CN113774165A - 一种hbv基因分型检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种HBV基因分型检测方法和试剂盒，属于基因检测技术领域。本发明选取了HBV基因组中三段含有不同位置SNP的序列作为Cas12a酶的靶标位点，并分别设计了不同的gRNA，使其能够引导Cas12a酶对不同基因型的HBV产生差异性信号响应，从而实现基因分型的目的，为了提高CRISPR‑Cas12a系统用于基因分型的特异性，对gRNA的部分碱基进行甲氧基化学修饰，使其在常规的CRISPR‑Cas12a系统的基础上，能够更加准确和稳定地实现基因分型。本发明优点在于实现了高特异性、快速、操作简单、成本低HBV基因分型检测。

Description

一种HBV基因分型检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas12a的基因分型检测。
背景技术
HBV(乙型肝炎病毒)是世界范围内普遍存在的公共卫生问题，超过3.5亿感染者面临着可能罹患终末期肝病和肝细胞癌(HCC)的严重后果。中国属于乙型肝炎高流行高发地区，报告显示超过8％的中国人口有慢性乙肝感染。HBV一共可分为10个基因型，分别为A到J，在核苷酸序列上的分布差异较为明显，研究证据表明，了解乙肝病毒的基因型对于跟踪慢乙肝疾病的进展、确定有效的抗病毒治疗方法、临床预后也具有十分显著的意义。
用于HBV基因型的区分通常包括为以下几种方法：基因型特异性PCR，线性探针检测，RFLP(限制性片段长度多态性)，实时荧光PCR，反向杂交，直接测序和荧光偏振测定等。但均不同程度存在稳定性、准确性较差，结果容易受到环境客观因素干扰，灵敏度低；操作过程繁琐，对于少量样本进行检测时难度较大，不太适用于临床快速检测的需求等缺点，使上述检测方法临床应用受到较大的限制。因此，开发一种灵敏，快速，低成本，易于使用且高特异性的基因分型检测方法用于乙型肝炎病毒基因分型的临床诊断至关重要。
CRISPR((Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)和Cas蛋白(CRISPR associated proteins)的核酸酶系统在体外分子诊断领域中的应用已引起广泛关注。Cas12a酶是一种由gRNA(CRISPR guide RNA)引导的RNA核酸内切酶，可以在gRNA的指引下和靶标DNA进行特异性结合并激活Cas12a的DNA核酸酶活性，是一种十分有前景的DNA生物传感平台工具。此外，由于CRISPR-Cas系统对多种不同的核酸靶标具有较高的特异性，已经有研究证明了利用CRISPR系统进行单核苷酸变异(SNVs)/单核苷酸多态性(SNPs)检测的可行性。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，实现高特异性、快速、操作简单、成本低HBV基因分型检测。
为实现上述目的，本发明选取了HBV基因组中三段含有不同位置SNP的序列作为Cas12a酶的靶标位点，并分别设计了不同的gRNA(CRISPR guide RNA)，使其能够引导Cas12a酶对不同基因型的HBV产生差异性信号响应，从而实现基因分型的目的。进一步地，为了提高CRISPR-Cas12a系统用于基因分型的特异性，本发明对gRNA的部分碱基进行了甲氧基化学修饰，使其在常规的CRISPR-Cas12a系统的基础上，能够更加准确和稳定地实现基因分型。
本发明的具体技术方案为：一种基于CRISPR-Cas12a的基因分型检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、设计合成HBV基因组DNA的通用型普通PCR引物；
步骤2、扩增与纯化HBV DNA：
利用所述PCR引物对含有HBV基因组的质粒进行扩增，PCR扩增后的HBV DNA产物进行纯化、浓度测量和验证分析。
步骤3、使用Cas12a酶和gRNA对HBV DNA进行分型检测：
使用PCR扩增后的HBV DNA作为靶标DNA，加入50nM Cas12a酶，22.5nM gRNA，100nM荧光报告分子和1x测试缓冲液NEBuffer 2.1，单次反应的总体积为20μL，使用PCR仪的荧光通道监测反应1.5小时，反应温度为37℃，每隔1分钟检测一次体系内荧光信号。
优选的，所述HBV基因组DNA的通用型普通PCR引物前向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
