CN112080549A

CN112080549A - 一种新型的核酸检测方法

Info

Publication number: CN112080549A
Application number: CN202010983248.XA
Authority: CN
Inventors: 李颖; 李涛; 杨运煌; 胡锐; 刘买利
Original assignee: Institute of Precision Measurement Science and Technology Innovation of CAS
Current assignee: Institute of Precision Measurement Science and Technology Innovation of CAS
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN112080549B

Abstract

本发明提供了一种新型的核酸检测方法，利用CRISPR‑Cas12a在向导RNA（crRNA）的引导下识别靶标DNA序列后，靶标DNA、crRNA和CRISPR‑Cas12a形成三元复合体，在特定离子条件下（Mg²⁺与Na⁺或K⁺），该复合体将DNA G‑四链体或G‑三链体切割，利用G‑四链体或G‑三链体切割前后的高级结构的信号变化来检测靶标核酸，该检测方法具有成本低、灵敏度高、方便快速的特点。

Description

一种新型的核酸检测方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种新的核酸检测方法，将CRISPR-Cas12a系统和DNA G-四链体/G-三链体结合在一起，利用G-四链体/G-三链体的空间结构改变实现靶标核酸序列的快速、高效和灵敏检测。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是指细菌体内起适应性免疫作用的一套体系。细菌首先把外来的DNA片段整合进自己的基因组，然后转录成RNA，RNA经过加工剪切后可以将Cas蛋白引导到外源序列的位置，从而对入侵体内的外源DNA实行精准剪切。这种针对外来病原体的快速精确打击能力使得CRISPR系统在基因编辑领域发挥着重要的作用，目前已经在大肠杆菌、酵母菌、人源干细胞和小鼠体内等成功实现了基因编辑，为相关疾病的治疗提供了有效手段。最近，有研究发现CRISPR-Cas12a系统除了具有针对目的序列的精准切割能力外，还具有任意切割单链DNA(ssDNA)的能力。利用CRISPR-Cas12a被激活后可任意切割ssDNA的能力，研究人员开发了多种针对病原菌的体外检测方法，例如新冠病毒、埃博拉病毒和HIV病毒等，这些检测方法具有快速灵敏的特点，有研究者已经利用这种切割ssDNA的能力申请了相关专利(CN107488710A)。

DNA G-quadruplex(G-四链体，G4)或G-triplex(G-三链体,G3)是一种由富含G碱基的DNA链通过氢键形成的高级结构，它在溶液中可以稳定存在。G4和G3具有很多特性，比如：1、其寡核苷酸链在金属离子(如Na⁺,K⁺,Ca²⁺,Pb²⁺,Sr²⁺等)存在时可以由线性的DNA分子折叠成具有高级结构的G4或G3；2、G4或G3可以与hemin(血红素)结合，形成的复合物具有类似HRP(辣根过氧化物酶)的特性，从而可以催化TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，DAB(二氨基联苯胺)，鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)和ABTS[2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid)]等底物发生颜色变化；3、G4或G3在和Thioflavin T(ThT，硫黄素T)或N-methyl mesoporphyrin IX(NMM)结合后，可促进ThT或NMM产生很强的荧光。正由于G4和G3的上述特性，它常被用于作为各种检测方法的传感单元。比如，常用来检测溶液中Hg²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Sr²⁺等重金属离子污染，同时也可以检测氨基酸，葡萄糖，胆固醇等有机物和凝血酶，RNA酶等生物大分子，以及各种细菌或病毒的基因片段等；此外，基于G4/G3的检测系统还可以用于可卡因等毒品检测领域。

