CN117529560A - 检测微小rna的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
提供了一种检测微小RNA的方法，其包括：在待测样品同时加入(a)聚腺苷酸加尾反应体系和(b)逆转录反应体系，采用通用逆转录引物经一步法得到逆转录的cDNA产物；在DNA扩增反应和荧光检测体系中采用下游通用引物和特异性上游引物进行扩增和采用通用荧光探针对扩增产物进行检测。还提供了基于上述方法的试剂盒。提供的方法和试剂盒的灵敏性和特异性显著高于传统方法，可以用少量的样本进行高通量的灵敏检测，操作方便、耗时短，低成本检测批量靶标microRNA，适于应用于各类生物样本筛查，以及临床疾病早期诊断、伴随诊断及预后评估等。
Description
本发明涉及在样品中检测微小RNA的方法。更具体地说，本发明涉及使用逆转录和扩增反应以及荧光探针在样品中检测微小RNA的方法。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18-24个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，普遍存在于各种生物中。miRNA初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核内经RNA酶III和双链RNA结合蛋白Pasha加工成长约70个核苷酸，具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNAs)，pre-miRNAs经exportin5等蛋白转运到细胞质中，在另一个RNA酶III(Dicer)剪切下形成约22个核苷酸的双链，其中一条为成熟的miRNA分子。成熟的miRNA分子对靶mRNA进行负调控，从而实现对靶基因的转录调控。随着研究的深入，发现miRNA以及非编码RNA家族，在生物体液中表达丰富，涉及到多种病理生理学过程，对生理条件的改变反应更直接，可作为一种有效生物标志物。
循环核酸(circulating nucleic acids，CNAs)是指血浆或血清中游离的DNA和RNA，是细胞外游离核酸。自从1948年Mandel和Metais在血浆和血清中发现循环核酸以来，就出现了相应的诊断技术。例如：在母体血浆中发现胎儿DNA为非侵入性产前诊断和监测各种妊娠有关的疾病提供了可能。类似的，肿瘤来源的循环DNA已经在多种肿瘤病人中被证实。肿瘤来源的循环RNA及胎儿核酸同样应用于肿瘤和产前诊断等方面。正因为如此，近年来科学家们越来越关注循环miRNA的研究。从研究发现循环miRNA在产前诊断、肺癌、肠癌、前列腺癌、糖尿病、和药物性肝损伤等疾病中的显著意义以来，人们就一直致力于循环miRNA用于临床疾病的无创诊断预警方面的应用研究。
对于miRNA的检测方法，目前已有许多检测分析方法被报道，包括RNA印记法、微阵列芯片法、电化学生物传感器法和实时荧光定量PCR方法等。RNA印记法特异性较高，但该方法灵敏度低且步骤繁琐，不适用于 高通量检测。微阵列芯片放可快速高通量检测，但该检测方法重现性和准确性较差。电化学生物传感器检测miRNA需要对其进行电活性标记，操作步骤复杂，且灵敏度不高，对于低水平表达的miRNA检出效果差。
本领域已经开发了各种基于实时荧光定量PCR(qPCR)的miRNA检测技术，但都存在一定的问题。由于微小RNA序列较短，不能直接进行qPCR扩增，所以一般在微小RNA逆转录反应时进行延长。利用茎环引物或miRNA加尾等方法对miRNA进行逆转录扩增检测的方法是目前用于识别并合成微小RNA第一链的主要方法。其中茎环法利用特异的茎环状引物对微小RNA进行反转录。Jung U等人(A universal TaqMan-based RT-PCR protocol for cost-efficient detection of small noncoding RNA.RNA.2013 Dec；19(12)：1864-73.)公开了一种采用茎环状引物对微小RNA进行反转录的方法，以及采用识别茎环序列的通用性探针或识别微小RNA序列的特异性探针。所述方法中采用的茎环状反转录引物中包含一段与特定微小RNA互补的特异性序列和一段较长的具有茎环结构的通用序列，在反转录过程中，每次逆转录过程只可针对单个微小RNA，导致需要的样本大，难以进行高通量检测。
另一种常用方法加尾法是利用poly(A)聚合酶在微小RNA的3’端加上一段poly A尾巴，然后利用含有poly T的引物进行逆转录，使得微小RNA的cDNA链加上一段接头。一次逆转录可获得全部微小RNA的cDNA产物，进一步进行荧光定量PCR。但在PCR过程中，需针对每个独立的微小RNA合成定制探针，导致成本高，同样难以进行高通量检测。Kang K等人(A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T)，a specific oligo(dT)reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.PLoS One.2012；7(11)：e48536.)公开了一种改进的方法，利用两步法对微小RNA进行合成cDNA产物，第一步先在微小RNA的3’端加上一段poly A尾巴进行加尾反应，第二步再利用含有微小RNA的部分序列，以及poly T和延长片段的下游特异性扩增引物进行逆转录。在该方法中采用了通用的Taqman探针，用于识别延长片段上的部分序列。但该方法需两步法对微小RNA进行加尾和逆转录，步骤繁琐，耗时长，且针对每个独立的微小RNA合成特异性下游扩增引物和进行单独的逆转录反应，难以进行高通量检测。
本领域已采用基于SYBR Green的荧光定量PCR用于检测液体中游离miRNA的表达量。但SYBR Green存在非特异性与双链DNA结合发光导致假阳性的缺陷，不能去除对于非特异扩增产生的荧光信号，导致定量不准 确。Busk PK(A tool for design of primers for microRNA-specific quantitative RT-qPCR.BMC Bioinformatics.2014 Jan 28；15：29.)公开了一种方法，在微小RNA的3’端加上一段poly A尾巴，然后利用含有微小RNA的部分序列，以及poly T和一段Tag的下游扩增引物进行逆转录。Busk PK的方法不需要定制探针，但需针对每个独立的微小RNA合成下游扩增引物，检测方法采用SYBR Green的荧光定量PCR方法，检测的灵敏度和特异性均有一定不足，同时难以进行高通量检测。
US 20130045885A1公开了一种茎环法和加尾法联用的方法，利用两步法对微小RNA进行合成cDNA产物，第一步先在微小RNA的3’端加上一段poly A尾巴进行加尾反应，第二步采用具有polyT片段的通用茎环状引物对微小RNA进行反转录，合成的cDNA产物采用识别茎环序列的通用性探针进行检测。US 20130045885A1公开的方法采用的茎环式通用逆转录引物和polyT序列结合的方式逆转录引物设计复杂，序列偏长，而且加poly A反应和逆转录反应通常需进行两步反应，存在步骤繁琐、耗时较长等问题。
因此，现有的用于检测生物样本中miRNA的方法存在检测步骤繁琐，探针和/或引物设计复杂，检测成本较高，或者是无法满足高通量检测要求的问题。
本领域还需要更好的检测微小RNA的方法，达到操作方便，对样本量要求少，灵敏度高、选择性好、分析快速和整体成本效益好，并能实现高通量检测的目的。
发明内容
本发明提供了一种检测微小RNA(microRNA，miRNA)的方法，其包括以下步骤：
(a)在含有微小RNA的待测样品加入聚腺苷酸加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；
所述加尾反应体系含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；
(b)加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物；
所述催化体系含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物、用于逆转录反应的底物；
其中，所述通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；
(c)在DNA扩增反应和荧光检测体系中对得到的cDNA逆转录产物进行扩增，检测所述扩增产物的存在与否和/或数量，从而获得所述微小RNA的检测结果。在其中一种实施方式中，步骤(c)中采用聚合酶链式反应即PCR对得到的cDNA逆转录产物进行扩增，并通过荧光探针法在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中通过检测报告基团的信号获得所述微小RNA的检测结果。
