CN110819629A

CN110819629A - 检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法

Info

Publication number: CN110819629A
Application number: CN201911351814.9A
Authority: CN
Inventors: 金宁一; 田明尧; 鲁会军; 李昌; 李霄; 李乐天; 刘云霞; 李成辉; 曹亮; 李凯; 于潼
Original assignee: Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Current assignee: Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及用于鉴别蓝舌病毒8型及蓝舌病毒16型的引物组合。所述引物组合包括特异性扩增蓝舌病毒8型VP2基因的引物对以及特异性扩增蓝舌病毒16型VP2基因的引物对。两对PCR引物可在同一PCR扩增体系及反应条件下，同时进行扩增，实现双重检测，经引物及酶优化后可在短时间内完成分子生物学上蓝舌8型及蓝舌16型的快速鉴定，具有快速简便、特异性及灵敏度高、重复性好等优点，对新发蓝舌8型疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

Description

检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue,BT)由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的家养或野生反刍动物的一种典型的非接触性病毒性传染病。蓝舌病于19世纪后期首先在南非发生，1905年被正式报道。其主要感染山羊、绵羊、牛等反刍类动物，感染动物的平均病死率为30％，其中绵羊的病死率可高达80％。引起重大经济损失，被卫生组织(OIE)列入A类动物流行病之一，我国已将其规定为一类动物传染病

蓝舌病毒属呼肠孤病毒科、环状病毒属，是一种虫媒病毒，主要由库蠓传播。BTV的基因组由10个双链RNA分子组成，全长约19200bp，编码7个结构蛋白(VP1-VP7)和5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。迄今为止发现的流行BTV可分为27个血清型，且型与型之间无交叉保护作用。

我国已检测出的血清型有BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-24等。其中BTV-1和BTV-16为我国主要的致病性血清型。2006年8月，BTV-8在荷兰首次流行，之后在欧洲大规模流行，该病在全球有扩大暴发的趋势。张怡轩在采集的广西牛羊血清样本检测中，首次报道了我国BTV-8血清型。血清型种类多、变异快，为有效控制其流行，早期诊断就显得尤为重要。目前已有的诊断方法包括病毒分离鉴定、血清学检测方法及分子生物学检测方法等。病毒分离需要很长时间才能得到结果。直接分离细胞培养敏感性差，它可能无法识别弱阳性样本。血清学检测缺点是灵敏性和特异性稍差，与环状病毒其他相关病毒如流行性出血病病毒(EHDV)等存在交叉反应。

VP2是主要的型特异性抗原，大多数能够诱导产生中和抗体的抗原表位都存在于VP2蛋白上，决定着BTV的血清型。VP2蛋白高度变异，其氨基酸序列在不同血清型毒株间的差异在22.7％(BTV-4与BTV-20)至72.9％(BTV-6与BTV-22)之间。研究表明，不同地域分离的同一血清型毒株核酸序列差异可高达30％，对分离BTV毒株L2序列的分析不仅可确定BTV血清型，还可掌握同一血清型BTV毒株L2的变异情况，为建立BTV血清型特异性核酸检测法提供依据。

新的血清型的出现会使未免疫的易感动物感染而发病，甚至死亡，造成严重的经济损失，因此使用适宜的诊断方法对BTV进行检测至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法。该引物组合及试剂盒具有快速简便、特异性及灵敏度高、重复性好等优点，对新发蓝舌8型疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物组合，包括如下组合中的一种或两者以上：

组合一：

(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和

(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和

(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

(4)、与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；

组合二：

(5)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和

(6)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和

(7)、如(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

(8)、与(5)、(6)或(7)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合在制备病毒检测的试剂和/或试剂盒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为蓝舌病病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蓝舌病病毒为蓝舌病病毒8型或蓝舌病病毒16型中的一种或两种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒检测的扩增体系为：模板0.5μL，FastPfu Fly Buffer 5μL，10μM本发明所述的引物组合中的引物F/R各0.25μL，

FastPfu Fly DNA Polymerase 0.5μL，2.5mM dNTPs 4μL，加ddH₂O至25μL。

在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒检测的扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性20s，(61℃起第6个循环开始每个循环降低0.2℃)复性30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸5min。

在上述研究的基础上，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括如权利要求1或2所述的引物组合以及常用的助剂。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

在本发明的一些具体实施方案中，病毒检测的试剂盒中，所述病毒为蓝舌病病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，病毒检测的试剂盒中，所述蓝舌病病毒为蓝舌病病毒8型或蓝舌病病毒16型中的一种或两种。