近期，CN109929949A公开了CRISPR-Cas12a和G4-血红素的EBV的检测方法及应用。该专利中所使用的是可以形成G4的PS2.M序列，其检测是通过以下方式实现的：当有靶标EBV特征序列存在时，被激活的CRISPR-Cas12a可以将单链状态的PS2.M DNA切割成碎片，使PS2.M不能形成G4，G4/hemin复合物不能形成，从而不能产生类似HRP的过氧化物酶的特性，最后也不能催化底物ABTS发生颜色或吸光度的变化。通过该专利公开的内容，我们知道，该专利中所使用的虽然是能形成G4的PS2.M序列，但其检测利用的还是之前已有文献(Science，2018，360,436)中报道的原理，即利用激活的CRISPR-Cas12a去切割处于单链状态的非目标PS2.M序列，而丝毫未提及，也未提供任何实验数据证明CRISPR-Cas12a是否可以切割具有高级结构的G4的能力。

我们近期研究发现，在Na⁺、K⁺溶液以及分子拥挤环境(含10％，20％PEG200，w/v)条件下形成的人端粒(Telomere)G4(序列为(TTAGGG)₄)、人端粒G3(序列为(TTAGGG)₃TTA)、凝血酶适配体(thrombin binding aptamer TBA)G4(序列为GGTTGGTGTGGTTGG)和TBA11 G3(序列为GGTTGGTGTGG)，可以被激活的CRISPR-Cas12a系统切割；被切割之后，G4或G3的特征会消失。我们通过荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)、圆二色光谱(Circular Dichroism,CD)以及核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)等方式充分地证明了DNA G4或G3可以被CRISPR-Cas12a系统剪切。考虑到G4或G3作为生物传感器具有稳定性好，灵敏度高以及对多种物质敏感的特点，我们认为结合CRISPR-Cas12a和G4或G3可以开发一种新型的快速核酸检测方法，有望为核酸的快速检测提供新的解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的核酸检测方法，在特定离子条件下(Mg²⁺与Na⁺或K⁺)，被激活的CRISPR-Cas12a系统可以切割DNA G-四链体或G-三链体，利用G-四链体或G-三链体切割前后的高级结构的信号变化来检测靶标核酸。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种新型核酸检测方法，包括以下步骤：

1)将CRISPR-Cas12a和crRNA加入到酶切缓冲液中孵育，所述的酶切缓冲液含有镁离子(镁离子为Cas12a产生酶活作用所需的离子，其浓度可为核酸酶常用的浓度，比如5～20mM,本发明的实施例中主要采用10mM Mg²⁺)、钠离子(50～200mM均可)或钾离子(0.5～70mM均可)；

2)在上述体系中加入靶标DNA(若靶标为RNA，则先进行反转录)的扩增产物以及DNA G-四链体或G-三链体进行孵育，靶标DNA、crRNA和CRISPR-Cas12a形成三元复合体，该复合体将DNA G-四链体或G-三链体切割，利用G-四链体或G-三链体切割前后的高级结构的信号变化来检测靶标核酸。

进一步地，所述的DNA G-四链体包括但不限于人端粒(Telomere)G4和凝血酶适配体(TBA)G4，例如c-Myc G4，PS2.M G4，PS5.M G4，Bcl-2 G4等；所述的DNA G-三链体包括但不限于Telomere G3和TBA11 G3，还可以为其他可行成G3的5’-TGGGTAGGGCGGG-3’和5’-CTGGGAGGGAGGGA-3’序列等(Analytical Chemistry,2019,91,10731；AnalyticalChemistry,2014,86,2925)。

进一步地，利用圆二色光谱或核磁共振检测DNA G-四链体或G-三链体切割前后的高级结构的信号变化。

进一步地，所述的反应体系中还可以加入硫磺素T或者血红素，上述小分子与DNAG-四链体或G-三链体结合后会产生特殊的荧光效应或过氧化物酶HRP的效果，可以通过测荧光、颜色变化或者气体的变化等方式进行信号的检测。

进一步地，所述的DNA G-四链体或G-三链体的两端可分别标记能发生荧光共振能量转移的两个荧光基团对(如常用的FAM和TAMRA)，从而通过比较G-四链体或G-三链体被切割前后的荧光变化实现检测。

进一步地，所述的DNA G-四链体或G-三链体的两端可分别标记能发生荧光共振能量转移的一个荧光基团和一个淬灭基团(如常用的FAM和BHQ)，从而通过比较G-四链体或G-三链体被切割前后的荧光变化实现检测。