在本发明的其中又一个方面，步骤(c)中对得到的cDNA逆转录产物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到扩增产物，其中，所述扩增所采用的引物对包括：下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物；同时，在反应体系中加入通用荧光探针，其中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，以及在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中检测报告基团的信号，从而获得所述微小RNA的检测结果。
其中，所述下游通用引物特异性识别所述通用逆转录引物的序列；所述特异性上游引物识别目标微小RNA的序列；以及所述通用荧光探针可特异性地与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。
微小RNA(microRNA，miRNA)是大小为20-25个核苷酸不等的RNA分子，术语非编码RNA家族。miRNA通过“发夹前体”加工，并可在基因表达中作为负调节物，向下调节许多基因。微小RNA首先作为长“原始转录物”被转录(也被称为原始微小RNA)。然后，这些“原始转录物”被缩短，从其缩短至约70个核苷酸，产生所谓的“茎环结构”，也称为“前-miRNA”。前-miRNA被输出到胞质内，在此被进一步加工，由此产生长约22个核苷酸的天然miRNA分子。
在本发明的方法中，当样品中存在目标微小RNA(或称为靶miRNA)时，经过步骤(a)的加尾反应和(b)的逆转录，由于采用了其3’端具有聚T寡核苷酸片段的通用逆转录引物，可一次性获得样品中所有微小RNA模板，达到了大通量的目的。在步骤(c)中，通过加入目标微小RNA的特异性上游引物对前面步骤获得的miRNA文库进行扩增，可以对一个或多个目标微小RNA进行扩增以便于下一步的检测。同时，通过采用识别前述通用逆转录引物中的序列的通用下游扩增引物，可以简化下游引物的设计并降低检测应用的成本。当样品中存在目标微小RNA时，可特异性地获得包括目标微小RNA序列和所述通用逆转录引物序列的扩增子产物。同时，在步骤(c)中，所述探针与包括目标微小RNA序列和所述通用逆转录引物序列的扩增子发生杂交，并在循环扩增的每一个步骤被水解，由此探针上的报告基 团脱落和离开淬灭基团，释放荧光信号，从而提供所述微小RNA的检测结果。通过采用识别和结合所述通用逆转录引物的聚T寡核苷酸片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基的通用荧光探针，也可简化探针的设计并降低检测应用的成本。
在本发明的其中一个方面，步骤(a)中所述聚腺苷酸加尾反应体系中催化聚腺苷酸加尾反应的酶为具有聚腺苷酸化活性的酶。本领域技术人员已知许多具有聚腺苷酸化活性的酶。聚腺苷酸化活性为使用核糖核酸的3’-端作为底物，在合适的缓冲液中在该3’-端能加上核糖核苷酸，优选为加上至少10-20个核糖核苷酸。所述聚腺苷酸化活性的酶以腺嘌呤-5’-三磷酸作为底物。可用于本发明的具有聚腺苷酸化活性的酶包括：大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶、酵母聚腺苷酸聚合酶、牛聚腺苷酸聚合酶、青蛙聚腺苷酸聚合酶、人聚腺苷酸聚合酶和植物聚腺苷酸聚合酶等。在本发明的其中一个方面，步骤(a)中采用的具有聚腺苷酸化活性的酶是大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶。
在本发明的其中一个方面，步骤(a)中所述聚腺苷酸加尾反应体系中包括用于加尾反应的底物，例如为三磷酸腺苷(ATP)。在本发明的其中一个方面，步骤(a)中所述聚腺苷酸加尾反应体系中还包括适于酶反应的缓冲液成分。
在本发明的其中一个方面，步骤(b)中逆转录反应体系的酶为具有逆转录酶活性的酶，其可选自来自病毒、细菌和真核细胞，特别是来自热稳定生物的酶。在本发明的说明书中，逆转录和反转录这两个术语都可用于表示以RNA为模板合成DNA的过程。
可用于本发明的具有逆转录酶活性的酶包括：HIV逆转录酶、M-MLV逆转录酶，EAIV逆转录酶，AMV逆转录酶，嗜热栖热菌DNA聚合酶I，M-MLV RNA酶H，Superscript，Superscript II，Superscript III，Sensiscript逆转录酶，ThermoScript和Thermo-X等。在本发明的其中一个方面，步骤(b)中采用的逆转录酶是M-MLV逆转录酶。
在本发明的其中一个方面，步骤(b)中所述逆转录反应体系中还包括适于逆转录酶反应的缓冲液成分，包括二价离子，例如Mg
2+和Mn
2+。
在本发明的其中一个方面，步骤(b)中所述逆转录反应体系中还包括逆转录引物。在本发明的方法中，所述逆转录引物是一种通用引物，即可用于将样品中各种微小RNA都逆转录生成对应的cDNA的引物。所述通用逆转录引物的3’端具有聚T寡核苷酸片段，其能够识别在步骤(a)中聚腺苷酸化的miRNA。在本发明中，所述通用逆转录引物的3’端的聚T寡核 苷酸片段具有大于10个碱基，例如具有约10-20个碱基，优选为15个碱基。在本发明中，所述通用逆转录引物的5’端为大于约20个碱基(例如为20-30个碱基)的延长标签序列片段。在本发明的其中又一个方面，在所述通用逆转录引物的3’端，即所述聚T寡核苷酸片段的上游还包括锚定碱基序列，用于结合到聚腺苷酸片段的5’末端。所述锚定碱基序列例如为VN，其中“V”代表dATP、dGTP或dCTP；“N”代表dATP、dTTP、dGTP或dCTP中的任意一种。
在本发明的其中一个方面，所述方法中的步骤(a)和(b)为一步反应，即在所述含微小RNA的待测样品同时加入所述加尾反应体系和逆转录反应体系进行加尾反应和逆转录反应，形成逆转录的cDNA产物。
本领域技术人员能通过使用各种酶的对应量、一种或多种合适的温育温度和温育时间，使得催化聚腺苷酸加尾反应的酶和逆转录酶活性在同一个反应体系和溶液条件下发挥其活性，将待测样品中的微小RNA转化为对应的cDNA。
在本发明的其中一个方面，步骤(c)中可采用本领域已知的各种扩增方式对得到的cDNA逆转录产物进行扩增，检测所述扩增产物的存在与否和/或数量，从而获得所述微小RNA的检测结果。
在本发明的其中一种实施方式中，步骤(c)中采用聚合酶链式反应即PCR对得到的cDNA逆转录产物进行扩增，并通过荧光探针法在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中通过检测报告基团的信号获得所述微小RNA的检测结果。
术语“PCR”或“聚合酶链式反应”是指使用热稳定的DNA聚合酶扩增某种靶核酸分子的反应。聚合酶链式反应的反应体系中包括DNA聚合酶，以及能够与靶核酸特异性杂交的寡核苷酸引物(正向引物和反向引物)、用于PCR扩增反应的底物如脱氧核苷酸(dNTP)混合物、二价离子如Mg2+等的反应缓冲液。“DNA聚合酶”是催化脱氧核苷酸的聚合的酶，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3’-端开始合成，并将继续朝向模板链的5’端。本领域已知的各种DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等都可以用于本发明。通过PCR反应产生的DNA分子称为“扩增产物”。″引物″一般指的是在具有催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件(例如具有聚合酶和互补序列的模板，以及在合适的温度)下能够作为沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以为一条或多条。术语“引物对”表示一组或一 对引物，其包括与扩增的核酸序列的5′末端的互补序列杂交的5′有义引物(有时称为“正向”或“上游”)以及与扩增的序列的3′末端杂交的3′反义引物(有时称为“反向”或“下游”)。
在本发明中，步骤(c)中用于对前面步骤得到的cDNA逆转录产物进行PCR扩增的引物对中的所述下游通用引物识别所述通用逆转录引物，即具有与所述通用逆转录引物的全部或部分互补的序列。在本发明的其中一个方面，所述下游通用引物识别所述通用逆转录引物的延长标签序列片段，例如具有与所述通用逆转录引物的延长标签序列的5’端片段互补的序列。
