CN116179652A - 基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法。该方法包括：通过LAMP方式对目标核酸进行扩增，得到扩增的目标核酸；利用RNA聚合酶对扩增的目标核酸进行转录，得到转录核酸；利用Cas13a核酸酶和crRNA形成的复合物，其中，利用crRNA识别转录核酸后激活非特异性RNase活性的Cas13a核酸酶剪切荧光底物，得到荧光信号用于检测。本申请还公开了一种检测痕量核酸的方法在病毒检测上的应用。通过上述方式，本申请能够实现对痕量核酸的普适、快速、精准识别检测。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法以及应用。
背景技术
随着分子生物学技术发展的日新月异，在很多的领域都需要对极其微量的核酸(痕量核酸)进行检测。痕量核酸检测可应用于病毒(如SARS、禽流感、新冠病毒等)、细菌、寄生虫等引起的疾病检测，物品安全检查及进出口的快速检测(如新冠病毒的感染检测)、细胞和基因治疗病毒载体药物制品的质控分析鉴定等领域，具有重要的应用价值。但是传统的分光光度计以及各种的Nano超微量分光光度计仅能检测到ng级的核酸分子，对于浓度低于ng级的核酸分子检测束手无策。
发明内容
本申请主要目的是提供一种基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法以及应用，能够解决痕量核酸难以快速精准检测的问题。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法。该方法包括：通过LAMP方式对目标核酸进行扩增，得到扩增的目标核酸；利用RNA聚合酶对扩增的目标核酸进行转录，得到转录核酸；利用Cas13a核酸酶和crRNA形成的复合物，其中，利用crRNA识别转录核酸后激活非特异性RNase活性的Cas13a核酸酶剪切荧光底物，得到荧光信号用于检测。
其中，通过LAMP方式对目标核酸进行扩增，得到扩增的目标核酸包括：获取6个引物，用于特异性识别目标核酸的片段以及在LAMP扩增的过程中使扩增的目标核酸成环。
其中，6个引物包括：第一上游引物、第二上游引物、上游成环引物、第一下游引物、第二下游引物以及下游成环引物，其中，上游成环引物位于第一上游引物和第二上游引物的下游，下游成环引物位于第一下游引物和第二下游引物的下游。
其中，启动子片段为T7启动子序列。
其中，RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
其中，利用Cas13a核酸酶和crRNA形成的复合物，其中，利用crRNA识别转录核酸后激活非特异性RNase活性的Cas13a核酸酶剪切荧光底物，得到荧光信号用于检测之前，包括：以转录核酸为模板设计靶向的crRNA。
其中，设计靶向的crRNA的模板为转录核酸中不会在扩增和转录过程中发生变化的片段。
其中，目标核酸包括HSV病毒基因组时，目标核酸的量至少为60拷贝数。
为解决上述技术问题，本申请采用的另一个技术方案是：提供一种检测痕量核酸的方法在病毒检测上的应用。该方法为上述技术方案中所述的基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法。
本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请通过LAMP对目标核酸进行等温扩增，结合Cas13a核酸酶进行荧光检测，能够检测出模板浓度低于ng级的目标核酸，实现对痕量核酸的普适、快速、精准识别检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请检测痕量核酸的方法的第一实施例的流程示意图；
图2是本申请检测痕量核酸的方法一实施例的实验流程示意图；
图3是本申请检测痕量核酸的方法一实施例的荧光检测结果。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
在详细说明本申请之前，先介绍一下与本申请相关的基本概念。
常规技术中，痕量核酸检测方法有SHERLOCK，该方法为结合等温扩增技术RPA(Recombinase Polymerase Amplification)与CRISPR/Cas家族蛋白Cas13a，特异性检测痕量核酸。该方法的步骤如下：等温扩增技术RPA主要利用3个核心蛋白：重组蛋白RecA，单链DNA结合蛋白SSB以及链置换DNA聚合酶来对DNA模板进行扩增；在RPA的引物5'端引入T7启动子后可将扩增的产物转录为RNA，利用Cas13a和crRNA复合物识别RNA模板后产生的非特异性RNase活性剪切RNA荧光底物后产生的荧光信号进行检测。
RPA的反应温度为37～42℃。在等温扩增技术RPA的扩增过程中，重组蛋白和引物结合形成的蛋白-DNA复合物能在双链DNA中寻找同源序列。而一旦引物确定了同源序列，就会发生链交换反应并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式的扩增。而被替换的DNA链与SSB结合以防止进一步的替换。