本发明设计了两对PCR引物分别特异性扩增BTV8和BTV16蓝舌病毒VP2基因，两对PCR引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现双重检测，经优化后可在短时内完成BTV8和BTV16蓝舌病毒VP2基因的快速分子鉴定，具有快速简便、特异性及灵敏度高等优点，对新发BTV8血清型蓝舌病毒突发疫情的早期检测、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例2中利用引物组合I检测BTV8血清型蓝舌病毒的特异性分析结果；其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为BTV8病毒pGH-BTV8-VP2质粒样品，泳道3为蚊虫传播病毒寨卡质粒样品，泳道4为蚊虫传播病毒病毒cDNA样品，泳道5为不加模板的空白对照；

图2示本发明实施例2中利用引物组合Ⅱ检测BTV16血清型蓝舌病毒的特异性分析结果；其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为BTV16病毒pEASY-BTV16-VP2质粒样品，泳道3为蚊虫传播病毒寨卡质粒样品，泳道4为蚊虫传播病毒cDNA样品，泳道5为不加模板的空白对照；

图3示本发明实施例3中利用引物组合检测BTV8血清型蓝舌病毒及BTV16血清型蓝舌病毒的灵敏度分析结果；其中，永道1为DNA Marker，泳道2～9分别为样品pGH-BTV8-VP2质粒和pEASY-BTV16-VP2质粒梯度稀释的PCR扩增产物，泳道10为以稀释10⁹为模板的PCR扩增产物。

具体实施方式

本发明公开了一种检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明设计了一种用于检测蓝舌8型及蓝舌16型病毒的引物组合，所述引物组合包括特异性扩增BTV8-VP2基因的引物对以及特异性扩增BTV16-VP2基因的引物对。

BTV8引物对I：扩增产物536bp

BTV8-VP2-F：5’-GCGATTATATACAAACCAGTC-3’(如SEQ ID No.1所示)；

BTV8-VP2-R：5’-TGTACCAACCCTTCTTTCAAC-3’；(如SEQ ID No.2所示)；

BTV16引物对Ⅱ：扩增产物351bp

BTV16-VP2-F：5’-ATACCAGTCATAACTCGTC-3’(如SEQ ID No.3所示)；

BTV16-VP2-R：5’-CATCGAATCTCCTATCATCC-3’(如SEQ ID No.4所示)。

本发明还提供利用上述引物组合鉴定BTV8和BTV16蓝舌病毒的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供利用上述引物组合或检测试剂盒鉴定BTV8和BTV16蓝舌病毒VP2基因的方法，该方法为：以合成的pGH-BTV8-VP2质粒及构建的pEASY-BTV16-VP2为标准模板，采用上述引物组合对BTV8和BTV16病毒VP2基因进行PCR扩增(可在同一PCR反应管内进行，实现双重检测)，同时设立对照组，然后采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当标准质粒扩增产物出现上述预期大小特异性扩增条带，而对照组无条带时判断为建立BTV8和BTV16病毒双重PCR检测方法。

PCR扩增体系：模板0.5μL，FastPfu Fly Buffer 5μL，10μM引物F/R各0.25μL，

FastPfu Fly DNA Polymerase 0.5μL，2.5mM dNTPs 4μL，加ddH₂O至25μL。

PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性20s，(61℃起第6个循环开始每个循环降低0.2℃)复性30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸5min。

本发明设计了两对PCR引物分别特异性扩增BTV8和BTV16蓝舌病毒VP2基因，两对PCR引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现双重检测，经优化后可在短时内完成BTV8和BTV16蓝舌病毒VP2基因的快速分子鉴定，具有快速简便、特异性及灵敏度高、低成本、重复性好等优点，对新发BTV8血清型蓝舌病毒突发疫情的早期检测、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

本发明提供的检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1用于检测BTV8及BTV16血清型蓝舌病毒的引物的合成

根据Genbank下载BTV8及BTV16血清型蓝舌病毒VP2全基因，分别经MEGA比对BTV8和BTV16血清型蓝舌病毒VP2基因序列的结果，选取保守区序列，用PrimerPremier软件设计用于特异性扩增BTV8及BTV16血清型蓝舌VP2基因的引物，并将设计的引物与NCBI里核酸数据进行比对，利用Primer Premier进行引物设计时综合条件最优，进行BLAST时无其他蚊虫或症状相关的序列配对情况。

