CN111088397B

CN111088397B - 一种检测h7n9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量rt-pcr方法

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Publication number: CN111088397B
Application number: CN201911303737.XA
Authority: CN
Inventors: 刘金华; 佟琪; 祖之鹏; 高卫华; 蒲娟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN111088397A

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量RT‑PCR方法。本发明提供分别针对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的高度保守区的特异性引物对，利用这些特异性引物对进行实时荧光定量RT‑PCR检测H7N9亚型流感病毒基因组中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的拷贝数，进而检测H7N9亚型流感病毒的基因组包装变异。该方法具有特异性高、灵敏度高、准确性高、检测时间较短，成本低等优势，能够对病毒滴度较低的临床样品做出准确诊断，适用于H7N9亚型禽流感病毒的临床诊断和流行病控制。

Description

一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量RT-PCR方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组、试剂盒以及利用该引物组进行实时荧光绝对定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的方法。

背景技术

H7N9亚型禽流感病毒为新型重配病毒，已有研究表明该病毒的HA基因来源于鸭群中流行的H7亚型流感病毒，NA基因来源于鸭群或者野鸟中的N9亚型流感病毒，内部基因来源于中国鸡群中流行的H9N2病毒。为了检测H7N9亚型流感病毒并研究其基因组的变异和进化情况，需要对病毒的基因片段进行定性及定量。

禽流感病毒的常规检测方法主要为鸡胚病毒分离试验和HA、HI试验。采用鸡胚进行病毒的分离培养(一般需要2～3天)，然后采用血凝抑制试验进行流感病毒亚型及分支的鉴定(一般需要1天)。HA、HI试验特异性好，但其操作过程繁琐费时。而利用常规方法，即收集有血凝性的鸡胚尿囊液提取RNA，运用流感病毒HA、NA基因的通用引物进行全长扩增并克隆测序，进行流感病毒亚型鉴定(一般需要2天)，这种检测方法费时、费力而且特异性差，不能做出快速及时而准确的诊断。因此，临床上，迫切需要一种能快速准确鉴定并定量H7N9亚型流感病毒的基因组片段、分析的方法。

实时荧光定量PCR技术是近年发展成熟的基因体外复制扩增技术，它可以使微量的DNA在数小时内以指数式增长，该方法具有灵敏度高、特异性强、简便快捷等优点。实时荧光定量PCR检测系统包含探针类方法和非探针方法，其中，非探针方法为利用荧光染料(如SYBR Green I染料)以及特异性引物来指示模板的扩增情况。由于荧光染料能够结合DNA双链，发射荧光信号，但是不能区分目的DNA和引物二聚体以及非特异性片段。因此，非探针方法的特异性完全由引物决定，因此非探针方法对于引物的要求很高，需要尽量避免引物二聚体和非特异性扩增的形成，确保引物的特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效快速检测H7N9亚型禽流感病毒以及其基因组包装变异的引物组以及利用该引物组进行实时荧光绝对定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明根据H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的保守区分别设计特异性引物，序列设计特异性引物对，通过大量优化和筛选得到能够满足非探针法荧光绝对定量RT-PCR检测要求的上述各基因片段的特异性引物对。利用这些特异性引物对进行荧光定量RT-PCR检测，不仅能够用于H7N9亚型禽流感病毒的鉴定，同时能够通过对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因拷贝数的定量实现特异灵敏的H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的检测。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组，包括用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1-16所示。

