CN109837356A

CN109837356A - 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用

Info

Publication number: CN109837356A
Application number: CN201910191679.XA
Authority: CN
Inventors: 刘万里; 邓敏; 邢珊
Original assignee: Cancer Prevention Center Of Zhongshan University (affiliated Cancer Hospital Of Zhongshan University Zhongshan University Institute Of Oncology)
Current assignee: Cancer Prevention Center Of Zhongshan University (affiliated Cancer Hospital Of Zhongshan University Zhongshan University Institute Of Oncology); Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN109837356B

Abstract

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的HBV的检测方法及应用，过程如下：以HBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH₂O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；PS2.M DNA溶解在Tris‑HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；将FnCas12a和HBV crRNA加入到Tris‑HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H₂O₂处理后测定吸光度。本发明是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。

Description

基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用。

背景技术

肝炎是在世界范围内广泛流行的严重危害人体健康甚至生命的严重疾病，目前主要分为甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎。根据传播途径可将其分为两大类，其中乙型、丙型、丁型、庚型肝炎的主要传播途径为血液传播、医源性传播、母婴传播、性传播，其中血液传播和性传播为最常见途径。甲型和戊型肝炎的主要通过粪-口途径传播。

1985年，当PCR方法成为常规实验方法后，导致了分子生物学指数级的进步。目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。PCR技术是最先建立也是目前最常用的扩增方法，目前在PCR方法基础上，引入了荧光标记的探针，可以实时检测靶标的扩增情况，称为Realtime PCR。Realtime PCR不仅是快速、高灵敏的检测方法，同时这种方法也可以进行定量分析。但是常规PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。与传统PCR相比，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification，RPA)一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在37-42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～40min内完成数十亿的DNA拷贝。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器。

CRISPR-Cas是细菌抵抗病毒和质粒侵染的获得性免疫防御系统，几乎存在于所有的古菌和约50％的现代细菌。CRISPR-Cas平台是出色的基因组编辑工具，其层出不穷的科研进展及其应用更新给生物学界带来巨大革命。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR系统要由多个Cas蛋白组成的效应复合物才能发挥功能；第二大类Cas是依靠单个Cas效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)就能发挥功能。

2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为附属活性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用，通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，且是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。

为解决上述问题，

一方面，本发明在于提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，包括如下步骤：

1)制备RPA产物：以HBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH₂O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；

2)制备PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA溶解在Tris-HCL溶液，向溶液中加入Hemin(血红素)溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；

3)制备Cas12a/crRNA复合物溶液：将FnCas12a和HBV crRNA加入到Tris-HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；

4)检测HBV：将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H₂O₂处理后测定吸光度。

进一步地，步骤1)中，所述DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取。

进一步地，步骤1)中，所述扩增引物对包括RPA引物对1

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'；

RPA引物对2

RPA-2上游引物:5'AGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATT3'，

RPA-2下游引物：5'AGAAGATTGACGATATGGGTGAGGCAGTAG3'；

或RPA引物对3

RPA-3上游引物：5'GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAG3'，

RPA-3下游引物：5'ATACAAGTGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTTT3'。

进一步地，步骤1)中，所述孵育过程如下：涡旋混匀后，37℃水浴锅中孵育20min。

进一步地，所述Tris-HCL溶液的浓度为20mm/L，PH7.5，含100mm/LKCl、40mm/LMgCl₂、0.008％Triton X-100。

进一步地，所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。

进一步地，所述FnCas12a的制备过程如下：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中；经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21；用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行亲和层析纯化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。

进一步地，所述HBV crRNA的制备过程如下：合成如序列SEQ ID NO.4所示的正义链序列、如序列SEQ ID NO.5所示的反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化得到如序列SEQ ID NO.6所示的HBVcrRNA；

所述正义链序列为

5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTCCTCTACTTCCAGGAACAT3’；

所述反义链序列为

5’ATGTTCCTGGAAGTAGAGGAATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA3’；

所述HBV crRNA序列为

5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCUACUUCCAGGAACAU3’。

进一步地，所述Tris-HCl缓冲液包括20mM/L Tris-HCl，pH 7.5，100mM/L KCl，5mM/LMgCl₂，1mM/LDTT，5％甘油。

进一步地，步骤3)中，所述孵育的过程为：37度孵育30min。

进一步地，步骤4)中，所述孵育的过程为：37度孵育60min。

进一步地，步骤4)中，所述处理的时间为5min。

进一步地，所述测定吸光度可采用普通分光光度计、酶标仪在波长420nm处测定。优选为Biotek多功能酶标仪。

一方面，本发明在于提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV检测的RPA引物对，包括

RPA引物对1

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，如序列SEQ ID NO.7所示；

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'；如序列SEQ ID NO.8所示

RPA引物对2

RPA-2上游引物:5'AGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATT3'，如序列SEQ ID NO.9所示；

