CN107988340B - 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用 - Google Patents

一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学领域。所述PCR扩增引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒。该试剂盒提供的PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出绵羊肺炎支原体，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，适合基层使用，可作为绵羊肺炎支原体实验室快速鉴别和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

Description

一种快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物及其应用
技术领域
本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体说是涉及一种快速、简便、低成本检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物及其应用。
背景技术
绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）是引起羊呼吸道疾病的重要病原之一，可导致山羊、绵羊及野生小反刍动物的非典型性肺炎。患羊临床上主要表现为咳嗽、流鼻汁、消瘦、贫血、生长发育迟缓，病程可达数月至数年，致使出栏率、毛质、毛量下降，并造成饲料和人力的大量浪费。同时，羊感染绵羊肺炎支原体后，对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌以及副流感病毒等病原的易感性增加。目前，该病原体在全球范围内均有分布，在中国的分布流行同样十分广泛，造成巨大的经济损失，成为威胁羊养殖业的重要病原之一。
绵羊肺炎支原体为无细胞壁微生物，人工培养较困难，加之分离培养方法繁琐耗时。血清学诊断方法是检测支原体感染通常使用的方法，然而种间的交叉反应、非特异性反应的存在，极大阻碍了血清学方法的应用。此外，鉴定支原体分离株需要对应的特异的高免血清，而这些血清是不易得到的，采用病原分离鉴定的方法和血清学鉴定的方法进行绵羊肺炎支原体检测鉴别难度非常大。因此，建立一种可以快速、准确检测和鉴定绵羊肺炎支原体的方法，在实验室检测和大规模流行病学调查方面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种低成本、快速、准确地检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：其步骤包括样品采集，病原基因组DNA的提取，特异性引物的设计和优化，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物和结果判定。
一种快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物是依据绵羊肺炎支原体的膜蛋白编码基因进行设计，扩增的目的片段大小为500 bp，引物的序列分别为：
Forward primer：5ˊ-CGGAGCCATAAAGTTGTAAT-3ˊ SEQ ID NO:1
Reverse primer：5ˊ-CGAAACTCCCGTGGATGCTA-3ˊ SEQ ID NO:2
使用前将引物浓度稀释至25 pmol。
优选的，将所述的PCR 扩增引物在制备检测绵羊肺炎支原体试剂盒的应用。
本发明还提供一种快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，包括具有SEQ IDNO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，PCR扩增试剂盒的反应模板是使用DNA/RNA提取试剂盒（CW0590S，北京康为世纪生物科技有限公司）提取细胞培养物或组织样品的病原基因组DNA。
优选的，利用快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒建立PCR扩增方法，其反应体系建立以25 μL计，
PCR 预混液 12.5 μL
Forward primer（25 pmol/L） 1μL
Reverse primer（25 pmol/L） 1μL
DNA模板 3 μL
RNase-Free water 补足25 μL。
优选的所述的PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95℃ 5 min；随后进行35个95℃45 s，49℃ 45 s，72℃ 45 s的循环；最后72℃延伸7 min。
以上所述的一种快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，即阳性对照扩增出500 bp的单一条带，而阴性对照没有任何条带，如果从样品中扩增出了500 bp的特异性条带，则说明该样品存在绵羊肺炎支原体；如果样品没有扩增出500 bp的特异性条带，则说明该样品不含有绵羊肺炎支原体。
本发明还提供了绵羊肺炎支原体的PCR 扩增引物在制备检测绵羊肺炎支原体的试剂中的应用。
本发明还提供了一种检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
（1）PCR预混液：包含PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA
（2）RNase-Free water（灭菌双蒸水）
（3）PCR扩增引物： Forward primer和Reverse primer
（4）阳性对照：含有绵羊肺炎支原体特异性核算片段的重组质粒。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物能够特异性扩增出绵羊肺炎支原体的特异性核酸片段，所检测的阴性对照病原菌（丝状支原体山羊亚种、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌）和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高，检测结果准确
当样品的绵羊肺炎支原体含量较低时，或者样品在保存运输不当时导致支原体失活，会出现分离不到绵羊肺炎支原体的情况，因而做出该样品不存在绵羊肺炎支原体的误判。
本发明的绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物灵敏度高，最小检测限为2.12×10-3 ng/μL。即使样品中绵羊肺炎支原体含量低或已经失活，使用本发明的绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定。
3）耗时少、成本低廉
体外培养支原体难度很大，分离率低，接种之后培养72-96小时还要明显的生长。与通过病原分离鉴定来检测相比，使用本发明的绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物进行扩增，在时间成本、工作量等方面具有显著的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
4）准确性高、稳定性好
用2.12x101 ng/μL、2.12x100 ng/μL、2.12x10-1 ng/μL、2.12x10-2 ng/μL和2.12x10-3 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致，表明建立的PCR检测方法的反应体系重复性好。
附图说明
图1是最佳退火温度筛选试验结果，结果显示，，其中M：DNA marker 100 bpladder 、1：45℃、2：47℃、3：49℃、4：51℃、5：53℃、6：55℃、7：57℃、8：水对照。
图2特异性检测结果：其中M：DNA marker 100bp ladder、1：绵羊肺炎支原体、2：丝状支原体山羊亚种、3：隐秘杆菌、4：溶血性曼氏杆菌、5：巴氏杆菌、6：水对照。
图3是本发明敏感性检测结果：，其中M：DNA marker 100bp ladder、1：2.12×101ng/μL、2：2.12×100 ng/μL、3：2.12×10-1 ng/μL、4：2.12×10-2 ng/μL、5：2.12×10-3 ng/μL、6：2.12×10-4 ng/μL、7：水对照。。
图4是临床样品检测电泳图：其中M：DNA marker 100bp ladder、泳道P：阳性对照、N：阴性对照泳道；泳道1、5、7、8、11、12、13、18、20为阳性结果；泳道2、3、4、6、9、10、14、15、16、17、19为阴性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、材料的准备
绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌为广西兽医研究所分离鉴定保存，组织样品来自兽医临床。10×PCR Buffer、dNTPs、ES-TaqDNA聚合酶、细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。