进一步地，所述的DNA G-四链体或G-三链体的两端可分别标记用于试纸条检测的分子基团(如常用的FAM和Biotin)，配套相应的试纸条可实现靶标核酸的快速检测。

基于上述核酸检测方法，还可以开发检测试剂盒，所述的试剂盒包括CRISPR-Cas12a，crRNA，DNA G-四链体或G-三链体，酶切缓冲液，所述酶切缓冲液含有5～20mM镁离子，50～200mM钠离子或者0.5～70mM钾离子。

与现有的技术相比，本发明中让DNA G4或G3在没有靶标分子存在时先折叠成高级结构，这一特点可以产生以下3个明显的技术效果：1)基于DNA G4或G3的高级结构在被Cas12a切割前后的变化，可以实现非标记的检测，即无需对DNA G4或G3序列进行任何标记，只需辅助添加其他与G4或G3发生作用的分子即可完成检测，而基于单链DNA的检测均需进行特殊标记后才可以进行检测，因此本发明的这种方式可以大大降低检测成本；2)这种高级结构可与多种分子(如硫磺素T或血红素)结合并产生特殊的荧光效应或过氧化物酶HRP的效果，因此可以通过多种方式进行信号的检测，比如测荧光、颜色变化或者气体的变化等，而单链DNA报告分子不存在这种特殊效应；3)这种高级结构让DNA报告分子的5’与3’端距离相隔较近，若报告分子采用了荧光标记则可以大幅增强FRET效应或淬灭效应，当有靶标分子存在时，由于G4或G3被激活的Cas12a切割，高级结构被破坏，造成相应荧光信号的改变会比单链的DNA报告基团更明显，从而更利于提高灵敏度。

附图说明

图1是不同盐离子条件下，Cas12a切割Telomere G4的效率。

图2是FRET实验证实Telomere G4可以被Cas12a切割。

图3是CD实验证实Telomere G4可以被Cas12a切割。

图4是NMR实验证实Telomere G4可以被Cas12a切割。

图5是FRET实验证实TBA G4可以被Cas12a切割。

图6是FRET和CD实验证实Telomere G3可以被Cas12a切割。

图7是FRET和CD实验证实TBA11 G3可以被Cas12a切割。

图8是通过FRET实验来测试灵敏度。

图9是通过试纸条检测测试灵敏度。

具体实施方式

试剂：Cas12a蛋白购买于广州美格生物技术有限公司；SARS-CoV-2N-gene和SARSN-gene是通过PCR扩增的方式得到，涉及的质粒及相关引物由北京擎科新业生物技术有限公司提供；下表中其他DNA或RNA由生工生物技术有限公司合成，经过HPLC-CE方式纯化并脱盐处理；试纸条购买自TwistDX公司。相关序列具体信息如下：

表1核酸序列表

注:有下划线标注的序列表示与目的基因结合的区间

实施例1

本实施例为不同盐离子条件下，Cas12a切割Fluo Telomere G4效率的对比。具体操作方法如下：

将Cas12a(1.5μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(3μL，1μM)和15.5μL对应的缓冲液(50mM NaCl，100mM NaCl，150mM NaCl，200mM NaCl，70mM KCl)于37℃下孵育10min，然后往上述体系中加入Fluo Telomere G4(50μl，5μM)和425μL相应缓冲液，将混合后的反应液加入到石英比色皿中，置于37℃恒温槽下孵育10min后，最后加入SARS-CoV-2N-gene(5μL，120ng/μL，序列如SEQ ID NO.1所示)在37℃恒温槽下开始采样，采样时间间隔设置为1min。荧光检测的激发波长为488nm，吸收波长为500-750nm。

如图1所示，Cas12a对Fluo Telomere G4的切割能力会受到离子种类和浓度的影响，具体表现为，从切割速度来看，50mM Na⁺＞100mM Na⁺＞150mM Na⁺＞70mM K⁺＞200mM Na⁺，造成这种现象的原因可能是由于Telomere G4在不同盐离子条件下形成的二级结构具有不同的稳定性，从而在切割速率上表现出差异。