具体地，所述用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组包括如下引物：

HA基因的引物：

上游引物H7N9-HA-F(SEQ ID NO.1)：

5'-CACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTG-3'；

下游引物H7N9-HA-R(SEQ ID NO.2)：

5'-GGGATGTTTGTTCGTTCCACTGTTT-3'；

NA基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-NA-F(SEQ ID NO.3)：

5'-AAGCAGGGTCAAGATGAATCCAAAT-3；

下游引物H7N9-NA-R(SEQ ID NO.4)：

5'-CGGTTTTAGATGCAGTCCTATGTTC-3'；

PB2基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-PB2-F(SEQ ID NO.5)：

5'-ACTGTGGACCATATGGCCATAATCA-3'；

下游引物H7N9-PB2-R(SEQ ID NO.6)：

5'-TCATCTCCATTATCCTTTTGTCTGC-3'；

PB1基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-PB1-F(SEQ ID NO.7)：

5'-AGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAAC-3'；

下游引物H7N9-PB1-R(SEQ ID NO.8)：

5'-GTGAGATTCTTCAAGGAAAGCCATT-3'；

PA基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-PA-F(SEQ ID NO.9)：

5'-ACAGTGCTTCAATCCAATGATCGTC-3'；

下游引物H7N9-PA-R(SEQ ID NO.10)：

5'-AGCAGACTTCTAAGTGTGTGCATATTG-3'

NP基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-NP-F(SEQ ID NO.11)：

5'-TGGTGGGGAACGCCAGAATGCTACT-3；

下游引物H7N9-NP-R(SEQ ID NO.12)：

5'-GAATCAGCCTCCCTTCATTGTCACT-3'；

M基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-M-F(SEQ ID NO.13)：

5'-GATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTC-3'；

下游引物H7N9-M-R(SEQ ID NO.14)：

5'-TGTCATTTCCCTCTTCAGTTTCTTG-3'；

NS基因为靶基因的引物为：

上游引物H7N9-NS-F(SEQ ID NO.15)：

5'-ATGGATTCCAATACTGTGTCAAGCT-3；

下游引物H7N9-NS-R(SEQ ID NO.16)：

5'-CTGCTTCTTCCTCTCAGGGACTTCT-3'。

采用上述引物组能够特异准确地鉴定H7N9亚型禽流感病毒，同时能够对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因拷贝数的进行定量检测，并实现特异灵敏的H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的检测。

第二方面，本发明提供所述的引物组在制备用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的试剂或试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供一种用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的试剂盒，包含所述用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的引物组。

为方便检测，所述试剂盒还可包括检测所需的其它试剂，包括但不限于RNA提取试剂、反转录反应缓冲液、反转录酶、荧光定量PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、阳性标准品等。

本发明提供的如SEQ ID NO.1-16所示的引物组能够实现高效特异灵敏的H7N9亚型禽流感病毒鉴定、H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的拷贝数定量检测、H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异检测。

第四方面，本发明提供所述引物组或所述试剂盒在鉴定H7N9亚型禽流感病毒中的应用。

第五方面，本发明提供所述引物组或所述试剂盒在H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因拷贝数定量检测中的应用。

第六方面，本发明提供所述引物组或所述试剂盒在H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异检测中的应用。

第七方面，本发明提供所述引物组或所述试剂盒在H7N9亚型禽流感病毒突变株检测或进化分析中的应用。

第八方面，本发明提供一种检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的方法，其为采用包含如SEQ ID NO.1-16所示的特异性引物对的引物组或包含所述引物组的试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR检测。

具体地，所述检测H7N9亚型禽流感病毒及其基因组包装变异的方法包括如下步骤：

(1)待测样品RNA提取；

(2)RNA反转录合成cDNA；

(3)以cDNA为模板、采用包括序列如SEQ ID NO.1-16所示的特异性引物对的引物组或包含所述引物组的试剂盒进行荧光定量PCR扩增，获得HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的扩增曲线；

(4)分析荧光定量PCR的扩增曲线，若HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段均出现特异性扩增曲线，则判断待测样品为H7N9亚型禽流感病毒或待测样品中含有H7N9亚型禽流感病毒；

(5)根据标准曲线计算待测样品中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的拷贝数，根据各基因片段的拷贝数比例判断基因组包装变异。

上述步骤(1)中的RNA提取可采用本领域常规方法。对于不同类型的待测样品，根据需要可在RNA提取前对所述待测样品进行预处理。例如，组织样品可通过研磨处理；棉拭子样品先置于浸液中充分捻动，拧干后弃去拭子，离心后取上清。

作为优选，上述步骤(2)中，RNA反转录合成cDNA采用反转通用引物。

作为优选，上述步骤(3)中，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃10min；95℃15s，59℃1min，40个循环；

