CN117165664B - 一种在单碱基水平检测drach基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法，涉及分子生物学技术领域，该方法包括以下步骤：以待检RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所述cDNA为模板，体外转录得到不带有腺苷酸第六位氮原子甲基化修饰的RNA，作为对照RNA；根据该待检RNA的目标DRACH基序，设计得到上游探针和下游探针；利用该上游探针和下游探针，分别以该待检RNA和该对照RNA为模板，在相同条件下，仅使用实时荧光定量PCR仪(而非进行逆转录和荧光定量PCR反应)检测后获得熔解曲线；最后进行结果判定。该方法可在单碱基水平上实现对DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法。
背景技术
RNA腺苷酸第六位氮原子甲基化(N6-methyladenosine，m6A)修饰是调控mRNA剪接、翻译和稳定性的重要表观遗传学因素，是哺乳动物信使RNA中存在最为广泛的一种碱基化学修饰。近年来，大量研究表明，m6A修饰是否发生及其动态变化对多种疾病，例如神经退行性疾病，恶性肿瘤，基因变异罕见病，感染性疾病的临床诊断，治疗具有重要意义，研究m6A修饰的功能及其与疾病的相关性是靶向核酸的精准医学研究的前沿和热点方向。由于m6A修饰是腺苷酸上发生的一种特殊化学标记，而病原微生物通常无法编码m6A修饰甲基转移酶，病原体自身核酸无法发生修饰，因此，m6A修饰可能是区分外来病原体的核酸与细胞内源核酸的重要标记之一，在细胞和机体的抗病毒/细菌免疫反应的识别等过程中发挥重要功能。已有研究表明，新型冠状病毒等多种人类传染性病毒病原体的核酸中均发现有m6A修饰的存在。然而，由于m6A修饰不会改变腺苷酸与胸腺嘧啶或尿嘧啶的碱基配对能力，无法使用标准的杂交或基于测序的鉴定的方法检测RNA m6A修饰，因此，在单碱基水平精确定位m6A修饰位点仍然是国际上本领域研究的难点和重点之一。
目前，m6A修饰位点的鉴定主要通过分析待检测RNA与m6A特异性抗体的相互作用结合高通量测序来完成。此类高度依赖抗体的方法包括MERIP-m6A-seq、PA-m6A-seq和MiCLIP-m6A-seq等。此类方法耗时较长，成本较高，需要具有极高的操作技巧，更为重要的是，由于抗体与RNA结合十分不稳定，鉴定结果的可重复性较差，不适合临床或实际生产中对待测样本进行鉴定。因此，开发不依赖于抗体的单碱基水平m6A修饰检测方法十分重要。不需要依赖抗体的m6A修饰检测方法的实用性和可重复性均显著高于抗体依赖性检测方法，例如本发明阐述的高分辨率熔融(HRM)法以及MazF内切酶识别法(仅限于检测AmodCA基序中的修饰)等。
依赖抗体的m6A修饰检测方法主要包括以下几种：(1)MERIP-m6A-seq主要依靠一种识别m6A的抗体，识别并结合RNA上的m6A修饰位点，从而实现RNA的富集，然后利用高通量测序技术鉴定和抗体结合的含有m6A修饰的RNA转录本，从而获得m6A修饰在RNA中的具体位置范围。该方法的优点是相对简单，适用范围广，但也存在明显的缺陷，例如测序结果背景复杂，分辨率低。而且由于抗体蛋白空间占位较大，与之结合的核苷酸必须经过片段化处理后才能测序，然而，即使经片段化处理，平均RNA片段长度仍为100nt左右，因此无法通过该方法在单碱基水平精确鉴定m6A位点的位置和数量。(2)PA-m6A-seq是一种光交联辅助的m6A测序方法。在RNA提取之前，用光激活的核苷类似物4-硫氧尿嘧啶(4SU)处理靶细胞，使4SU掺入转录后的RNA中，然后进行RNA提取，提取的RNA与m6A特异性抗体结合，在365nm紫外光波长处进行交联，使含有4SU的RNA转录本能更好地与m6A特异性抗体结合。经核糖核酸酶和蛋白酶K处理后，产物会错误地结合到RNA-seq的反转录步骤中，导致交联点发生突变，突变后T大于C。该方法分辨率较高，可以达到32nts，而且由于实验中包括使用核糖核酸酶处理，没有被抗体结合和保护的RNA可以被消化，可以在一定程度上降低背景噪音。然而，这种检测RNA修饰的方法操作步骤繁杂，需要极高的实验条件和操作技巧。此外，MERIP-m6A-seq和PA-m6A-seq方法只能确定一段RNA序列中m6A修饰的存在，而MiCLIP-m6A-seq方法能在单碱基水平上确定m6A修饰位点的存在。这种方法高度依赖RNA和m6A特异性抗体之间的相互作用，这种相互作用需要在紫外光诱导下在RNA和抗体之间形成共价交联，然后用抗m6A抗体诱导RNA产生特异的突变特性，在对交联的RNA进行逆转录反应时，修饰位点处会发生高度特异性的突变或截断。通过计算和识别这些突变特征，能够鉴定出m6A修饰的准确位置。然而，由于该技术较为复杂，其可重复性较低，且检测和实验周期也很长。
不依赖于抗体的m6A修饰检测方法MazF内切酶识别法使用范围较为局限。其基于一种对m6A修饰敏感的核酸内切酶MazF，可以切割RNA单链5’端的ACA基序，但如果第一个A发生甲基化修饰，即m6ACA则不会被MazF切割。利用MazF的这一特性，将待检测的RNA用MazF进行消化，不存在m6A修饰时，由于模板RNA中ACA序列被MazF消化，因此逆转录反应在ACA序列中A的位置会发生终止，而存在m6A修饰时，RNA模板中的ACA序列经MazF处理后仍保有完整性，因此，逆转录反应在m6A修饰的位置不会停止。逆转录完成后对该基因进行扩增和测序，通过对比MazF处理组和对照组的序列，即可确定相对应的ACA位点是否被m6A修饰。然而，该方法只能用于鉴定ACA序列中的m6A修饰，通用性较差。
相对与其他种类RNA来说，病毒RNA具有多种复杂的结构，具有很高的热稳定性。病毒RNA中存在m6A修饰很早就已经被人发现，但目前缺少在单碱基水平上确定m6A修饰位点的方法，现有技术过于依赖m6A修饰特异性抗体，使得检测背景过于复杂，只能确定m6A修饰位点存在的范围，难以在单碱基水平上确定具体的m6A修饰位点，并且现有技术中的方法还存在依赖高通量测序技术的缺陷，使得其对RNA质量要求高，检测耗费时间长，成本高。
研究表明，RNA的m6A修饰通常发生在DRAmodCH(D＝A,G or U；R＝G or A；H＝A,C,or U)基序中，而发生在腺苷酸上的其他甲基化修饰，则出现在不同类型的基序中(例如m1A发生在GUUCNANNC或GUUCRA基序中)，虽然这种序列选择性修饰机制尚不清楚，但大量的基于m6A修饰特异性抗体结合的测序结果表明，DRACH基序中只有第三个碱基A会发生m6A修饰。基于此，本发明提出了一种在单碱基水平检测DRACH基序中m6A修饰的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法可在单碱基水平上实现对DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的检测，且对待检RNA质量要求低，检测过程不依赖抗体和高通量测序技术，具有低成本和检测耗时短的优势。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法，包括以下步骤：
