CN116574732A - 一种基于修饰crRNA的CRISPR-Cas检测体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于修饰crRNA的CRISPR‑Cas检测体系。本发明对crRNA的3’和5’末端进行保护性修饰，包括延伸脱氧核糖核酸链，在核苷酸之间使用硫代磷酸酯(PS)键替代磷酸二酯键以及对碱基进行甲基化；发现通过对crRNA进行特定的修饰后，crRNA的稳定性得到了提高，而且在核糖核酸外切酶的条件下，90min后修饰crRNA的功能性依然保存良好，酶活力保留率在80％以上；而且在Cas12体系中修饰后的crRNA反式切割活性比未修饰时提升了4.4倍，提高了检测的灵敏度和结果的准确性；并且修饰crRNA在Cas12以及Cas13体系中都可以应用，可用于同时检测DNA以及RNA。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于修饰crRNA的CRISPR-Cas检测体系。
背景技术
核酸检测技术是一系列直接检测病毒核酸技术的总称，能够检测处于潜伏期的病原体。目前的核酸检测试剂盒多采用实时荧光定量Polymerase Chain Reaction(PCR)方法，该法通过检测累积的荧光信号来确定样本中核酸含量，具有较高的灵敏度和特异性，被认为是核酸检测的“金标准”。随着PCR技术的发展，数字核酸检测作为一项新兴技术，通过分区分析的方法，能够最大限度地减少竞争目标的影响，在强背景下识别微弱的信号，从而提高稀有物质检测的精度和灵敏度。此外，等温扩增技术以其快速、准确、特异，且不依赖精密仪器的特点，在临床和快速诊断中展现了良好的应用前景，常见的有重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、链接代扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)等。
CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)是细菌和古细菌中与获得性免疫反应系统相关的核酸序列，具有顺式和反式切割活性。顺式切割活性是切割靶标序列的能力，当病毒入侵时，细菌将外来DNA的片段整合进自己的基因组中，转录并进行加工后，生成crRNA(CRISPR RNA)，该crRNA能识别对应的病毒基因组，引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白(CRISPR相关蛋白)对病毒靶标序列进行识别和切割。反式切割活性是切割非靶标序列的能力，II类CRISPR/Cas系统，如Cas12a和Cas13a，形成的Cas/crRNA/靶DNA三元复合物进行顺式切割后，具有反式切割活性，能够对附近的单链DNA或RNA进行非特异性切割。将这一特性与FRET(荧光能量共振转移)技术结合，能够进行核酸检测。具体原理是设计一条末端分别添加荧光基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，称为reporter，在CRISPR/Cas系统进行顺式切割后，通过反式切割reporter产生荧光信号，检测荧光信号强度得以推断靶标核酸序列的含量，达到核酸检测的效果。
CRISPR/Cas系统因其快速、便携和准确的特点，在开发核酸检测新方法上具有极大的潜力。以CRISPR/Cas系统为核心，结合RPA等温扩增技术开发的核酸检测新方法SHERLOCK和DETECTR有着高灵敏度和特异性。核酸检测的核心是反式切割活性，以Cas/crRNA/靶DNA三元复合物的晶体结构出发，crRNA的变化将改变Cas酶结构域的构象，从而激活或抑制Cas酶的催化效率进而影响反式切割活性。此外，反式切割产生于系统进行顺式切割之后，而顺式切割需要crRNA识别靶标序列激活，因此若crRNA的浓度过低，纯度不足或序列产生突变，也将影响到系统的反式切割活性，使核酸检测的效果大打折扣。然而，crRNA极易降解，需要严格的贮存条件，即使在-80℃低温下也只能存活数个月，反复冻融会加速crRNA降解。此外，crRNA极易被酶切，在核酸检测时，一方面要严格控制外源RNA酶的污染，另一方面要最大限度地抑制内源性RNA酶，无疑提高了进行检测的条件要求，也使假阴性结果出现的概率增大。种种限制使该技术无法在即时检测领域推广使用。
本发明需要解决的技术问题是：用于识别靶序列的crRNA极不稳定，难以长期保存，且在暴露于血清等体液或实验室常规处理期间；极易被核酸内切酶或核酸外切酶降解，这在提高贮存难度的同时也使检测误差增大。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种修饰crRNA。
本发明第二方面的目的，在于提供一种CRISPR/Cas系统。
本发明第三方面的目的，在于提供上述修饰crRNA或CRISPR/Cas系统的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第五方面的目的，在于提供一种核酸检测或基因编辑的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种修饰crRNA，所述修饰crRNA的修饰方式为以下至少一种：
(a1)在crRNA的3’末端添加3～7个脱氧核糖核苷酸；
(a2)在crRNA的3’末端对添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a3)在crRNA的5’末端添加2～5个脱氧核糖核苷酸；
(a4)在crRNA的5’末端对添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a5)在crRNA3’末端和5’末端前三个碱基的磷酸二酯键使用硫代磷酸酯键进行替换和/或crRNA首尾的碱基进行甲基化。
在本发明的一些优选实施方式中，所述修饰crRNA的修饰方式为以下至少一种：
(a6)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，并对添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a7)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸；