作为优选，上述步骤(3)中，所述荧光定量PCR扩增的20μL反应体系为：每管反应体系为，反应体系如下：2×SYBR Premix ExTaq 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，cDNA2μL，加水补足至20μL。

作为优选，上述步骤(4)中，是否出现特异性扩增曲线为通过与阳性标准品的扩增曲线对比判断。所述阳性标准品为选择含目的片段的质粒、DNA片段、cDNA中的任一种。

作为优选，上述步骤(5)中，所述标准曲线为根据不同浓度的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段标准品的Ct值制备。

作为优选，上述步骤(5)中，根据各基因片段的拷贝数比例判断基因组包装变异的判断依据为：H7N9流感病毒亚型标准株中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因拷贝数基本相同，若待测H7N9流感病毒中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因拷贝数的比例不同于标准株的比例，则判断该H7N9流感病毒的基因组包装存在变异。

本发明的有益效果在于：

本发明提供分别针对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的高度保守区的特异性引物对，利用这些特异性引物对进行实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型流感病毒，并对基因组中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的拷贝数进行定量，进而检测H7N9亚型流感病毒的基因组包装变异的存在。本发明提供的H7N9亚型流感病毒及其基因组包装变异的检测方法具有特异性高(能够特异性的区分基因组内8个基因片段)、灵敏度高(最低检出量为100copies/μL)、准确性高(与经典的病毒分离并通过流感病毒通用引物PCR扩增测序的检测方法的检测结果一致)的优势，能够对病毒滴度较低的临床样品做出准确诊断。

此外，本发明提供的方法较经典的病毒分离鉴定、普通RT-PCR方法更加快捷、检测时间较短、实验设计简单、不需要探针、成本更低、通用性更好，适合开发相应的H7N9亚型流感病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，用于H7N9亚型流感病毒的临床诊断和流行病控制，对监测H7N9亚型流感病毒的遗传演化具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例2中针对H7N9亚型禽流感病毒各基因的拷贝数和Ct值的标准曲线，其中，a为HA基因，b为NA基因，c为PB2基因，d为PB1基因，e为PA基因，f为NP基因，g为M基因，h为NS基因。

图2为本发明实施例3中H7N9亚型禽流感病毒各基因片段的检测特异性分析，其中，a为HA基因，b为NA基因，c为PB2基因，d为PB1基因，e为PA基因，f为NP基因，g为M基因，h为NS基因。

图3为本发明实施例4中H7N9亚型禽流感病毒各基因片段的检测灵敏度分析，其中，a为HA基因，b为NA基因，c为PB2基因，d为PB1基因，e为PA基因，f为NP基因，g为M基因，h为NS基因。

图4为本发明实施例5中荧光定量PCR检测H7N9亚型禽流感病毒8个基因片段的拷贝数，其中，A为HA、NA、PB2、PB1基因的扩增曲线；B为PA、NP、M、NS基因的扩增曲线；C为8个片段的拷贝数。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1特异性引物对的设计、优化和筛选

下载数据库中登记的H7N9亚型禽流感病毒的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因序列，采用MEGA6软件筛选高度保守区域，根据各基因高度保守区域分别设计多个特异性引物对，对各基因的特异性引物对进行荧光定量RT-PCR扩增，根据熔解曲线和扩增曲线筛选具有高度特异性、灵敏度的特异性引物对，根据筛选结果对特异性引物对进行人工优化，并进行下一轮筛选，如此进行筛选-优化-筛选的多个循环，直至获得能够满足荧光绝对定量RT-PCR要求、能够准确对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的拷贝数进行定量的特异性引物对。

本发明在特异性引物对的设计和优化筛选过程中发现并非只要满足普通引物设计原则或采用引物设计软件得到的引物就能够实现高效特异的非探针法荧光定量PCR检测，尤其是对于通过绝对荧光定量PCR实现H7N9亚型禽流感病毒各基因片段的拷贝数定量，仅采用引物设计软件得到的引物并不能满足其对于特异性和扩增效率的要求。

