CN112662814A

CN112662814A - 鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA

Info

Publication number: CN112662814A
Application number: CN202110091225.2A
Authority: CN
Inventors: 赵丽丽; 陈洪岩; 王玉娥
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112662814B

Abstract

本发明公开了鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA。本发明基于设计的RPA引物对和特异性的crRNA建立了一种基于SHERLOCK诊断平台可视、灵敏且特异的鹅星状病毒快速临床检测系统，该系统特异性识别鹅星状病毒RNA部分保守序列，同时LwCas13a的协同切割活性被激活以降解作为报告基因的非靶向RNA，以此为基础对临床样品中的RNA进行核酸检测。本发明检测系统在37℃下进行等温检测，可用于实时分析或视觉读数，检测系统的最低检出限为1.3×10²copies/μL，且与其他水禽病毒没有交叉反应，增强的Cas13a检测还可直接在临床样品中发挥作用。

Description

鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测系统及RPA引物对和 crRNA

技术领域

本发明涉及鹅源星状病毒核酸的检测，尤其涉及采用CRISPR–Cas13a横向流动检测系统检测鹅源星状病毒核酸的方法以及RPA引物对及其特异性CRISPR RNA，属于鹅源星状病毒核酸的可视化检测领域。

背景技术

自2017年来，中国多个省份的鹅场都发现并报道了一种以致命的内脏和关节痛风为主要临床特征的水禽传染性疾病，该病多发于雏鹅，且具有高度致死性，死亡率为30％至50％。死亡鹅表现为肾脏发白肿胀，胸腹膜及心表面、输尿管中存在大量尿酸盐沉积，给养鹅业带来严重经济损失。经过病原学检测，研究者们从各个地区临床样本中相继分离并鉴定出一种与已报道的禽星状病毒遗传学差异较大的新型星状病毒，并命名为鹅源星状病毒(Goose-origin astrovirus，GoAstV)。

目前常规PCR及荧光定量PCR方法是检测该病毒常用的手段，无论从定性还是定量方面均表现良好的灵敏性和特异性，但检测条件较为复杂，需要使用昂贵的仪器设备，目前仅限于实验室诊断使用且步骤繁琐耗时较长，无法用于现场即时的临床检测，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的之一提供CRISPR–Cas13a检测系统检测鹅源星状病毒核酸的RPA引物对及其特异性CRISPR RNA；

本发明的目的之二是提供应用所述的RPA引物对及其特异性CRISPR RNA构建一种鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测系统。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

采用CRISPR–Cas13a检测系统检测鹅源星状病毒核酸的RPA引物对及其特异性CRISPR RNA，其中，所述的RPA引物对选自以下12对引物对中的任何一对：

(1)由RPA F1-1和RPA R1-1组成的引物对，其中，RPA F1-1的核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，RPA R1-1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；

(2)由RPA F1-1和RPA R1-2组成的引物对，其中，RPA F1-1的核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，RPA R1-2的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；

(3)由RPA F1-2和RPA R1-1组成的引物对，其中，RPA F1-2的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示，RPA R1-1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；

(4)由RPA F1-2和RPA R1-2组成的引物对，其中，RPA F1-2的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示，RPA R1-2的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；

(5)由RPA F1-3和RPA R1-1组成的引物对，其中，RPA F1-3的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示，RPA R1-1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；

(6)由RPA F1-3和RPA R1-2组成的引物对，其中，RPA F1-3的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示，RPA R1-2的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；

(7)由RPA F2-1和RPA R2-1组成的引物对，其中，RPA F2-1的核苷酸序列为SEQ IDNo.6所示，RPA R2-1的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；

(8)由RPA F2-1和RPA R2-2组成的引物对，其中，RPA F2-1的核苷酸序列为SEQ IDNo.6所示，RPA R2-2的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；

(9)由RPA F2-2和RPA R2-1组成的引物对，其中，RPA F2-2的核苷酸序列为SEQ IDNo.7所示，RPA R2-1的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；