另外，步骤(c)中用于对前面步骤得到的cDNA逆转录产物进行PCR扩增的引物对中的所述特异性上游引物特异性识别目标微小RNA的全长或部分。优选的，所述特异性上游引物具有对应与目标miRNA的全长的序列。例如所述特异性上游引物具有与miRNA的全长的序列，其中将miRNA中的碱基U变为T。
在本发明的其中一个方面，步骤(c)中所述下游通用引物Tm值为约55-65℃，优选为约60℃。
在本发明的其中一个方面，步骤(c)所述特异性上游引物的Tm值为约55-65℃，优选为约60℃。
在本发明的方法中，本发明采用的所述下游通用引物的选择，包括通过其长度和碱基的选择使得引物的Tm值适合与特异性上游引物的Tm值相匹配。本发明提供的方法可用于检测同一样本上大量不同的miRNA，而特异性上游引物通常具有对应与目标miRNA的全长的序列。通用型下游扩增引物的选择使得方便可同时适应大量的不同靶miRNA的特异性上游引物和扩增反应。
在本发明中，步骤(c)中所述通用荧光探针可特异性地与前述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。
在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针识别和结合所述扩增产物中对应所述通用逆转录引物的片段，即具有与所述通用逆转录引物的全部或部分互补的序列。例如，所述探针识别和结合所述通用逆转录引物的聚T寡核苷酸片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基。
在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针的长度为约15-30个碱基，优选为19-24个碱基，例如为19个碱基。在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针的5’端具有约10-15个寡聚腺苷酸，以及3’端还具有一个或多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。
在本发明的方法的步骤(c)中，采用荧光探针，或称为TaqMan检测探针来检测PCR扩增产物。探针是指含有与靶标序列(如PCR扩增产物)互补和能够形成杂交的核酸分子。所述荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭。所述探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。所述探针在识别和与扩增产物形成DNA双链后，可以通过DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性被水解，从而释放所述报告基团和淬灭基团。
术语″报告基团″一般指的是产生可检测的荧光或发光辐射的发射的部分，该发射可以被转移给足够接近的适当的FRET淬灭剂。通常，这样的分子是染料。术语″淬灭基团″通常指的是减少和/或能够减少可检测的荧光或发光辐射的发射的部分。淬灭分子导致来自报道分子的荧光发射减少，由此报道分子/淬灭分子形成FRET对。术语″FRET″(荧光共振能量转移或
型共振能量转移)通常指的是两个染料分子的电子状态之间的动态距离依赖的相互作用，其中能量从供体染料分子转移到受体染料分子而没有来自供体分子的光子发射。
在本发明的其中一个方面，步骤(c)中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团。在本发明的其中一个方面，所述探针的3’标记淬灭基团和5’端标记报告基团。
在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自FAM、VIC、HEX，、TET、TAMRA等，优选为FAM。
在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB等，优选为MGB。
在本发明的其中一个方面，上述检测微小RNA的方法用于体外检测的应用。
在本发明的其中一个方面，上述体外检测微小RNA的方法用于非诊断性和非治疗性的应用。
本发明还提供了用试剂制备用于实施前述本发明的检测微小RNA的方法的试剂盒的用途。其中所述试剂包括前述以下反应体系的试剂：(a)聚腺苷酸加尾反应体系，其含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；
(b)逆转录反应体系，其含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；和
(c)PCR扩增反应和荧光检测体系。
其中各体系中的用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；以及所述用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的底物、下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物、通用荧光探针如前描述和定义。
本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括：
(a)聚腺苷酸加尾反应体系，其含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；
(b)逆转录反应体系，其含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；
(c)PCR扩增反应和荧光检测体系，其含有：用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的底物、下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物、通用荧光探针。
本发明提供的试剂盒中的用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；以及所述用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的底物、下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物、通用荧光探针如前描述和定义。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的聚腺苷酸加尾反应体系和逆转录反应体系配置在一个反应体系中。本发明的方法和试剂盒适于将聚腺苷酸加尾反应和逆转录反应在一步法中进行，即在一个反应体系同时进行加尾反应和逆转录反应，得到逆转录的cDNA产物。在同时包含聚腺苷酸加尾反应体系和逆转录反应体系中，包括了聚腺苷酸加尾反应和逆转录反应需要的酶和底物，并且通过调节各种酶的对应量、缓冲液的离子浓度等条件，使得催化聚腺苷酸加尾反应的酶和逆转录酶活性在同一个反应体系和溶液条件下发挥其活性。由此，在本发明的其中一个方面，提供了一种检测微小RNA的方法，包括以下步骤：
步骤1：在含有微小RNA的待测样品同时加入(a)聚腺苷酸加尾反应体系，用于得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；所述加尾反应体系含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；和(b)逆转录反应体系，用于得到逆转录的cDNA产物；所述逆转录体系含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；其中，所述的通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；
任选的，其中所述通用逆转录引物的3’端的聚T寡核苷酸片段具有约10-20个碱基，以及任选的，所述5’端的延长标签序列片段具有约20-30个碱基；
步骤2：在DNA扩增反应和荧光检测体系中对步骤1得到的cDNA逆转录产物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到扩增产物，其中，所述扩增所采用的引物对包括：下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物；同时，在反应体系中加入通用荧光探针，其中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，以及在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中检测报告基团的信号，从而获得所述微小RNA的检测结果；
