CN105859845A - 绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用 - Google Patents

绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5及其制备方法和应用，通过MO基因组的提取、表达文库的构建、筛选，MO多表位融合抗原基因的构建和在大肠杆菌中的表达，得到具有良好免疫原性的抗原蛋白，即本发明的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5，为进一步研制开发安全、高效的绵羊支原体肺炎多表位蛋白疫苗奠定基础。

Description

绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用，属生物技术领域。
背景技术
近年来，在我国新疆、甘肃、内蒙古、青海、陕西、宁夏、辽宁、江苏、四川、云南等多个养羊业发达的省区均有绵羊支原体肺炎的发生和流行的报道，该病严重影响着养羊业的健康发展，危害日趋加重，给当地养羊业造成巨大的经济损失。
绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属的一种。
MO是一种缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器的最小原核细胞型微生物。MO基因组比多数微生物小，为环状双股DNA，大小约为1200kb。G+C含量在25～35％之间。
由于其基因组较小，生物合成及代谢能力有限，细胞需要的很多营养物质需要从外界摄取，因此对培养基的要求较高。
疫苗接种是预防MO感染的重要手段之一。目前，绵羊肺炎支原体疫苗的研制基础还比较薄弱，尚未取得突破。国内虽然有利用MO SC02地方分离株制备灭活疫苗的报道，但由于MO存在遗传多样性和抗原异质性，加上MO菌株培养条件要求高，菌体抗原含量不足，导致菌体灭活疫苗成本较高，免疫效果不理想。因此，有必要开展绵羊支原体肺炎新型疫苗的研制，为该病的科学防治提供物质基础。
寻找具有良好免疫原性的MO抗原蛋白是研发MO新型疫苗的关键。由于MO的抗原结构比较复杂，国内外至今尚未筛选和鉴定出具有良好免疫保护的抗原，严重制约着绵羊支原体肺炎新型疫苗的研发。
因此，一种为绵羊支原体肺炎多表位蛋白疫苗的研发奠定良好的前期基础的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用就应运而生。
发明内容
本发明的目的是提供一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用，通过构建MO基因组表达文库，采用抗MO阳性血清对构建的MO基因组表达文库进行筛选，获得具有免疫原性的抗原基因，然后通过生物信息学对筛选出的抗原基因所编码氨基酸的优势抗原表位进行分析，并进行试验验证；通过采用柔性氨基 酸对优势抗原表位进行串联，构建MO多表位融合抗原基因并进行原核表达，将表达的重组蛋白进行纯化，进一步分析其免疫原性，为MO多表位蛋白疫苗研究奠定基础。
本发明的主要过程如下：
1.MO基因组的提取。
2.MO基因组表达文库的构建。
3.MO基因组表达文库的鉴定。
4.MO抗原基因的免疫学筛选。
5.MO抗原蛋白线性优势抗原表位的预测分析。
6.MO线性优势抗原表位的鉴定。
7.MO-多表位融合抗原基因的构建方法。
8.MO多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达。
9.MO多表位融合抗原的免疫原性分析。
其要点在于通过构建绵羊肺炎支原体基因组表的文库，筛选具有免疫原性的抗原基因，利用生物信息学手段分析抗原基因编码蛋白的B细胞抗原表位，将抗原表位按照一定顺序串联，构建含有多表位融合抗原基因MO-meAg5，并在大肠杆菌中表达，得到具有亚疫苗研究价值的强免疫原性抗原蛋白MO-meAg5，为绵羊肺炎支原体的亚单位疫苗研究奠定基础。
其具体过程如下：
1.MO基因组的提取
将纯化后的菌株转接于(30～50ml)培养基中，于36～38℃、浓度为4～6％的CO2培养箱中培养5～9天，当生长滴度达到109CCU/ml及以上时，10000～16000r/min离心10～20min，收集菌体，弃上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit(BIOMIGA，USA)提取试剂盒提取得到绵羊肺炎支原体的总DNA。
所述培养基为脑心浸液肉汤培养基(BD,USA)。
培养基优选组成如下：至少含有
热灭活特级马血清(Biotopped,China)15～20％(v/v)，
酚红(Sigma,USA)0.004～0.06％(w/v)，
氨苄西林(OMEGA,USA)25～30μg/ml。
2.MO基因组表达文库的构建
用Sau3A I酶(TaKaRa,Japan)对MO总DNA进行酶切，使酶切的基因组片段集中 于0.5～3kb，然后按照酶切体系：0.2～0.3ul的Sau3A I酶(0.5～1.5U/ul)于36～38℃，酶切0.5～1.5ug基因组DNA 2～2.5h进行酶切。
将酶切的片段通过T4DNA连接酶(Promega,USA)连接于经BamH I(TaKaRa,Japan)酶切并去磷酸化处理的PET28(a/b/c)(Invitrogen,USA)表达载体中，然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml，以满足筛选重组质粒的需要)的LB平板上，于36～38℃培养12～14h。按照分子克隆技术提取质粒，再将其转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，同样涂布于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml)的LB平板上，于36～38℃培养12～14h。