T7启动子是启动基因转录的一段序列，完全专一受控于T7 RNA聚合酶，是功能强大专一性高的强启动子，控制基因转录表达的起始时间和表达的程度。
由crRNA和RNA模板激活的Cas13a能对RNA进行切割，将荧光基团与淬灭基团分割以产生荧光。CRISPR是一种出色的基因组编辑工具，比较常用的是来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9)，不过这并不是唯一的选择，Cas13a(以前称为C2c2)的应用也越来越广泛。Cas9与Cas13a最大的区别在于Cas13a结合并切割RNA，而Cas9切割DNA。从结构上来看，Cas13a含有两个HEPN结构域，而Cas9用HNH和RuvC结构域来切割DNA目标。HEPN结构域对Cas13a切割RNA目标是必需的。Cas13a只需要crRNA即可实现对于RNA的结合和切割。crRNA通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用，并通过Cas13a的一系列构象变化来实现目标的切割。Cas13a能够容忍crRNA与目标序列之间的单个错配，不过若存在2个错配，那切割效率就大大降低。它的PFS序列(相当于PAM序列)位于间隔区的3’端，由A、U或C碱基组成。CRISPRCas13a蛋白的两个保守HEPN结构域导致了响应crRNA引导的RNA切割的复合HEPN催化口袋的形成。在没有靶标RNA的情况下，Cas13a蛋白的HEPN催化口袋无活性，其用于切割目标RNA的切割单元是没有活性的。在靶标RNA存在下，引导链的中心种子区域启动与互补靶标的结合，形成引导靶RNA双链体，然后其传播至引导链的两端。引导靶双螺旋的形成诱导Cas13a蛋白的构象变化，激活HEPN催化位点。因此，在靶RNA结合后，活化的HEPN催化位点完全具有RNase活性。活化的Cas13a蛋白分子不加选择地切割任何暴露的RNA分子，包括与Cas13a蛋白结合的靶RNA和溶液中的任何游离RNA，导致靶降解以及宿主和任何其他噬菌体RNA序列的附带切割。
等温扩增技术还包括交叉引物扩增(crossing priming amplification，CPA)，链替代扩增(strand displacement amplification，SDA)，依赖核酸序列的扩增(nucleicacid sequence-based amplification，NASBA)，滚环扩增(rolling circleamplification，RCA)，依赖解旋酶的扩增(helicase-dependent amplification，HDA)等等。
CPA在63℃左右进行，依赖Bst DNA聚合酶、甜菜碱和交叉引物。根据交叉引物数量的不同，可分为双交叉引物扩增和单交叉引物扩增。双交叉引物扩增使用两条交叉引物和两条剥离引物。两条交叉引物分别与模板链互补结合后延伸，随后剥离引物在Bst DNA聚合酶的作用下将新合成的单链剥离，最后两条交叉引物在Bst DNA聚合酶的作用下以新生单链为模板合成大量目的片段。单交叉引物扩增使用一条交叉引物、两条剥离引物和两条普通引物。首先交叉引物与模板链结合并延伸为双链，而剥离引物在Bst DNA聚合酶的作用下将新链与模板分离；随后普通引物以新链为模板，合成两条不同长度的单链DNA；最后以这两条单链为模板，以交叉引物与普通引物为引物对，形成扩增循环。
SDA的反应温度约为37℃，反应需要限制性核酸内切酶、链置换DNA聚合酶和两对引物，且其中一对引物(P1和P2)含有内切酶识别序列。反应开始时P1和P2与模板链互补结合，在聚合酶的催化下延伸为双链，随后内切酶识别双链两端的酶切位点，切割形成黏性末端。第二对引物结合模板链末端，在聚合酶的作用下合成新链同时置换出一条单链。
NASBA技术是检测RNA的等温扩增方法，通常在42℃左右进行，需要AMV(avianmyeloblastosis virus)逆转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一对引物来完成。其正向引物包含T7启动子互补序列。反应过程中正向引物与RNA链结合，由AMV酶催化形成DNA-RNA双链；RNA酶H消化杂交双链中的RNA,保留DNA单链；在反向引物与AMV酶的作用下形成含有T7启动子序列的DNA双链；在T7 RNA聚合酶的作用下完成转录过程，产生大量目的RNA。
RCA借鉴了自然界中环状DNA复制方式。所需酶为phi29DNA聚合酶，在37℃左右进行。普通RCA的过程为：引物与环状DNA模板结合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA单链。
HDA模拟体内DNA半保留复制过程，该反应在37℃左右进行，依赖于解旋酶、SSB、DNA聚合酶以及一对引物。过程为：DNA双链在解旋酶的作用下解开，SSB与单链DNA结合保持其稳定；同时引物与单链结合，在聚合酶的催化下形成双链；新合成的DNA双链作为模板进入新一轮扩增。