对于钠离子浓度，本实施例测试了50～200mM Na⁺的效果，均可以实现G-四链体的切割，且发现高离子浓度下的G-四链体由于具有更高的稳定性导致其被切割的速率也更慢，因此50mM Na⁺是最适切割条件；对于钾离子浓度，本实施例主要测试了70mM K⁺条件下G-四链体的切割，但多篇文献已报道低浓度K⁺条件下也可以形成G-四链体(比如0.5mM和10mM，Nucleic Acids Research,2012,40,4229；Journal of Physical Chemistry B,2005,109,3594)，且文献中已表明K⁺浓度越低，稳定性相对越差；基于此可以推论在0.5～70mM钾离子的条件下均可实现G-四链体的切割。

实施例2

本实施例用FRET实验证明Fluo Telomere G4可以被激活的Cas12a切割，具体操作方法如下：

将Cas12a(1μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(2μL，1μM)和17μL酶解缓冲液(10mM Tris,pH 7.9,50mM NaCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后在上述体系中加入SARS-CoV-2N-gene(5μL，60ng/μL)和Fluo Telomere G4(25μL，5μM)，经过37℃酶切15min后，取5μL样品稀释到500μL进行荧光检测。荧光检测的激发波长设置为488nm，吸收波长设置为500-750nm。

结果如图2所示，由于Fluo Telomere G4的两端分别带有FAM和TAMRA荧光标记，在Na⁺溶液下形成稳定的G4结构后，上述两个荧光基团产生FRET，在谱图上表现为两个峰(518nm和585nm)，而被切割的G4不能产生这种效应，从而在荧光谱图上只有一个峰(518nm)，说明G4可以被激活的Cas12a切割。我们将SRAS N-gene(序列如SEQ ID NO.2所示)和纯buffer条件(以酶解缓冲液替代SARS-CoV-2N-gene或SRAS N-gene，其余条件不变，以下同理)作为对照，发现这两种条件下的荧光谱图重叠较好，说明这两种条件下Cas12a都不能切割G4。

实施例3

本实施例为CD实验证明Telomere G4可以被激活的Cas12a切割，具体操作方法如下：

将Cas12a(1.5μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(3μL，1μM)和15.5μL酶解缓冲液(10mM Tris,pH 7.9,50mM NaCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后往上述体系中加入SARS-CoV-2N-gene(5μL，60ng/μL)和Telomere G4(110μL，10μM)，经过37℃酶切2h后，将样品稀释到220μL进行CD检测,波长范围为200-320nm。

通过CD实验，我们发现加入SARS-CoV-2N-gene后，Na⁺溶液下的Telomere G4实验组的二级结构特征与SRAS N-gene和buffer条件下存在明显差异，如图3所示，245nm附近的正峰和265nm附近的负峰发生了明显的偏移，进一步证实了该Telomere G4可以被Cas12a切割。

实施例4

本实例为核磁共振实验证明Telomere G4在形成稳定的二级结构后可以被激活的Cas12a切割，具体操作方法如下：

将Cas12a(10μL，20μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(20μL，10μM)和70μL酶解缓冲液(10mM Tris,pH 7.9,100mM NaCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后加入Telomere G4和10％D₂O(v/v)，并添加酶解缓冲液至总体积为400μL,此时Telomere G4的终浓度为0.3mM。将上述样品置于核磁共振谱仪(Bruker AVANCE 700MHz)中采集一维氢谱的信号，温度设置为10℃。这里得到的谱图为G4被切割之前的信号，待采集完成后，往体系中加入终浓度为15nM的SARS-CoV-2N-gene置于37℃下酶切12h，随后采集Telomere G4被Cas12a切割后的核磁信号。