得到含有绵羊肺炎支原体基因片段的大肠杆菌，既绵羊肺炎支原体基因组表达文库。
3.MO基因组表达文库的鉴定
从已转入BL21大肠杆菌的平板上随机挑选80～120个菌落，通过pET28(a/b/c)的通用引物<210>4(T7)和<210>5(T7ter)对所构建文库的容量及插入片段的大小进行菌液PCR扩增。
PCR反应条件为：93～95℃变性3-5min；52～56℃退火40～50s，70～72℃延伸2min～3min；共30～35个循环；70～72℃终延伸10～15min，3～5℃时结束反应。扩增后将PCR产物经10～15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后对插入片段的大小及插入片段的成功率进行分析。
4.MO抗原基因的免疫学筛选
将基因组文库等份稀释，涂于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml，以防止杂菌的污染)的LB平板上36～38℃培养7～8h。将克隆菌复制于硝酸纤维素膜上置于一个新的含卡那霉素(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml)LB平板上培养2～3h后，再将此含菌的NC膜置于含有1～1.2mM的IPTG的LB琼脂板，36～38℃培养4～6h.然后将有细菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15～25min，于空气中干燥。将NC膜放入裂解液(100mM Tris-HCl PH7.8，150mM MgCl2，1.0～2.0％BSA(m/V)，0.5～1.5ug/ml胰DNA酶，30～50ug/ml溶菌酶)中于室温缓慢摇动14～16h；然后将NC膜放入TBST缓冲液(40`60mM Tris,150mM NaCl，0.04％～0.06％Tween-20,PH7.5～7.7)中漂洗3～5次，每次20～30min；将NC膜再放入膜封闭液(TIANGEN)中室温缓慢晃动1～1.5h.再用TBST缓冲 液漂洗2～4次，每次10～20分钟；再将NC膜放入用封闭缓冲液按1：2500～1:3500稀释被处理过的阳性血清中，室温孵育1～1.5h，分别用含0.05～0.15％BSA的TBST缓冲液、含有0.05～0.15％BSA和0.05～0.15％Tween-20的TBST缓冲液、含0.05～0.15％BSA的TBST缓冲液各洗涤3～5min。最后将NC膜放入用封闭缓冲液按1:4500～1:5500稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG溶液中，室温孵育1～1.5h后，用TBST缓冲液洗涤3～5次，每次30～40min。用TMB显色液覆盖于NC膜上，挑取NC膜上颜色较深的阳性斑点反复进行筛选验证。
挑选出阳性克隆菌在10ug/ml～50ug/ml的卡那霉素的LB液体中培养，当其OD600nm达到0.6～0.8时，加入终浓度为1～1.2mM的IPTG进行诱导，在36～38℃剧烈摇动培养6～8h。
得到表达的绵羊肺炎支原体相关蛋白。
分别用SDS-PAGE和Western blot对所表达的蛋白进行检测。
5.MO抗原基因编码蛋白线性优势抗原表位的预测分析
采用Novasygen质粒小量提取试剂盒对筛选出的阳性菌落提取质粒，并将质粒进行测序，获得其序列。
对筛选出抗原基因所编码氨基酸序列的线性优势抗原表位进行预测分析，综合三种不同的预测方法寻找出存在共同优势抗原表位的序列。
6.MO线性优势抗原表位的鉴定
取BALB/c小鼠进行免疫实验。
7.MO多表位融合抗原基因的构建
通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸GGCCCGGGC将具有编码线性优势抗原表位的单个基因串联在一起，构建一个具有多表位融合抗原基因的串联体(命名为MO-meAg5)。即<210>1。
对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸的大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，通过基因体外合成的方式合成MO多表位融合基因。即<210>2。
8.MO多表位融合抗原MO-meAg5基因在大肠杆菌中的表达
通过常规分子克隆技术构建pMD19-T-MO-meAg5重组质粒，采用EcoR I和Xhol I分别对pMD19-T-MO-meAg5质粒和pET32a(+)质粒进行双酶切，采用T4DNA连接酶构建一个pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒。将该质粒转入DH5α感受态细胞中， 涂布于含有Amp抗性的固体LB平板上，36～38℃培养11～14h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，得到pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒。
上述含有Amp抗性为Amp在培养基中的工作终浓度为25ug/ml～50ug/ml，可以筛选出含有Amp抗性的重组菌。
将鉴定正确的pET32a(+)-MO-meAg5重组表达质粒转化至表达工程菌BL21E.coli中，36～38℃培养12～14h，挑选菌落并用PCR进行筛选，将筛选到的阳性菌转接到含有Amp(氨苄青霉素)抗性(Amp在培养基中的工作终浓度为25ug/ml～50ug/ml)的液体LB培养基中，36～38℃培养至OD600nm(吸光度)为0.6～0.8，加入终浓度为0.5～1.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导6～10h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，然后进行SDS-PAGE电泳分析，同时用抗MO阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗羊为二抗进行Western blot分析。结果在IPTG的诱导下，可表达出33.5kDa的重组蛋白条带；纯化后进行Western blot检测发现，重组蛋白MO-meAg5表现出较强的反应原性。按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)说明书进行蛋白的纯化。将最终纯化的蛋白溶液稀释为1～1.5mg/ml。