本申请所使用的方法为利用等温扩增技术LAMP与CRISPR/Cas家族蛋白Cas13a进行痕量核酸的检测。LAMP(loop-mediated isothermal amplification)，环介导等温扩增技术，也是一种全新的核酸扩增方法。LAMP的局限性在于引物的设计较繁琐，但是可通过标准化引物来克服。LAMP的基本过程为内引物结合目的基因，在聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5′端结合，在一端形成环状结构。另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构。哑铃状结构的单链DNA具有模板与引物的双重功能，在聚合酶的催化下即能延伸。内引物也能与环状结构结合，在酶的作用下进行延伸。在LAMP的DNA合成过程中，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，其与传统的PCR不同，不需要模板的热变性，温度循环、电泳以及紫外观察等过程，可以在等温(通常60-65℃)条件下，短时间内进行核酸扩增，是一种简单、快速、特异性强的方法。LAMP通过至少四条引物与靶序列上的六个特异部位准确结合以进行扩增反应，因此其扩增的特异性比两引物扩增的RPA更高，其扩增效率也比RPA更高。
下面结合附图和实施方式对本申请进行详细说明。
图1为本申请检测痕量核酸的方法的第一实施例的流程示意图。该方法包括以下步骤：
S11：通过LAMP方式对目标核酸进行扩增，得到扩增的目标核酸。
在一实施例中，通过LAMP方式对目标核酸，即目标DNA序列进行扩增。该方法包括：确定目标DNA序列，针对目的DNA序列设计引物，在DNA聚合酶的作用下，60-65℃下恒温扩增。其15至60分钟左右可实现10^9至10^10倍的核酸扩增。
在一实施例中，LAMP过程中针对DNA序列，即目标核酸设计的引物可包括第一上游引物、第二上游引物、上游成环引物、第一下游引物、第二下游引物以及下游成环引物。这些引物用于特异性识别模板DNA的片段以及在LAMP扩增的过程中使扩增的模板DNA成环。
在一实施例中，该目标DNA序列为复制型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)野生型病毒基因组。检测其在目标样本，比如非复制型HSV病毒载体制剂中是否微量存在或污染。微量可为基因组小于100拷贝数。在本申请的实施例中，当目标核酸基因组为HSV病毒基因组时，对于目标核酸的基因组为60拷贝数的情况下可明显的检测出来。随着相关实验条件的优化，该基因组的量还可进一步下降，该方法的检测灵敏度可进一步提升。该实验过程为将HSV1野生型病毒基因作为模板，针对其gD基因进行LAMP的引物设计、crRNA设计以及通过Cas13a核酸酶高灵敏检测是否存在野生型HSV靶基因组残留或污染。其gD基因序列如SEQ ID NO.1所示。
以该基因序列为模板所设计的LAMP引物包括FIP(F1C-F2)，F3，Loop F，BIP(B1C-B2)，B3，Loop B。F3为第一上游引物，其也可称为上游外部引物。B3为第一下游引物，其也可称为下游外部引物。FIP为第二上游引物，也可称为上游内部引物，由F2区和F1C区组成，F2区与靶基因3'端的F2C区互补，F1C区与靶基因5'端的F1C区相同。BIP为第二下游引物，也可称为下游内部引物，由B1C区和B2区组成，B2区与靶基因3'端的B2C区互补，B1C区与靶基因5'端的B1C区相同。Loop F和Loop B即为上游成环引物和下游成环引物。上游成环引物位于第一上游引物和第二上游引物的下游，下游成环引物位于第一下游引物和第二下游引物的上游。其相关的基因序列如下所示：
FIP：TGTGGTACACGCGCCGGATTTTCCAATCGCTTTCGCGGCAAAG
F3：TCTCTCAAGATGGCCGACC
F2：CCAATCGCTTTCGCGGCAAAG
F1：GTCCGGCGCGTGTACCACAT
Loop-F：GTCAGCTGGTCCAGGAC
Loop-B：CAGCCTCCCGATCACGGTT
B3：GCGTTTAGGAGCACGCT
B2：CAGGCGCGCTCCAACACG
B1：GGCTGGAACGGGTCCGGTAG
BIP：CTACCGGACCCGTTCCAGCTTTTCAGGCGCGCTCCAACAC
而上游成环引物和下游成环引物需包括识别序列和启动子序列。该识别序列用于特异性识别模板DNA的片段。该启动子序列是由于Cas13a核酸酶只能靶向识别RNA，因此需要将启动子序列引入设计的6个引物中的一条或者多条的5'端，以帮助扩增的序列进行RNA转化从而被Cas13a所识别。
由于引物F3和B3仅仅作用在LAMP环形成的过程中，不出现在后续的扩增产生的DNA的产物中，因此在这两条引物中加入启动子是属于无效扩增，因为产生的扩增产物中并不会含有启动子序列，进而无法实现体外转录，后续试验也无法进行。而在FIP以及BIP引物的5'端引入启动子序列，会影响LAMP的成环过程，使得扩增过程无法实现。在Loop引物的5'端引入的启动子序列，对于LAMP整个扩增过程无任何影响。除去Loop引物外的其他四引物依旧可以完成扩增过程，而Loop引物可在此基础上对扩增产物进行进一步的扩增。因此，实验过程中的引物设计引入了包含启动子序列的引物替代原本的Loop F和Loop B。