本发明通过对引物与靶序列结合的稳定性、引物对之间或引物与靶序列之间的二级结构、GC含量、Tm值、引物长度、扩增片段长度等进行了人工优化设计和筛选，最终筛选得到分别针对H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的8对性能最优的特异性引物对，其序列如表1所示。引物均委托商家合成。

表1荧光定量PCR检测所用引物

实施例2实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型流感病毒及其基因组包装变异的方法

本实施例提供一种实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型流感病毒及其基因组包装变异的方法，具体包括如下步骤：

1、待测样品预处理：对每份待测样品分别进行预处理，不同类型的待测样品的预处理方法具体如下：

(1)感染细胞样品：取病毒感染细胞上清液，置于1.5mL灭菌离心管中。

(2)感染鸡胚样品：病毒感染鸡胚尿囊液，置于1.5mL灭菌离心管中。

(3)组织样品处理：取待检病料加入病毒处理液后(加入钢珠)置组织研磨仪中研磨，把研磨好的病料移至1.5mL离心管中，4℃8000rpm离心5min，取上清200μL，置于1.5mL灭菌离心管中。

(4)棉拭子处理：将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4℃8000rpm离心5min，取上清200μL，置于1.5mL灭菌离心管中。

2、病毒RNA的提取与反转录

病毒RNA的提取按照Roche病毒RNA提取试剂盒的说明书进行，具体如下：

(1)取200μL上述步骤1制备的待测病毒液加入400μL Binding Buffer，混匀，静置10min；

(2)将步骤(1)中的混合液过柱，12000r/min离心1min；

(3)将层析柱移到另一干净的收集管中，加入500μLInhibitor Removal Buffer，12000r/min离心1min；

(4)将层析柱移到另一干净的收集管中，加入450μL Wash Buffer，12000r/min离心1min；

(5)重复操作(4)；

(6)弃去收集管中的液体，12000r/min离心1min；

(7)再将层析柱移到1.5mL离心管中，加入50μLElution Buffer，12000r/min离心1min。

反转录的66μL反应体系如下：

RNA抽提产物50μL，反转录引物Uni12 2μL，M-MLV RT 5×buffer 8μL，dNTP Mix 4μL，M-MLV Reverse Transcriptase(RT)1μL，Recombinant RNase Inhibitor(RRI)1μL。

反转录引物Uni12的序列如下：AGCAAAAGCAGG。

反转录的反应程序如下：反应体系加样完成后，瞬时离心，放于37℃反应1h，4℃保存。

3、荧光定量PCR反应

以上述步骤2中反转录得到的cDNA为模板，采用实施例1筛选得到的如SEQ IDNO.1-16所示的特异性引物进行荧光定量PCR扩增。

每管反应体系为20μL，反应体系如下：

2×SYBR Premix ExTaq 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，cDNA2μL，加双蒸水至终体积为20μL。混匀，并作好标记。

反应程序如下：95℃10min；95℃15s；59℃1min；40个循环。

反应在荧光定量PCR仪上进行，将制备好的阳性标准品(即用于构建标准曲线的阳性标准品质粒)和检测样本同时上机。

针对HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的8对特异性引物的反应程序和反应体系相同，可同时上机检测。

4、H7N9亚型禽流感病毒的鉴定

通过与荧光定量系统相连的计算机收集数据，分析扩增曲线，若待测样品中出现特异性扩增曲线，则表明样品中含有H7N9亚型禽流感病毒。

5、H7N9亚型禽流感病毒各基因拷贝数定量

根据待测样品的Ct值和标准曲线计算H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的拷贝数。

其中，标准曲线的建立过程具体如下：

(1)H7N9流感病毒标准品重组质粒的构建

利用如表1所示的8对特异性引物分别扩增H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段，切胶回收，使用全式金公司生产的T1克隆载体与8个片段目的基因分别按照说明书中提供的载体与片段摩尔比＝1：7的比例进行连接。连接产物的转化到TransT1感受肽细胞(100μL/管)(全式金公司生产)。取若干个高压灭菌洁净1.5mLEP管，每管加入500μL LBA(Amp+)培养基，挑取单个菌落，将枪头置于EP管中，37℃摇床，200r/min震荡培养直到培养基变得不透亮；对菌液进行PCR鉴定。使用Promega去内毒素质粒提取试剂盒(中提)提取阳性克隆质粒。用Nano-drop测定标准品重组质粒浓度为204.2ng/μL-506.9ng/μL。

