CN102277425A - 一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体说是涉及一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，本发明从补体角度入手，通过对绵羊自身MBL基因的研究，研究发现其多态性与绵羊支原体的抗性紧密相关，预测MBL基因为绵羊支原体肺炎抗性性状的候选基因，可作为选育高抗性绵羊的分子标记，并能快速、准确地建立抗绵羊支原体肺炎新品系，同时，本发明也可为该疾病的治疗提供新的思路，MBL作为广泛参与多种疾病免疫途径的重要因素，该发明为其它疾病研究提供借鉴，对合理开发利用新疆地方绵羊品种遗传资源以及引进新品种具有重要的现实意义，为进一步选育绵羊支原体肺炎抗性基因型个体奠定实验基础。

Description

一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法

技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，具体说是涉及一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法。

背景技术：

绵羊支原体性肺炎又称绵羊传染性胸膜肺炎的病原，是一种由绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)所引起的以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症为特征的呼吸道疾病，本病的直接损失是羔羊死亡率增加、疾病监测治疗的费用提高；间接损失主要是疾病的慢性营养消耗、体重减轻、上市推迟、繁殖力降低等。因此从抗病育种的角度，通过研究MBL基因多态性与疾病的相关性，采用PCR-SSCP技术研究其MBL基因外显子和内含子的遗传多态性，并统计分析MBL基因不同的基因型与湖羊血清MBL水平的相关性，寻找抗性型与易感型个体，为研究绵羊MBL基因的多态性与疾病的关系奠定坚实的基础，对合理开发利用新疆地方绵羊品种遗传资源以及引进新品种具有重要的现实意义；

MBL存在于人及动物的血液和肝脏组织中，是一种重要的天然免疫防御分子，MBL能直接介导调理吞噬作用或通过MBL途径激活补体，在机体先天性免疫防御、免疫监视和免疫复合物清除中起重要作用。MBL生物学功能的实现有赖于其完整的蛋白质结构，MBL结构基因突变影响了蛋白多聚体的功能性和稳定性，使得MBL血清浓度明显降低，机体的免疫防御和监视能力削弱，导致机体对多种病原的易感。研究表明编码区上游(主要是外显子1、2)的点突变则会影响血清MBL检测浓度，而内含子区域的突变可能影响转录，导致功能区翻译不全，使得MBL的蛋白质结构发生变化，因此MBL基因外显子和内含子的多态性与MBL的表达水平具有一定的相关性，为进一步选育绵羊支原体肺炎抗性基因型个体奠定实验基础。

发明内容：

本发明的目的是以常发病绵羊支原体肺炎为疾病模型，实验证实该病与MBL多态性及血清水平有相关性，并提供绵羊MBL基因与MBL水平相关的21种基因型和各自的突变位点，分析了绵羊MBL基因外显子1、4和内含子1、2的多态性，通过测序找到他们的突变位点，并经过EILSA检测发现这些位点的突变对绵羊支原体肺炎的抗性是有意义的，最后用人工感染的方法进行了验证的一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，以克服上述不足。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，其特征是：绵羊支原体肺炎抗性基因多态性分析及筛选，具体筛选包括以下方法：

(1)样品采集和绵羊基因组DNA的提取；

(2)对MBL外显子1和4、内含子1和2逐段进行多态性分析，设计了7对引物，进行PCR扩增，筛选出与MBL水平相关的基因型21种，其中外显子1上有4种基因型，即AA、BB、CC和BC型，含5个突变位点，分别位于第27、41、43、83、105位点，其中g.27T＞C和g105C＞T为同义突变，g41T＞A(Val14 Glu)，g43G＞A(Val15 Met)，g83A＞G(Glu28 Gly)3处为错义突变；外显子4上有3种基因型，即GG、GH和HH型，含5个突变位点，分别位于第3235、3243、3257、3331、3334位点，其中g.3235T＞C，g.3331C＞T，g.3334C＞T为同义突变，g.3243A＞G(Glu 181 Gly)，g.3257G＞A(Gly 186 Ser)2处为错义突变；内含子1上有3种基因型，含AA、BB、AB型，1个突变位点，位于第288位点；内含子2上有11种基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3个突变位点，分别位于第1091、1096、1784位点，均为同义突变位点；

(3)进行绵羊支原体肺炎EILSA抗体水平检测，以外显子1的多态性分析为基础，对同一基因型绵羊支原体肺炎阴性和阳性不同个体进行差异显著性分析，筛选出绵羊支原体肺炎抗性基因型和易感性基因型；