该启动子可包括T7启动子，是来自于T7噬菌体的能够对T7 RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是能够启动基因转录的一段序列。
T7启动子的基因序列如下所示：
T7 promoter：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
而代替原本的成环引物Loop F和Loop B的新的成环引物T7-Loop F和T7-Loop B的基因序列如下所示：
T7-LoopF：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGTCAGCTGGTCCAGGAC
T7-LoopB：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCAGCCTCCCGATCACGGTT
在使用T7启动子序列作为启动RNA转录的序列后，相对应地，后续使用的RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
S12：利用RNA聚合酶对扩增的目标核酸进行转录，得到转录核酸。
在一实施例中，在得到扩增后的模板DNA后，对应地利用RNA聚合酶对模板DNA进行体外转录，转录为模板RNA。转录完成之后，以该模板RNA为模板设计靶向的crRNA。
例如，在上述的实施例中，在以HSV1野生型病毒基因作为模板设计的六引物，FIP(F1C-F2)，F3，T7-Loop F，BIP(B1C-B2)，B3，T7-Loop B作用下扩增的复制型单纯疱疹病毒野生型病毒基因组目标核酸，将得到的扩增产物进行转录得到RNA，以该RNA为模板设计crRNA。
而设计靶向的crRNA的模板为转录核酸中不会在扩增和转录过程中发生变化的片段，从而保证该crRNA可靶向ssRNA。ssRNA，即模板RNA，为可被Cas13a核酸酶所识别剪切的目标RNA片段。
在上述实施例中，LAMP扩增和转录的产物序列有以下几部分是不变的，F1/B1C，Loop B/B2C，Loop F/F2C。其都可以作为crRNA设计的靶标。其基因序列如下所示：
F1-B1C：
GTCCGGCGCGTGTACCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCC
LoopB-B2C：
CAGCCTCCCGATCACGGTTTACTACGCCGTGTTGGAGCGCGCCTG
LoopF-F2C：GGTCAGCTGGTCCAGGACCGGAAGGTCTTTGCCGCGAAAGCGATTG
S13：利用Cas13a核酸酶和crRNA形成的复合物，其中，利用crRNA识别转录核酸后激活非特异性RNase活性的Cas13a核酸酶剪切荧光底物，得到荧光信号用于检测。
利用将设计的crRNA与Cas13a结合形成的复合物，其中，利用设计的crRNA特异性识别模板RNA，识别后会激活Cas13a核酸酶的非特异性RNase活性，再利用具有了非特异性RNase活性的Cas13a核酸酶对RNA荧光底物进行剪切。激活后的Cas13a核酸酶由于具有了非特异性，因此对所有的RNA都可以进行剪切，就能够剪切荧光底物，将荧光基团与淬灭基团进行分离，以产生荧光信号用于检测。
下面结合图2，对本申请第一实施例进行更加详细的说明。图2为本申请检测痕量核酸的方法一实施例的实验流程示意图。
本实施例以检测目标样本(如非复制型HSV病毒载体制剂)中的微量(基因组<100拷贝)复制型单纯疱疹病毒野生型病毒基因组为范例。方法为以HSV1野生型病毒基因组作为模板，针对其gD基因进行LAMP引物、crRNA设计以及通过Cas13a核酸酶高灵敏检测是否存在野生型HSV靶基因组残留或污染。
检测过程可大致分为三大步骤：扩增过程、转录过程以及检测过程。
扩增过程：首先设计靶向HSV病毒gD基因的6个引物的扩增方案。6个引物分别为FIP(F1C-F2)，F3，Loop F，BIP(B1C-B2)，B3，Loop B。而在将T7启动子加入成环引物后形成新的引物T7-Loop F和T7-Loop B代替原有的Loop F和Loop B。
引物设计完成之后，LAMP的一个反应体系可如下所示：1.6μM FIP/BIP、0.2μM F3/B3、0.4μM T7-LoopF/B，1.4mM dNTP each，8μl Bst DNA聚合酶(碧云天，D7050S)，1×Bstreaction buffer，8mM MgSO4，总体系25μl，65℃，30min。该反应温度和反应时间可根据实际试验情况自行调整以达到最佳的试验效果。
转录过程：在完成LAMP扩增后，其扩增得到的DNA产物中也引入T7启动子序列，利用T7 RNA聚合酶即可进行体外转录，将模板DNA转录为ssRNA用于后续Cas13a检测。其反应体系可如下所示：10μl扩增过程中的扩增产物，10μl NTP，1μl T7 RNA polymerase，加RNase-free H2O补充，总体系30μl，37℃30min。该反应温度和反应时间可根据实际试验情况自行调整以达到最佳的试验效果。
检测过程：得到转录产物后，需设计靶向ssRNA的crRNA。
本实施例中，选取Loop B/B2C作为靶标设计crRNA，靶向序列长度28nt，该gDcrRNA的基因序列如下所示：