优选的，使用2x PCR master mix对含有HBV基因组的质粒进行扩增。
优选的，使用MinElute PCR purification kit对PCR扩增后的HBV DNA产物进行纯化，使用Nanodrop进行浓度测量，使用琼脂糖凝胶电泳进行验证分析。
优选的，所述未进行化学修饰的unmodified gRNA(ugRNA)序列包括ugRNA1、ugRNA2和ugRNA3，序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11所示。
进一步优选的，所述mgRNA序列是经过甲氧基化学修饰的gRNA，包括mgRNA1-1～mgRNA1-3，序列如SEQ ID NO.4-6所示；mgRNA2-1～mgRNA2-3，序列如SEQ ID NO.8-10所示；mgRNA3-1～mgRNA3-3，序列如SEQ ID NO.12-14所示，甲氧基化学修饰碱基位置见实施例表1。
优选的，荧光报告分子含12个碱基A的短链DNA，荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。
本发明提供的另一种技术方案为：提供一种HBV基因分型检测试剂盒，其特征在于，包括Cas12a、gRNA、HBV基因组DNA的通用型普通PCR前向引物和反向引物、荧光报告分子。
优选的，上述所述的HBV基因分型检测试剂盒中，所述mgRNA序列是经过甲氧基化学修饰的gRNA。
本发明的有益效果在于：本发明的基于CRISPR-Cas12a的基因分型检测方法和HBV基因分型检测试剂盒具有以下优点：
1.高特异性：选取了HBV基因组中不同位置SNP的序列作为Cas12a酶的靶标位点，并分别设计了不同的CRISPR guide RNA(gRNA)，使其能够引导Cas12a酶对不同基因型的HBV产生差异性信号响应，进一步地，为了提高CRISPR-Cas12a系统用于基因分型的特异性，本发明对gRNA的部分碱基进行了2’-OMe化学修饰，能够更加准确和稳定地实现基因分型。
2.快速：节省检测分型的时间，在1.5小时内实现对不同HBV基因型的区分。
3.操作简单：免去繁琐的操作过程，尽可能节省检测人员的时间成本。
4.成本低：所需用到的技术和方法价格合理，符合临床检测需求。
附图说明
图1是本发明一种基于CRISPR-Cas12a的HBV基因分型检测方法的原理示意图；
图2是本发明目标位点1的靶标与非靶标序列以及ugRNA1的序列设计；
图3是本发明甲氧基化学修饰RNA的分子式结构图；
图4是本发明带有不同位置甲氧基化学修饰的mgRNA1序列设计图；
图5是本发明利用CRISPP/Cas12a及ugRNA1、mgRNA1-1、mgRNA1-2、mgRNA1-3对目标位点1特异性测试结果示意图；
图6是本发明利用CRISPP/Cas12a及ugRNA1、mgRNA1-1、mgRNA1-2、mgRNA1-3对目标位点1灵敏度测试结果示意图；
图7是本发明目标位点2的靶标与非靶标序列以及ugRNA2的序列设计图；
图8是本发明利用CRISPP/Cas12a及ugRNA2、mgRNA2-1、mgRNA2-2、mgRNA2-3对目标位点2特异性测试结果示意图；
图9是本发明利用CRISPP/Cas12a及ugRNA2、mgRNA2-1、mgRNA2-2、mgRNA2-3对目标位点2灵敏度测试结果示意图；
图10是本发明目标位点3的靶标与非靶标序列以及ugRNA3的序列设计图；
图11是本发明利用CRISPP/Cas12a及ugRNA3、mgRNA3-1、mgRNA3-2、mgRNA3-3对目标位点3特异性测试结果示意图；
图12是本发明利用CRISPP/Cas12a及ugRNA3、mgRNA3-1、mgRNA3-2、mgRNA3-3对目标位点3灵敏度测试结果示意图；
图13是本发明使用Cas12a酶和gRNA进行复杂样本中的稳定性测试结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明所涉及的技术为基因合成、PCR等常规技术手段，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
如附图1所示，本发明的基本原理是选取了HBV基因组中三段含有不同位置SNP的序列作为Cas12a酶的靶标位点，并分别设计对应不同的CRISPR guide RNA(gRNA)，使其能够引导Cas12a酶对不同基因型的HBV产生差异性信号响应，从而实现基因分型的目的。