(4)以外显子1的多态性分析为基础，筛选出中国美利奴羊四种不同MBL基因型，即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供试群体，EILSA检测群体MBL水平，结果显示CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，预测CC型为抗性组，DD型为易感组，人工感染绵羊肺炎支原体，结果抗性组中发病2只，未发病7只；易感组中发病7只，未发病2只，对照组均未发病，BC组中发病5只，未发病5只；BB组中发病5只，未发病4只，表明抗性组绵羊支原体肺炎的感染率显著低于易感组。

本发明的优点是：

本发明以绵羊支原体肺炎为疾病模型，从补体角度入手，通过对绵羊自身MBL基因的研究，研究发现其多态性与绵羊支原体的抗性紧密相关，预测MBL基因为绵羊支原体肺炎抗性性状的候选基因，可作为选育高抗性绵羊的分子标记，并能快速、准确地建立抗绵羊支原体肺炎新品系，同时，本发明也可为该疾病的治疗提供新的思路，MBL作为广泛参与多种疾病免疫途径的重要因素，该发明为其它疾病研究提供借鉴，因此通过PCR-SSCP筛选得到的基因型和多态位点对绵羊支原体肺炎的抗病育种有一定意义，对合理开发利用新疆地方绵羊品种遗传资源以及引进新品种具有重要的现实意义。

附图说明：

图1是本发明绵羊全血基因组DNA提取结果图；

图2是本发明湖羊MBL基因外显子1的PCR-SSCP电泳图；

图3是本发明湖羊MBL基因外显子4的PCR-SSCP电泳图；

图4是本发明引物对③PCR扩增产物的SSCP分析图；

图5是本发明引物对④PCR扩增产物的SSCP分析图；

图6是本发明引物对⑤PCR扩增产物的SSCP分析图；

图7是本发明引物对⑥PCR扩增产物的SSCP分析图；

图8是本发明引物对⑦PCR扩增产物的SSCP分析图。

下面结合实施例对本发明作进一步描述，

具体实施方式：

实施例：检测各个样本的基因型，筛选出和我们测到的抗性型基因一致的个体进行育种，淘汰易感性基因型个体，以彻底从遗传水平上消灭支原体肺炎。

如图1-图8所示，一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，其特征是：由绵羊支原体绵羊肺炎抗性基因提取筛选，具体筛选包括以下方法和步骤：

(1)样品采集和绵羊基因组DNA的提取；

(2)对MBL外显子1和4、内含子1和2逐段进行多态性分析，设计了7对引物，进行PCR扩增，筛选出与MBL水平相关的基因型21种，其中外显子1上有4种基因型，即AA、BB、CC和BC型，含5个突变位点，分别位于第27、41、43、83、105位点，其中g.27T＞C和g105C＞T为同义突变，g41T＞A(Val14 Glu)，g43G＞A(Val15 Met)，g83A＞G(Glu28 Gly)3处为错义突变；外显子4上有3种基因型，即GG、GH和HH型，含5个突变位点，分别位于第3235、3243、3257、3331、3334位点，其中g.3235T＞C，g.3331C＞T，g.3334C＞T为同义突变，g.3243A＞G(Glu 181 Gly)，g.3257G＞A(Gly 186 Ser)2处为错义突变；内含子1上有3种基因型，含AA、BB、AB型，1个突变位点，位于第288位点；内含子2上有11种基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3个突变位点，分别位于第1091、1096、1784位点，均为同义突变位点；

(3)进行绵羊支原体肺炎EILSA抗体水平检测，以外显子1的多态性分析为基础，对同一基因型绵羊支原体肺炎阴性和阳性不同个体进行差异显著性分析，筛选出绵羊支原体肺炎抗性基因型和易感性基因型；

(4)以外显子1的多态性分析为基础，筛选出中国美利奴羊四种不同MBL基因型，即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供试群体，EILSA检测群体MBL水平，结果显示CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，预测CC型为抗性组，DD型为易感组，人工感染绵羊肺炎支原体，结果抗性组中发病2只，未发病7只；易感组中发病7只，未发病2只，对照组均未发病，BC组中发病5只，未发病5只；BB组中发病5只，未发病4只，表明抗性组绵羊支原体肺炎的感染率显著低于易感组；

材料和方法：

实验动物：

选择新疆生产建设兵团农九师某羊场，随机采集血样105只，所采血样提取基因组DNA，引物设计及PCR扩增，

引物设计：

利用Primer premier5.0软件，参照Genbank中的绵羊MBL基因序列(Accession No.FJ977629)设计2个外显子和2个内含子如下引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 MBL基因外显子和内含子引物序列信息

Table 1 Primer sequences Information of MBL exon and intron Gene

PCR扩增：

PCR反应体系均为25μL，包括10×buffer 2.5μL，MgCl₂ 1.5μL(15mM)，dNTPs 2.5μL(2.5mM)，10μmol·L^-1上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL，2.5U·μL^-1 Taq DNA聚合酶0.6μL，双蒸水14.9μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火45s(见表1)，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物检测：