RPA-2下游引物：5'AGAAGATTGACGATATGGGTGAGGCAGTAG3'；如序列SEQ ID NO.10所示；

或RPA引物对3

RPA-3上游引物：5'GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAG3'，如序列SEQ ID NO.11所示；

RPA-3下游引物：5'ATACAAGTGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTTT3'，如序列SEQ ID NO.12所示。

进一步地，所述RPA引物对为RPA引物对1

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'。

一方面，本发明在于提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV检测的试剂，包括PS2.M/Hemin溶液和/或Cas12a/crRNA复合物溶液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用，通过采用重组酶聚合酶扩增技术检测HBV，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，检测灵敏度高，最低可以检测到1×10¹拷贝HBV重组质粒DNA。

检测过程中不需将RNA转化为DNA再进行扩增，只需要将Cas12a与RNA结合形成复合物，再与RPA扩增的靶标DNA形成三元复合体；激活的Cas12a不但可以切割靶标HBV DNA，而且可将体系中PS2.M DNA单链切成碎片，使PS2.M不能形成G-四链体，G-四链体/Hemin复合体不能形成，抑制了ABTS2-H₂O₂体系的氧化还原反应，响应体系吸光度即可实现检测，且该检测可以通过普通分光光度计、酶标仪检测，甚至肉眼可见。

本发明的检测过程采用重组酶聚合酶扩增技术，可在20min内完成反应，无需精密仪器。

本发明的检测方法简单、高效、快速、低成本、高准确度、高敏感性、通用性好、特异性强，设备简单。

附图说明

图1Cas12a融合蛋白细菌诱导表达条件优化。M1:Protein marker；PC1:BSA(1μg)；PC2:BSA(2μg)；NC:无IPTG诱导的细菌裂解液；1:加入IPTG在15℃诱导16h的细菌裂解液；2:加入IPTG在37℃诱导4h的细菌裂解液；NC1:无IPTG诱导的裂解液上清；3:加入IPTG在15℃诱导16h的细菌裂解液上清；4:加入IPTG在37℃诱导4h的细菌裂解液上清；NC2:无IPTG诱导裂解液离心沉渣；5:加入IPTG在15℃诱导16h的细菌裂解液裂解液离心沉渣；6:加入IPTG在37℃诱导4h的细菌裂解液离心沉渣。

图2RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法灵敏度检测比对图

图3RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法检测效果评价比对图(图中P1-P5为通过qPCR方法证实为HBV阳性的病人；N1-N5为通过qPCR方法证实为HBV阴性的健康人)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

1)RPA引物及试剂：

HBV有个10基因亚型，本发明人充分考虑10个基因型检测的通用性，以HBV基因组保守的S基因区域片段为靶标，根据RPA引物的设计原则，设计3对RPA引物。引物序列如下：

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'；

RPA-2上游引物:5'AGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATT3'，

RPA-2下游引物：5'AGAAGATTGACGATATGGGTGAGGCAGTAG3'；

RPA-3上游引物：5'GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAG3'，

RPA-3下游引物：5'ATACAAGTGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTTT3'。

RPA引物的选择：

RPA试剂盒购自TwistDx公司Basic kit。RPA的反应体系是50ul，包括：50ul RPA反应体系包括：10uM上、下游引物(RPA引物对)各2.4ul，重泡胀缓冲液(Rehydration Buffer)29.5ul，HBV阳性对照品1ul，ddH₂O 13.2ul，混匀，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的TwistAmp Basic管中，加入2.5μl 280mM MgAc，混匀。涡旋混匀后，37℃水浴锅中孵育20min。取RPA产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，得出最佳引物对。凝胶电泳显示RPA-1引物对扩增效率最高。因些选择RPA-1上、下游引物对作为RPA引物来扩增HBV DNA。

所优选的RPA引物序列为：

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'。扩增片段大小为387bp，RPA扩增产物序列如SEQ ID NO:1所示。

2)纯化的Cas12a蛋白：

本发明所述的Cas12a为土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis来源的Cas12a，简称FnCas12。

制备纯化的FnCas12蛋白：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中。经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)。用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白(图1)，进行His亲和层析纯化融和蛋白。用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。FnCas12蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3)HBV crRNA：

所述的crRNA为含茎环结构的单链RNA，与HBV基因组部分同源。crRNA能与Cas12a结合，指导Cas12a在HBV基因组PAM(TTTN)附近切割HBV基因组，并切割无关DNA序列。