特异性扩增BTV8血清型蓝舌病毒VP2基因的PCR引物BTV8-VP2-F和BTV8-VP2-R，其碱基序列为：

BTV8-VP2-F：5’-GCGATTATATACAAACCAGTC-3’(如SEQ ID No.1所示)；

BTV8-VP2-R：5’-TGTACCAACCCTTCTTTCAAC-3’；(如SEQ ID No.2所示)；

特异性扩增BTV16血清型蓝舌病毒VP2基因的PCR引物BTV16-VP2-F和BTV16-VP2-R，其碱基序列为：

BTV16-VP2-F：5’-ATACCAGTCATAACTCGTC-3’(如SEQ ID No.3所示)；

BTV16-VP2-R：5’-CATCGAATCTCCTATCATCC-3’(如SEQ ID No.4所示)。

引物合成由吉林库美生物公司完成。

实施例2利用引物组合检测BTV8血清型蓝舌病毒和BTV16血清型蓝舌病毒的特异性分析

1样品来源

本实施例中采用的BTV8血清型质粒由江苏捷瑞公司合成、BTV16血清型质粒、寨卡质粒由本实验室构建，蚊虫cDNA由本实验室提取。

2质粒的构建及验证

BTV8质粒验证：根据Genbank登录号(AJ585184.1)合成1581bp的BTV8型VP2基因(如SEQ ID No.7所示)，将合成后的pGH-BTV8-VP2质粒穿刺菌复苏，用含A⁺抗性的无菌LB培养液，37℃，220rpm震荡培养13h，按照AxyPrep DNA小量提取试剂盒操作(购自美国AXYGEN公司)，提取质粒经KpenⅠ和XhoⅠ双酶切验证，将验证正确的质粒测浓度。

pEASY-BTV16-VP2质粒构建：设计引物对Ⅲ：

BTV16-F：5’-GGTACCATGGAGGAGCTAGTTATAC-3’(如SEQ ID No.5所示)

BTV16-R：5’-CTCGAGTTATGGTGGAAATATAACTTG-3’(如SEQ ID No.6所示)。

特异性扩增BTV16血清型VP2基因，按照胶回收试剂盒操作，回收目的片段，并连接至

Zero Cloning Kit载体上，将连接产物转化至Trans1-T1感受态，涂板(A⁺)、挑取单菌落于7mL含A⁺抗性的无菌LB培养液，37℃，220rpm震荡培养，13h-15h。参照AxyPrep DNA小量提取试剂盒操作(美国AXYGEN公司)，提取质粒经KpenⅠ和XhoⅠ双酶切验证，将验证正确的质粒测浓度。

3PCR反应

采用实施例1中合成的引物组合(I：BTV8-VP2-F/R，Ⅱ：BTV16-VP2-F/R)分别对上述获得的模板VP2基因进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系(20μL体系)：模板0.5μL，FastPfu Fly Buffer 4μL，10μM引物F/R各0.5μL，

FastPfuFly DNA Polymerase 0.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，加ddH₂O至20μL。

4PCR产物电泳检测

取4μL上述PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，电泳结果见图1、2，图1中从左至右，泳道1为DNA Marker，泳道2为BTV8病毒pGH-BTV8-VP2质粒样品，泳道3为蚊虫传播病毒寨卡质粒样品，泳道4为蚊虫传播病毒cDNA样品，泳道5为不加模板的空白对照。图2中从左到右，泳道1为DNA Marker，泳道2为BTV16病毒pEASY-BTV16-VP2质粒样品，泳道3为蚊虫传播病毒寨卡质粒样品，泳道4为蚊虫传播病毒病毒cDNA样品，泳道5为不加模板的空白对照。结果显示：图1中泳道2出现特异性条带，大小为536bp，其余泳道未见条带。图1中泳道2出现特异性条带，大小为351bp，其余对照泳道没有出现条带；鉴定结果表明本发明的引物组合可特异地检测出BTV8血清型和BTV16血清型蓝舌病毒。

实施例3利用引物组合检测BTV8和BTV16血清型蓝舌病毒的灵敏度分析

1样品浓度

在生物安全柜中对样品pGH-BTV8-VP2质粒(5.2×10¹⁰copies/μL)和pEASY-BTV16-VP2质粒(2.20×10⁹copies/μL)进行10倍梯度分别稀释，以稀释后的质粒作为模板备用。

2引物组合灵敏度检测

采用实施例1中合成的引物组合(I：BTV8-VP2-F/R，Ⅱ：BTV16-VP2-F/R)分别对稀释样品质粒中的VP2基因进行PCR扩增。PCR扩增体系25μL：模板0.5μL，FastPfu FlyBuffer 5μL，10μM引物F/R各0.25μL，