得到本发明的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5。
9.MO多表位融合抗原MO-meAg5的免疫原性分析
将小鼠分成实验组和对照组进行免疫实验，实验组：MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合。采用皮内多点分部注射方式进行首次免疫，免疫剂量为4-～60ul。在首次免疫10～20天后，制备MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合。同样采用皮内多点分部注射方式进行二次免疫，免疫剂量为100ul。在二次免疫6～10天后，采血，离心分离血清，-20℃保存备用。
将2月龄的羔羊分成实验组和对照组，实验组：MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合。采用肌肉注射方式进行首次免疫，免疫剂量为400～600ul。在首次免疫10～20天后，制备MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合。同样采用相同的注 射方式进行二次免疫，免疫剂量为400～600ul。在二次免疫6～10天后，采血，分离血清，-20℃～-70℃保存备用。
参照绵羊支原体肺炎间接血凝诊断试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所)说明书，取96孔V型反应板，从第1孔开始至第8孔分别滴加PBS缓冲液20～30uL，吸取被检血清20～30uL于第1孔中，充分混匀后再吸取20～30uL加于第2孔，依次做对倍稀释至第8孔，每孔滴加0.5～1.5％抗原致敏红细胞20～30uL，放在微量震荡器上震荡2min以上，直至诊断液中的血球分布均匀，从震荡器上取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃板，置36～38℃2～3h，进行结果判定。阳性对照血清效价在1：128(第7孔)以上凝集，阴性对照凝集效价小于1：4。抗原对照无自凝现象的前提下，被检血清效价1：8以上凝集者判为阳性，效价小于1：4者判为阴性。测定小鼠和羔羊(实验组和对照组)血清样品的抗体效价。
结果MO-meAg5多表位融合抗原免疫小鼠后血清中MO特异性间接血凝抗体效价在2-6～2-7之间，MO-meAg5多表位融合抗原免疫羔羊后血清中MO特异性间接血凝抗体效价在2-5～2-6之间。
本发明通过构建绵羊肺炎支原体基因组表达文库，并利用抗MO阳性血清对文库进行筛选以期获得具有免疫原性的抗原基因，通过生物学软件对免疫原性基因所编码氨基酸的序列进行分析，将具有优势抗原表位的氨基酸序列与柔性氨基酸串联，通过生物信息学软件寻找出与其对应的核苷酸序列，在不改变氨基酸序列的前提下将大肠杆菌的稀有密码子替换为偏爱密码子，构建一个多表位融合抗原基因，并采用原核表达工程菌对该融合基因进行表达，进一步对其免疫保护进行验证与分析，以获得具有良好免疫原性的抗原蛋白，为进一步研制开发安全、高效的绵羊支原体肺炎多表位蛋白疫苗奠定基础。
附图说明
图1为实施例1重组载体pMD19-T-MO-meAg5的PCR鉴定(Fig 1.Identification of pMD19-T-MO-meAg5 by PCR)。
图中：M:DNA Marker(DL2000)1:Negative control，2～7:Amplification of MO-meA5gene。
图2为实施例1重组表达载体pET32a(+)-MO-meA5的双酶切鉴定(Fig2.Identification of pET32a(+)-MO-ME1plasmid by double enzyme digestion)。
图中：M:DNA Marker DL-5000；1～3:The products from pET32a(+)-MO-meA5
by double enzyme digestion。
图3表达MO-meAg5多表位融合抗原蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析(Fig3.SDS-PAGE and Western blot analysis of expressed recombinant protein MO-meAg5)。
图中：M:molecular mass standard；Lane 1:PET32a(+)；Lane 2,3,4,5,6；pET32a-MO-meAg5plasmid induced 0,10,8,6,4h by IPTG；Lane 7:The purified recombinant protein；Lane 8:Western blot analysis of recombinant protein MO-meAg5。
图4为实施例1MO-meAg5多表位融合抗原免疫羔羊后血清MO特异性抗体水平检测(Fig4.The specific antibody level of lamb post vaccination)。
图5为表1：MO基因组表达文库中筛选出的抗原基因编码氨基酸序列的线性优势抗原表位预测分析表。
具体实施方式
实施例1：
1.MO基因组的提取