(10)由RPA F2-2和RPA R2-2组成的引物对，其中，RPA F2-2的核苷酸序列为SEQID No.7所示，RPA R2-2的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；

(11)由RPA F2-3和RPA R2-1组成的引物对，其中，RPA F2-3的核苷酸序列为SEQID No.8所示，RPA R2-1的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；

(12)由RPA F2-3和RPA R2-2组成的引物对，其中，RPA F2-3的核苷酸序列为SEQID No.8所示，RPA R2-2的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

所述的特异性CRISPR RNA(crRNA)可以是crRNA-1或crRNA-2中的任何一种，所述的crRNA-1的DNA模板序列为SEQ ID No.11所示，所述的crRNA-2的DNA模板序列为SEQ IDNo.12所示。

本发明对上述的12对引物搭配各自的crRNA进行显色反应的视觉效果来筛选出最佳预扩增引物及相应的crRNA，结果发现引物F1-1/R1-2,F1-2/R1-2,F1-3/R1-1搭配crRNA-1以及引物F2-3/R2-1搭配crRNA-2虽侧向流动检测条的测试线出现了显色条带但多不明显，而引物F1-1/R1-1(扩增片段长度为119bp，Tm＝60℃)搭配使用crRNA-1显色效果最佳，且阴性对照成立。

本发明进一步提供了一种鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测试剂盒，包括：RPA引物对，CRISPR RNA，Cas13a蛋白，DEPC水，NTP buffer mix，T7 RNA polymerase mix，PCR std buffer，Rnase inhibitor murine，LF-polyU和鹅源星状病毒质粒标准品；其中，所述的RPA引物对选自以下12对引物对中的任何一对：

所述的特异性CRISPR RNA(crRNA)是crRNA-1或crRNA-2中的任何一种，所述的crRNA-1的DNA模板序列为SEQ ID No.11所示，所述的crRNA-2的DNA模板序列为SEQ IDNo.12所示。

为了在不具备仪器设备操作条件的室外使用，本发明建立了鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a横向流动检测系统，对于阴性样品，金颗粒抗FAM抗体与高浓度FAM-RNA-生物素报道分子充分偶联，偶联物在对照带被生物素配体截获；对于阳性样品，FAM-RNA-生物素报告基因被Cas13a切割，金颗粒-抗FAM抗体-FAM的结合物在测试条带处积累，而在对照条带处减少。采用本发明构建的CRISPR-Cas13a横向流动检测分析了几株GoAstV株(HLJ01，MS01,JMS01和SYS02)并优化得到最佳反应体系及条件。进一步对该方法的特异性，灵敏性进行验证，结果显示该方法特异性良好且最低检测限为10²拷贝，敏感性与荧光定量PCR相近。经临床样品检测试验验证可知该方法适用于大批量快速定性检测GoAstV，有效地证明了CRISPR-Cas13a横向流动检测系统可以通过视觉观察检测GoAstV。将该方法结合HUDSON方法处理临床样本并检测，以期实现疫区的现场GoAstV诊断，彻底摆脱检测仪器的限制，经验证后反应效果良好，可通过进一步优化实验操作及条件完善该方法并为后续大规模应用奠定基础。

本发明建立了一种基于SHERLOCK(特定的高灵敏度酶报告分子解锁)诊断平台的鹅星状病毒快速临床检测系统，该系统将重组酶聚合酶核酸预扩增(RPA)与CRISPR–Cas蛋白酶学相结合，可特异性识别鹅星状病毒RNA部分保守序列，同时LwCas13a的协同切割活性被激活以降解作为报告基因的非靶向RNA。以此为基础对临床样品中的RNA进行直观、灵敏且特异的核酸检测。本发明检测系统在37℃下进行等温检测，该检测可用于实时分析或视觉读数；该检测系统的最低检出限为1.3×10²copies/μL，且与其他水禽病毒没有交叉反应。增强的Cas13a检测还可以直接在临床样品中很好地发挥作用。