gD crRNA：
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUCCAACACGGCGUAGUAAACCGUGAUC
而为了得到crRNA需设计模板ssDNA与T7启动子退火后进行体外转录，该模板DNA的基因序列如下所示：
crRNA IVT DNA template：
GATCACGGTTTACTACGCCGTGTTGGAGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
该过程的一个反应体系可如下所示：1μl 100mM ssDNA，1μl 100mM T7 promoter，1μl 10×Taq buffer，7μl RNase-free H20，95℃5min，然后0.2℃/s退火至4℃，接着根据转录过程中同样的方法进行体外转录得到target ssRNA并纯化，然后利用cas13a核酸酶蛋白进行荧光信号检测，检测过程的一个反应体系可如下所示：10μl转录过程中获取的ssRNA模板，0.5μM cas13a酶，2μl RnaseAlert(Invitrogen，4479768)，1μl Rnase inhibitor(NEB，M0314S)，1μl crRNA，RNase-free H20补充至20μl，37℃real time detection。其中的RnaseAlert即为荧光RNA底物，该底物一端标记有荧光报告分子(荧光体)，另一端标记有淬灭基团，以用于被激活后的Cas13a核酸酶切割。该反应温度和反应时间可根据实际试验情况自行调整以达到最佳的试验效果。此检测过程的荧光检测信号可通过qPCR来进行实时监测，也可以在反应一段时间后直接进行荧光数据的读取。
检测结果如图3所示。从图3中可看出，从模板量10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng、直至低至10-5ng(60拷贝数)都能够得到很好的阳性扩增信号，以及展现明显的荧光反应。图3C中的Negative Control，为反应体系中不加入HSV1基因组的样品。Positive Control为直接合成crRNA对应的ssDNA体外转录进行检测，该DNA的基因序列如下所示：
Positive control IVT DNA template：
GCACGCTGCGGCAGGCGCGCTCCAACACGGCGTAGTAAACCGTGATCGGGAGGCTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
实验结果进一步说明了本申请的方法将T7启动子加入至Loop引物中的5'端并不影响LAMP的扩增效率，该引入为有效引入。
本申请还公开了一种应用，将上述的基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法应用于病毒检测，例如在病毒感染、细菌、寄生虫等引起的疾病检测，食品化妆品安全检查及进出口快速检测(如新冠病毒感染检测)，细胞和基因治疗病毒载体制剂的质控分析检测等方面。
本申请通过将T7启动子引入Loop引物，使得启动子的引入不会对扩增过程产生影响，并且能够出现在扩增的产物之中，进而可以使用LAMP技术进行目标核酸的等温扩增，实现目标核酸的指数级增长，然后在进行目标核酸的转录后结合设计的crRNA以及Cas13a核酸酶，实现对转录后目标核酸的识别与荧光底物的剪切，从而产生荧光以用于识别检测。该LAMP、Cas13a核酸酶联合检测方法可用于精准检测任意的目标靶核酸，不论是DNA还是RNA片段，无需特殊的PCR扩增仪，检测操作便捷、快速且结果精准可靠。
综上所述，本申请通过LAMP对目标核酸进行扩增，结合Cas13a核酸酶进行荧光检测，能够检测出模板浓度低于ng级的目标核酸，实现对痕量核酸的普适、快速、精准识别检测。
在本申请所提供的几个实施方式中，应该理解到，所揭露的方法以及设备，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的设备实施方式仅仅是示意性的，例如，所述模块或单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。
以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法以及应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1185
<212> gD基因DNA
<213> HSV病毒
<400> 1
ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGATGCCTCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCGGCGCGTGTACCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGATCACGGTTTACTACGCCGTGTTGGAGCGCGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTAAACGCACCGTCGGAGGCCCCCCAGATTGTCCGCGGGGCCTCCGAAGACGTCCGGAAACAACCCTACAACCTGACCATCGCTTGGTTTCGGATGGGAGGCAACTGTGCTATCCCCATCACGGTCATGGAGTACACCGAATGCTCCTACAACAAGTCTCTGGGGGCCTGTCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGAACTACTATGACAGCTTCAGCGCCGTCAGCGAGGATAACCTGGGGTTCCTGATGCACGCCCCCGCGTTTGAGACCGCCGGCACGTACCTGCGGCTCGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATTACACAGTTTATCCTGGAGCACCGAGCCAAGGGCTCCTGTAAGTACGCCCTCCCGCTGCGCATCCCCCCGTCAGCCTGCCTGTCCCCCCAGGCCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCATCCCCGAGAACCAGCGCACCGTCGCCGTATACAGCTTGAAGATCGCCGGGTGGCACGGGCCCAAGGCCCCATACACGAGCACCCTGCTGCCCCCGGAGCTGTCCGAGACCCCCAACGCCACGCAGCCAGAACTCGCCCCGGAAGACCCCGAGGATTCGGCCCTCTTGGAGGACCCCGTGGGGACGGTGGCGCCGCAAATCCCACCAAACTGGCACATACCGTCGATCCAGGACGCCGCGACGCCTTACCATCCCCCGGCCACCCCGAACAACATGGGCCTGATCGCCGGCGCGGTGGGCGGCAGTCTCCTGGCAGCCCTGGTCATTTGCGGAATTGTGTACTGGATGCGCCGCCGCACTCAAAAAGCCCCAAAGCGCATACGCCTCCCCCACATCCGGGAAGACGACCAGCCGTCCTCGCACCAGCCCTTGTTTTACTAG
Claims (10)
1.一种基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法，其特征在于，包括：
通过LAMP方式对目标核酸进行扩增，得到扩增的目标核酸；
利用RNA聚合酶对所述扩增的目标核酸进行转录，得到转录核酸；
利用Cas13a核酸酶和crRNA形成的复合物，其中，利用所述crRNA识别所述转录核酸后激活非特异性RNase活性的所述Cas13a核酸酶剪切荧光底物，得到荧光信号用于检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过LAMP方式对目标核酸进行扩增，得到扩增的目标核酸，包括：
获取6个引物，用于特异性识别所述目标核酸的片段以及在LAMP扩增的过程中使所述扩增的目标核酸成环。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述6个引物包括：第一上游引物、第二上游引物、上游成环引物、第一下游引物、第二下游引物以及下游成环引物，其中，所述上游成环引物位于所述第一上游引物和所述第二上游引物的下游，所述下游成环引物位于所述第一下游引物和所述第二下游引物的上游。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述上游成环引物和所述下游成环引物包括识别序列和启动子序列，其中所述识别序列用于特异性识别所述目标核酸的片段，所述启动子序列用于被所述RNA聚合酶识别以启动转录，所述启动子序列位于所述片段的5'端。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述启动子序列为T7启动子序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用Cas13a核酸酶和crRNA形成的复合物，其中，利用所述crRNA识别所述转录核酸后激活非特异性RNase活性的所述Cas13a核酸酶剪切荧光底物，得到荧光信号用于检测之前，包括：
以所述转录核酸为模板设计靶向的crRNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，设计所述靶向的crRNA的模板为所述转录核酸中不会在所述扩增和所述转录过程中发生变化的片段。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述目标核酸包括HSV病毒基因组时，所述目标核酸的量至少为60拷贝数。
10.一种检测痕量核酸的方法在病毒检测的应用，其特征在于，所述方法是如权利要求1-9中任意一项所述的基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法。
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