(2)将标准品重组质粒浓度稀释至45ng/μL，进行10倍梯度稀释，取1.0×10⁸-1.0×10³copies/μL浓度梯度的标准品建立标准曲线，每个稀释度做三个重复；

参照以下公式计算拷贝数：

基因模板拷贝数＝DNA质量浓度/DNA分子量

(3)以上述制备的标准品重组质粒为模板、分别采用如表1所示的如SEQ ID NO.1-16所示的特异性引物、按照上述步骤3中的反应程序和反应体系进行荧光定量PCR扩增，得到各模板标准品的Ct值。以上述得到的Ct值为Y轴、模板标准品的浓度为X轴，制作标准曲线。

H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS各基因的标准曲线如图1所示，各基因的拷贝数与Ct值之间的线性关系结果如下：

HA的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.2059logC0+33.97，相关系数：R²＝1；

NA的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.0227logC0+33.16，相关系数：R²＝1；

PB2的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.0427logC0+34.10，相关系数：R²＝1；

PB1的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.1279logC0+33.58，相关系数：R²＝1；

PA的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.0639logC0+33.97，相关系数：R²＝1；

NP的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.0766logC0+34.04，相关系数：R²＝1；

M的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.3154logC0+36.27，相关系数：R²＝1；

NS的拷贝数与Ct值之间的线性关系：Ct＝-3.1104logC0+34.13，相关系数：R²＝1。

上述线性关系中C0为拷贝数(copies/μL)。

实施例3实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性评价

(一)分别携带HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的体外转录质粒的构建

1、H7N9流感病毒RNA提取

使用Magen公司生产的RNA提取试剂盒(RaPure Total RNA Kit)，提取A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒RNA。RNA提取操作步骤如下：

(1)使用无RNA酶的枪头吸取200μL的病毒尿囊液置于已标记的1.5mL无RNA酶EP管中，在管中加入350μL RTL Lysis Buffer，轻柔吹打混匀，再加入等体积的RNA BindingBuffer，轻柔吹打混匀；

(2)将HiPure RNA Mini Column吸附柱安装在2mL收集管中，把上述混合液体全部转入至HiPure RNAMini Column吸附柱中，以12000×g离心60s；

(3)弃去收集管内滤液，将吸附柱再次装回；向吸附柱中加入500μL Buffer RW1，以12000×g离心60s；弃去收集管内滤液，将吸附柱再次装回；

(4)向吸附柱中加入500μL Buffer RW2，以12000×g离心60s；

(5)弃去收集管内的滤液，将吸附柱再次装回，以12000×g离心2min；

(6)将吸附柱转移至无RNA酶1.5mL离心管中，再加入50μL RNase Free Water至吸附柱膜的中央洗脱RNA，在室温条件下静置2min，以12000×g离心1min；

(7)弃去吸附柱，无RNA酶离心管中的液体即为已提取出的流感病毒RNA。

2、反转录

采用试剂盒法对提取的RNA直接进行反转录(RT)，RT反应体系如下：

在冰盒中操作，依次加入上表中各成分，吹打混匀后瞬时离心。37℃水浴1h，置于4℃保存。将反转录后的流感病毒cDNA作为PCR反应的模板。

3、H7N9流感病毒基因组片段的PCR扩增及回收

将反转录后的流感病毒cDNA作为模板，分别以HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS全长基因的引物扩增目的基因，各全长基因的扩增引物如表2所示。