总之，本发明提供了一种基于RPA、T7转录和CRISPR-Cas13a相结合的可视、灵敏且特异的鹅源星状病毒核酸核酸CRISPR–Cas13a检测系统，该系统对GoAstV的早期检测及后期流行病学调查提供了技术支撑，对该疾病的治疗和预防更具指导意义。

附图说明

图1 RPA引物筛选结果。

图2目的片段PCR结果；M.DL2000 DNA Marker；1-2.目的基因；3.阴性对照。

图3 SHERLOCK横向流动试纸条特异性检测结果。

图4常规PCR敏感性检测结果。

图5荧光定量PCR敏感性检测结果。

图6本发明建立的SHERLOCK侧向流动试纸条敏感性检测结果。

图7常规RT-PCR检测36个临床样品结果。

图8荧光定量PCR检测36个临床样品结果。

图9采用本发明建立的SHERLOCK平台检测36个临床样品结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

毒株及主要试剂

GoAstV HLJ01株(GenBank登录号：MN175321.1)，YC01，XZ02，JL02，MS01，JMS01，SYS02，PF01株为本发明人实验室2018年至今从各发病地区鹅场病死雏鹅肝、肾组织分离获得。新城疫病毒(NDV)购自哈尔滨维科生物技术有限公司。鹅细小病毒(GPV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭肝炎病毒1型(DHV-1)、产蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等由本发明人实验室保存。

Cas13a(Lwa)购自广州博徕斯生物科技股份有限公司；HiScribe T7Quick HighYield RNA Synthesis Kit、

RNA Cleanup Kit(500μg)、RNase inhibitorMurine均购自New England Biolabs公司；Milenia HybriDetect试纸条购自TwistDx公司；TaKaRa Ex Taq和PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser购自TaKaRa公司；RT-荧光型核酸扩增试剂盒购自杭州众测生物技术有限公司；DEPC无菌水购自北京索莱宝科技有限公司。

试验例1 RPA引物及crRNA的筛选、CRISPR–Cas13a可视性检测反应条件的优化以及质粒标准品的构建

1试验方法

1.1 RPA引物及CRISPR RNA的设计

使用DNASTAR对GoAstV参考序列进行比对，选择一段保守区域并设计RPA引物。为了最大化扩增成功，引物长度应为25-35nt，总扩增子大小80-140bp，引物通常设计为具有54至67℃的熔解温度，并将T7启动子序列(GAAATTAATACGACTCACTATAGGG)附加到RPA正向引物的5'末端。

对于crRNA的设计遵循以下四个原则：不能与RPA引物序列重叠；应该是与转录RNA中的目标位点反向互补；28nt的spacer序列可设置在RPA扩增产物中的任何位置；将spacer序列与5’direct repeat(DR)序列连接以产生完整的crRNA，其DNA模板附加有T7启动子序列。

根据设计原则分别设计了两条crRNA及其各自对应的6对RPA引物(表1)，通过后续实验条件的优化及视觉效果的判定，最终选择一对RPA引物及其对应的一条crRNA作为常用引物及序列。

表1相关RPA引物及CRISPR RNA

1.2 CRISPR RNA的合成

使用TaKaRa Ex Taq试剂盒将crRNA的DNA模板退火成双链DNA，退火体系：crRNAsIVT tempaltes(100uM)1ul，T7-3G IVT(100uM)1ul，10×Pcr std buffer 1ul，dNTP(2.5mM)0.8ul，Ex Taq 0.05ul，DEPC H2O补足至总体系10ul。进行退火反应，退火程序：95℃5min；94℃to 4℃(0.5℃/s)；72℃1min。根据HiScribe T7 Quick High Yield RNASynthesis Kit的说明，向上步得到的退火产物中加入10ul NTP buffer mix，2ul T7RNApolymerase mix和18ul DEPC H₂O。通过在37℃孵育过夜，将双链DNA转录为crRNA。根据制造商的说明，使用