FastPfu Fly DNAPolymerase 0.5μL，2.5mM dNTPs 4μL，加ddH2O至25μL。

3结果

对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果如图3所示，图中从左至右，泳道1为DNA Marker，泳道2-9分别为样品pGH-BTV8-VP2质粒和pEASY-BTV16-VP2质粒梯度稀释的PCR扩增产物，泳道10为以稀释10⁹为模板的PCR扩增产物。结果显示第2-9泳道出现两条特异性扩增条带，大小分别为536bp(I：BTV8-VP2-F/R)和351bp(Ⅱ：BTV16-VP2-F/R)。利用本发明提供的引物组合可同时检测出BTV8和BTV16血清型的最低检测浓度分别为520copies/μL和220copies/μL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 申请人

<120> 检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgattatat acaaaccagt c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtaccaacc cttctttcaa c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataccagtca taactcgtc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catcgaatct cctatcatcc 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaccatgg aggagctagt tatac 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgagttat ggtggaaata taacttg 27

<210> 7

<211> 1581

<212> DNA

<213> BTV8型VP2基因(BTV8 VP2 gene)

<400> 7

ggtaccatgg aggagcttgc gattccgatt tatacaaatg tattcccagc ggaactttta 60

gatggatatg attacatcat tgacgttagt agtcgtgttg aagaggaagg tgatgagccc 120

gttaagcgac acgatgtgac agaaattcct agaaattcga tgttcgatat taaggatgaa 180

catatacgtg atgcgattat atacaaacca gtcaacaatg atgggtacgt actaccgaga 240

gtattagata tcacgctgaa agcctttgat gaccggaaaa gggttgtttt gaatgatggt 300

catagcgaat ttcacacgaa aacaaattgg gttcagtgga tgattgatga cgcaatggat 360

gtccagcctc ttaaggtaga tatcgcacac acgcgctcaa ggattagcca cgcgctcttc 420

aattgtacgg tgcgattgca ttcaaaaaag gctgacaccg catcttatca tgttgaacca 480

gttgaaattg aatcgcgggg gtgtaaccac acatggttga gtaggattca tcatctagtg 540

aatgttgaat tatttcattg ttcacaagag gcggcgtata cattaaagcc cacatataag 600

ataatatcaa atgcggaacg tgcatcaacg agtgattctt ttaatggaac tatgattgaa 660

ttaggtcgta atcatcaaat tcagatgggt gaccagggat accagaagtt gaaagaaggg 720

ttggtacaag ttcgaattga agggaagacg cctttggcga tacaagagga aataaccgct 780

ttgaataaaa taagagaaca atggatcgct cgaaatttcg atcaaaggga aatcaaggtt 840

ttagatctgt gtaggttgtt gtctacgata ggtaggaaaa tgtgcaatac tgaagaggaa 900

cctaagaatg aagctgatct ttcagtgaaa ttccaaatgg agcttgacga aatatttcga 960

ccaggaaaca acgagcgtac caacatcatg gggggcggag tgcatcggaa aaacgaggac 1020

agattttacg tactgattat gattgctgca tccgatacca acaaaggtcg tatatggtgg 1080

agcaatccgt atccctgcct acgtggagcg ttaatcgccg ctgaagttca attaggtgat 1140

gtttacaacc ttttaaggaa ttggttccaa tggagcgtac gacccactta tgtaccttac 1200

gataggaata gagaaagtga taagtatatc tatagtagaa tcaatttatt tgattcaacc 1260

ttgaggccag gcgacaaaat agtacactgg gaatataagt tacttaatga agtacgagag 1320

gttagcatca acaaaggtaa tgagtgcgat ctgttccctg aggatgaaga atttaccacc 1380

aagtttcatg aggcgcggta tacggagatg aagaatcaaa ttatccaaag cgggtggaat 1440

caacgagatt ttaaaatgca taaaatacta gaagatggcg caaatgtgtt aacgatcgat 1500

tttgagaagg acgcgcacat cggcacaggc tcagctctaa gtttgccgga ttactataac 1560

aaatggataa tttaactcga g 1581

Claims

1.引物组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：

组合一：

(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和

(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和

组合二：

(5)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和

(6)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

3.如权利要求1或2所述的引物组合在制备病毒检测的试剂和/或试剂盒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为蓝舌病病毒。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蓝舌病病毒为蓝舌病病毒8型或蓝舌病病毒16型中的一种或两种。

6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒检测的扩增体系为：模板0.5μL，

FastPfu Fly Buffer 5μL，10μM如权利要求1或2所述的引物组合中的引物F/R各0.25μL，FastPfu Fly DNA Polymerase 0.5μL，2.5mM dNTPs 4μL，加ddH₂O至25μL。

7.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒检测的扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性20s，(61℃起第6个循环开始每个循环降低0.2℃)复性30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸5min。

8.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合以及常用的助剂。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为蓝舌病病毒。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述蓝舌病病毒为蓝舌病病毒8型或蓝舌病病毒16型中的一种或两种。