表2 HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS全长基因的扩增引物

PCR反应体系(50μL)如下：

依次加入以上各成分，旋涡震荡混匀后瞬时离心。

PCR反应程序如表3所示：

表3 HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS全长基因的PCR扩增反应程序

其中stage 2进行30个循环。

待PCR程序结束后，配制1％琼脂糖凝胶，经电泳鉴定PCR的条带大小正确后，再按照OMEGA公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明进行切胶回收，操作步骤如下：

(1)将PCR产物与6×DNA Loading Buffer混匀后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在电压150V，电流150mA条件下电泳30min后，在成像仪的紫外灯下，使用消毒后的手术刀片迅速切下含有目的条带的凝胶置于高压洁净的1.5mLEP管中；

(2)对凝胶的重量进行称量，按凝胶重量：Binding buffer体积＝1：1加入相应体积Binding buffer，置于56℃水浴直至凝胶完全融化，在温育过程中每隔2～3min颠倒混匀一次；

(3)将融化后的凝胶混合液转移到试剂盒自带的离心柱中，以12000×g离心30s，离心后弃掉收集管内的滤液，每次转移体积应少于750μL，直至将混合液全部滤过柱子；

(4)加入300μL Binding buffer到离心柱中，以12000×g离心1min，离心后弃掉收集管内的滤液；

(5)加入700μL Wash buffer到离心柱中，以12000×g离心1min，弃掉收集管内滤液；加入700μL Wash buffer到离心柱中，以12000×g离心1min，弃掉收集管内滤液；以12000×g空离2min，弃掉收集管内滤液；

(6)将离心柱转移到高压后洁净的1.5mL离心管中，在离心柱的膜中央处加入25-30μL Elution buffer，室温条件下静止1min，以12000×g离心1min；弃掉离心柱，在1.5mL离心管内的液体即为胶回收的目的DNA产物。

(7)取1μL胶回收DNA产物以核酸定量仪Nano Drop检测浓度，标记好浓度后置于-20℃保存。

4、H7N9流感病毒体外转录质粒的构建

(1)目的片段与载体的酶切

各基因片段所选择的酶切位点如表4所示：

表4各基因片段与pSPT19载体连接所选择的酶切位点

将回收的PCR产物与pSPT19载体分别进行双酶切，酶切体系(50μL)如下：

以上成分依次加入后，旋涡震荡混匀，瞬时离心，37℃酶切3-5h。酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段条带大小正确后，切胶回收，操作步骤同上述3中的切胶回收。

(2)目的片段与载体的连接

将酶切纯化的PCR产物和载体进行连接。

连接体系(10μL)如下：

载体与目的片段之间的质量比约为1:3～1:5，连接体系总体积不超过10ul，16℃过夜连接。

(3)连接产物的转化

①将-80℃冰箱内冻存的TransT1感受肽细胞(100μL/管)取出，置于冰上融化(约5min)；

②取出高压后洁净的1.5mLEP管，每管加入50μL大肠杆菌感受肽细胞，再加入5μL连接产物，轻弹管壁使之混匀，冰浴静置30min(同时将液体LB培养基放置于37℃水浴，打开42℃水浴)；

③42℃水浴热激45s，期间切勿摇动离心管；再迅速冰浴2min；

④每管中加入450μL预热后的LB培养基，37℃摇床培养45min(同时将LBA平板放置于37℃温箱中预热)；

⑤以3500rpm离心4min，吸掉上清300μL，取液体约100μL涂布在的LBA平板上，倒置平板；

⑥37℃温箱培养过夜至菌落大小合适之后收获平板，4℃保存(保存时间不能超过一周)。

(4)阳性重组质粒的筛选

取若干个高压灭菌洁净1.5mLEP管，每管加入500μL LBA(Amp+)培养基，挑取单个菌落，将枪头置于EP管中，37℃摇床，200r/min震荡培养直到培养基变得不透亮；对菌液进行PCR鉴定。

PCR鉴定反应体系(25μL)如下：

PCR鉴定反应程序如表5所示：

表5 H7N9流感病毒体外转录质粒阳性克隆的PCR鉴定反应程序

其中stage 2进行30个循环。

取5μL PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性菌液进行测序鉴定：取100μL鉴定为阳性克隆的菌液，送公司测序，以确保阳性克隆连接的正确性，以及避免操作过程中所产生的突变，测序引物为pSPT19载体通用引物SP6/T7。经测序鉴定无误后，将阳性菌液与50％甘油1:1混合后保存于-80℃。