将纯化后的一株纯菌转接于30～50ml含有15～20％热灭活特级马血清(Biotopped,China)(v/v)，0.004～0.06％酚红(Sigma,USA)(w/v),25～30μg/ml氨苄西林(OMEGA,USA)的脑心浸液肉汤培养基(BD,USA)中，于36～38℃，浓度为5％的CO2培养箱中培养5～8天，当生长滴度达到109CCU/ml时，12000r/min离心15min，收集菌体，弃上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit(BIOMIGA，USA)提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体的总DNA。
2.MO基因组表达文库的构建
用Sau3A I酶(TaKaRa,Japan)对MO总DNA进行酶切，通过酶切预实验掌握好最佳酶切用量及酶切时间，使酶切的基因组片段集中于0.5～3kb，然后按照适当的酶切体系：0.25ul的Sau3A I酶(1U/ul)于37℃，酶切1ug基因组DNA 2～2.5h进行酶切。
将酶切的片段通过T4DNA连接酶(Promega,USA)连接于经BamH I(TaKaRa,Japan)酶切并去磷酸化处理PET28(a/b/c)(Invitrogen,USA)表达载体中，然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，于36～38℃培养12～14h。按照分子克隆技术提取质粒，再将其转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，同样涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，于36～38℃培养12～14h。
3.MO基因组表达文库的鉴定
从已转入BL21大肠杆菌的平板上随机挑选100个菌落，通过pET28(a/b/c)的通用引物T7和T7ter对所构建文库的容量及插入片段的大小进行菌液PCR扩增。
PCR反应条件为：93～95℃变性3-5min；52～56℃退火40～50s，70～72℃延伸2min～3min；共30～35个循环；70～72℃终延伸10～15min，4℃结束反应。扩增后将PCR产物经10～15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后对插入片段的大小及插入片段的成功率进行分析。
4.MO抗原基因的免疫学筛选
将基因组文库等份稀释，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板上36～38℃培养7～8h。将克隆菌复制于硝酸纤维素膜上置于一个新的含卡那霉素LB平板上培养2～3h后，再将此含菌的NC膜置于含有1～1.2mM的IPTG的LB琼脂板，36～38℃培养4～6h.然后将有细菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15～25min，于空气中干燥。
将NC膜放入裂解液(100mM Tris-HCl PH7.8，150mM MgCl2，1.5％BSA(m/V)，1ug/ml胰DNA酶，40ug/ml溶菌酶)中于室温缓慢摇动14～16h；然后将NC膜放入TBST缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl，0.05％Tween-20,PH7.6)中漂洗3～5次，每次20～30min；将NC膜再放入膜封闭液(TIANGEN)中室温缓慢晃动1～1.5h.再用TBST缓冲液漂洗2～4次，每次10～20分钟；再将NC膜放入用封闭缓冲液按1：3000稀释被处理过的阳性血清中，室温孵育1～1.5h，分别用含0.1％BSA的TBST缓冲液、含有0.1％BSA和0.1％Tween-20的TBST缓冲液、含0.1％BSA的TBST缓冲液各洗涤3～5min。最后将NC膜放入用封闭缓冲液按1:5000稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG溶液中，室温孵育1～1.5h后，用TBST缓冲液洗涤3～5次，每次30～40min。用TMB显色液覆盖于NC膜上，挑取NC膜上颜色较深的阳性斑点反复进行筛选验证。
挑选出阳性克隆菌在含有卡那霉素的40～50ml LB液体中培养，当其OD600nm达到0.6～0.8时，加入终浓度为1～1.2mM的IPTG进行诱导，在36～38℃剧烈摇动培养6～8h。分别用SDS-PAGE和Western blot对所表达的蛋白进行检测。
5.MO抗原基因编码蛋白线性优势抗原表位的预测分析
采用Novasygen质粒小量提取试剂盒对筛选出的阳性菌落提取质粒，并将质粒进行测序，获得其序列。
利用生物在线软件ABCPred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)及DNAStar软件对筛选出抗原基因(表1)所编码氨基酸序列的线性优势抗原表位进行预测分析， 综合三种不同的预测方法寻找出存在共同优势抗原表位的序列。
6.MO线性优势抗原表位的鉴定
取BALB/c小鼠50只，随机分为10组，每组5只，9个实验组和一个对照组。将合成的9个优势抗原表位肽与BSA偶联后，与弗氏佐剂按照1:1乳化制成9组疫苗分别皮下注射9个实验组，同时，使用同等体积的PBS作为对照。第一次乳化采用弗氏完全佐剂，第二、三次采用弗氏不完全佐剂。每隔14天免疫一次，每次免疫前都进行采血，三免14天后进行断尾采血，分离血清用ELISA检测血清抗体。
7.MO多表位融合抗原基因的构建方法
通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸GGCCCGGGC将具有编码线性优势抗原表位的单个基因串联在一起，构建一个具有多表位融合抗原基因的串联体(命名为MO-meAg5)。运用稀有密码子在线软件(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸的大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，通过基因体外合成的方式合成MO多表位融合基因。