对扩增效果良好的PCR产物，进行SSCP电泳。取2μL PCR产物于8μL的上样缓冲液(98％的甲酰胺，10mmol/L EDTA(pH8.0)，0.025％的二甲苯菁，0.025％的溴酚蓝)混合，98℃变性10min，迅速插入冰中，冰浴10min，然后用微量上样器上样于12％非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶N，N’-亚甲双丙烯酰胺＝29∶1)中。220V预电泳5min，恒压140V过夜电泳20h，电泳条件为室温(大约15℃)。

电泳结束后采用银染法染色，先用超纯水洗1次，然后取凝胶于固定液(100mL无水乙醇+5mL冰醋酸定容至1000mL)中，轻摇约20min，去固定液，双蒸水洗3次，将凝胶置于染色液(2g硝酸银+100mL无水乙醇+5mL冰醋酸定容至1000mL)中，轻摇10min-15min，去染色液，双蒸水洗凝胶2-3次，倒入显色液(5mL甲醛+30g氢氧化钠定容之1000mL)轻摇至条带清晰出现，用大量双蒸水冲洗以终止反应，凝胶成像仪拍照保存结果进行下一步分析。

MBL EILSA检测：

利用绵羊MBL EILSA试剂盒检测不同MBL基因型血清MBL水平，筛选出与MBL水平相关的基因型。

绵羊支原体肺炎EILSA检测：

利用绵羊支原体肺炎EILSA试剂盒进行绵羊支原体肺炎EILSA抗体水平检测，对同一基因型绵羊支原体肺炎阴性和阳性不同个体进行差异显著性分析，筛选出绵羊支原体肺炎抗性基因型和易感性基因型。

人工感染验证实验：

试验绵羊来自新疆西部牧业种羊场，3月龄，体重8kg-12kg雌性中国美利奴(新疆军垦型)健康绵羊，绵羊支原体肺炎ELISA抗体检测为阴性。对中国美利奴羊群中选择336只进行MBL基因多态分析，以MBL外显子1为基础。选择不同基因型绵羊各9只进行绵羊支原体人工接种感染，共36只羊编号依次为1-36，试验组用注射器向气管内注射肺炎支原体5mL/只，对照组(编号依次为37-42)气管内注射相同量灭菌生理盐水。分别在攻毒后一天，一周，两周，三周，用EILSA方法测定MBL水平和MP抗体水平。

结果和分析：样品基因组DNA提取结果

图1绵羊全血基因组DNAFig1.1 Genomic DNA extracted from sheep BloodPCR-SSCP及序列分析，

根据电泳图谱，MBL exon1的SSCP分型，出现了4种基因型(如图2)，由3种等位基因控制。基因型为：AA、BB、CC和BC，由A、B、C三种等位基因控制，经测序分析，发现5个核苷酸突变位点，分别是第27、41、43、83、105位点，其中g.27T＞C和g105C＞T为同义突变，g41T＞A(Val14Glu)，g43G＞A(Val15 Met)，g83A＞G(Glu28 Gly)3处为错义突变。MBL exon4的SSCP分型，出现了3种基因型(如图3)由2种等位基因控制。基因型为：GG、GH和HH，由G、H两种等位基因控制，测序结果显示有5个核苷酸突变位点，分别是第3235、3243、3257、3331、3334位点，其中g.3235T＞C，g.3331C＞T，g.3334C＞T为同义突变，g.3243A＞G(Glu 181 Gly)，g.3257G＞A(Gly 186 Ser)2处为错义突变。

图2湖羊MBL基因外显子1的PCR-SSCP电泳图1，4：AA；2：BB；5，6：CC；3：BC Fig 2.1Electrophoretic patterns of PCR-SSCP GG of MBL exon1 in Hu sheep

图3湖羊MBL基因外显子4的PCR-SSCP电泳图1，2，5：GH；2，4：HH；6：GG Fig 2.2 Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of MBL exon 4 in Hu sheep

内含子1③有3种基因型，分别定义为AA、BB、AB，由A、B两种等位基因控制(如图4)，经测序有1个突变位点，位于第288位点，即g.288T＞A；引物④即内含子2-1有2种基因型，分别定义为PP、OP，由O、P两种等位基因控制(如图5)；引物⑤即内含子2-2有3种基因型，分别定义为CC、CD、DD，由C、D两种等位基因控制(如图6)；引物⑥即内含子2-3有3种基因型，分别定义为EE、EF、FF，由E、F两种等位基因控制(如图7)；引物⑦即内含子2-4有3种基因型，分别定义为GG、GH、HH，由G、H两种等位基因控制，经测序内含子2共有3个突变位点，分别是第1091、1096、1784位点，即g.1091T＞C、g.1096A＞C、g.1784G＞C，均为同义突变。(如图8)；

