CN109750124B

CN109750124B - 一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法

Info

Publication number: CN109750124B
Application number: CN201910207739.2A
Authority: CN
Inventors: 孙耀光; 祁雪; 姚连琦; 张亮; 席在喜
Original assignee: Shanghai Bangyao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Bangyao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109750124A

Abstract

本发明公开了一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法，涉及慢病毒检测技术领域，用于测试病毒含量与核酸残留及可复制慢病毒。该核酸组包括用于检测慢病毒VSV‑G基因的引物对，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。该核酸组可以用于检测样品中的慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。

Description

一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法

技术领域

本发明涉及慢病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral vector)较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达用于基因治疗的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达特定基因，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性表达或沉默，为基因治疗、及在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

慢病毒作为外源基因的携带者，慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。慢病毒包装系统一般都是三质粒或四质粒包装系统。CART细胞需要慢病毒载体将CAR基因转入活化的T细胞。

常见的慢病毒检测方法有两种，分别为酶联免疫吸附实验(ELISA)和qPCR检测。其中酶联免疫吸附实验在慢病毒检测中发挥了重要的作用，但是此方法也存在一定的缺陷。酶联免疫吸附实验试剂盒价格较高，并且检测范围窄，灵敏度相对较差。qPCR检测价格低，检测范围宽，灵敏度高；但是没有明确的检测方法和对应的检测引物和探针。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测慢病毒的核酸组，该核酸组可以用于检测慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。

本发明的另一目的在于提供一种快速检测慢病毒残留及可复制慢病毒的方法，该方法可以有效检测样品中的慢病毒残留及可复制慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。

本发明是这样实现的：

聚合酶链式反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)(又称：多聚酶链式反应)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

一方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒的核酸组，其包括用于检测慢病毒VSV-G基因的引物对，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸组还包括碱基序列如SEQ IDNO.3所示的荧光探针。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述荧光探针一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、CY3、Texas Red、JOE或TFAM。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述淬灭基团选自TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB、BHQ1或BHQ2。

本发明根据慢病毒上VSV-G的基因序列，设计出特异性的引物和序列，可以以含有VSV-G序列的质粒作为标准品，不仅可以检测样本中的慢病毒，还可具体检测样本中含有慢病毒基因的拷贝数。

本发明的发明人通过对引物和探针序列的合理优化配置，使其检测结果具有更好的特异性和灵敏度，实现对样品中的慢病毒及其拷贝数的有效检测。

另一方面，本发明还提供了一种检测慢病毒的方法，其包括：使用如上所述的核酸组对提取自待检样品的DNA待测样品进行PCR扩增。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR扩增的反应体系中，上游引物浓度为：10-500pmol/ml，优选范围为240-260pmol/ml，下游引物浓度为：10-500pmol/ml，优选范围为240-260pmol/ml。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的反应体系含有如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述荧光探针的浓度为：10-500pmol/ml，优选范围为380-420pmol/ml。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的反应体系还添加有0-10％的二甲基亚砜；

优选的，二甲基亚砜的浓度为：3％。

二甲基亚砜加入至反应体系中有助于提高引物对和探针的灵敏度和特异性，避免非特异性扩增对实验的影响。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的退火温度为55-65℃，优选为59℃。

本发明的核酸组可以通过实时荧光定量PCR的方法，快速准确的检测样本中慢病毒基因(VSV-G)的拷贝数，判断样本的阴阳性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例中的对不同浓度的阳性标准质粒的荧光扩增曲线结果，图中：从左往右依次是：1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的用于检测慢病毒的核酸组，其包括用于检测慢病毒VSV-G基因的引物对和荧光探针，其中，荧光探针的5’端有荧光基团FAM，3’端有淬灭基团TAMRA。所述荧光探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示。所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQID NO.2所示的下游引物。