任选的，所述下游通用引物特异性识别所述通用逆转录引物的序列；任选的，所述特异性上游引物特异性识别目标微小RNA的全长或部分；以及任选的，所述通用荧光探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交，优选的，其长度为约19-24个碱基，例如其中5’端具有约10-15个寡聚腺苷酸；以及例如其3’端还具有多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。
采用本发明的方法和试剂盒能够非常高效地和准确地检测样品中的目标miRNA。具体的，本发明的方法通过一步法将miRNA加尾和逆转录同时进行，利用通用逆转录引物序列，通过一次逆转录反应就为所有miRNA加尾，并完成所有miRNA的PCR模板制备；然后通过通用荧光探针，可用于逆转录后所有miRNA的检测，其中通过通用下游扩增引物和特异性上游扩增引物来对具体的目标miRNA进行特异性检测。
本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的缺陷，具有以下优点：一、用少量样本快速获得所有靶标miRNA逆转录产物；二、对于加尾后miRNA的序列，设计出通用荧光探针，提高检测的灵敏性和特异性，可分辨出仅有单碱基差异的干扰序列和目的序列；三、基于miRNA的快速逆转录产物和通用荧光探针的设计，可对样本中的miRNA进行高通量的检测，解决了对于miRNA检测利用定制化Taqman探针，以及高通量检测成本高、耗时长、需要合成单个miRNA的cDNA的问题。应用本发明提供的方法，灵敏度高、选择性好，对检测样本要求量低，例如可使用1ml样品筛查多达500-1000种的游离微小RNA，特别适合样本量少和靶RNA量少的检测，例如对临床样本中循环微小RNA的筛查。本发明对生物样本的处理、批量miRNA的获得、以及利用PCR芯片高通量检测靶标miRNA的研究提 供了平台基础。
在本发明中，有关术语具有现有的生物技术、有机化学、无机化学等领域的常规定义。具体的，有关术语可如以下说明和定义。
术语″样品″指的是包含或推测包含目标微小RNA的任何物质。例如从个体分离的组织或液体样品，包括但不限于，例如，皮肤、血液、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官、肿瘤，以及体外细胞培养组分样品。优选的，所述样品为血浆、血清、淋巴液、尿液、唾液、乳汁、精液、阴道分泌液、泪液、脊髓液等体液样品。所述个体可以为植物、动物、细菌等。
术语″靶微小RNA″或″靶核酸序列″指的是要检测的微小RNA或要扩增的核酸序列。靶序列通常具有与引物或探针互补的序列，或为位于用于扩增的两引物序列之间的序列。
如本文所用，术语“Ct值(阈值循环)”是指用于在指数期范围内实时测量扩增产物的实时PCR的循环数，此时测量的荧光强度显著提高至远高于实时PCR中的基线水平的程度。其反映了靶RNA的初始模板的量。
图1为本发明示例性的检测微小RNA的方法的流程示意图。
图2为采用示例性的本发明的一步法逆转录和实时荧光定量PCR检测微小RNA的方法检测不同浓度梯度的线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39 mimic)的实验结果图。其中图2A为6个不同浓度梯度的cel-miR-39的扩增曲线。图2B为标准曲线图。
图3为分别采用示例性的本发明的方法和SYBR Green方法对样品检测的结果图。图3A为采用SYBR Green方法对样品检测的结果图。图3B为采用本发明的方法对样品检测的结果图。
图4为在示例性的本发明的方法中采用不同序列的探针对样品检测的结果图。
图5为一个采用示例性的本发明的一步法逆转录和实时荧光定量PCR检测微小RNA的方法检测不同浓度梯度的线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39mimic)的逆转录后得到的cDNA模板的实验结果图。
图6为比较性的采用SYBR Green方法检测微小RNA的方法的图。图6A为检测不同浓度梯度的线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39 mimic)的逆转 录后得到的cDNA模板的实验结果图。图6B为其中的浓度4样品的溶解曲线。图6C为其中的浓度5样品的溶解曲线。
图7为采用示例性的本发明的方法对样品进行大批量微小RNA进行检测的结果图。
图8为分别采用示例性的本发明的方法和SYBR Green方法对样品检测时DNA污染对检测的影响的结果图。图8A为采用本发明的方法对样品检测的结果图。图8B为采用SYBR Green方法对样品检测的结果图。
图9为采用示例性的本发明的方法对样品检测的特异性的结果图。图9A为采用let-7a-5p特异性引物扩增let-7a-5p和let-7c-5p标准品(二者存在一个碱基的区别)的结果图。图9B为采用let-7c-5p特异性引物扩增let-7a-5p和let-7c-5p标准品的结果图。
通过以下实施例进一步说明本发明，但这些实施例不在任何方面限制本发明。
实施例1样品溶液中游离miRNA提取、检测以及定量
实验仪器和试剂：
PCR仪(ABI Veriti)、荧光定量PCR(ABI QuantStudio
TM 6)、八连管(Axygen#PCR-0208-C)、荧光定量96孔PCR板(ABI#AB0600)、低温高速离心机(Eppendorf 5424R)、EP管、移液枪(Eppendorf)、
通用核酸提取试剂盒(GeneDotech#GD-101，深圳市竞渡医疗器械科技有限公司)、线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39mimic，上海艾博思生物科技有限公司)、
一步法逆转录通用试剂盒(GeneDotech#GD-102，深圳市竞渡医疗器械科技有限公司)、
一步法逆转录通用试剂盒(GeneDotech#GD-102，深圳市竞渡医疗器械科技有限公司)、探针法荧光定量PCR试剂(Takara#RR390A)
以下引物和探针由上海艾博思生物科技有限公司合成和提供。
引物及探针序列：
通用反转录引物序列：
5’GTCCGAGCAGCACGATCCGGTGACCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN 3’(V：A C G，N：ACGT)(SEQ ID No.1)
通用下游引物：5’GTCCGAGCAGCACGATC 3’(SEQ ID No.2)
cel-miR-39上游特异性引物：5’CACCGGGTGTAAATCAGCTTG 3’ (SEQ ID No.3)
通用荧光探针：FAM-5’-AAAAAAAAAAAAAAACTGG-3’-MGB(SEQ ID No.4)
实验步骤：
a)血浆标本收集
从志愿者收集正常人外周血血浆样本，使用EDTA抗凝管采集外周血3ml，室温放置1h，1600g离心10min，吸取上层血浆，按照每200μl一管进行分装，冻存于-80℃冰箱。
b)血浆游离miRNA提取
取新鲜血浆200ul，按照miRNA提取试剂盒说明，每200μl血浆加入800μl的裂解液，颠倒混匀3-5次，加入系列稀释浓度cel-miR-39 mimic的外源参照物，以及10ul的助提取剂(50ng/μl tRNA)，向上一步匀浆好的EP管中加入200μl氯仿，并将其盖住。涡旋或剧烈摇动15s，充分混合。在室温(15-25℃)下，将EP管放置在实验台上静置2-3分钟。在4℃以12,000g离心15分钟。离心后，样品分成3层：上层是含有RNA的无色水层，白色含有蛋白的中间层，和较低的红色有机层。将上层水相(～500μl)转移到新的EP管中。避免接触到其他层。加入等体积的异丙醇，使用移液枪上下吸取几次来彻底混匀。室温放置10-15min。将上一步中混合液取500μl转入RNase-free吸附柱中，8,000g，离心30秒，弃掉流出液，再将剩余混合液转入RNase-free吸附柱中，8,000g，离心30秒，弃掉流出液。向RNase-free吸附柱中加入750μl的已经加入75％乙醇的清洗液，8,000g，离心30秒，轻轻倒掉上流出液。加入500μl的75％的乙醇，8,000g，离心2分钟，轻轻倒掉上流出液，向吸附柱中加入15μl无核酸酶水，室温静置1min。12,000g，离心1分钟，弃掉吸附柱，立即进行逆转录或-80℃冰箱保存。
c)miRNA的一步法逆转录和实时荧光定量PCR：