(1)以待检RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所述cDNA为模板，体外转录得到不带有腺苷酸第六位氮原子甲基化修饰的RNA，作为对照RNA；
(2)根据所述待检RNA的目标DRACH基序，设计得到上游探针和下游探针；
(3)利用所述上游探针和所述下游探针，分别以所述待检RNA和所述对照RNA为模板，在相同条件下，利用实时荧光定量PCR仪进行检测，分别获得所述待检RNA和所述对照RNA的熔解曲线；
(4)结果判定：当所述待检RNA的熔解温度相对于所述对照RNA发生降低，并且降低温度>1℃，则判定待测位点具有腺苷酸第六位氮原子甲基化修饰；
在步骤(2)中，所述上游探针为5’-(D+8)cN24-3’，其中，5’端标记有荧光基团FAM；(D+8)c为所述目标DRACH基序中D上游的第8个碱基的互补配对碱基；N24为所述目标DRACH基序中D上游3'-5'方向第9个碱基到第32个碱基互补配对的序列；
所述下游探针为5’-(H-4)c(H-3)c(H-2)c(H-1)cHcGTRcDcN7-3’，其中3’标记有荧光基团BHQ；(H-4)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第4个碱基互补配对的碱基，(H-3)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第3个碱基互补配对的碱基，(H-2)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第2个碱基互补配对的碱基，(H-1)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第1个碱基互补配对的碱基，Hc与所述目标DRACH基序中的H互补配对，Rc和Dc分别与所述目标DRACH基序中R和D互补配对，N7为从所述目标DRACH基序中D上游3'-5'方向第1个碱基到第7个碱基互补配对的序列；
进一步地，在步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为：上游探针0.4μmol，下游探针0.2μmol，所述待检RNA或所述对照RNA 2μg，1mol/L KCI溶液0.4μL，1mol/LTris-HCI溶液0.5μL，RNase-Free H2O补足至10μL。
进一步地，在步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：80℃孵育3min后降温至20℃，然后以速率为1℃/min升温至80℃。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法，该方法基于高分辨率熔融法，可在单碱基水平上确定病毒RNA中所存在的m6A修饰的具体位点，在检测过程中不依赖抗体和任何高通量测序技术，对待检测的病毒RNA样本要求低，且检测时间短，检测过程仅需2小时即可。
本发明提供的在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法对待检测RNA样本要求低，RNA样本可仅为病毒RNA，也可为病毒感染细胞后的细胞总RNA等原料，尤其是当RNA样本仅为病毒RNA时，检测过程不会有其他RNA干扰。而且，该方法仅需合成与病毒序列相对应的带有荧光基团的探针，所使用仪器仅为实时荧光定量PCR仪，而非进行逆转录和荧光定量PCR反应，因此，所需实验成本低廉，利于该方法在普通实验室的推广和应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的实时荧光定量PCR熔解曲线；
图2为实施例2的实时荧光定量PCR熔解曲线；
图3为实施例3的实时荧光定量PCR熔解曲线；
图4为实施例4的实时荧光定量PCR熔解曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，所使用到的探针如表1所示：
表1
在本发明中，针对待测RNA的某一可能存在m6A修饰的位点设计探针，探针设计原则为：
(1)与待测基序前结合的探针序列长度为25个碱基，5’端带有FAM荧光基团，5’端第一个碱基与DRACH中D上游的第8个碱基互补配对。
(2)与待测位点后结合探针序列长度为16个碱基，3’端带有BHQ荧光基团，5’端第一个碱基与DRACH中H下游的第4个碱基互补配对。
例：上游探针：(5’-3’)FAM-(D+8)cN24；
下游探针：(5’-3’)(H-4)c(H-3)c(H-2)c(H-1)cHcGTRcDcN7-BHQ；其中，(D+8)c为所述目标DRACH基序中D上游的第8个碱基的互补配对碱基；N24为所述目标DRACH基序中D上游3'-5'方向第9个碱基到上游第32个碱基互补配对的序列；
(H-4)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第4个碱基互补配对的碱基，(H-3)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第3个碱基互补配对的碱基，(H-2)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第2个碱基互补配对的碱基，(H-1)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第1个碱基互补配对的碱基，Hc与所述目标DRACH基序中的H互补配对，Rc和Dc分别与所述目标DRACH基序中R和D互补配对，N7为从所述目标DRACH基序中D上游3'-5'方向第1个碱基到第7个碱基互补配对的序列。
实施例1
以目前已被明确发现的人18s核糖体RNA中的具有m6A修饰的第1832位腺苷酸为例对本发明的方法进行说明。
人18s核糖体RNA的cDNA序列(SEQ ID NO.9)为：
tacctggttgatcctgccagtagcatatgcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtacgcacggccggtacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatggttcctttggtcgctcgctcctctcctacttggataactgtggtaattctagagctaatacatgccgacgggcgctgacccccttcgcgggggggatgcgtgcatttatcagatcaaaaccaacccggtcagcccctctccggccccggccggggggcgggcgccggcggctttggtgactctagataacctcgggccgatcgcacgccccccgtggcggcgacgacccattcgaacgtctgccctatcaactttcgatggtagtcgccgtgcctaccatggtgaccacgggtgacggggaatcagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccactcccgacccggggaggtagtgacgaaaaataacaatacaggactctttcgaggccctgtaattggaatgagtccactttaaatcctttaacgaggatccattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgctgcagttaaaaagctcgtagttggatcttgggagcgggcgggcggtccgccgcgaggcgagccaccgcccgtccccgccccttgcctctcggcgccccctcgatgctcttagctgagtgtcccgcggggcccgaagcgtttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcccgagccgcctggataccgcagctaggaataatggaataggaccgcggttctattttgttggttttcggaactgaggccatgattaagagggacggccgggggcattcgtattgcgccgctagaggtgaaattcttggaccggcgcaagacggaccagagcgaaagcatttgccaagaatgttttcattaatcaagaacgaaagtcggaggttcgaagacgatcagataccgtcgtagttccgaccataaacgatgccgaccggcgatgcggcggcgttattcccatgacccgccgggcagcttccgggaaaccaaagtctttgggttccggggggagtatggttgcaaagctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaacctcacccggcccggacacggacaggattgacagattgatagctctttctcgattccgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctggttaattccgataacgaacgagactctggcatgctaactagttacgcgacccccgagcggtcggcgtcccccaacttcttagagggacaagtggcgttcagccacccgagattgagcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtccggggctgcacgcgcgctacactgactggctcagcgtgtgcctaccctacgccggcaggcgcgggtaacccgttgaaccccattcgtgatggggatcggggattgcaattattccccatgaacgaggaattcccagtaagtgcgggtcataagcttgcgttgattaagtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattggatggtttagtgaggccctcggatcggccccgccggggtcggcccacggccctggcggagcgctgagaagacggtcgaacttgactatctagaggaagtaaaagtcgtaA1832caaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcatta，其中第1832位腺苷酸(大写字母处)处在DRACH基序(下划线处)上，且现有文献已明确其具有m6A修饰。
检测人18s核糖体RNA中第1832位腺苷酸的m6A修饰：
(1)在待检样本HEK-293T细胞中提取得到总RNA。
(2)以总RNA为模板反转录得到待检样本cDNA，再使用体外制备RNA试剂盒进行体外转录，获得不带有m6A修饰的RNA，作为对照。
(3)针对人18s核糖体RNA中第1832位的检测位点，设计探针CYR001和CYR002(见表1)。
(4)利用探针CYR001和CYR002，分别以步骤(1)得到的待检样本总RNA和步骤(2)得到的对照RNA为模板，在相同条件下，利用实时荧光定量PCR仪进行检测，获得二者的熔解曲线。
其中，实时荧光定量PCR检测的反应体系见表2：
表2实时荧光定量PCR检测的反应体系
| 试剂 | 加入量 |
| 带有BHQ荧光基团的探针 | 0.4μmol |
| 带有FAM荧光基团的探针 | 0.2μmol |
| 待测RNA/不带有m6A修饰的RNA | 2μg |
| 1mol/L KCI溶液 | 0.4μL |
| 1mol/L Tris-HCI溶液(pH＝8.0) | 0.5μL |
| RNase-Free H2O | Up to 10μL |
实时荧光定量PCR检测的反应程序为：80℃孵育3min后逐步降温(每分钟降低1℃)至20℃，然后以速率为1℃/min升温至80℃。
(5)检测结果：如图1所示，待检样本组的探针与RNA结合后出现了明显的特异性峰，并且与对照组相比，待检样本组的熔解温度发生了降低(降低2℃)，证明人18s核糖体RNA的第1832位腺苷酸确实存在m6A修饰。
实施例2
检测目标：人28s rRNA的4190A位点
人28s rRNA的cDNA序列(SEQ ID NO.10)：
TGAAGCGCGGGTAAACGCGACCTCAGATCAGACGTGGCGACCCGCTGAATTTAAGCATATTAGTCAGCGGAGGAGAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAACGGCGAGTGAACAGGGAAGAGCCCAGCGCCGAATCCCCGCCCCGCGGCGGGGCGCGGGACATGTGGCGTACGGAAGACCCGCTCCCCGGCGCCGCTCGTGGGGGGCCCAAGTCCTTCTGATCGAGGCCCAGCCCGTGGACGGTGTGAGGCCGGTAGCGGCCCCCGGCGCGCCGGGCCCGGGTCTTCCCGGAGTCGGGTTGCTTGGGAATGCAGCCCAAAGCGGGTGGTAAACTCCATCTAAGGCTAAATACCGGCACGAGACCGATAGTCAACAAGTACCGTAAGGGAAAGTTGAAAAGA
ACTTTGAAGAGAGAGTTCAAGAGGGCGTGAAACCGTTAAGAGGTAAACGGGTGGGGTC
CGCGCAGTCCGCCCGGAGGATTCAACCCGGCGGCGGGTCCGGCCGTGTCGGCGGCCCG
GCGGATCTTTCCCGCCCCCCGTTCCTCCCGACCCCTCCACCCGCCCTCCCTTCCCCCGCC
GCCCCTCCTCCTCCTCCCCGGAGGGGGCGGGCTCCGGCGGGTGCGGGGGTGGGCGGGC
GGGGCCGGGGGTGGGGTCGGCGGGGGACCGTCCCCCGACCGGCGACCGGCCGCCGCC
GGGCGCATTTCCACCGCGGCGGTGCGCCGCGACCGGCTCCGGGACGGCTGGGAAGGCC