制备HBV crRNA：设计针对RPA扩增靶标区的单链crDNA，并在其5’端添加T7启动子序列，送公司合成正义链和反义链序列，

正义链序列为：

5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTCCTCTACTTCCAGGAACAT3’，

反义链序列为：

5’ATGTTCCTGGAAGTAGAGGAATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA3’。

正义链和反义链经退火形成双链DNA。经T7polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化crRNA，crRNA序列为：

5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCUACUUCCAGGAACAU3’。

G4/Hemin显色体系：采用富含G的DNA核苷酸链PS2.M(序列为：5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3')。PS2.M核苷酸链在K⁺诱导下形成平行G-四链体，所述平行G-四链体与Hemin(氯化血红素)结合，形成稳定的具有过氧化物酶活性的复合物，可催化ABTS2-H₂O₂系统氧化显色。可以通过普通分光光度计、酶标仪检测，甚至肉眼可见。

实施例：

实施例1

RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法的原理：Cas12a与HBV crRNA及RPA扩增的靶标DNA形成三元复合体后，激活的Cas12a不但可以切割靶标HBV DNA，而且可将体系中PS2.M DNA单链切成碎片，使PS2.M不能形成G-四链体，G-四链体/Hemin复合体不能形成，抑制了ABTS2-H₂O₂体系的氧化还原反应，体系吸光度响应值急剧降低。因此本发明为一种“Turn-off”检测模式。

HBV阳性对照品的准备:以含HBsAg基因片段的重组质粒为阳性对照。制备方法：用化学合成法进行HBsAg基因片段合成(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，并克隆至PUC57载体获得重组质粒。通过Sanger法测序确定插入序列正确。将重组质粒菌37度培养过夜，抽提质粒，测浓度。根据下列公式，计算PUC57/HBsAg重组质粒拷贝数：拷贝数(拷贝/μL＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。

1.RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法灵敏度检测

(1)将重组质粒PUC57/HBsAg重组质粒进行稀释，使其浓度为0、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝/μl(copies/μl)。

(2)RPA扩增：以上述不同浓度的PUC57/HBsAg重组质粒为模板，进行RPA扩增。RPA的反应体系是50ul，50ul RPA反应体系包括：10um上、下游引物各2.4ul，重泡胀缓冲液29.5ul，不同浓度的PUC57/HBsAg重组质粒模板1ul，ddH₂O 13.2ul，混匀，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的反应管中，加入2.5μl 280mm MgAc，混匀。37℃水浴锅中孵育20min，RPA产物备用；

(3)Cas12a-crRNA复合物的准备：将纯化的FnCas12a及HBV crRNA加入到Tris-HCl缓冲液(20mm/LTris-HCl,pH 7.5,100mm/LKCl,5mm/LMgCl₂,1mm/LDTT,5％甘油)中，使FnCas12a及HBV crRNA终浓度分别为400nm/L、500nm/L。37度孵育30min。使Cas12a与crRNA结合形成复合物。

(4)吸光度检测：PS2.M DNA溶解在20mm/LTris-HCL溶液(PH7.5，含100mm/L KCl、40mm/LMgCl₂、0.008％Triton X-100)，浓度为1umol/L，向溶液中加入终浓度为2um/LHemin(Hemin用DMSO配制成2.38mm/L的母液)，制得PS2.M/Hemin溶液。-20度冻存备用。取10ulPS2.M/Hemin溶液、上述Cas12a/crRNA复合物溶液2ul、上述RPA产物8ul加入384微孔板中，共20ul，37度孵育1h。加入ABTS和H₂O₂(终浓度分别为2mM/L、4mm/L)，反应5分钟后上Biotek多功能酶标仪在波长420nm处测定吸光度。

(5)结果：如图2所示，随着HBV重组质粒浓度的增加，420nm处测得的吸光度逐渐降低，当重组质粒浓度达到10⁵以上时，吸光度进入平台期。本方法最低可以检测到1×10¹拷贝/ul HBV重组质粒DNA，表明本方法具有较高的灵敏度。

实施例2 RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法检测效果评价

采集血清样本：HBV病人及健康人血清样本各5例。均经qPCR检测证实。

病毒核酸提取：采用北京天根生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)进行核酸提取。主要步骤如下：