8.MO多表位融合抗原MO-meAg5基因在大肠杆菌中的表达
通过常规分子克隆技术构建pMD19-T-MO-meAg5重组质粒(图1)，采用EcoR I和Xhol I分别对pMD19-T-MO-meAg5质粒和pET32a(+)质粒进行双酶切，采用T4 DNA连接酶构建一个pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒。
将该质粒转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp抗性的固体LB平板上，36～38℃培养11～14h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，得到pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒(图2)。
将鉴定正确的pET32a(+)-MO-meAg5重组表达质粒转化至表达工程菌BL21E.coli中，36～38℃培养12～14h，挑选菌落并用PCR进行筛选，将筛选到的阳性菌转接到含有Amp抗性的液体LB培养基中，36～38℃培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导6～10h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，然后进行SDS-PAGE电泳分析，同时用抗MO阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗羊为二抗进行Western blot分析。结果在IPTG的诱导下，可表达出33.5kDa的重组蛋白条带；纯化后进行Western blot检测发现，重组蛋白MO-meAg5表现出较强的反应原性(图3)。
按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)说明书进行蛋白的纯化。 将最终纯化的蛋白溶液稀释为1～1.5mg/ml。
9.MO多表位融合抗原MO-meAg5的免疫原性分析
将20只25日龄的昆明(KM)小鼠分成实验组和对照组，每组10只。实验组：MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合。采用皮内多点分部注射方式进行首次免疫，免疫剂量为50ul。在首次免疫14天后，制备MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合。同样采用皮内多点分部注射方式进行二次免疫，免疫剂量为100ul。在二次免疫7天后，采血，离心分离血清，-20℃保存备用。
将10只2月龄的羔羊分成实验组和对照组，每组5只。实验组：MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合。采用肌肉注射方式进行首次免疫，免疫剂量为500ul。在首次免疫14天后，制备MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合。同样采用相同的注射方式进行二次免疫，免疫剂量为500ul。在二次免疫7天后，采血，分离血清，-20℃保存备用。
参照绵羊支原体肺炎间接血凝诊断试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所)说明书，取96孔V型反应板，从第1孔开始至第8孔分别滴加PBS缓冲液25uL，吸取被检血清25uL于第1孔中，充分混匀后再吸取25uL加于第2孔，依次做对倍稀释至第8孔，每孔滴加1％抗原致敏红细胞25uL，放在微量震荡器上震荡2min，直至诊断液中的血球分布均匀，从震荡器上取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃板，置37℃2～3h，进行结果判定。
阳性对照血清效价在1：128(第7孔)以上凝集，阴性对照凝集效价小于1：4。抗原对照无自凝现象的前提下，被检血清效价1：8以上凝集者判为阳性，效价小于1：4者判为阴性。测定小鼠和羔羊(实验组和对照组)血清样品的抗体效价。结果MO-meAg5多表位融合抗原免疫小鼠后血清中MO特异性间接血凝抗体效价在2-6～2-7之间，MO-meAg5多表位融合抗原免疫羔羊后血清中MO特异性间接血凝抗体效价在2-5～2-6之间(图4)。
实施例2：
1.MO基因组的提取
将纯化后的菌株转接于30～50ml培养基中，于36～38℃、浓度为4～6％的CO2培养箱中培养5～9天，当生长滴度达到109CCU/ml及以上时，10000～16000r/min离心10～20min，收集菌体，弃上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit(BIOMIGA，USA)提取试剂盒提取得到绵羊肺炎支原体的总DNA。
所述培养基为脑心浸液肉汤培养基(BD,USA)。
培养基优选组成如下：含有
热灭活特级马血清(Biotopped,China)15～20％(v/v)，
酚红(Sigma,USA)0.004～0.06％(w/v)，
氨苄西林(OMEGA,USA)25～30μg/ml。
2.MO基因组表达文库的构建
用Sau3A I酶(TaKaRa,Japan)对MO总DNA进行酶切，使酶切的基因组片段集中于0.5～3kb，然后按照酶切体系：0.2～0.3ul的Sau3A I酶(0.5～1.5U/ul)于36～38℃，酶切0.5～1.5ug基因组DNA 2～2.5h进行酶切。
将酶切的片段通过T4DNA连接酶(Promega,USA)连接于经BamH I(TaKaRa,Japan)酶切并去磷酸化处理的PET28(a/b/c)(Invitrogen,USA)表达载体中，然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml，以满足筛选重组质粒的需要)的LB平板上，于36～38℃培养12～14h。按照分子克隆技术提取质粒，再将其转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，同样涂布于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml)的LB平板上，于36～38℃培养12～14h。