为了进一步地提高CRISPR-Cas12a系统用于基因分型的特异性，本发明对gRNA的部分碱基进行了2’-OMe(甲氧基)化学修饰，使其在常规的CRISPR-Cas12a系统的基础上，能够更加准确和稳定地实现基因分型。
目标位点1的靶标与非靶标序列以及ugRNA1的序列设计如图2所示。
甲氧基化学修饰RNA的分子式如图3所示。
带有不同位置甲氧基化学修饰的mgRNA1序列设计如图4所示。
目标位点2的靶标与非靶标序列以及ugRNA2的序列设计如图7所示。
目标位点3的靶标与非靶标序列以及ugRNA3的序列设计如图10所示。
本发明以下实施例中PCR引物如下表1所示：
表1
Figure BDA0003254631630000041
Figure BDA0003254631630000051
实施例1：HBV病毒基因组DNA的PCR引物设计
1)使用NCBI Primer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型普通PCR引物，该引物对HBV B型和C型病毒都有效，即只需要这一对PCR引物即可实现对HBV B型和C型病毒的扩增。
2)经筛选，本发明中最后使用的PCR引物对为：前向引物(5’-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3’)和反向引物(5’-ACTTTCCAATCAATAGG-3’)。
实施例2：HBV DNA的合成与纯化
1)首先利用设计好的PCR引物通过2x PCR master mix(NEB)对含有HBV基因组的质粒进行扩增。
2)PCR扩增后的HBV DNA产物再使用MinElute PCR purification kit进行纯化，然后使用Nanodrop进行浓度测量，并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证分析。
实施例3：特异性测试。
此检测体系中包含50nM Cas12a酶，22.5nM gRNA，100nM荧光报告分子，以及不同浓度的靶标HBV DNA和1x测试缓冲液NEBuffer 2.1(含有5mM NaCl,1mM Tris-HCl,1mMMgCl2,0.1mM DTT,10g/ml BSA,pH 7.9)。
单次反应的总体积为20μL，使用PCR仪的荧光通道监测反应1.5小时，反应温度为37℃，每隔1分钟检测一次体系内荧光信号。
其中，荧光报告分子为只含12个碱基A的短链DNA，其一端修饰了荧光基团HEX，另一端修饰了荧光淬灭基团BHQ1。
Cas12a酶在gRNA的指引下被靶标序列激活其DNA酶活性，即可切断此短链DNA，荧光淬灭机制失效，体系发荧光。
如图5、图8、图11、所示：利用CRISPP/Cas12a及ugRNA1、mgRNA1-1、mgRNA1-2、mgRNA1-3对目标位点1，ugRNA2、mgRNA2-1、mgRNA2-2、mgRNA2-3对目标位点2，ugRNA3、mgRNA3-1、mgRNA3-2、mgRNA3-3对目标位点3在高(10nM)、中(1nM)、低(0.1nM)三种不同浓度靶标HBV DNA进行的特异性测试，经过甲氧基化学修饰的mgRNA1-2、mgRNA1-3表现出了更高的特异性。
实施例4：灵敏度测试
使用PCR扩增后的HBV DNA作为靶标DNA。
此检测体系中包含50nM Cas12a酶，22.5nM gRNA，100nM荧光报告分子，以及不同浓度(0–10nM)的靶标HBV DNA和1x测试缓冲液NEBuffer 2.1(含有5mM NaCl,1mM Tris-HCl,1mM MgCl2,0.1mM DTT,10g/ml BSA,pH 7.9)。
单次反应的总体积为20μL，使用PCR仪的荧光通道监测反应1.5小时，反应温度为37℃，每隔1分钟检测一次体系内荧光信号。
如图6、图9、图12所示：：利用CRISPP/Cas12a及ugRNA1、mgRNA1-1、mgRNA1-2、mgRNA1-3对目标位点1，ugRNA2、mgRNA2-1、mgRNA2-2、mgRNA2-3对目标位点2，ugRNA3、mgRNA3-1、mgRNA3-2、mgRNA3-3对目标位点3，对0–10nM的不同浓度靶标HBV DNA进行灵敏度测试，结果显示，与未修饰的ugRNAs对比，经过甲氧基化学修饰的mgRNAs不会削弱Cas12a酶的灵敏度。
实施例5：稳定性测试