引物对和荧光探针的碱基序列如下表1所示。

表1

采用本实施例的核酸组进行实时荧光定量PCR检测的方法如下：

(1)配制实时荧光定量PCR反应体系(以20μl为例)：

上游引物和下游引物(浓度为10μM)各0.5μl，荧光探针(浓度为10μM)0.8μl，Premix Ex Taq(probe qPCR)(2×)反应液10μl，二甲基亚砜0.6μl(体系中的浓度为3％，质量体积比：反应总体系20μl，加入二甲基亚砜的体积为0.6μl)，ROX溶液0.2μl，DNA模板10ng或者标准质粒溶液2μl，加RNase-free Water补足20μl体系(体系中，上游或下游引物终浓度为250pmol/ml，荧光探针终浓度为400pmol/ml)。配制好后，将反应液分装到八连管中。

(2)PCR反应程序：

预变性：95℃，45s；(变性：95℃，5s；退火及延伸：59℃，34s)40个循环；扩增过程中在59℃时收集荧光信号，选择收集荧光信号通道为FAM。

(3)结果判断：

如果样本的三个复孔中有两个复孔检测结果为阴性，此处阴性为复孔无扩增曲线，另外一个检测结果Ct值大于10copy样本的Ct值，亦认为此样本为阴性。

如果样本三个复孔有两个复孔检测Ct值小于或者等于10copy样本的Ct值，则认为此样本为阳性。

如果样本三个复孔的Ct值均小于10copy样本的Ct值，样本检测结果为阳性。

实验例2

灵敏度检测

(1)配制不同浓度的阳性质粒

使用微量紫外分光光度计检测含有VSV-G质粒(标准质粒)的浓度，并计算拷贝数，计算公式拷贝数(copy/μL)＝(6.02×10²³copies/mol)×(浓度g/μL)/(MW g/mol)。含有VSV-G基因的质粒MW g/mol＝3842520。使用RNase-free Water稀释质粒至1×10¹⁰copies/μL，并逐级稀释成1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL。

(2)采用实施例1的核酸组和对应的方法检测上述步骤(1)不同浓度的阳性标准质粒。结果见图1。

从图1中可以看出，采用实施例1的核酸组检测的灵敏度可以达到1×10¹copies/μL。

(3)按步骤(1)方法稀释质粒至：5×10⁹copies/μL、5×10⁸copies/μL、5×10⁷copies/μL、5×10⁶copies/μL、5×10⁵copies/μL、5×10⁴copies/μL、5×10³copies/μL、5×10²copies/μL、5×10¹copies/μL、5×10⁰copies/μL。

(4)采用实施例1的核酸组和对应的方法检测上述步骤(3)不同浓度的阳性标准质粒。结果见下表2。

表2

(5)细胞样品检测

样本DNA的提取：

取1×10⁶细胞样品1ml，向样本中加入1μl的核酸酶37℃孵育30min消化培养基中可能存在的DNA基因组或者质粒。然后1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml PBS清洗，然后离心弃上清，重复此过程两遍。向清洗后的样本中加入200μl PBS吹打混匀，然后加入20μl的蛋白酶K和RNase A混匀，孵育2min。孵育完成后加入200μl Pure Link Genomic DNALysis/Binding Buffer，震荡混匀，55℃水浴锅中孵育10min。

加入200μL 100％ethanol，震荡混匀，将上述裂解液转移到过滤柱中，10000g离心1min。弃掉收集管中的液体，向过滤柱中加入500μl的基因组清洗液1，10000g离心1min。弃掉收集管中的液体，向过滤柱中加入500μl的基因组清洗液2，10000g离心3min。弃掉收集管，换上1.5ml的EP管，向过滤柱中加入30μl的洗脱液，孵育1min，10000g离心1min，将得到的液体重新加入到过滤柱中，再次孵育和离心，得到样本DNA溶液，并用微量分光光度计检测DNA溶液的浓度。