(a8)在crRNA的5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，并对添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a9)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且5’末端添加的核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a10)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a11)在crRNA的3’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a12)在crRNA的3’末端添加7个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a13)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a14)在crRNA的3’末端和5’末端前三个碱基的磷酸二酯键使用硫代磷酸酯键进行替换和crRNA首尾的碱基进行甲基化。
在本发明的一些实施方式中，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示。
在本发明的一些实施方式中，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.10所示时，所述修饰crRNA的修饰方式优选为(a10)、(a11)或(a14)。
本发明的第二方面，提供一种CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统中的CrRN A片段为本发明第一方面所述经修饰的crRNA片段。
在本发明的一些实施方式中，所述CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白为Cas12a或Cas13。
其中引导Cas12a进行切割的crRNA修饰的方法可为(a6)～(a14)任一项；引导Cas13a进行切割的crRNA修饰的方法具体可为(a10)、(a11)或(a14)。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述修饰后的crRNA或本发明第二方面所述的CRISPR/Cas系统在以下至少一项中的应用；
(b1)非诊断目的的核酸检测；
(b2)制备核酸检测的产品；
(b3)提高crRNA反式切割活性；
(b4)提高crRNA稳定性。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂盒、芯片、试纸。
本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述修饰后的crRNA或本发明第二方面所述的CRISPR/Cas系统。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包含基因编辑或基因检测所需的常规试剂。
本发明的第五方面，提供一种核酸检测或基因编辑的方法，包括使用本发明第一方面所述修饰后的crRNA或本发明第二方面所述的CRISPR/Cas系统或本发明第四方面所述的产品。
本发明的有益效果是：
本发明对crRNA的3’和5’末端进行保护性修饰，包括延伸脱氧核糖核酸链，在核苷酸之间使用硫代磷酸酯(PS)键替代磷酸二酯键以及对碱基进行甲基化；发现进行特定的修饰后的crRNA的稳定性得到了提高，而且在存在核糖核酸外切酶的条件下，90min后修饰的crRNA的功能性依然保存良好，酶活力保留率在80％以上，而未修饰的crRNA仅保留不到20％；而且在Cas12体系中修饰后的crRNA反式切割活性比未修饰时提升了4.4倍，提高了检测的灵敏度和结果的准确性；并且修饰crRNA在Cas12以及Cas13体系中都可以应用，可用于同时检测DNA以及RNA。
附图说明
图1为反式切割活性实验流程。
图2为CRISPR-LbaCas12a酶活力提高倍数结果图。
图3为CRISPR-LbuCas13a酶活力提高倍数结果图。
图4为CRISPR-LbaCas12a酶活力保留率结果图。
图5为CRISPR-LbuCas13a酶活力保留率结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
主要溶液及成分：
10×NEBuffer 2.1包含10mM Tris-HCl(pH＝7.9)，50mM NaCl，10mM MgCl2，100μg/mL BSA；
10×Cas13a reaction buffer包含10mM Tris-HCl(pH＝8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2；
1×NEB Buffer 4包含50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT(pH7.9)；
1×TAE Buffer包含40mM Tris-Acetate，1mM EDTA，pH 8.3。
反式切割活性实验，步骤如下：
1)先向96孔板底部加入待反应试剂(试剂中包括发生反应所需的LbaCas12a(或LbaCas13a)，reporter，靶基因等成分)，静置15分钟。
2)将野生型或修饰后的crRNA分别加入管中。
3)将所得混合物转移至PCR仪中孵育。
4)反应结束后，通过分析不同crRNA反应得到的荧光曲线以对比其反式切割活性；
流程图如图1所示。
稳定性实验，步骤如下：
1)将野生型或修饰后的crRNA与RNSE T(核酸外切酶)混合，在25℃下水浴加热。
2)在相应的时间点取出6μL，高温使酶失活后存入-80°冰箱中用于后续检测。
实施例1：修饰crRNA的制备
本发明设计多条修饰crRNA序列，其中：