CGGCGGGGAAGGTGGCTCGGGGGGCCCCGTCCGTCCGTCCGTCCGTCCTCCTCCTCCCC
CGTCTCCGCCCCCCGGCCCCGCGTCCTCCCTCGGGAGGGCGCGCGGGTCGGGGCGGCG
GCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGGACCGAAACCCCCCCCGAGTGTT
ACAGCCCCCCCGGCAGCAGCACTCGCCGAATCCCGGGGCCGAGGGAGCGAGACCCGTC
GCCGCGCTCTCCCCCCTCCCGGCGCCCACCCCCGCGGGGAATCCCCCGCGAGGGGGGT
CTCCCCCGCGGGGGCGCGCCGGCGTCTCCTCGTGGGGGGGCCGGGCCACCCCTCCCAC
GGCGCGACCGCTCTCCCACCCCTCCTCCCCGCGCCCCCGCCCCGGCGACGGGGGGGGT
GCCGCGCGCGGGTCGGGGGGCGGGGCGGACTGTCCCCAGTGCGCCCCGGGCGGGTCG
CGCCGTCGGGCCCGGGGGAGGTTCTCTCGGGGCCACGCGCGCGTCCCCCGAAGAGGGG
GACGGCGGAGCGAGCGCACGGGGTCGGCGGCGACGTCGGCTACCCACCCGACCCGTCT
TGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACACGTGCGCGAGTCGGGGGCTCGCACGAAAGCC
GCCGTGGCGCAATGAAGGTGAAGGCCGGCGCGCTCGCCGGCCGAGGTGGGATCCCGAG
GCCTCTCCAGTCCGCCGAGGGCGCACCACCGGCCCGTCTCGCCCGCCGCGCCGGGGAG
GTGGAGCACGAGCGCACGTGTTAGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGGGCAGGG
CGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGTCCGTAGCGGTCCTGACGTGCAAATCGGTCG
TCCGACCTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCCG
AAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGCGCTCTCGCAGACCCGACGCACCCCCGCCACGCAGTT
TTATCCGGTAAAGCGAATGATTAGAGGTCTTGGGGCCGAAACGATCTCAACCTATTCTCA
AACTTTAAATGGGTAAGAAGCCCGGCTCGCTGGCGTGGAGCCGGGCGTGGAATGCGAG
TGCCTAGTGGGCCACTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGCTGCGGGATGAACCGAACGCCG
GGTTAAGGCGCCCGATGCCGACGCTCATCAGACCCCAGAAAAGGTGTTGGTTGATATAG
ACAGCAGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACC
TGCCGAATCAACTAGCCCTGAAAATGGATGGCGCTGGAGCGTCGGGCCCATACCCGGCC
GTCGCCGGCAGTCGAGAGTGGACGGGAGCGGCGGGGGCGGCGCGCGCGCGCGCGCGT
GTGGTGTGCGTCGGAGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGGGGTGTGGGGTCCTTCCCC
CGCCCCCCCCCCCACGCCTCCTCCCCTCCTCCCGCCCACGCCCCGCTCCCCGCCCCCGG
AGCCCCGCGGACGCTACGCCGCGACGAGTAGGAGGGCCGCTGCGGTGAGCCTTGAAGC
CTAGGGCGCGGGCCCGGGTGGAGCCGCCGCAGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAA
TATTCAAACGAGAACTTTGAAGGCCGAAGTGGAGAAGGGTTCCATGTGAACAGCAGTT
GAACATGGGTCAGTCGGTCCTGAGAGATGGGCGAGCGCCGTTCCGAAGGGACGGGCGA
TGGCCTCCGTTGCCCTCGGCCGATCGAAAGGGAGTCGGGTTCAGATCCCCGAATCCGGA
GTGGCGGAGATGGGCGCCGCGAGGCGTCCAGTGCGGTAACGCGACCGATCCCGGAGAA
GCCGGCGGGAGCCCCGGGGAGAGTTCTCTTTTCTTTGTGAAGGGCAGGGCGCCCTGGA
ATGGGTTCGCCCCGAGAGAGGGGCCCGTGCCTTGGAAAGCGTCGCGGTTCCGGCGGCG
TCCGGTGAGCTCTCGCTGGCCCTTGAAAATCCGGGGGAGAGGGTGTAAATCTCGCGCCG
GGCCGTACCCATATCCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTGGCATGTTGGAACA
ATGTAGGTAAGGGAAGTCGGCAAGCCGGATCCGTAACTTCGGGATAAGGATTGGCTCTA
AGGGCTGGGTCGGTCGGGCTGGGGCGCGAAGCGGGGCTGGGCGCGCGCCGCGGCTGG
ACGAGGCGCCGCCGCCCCCCCCACGCCCGGGGCACCCCCCTCGCGGCCCTCCCCCGCC
CCACCCCGCGCGCGCCGCTCGCTCCCTCCCCACCCCGCGCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
CCCCGCTCCCCGTCCTCCCCCCTCCCCGGGGGAGCGCCGCGTGGGGGCGGCGGCGGGG
GGAGAAGGGTCGGGGCGGCAGGGGCCGGCGGCGGCCCGCCGCGGGGCCCCGGCGGCG
GGGGCACGGTCCCCCGCGAGGGGGGCCCGGGCACCCGGGGGGCCGGCGGCGGCGGCG
ACTCTGGACGCGAGCCGGGCCCTTCCCGTGGATCGCCCCAGCTGCGGCGGGCGTCGCG
GCCGCCCCCGGGGAGCCCGGCGGGCGCCGGCGCGCCCCCCCCACCCCCACCCCGCGTC
TCGTCGCGCGCGCGTCCGCTGGGGGCGGGGAGCGGTCGGGCGGCGGCGGTCGGCGGG
CGGCGGGGCGGGGCGGTTCGTCCCCCCGCCCTACCCCCCCGGCCCCGTCCGCCCCCCGT
TCCCCCCTCCTCCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGGCGGCGGAGGGGCCGC
GGGCCGGTCCCCCCCGCCGGGTCCGCCCCCGGGGCCGCGGTTCCGCGCGGCGCCTCGC
CTCGGCCGGCGCCTAGCAGCCGACTTAGAACTGGTGCGGACCAGGGGAATCCGACTGT
TTAATTAAAACAAAGCATCGCGAAGGCCCGCGGCGGGTGTTGACGCGATGTGATTTCTG
CCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAATGAAGCGCGGGTAAACGGCGGGA
GTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGA
ATGGATGAACGAGATTCCCACTGTCCCTACCTACTATCCAGCGAAACCACAGCCAAGGG
AACGGGCTTGGCGGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCTG
GCACGGTGAAGAGACATGAGAGGTGTAGAATAAGTGGGAGGCCCCCGGCGCTCCCCCGGTGTCCCCGCGAGGGGCCCGGGGCGGGGTCCGCCGGCCCTGCGGGCCGCCGGTGAAATACCACTACTCTGATCGTTTTTTCACTGACCCGGTGAGGCGGGGGGGCGAGCCCCGAGGGGCTCTCGCTTCTGGCGCCAAGCGCCCGGCCGCGCGCCGGCCGGGCGCGACCCGCTCCGGGGA4190CAGTGCCAGGTGGGGAGTTTGACTGGGGCGGTACACCTGTCAAACGGTAACGCAGGTGTCCTAAGGCGAGCTCAGGGAGGACAGAAACCTCCCGTGGAGCAGAAGGGCAAAAGCTCGCTTGATCTTGATTTTCAGTACGAATACAGACCGTGAAAGCGGGGCCTCACGATCCTTCTGACCTTTTGGGTTTTAAGCAGGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGATGTGTTGTTGCCATGGTAATCCTGCTCAGTACGAGAGGAACCGCAGGTTCAGACATTTGGTGTATGTGCTTGGCTGAGGAGCCAATGGGGCGAAGCTACCATCTGTGGGATTATGACTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCCGCCCAGGCGGAACGATACGGCAGCGCCGCGGAGCCTCGGTTGGCCTCGGATAGCCGGTCCCCCGCCTGTCCCCGCCGGCGGGCCGCCCCCCCCTCCACGCGCCCCGCGCGCGCGGGAGGGCGCGTGCCCCGCCGCGCGCCGGGACCGGGGTCCGGTGCGGAGTGCCCTTCGTCCTGGGAAACGGGGCGCGGCCGGAAAGGCGGCCGCCCCCTCGCCCGTCACGCACCGCACGTTCGTGGGGAACCTGGCGCTAAACCATTCGTAGACGACCTGCTTCTGGGTCGGGGTTTCGTACGTAGCAGAGCAGCTCCCTCGCTGCGATCTATTGAAAGTCAGCCCTCGACACAAGGGTTTGT；其中第4190位腺苷酸处在DRACH基序(下划线处)上，且具有m6A修饰。
(1)在HEK-293T细胞中提取得到总RNA。
(2)以总RNA为模板反转录得到待检样本cDNA，再使用体外制备RNA试剂盒进行体外转录，获得一定不带有m6A修饰的RNA，作为对照。
(3)针对人28s核糖体RNA中第4190位的检测位点，设计探针CYR003和CYR004(见表1)。
(4)利用探针CYR003和CYR004，分别以步骤(1)得到的待检样本总RNA和步骤(2)得到的对照RNA为模板，在相同条件下，利用实时荧光定量PCR仪进行检测，获得二者的熔解曲线；
其中，实时荧光定量PCR检测的反应体系和反应程序同实施例1。
(5)检测结果：如图2所示，待检样本组的探针与RNA结合后出现了明显的特异性峰，并且与对照组相比，待检样本组的熔解温度发生了降低(降低3℃)，证明人28s核糖体RNA的第4190位腺苷酸确实存在m6A修饰。
实施例3
检测目标：EV71 RNA 3062A
EV71 RNA的cDNA序列(SEQ ID NO.11)：
GTTGCACCCACCCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACTCTGGCACTGAGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTTACTTCCCTTCCCCAAAGTAATTTAGAAGTTGTGCACCAACGATCAATAGCAGGTGTGACGCACCAGTCATATCTTGATCAAGTATTTCTGTTTCCCCGGACCGAGTATCAATAAGCTGCTCGCGCGGCTGAAGGAGAAAACGTTCGTTACCCGACCAACTACTTCGAGAAGCTTAGTACCACCATGAATGAGGCAGAGTGTTTCGTTCAGCACAACCCCGGTGTAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCAAACCCCATGGGCGACCATGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGAGAAATCCATGGGACGCTCTAATTCTGACATGGTGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCTCACAAACCAGTGGGTGGTGTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTACTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATCAAAGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTGCAACAGAGCAATTGTTTACCTATTTATTGGTTTCGTACCACTATCACTGAAGTCTGTGATCACTCTCAAATTCATTCTGACCCTCAACTCAATCAAACATGGGCTCACAGGTATCCGCACAACGCTCCGGTTCTCATGAGAACTCCAACTCAGCTACTGAGGGCTCCACTATAAATTACACTACCATTAATTACTATAAAGACTCCTATGCTGCCACAGCAGGTAAACAGAGTCTCAAGCAGGACCCAGACAAGTTCGCAAACCCTGTCAAGGACATCTTCACTGAAATGGCAGCGCCATTAAAATCCCCATCCGCTGAGGCGTGCGGTTACAGCGATCGGGTAGCACAATTAACTATTGGCAACTCTACCATCACCACACAAGAAGCAGCAAACATCATAGTTGGCTATGGTGAGTGGCCTTCCTATTGCTCGGATTCTGACGCTACAGCAGTGGACAAGCCAACGCGCCCAGACGTTTCGGTGAATAGGTTTTACACATTAGACACCAAGCTGTGGGAGAAATCATCCAAGGGGTGGTACTGGAAATTCCCGGATGTGTTAACTGAAACCGGGGTCTTTGGTCAAAACGCACAGTTCCACTACCTCTATCGGTCAGGGTTCTGCATTCACGTGCAGTGCAATGCTAGTAAATTCCACCAAGGAGCACTCCTAGTTGCTGTCCTCCCAGAGTACGTCATTGGGACCGTAGCAGGTGGCACAGGGACGGAAGATAGTCACCCTCCATACAAGCAGACTCAACCCGGTGCTGATGGCTTTGAGTTGCAACACCCGTACGTGCTTGATGCTGGCATTCCAATATCACAATTGACAGTGTGCCCACACCAGTGGATTAATTTGAGGACCAACAACTGCGCCACAATAATAGTACCGTACATAAACGCACTACCCTTTGATTCTGCCTTGAATCATTGTAATTTTGGCCTGTTGGTTGTGCCTATTAGCCCATTAGATTATGACCAAGGTGCGACGCCAGTGATTCCTATTACTATCACCCTGGCCCCGATGTGTTCCGAGTTTGCAGGCCTTAGACAAGCAGTTACGCAAGGGTTTCCTACTGAGCTGAAACCTGGTACAAATCAATTTCTAACTACTGACGATGGTGTTTCAGCACCCATCCTGCCGAACTTCCACCCTACCCCATGTATCCATATACCTGGTGAAGTTAGGAATTTGCTAGAGTTATGCCAGGTGGAGACTATTTTAGAAGTCAACAATGTACCCACGAATGCCACTAGCTTAATGGAGAGACTGCGCTTCCCGGTCTCAGCCCAGGCTGGAAAAGGTGAGTTATGTGCAGTGTTCAGAGCTGATCCCGGGCGAAGCGGACCATGGCAGTCCACCTTGTTGGGTCAGTTGTGCGGGTACTACACCCAATGGTCAGGGTCACTGGAAGTTACCTTCATGTTCACTGGATCCTTTATGGCTACTGGTAAGATGCTTATAGCATACACACCGCCAGGAGGCCCCTTACCCAAGGACCGGGCAACCGCCATGTTGGGCACGCACGTCATCTGGGACTTTGGGCTGCAATCGTCTGTCACCCTTGTGATACCATGGATTAGTAACACTCATTACAGAGCGCACGCTCGTGACGGTGTGTTTGACTACTACACTACAGGTTTGGTTAGCATATGGTACCAGACGAACTACGTGGTCCCAATTGGAGCACCCAATACAGCCTATATAATAGCACTGGCGGCAGCTCAGAAGAATTTCACCATGAAGCTATGTAAGGATGCTAGTGATATCCTGCAGACAGGCACTATTCAGGGAGATAGGGTGGCAGATGTGATTGAGAGTTCTATAGGGGATAGTGTGAGCAGAGCCCTTACTCGAGCTCTACCGGCACCTACAGGCCAAGACACGCAGGTAAGCAGCCATCGATTGGACACTGGCAAAGTTCCAGCGCTCCAAGCCGCTGAAATTGGTGCATCATCAAATGCTAGTGATGAGAGCATGATCGAGACGCGATGCGTTCTTAATTCACATAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGCTTTTTCAGCAGGGCAGGATTAGTTGGAGAAATAGACCTCCCTCTTGAAGGCACAACCAACCCGAATGGGTACGCAAACTGGGATATAGATATAACAGGCTACGCGCAAATGCGTAGAAAGGTGGAGTTGTTCACCTACATGCGTTTCGACGCAGAGTTCACCTTTGTAGCATGCACGCCCACCGGGGAAGTCGTCCCGCAGCTGCTCCAGTATATGTTTGTACCACCTGGAGCCCCCAAGCCAGACTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACTGCCACTAATCCCTCAGTCTTTGTGAAGCTGTCAGATCCCCCAGCACAGGTTTCAGTTCCCTTCATGTCACCTGCGAGCGCCTACCAATGGTTCTATGATGGGTATCCCACATTCGGTGAA3062CACAAGCAGGAGGAAGATCTTGAATATGGGGCATGCCCAAACAACATGATGGGTACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGAACTTCGAAGTCCAAGTACCCACTGGTGATCAGGATTTACATGAGGATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGTCCAATGCGCAATCAAAATTATCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCCGGCAACTCCATCAAACCAACAGGCGCCAGTCGCACAGCAATCACCACCCTCGGGAAGTTCGGACAACAGTCCGGGGCCATCTACGTGGGCAACTTCAGAGTAGTCAACCGCCATCTTGCCACTCATAATGACTGGGCAAATCTTGTTTGGGAAGACAGCTCCCGCGATCTACTTGTATCATCTACCACTGCCCAAGGTTGTGACACGATTGCTCGTTGCAATTGCCAAACAGGAGTGTATTATTGTAACTCAATGAGAAAACACTATCCAGTCAGTTTCTCGAAACCCAGTTTGATCTTTGTAGAGGCCAGCGAGTATTACCCGGCTAGATACCAGTCGCACCTCATGCTTGCAGTGGGTCACTCAGAACCAGGGGATTGCGGTGGCATCCTTAGATGTCAACATGGCGTCGTAGGAATAGTTTCCACCGGGGGAAACGGCCTGGTGGGGTTTGCTGATGTGAGGGACCTCCTGTGGTTGGATGATGAGGCTATGGAGCAGGGCGTGTCTGATTACATCAAAGGACTTGGAGATGCTTTTGGCATGGGGTTTACAGACGCAGTGTCAAGAGAAGTTGAAGCATTGAAGAATCACTTGATTGGTTCAGAGGGTGCCGTGGAGAAAATTCTTAAGAACTTAGTTAAACTCATTTCTGCGCTCGTCATTGTCATCAGGAGCGATTATGACATGGTCACGTTGACGGCAACACTTGCCCTGATCGGGTGCCACGGGAGCCCCTGGGCCTGGGTCAAATCGAAAACAGCGTCAATTTTGGGCATTCCGATGGCTCAGAAGCAGAGTGCCTCTTGGTTGAAGAAGTTCAATGATGCGGCGAGCGCCGCTAAGGGGCTTGAGTGGATCTCCAACAAAATCAGCAAATTTATCGATTGGCTCAAGGAGAAAATTGTTCCGGCTGCTAGAGAGAAAGTCGAATTTCTAAATAATCTAAAGCAGCTCCCCTTGTTGGAGAACCAAATTTCCAATCTCGAACAATCAGCAGCTTCGCAGGAGGACCTTGAAGCGATGTTCGGCAATGTGTCTTATCTGGCCCACTTCTGCCGCAAATTCCAACCCCTCTATGCTACGGAAGCGAAGAGGGTGTACGCCCTGGAAAAGAGAATGAATAATTACATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGAACCTGTATGTCTAATCATTAGGGGCTCACCTGGTACTGGGAAGTCCTTGGCAACAGGGATTATTGCTAGGGCTATAGCAGACAAGTATCACTCCAGTGTGTATTCCTTACCTCCGGACCCAGACCACTTTGATGGGTATAAA4562CAACAGATCGTCACTGTTATGGATGACCTGTGCCAAAACCCAGACGGGAAGGACATGTCACTATTTTGTCAGATGGTCTCCACAGTGGATTTTATACCGCCTATGGCATCTCTGGAAGAAAAGGGAGTCTCATTCACCTCCAAGTTTGTGATCGCCTCCACTAACGCCAGCAATATCATAGTGCCAACAGTCTCGGATTCGGATGCCATTCGCCGTCGATTCTTTATGGACTGTGACATTGAGGTAACTGATTCCTATAAGACAGAACTGGGTAGGCTCGATGCAGGGAGAGCAGCTAGGCTGTGCTCTGAGAACAACACTGCAAACTTTAAACGGTGTAGTCCATTGGTCTGCGGGAAAGCAATCCAGCTTAGGGATAGGAAGTCCAAGGTGAGATACAGTTTGGACACTGTGGTGAGTGAGCTTGTCAGGGAGTATAACAACAGATCCGTTATTGGGAACACCATTGAAGCTCTCTTCCAGGGACCCCCTAAATTTAGACCGATAAGGATTAGCCTAGAGGAGAAGCCTGCACCTGATGCTATTAGTGACCTATTAGCTAGTGTTGATAGTGAAGAGGTCCGCCAATACTGTAGAGACCAGGGATGGATTGTACCTGACTCTCCCACCAATGTTGAGCGCCACCTAAGTAGAGCTGTCTTGATTGTGCAATCTGTGGCCACCGTGGTAGCAGTTGTGTCCCTTGTTTACGTTATCTAC
AAGTTGTTCGCCGGCTTTCAAGGGGCATATTCCGGCGCCCCCAAGCAAACGCTCAAGAA
ACCAGTGCTGCGCACGGCAACTGTGCAGGGGCCGAGCTTGGACTTCGCCCTATCTTTAC
TTAGGAGAAACATTAGGCAGGTCCAAACCGATCAGGGTCACTTTACAATGTTAGGAGTG
CGAGACCACTTGGCTGTGCTCCCCAGGCACTCCCAACCAGGTAAAACCATCTGGGTTGA
ACACAAGTTAGTGAAGATTGTAGACGCTGTAGAGCTAGTAGATGAACAAGGGGTTAACC
TGGAGCTCACATTGGTAACGCTTGACACCAACGAAAAATTTAGAGACATCACAAGATTC
ATACCAGAAACAATTAGTCCTGCTAGTGATGCCACTTTAGTTATAAATACTGAACATATGC
CCAGTATGTTTGTGCCAGTTGGGGATGTGGTCCAGTATGGATTTTTGAATCTTAGTGGTA
AACCCACTCACAGGACTATGATGTACAATTTTCCAACTAAAGCAGGACAGTGTGGTGGT
GTTGTGACTGCCGTGGGTAAAGTGATTGGGATCCACATTGGTGGCAACGGTAGGCAAGG
CTTTTGCGCCGCCTTAAAGAGAGGATACTTTTGTAGTGAGCAGGGTGAGATTCAATGGAT
GAAACCCAACAAAGAAACTGGCAGATTGAACATCAACGGACCTACTCGCACTAAGCTT
GAACCAAGTGTCTTCCACGACGTGTTCGAGGGCACCAAAGAGCCAGCAGTGCTTACCA
GCAAAGACCCAAGGCTGGAAGTTGACTTTGAACAGGCTCTTTTCTCTAAATACGTGGGA
AACACACTCCATGAGCCCGACGAGTTTGTCAAGGAGGCGGCCTTACATTATGCTAATCA
ACTCAAGCAGTTAGATATCAAGACCACCAAGATGAGTATGGAGGATGCTTGTTACGGTA
CAGAGAACCTGGAAGCCATAGATCTTCACACAAGTGCAGGATATCCATACAGTGCACTA
GGCATCAAGAAGAGGGACATTTTGGACCCAACAACTCGTGATGTCAGCAAGATGAAATT
CTACATGGACAAGTACGGGTTGGATTTACCGTACTCCACTTATGTTAAAGATGAGCTTAG
GGCAATCGACAAGATCAAGAAAGGTAAGTCTCGTCTTATAGAGGCAAGCAGTCTAAATG
ATTCAGTGTACTTGAGAATGACATTTGGGCACCTTTATGAAGTTTTTCACGCCAACCCAG
GTACAGTCACTGGCTCAGCTGTTGGGTGCAACCCGGATGTGTTCTGGAGTAAGTTACCA
ATTCTACTTCCAGGGTCGCTTTTTGCGTTTGACTACTCGGGATATGATGCTAGTCTTAGCC
CAGTGTGGTTCAGAGCGCTGGAGATAGTCCTGCGGGAGATTGGGTACTCTGAGGACGC
AGTGTCTCTCATAGAAGGGATCAATCACACCCATCATGTGTACCGCAACACAACTTATTG
TGTTCTTGGGGGAATGCCCTCAGGTTGCTCAGGCACTTCCATTTTCAACTCGATGATCAA