样本DNA采用实施例1的核酸组和对应的方法检测，结果见下表3。样品1和样品2均是慢病毒转染后培养一段时间的CAR-T细胞。

表3

表中“-”代表未检测出结果。

根据实施例1的判断结果的方法，可知，样本1和样本2的结果为阴性。

实验例2

使用不同的引物探针，对比表1中的引物探针。实验中用到的引物探针如下表4。

表4

使用实施例1中的反应条件，用各个引物探针同时扩增T细胞DNA，含VSV-G基因的质粒(10copies)，293T细胞DNA，VERO细胞DNA，Jurkat细胞DNA，C8166细胞DNA。检测结果如下表5。

表5

上述实验结果表明，VSV-G基因1的引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和探针(SEQ ID NO.3)，灵敏度更高，特异性更好。

实验例3

对比加入二甲基亚砜和不加入二甲基亚砜在同样的实验条件下的扩增结果。其他实验参数与实施例1基本相同，实验结果如下表6所示：

表6：加入二甲基亚砜的实验数据

样本名称	靶基因	荧光基因	CT	拷贝数
					标准质粒	VSV-G	FAM	36.162	1.E+01
标准质粒	VSV-G	FAM	35.588	1.E+01
					标准质粒	VSV-G	FAM	35.272	1.E+01
标准质粒	VSV-G	FAM	31.697	1.E+02
					标准质粒	VSV-G	FAM	31.857	1.E+02
标准质粒	VSV-G	FAM	32.014	1.E+02
					标准质粒	VSV-G	FAM	29.006	1.E+03
标准质粒	VSV-G	FAM	28.958	1.E+03
					标准质粒	VSV-G	FAM	28.723	1.E+03
标准质粒	VSV-G	FAM	25.510	1.E+04
					标准质粒	VSV-G	FAM	25.425	1.E+04
标准质粒	VSV-G	FAM	25.333	1.E+04
					标准质粒	VSV-G	FAM	21.831	1.E+05
标准质粒	VSV-G	FAM	21.858	1.E+05
					标准质粒	VSV-G	FAM	21.721	1.E+05
标准质粒	VSV-G	FAM	18.202	1.E+06
					标准质粒	VSV-G	FAM	18.035	1.E+06
标准质粒	VSV-G	FAM	18.006	1.E+06

表7：未加入二甲亚砜的实验数据

表6和表7的实验结果表明，加入二甲基亚砜的实验数据复孔间重复性好，检测灵敏度高。

实验例4

使用实施例1中的引物探针，验证在不同退火温度下标准品的扩增情况。结果见下表8。

表8

实验结果表明：实施例1中的引物探针在退火温度为59℃时，扩增情况较好，复孔间的重复性更好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海邦耀生物科技有限公司

<120> 一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法

<130> 250

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccaagaaac ctggagcaaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgagaggat tggagcagca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acccaggaac cggtcctgct 20

Claims

1.一种用于检测慢病毒的核酸组，其特征在于，其包括用于检测慢病毒VSV-G基因的引物对，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；所述核酸组还包括碱基序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的核酸组，其特征在于，所述荧光探针一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的核酸组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、CY3、Texas Red或JOE。

4.根据权利要求3所述的核酸组，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB、BHQ1或BHQ2。

5.一种检测慢病毒的方法，所述方法不以疾病诊断为目的，其特征在于，其包括：使用权利要求1-4任一项所述的核酸组对提取自待检样品的DNA待测样品进行PCR扩增。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在PCR扩增的反应体系中，上游引物浓度为：10-500pmol/ml，下游引物浓度为：10-500pmol/ml。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在PCR扩增的反应体系中，上游引物浓度为：240-260pmol/ml，下游引物浓度为：240-260pmol/ml。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系含有如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述荧光探针的浓度为：10-500pmol/ml。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光探针的浓度为：380-420pmol/ml。

10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系还添加有0-10％的二甲基亚砜。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，二甲基亚砜的浓度为3％。

12.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为55-65℃。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为59℃。