得到含有绵羊肺炎支原体基因片段的大肠杆菌，既绵羊肺炎支原体基因组表达文库。
3.MO基因组表达文库的鉴定
从已转入BL21大肠杆菌的平板上随机挑选80～120个菌落，通过pET28(a/b/c)的通用引物<210>4(T7)和<210>5(T7ter)对所构建文库的容量及插入片段的大小进行菌液PCR扩增。
PCR反应条件为：93～95℃变性3-5min；52～56℃退火40～50s，70～72℃延伸2min～3min；共30～35个循环；70～72℃终延伸10～15min，3～5℃时结束反应。扩增后将PCR产物经10～15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后对插入片段的大小及插入片段的成功率进行分析。
4.MO抗原基因的免疫学筛选
将基因组文库等份稀释，涂于含有卡那霉素抗性(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml，以防止杂菌的污染)的LB平板上36～38℃培养7～8h。将克隆菌复制于硝酸纤维素膜上置于一个新的含卡那霉素(卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml)LB平板上培养2～3h后，再将此含菌的NC膜置于含有1～1.2mM的IPTG的LB琼脂板，36～38℃培养4～6h.然后将有细菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15～25min，于空气中干燥。
将NC膜放入裂解液(100mM Tris-HCl PH7.8，150mM MgCl2，1.0～2.0％BSA(m/V)，0.5～1.5ug/ml胰DNA酶，30～50ug/ml溶菌酶)中于室温缓慢摇动14～16h；然后将NC膜放入TBST缓冲液(40`60mM Tris,150mM NaCl，0.04％～0.06％Tween-20,PH7.5～7.7)中漂洗3～5次，每次20～30min；将NC膜再放入膜封闭液(TIANGEN)中室温缓慢晃动1～1.5h.再用TBST缓冲液漂洗2～4次，每次10～20分钟；再将NC膜放入用封闭缓冲液按1：2500～1:3500稀释被处理过的阳性血清中，室温孵育1～1.5h，分别用含0.05～0.15％BSA的TBST缓冲液、含有0.05～0.15％BSA和0.05～0.15％Tween-20的TBST缓冲液、含0.05～0.15％BSA的TBST缓冲液各洗涤3～5min。最后将NC膜放入用封闭缓冲液按1:4500～1:5500稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG溶液中，室温孵育1～1.5h后，用TBST缓冲液洗涤3～5次，每次30～40min。用TMB显色液覆盖于NC膜上，挑取NC膜上颜色较深的阳性斑点反复进行筛选验证。
挑选出阳性克隆菌在10ug/ml～50ug/ml的卡那霉素的LB液体中培养，当其OD600nm达到0.6～0.8时，加入终浓度为1～1.2mM的IPTG进行诱导，在36～38℃剧烈摇动培养6～8h。
得到表达的绵羊肺炎支原体相关蛋白。
分别用SDS-PAGE和Western blot对所表达的蛋白进行检测。
5.MO抗原基因编码蛋白线性优势抗原表位的预测分析
采用Novasygen质粒小量提取试剂盒对筛选出的阳性菌落提取质粒，并将质粒进行测序，获得其序列。
利用生物在线软件ABCPred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)及DNAStar软件对筛选出抗原基因(表1)所编码氨基酸序列的线性优势抗原表位进行预测分析，综合三种不同的预测方法寻找出存在共同优势抗原表位的序列。
6.MO线性优势抗原表位的鉴定
取BALB/c小鼠40～60只，随机分为8～12组，每组4～6只，7～11个实验组和一个对照组。将合成的7～11个优势抗原表位肽与BSA偶联后，与弗氏佐剂按照1:1乳化制成7～11组疫苗分别皮下注射7～11个实验组，同时，使用同等体积的PBS作为对照。第一次乳化采用弗氏完全佐剂，第二、三次采用弗氏不完全佐剂。每隔10～20天免疫一次，每次免疫前都进行采血，三免10～20天后进行断尾采血，分离血清用ELISA检测血清抗体。
7.MO多表位融合抗原基因的构建
通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸GGCCCGGGC将具有编码线性优势抗原表位的单个基因串联在一起，构建一个具有多表位融合抗原基因的串联体(命名为MO-meAg5)。即<210>1。
用在线软件(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸的大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，通过基因体外合成的方式合成MO多表位融合基因。即<210>2。
8.MO多表位融合抗原MO-meAg5基因在大肠杆菌中的表达
通过常规分子克隆技术构建pMD19-T-MO-meAg5重组质粒(图1)，采用EcoR I和Xhol I分别对pMD19-T-MO-meAg5质粒和pET32a(+)质粒进行双酶切，采用T4DNA连接酶构建一个pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒。将该质粒转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp抗性的固体LB平板上，36～38℃培养11～14h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，得到pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒(图2)。
