸、STAR封闭寡核苷酸和包含poly(A)序列的封闭寡核苷酸组成的组。
18.一种用于检测成熟小RNA的方法，所述方法包括：
提供包含成熟小RNA的样本；
使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成RNA连接产物，其中所述衔接子包含通用正向引物部分；
使用反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物，从而形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分；
使用第一正向引物和反向引物对预扩增所述cDNA产物以形成扩增产物，其中所述第一正向引物能够与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物能够与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及
通过qPCR检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物，其中所述qPCR包含第二正向引物和反向引物对，其中所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的部分。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述qPCR还包含标记的检测器探针，所述标记的检测器探针包含特异于所述成熟小RNA的部分。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述预扩增包括2至14个扩增循环。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述聚腺苷酸化、连接、反转录和预扩增步骤在不干扰所述反应产物的纯化的情况下进行。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述聚腺苷酸化步骤在所述连接步骤之前进行。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述连接步骤在所述聚腺苷酸化步骤之前进行。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述反转录步骤和预扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述连接步骤和反转录步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述连接步骤、反转录步骤和预扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述成熟小RNA选自由微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复序列相关siRNA(rasiRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)和21-URNA组成的组。
28.根据权利要求18所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本选自由单独制备的总RNA、细胞提取物、完整细胞、来自体外转录反应的样本和来自化学合成的样本组成的组。
29.根据权利要求18所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本由生物组织、全血、血清、血浆和尿液组成的组来制备。
30.根据权利要求18所述的方法，其中所述通用衔接子为RNA分子。
31.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括在所述连接和/或扩增步骤中增加封闭寡核苷酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸选自由3'-MGB封闭寡核苷酸、5'-MGB封闭寡核苷酸、2'-O-甲基封闭寡核苷酸、3'-吖啶封闭寡核苷酸、5'-吖啶封闭寡核苷酸、STAR封闭寡核苷酸和包含poly(A)序列的封闭寡核苷酸所组成的组。
33.一种用于合成和扩增成熟小RNAcDNA的试剂盒，所述试剂盒包含：
单链衔接子，所述单链衔接子包含3'末端–OH基团和通用正向引物部分；
反转录(RT)引物，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，并且其中所述尾巴
部分包含通用反向引物部分；
单链RNA连接酶；
反转录酶；
DNA聚合酶；以及
通用正向引物和反向引物对，其中所述通用正向引物能够与所述通用正向引物部分或
其互补序列杂交，并且所述通用反向引物能够与所述通用反向引物部分或其互
补序列杂交。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，还包含一种或多种dNTP、ATP、缓冲液和二价阳离子的盐。
35.一种用于检测成熟小RNA的组合物，所述组合物包含：
成熟小RNA的cDNA，所述cDNA包含位于5'端的反转录(RT)引物序列和位于3'端的衔
接子序列，其中所述RT引物包含poly(T)部分和尾巴部分，并且其中所述尾巴
部分包含通用反向引物部分，且其中所述衔接子包含通用正向引物部分；
poly(A)聚合酶，
RNA连接酶1，
和反转录酶。
36.根据权利要求35所述的组合物，还包含通用正向引物和反向引物对，其中所述通用正向引物能够与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述通用反向引物能够与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交。
37.根据权利要求36所述的组合物，还包含DNA聚合酶。
38.根据权利要求33所述的试剂盒或权利要求35所述的组合物，还包含封闭寡核苷酸。
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