(5)阳性重组质粒的提取

当所需提取质粒的总量大于10μg时，使用Promega去内毒素质粒提取试剂盒(中提)提取阳性克隆质粒，步骤如下：

①将50μL阳性菌液加入到100mL LBA(Amp+)培养基中，过夜摇菌(12～14小时)；

②将菌液倒入离心管中以5000×g离心10min后弃去上清。

③加入3mL细胞悬浮液到离心管中，使用电动移液枪吹打混匀，并用旋涡振荡器震荡，使菌液完全悬浮；加入3mL细胞裂解液到离心管中，轻柔地颠倒离心管3-5次以混匀，室温静置3-4min；加入5mL中和液到离心管中，轻柔颠倒离心管5-10次，以15000×g室温离心15min；

④提前组合好过滤装置：将蓝色清洁柱套在白色结合柱上，然后将过滤装置安装到多头抽真空装置上；将离心好的上清液倾倒于蓝色清洁柱上后，开启真空泵，待到所有液体穿过这两层柱子后，取下蓝色清洁柱；

⑤向白色结合柱中加入5mL去内毒素洗液，再开启真空泵使液体完全滤过柱子；再向白色结合柱中加入20mL柱洗液，再开启真空泵使液体滤过柱子，继续开启真空泵1-2min以干燥结合膜；

⑥将结合柱取下，将并其末端放置在吸水纸上，吸去多余的酒精液，将1.5mLEP管开盖放入到真空洗脱装置的底座上，再将结合柱插到洗脱装置上面，并将洗脱装置插到多头真空装置上；

⑦在DNA结合柱上加入500μL无RNA酶水，开启真空泵1-2min，待所有液体都滤过柱子后，取下1.5mL离心管，使用Nanodrop2000测定质粒的浓度，并做好记录。质粒分装存放于-80℃，以供后续实验使用。

经上述制备得到分别携带HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的体外转录质粒。

(二)实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性评价

分别采用实施例1筛选得到的如SEQ ID NO.1-16所示的特异性引物对H7N9亚型流感病毒的8个基因片段(HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS)进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR的反应条件和反应体系同实施例2，取上述(一)中构建的分别携带HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的体外转录质粒，并将其稀释至10⁶copies/μL，将稀释后的各质粒作为扩增模板；以水为阴性对照。在Roche公司的LightCycler 96荧光定量PCR仪上进行扩增。根据每对引物扩增得到的扩增曲线，结果如图2所示，结果表明，如SEQ ID NO.1-16所示的每对引物均能特异性扩增其相对应的基因片段，而无法扩增其它基因片段(例如，如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对仅针对携带HA基因的体外转录质粒出现特异性扩增曲线，而其他7个片段的体外转录质粒以及阴性对照均未出现扩增曲线)，表明实施例2所建立的荧光定量PCR方法具有较高的特异性。

实施例4实时荧光定量RT-PCR检测方法的敏感性评价

分别采用实施例1筛选得到的如SEQ ID NO.1-16所示的特异性引物对H7N9亚型流感病毒的8个基因片段(HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS)进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR的反应条件和反应体系同实施例2。将构建的H7N9亚型流感病毒阳性标准品质粒(即用于构建标准曲线的阳性标准品质粒)以10倍梯度稀释后作为模板(10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μL)，在Roche公司的LightCycler 96荧光定量PCR仪上进行检测。通过检测不同浓度标准品的Ct值，来判定该方法所能检测到的最小的DNA拷贝数量。

结果如图3所示，结果显示，HA基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的HA质粒模板；NA基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的NA质粒模板；PB2基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的PB2质粒模板；PB1基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的PB1质粒模板；PA基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的PA质粒模板；NP基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的NP质粒模板；M基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到10copies/μL浓度的M质粒模板；NS基因的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到100copies/μL浓度的NS质粒模板。以上结果表明本发明实施例2所建立荧光定量PCR方法的灵敏度均较高。