上述含有Amp抗性为Amp在培养基中的工作终浓度为25ug/ml～50ug/ml，可以筛选出含有Amp抗性的重组菌。
将鉴定正确的pET32a(+)-MO-meAg5重组表达质粒转化至表达工程菌BL21E.coli中，36～38℃培养12～14h，挑选菌落并用PCR进行筛选，将筛选到的阳性菌转接到含有Amp(氨苄青霉素)抗性(Amp在培养基中的工作终浓度为25ug/ml～50ug/ml)的液体LB培养基中，36～38℃培养至OD600nm(吸光度)为0.6～0.8，加入终浓度为0.5～1.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导6～10h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，然后进行SDS-PAGE电泳分析，同时用抗MO阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗羊为二抗进行Western blot分析。结果 在IPTG的诱导下，可表达出33.5kDa的重组蛋白条带；纯化后进行Western blot检测发现，重组蛋白MO-meAg5表现出较强的反应原性(图3)。
按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)说明书进行蛋白的纯化。将最终纯化的蛋白溶液稀释为1～1.5mg/ml。
得到本发明的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5。
9.MO多表位融合抗原MO-meAg5的免疫原性分析
将16～24只25日龄的昆明(KM)小鼠分成实验组和对照组，每组10只。实验组：MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合。采用皮内多点分部注射方式进行首次免疫，免疫剂量为4-～60ul。在首次免疫10～20天后，制备MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合。同样采用皮内多点分部注射方式进行二次免疫，免疫剂量为100ul。在二次免疫6～10天后，采血，离心分离血清，-20℃保存备用。
将8～15只2月龄的羔羊分成实验组和对照组，每组5只。实验组：MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1:1混合。采用肌肉注射方式进行首次免疫，免疫剂量为400～600ul。在首次免疫10～20天后，制备MO-meAg5重组蛋白溶液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏不完全佐剂按体积比1:0.8～1:1.2混合。同样采用相同的注射方式进行二次免疫，免疫剂量为400～600ul。在二次免疫6～10天后，采血，分离血清，-20℃～-70℃保存备用。
参照绵羊支原体肺炎间接血凝诊断试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所)说明书，取96孔V型反应板，从第1孔开始至第8孔分别滴加PBS缓冲液20～30uL，吸取被检血清20～30uL于第1孔中，充分混匀后再吸取20～30uL加于第2孔，依次做对倍稀释至第8孔，每孔滴加0.5～1.5％抗原致敏红细胞20～30uL，放在微量震荡器上震荡2min以上，直至诊断液中的血球分布均匀，从震荡器上取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃板，置36～38℃2～3h，进行结果判定。
阳性对照血清效价在1：128(第7孔)以上凝集，阴性对照凝集效价小于1：4。抗原对照无自凝现象的前提下，被检血清效价1：8以上凝集者判为阳性，效价小于1：4者判为阴性。测定小鼠和羔羊(实验组和对照组)血清样品的抗体效价。结果MO-meAg5多表位融合抗原免疫小鼠后血清中MO特异性间接血凝抗体效价在2-6～2-7 之间，MO-meAg5多表位融合抗原免疫羔羊后血清中MO特异性间接血凝抗体效价在2-5～2-6之间(图4)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5的制备方法，其特征在于，主要包含以下过程：
MO基因组的提取；
MO基因组表达文库的构建；
MO抗原基因的免疫学筛选；
MO-多表位融合抗原基因的构建方法；
MO多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达；
其具体过程如下：
MO基因组的提取：
将纯化后的菌株转接于培养基中，于36～38℃、浓度为4～6％的CO2培养箱中培养5～9天，当生长滴度达到109CCU/ml及以上时，10000～16000r/min离心10～20min，收集菌体，弃上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit提取试剂盒提取得到绵羊肺炎支原体的总DNA；
所述培养基为脑心浸液肉汤培养基(BD,USA)；
MO基因组表达文库的构建：
用Sau3A I酶对MO总DNA进行酶切，使酶切的基因组片段集中于0.5～3kb，然后按照酶切体系Sau3A I酶于36～38℃，酶切0.5～1.5ug基因组DNA 2～2.5h进行酶切。
将酶切的片段通过T4DNA连接酶连接于经BamH I酶切并去磷酸化处理的PET28表达载体中，然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，于36～38℃培养12～14h；
按照分子克隆技术提取质粒，再将其转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，同样涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，于36～38℃培养12～14h；