RNA Cleanup Kit纯化crRNA，使用DEPC H₂O调整浓度至10ng/ul(分装20ul一管，-80℃保存)。

1.3核酸制备及质粒构建

按照病毒RNA提取试剂盒的说明书提取GoAstV HLJ01，YC01，XZ02，JL02，MS01，JMS01，SYS02，PF01等株的病毒RNA，以及其他各类水禽病毒的病毒基因组，所有RNA-80℃保存，DNA-20℃保存备用。

按照PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser的操作手册对GoAstVHLJ01株病毒RNA进行cDNA的合成。以得到的cDNA为模板，利用引物RPAZL F1/R1对标准品目的片段进行PCR扩增。反应体系：2×Taq PCR StarMix 10μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，cDNA模板1μL，ddH₂O补充至20μL；反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，30cycles；72℃10min；12℃∞。将获得的产物进行凝胶电泳、切胶回收并纯化目的片段，连接pMD-19T克隆载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌进行扩大培养，提取质粒并送测序，将序列鉴定正确的阳性质粒命名为pMD-19T-RPAZL，-80℃保存备用。测定pMD-19T-RPAZL浓度，并进行10倍的梯度稀释，将其作为CRISPR–Cas13a可视化检测方法的标准品。

1.4重组聚合酶扩增(RPA)

按照RT-荧光型核酸扩增试剂盒(RT-RPA)试剂盒说明书操作，每管反应干粉加入Buffer A 40.9ul，上下游引物RPA F1/R1(10uM)各加2ul，RNA模板加2ul，Buffer B加2.5ul。加完盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心10s，42℃反应30min。

1.5显色反应体系和条件的优化

将1.4获得的RT-RPA扩增产物加入到显色反应体系中，显色反应体系：DEPC水10.7ul，NTP buffer mix 0.8ul，T7 RNA polymerase mix 0.5ul，10×PCR std buffer2ul，Rnase inhibitor murine 1ul，Cas13a(50μM)1ul，crRNA 1ul，LF-polyU(10μM)2ul。37℃作用15min后，取上述反应液，加入适量的上样缓冲液(提前平衡至室温)，混匀。混合液中插入Milenia HybriDetect试纸条，室温作用2～5min，观察显色情况。

将LF-polyU和Cas13a分别稀释至10μM和50mM，在2ul LF-polyU条件下，对1.4中得到的扩增产物加入量(0.5ul、1ul、2ul、4ul)进行摸索，并采取控制变量法优化Cas13a及crRNA的工作浓度，利用优化后的反应体系对LF-polyU的量(0.5、1ul、2ul)进行确定。确定以上反应条件后对显色反应体系的反应时间，试纸条上样模板量、上样缓冲液的量和试纸条作用时间进行探究，从而得到最佳的工作条件。

2试验结果

2.1 RPA引物及crRNA的筛选

通过观察图1中12对引物搭配各自的crRNA进行显色反应的视觉效果来筛选出最佳预扩增引物及相应的crRNA。

结果如图1所示，引物F1-1/R1-2，F1-2/R1-2，F1-3/R1-1搭配crRNA-1以及引物F2-3/R2-1搭配crRNA-2虽侧向流动检测条的测试线出现了显色条带但多不明显，而引物F1-1/R1-1(扩增片段长度为119bp，Tm＝60℃)搭配使用crRNA-1显色效果最佳，且阴性对照成立。以此作为后续实验的常用引物及序列(表2)。并在该引物基础上设计一对不加T7启动子序列的引物用于标准质粒的构建。该结果同时证明了CRISPR-Cas13a横向流动检测方法可以通过视觉直接检测GoAstV。

表2筛选后确定的RPA引物和特异性的crRNA序列及本发明中应用的其他序列

2.2 CRISPR–Cas13a可视性检测反应条件的优化

优化后的显色反应液体系：DEPC水9.7ul，NTP buffer mix 0.8ul，T7 RNApolymerase mix 0.5ul，10×PCR std buffer 2ul，Rnase inhibitor murine 1ul，Cas13a(50uM)1ul，crRNA 2ul，LF-polyU(10uM)1ul，RPA扩增产物2ul。