本实施例中采取的本发明示例性的检测miRNA的方法的流程如图1所示。所述方法包括：步骤1：在含有微小RNA的待测样品加入加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；步骤2：加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物，其中加入的通用逆转录引物的3’端为10-20个碱基的oligo(dT)片段，5’端为大于约20个碱基的延长标签序列片段；步骤3：对得到的cDNA逆转录产物进行PCR扩增，形成扩增产物，其中加入的引物对包括：识别和结合所述通用逆转录引物的下游通用扩增引物和识别微小RNA序列的特异性上游扩增引物；步骤4：在PCR反应体系中加入通用 荧光探针，所述探针识别和结合所述通用逆转录引物的oligo(dT)片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基，以及在PCR的每个循环扩增步骤中检测荧光报告基团的信号。
在本实施例给出的优选的技术方案中，步骤1和2为一步法，即在同一个反应体系中进行加尾反应和逆转录反应：在所述含微小RNA的待测样品加入含有所述加尾反应体系和逆转录反应体系的制剂，以同时进行加尾反应和逆转录反应，从而形成逆转录的cDNA产物。上述本发明提供的利用通用逆转录引物、特异性上游扩增引物和通用下游扩增引物、以及通用荧光探针检测miRNA的方法在本文中有时也称为IntelliMiR荧光探针法。
具体的，本实施例中的方法步骤包括：
一步法加尾和逆转录：
取5μl的总RNA加入5μl的无核酸水稀释，加到8连管中，继续加入1μl的M-MLV逆转录酶和0.4μl的聚合酶A，再加8.6μl的逆转录混合液(工作浓度：dNTP 1mM，ATP 0.1mM，250mM NaCl，50mM Tris-HCl 10mM MgCl2，通用逆转录引物1μM)，充分混合后，使用移液枪混匀3-5次，将8连管放到PCR仪中，设置程序：42℃ 60min，95℃ 5min，4℃ 5min。
探针法实时荧光定量PCR：
10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl
2等)5μl，cel-miR-39上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA产物(10倍稀释后产物)1μl，通用荧光探针(10μM)0.5μl，ROX Dye 0.2μl，无核酸酶水2.3μl。
荧光定量PCR仪反应程序：95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)，每个样品反应设置3个复孔。
检测样品：
不同样品系列浓度稀释：线虫cel-miR-39模拟物，按照阿伏伽德罗常数对其换算(1mol microRNA的量＝6.02x10
23拷贝)，将其稀释为不同的浓度10
6，10
5，10
4，10
3，10
2，10拷贝/微升，加入至200μl正常人血浆中，按照实施例1中描述的miRNA提取步骤进行RNA抽提。
图2为采用示例性的本发明的采用一步法进行逆转录和实时荧光定量PCR检测微小RNA的IntelliMiR荧光探针法检测不同浓度梯度的线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39 mimic)的实验结果图。其中图2A为6个不同浓度梯度的cel-miR-39的扩增曲线。图2B为标准曲线图。根据6个浓度的cel-miR-39所获得的Ct值，获得拟合曲线以及公式y＝1.274ln(x)+39.206，决 定系数R2＝0.9904。
可见，本发明提供的荧光探针方法可用于样品溶液中miRNA的检测。结合不同浓度标准品的稀释，制定标准曲线，可对样品溶液中miRNA的含量进行准确的定量测定。
实施例2比较本发明的荧光探针定量方法与SYBR Green法对样品溶液中miRNA的检测
血浆处理和miRNA提取按照实施例1中描述的方法和步骤进行，其中检测的样品包括：
检测样品1：200μl血浆+10
3拷贝cel-miR-39模拟物/微升+助提取剂；
检测样品2：200μl血浆+10
3拷贝cel-miR-39模拟物/微升；
检测样品3：200μl血浆。
探针荧光定量方法如实施例1所列出的方法和步骤进行。
用于比较的采用SYBR Green荧光定量PCR的方法和步骤如下：
10μl荧光定量反应体系包括：2xPCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl
2、SYBR Green I荧光染料)5μl，cel-miR-39上游特异性引物(10μM)0.5μl，通用下游引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA产物(10倍稀释后产物)1μl，ROX Dye 0.2μl，无核酸酶水2.8μl。
荧光定量PCR仪反应程序：95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)，每个样品反应设置3个复孔。
图3为分别采用本发明的IntelliMiR荧光探针法和SYBR Green方法对样品检测的结果图。图3A为采用SYBR Green方法对样品检测的结果图。图3B为采用本发明的IntelliMiR荧光探针法对样品检测的结果图。
如图3A所示，采用SYBR Green方法对三个样品进行检测，获得扩增曲线。样品3内并不含有外源cel-miR-39，依然出现扩增曲线，表明利用SYBR Green方法检测液体miRNA的表达量时出现非特异扩增。
如图3B所示，利用IntelliMiR荧光探针法对三个样品进行检测，获得扩增曲线。样品3内并无明显扩增曲线，表明本发明的方法检测液体miRNA的表达量时不产生非特异扩增。结果显示样品1中Ct值明显小于样品2，即样品1中的所检测到的cel-miR-39的量要大于样品2，准确地体现了溶液miRNA提取过程中加入助提取剂可显著提高游离miRNA抽提产量。
可见，本发明提供的探针法实时荧光定量PCR方法可特异性的区分溶 液样品中的miRNA以及进行定量测定。
实施例3不同的荧光探针对样品溶液中miRNA检测
采用不同序列的通用荧光探针对于样品中游离miRNA检测。血浆样本处理、miRNA提取和逆转录方法按照实施例1中进行。
探针序列1：
FAM-5’-AAAAAAAAAAAAAAACTGG-3’-MGB(SEQ ID No.4)
探针序列2：
FAM-5’-AAAAAAAAAAAAAAACTGGTCA-3’-MGB(SEQ ID No.5)
探针序列3：
FAM-5’-AAAAAAAAAAAACTGGTCA-3’-MGB(SEQ ID No.6)
探针序列4：
FAM-5’-AAAAAAAAAAAACTGGTCACC-3’-MGB(SEQ ID No.7)
检测样品：检测样品中加入cel-miR-39的系列稀释浓度为10
6，10
5，10
4，10
3，10
2，10拷贝/微升。图4为采用不同探针序列检测的系列稀释浓度的扩增曲线。结果显示，本实验测试的不同序列的探针都可用于检出样品溶液中的miRNA，；采用探针序列1对于同一浓度的标准品检测出的Ct值更小，检测的灵敏度更高。
实施例4本发明的荧光探针定量方法的重复性和灵敏度，以及与SYBR Green法的比较
实验仪器和试剂：
PCR仪(Bro-rad#T100)、荧光定量PCR(Lightcycler480 II)、八连管(Axygen#PCR-0208-C)、荧光定量96孔PCR板(Roche#047296922001)、低温高速离心机(Eppendorf 5424R)、EP管、移液枪(Eppendorf)、线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39 mimic，上海艾博思生物科技有限公司)，
一步法逆转录通用试剂盒(GeneDotech#GD-102，深圳市竞渡医疗器械科技有限公司)、探针法荧光定量PCR试剂(Takara#RR390A)
引物和探针由上海艾博思生物科技有限公司合成和提供。其序列同实施例1中序列。
实验步骤：一步法加尾和逆转录同实施例1中步骤。
检测样品：将cel-miR-39按照阿伏伽德罗常数对其换算(1mol microRNA的量＝6.02x10
23拷贝)，将其稀释溶解为5fmol/μl的标准品模板，取5μl标准品模板按照实施例1中一步法加尾法逆转录体系进行逆转录，获得20μl的cDNA产物，然后进行梯度稀释，获得一系列浓度梯度的标准品模板：1.25x10^7，1.25x10^6，1.25x10^5，1.25x10^4，6.125x10^3，3.06x10^3，1.5x10^3，7.5x10^2copies/μl。
IntelliMiR探针法实时荧光定量PCR：