引导Cas12a进行切割的crRNA修饰的方法具体可为以下9种：
方案1：在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，并使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案2：在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸；
方案3：在crRNA的5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，并使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案4：在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且5’末端添加的核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案5：在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案6：在crRNA的3’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案7：在crRNA的3’末端添加7个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案8：在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案9：在crRNA的3’末端和5’末端前三个碱基的磷酸二酯键使用硫代磷酸酯键进行替换，并将首尾各一个的碱基进行甲基化；
引导Cas13a进行切割的crRNA修饰的方法具体可为以下3种：
方案5：在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案6：在crRNA的3’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
方案9：在crRNA的3’末端和5’末端前三个碱基的磷酸二酯键使用硫代磷酸酯键进行替换，并将首尾各一个的碱基进行甲基化。
具体序列如表1和表2所示。
表1CRISPR-LbaCas12a检测实验所用核酸序列
表2CRISPR-Cas13检测所用核酸序列
A：腺嘌呤核糖核苷酸；U：尿嘧啶核糖核苷酸；C：胞嘧啶核糖核苷酸；G：鸟嘌呤核糖核苷酸；dA：腺嘌呤脱氧核苷酸；dT：胸腺嘧啶脱氧核苷酸；‘*’：使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；其中crRNA-dsDNA，crRNA-RNA为未修饰序列，靶向N基因；crRNA-dsDNA(1-9)，crRNA-RNA(1-3)为修饰序列，下标有M为甲基化碱基，标红处为修饰区域。
实施例2：Crispr/Cas12a反式切割活性实验
1)将1.25ul的10×buffer置于96孔板底部，分别加入0.5ul Cas12a(2μM)，1.25ulssDNA reporter(5μM)，1.25ul靶DNA(10nM)和7.25ul无DNase/RNase蒸馏水，静置15分钟。
2)将0.5ul野生型或修饰后的crRNA(2.5μM)分别加入管中开始反应。
3)将所得混合物(12.5ul)转移至PCR仪中恒温40℃孵育一个小时，每分钟检测一次荧光强度(HEX通道)。
4)反应结束后，对于不同crRNA反应得到的荧光曲线，通过求斜率的方式得到不同时间点反应切割速度以对比其反式切割活性。
实施例3：Crispr/Cas13a反式切割活性实验
1)将1.25ul的10×buffer置于PCR管底部，分别加入3.125ul Cas13a(500nM)，1.25ul ssRNA reporter(5μM)，1.25ul靶RNA(10pM)，0.32ul RNase Inhibitor和4.93ul无DNase/RNase蒸馏水。
2)将0.625ul野生型或修饰后的crRNA(2.5μM)分别加入管中开始反应。
3)将所得混合物(12.5ul)转移至PCR仪中恒温37℃孵育一个小时，每一分钟检测一次荧光强度(FAM通道)。
4)反应结束后，对于不同crRNA反应得到的荧光曲线，通过求斜率的方式得到不同时间点反应切割速度以对比其反式切割活性。
CRISPR-LbaCas12a酶活力提高倍数结果如图2所示，这里使用反应开始5分钟后得到的荧光增长速率，代表CRISPR反式切割活性。通过图中数据可以得出：(1)方案1，2的荧光增长速率是原始crRNA的4倍，表明在crRNA的3’末端延伸单链DNA能够提高CRISPR反式切割活性；(2)方案3，4，5表明仅在crRNA的5’末端延伸单链DNA时，CRISPR反式切割活性变化不大，但是同时修饰3’和5’末端带来的反式切割活性增益高于仅修饰3’末端带来的增益；(3)方案5，8表明在3‘末端修饰条件相同的情况下，在5‘末端延伸3个碱基长度的单链DNA对提高反式切割活性效果最好；(4)方案5，6，7在5’末端修饰条件相同的情况下，分别在3’末端延伸3，5，7个碱基长度的单链DNA，实验结果表明，在3‘末端延伸单链DNA越长，活性提高越少，延伸单链DNA长度在7个碱基以内最佳；(5)方案9反式切割活性与原始crRNA相比提高了1.7倍，表明硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键和甲基化处理能够提高CRISPR反式切割活性。
修饰方案5即在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键得到的crRNA切割活性最好，与原始crRNA相比反式切割活性提高了4.4倍。
根据CRISPR-LbaCas12a系统反式切割实验结果，对LbuCas13a crRNA进行方案5，6，9的修饰。结果见图3，通过图中数据可以得出：(1)使用方案5修饰后的Cas13-crRNA活性与修饰前相当，表明该修饰方案也适用于CRISPR-LbuCas13a体系。(2)不延伸单链DNA，仅在末端修饰硫代磷酸键对CRISPR-LbuCas13a体系反式切割活性有抑制效果。