优化后的最佳反应条件为：37℃反应30min。然后将20ul反应液加入80ul上样缓冲液(提前平衡至室温)，混匀后，插入试纸条，作用5分钟后读结果并拍照记录。

2.3质粒标准品的构建

利用引物RPAZL F1/R1对JMS01株cDNA进行常规PCR反应，获长度94bp的单一条带(图2)。产物经胶回收纯化后克隆、测序，结果与预期完全一致，将构建成功的阳性质粒命名为pMD-19T-RPAZL，-80℃保存备用。使用分光光度计测定质粒标准品OD值为：400ng/ul。拷贝数计算公式：拷贝数(copies/μL)＝(6.02×10²³×浓度×10^-9)/(660×碱基数)，根据公式计算pMD-19T-RPAZL标准品的拷贝数为1.30×10¹¹copies/ul。

试验例2特异性试验

1试验方法

用病毒RNA提取试剂盒提取GoAstV HLJ01株、NDV、DHV-1基因组RNA；用病毒DNA试剂盒提取GPV、DPV、EDSV和MDPV的基因组核酸。以上述病毒基因组为模板进行核酸预扩增实验并应用试验例1已经建立的显色方法进行CRISPR–Cas13a侧向流动试纸条检测，同时设置阴性对照，验证该方法的特异性。

2试验结果

分别检测GAstV和其他水禽病毒(DPV、MDPV、GPV、EDSV、NDV、DHV-1)对CRISPR–Cas13a横向流动检测的特异性进行评估。

检测结果如图3所示，仅在检测GAstV的试纸条上出现测试带的显色，检测其他病毒的试纸条均被判定为阴性，结果证明本发明建立的检测方法特异性良好。

试验例3敏感性试验

1试验方法

以10倍梯度稀释的pMD-19T-RPAZL标准品质粒(1.30×10¹¹copies/μL-1.30×10⁰copies/μL)为模板进行敏感性检测，以ddH₂O为阴性对照，以测试线无明显条带的最低浓度作为检测方法的灵敏度。

2试验结果

将标准质粒进行10倍梯度稀释用于检测该方法的灵敏度，检测结果图4，图5和图6所示，结合常规PCR检测与本实验室建立的Taqman探针法荧光定量PCR检测结果相比较发现，其灵敏度高于常规PCR(1.3×10³copies/μL)，与荧光定量PCR(1.5×10²copies/μL)效果相近，说明本发明方法敏感性较好，最低检测限可达到1.3×10²copies/μL。

试验例4临床样品检测以及现场检测方法应用

1试验方法

根据相关文献报道，可以使用加热及化学还原的方法处理临床样品，使其消除核酸酶并裂解病毒颗粒，处理后的样品可直接作为模板进行RPA反应。反应条件为使用终浓度分别为100mM和1mM的TCEP和EDTA添加到样品中，42℃，20min；64℃，5min。该方法可摆脱检测仪器及复杂操作的限制，适用于现场快速批量的检测。对该方法进行初步验证并进一步优化应用。

分别用CRISPR–Cas13a侧向流动试纸条检测方法，常规RT-PCR方法以及本发明人实验室建立的荧光定量PCR方法对从吉林部分地区发病鹅场采集的36份疑似发病雏鹅的肝脏研磨液进行检测，并比较检测结果。

2试验结果

根据相关文献报道，采集的临床样本可以直接进行SHERLOCK检测，无需提取病毒基因组，即采用HUDSON方法将TCEP和EDTA分别稀释至终浓度100mM/L和1mM/L加入至发病地区采集病料的组织研磨上清中，42℃水浴20min后64℃处理5min。从处理后的样品中各取2μL直接进行RPA反应(无需稀释或纯化)和显色反应。本发明人实验室分别以常规RT-PCR，TaqMan荧光定量PCR及CRISPR–Cas13a横向流动检测三种方法对吉林发病鹅场采集的36份疑似发病雏鹅的肝脏研磨液进行临床检测，检测结果如图7，图8和图9所示。