使用PCR扩增后的HBV DNA作为靶标DNA(11ng/反应)，细菌基因组DNA(80ng/反应)作为背景信号干扰。
此检测体系中包含50nM Cas12a酶，22.5nM gRNA，100nM荧光报告分子，以及11ng的靶标HBV DNA、80ng细菌基因组DNA(干扰信号)和1x测试缓冲液NEBuffer 2.1(含有5mMNaCl,1mM Tris-HCl,1mM MgCl2,0.1mM DTT,10g/ml BSA,pH 7.9)。
只含有11ng的靶标HBV DNA，而不含有细菌基因组DNA的反应组作为阳性对照；不含有靶标HBV DNA和细菌基因组DNA的反应组作为阴性对照。
单次反应的总体积为20μL，使用PCR仪的荧光通道监测反应1.5小时，反应温度为37℃，每隔1分钟检测一次体系内荧光信号。
如图13所示：利用CRISPP/Cas12a及ugRNA、mgRNA1、mgRNA2、mgRNA3对目标位点1、位点2、位点3分别在含有靶标HBV DNA和细菌基因组DNA的体系中进行稳定性测试，结果显示未经修饰的ugRNAs和经过甲氧基化学修饰的mgRNAs在复杂体系中都具备优异的稳定性和特异性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种HBV基因分型检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、设计合成HBV基因组DNA的通用型普通PCR引物；
步骤2、扩增与纯化HBV DNA：
步骤3、使用Cas12a酶和gRNA对HBV DNA进行分型检测。
2.如权利要求1所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于，所述HBV基因组DNA的通用型普通PCR引物的前向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于所述步骤2中使用2xPCR master mix对含有HBV基因组的质粒进行扩增。
4.如权利要求1所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：使用所述步骤2中的HBV DNA作为靶标DNA，加入50nM Cas12a酶，22.5nM gRNA，100nM荧光报告分子和1x测试缓冲液NEBuffer 2.1，单次反应的总体积为20μL，使用PCR仪的荧光通道监测反应1.5小时，反应温度为37℃，每隔1分钟检测一次体系内荧光信号。
5.如权利要求4所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于所述荧光报告分子含12个碱基A的短链DNA，荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。
6.如权利要求4所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于使用MinElute PCRpurification kit对PCR扩增后的HBV DNA产物进行纯化，使用Nanodrop进行浓度测量，使用琼脂糖凝胶电泳进行验证分析。
7.如权利要求1所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于所述gRNA序列为未经过甲氧基化学修饰的ugRNA或经过甲氧基化学修饰mgRNA。
8.如权利要求7所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于所述ugRNA序列包括ugRNA1、ugRNA2和ugRNA3，序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11所示。
9.如权利要求7所述的一种HBV基因分型检测方法，其特征在于所述mgRNA序列包括mgRNA1-1、mgRNA1-2、mgRNA1-3、mgRNA2-1、mgRNA2-2、mgRNA2-3、mgRNA3-1、mgRNA3-1和mgRNA3-1，序列如SEQ ID NO.4-6、SEQ ID NO.8-10、SEQ ID NO.12-14所示。
10.一种HBV基因分型检测试剂盒，其特征在于，包括Cas12a、ugRNA或mgRNA、HBV基因组DNA的通用型普通PCR前向引物和反向引物、荧光报告分子。
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