通过核磁共振实验，我们发现，在加入SARS-CoV-2N-gene之前，Cas12a的切割能力没有被激活，Telomere G4在100mM Na⁺溶液中形成了稳定的二级结构，如图4(a)所示，在核磁谱图上表现为10-12ppm范围内具有明显的特征峰；而加入SARS-CoV-2N-gene之后，Cas12a的任意切割能力被激活，Telomere G4被切割，如图4(b)所示，在核磁谱图上表现为10-12ppm范围内的特征峰也随之消失。

实施例5

本实施例为FRET实验证实Fluo TBAG4可以被激活的Cas12a切割，具体操作方法如下：

将Cas12a(1μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(2μL，1μM)和17μL酶解缓冲液(10mM Tris,pH 7.9,50mM NaCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后在上述体系中加入SARS-CoV-2N-gene(5μL，60ng/μL)和Fluo TBA G4(25μL，5μM)，经过37℃酶切15min后，取5μL样品稀释到500μL进行荧光检测。荧光检测的激发波长设置为488nm，吸收波长设置为500-750nm。

如图5所示，由于Fluo TBA G4的两端分别带有FAM和TAMRA荧光标记，在溶液中形成稳定的G4结构后，上述两个荧光基团产生FRET，在谱图上表现为两个峰(518nm和585nm)，而被切割的TBA G4不能产生这种效应，在荧光谱图上表现为只有一个峰(518nm)，说明TBAG4可以被激活的Cas12a切割。我们将SRAS N-gene和纯buffer条件作为对照，发现这两种条件下的荧光谱图重叠较好，说明这两种条件下Cas12a都不能切割TBA G4。

实施例6

本实施例为FRET和CD实验证实Telomere G3可以被激活的Cas12a切割，具体操作方法如下：

将Cas12a(2μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(4μL，1μM)和14μL酶解缓冲液(10mM Tris(pH 7.9),70mM KCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后往上述体系中加入SARS-CoV-2N-gene(10μL，60ng/μL)和Fluo Telomere G3(110μL，20μM)，经过37℃酶切1h后，添加缓冲液至总体积为220μL，然后取5μL样品稀释到500μL进行FRET荧光检测，余下的样品进行CD检测。荧光光谱的检测的波长范围为500-750nm，CD的波长检测范围为200-320nm。

我们首先通过荧光光谱实验证实加入SARS-CoV-2N gene后，如图6(a)所示，FRET现象明显消失，而SRAS N-gene和buffer条件下没有明显差异，说明该Telomere G3已经被Cas12a切割。然后我们通过CD实验，发现加入SARS-CoV-2N-gene后，如图6(b)所示，G3的二级结构特征与SRAS N-gene和buffer条件下存在明显差异，进一步证实了Telomere G3可以被激活的Cas12a切割。

实施例7

本实施例为FRET和CD实验证实TBA11 G3也可以被激活的Cas12a切割，具体操作方法如下：

将Cas12a(2μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(4μL，1μM)和14μL酶解缓冲液(10mM Tris(pH 7.9)，70mM KCl，10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后往上述体系中加入SARS-CoV-2N-gene(10μL，60ng/μL)和Fluo TBA11 G3(110μL，20μM)，经过37℃酶切1h后，添加缓冲液至总体积为220μL，然后取5μL样品稀释到500μL进行FRET荧光检测，余下的样品进行CD检测。荧光光谱的检测的波长范围为500-750nm，CD的波长检测范围为200-320nm。

我们首先通过荧光光谱实验证实加入SARS-CoV-2N gene后，如图7(a)所示，FRET现象明显消失，而SRAS N-gene和纯buffer条件下没有明显差异，说明该TBA11 G3已经被Cas12a切割。然后我们通过CD实验，发现加入SARS-CoV-2N-gene后，如图7(b)所示，G3的二级结构特征与SRAS N-gene和buffer条件下存在明显差异，进一步证实了TBA11 G3可以被激活的Cas12a切割。