10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶，dNTP混合液、MgCl
2等)5μl，cel-miR-39上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA梯度稀释模板(10倍稀释后产物)1μl，通用荧光探针(10μM)0.5μl，无核酸酶水2.5μl。
荧光定量PCR仪反应程序：于Lightcycler480 II荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)，每个样品反应设置3个复孔。
实验结果如图5，可以看出扩增曲线呈S型，能够实现荧光定量PCR检测cel-miR-39模拟物的不同浓度的标准品，其灵敏度可达浓度7(1.5x10^3copies)。
SYBR Green法
实验步骤：一步法加尾和逆转录同实施例1中步骤。
检测样品：将cel-miR-39按照阿伏伽德罗常数对其换算(1mol microRNA的量＝6.02x10
23拷贝)，将其稀释溶解为5fmol/μl的标准品模板，取5μl标准品模板按照实施例1中一步法加尾法逆转录体系进行逆转录，获得20μl的cDNA产物，然后进行梯度稀释，获得一系列浓度梯度的标准品模板：1.25x10^7，1.25x10^6，1.25x10^5，1.25x10^4，6.125x10^3，3.06x10^3，1.5x10^3，7.5x10^2copies/μl。
SYBR Green实时荧光定量PCR：
10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、SYBR Green I荧光染料，dNTP混合液、MgCl
2等)5μl，cel-miR-39上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA梯度稀释模板(10倍稀释后产物)1μl，无核酸酶水3μl。
荧光定量PCR仪反应程序：于Lightcycler480 II荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)，每个样品反应设置3个复孔。
实验结果如图6A所示，可以看出扩增曲线呈S型，能够实现荧光定量 PCR检测cel-miR-39模拟物的不同浓度的标准品，其灵敏度可达浓度4(1.25x10^4copies)，浓度5的(6.125x10^3copies)重复孔的扩增曲线呈现不一致状态，表明该方法在浓度5中的检测灵敏度不足。进一步通过对PCR产物进行熔解曲线分析，如图6B所示，浓度4(1.25x10^4copies)熔解曲线为特异性峰图，而如图6C所示，浓度5(6.125x10^3copies)熔解曲线出现非特异性峰图，表明扩增过程中出现非特异性扩增，从而导致定量不准确。
实施例5本发明的荧光探针定量方法对同一样本进行批量微小RNA的检测
实验步骤：正常人血浆样本提取、一步法加尾和逆转录条件和步骤同实施例1中描述，微小RNA的逆转录后的cDNA产物取10μl，加50μl无核酸酶水稀释后用于下一步荧光定量PCR反应。
IntelliMiR探针法实时荧光定量PCR：
10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl
2等)5μl，微小RNA上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA稀释模板1μl，通用荧光探针(10μM)0.5μl，无核酸酶水2.5μl。
荧光定量PCR仪反应程序：于Lightcycler480 II荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)。
其中用于检测50多种微小RNA的名称和其上游扩增引物序列如下：
hsa-miR-9-5p上游引物序列：CGCAGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA
hsa-miR-128-3p上游引物序列：TCACAGTGAACCGGTCTCTTT
hsa-miR-129-2-3p上游引物序列：AAGCCCTTACCCCAAAAAGCAT
hsa-miR-132-3p上游引物序列：TAACAGTCTACAGCCATGGTCG
hsa-miR-149-5p上游引物序列：TCTGGCTCCGTGTCTTCACTCCC
hsa-miR-181b-5p上游引物序列：AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT
hsa-miR-181d-5p上游引物序列：AACATTCATTGTTGTCGGTGGG
hsa-miR-212-5p上游引物序列：ACCTTGGCTCTAGACTGCTTACT
hsa-miR-491上游引物序列：AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG
hsa-miR-598-3p上游引物序列：TACGTCATCGTTGTCATCGTCA
hsa-miR-181a-5p上游引物序列：AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT
hsa-miR-195-5p上游引物序列：CAGTAGCAGCACAGAAATATTGGC
hsa-miR-371上游引物序列：AAGTGCCGCCATCTTTTGAGTGT
hsa-miR-155上游引物序列：CAGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTT
hsa-miR-17-5p上游引物序列：CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG
hsa-miR-20b-5p上游引物序列：CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG
hsa-miR-93-5p上游引物序列：CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG
hsa-miR-27b-3p上游引物序列：TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC
hsa-miR-146b上游引物序列：AGTGAGAACTGAATTCCATAGGCTG
let-7e-5p上游引物序列：GCAGTGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT
hsa-miR-15a上游引物序列：CAGTAGCAGCACATAATGGTTTGTG
hsa-miR-16上游引物序列：TAGCAGCACGTAAATATTGGCG
hsa-miR-18a-3p上游引物序列：ACTGCCCTAAGTGCTCCTTCTGG
hsa-miR-145上游引物序列：GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT
hsa-miR-222上游引物序列：AGCTACATCTGGCTACTGGGT
hsa-miR-218上游引物序列：GCAGTTGTGCTTGATCTAACCATGT
hsa-miR-185上游引物序列：TGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGA
hsa-miR-151a-3p上游引物序列：GCTAGACTGAAGCTCCTTGAGG
hsa-miR-140-5p上游引物序列：CAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAG
let-7c上游引物序列：CAGTGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT
hsa-miR-221-3p上游引物序列：AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC
hsa-miR-21-5p上游引物序列：CGACGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
hsa-miR-30a-5p上游引物序列：CGTGTAAACATCCTCGACTGGAAG
hsa-miR-9-3p上游引物序列：CGCAGATAAAGCTAGATAACCGAAAGT
hsa-miR-325上游引物序列：CCTAGTAGGTGTCCAGTAAGTGT
hsa-miR-34a-5p上游引物序列：TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT
hsa-miR-422a上游引物序列：ACTGGACTTAGGGTCAGAAGGC
hsa-miR-505-5p上游引物序列：GGGAGCCAGGAAGTATTGATGT
hsa-miR-544a上游引物序列：CGCAGATTCTGCATTTTTAGCAAGTTC
hsa-miR-363上游引物序列：CGAATTGCACGGTATCCATCTGTA
hsa-miR-487b上游引物序列：GTGGTTATCCCTGTCCTGTTCG
hsa-miR-22上游引物序列：AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT
hsa-miR-199b-3p上游引物序列：CAGACAGTAGTCTGCACATTGGTTA
hsa-miR-125a-5p上游引物序列：TCCCTGAGACCCTTTAACCTGTGA
hsa-miR-122-5p上游引物序列：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG
hsa-miR-23a上游引物序列：ATCACATTGCCAGGGATTTCC
hsa-miR-451a上游引物序列：CAGAAACCGTTACCATTACTGAGTT
let-7i-5p上游引物序列：AGTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT
hsa-miR-425上游引物序列：AATGACACGATCACTCCCGTTGA
hsa-miR-484上游引物序列：GCTCAGTCCCCTCCCGAT
实验结果：如图7所示，50个微小RNA的扩增曲线呈S型，Ct值范围在25-35之间。在本方法的实验中，使用血浆样本量0.2ml可用于约300-500个(种)微小RNA的检测。因此，使用本发明的方法在1ml外周血(可分 离约0.5ml血浆样本)可检测约500-1200多种微小RNA。而利用茎环法荧光定量PCR方法，相同的样本量(1ml外周血)仅可检测约40-80个(种)微小RNA。
实施例6 DNA污染对于微小RNA表达检测特异度的影响
PCR仪(Bro-rad#T100)、荧光定量PCR(Lightcycler480 II)、八连管(Axygen#PCR-0208-C)、荧光定量96孔PCR板(Roche#047296922001)、低温高速离心机(Eppendorf 5424R)、EP管、移液枪(Eppendorf)、线虫cel-miR-39模拟物(cel-miR-39 mimic)，小鼠DNA样本，
一步法逆转录通用试剂盒(GeneDotech#GD-102)、SYBR Green荧光定量PCR试剂(Takara#RR420A)、探针法荧光定量PCR试剂(Takara#RR390A)、琼脂糖(Solarbio#A8201)，SYBR safe DNA gel stain(invitrogen#S33102)，DNA Marker(Takara#DL1000)
引物和探针由上海艾博思生物科技有限公司合成和提供。其序列同实施例1中序列。
实验步骤：一步法加尾和逆转录同实施例1中步骤。
检测样品：
样本1：选取cel-miR-39模拟物稀释得到标准品样本1.25x10^5copies
样本2：1.25x10^4copies为模板，取5μl标准品模板按照实施例1中一步法加尾法逆转录体系进行逆转录，获得20μl的cDNA产物，然后进行稀释。
以小鼠DNA样本为干扰对照：
样本3：小鼠DNA(浓度150ng/μl)；
样本4：小鼠DNA样本(浓度30ng/μl)。
IntelliMiR探针法实时荧光定量PCR：
10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2等)5μl，cel-miR-39上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA梯度稀释模板(10倍稀释后产物)1μl，通用荧光探针(10μM)0.5μl，无核酸酶水2.5μl。
SYBR Green实时荧光定量PCR：
10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、SYBR Green I荧光染料，dNTP混合液、MgCl2等)5μl，cel-miR-39上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA梯度 稀释模板(10倍稀释后产物)1μl，无核酸酶水3μl。
荧光定量PCR仪反应程序：于Lightcycler480 II荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)，每个样品反应设置3个复孔。
实验结果：RNA样本提取过程中不可避免的会混入少量DNA。现有技术对于RNA样本中的DNA去除，主要使用DNase进行处理，然后再进一步纯化，这样会损失部分RNA，这对于少量或者珍惜样本的RNA提取造成不必要的浪费。本发明中探针法检测微小RNA的方法，可以特异性检测微小RNA，去除混入DNA对于扩增的影响。如图8A所示，本发明的荧光探针法检测样本1和2可看出明显扩增曲线，而样本3和4为小鼠DNA样本，未看到扩增曲线。如图8B所示，应用SYBR Green法对于微小RNA的检测，样本1和2可看到扩增曲线，但对于干扰DNA样本3和4，存在非特异扩增。进一步对两种方法扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8C和8D所示，两种方法均可扩增出特异性的目的条带，同时干扰样本3和4也都有明显条带，但在荧光定量检测过程中，荧光探针检测的方法可去除残留DNA的引起的非特异扩增信号，而SYBR Green检测的方法则不能识别干扰信号。
实施例7本发明的荧光探针定量方法的特异性
PCR仪(Bro-rad#T100)、荧光定量PCR(Lightcycler480 II)、八连管(Axygen#PCR-0208-C)、荧光定量96孔PCR板(Roche#047296922001)、低温高速离心机(Eppendorf 5424R)、EP管、移液枪(Eppendorf)、let-7a-5p和let-7c-5p模拟物(苏州吉玛基因有限公司)、聚
一步法逆转录通用试剂盒(GeneDotech#GD-102，包含以下成分：聚合酶A、逆转录酶MMLV、ATP、dNTP)、探针法荧光定量PCR试剂(Takara#RR390A)
引物和探针由上海艾博思生物科技有限公司合成和提供。其序列同实施例1中序列。
按照let-7a-5p和let-7c-5p序列合成miRNA干粉，两种模拟物仅有一个碱基不同，作为标准品：
let-7a-5p：UGAGGUAGUAGGUUGUAU
AGUU
let-7c-5p：UGAGGUAGUAGGUUGUAU
GGUU
实验步骤：一步法加尾和逆转录同实施例1中步骤。
检测样品：将let-7a-5p和let-7c-5p按照阿伏伽德罗常数对其换算(1 mol microRNA的量＝6.02x10
23拷贝)，将其稀释溶解为5fmol/μl的标准品模板，取5μl标准品模板按照实施例1中一步法加尾法逆转录体系进行逆转录，获得20μl的cDNA产物，然后进行稀释准备PCR反应。
IntelliMiR探针法实时荧光定量PCR：
反应体系1：10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl
2等)5μl，let-7a-5p上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA稀释模板1μl，通用荧光探针(10μM)0.5μl，无核酸酶水2.5μl。
反应体系2：10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2等)5μl，let-7c-5p上游扩增引物(10μM)0.5μl，下游通用引物(10μM)0.5μl，miRNA cDNA稀释模板1μl，通用荧光探针(10μM)0.5μl，无核酸酶水2.5μl。
荧光定量PCR仪反应程序：于Lightcycler480 II荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为95℃ 30s，40循环(95℃ 5s，60℃ 30s)，每个样品反应设置3个复孔。