图4引物对③PCR扩增产物的SSCP分析1，3，5，6：AA；2：BB：4：AB Fig.2.3SSCP analysis of PCR products amplified with primers③

图5引物对④PCR扩增产物的SSCP分析2，3，5，6，7：PP；1，4：OP Fig.2.4 SSCPanalysis of PCR products amplified with primers④

图6引物对⑤PCR扩增产物的SSCP分析3，5：CC；1，3，4：CD；6：DD Fig.2.5SSCP analysis of PCR products amplified with primers⑤

图7引物对⑥PCR扩增产物的SSCP分析图1，2，4，5：EE；：FF；6：EFFig.2.6SSCPanalysis of PCR products amplifiedwith primers⑥

图8引物对⑦PCR扩增产物的SSCP分析1：GG；2，3，4，7：HH；5，6：GH Fig.2.7SSCP analysis of PCR products amplified with primers⑦

人工感染绵羊支原体肺炎验证实验：

结果表明：以MBL外显子1为基础，筛选出的四种不同MBL基因型，由3种等位基因控制，即BB型、BC型、CC型和DD型。发现有四个单碱基突变，g.28C＞T、g.53A＞G、g.86G＞C和g.105T＞C。其中g.28C＞T、g.53A＞G、g.86G＞C为错义突变，分别引起Leu10Phe、Met15Val、Thr29Ser的氨基酸置换，g.105T＞C为同义突变。

人工感染后EILSA结果表明CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低。经绵羊支原体肺炎ELISA试剂盒检测抗性组中发病2只，未发病7只；易感组中发病7只，未发病2只，对照组均未发病，BC组中发病5只，未发病4只；BB组中发病4只，未发病5只。因此表明抗性组绵羊支原体肺炎的感染率显著低于易感组，进而表明CC(突变位点为g.53A＞G)型为抗性基因型，DD型(突变位点为g.28C＞T)为易感性基因型。

实验结论：

本实验利用PCR-SSCP技术分析MBL外显子1、4及内含子1、2的多态性，共筛选到21种基因型，14个突变位点，将MBL血清水平与基因多态性进行关联性分析，预测外显子1的CC型和外显子4的BB基因型表现为抗性。MBL基因内含子AA型、CC型、GG型有可能与抗性相关，BB、DD、HH基因型有可能与易感性相关。且进行人工感染实验验证CC型会显著抗绵羊的支原体肺炎，为进一步选育绵羊支原体肺炎抗性基因型个体奠定实验基础。

Claims (1)

1.一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，其特征是：绵羊支原体肺炎抗性基因的多态性分析及提取筛选，具体筛选包括以下方法：

(1)样品采集和绵羊基因组DNA的提取；

(2)对MBL外显子1和4、内含子1和2逐段进行多态性分析，设计了7对引物，进行PCR扩增，筛选出与MBL水平相关的基因型21种，其中外显子1上有4种基因型，即AA、BB、CC和BC型，含5个突变位点，分别位于第27、41、43、83、105位点，其中g.27T＞C和g105C＞T为同义突变，g41T＞A、Val14 Glu，g43G＞A、Val15 Met，g83A＞G、Glu28 Gly3处为错义突变；外显子4上有3种基因型，即GG、GH和HH型，含5个突变位点，分别位于第3235、3243、3257、3331、3334位点，其中g.3235T＞C，g.3331C＞T，g.3334C＞T为同义突变，g.3243A＞G、Glu 181 Gly，g.3257G＞A、Gly 186 Ser、2处为错义突变；内含子1上有3种基因型，含AA、BB、AB型，1个突变位点，位于第288位点；内含子2上有11种基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3个突变位点，分别位于第1091、1096、1784位点，均为同义突变位点；

(3)进行绵羊支原体肺炎EILSA抗体水平检测，以外显子1的多态性分析为基础，对同一基因型绵羊支原体肺炎阴性和阳性不同个体进行差异显著性分析，筛选出绵羊支原体肺炎抗性基因型和易感性基因型；

(4)以外显子1的多态性分析为基础，筛选出中国美利奴羊四种不同MBL基因型，即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供试群体，EILSA检测群体MBL水平，结果显示CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，预测CC型为抗性组，DD型为易感组，人工感染绵羊肺炎支原体，结果抗性组中发病2只，未发病7只；易感组中发病7只，未发病2只，对照组均未发病，BC组中发病5只，未发病5只；BB组中发病5只，未发病4只，表明抗性组绵羊支原体肺炎的感染率显著低于易感组。

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