CAATATCATTATTAGGACACTCCTGATTAAAACATTCAAAGGGATAGATTTGGATGAATTA
AACATGGTGGCCTACGGGGATGATGTGCTGGCTAGCTACCCCTTCCCAATTGACTGTCTG
GAATTGGCGAAAACAGGCAAGGAGTATGGTTTAACCATGACCCCTGCCGACAAGTCAC
CCTGCTTCAATGAAGTCACATGGGAAAATGCCACTTTCTTGAAGAGAGGATTCTTGCCC
GATCATCAATTCCCATTCCTCATCCACCCCACGATGCCAATGAGAGAGATTCACGAGTCC
ATTCGTTGGACTAAAGACGCACGAAGTACTCAAGATCACGTGCGCTCCCTCTGCCTATTA
GCATGGCACAATGGGAAAGAAGAGTATGAAAAATTTGTGGGTATAATCAGATCAGTTCC
AATTGGAAAAGCACTGGCTATACCGAATTTTGAGAACCTGAGAAGGAATTGGCTCGAAT
TGTTTTGAACTTACAGTTTGTAACTGGACCCCACCAGTAATCTGGTCGCGTTAATGACTGGTGGGGGTAAATTTGTTATAACCAGAATAG；其中第3062位和4562腺苷酸(大写字母处)均处在DRACH基序(下划线处)上，且均具有m6A修饰。
(1)提取EV71基因组RNA。
(2)以基因组RNA为模板反转录得到待检样本cDNA，再使用体外制备RNA试剂盒进行体外转录，获得一定不带有m6A修饰的RNA，作为对照。
(3)针对EV71 RNA 3062A的检测位点，设计探针CYR005和CYR006(见表1)。
(4)利用探针CYR005和CYR006，分别以步骤(1)得到的待检样本基因组RNA和步骤(2)得到的对照RNA为模板，在相同条件下，利用实时荧光定量PCR仪进行检测，获得二者的熔解曲线；
其中，实时荧光定量PCR检测的反应体系和反应程序同实施例1。
(5)检测结果：如图3所示，待检样本组的探针与RNA结合后出现了明显的特异性峰，并且与对照组相比，待检样本组的熔解温度发生了降低(降低2℃)，证明EV71 RNA3062A确实存在m6A修饰。
实施例4
检测目标：EV71 RNA 4562A
EV71 RNA的cDNA序列(SEQ ID NO.4)：同实例3。
(1)提取EV71基因组RNA。
(2)以基因组RNA为模板反转录得到待检样本cDNA，再使用体外制备RNA试剂盒进行体外转录，获得一定不带有m6A修饰的RNA，作为对照。
(3)针对EV71 RNA 4562A的检测位点，设计探针CYR007和CYR008(见表1)。
(4)利用探针CYR007和CYR008，分别以步骤(1)得到的待检样本基因组RNA和步骤(2)得到的对照RNA为模板，在相同条件下，进行实时荧光定量PCR检测，获得二者的熔解曲线；
其中，实时荧光定量PCR检测的反应体系和反应程序同实施例1。
(5)检测结果：如图4所示，待检样本组的探针与RNA结合后出现了明显的特异性峰，并且与对照组相比，待检样本组的熔解温度发生了降低(降低2℃)，证明EV71 RNA4562A确实存在m6A修饰。
综上所述，本发明提出了一种基于RNA中m6A修饰的高分辨率融合分析的方法，该方法简单易行，只需预先识别或推测m6A修饰存在的具体位置，根据该位置设计相应的带有荧光基团和猝灭荧光基团的探针，将待检测RNA与两种探针在相应的环境中进行杂交，作为实验组，同时以不带m6A修饰的同序列RNA作为对照组，使用实时荧光定量PCR仪进行检测，即得到实验组和对照组相应的熔解曲线。若实验结果显示，与对照组相比，实验组RNA的熔解温度发生降低，则说明此位点存在m6A修饰。该方法相对灵敏，仅需使用较少量的RNA即可得到准确的结果，操作简单省时。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种在单碱基水平检测DRACH基序中腺苷酸第六位氮原子甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待检RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所述cDNA为模板，体外转录得到不带有腺苷酸第六位氮原子甲基化修饰的RNA，作为对照RNA；
(2)根据所述待检RNA的目标DRACH基序，设计得到上游探针和下游探针；
(3)利用所述上游探针和所述下游探针，分别以所述待检RNA和所述对照RNA为模板，在相同条件下，进行实时荧光定量PCR检测，分别获得所述待检RNA和所述对照RNA的熔解曲线；
(4)结果判定：当所述待检RNA的熔解温度相对于所述对照RNA发生降低，并且降低温度>1℃，则所述目标位点具有腺苷酸第六位氮原子甲基化修饰；
在步骤(2)中，所述上游探针为5’-(D+8)cN24-3’，其中，5’端标记有荧光基团；(D+8)c为所述目标DRACH基序中D上游的第8个碱基的互补配对碱基；N24为所述目标DRACH基序中D上游3'-5'方向第9个碱基到上游第32个碱基互补配对的序列；
所述下游探针为5’-(H-4)c(H-3)c(H-2)c(H-1)cHcGTRcDcN7-3’，其中3’标记有荧光基团；(H-4)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第4个碱基互补配对的碱基，(H-3)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第3个碱基互补配对的碱基，(H-2)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第2个碱基互补配对的碱基，(H-1)c为与所述目标DRACH基序中H下游的第1个碱基互补配对的碱基，Hc与所述目标DRACH基序中的H互补配对，Rc和Dc分别与所述目标DRACH基序中R和D互补配对，N7为从所述目标DRACH基序中D上游3'-5'方向第1个碱基到第7个碱基互补配对的序列；
所述上游探针和所述下游探针标记不同的荧光基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上游探针的5’端标记FAM荧光基团；所述下游探针的3’端标记BHQ荧光基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为：上游探针0.4μmol，下游探针0.2μmol，所述待检RNA或所述对照RNA2μg，1mol/LKCI溶液0.4μL，1mol/LTris-HCI溶液0.5μL，RNase-Free H2O补足至10μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：80℃孵育3min后降温至20℃，然后以速率为1℃/min升温至80℃。
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