2 、PCR引物的设计与合成
根据GenBank 中的绵羊肺炎支原体膜蛋白编码基因序列进行同源性比较分析，选择保守序列区作为扩增区域，设计特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：
Forward primer：5ˊ-CGGAGCCATAAAGTTGTAAT-3ˊ
Reverse primer：5ˊ-CGAAACTCCCGTGGATGCTA-3ˊ
扩增的目的基因片段大小为500 bp，
上、下游引物使用前稀释到25 pmol/L。
3、模板DNA的提取
样品处理：
使用培养基培养的支原体及阴性对照细菌：取适量至于灭菌离心管中，若为液体培养物，则离心后去上清，取沉淀。
组织样品：首先进行研磨，反复冻融，离心后取上清。
再使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。
4、PCR反应体系建立
利用检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物建立PCR方法，其反应体系建立以25μL计：
PCR 预混液 12.5 μL
Forward primer（25 pmol/L） 1μL
Reverse primer（25 pmol/L） 1μL
DNA模板 3 μL
RNase-Free water 补足25 μL。
5、PCR反应程序
所述的快速检测绵羊肺炎支原体的PCR方法的反应程序，首选进行最佳退火温度确定试验，确定退火温度后，使用的PCR反应程序为95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 45 s，退火温度45 s，72℃ 45 s的循环；最后72℃延伸7 min。
6、结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，即阳性对照扩增出500 bp的单一条带，而阴性对照没有任何条带，如果从样品中扩增出了500 bp的特异性条带，则说明该样品存在绵羊肺炎支原体；如果样品没有扩增出500 bp的特异性条带，则说明该样品不含有绵羊肺炎支原体。
7、绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物在PCR扩增试剂中的应用
7.1 标准样品制备
将绵羊肺炎支原体的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，作为标准样品，-70℃保存备用。
7.2 特异性检测
以提取的试验菌株和对照菌株的基因组DNA进行PCR扩增，检验PCR扩增引物的特异性。
7.3 敏感性检测
测定阳性重组质粒的起始浓度后，以2.12×10 ng/μL作用起始浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测。
7.4 重复性检测
用2.12×10 ng/μL、2.12×100 ng/μL、2.12×10-1 ng/μL、2.12×10-2 ng/μL和2.12×10-3 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测，检验本发明检测方法的准确性和稳定性。
7.5临床样品检测
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组DNA，使用建立的PCR方法进行扩增。
实施例1绵羊肺炎支原体PCR扩增引物的最佳退火温度试验
以超纯水作为对照，分别对退火温度45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃进行PCR扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度的包容性大，在退火温度为45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带（图1）。为此，本PCR方法使用的反应程序为：95℃ 5 min；随后进行35个95℃45 s，49℃45 s，72℃ 45 s的循环；最后72℃ 7 min延伸。
实施例2绵羊肺炎支原体PCR扩增引物的特异性检测结果
提取绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌的基因组DNA，使用优化好的反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明检测方法的特异性，结果显示，只有绵羊肺炎支原体样品扩增出了目的片段条带，为阳性结果，4株对照菌株反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果（图2），表明本方法具有很好的特异性。
实施例3绵羊肺炎支原体PCR扩增引物的敏感性检测结果
阳性重组质粒的起始浓度为2.12×10 ng/μL，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测，结果显示，建立的PCR检测方法最低检测限为2.12×10-3 ng/μL（图3）。
实施例4 绵羊肺炎支原体PCR方法的准确性和稳定性检测结果
用2.12×101 ng/μL、2.12×100 ng/μL、2.12×10-1 ng/μL、2.12×10-2 ng/μL和2.12×10-3 ng/μL的标准样品同时进行PCR扩增，分别重复3次检测。结果显示，重复结果良好，表明建立的PCR检测方法重复性好、稳定性高。
实施例5 绵羊肺炎支原体PCR扩增引物在临床样品检测中的应用
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组DNA，分别PCR扩增。图4展示了20份样品的检测结果，结果显示，有9份样品检测出绵羊肺炎支原体的特异性条带，为阳性结果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种快速检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物及其应用
<130> 2017
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<220>
<221> misc_feature
<223> 对人工序列的描述：上游引物Forward primer
<400> 1
cggagccata aagttgtaat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<220>
<221> misc_feature
<223> 对人工序列的描述：下游引物Reverse primer
<400> 2
cgaaactccc gtggatgcta 20

Claims (4)

1.一种检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，其特征在于，包含检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增引物，所述PCR扩增引物由SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和SEQ IDNO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；
还包括PCR 预混液、DNA模板和RNase-Free water。
2.根据权利要求1所述检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述的PCR预混液包含PCR Buffer、dNTPs和ES-Taq DNA。
3.根据权利要求1所述检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25 pmol。
4.根据权利要求1所述检测绵羊肺炎支原体的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 45 s，49℃ 45 s，72℃ 45 s的循环；最后72℃延伸7 min。
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Application publication date: 20180504

Assignee: Tianhe Xinpei Technology Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI VETERINARY Research Institute

Contract record no.: X2023980045488

Denomination of invention: A PCR amplification primer for rapid detection of Mycoplasma ovipneumoniae and its application

Granted publication date: 20210514

License type: Common License

Record date: 20231101

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