表3三种方法检测结果统计

根据图9和表3可看出，各样品试纸条均表现出正条带且阴性结果成立，且与荧光定量PCR检测结果吻合度达100％，证明本发明方法有效，可以通过后续进一步优化反应条件，进行大规模的现场诊断应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

<120> 鹅源星状病毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA

<130> HLJ-2001-201205A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

gaaattaata cgactcacta taggggcgga catgagtgaw ythttcacta 50

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> Abies grandis

<400> 2

gaaattaata cgactcacta taggggagaa gggcggacaa gagtttgatt aagat 55

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

gaaattaata cgactcacta tagggctttg aaaagggtgg acaaggtgac taac 54

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

rattctccct caagcctawt gagaaggtg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

aaaaacctcc tgattacgga ggaaaaatg 29

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

gaaattaata cgactcacta taggggacat gagtgawyth ttcactagca g 51

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 7

gaaattaata cgactcacta tagggctttg agaagggcgg acaagagttt gatta 55

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 8

gaaattaata cgactcacta tagggctttg aaaagggtgg acaaggtgac taaca 55

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

ctgactrtca ccgggttrat ttaagg 26

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

tcctgattac ggaggaaaaa tggtgaraag 30

<210> 11

<211> 89

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 11

gcagccgcgg ccacgccgag taggatcggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89

<210> 12

<211> 88

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 12

ccgcggccac gccgagtagg atcgagggtt ttagtcccct tcgtttttgg ggtagtctaa 60

atcccctata gtgagtcgta ttaatttc 88

Claims

1.采用CRISPR–Cas13a检测系统检测鹅源星状病毒核酸的RPA引物对，其特征在于，所述的RPA引物对选自以下12对引物对中的任何一对：

(10)由RPA F2-2和RPA R2-2组成的引物对，其中，RPA F2-2的核苷酸序列为SEQ IDNo.7所示，RPA R2-2的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；

(11)由RPA F2-3和RPA R2-1组成的引物对，其中，RPA F2-3的核苷酸序列为SEQ IDNo.8所示，RPA R2-1的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；

(12)由RPA F2-3和RPA R2-2组成的引物对，其中，RPA F2-3的核苷酸序列为SEQ IDNo.8所示，RPA R2-2的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

2.根据权利要求1所述的RPA引物对，其特征在于，所述的RPA引物是由RPA F1-1和RPAR1-1组成的引物对，其中，RPA F1-1的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，RPA R1-1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

3.采用CRISPR–Cas13a检测系统检测鹅源星状病毒核酸的CRISPR RNA，其特征在于，所述的CRISPR RNA是crRNA-1或crRNA-2中的任何一种，所述的crRNA-1的DNA模板序列为SEQID No.11所示，所述的crRNA-2的DNA模板序列为SEQ ID No.12所示。

4.根据权利要求所述的CRISPR RNA，其特征在于，所述的CRISPR RNA是crRNA-1。

5.权利要求1或2所述的RPA引物对在制备检测或诊断鹅源星状病毒核酸试剂中的用途。

6.权利要求3或4所述的CRISPR RNA对在制备检测或诊断鹅源星状病毒核酸试剂中的用途。

7.一种鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测试剂盒，包括：RPA引物对，CRISPR RNA，Cas13a蛋白，DEPC水，NTP buffer mix，T7 RNA polymerase mix，PCR std buffer，Rnaseinhibitor murine，LF-polyU和鹅源星状病质粒标准品；其特征在于，所述的RPA引物对选自以下12对引物对中的任何一对：

8.根据权利要求7所述的鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测试剂盒，其特征在于，所述的RPA引物对是由RPA F1-1和RPA R1-1组成的引物对。

9.根据权利要求7所述的鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测试剂盒，其特征在于，所述的CRISPR RNA是crRNA-1或crRNA-2中的任何一种，所述的crRNA-1的DNA模板序列为SEQ ID No.11所示，所述的crRNA-2的DNA模板序列为SEQ ID No.12所示。

10.根据权利要求9所述的鹅源星状病毒核酸CRISPR–Cas13a检测试剂盒，其特征在于，所述的CRISPR RNA是crRNA-1。