(1)将20μl蛋白酶K(Proteinase K)加入一个干净的1.5ml离心管中。

(2)向离心管中加入200μl人血清样品。

(3)加入200μl Carrier RNA工作液，涡旋振荡15sec混匀。

(4)在56℃孵育15min。

(5)加入250μl无水乙醇，涡旋振荡15sec，彻底混匀。在室温放置5min。

(6)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

(7)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

(8)小心打开吸附柱盖子，加入500μl溶液GD，8,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

(9)小心打开吸附柱盖子，加入600μl溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2min，8,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

(10)重复步骤9。

(11)小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，8,000rpm离心1min，弃废液。

(12)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。

(13)将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置5min。12,000rpm离心1min。

检测方法：以血清DNA为样品，以10³-10⁵拷贝/ul HBV重组质粒为阳性对照，以无关序列的质粒为阴性对照(图2中NC)。所有样品及对照进行RPA扩增(方法同实施例1)。取RPA产物8ul、PS2.M/Hemin溶液10ul、Cas12a/crRNA复合物溶液2ul、加入384微孔板中，体系共20ul，37度孵育1h。加入ABTS和H₂O₂(同实施例1)，反应5分钟后上Biotek多功能酶标仪在波长420nm处测定吸光度。

结果：如图3所示，所有5个HBV病人样品均为阳性(图中，P1-P5)，5个健康人血清样品均为阴性(图中，N1-N5)。与qPCR方法吻合率达100％。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

<120> 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用

<141> 2019-03-12

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 387

<212> DNA

<213> RPA-HBV

<400> 1

cctccaatca ctcaccaacc tcctgtcctc caatttgtcc tggctatcgc tggatgtgtc 60

tgcggcgttt tatcatattc ctcttcatcc tgctgctatg cctcatcttc ttgttggttc 120

ttctggacta ccaaggtatg ttgcccgttt gtcctctact tccaggaaca tcaactacca 180

gcacgggacc atgcaagacc tgcacgagtc ctgctcaagg aacctctatg tttccctctt 240

gttgctgtac aaaaccttcg gacggaaact gcacttgtat tcccatccca tcatcctggg 300

ctttcgcaag attcctatgg gagtgggcct cagtccgttt ctcctggctc agtttactag 360

tgccatttgt tcagtggttc gtagggc 387

<210> 2

<211> 1299

<212> PRT

<213> FnCas12

<400> 2

Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu

1 5 10 15

Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys Ala

20 25 30

Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys Lys

35 40 45

Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu Ile

50 55 60

Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys Asp

85 90 95

Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr Ile

100 105 110

Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile Asp

115 120 125

Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln Ser

130 135 140

Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr Asp

145 150 155 160

Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr Thr

165 170 175

Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser Asn

180 185 190

Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu Pro

195 200 205

Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys Ala

210 215 220

Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu Glu

225 230 235 240

Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg Val

245 250 255

Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr Leu

260 265 270

Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys Phe

275 280 285

Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile Asn

290 295 300

Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys Met

305 310 315 320

Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser Phe

325 330 335

Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met Gln

340 345 350

Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys Ser

355 360 365

Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln Lys

370 375 380

Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr Asp

385 390 395 400

Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala Val

405 410 415

Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn Pro

420 425 430

Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala Lys

435 440 445

Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn Lys

450 455 460

His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala Asn

465 470 475 480

Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys Asp

485 490 495

Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys Asp

500 505 510

Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp Leu

515 520 525

Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His Ile

530 535 540

Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His Phe

545 550 555 560

Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val Pro

565 570 575

Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Asp

580 585 590

Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly Trp

595 600 605

Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys Asp

610 615 620

Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile Phe

625 630 635 640

Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Ile

645 650 655

Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe

660 665 670

Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile Leu

675 680 685

Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln Lys

690 695 700

Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe Ile

705 710 715 720

Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp Phe

725 730 735

Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu Phe

740 745 750

Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn Ile

755 760 765

Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr Leu

770 775 780

Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg Pro

785 790 795 800

Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn Leu

805 810 815

Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr Arg

820 825 830

Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala Ile

835 840 845

Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu Tyr

850 855 860

Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe His

865 870 875 880

Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe Asn

885 890 895

Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His Ile

900 905 910

Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu Val

915 920 925

Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile Gly

930 935 940

Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile Glu

945 950 955 960

Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn Ile

965 970 975

Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile Ala

980 985 990

Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu Asn

995 1000 1005

Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

1010 1015 1020

Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu Val Phe Lys

1025 1030 1035 1040

Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg Ala Tyr Gln Leu

1045 1050 1055

Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly Lys Gln Thr Gly Ile

1060 1065 1070

Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser Lys Ile Cys Pro Val Thr

1075 1080 1085

Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser

1090 1095 1100

Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys

1105 1110 1115 1120

Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala

1125 1130 1135

Ala Lys Gly Lys Trp Thr Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn

1140 1145 1150

Phe Arg Asn Ser Asp Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr

1155 1160 1165

Pro Thr Lys Glu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr

1170 1175 1180

Gly His Gly Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys

1185 1190 1195 1200

Lys Phe Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met

1205 1210 1215

Arg Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys Asn

1235 1240 1245

Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly Leu Lys

1250 1255 1260

Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu Gly Lys Lys

1265 1270 1275 1280

Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu Phe Val Gln Asn

1285 1290 1295

Arg Asn Asn

<210> 3

<211> 1436

<212> DNA

<213> HBsAg

<400> 3

atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60

cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gatcctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120

ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180

ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240

gctcagggca tattaacaac agtgccagca gcacctcctc ctgcctccac caatcggcag 300

acaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360

cagtggaact ccacaacatt tcaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctatat 420

tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctcaccc 480

atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagaa cacaacatca 540

ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600

acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggagcaccc 660

aagtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcctgtcct 720

ccaatttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc 780

ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840

tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgagt 900

cctgctcaag gaacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960

tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa gattcctatg ggagtgggcc 1020

tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080

tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140

aacatcttga gtcccttttt acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200

taaaccctaa taaaaccaaa cgttggggtt actcccttaa cttcatggga tatgtaattg 1260

gaagttgggg tactttaccg caggagcata ttgtactgaa aatcaagcaa tgttttcgta 1320

aactgcctgt aaatagacct attgattgga aagtatgtca aagaattgtg ggtcttttgg 1380

gctttgctgc accttttaca caatgtggct atcctgcctt gatgccttag atctac 1436

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> HBV crRNA-F1

<400> 4

taatacgact cactataggg taatttctac taagtgtaga ttcctctact tccaggaaca 60

t 61

<210> 5

<211> 61

<212> DNA

<213> HBV crRNA-R1

<400> 5

atgttcctgg aagtagagga atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210> 6

<211> 41

<212> RNA

<213> HBV crRNA

<400> 6

uaauuucuac uaaguguaga uuccucuacu uccaggaaca u 41

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-1F

<400> 7

cctccaatca ctcaccaacc tcctgtcctc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-1R

<400> 8

gccctacgaa ccactgaaca aatggcacta 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-2F

<400> 9

agaggcaaat caggtaggag cgggagcatt 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-2R

<400> 10

agaagattga cgatatgggt gaggcagtag 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-3F

<400> 11

gtatgttgcc cgtttgtcct ctacttccag 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA-3R

<400> 12

atacaagtgc agtttccgtc cgaaggtttt 30

Claims

1.一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)制备PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA溶解在Tris-HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取；

所述扩增引物对包括RPA引物对1、

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'；

RPA引物对2、

RPA-2上游引物:5'AGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATT3'，

RPA-2下游引物：5'AGAAGATTGACGATATGGGTGAGGCAGTAG3'；

或RPA引物对3

RPA-3上游引物：5'GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAG3'，

RPA-3下游引物：5'ATACAAGTGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTTT3'；

所述孵育过程如下：涡旋混匀后，37℃水浴锅中孵育20min。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，所述Tris-HCL溶液的浓度为20mm/L，PH7.5，含100mm/LKCl、40mm/LMgCl₂、0.008％Triton X-100；所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，所述FnCas12a的制备过程如下：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中；经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21；用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行His亲和层析纯化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。

5.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，所述HBV crRNA的制备过程如下：合成正义链序列、反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化得到HBVcrRNA；

所述正义链序列为

5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTCCTCTACTTCCAGGAACAT3’；

所述反义链序列为

5’ATGTTCCTGGAAGTAGAGGAATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA3’；

所述HBV crRNA序列为

5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCUACUUCCAGGAACAU3’。

6.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液包括20mM/LTris-HCl，pH 7.5，100mM/L KCl，5mM/LMgCl₂，1mM/LDTT，5％甘油。

7.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述孵育的过程为：37度孵育30min。

8.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述孵育的过程为：37度孵育60min；所述处理的时间为5min。

9.一种用于权利要求1～8任一项所述HBV检测方法中的RPA引物对，其特征在于，包括

RPA引物对1、

RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'，

RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'；

RPA引物对2、

RPA-2上游引物:5'AGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATT3'，

RPA-2下游引物：5'AGAAGATTGACGATATGGGTGAGGCAGTAG3'；

或RPA引物对3

RPA-3上游引物：5'GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAG3'，

RPA-3下游引物：5'ATACAAGTGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTTT3'。

10.一种用于权利要求1～8任一项所述HBV检测方法中的试剂，其特征在于，包括PS2.M/Hemin溶液和/或Cas12a/crRNA复合物溶液。