实施例8

本实施例为通过FRET实验进行灵敏度检测，具体操作方法如下：

将浓度为100nM的SARS-CoV-2N-gene分别稀释至10fM、1fM、0.1fM和0.01fM等不同的浓度,然后用这些稀释好的浓度进行PCR扩增，PCR扩增体系为：25μL 2×PCR Mastermix，2.5μL SARS-CoV-2N-gene-FWD(10μM)和2.5μL SARS-CoV-2N-gene-REV(10μM)，10μL不同浓度的SARS-CoV-2N-gene。PCR程序设置为：(1)98℃3min；(2)98℃10s；(3)68℃30s；(4)重复(2)-(3),35个循环；(5)72℃5min。

然后将PCR扩增后的样品进行荧光检测。将Cas12a(1.5μL，2μM)、SARS-CoV-2N-gene crRNA(3μL，1μM)和15.5μL酶解缓冲液(10mM Tris，pH 7.9,50mM NaCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后往上述体系中分别加入10μL经过PCR扩增的不同浓度的SARS-CoV-2N-gene和Fluo Telomere G4(20μL，1.25μM)，经过37℃酶切30min，最后添加酶解缓冲液至500μL进行荧光检测。

如图8(a)所示，随着靶标SARS-CoV-2N-gene浓度的逐渐提高，Telomere G4 FRET效应逐渐减弱，说明反应体系中G4被切割的量也越来越多；如8(b)所示，当SARS-CoV-2N-gene的浓度为0.01fM时，其FRET值与G4 buffer条件下有显著差异，说明此方法的灵敏度最少可达0.01fM；通过优化条件，灵敏度还有很大的提升空间。

实施例9

PCR扩增后样品基于试纸条检测(试纸条购买于TwistDX公司，C线为对照线，T线为测试线，详细步骤见Nature Biotechnology,2020,38,870)。将浓度为100nM的SARS-CoV-2N-gene分别稀释至1pM，100fM，10fM，1fM和0.1fM等不同的浓度，然后用这些稀释好的浓度进行PCR扩增，PCR扩增体系为：25μL 2×PCR Master mix，2.5μL SARS-CoV-2N-gene-FWDprimer(10μM)和2.5μL SARS-CoV-2N-gene-REV primer(10μM)，10μL不同浓度的SARS-CoV-2N-gene。PCR程序设置为：(1)98℃3min；(2)98℃10s；(3)68℃30s；(4)重复(2)-(3)，35个循环；(5)72℃5min。将Cas12a(1.5μL，2μM)、crRNA(3μL，1μM)和15.5μL酶切缓冲液(10mMTris,pH 7.9,50mM NaCl,10mM MgCl₂)于37℃下孵育10min，然后往上述体系中分别加入10μL经过PCR扩增的不同浓度的SARS-CoV-2N-gene和Lateral flow G4(20μL，1.25μM)，经过37℃酶切30min，然后取反应物20μL与80μL缓冲液与1.5mL离心管中混合，插入试纸条，90秒后读取检测结果。

由图9可以看出，随着SARS-CoV-2N-gene浓度的提高，试纸条上的T线颜色逐渐变深。基于试纸条检测，CRISPR-Cas12a-G4体系可以用于靶标SARS-CoV-2N-gene的测定，灵敏度可达0.1fM。

序列表

<110> 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院

<120> 一种新型的核酸检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 931

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaaattggc tactaccgaa gagctaccag acgaattcgt ggtggtgacg gtaaaatgaa 60

agatctcagt ccaagatggt atttctacta cctaggaact gggccagaag ctggacttcc 120

ctatggtgct aacaaagacg gcatcatatg ggttgcaact gagggagcct tgaatacacc 180

aaaagatcac attggcaccc gcaatcctgc taacaatgct gcaatcgtgc tacaacttcc 240

tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc 300

ctcttctcgt tcctcatcac gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcagcag 360

taggggaact tctcctgcta gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc ttgctttgct 420