实施例5 H7N9亚型禽流感病毒的基因拷贝数定量检测

由于H7N9亚型禽流感病毒的野生型病毒粒子内部各基因片段理论上是以等摩尔比的形式存在的，因此我们通过检测A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒粒子内8个基因片段的拷贝数比例，判断该方法是否能够应用于H7N9病毒基因组8个基因片段的定量检测。利用本发明实施例2提供的检测方法，以如SEQ ID NO.1～16所示的特异性引物对病毒粒子中基因组RNA的反转录产物进行荧光定量检测发现，HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS这8个基因片段检测的Ct值大致相等，拷贝数近似1:1:1:1:1:1:1:1(如图4所示)，此结果与病毒粒子中真实的包装情况一致，说明该方法可以应用于H7N9病毒基因组内8个基因片段的定量检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量RT-PCR方法

<130> KHP191113233.4

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactcaaatc ctggtattcg ctctg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggatgtttg ttcgttccac tgttt 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcagggtc aagatgaatc caaat 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggttttaga tgcagtccta tgttc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actgtggacc atatggccat aatca 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcatctccat tatccttttg tctgc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaaaaagga aagtggacaa cgaac 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgagattct tcaaggaaag ccatt 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acagtgcttc aatccaatga tcgtc 25

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcagacttc taagtgtgtg catattg 27

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggtggggaa cgccagaatg ctact 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatcagcct cccttcattg tcact 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gattttaggg tttgtgttca cgctc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtcatttcc ctcttcagtt tcttg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggattcca atactgtgtc aagct 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgcttcttc ctctcaggga cttct 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aatggtacca gcaaaagcag ggg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggtgtcgaca gtagaaacaa ggg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aatggtacca gcaaaagcag ggt 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtggatcca gtagaaacaa ggg 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtttctagaa gcgaaagcag gtca 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gttaagctta gtagaaacaa ggtc 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtttctagaa gcgaaagcag gcaa 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gttgtcgaca gcgaaagcag gcaa 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtttctagaa gcgaaagcag gtac 24

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttgtcgaca gtagaaacaa ggtac 25

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aatggtacca gcaaaagcag ggta 24

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtgtcgacag tagaaacaag ggtat 25

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aatggtacca gcaaaagcag gta 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggtggatcca gtagaaacaa ggt 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aatggtacca gcaaaagcag ggt 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggtggatcca gtagaaacaa ggg 23

Claims

1.引物组在制备用于实时荧光定量RT-PCR检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的试剂中的应用，所述引物组为用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因片段的特异性引物对，所述HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的特异性引物对的序列依次如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16所示。

2.引物组在非诊断目的的H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异检测中的应用，所述引物组为用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因片段的特异性引物对，所述HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的特异性引物对的序列依次如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16所示。

3.一种非诊断目的的检测H7N9亚型禽流感病毒基因组包装变异的方法，其特征在于，采用引物组进行实时荧光定量RT-PCR检测，所述引物组为用于扩增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因片段的特异性引物对，所述HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的特异性引物对的序列依次如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）待测样品RNA提取；

（2）RNA反转录合成cDNA；

（3）以cDNA为模板、采用所述引物组进行荧光定量PCR扩增，获得HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的扩增曲线；

（4）分析荧光定量PCR的扩增曲线，若HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段均出现特异性扩增曲线，则判断待测样品为H7N9亚型禽流感病毒或待测样品中含有H7N9亚型禽流感病毒；

（5）根据标准曲线计算待测样品中HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的拷贝数，根据各基因片段的拷贝数比例判断基因组包装变异。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃10min；95℃ 15s，59℃ 1min，40个循环；

所述荧光定量PCR扩增的20μL反应体系为：每管反应体系为，反应体系如下：2×SYBRPremix ExTaq 10μL，上游引物 0.5μL，下游引物0.5μL，cDNA 2μL，加水补足至20μL。