得到含有绵羊肺炎支原体基因片段的大肠杆菌，既绵羊肺炎支原体基因组表达文库；
MO抗原基因的免疫学筛选：
将所构建的绵羊肺炎支原体基因组表达文库等份稀释，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板上36～38℃培养7～8h；
将克隆菌复制于硝酸纤维素膜上置于一个新的含卡那霉素LB平板上培养2～3h后，再将此含菌的NC膜置于含有1～1.2mM的IPTG的LB琼脂板，36～38℃培养4～6h.然后将有细菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15～25min，于空气中干燥；
将NC膜放入裂解液中于室温缓慢摇动14～16h；然后将NC膜放入TBST缓冲液中漂洗3～5次，每次20～30min；
将NC膜再放入膜封闭液(TIANGEN)中室温缓慢晃动1～1.5h.再用TBST缓冲液漂洗2～4次，每次10～20分钟；
再将NC膜放入用封闭缓冲液按1：2500～1:3500稀释被处理过的阳性血清中，室温孵育1～1.5h，分别用含0.05～0.15％BSA的TBST缓冲液、含有0.05～0.15％BSA和0.05～0.15％Tween-20的TBST缓冲液、含0.05～0.15％BSA的TBST缓冲液各洗涤3～5min；
最后将NC膜放入用封闭缓冲液按1:4500～1:5500稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG溶液中，室温孵育1～1.5h后，用TBST缓冲液洗涤3～5次，每次30～40min；用TMB显色液覆盖于NC膜上，挑取NC膜上颜色较深的阳性斑点反复进行筛选验证；
挑选出阳性克隆菌在10ug/ml～50ug/ml的卡那霉素的LB液体中培养，当其OD600nm达到0.6～0.8时，加入终浓度为1～1.2mM的IPTG进行诱导，在36～38℃剧烈摇动培养6～8h，得到表达的绵羊肺炎支原体相关蛋白；
MO多表位融合抗原基因的构建：
通过编码柔性氨基酸的核苷酸GGCCCGGGC将具有编码线性优势抗原表位的单个基因串联在一起，构建一个具有多表位融合抗原基因的串联体，即<210>1；
对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸的大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，通过基因体外合成的方式合成MO多表位融合基因，即<210>2。
MO多表位融合抗原MO-meAg5基因在大肠杆菌中的表达：
通过常规分子克隆技术构建pMD19-T-MO-meAg5重组质粒，采用EcoR I和XholI分别对pMD19-T-MO-meAg5质粒和pET32a(+)质粒进行双酶切，采用T4DNA连接酶构建一个pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒，将该质粒转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp抗性的固体LB平板上，36～38℃培养11～14h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，得到pET32a(+)-MO-meAg5重组质粒；
将鉴定正确的pET32a(+)-MO-meAg5重组表达质粒转化至表达工程菌BL21E.coli中，36～38℃培养12～14h，挑选菌落并用PCR进行筛选，将筛选到的阳性菌转接到含有Amp抗性的液体LB培养基中，36～38℃培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为0.5～1.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导6～10h后收集菌液；
得到绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5。
2.根据权利要求1所述的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5的制备方法，其特征在于，所述培养基为脑心浸液肉汤培养基。
3.根据权利要求2所述的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5的制备方法，其特征在于，所述培养基中至少含有下列中的一种：
热灭活特级马血清15～20％(v/v)，
酚红0.004～0.06％(w/v)，
氨苄西林25～30μg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5的制备方法，其特征在于：
所述含有卡那霉素抗性的LB平板为：涂布于LB平板上的卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml；
所述含有卡那霉素LB液体为：卡那霉素在培养基中的工作终浓度为10ug/ml～50ug/ml；
所述含有Amp抗性的固体LB平板为：Amp在培养基中的工作终浓度为25ug/ml～50ug/ml。
5.一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5，其特征在于，根据权利要求1至4任一项权利要求所述的方法制备。
6.一种权利要求5所述的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5的用途，其特征在于，将所述的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5用于制备绵羊支原体肺炎多表位蛋白疫苗。
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