gctgcttgac agattgaacc agcttgagag caaaatgtct ggtaaaggcc aacaacaaca 480

aggccaaact gtcactaaga aatctgctgc tgaggcttct aagaagcctc ggcaaaaacg 540

tactgccact aaagcataca atgtaacaca agctttcggc agacgtggtc cagaacaaac 600

ccaaggaaat tttggggacc aggaactaat cagacaagga actgattaca aacattggcc 660

gcaaattgca caatttgccc ccagcgcttc agcgttcttc ggaatgtcgc gcattggcat 720

ggaagtcaca ccttcgggaa cgtggttgac ctacacaggt gccatcaaat tggatgacaa 780

agatccaaat ttcaaagatc aagtcatttt gctgaataag catattgacg catacaaaac 840

attcccacca acagagccta aaaaggacaa aaagaagaag gctgatgaaa ctcaagcctt 900

accgcagaga cagaagaaac agcaaactgt g 931

<210> 2

<211> 931

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaaattggc tactaccgaa gagctacccg acgagttcgt ggtggtgacg gcaaaatgaa 60

agagctcagc cccagatggt acttctatta cctaggaact ggcccagaag cttcacttcc 120

ctacggcgct aacaaagaag gcatcgtatg ggttgcaact gagggagcct tgaatacacc 180

caaagaccac attggcaccc gcaatcctaa taacaatgct gccaccgtgc tacaacttcc 240

tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaggga agcagaggcg gcagtcaagc 300

ctcttctcgc tcctcatcac gtagtcgcgg taattcaaga aattcaactc ctggcagcag 360

taggggaaat tctcctgctc gaatggctag cggaggtggt gaaactgccc tcgcgctatt 420

gctgctagac agattgaacc agcttgagag caaagtttct ggtaaaggcc aacaacaaca 480

aggccaaact gtcactaaga aatctgctgc tgaggcatct aaaaagcctc gccaaaaacg 540

tactgccaca aaacagtaca acgtcactca agcatttggg agacgtggtc cagaacaaac 600

ccaaggaaat ttcggggacc aagacctaat cagacaagga actgattaca aacattggcc 660

gcaaattgca caatttgctc caagtgcctc tgcattcttt ggaatgtcac gcattggcat 720

ggaagtcaca ccttcgggaa catggctgac ttatcatgga gccattaaat tggatgacaa 780

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Claims

1.一种新型核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将CRISPR-Cas12a和crRNA加入到酶切缓冲液中孵育，所述的酶切缓冲液含有5-20mM 镁离子，50-200 mM钠离子或者0.5-70 mM钾离子；

2）在上述体系中加入靶标DNA的扩增产物以及DNA G-四链体或G-三链体进行孵育，靶标DNA、crRNA和CRISPR-Cas12a形成三元复合体，该复合体将DNA G-四链体或G-三链体切割，利用G-四链体或G-三链体切割前后的高级结构的信号变化来检测靶标核酸。

2.根据权利要求1所述的新型核酸检测方法，其特征在于，所述的DNA G-四链体包括人端粒G4和凝血酶适配体G4，所述的DNA G-三链体包括人端粒G3和凝血酶适配体11 G3。

3.根据权利要求1所述的新型核酸检测方法，其特征在于，利用圆二色光谱或核磁共振检测DNA G-四链体或G-三链体切割前后的高级结构的信号变化。

4.根据权利要求1所述的新型核酸检测方法，其特征在于，所述的反应体系中加入硫磺素T或者血红素。

5.根据权利要求1所述的新型核酸检测方法，其特征在于，所述的DNA G-四链体或G-三链体的两端标记能发生荧光共振能量转移的一对荧光基团，或者一个荧光基团和一个淬灭基团。

6.根据权利要求1所述的新型核酸检测方法，其特征在于，所述的DNA G-四链体或G-三链体的两端标记基于试纸条方式检测的基团。

7.用于检测核酸的试剂盒，其特征在于，包括CRISPR-Cas12a，crRNA，DNA G-四链体或G-三链体，酶切缓冲液，所述酶切缓冲液含有5-20 mM 镁离子，50-200 mM钠离子或0.5-70mM钾离子。