实验结果如图9A所示，在应用反应体系1(使用let-7a-5p特异性引物)进行荧光定量检测过程中，可以看出扩增曲线呈S型，仅有一个碱基差异的干扰序列let-7c-5p检测的Ct值和同浓度的目的序列let-7a-5p检测Ct值相差11，根据ΔCt计算，表示let-7c-5p对于let-7a-5p的检测干扰仅为0.05％。如图9B所示，在应用反应体系2(使用let-7c-5p特异性引物)进行荧光定量检测过程中，可以看出扩增曲线呈S型，仅有一个碱基差异的干扰序列let-7a-5p检测的Ct值和同浓度的目的序列let-7c-5p检测Ct值相差9，根据ΔCt计算，表示let-7c-5p对于let-7a-5p的检测干扰仅为0.2％。
可见，本发明提供的荧光探针检测方法可特异性检测仅有一个碱基差别的微小RNA的表达水平。
除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。
Claims (20)
- 一种检测微小RNA的方法，包括以下步骤：步骤1：在含有微小RNA的待测样品同时加入(a)聚腺苷酸加尾反应体系，用于得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；所述加尾反应体系含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；和(b)逆转录反应体系，用于得到逆转录的cDNA产物；所述逆转录体系含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；其中，所述的通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；其中所述通用逆转录引物的3’端的聚T寡核苷酸片段具有约10-20个碱基，5’端的延长标签序列片段具有约20-30个碱基；步骤2：在DNA扩增反应和荧光检测体系中对步骤1得到的cDNA逆转录产物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到扩增产物，其中，所述扩增所采用的引物对包括：下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物；同时，在反应体系中加入通用荧光探针，以及在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中检测报告基团的信号，从而获得所述微小RNA的检测结果，其中，所述下游通用引物特异性识别所述通用逆转录引物的序列；所述特异性上游引物特异性识别目标微小RNA；以及所述通用荧光探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交，其长度为约19-24个碱基。
- 根据权利要求1所述的方法，其中所述通用荧光探针5’端具有约10-15个寡聚腺苷酸，以及3’端还具有多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述下游通用引物Tm值为约55-65℃，优选为约60℃。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述特异性上游引物的Tm值为约55-65℃，优选为约60℃。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶选自：大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶、酵母聚腺苷酸聚合酶、牛聚腺苷酸聚合酶、青蛙聚腺苷酸聚合酶、人聚腺苷酸聚合酶和植物聚腺苷酸聚合酶，优选的，其为大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述具有逆转录酶活性的酶选自：HIV逆转录酶、M-MLV逆转录酶，EAIV逆转录酶，AMV逆转录酶，嗜热栖热菌DNA聚合酶I，M-MLV RNA酶H，Superscript，Superscript II，Superscript III，Sensiscript逆转录酶，ThermoScript和Thermo-X，优选的，其为M-MLV逆转录酶。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述通用逆转录引物的3’端的聚T寡核苷酸片段具有约15个碱基。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述通用逆转录引物的5’端的延长标签序列片段具有约27个碱基。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述通用逆转录引物的3’端还包括锚定碱基序列，例如为VN，其中“V”代表dATP、dGTP或dCTP；“N”代表dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的任意一种。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述下游通用引物识别所述通用逆转录引物的延长标签序列片段。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述特异性上游引物具有对应与目标miRNA的全长的序列。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述通用荧光探针识别和结合所述扩增产物中对应所述通用逆转录引物的片段，例如，所述通用荧光探针识别和结合所述通用逆转录引物的聚T寡核苷酸片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基。
- 根据权利要求12所述的方法，其中所述通用荧光探针的5’端具有约15个寡聚腺苷酸，以及3’端还具有多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。
- 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述通用荧光探针的3’标记淬灭基团和5’端标记报告基团。
- 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为包含目标微小RNA的组织或液体样品，例如为血浆、血清、淋巴液、尿液、唾液、乳汁、精液、阴道分泌液、泪液、脊髓液等体液样品。
- 一种用于检测微小RNA的试剂盒，其包括：(a)聚腺苷酸加尾反应体系，其含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；(b)逆转录反应体系，其含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转 录引物；(c)DNA扩增反应和荧光检测体系，其含有：用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的底物、下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物、通用荧光探针，其中，所述催化聚腺苷酸加尾反应的酶、所述催化逆转录反应的酶、所述通用逆转录引物、所述下游通用引物和特异性上游引物以及所述通用荧光探针如权利要求1-15中任一项定义，以及其中聚腺苷酸加尾反应体系(a)和逆转录反应体系(b)配置在一个反应体系中。
- 根据权利要求16所述的试剂盒，其中逆转录体系中的通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；其中所述通用逆转录引物的3’端的聚T寡核苷酸片段具有约10-20个碱基，5’端的延长标签序列片段具有约20-30个碱基。
- 根据权利要求16所述的试剂盒，其中DNA扩增反应和荧光检测体系中采用的引物对包括：下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物，所述下游通用引物Tm值为约55-65℃，优选为约60℃；以及所述特异性上游引物的Tm值为约55-65℃，优选为约60℃。
- 根据权利要求16所述的试剂盒，其中DNA扩增反应和荧光检测体系中采用的通用荧光探针5’端具有约10-15个寡聚腺苷酸，以及3’端还具有多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。
- 根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述样品为包含目标微小RNA的组织或液体样品，例如为血浆、血清、淋巴液、尿液、唾液、乳汁、精液、阴道分泌液、泪液、脊髓液等体液样品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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