实施例4：crRNA酶活力保留率实验
1)将2μl野生型或修饰后的crRNA(20μM)分别加入到18μlNEB Buffer4反应体系中，每个体系加入5U RNAE T(NEB)。
2)在30min，60min，90min三个时间点取出6μl，在80℃下加热20分钟后冻入-80°冰箱用于后续酶活力检测。
3)对酶切后不同时间点的crRNA分别进行实施例2(或3)中的操作步骤，观察其酶活力的变化情况。
酶活力保留率结果图如图4和图5所示，其中图4数据属于CRISPR-LbaCas12a体系，图5数据属于CRISPR-LbuCas13a体系。
图4和图5展示对酶切90min后的crRNA进行反式切割活性实验所得数据。从图中数据可得：(1)提高crRNA稳定性并不影响提高反式切割活性；(2)对于CRISPR-LbaCas12a，修饰方案5-9的酶活力保留率均在80％以上，这表明3’和5’端同时修饰的crRNA要比不修饰或仅修饰一端的crRNA更稳定，即使在有大量核酸外切酶的环境下，由于修饰的保护作用，crRNA用于核酸检测的功能性也大部分得以保留，这一规律在CRISPR-LbuCas13a体系也得以体现，表明该规律具有通用性。(3)综合不同CRISPR-Cas体系下的反式切割活性提高倍数和酶活力保留率情况，修饰方案5为最优选择。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种修饰crRNA，其特征在于，所述修饰crRNA的修饰方式为以下至少一种：
(a1)在crRNA的3’末端添加3～7个脱氧核糖核苷酸；
(a2)在crRNA的3’末端对添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a3)在crRNA的5’末端添加2～5个脱氧核糖核苷酸；
(a4)在crRNA的5’末端对添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a5)在crRNA的3’末端和5’末端前2～4个碱基的磷酸二酯键使用硫代磷酸酯键进行替换和/或crRNA首尾的碱基进行甲基化。
2.根据权利要求1所述的修饰crRNA，其特征在于，所述修饰crRNA的为以下至少一种；
(a6)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，且3’末端添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a7)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸；
(a8)在crRNA的5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且5’末端添加的脱氧核糖核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a9)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且5’末端添加的核苷酸使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a10)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a11)在crRNA的3’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a12)在crRNA的3’末端添加7个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加2个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a13)在crRNA的3’末端添加3个脱氧核糖核苷酸，5’末端添加5个脱氧核糖核苷酸，且两末端添加的核苷酸都使用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键；
(a14)在crRNA的3’末端和5’末端前3个碱基的磷酸二酯键使用硫代磷酸酯键进行替换和crRNA首尾的碱基进行甲基化。
3.根据权利要求1或2所述的修饰crRNA，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和/或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
4.根据权利要求1或2所述的修饰crRNA，其特征在于，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示。
5.根据权利要求4所述的修饰crRNA，其特征在于，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.10所示时，所述修饰crRNA的修饰方式为(a10)、(a11)或(a14)。
6.一种CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas系统中的crRNA片段包括权利要求1～5任一项所述修饰crRNA片段。
7.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白为Cas12a或Cas13a。
8.权利要求1～5任一项所述的修饰crRNA或权利要求6～7任一项所述的CRISPR/Cas系统在以下至少一项中的应用；
(b1)核酸检测；
(b2)制备核酸检测的产品；
(b3)提高crRNA反式切割活性；
(b4)提高crRNA稳定性。
9.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1～5任一项所述的修饰crRNA或权利要求6～7任一项所述的CRISPR/Cas系统。
10.一种核酸检测或基因编辑的方法，包括使用权利要求1～5任一项所述的修饰crRNA或权利要求6～7任一项所述的CRISPR/Cas系统或权利要求9所述的产品。
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