CN104480212B

CN104480212B - 黄牛plin2基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN104480212B
Application number: CN201410812179.0A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 邵斯旻; 张春雷; 房兴堂; 高晓猛; 李景景; 张海燕
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104480212A

Abstract

本发明公开了黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以包含PLIN2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PLIN2基因；再进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小；然后对产物进行变性后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。该方法在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的分子遗传标记，以用于黄牛的辅助选择和分子育种，加快黄牛良种繁育速度。

Description

黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测。

背景技术

近年来，牛肉以其蛋白质含量高、低胆固醇、低脂肪、营养丰富等特点越来越受到到人们的重视。现代中医学指出牛肉可以益气健胃、强健筋骨、止咳化痰，说明其还具有优良的滋补保健作用。随着近年来经济的发展、收入水平的提高，人们对牛肉质量的重视达到了前所未有的高度，如何进一步提高牛肉的肉用性能成了广大研究人员的新课题，优质肉牛的生产正成为一个新兴产业。

我国地方黄牛品种资源丰富，其中，有28个地方黄牛品种、育成品种4个，是世界上牛种最多的国家。虽然这些品种肉质良好、抗病性强、饲料利用转化率高、遗传稳定、适应能力强，但是长期以来我国的地方黄牛一直以役用为主。尽管牛种很多，但相对国外优质牛种，我国的黄牛品种体格偏小，后驱不发达、生长速度慢、屠宰率和净肉率偏低，满足不了现代肉牛生产规模化发展的要求。因此，对我国地方优良黄牛生长性状的选育势在必行，只有达到了高产与优质相统一，才能使我国的肉牛品种赶超欧美等国的优质肉牛品种。

肉用性状是典型的、具有重要经济价值的数量性状，受环境因素影响较大，用常规育种方法进行育种进展缓慢。20世纪80年代后期以来，国际上的动物遗传育种已经进入分子水平，即分子育种，使育种朝着快速改变动物基因型的方向发展。近几年来，由于分子生物学和各种分子生物技术的发展，使人们又可能直接从遗传物质本身的基础上揭示生物的性状特征，它与基因产物的研究相比克服了年龄、性别、组织及各种内外环境因素的影响，而且所提供的遗传差异，即遗传标记的种类又非常多，如微卫星遗传标记的种类也越来越多，因此，分子育种越来越受到人们的重视。在20世纪90年代中期以后，我国逐渐开展了黄牛肉用性能的分子遗传学研究。采用基因标记等现代分子育种新技术结合常规育种，以便能够加快中国肉牛品种的培育和选育。

SSCP(single strand comformation polymorphism)即单链构象多态性。PCR-SSCP技术是PCR技术和SSCP技术的结合，其原理是变性后的产物在电泳时，空间构象不同的单链DNA会因其迁移率不同而得到分离，从而检测相应的遗传变异。这项技术具有简便、快速、敏感和经济等特点，适用于大样本基因变异情况的筛查。

现代禽畜育种的主要目的就是改善肉牛的肉质或提高肉牛生长速度，如何加快选育进程，提高选择的准确性，是我国育种工作者多年不懈努力和共同追求的目标。而一系列的研究发现PLIN2基因与脂肪的沉积与代谢相关，间接的与体重、胸围等生长性状存在连锁关系，是与能量平衡调控密切相关的重要候选基因。研究该基因的分子遗传基础与经济性状之间的相关性，对于改善我国的肉牛育种工作具有促进作用，也具有潜在的经济价值和重要的科学意义。

PLIN2来源于一组序列相似、可以与脂滴结合的蛋白家族成员。研究人员将已经确定的脂滴包被蛋白(perilipin或PLIN1)、脂肪分化相关蛋白(ADRP或PLIN2)和47kDa的尾连互作蛋白(TIP47或PLIN3)三个成员，取每个蛋白名字的首个字母，统称它们为“PAT”家族蛋白。PAT家族的进化树相当古老，其家族成员存在于许多动物物种中(如青蛙和苍蝇)，甚至在真菌、粘菌中也有它们的身影。该蛋白家族的保守性表明了其在调控细胞内脂肪沉积存储的重要地位。

脂肪细胞分化的过程中，PLIN2蛋白含量及其mRNA含量不断降低。而PLIN1的mRNA含量及其蛋白质含量不断升高。反之，早期的细胞系含有大量PLIN2包被的小脂滴，成熟的细胞含有PLIN1包被的大脂滴。因此，PLIN2和PLIN1通常被认为是脂质包裹蛋白CPATs的基本要素，但在脂肪细胞中PLIN1会和PLIN2竞争与脂滴相结合。但是PLIN1只能分布在有限的组织细胞中(脂肪细胞、类固醇生成的细胞和巨噬细胞)，PLIN2可以在除成熟的人类脂肪细胞外的其他许多积累脂肪的细胞中存在。可见其对前脂肪细胞的早期分化具有重要的作用。

关于动物PLIN2基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，还未见黄牛PLIN2基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前黄牛PLIN2基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如：生长发育性状、肌内脂肪沉积性状)关联的研究成为空白。

发明内容

本发明目的在于提供一种黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以加快黄牛良种繁育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括以下步骤：

(1)以待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PLIN2基因部分序列；

所述的引物对P为：

上游引物P1(SEQ.ID.NO.1)：5’TGATGATGGCTGGTTTACA 3’；

下游引物P2(SEQ.ID.NO.2)：5’TCCAGCCAGGACAGATAGA 3’

(2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型，所述多态性位点为：

在黄牛PLIN2基因第6458位为G或T的碱基多态性位点，表现为GG、GT以及TT三种基因型。

所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，58.7℃退火45s，72℃延伸60s，34个循环；最后72℃延伸10min。

所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10％的聚丙烯酰胺凝胶。

所述变性处理包括以下步骤：取4μL PCR扩增产物与6μL SSCP变性剂混合，然后于98℃变性10min，然后再冰浴5min。

黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，包括引物对P，所述的引物对P为：

上游引物P1(SEQ.ID.NO.1)：5’TGATGATGGCTGGTTTACA 3’；

下游引物P2(SEQ.ID.NO.2)：5’TCCAGCCAGGACAGATAGA 3’

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过设计特定的PCR引物扩增片段，运用SSCP方法并结合DNA测序方法，简单、快速、低成本、精确的检测其单核苷酸的多态性，为PLIN2基因的SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛血样基因组DNA电泳检测图。

图2为黄牛PLIN2基因第6外显子176bp PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为黄牛PLIN2基因第6外显子176bp PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PLIN2基因多态性的电泳结果图；泳道1、2、4、6、8为GG基因型个体；泳道3为GT基因型个体；泳道5、7为TT基因型个体。

图4为黄牛PLIN2基因SNP的不同基因型测序峰图，箭头所指代表PLIN2基因第6458位SNP的位置及不同的基因型表现。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明以PLIN2基因保守序列设计引物扩增PLIN2基因第6外显子176bp片段，分别以4种黄牛品种的基因组为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经SSCP分析和测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得PLIN2基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的黄牛种群提供依据。

a、黄牛PLIN2基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测

1、黄牛血样的采集及处理

取黄牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了4个黄牛品种，具体如表1所示。

表1 黄牛样品来源表

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

(11)5℃保温10h左右；

(12)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次；

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

(15)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、基因组DNA的电泳检测

用1％的琼脂糖对部分黄牛血样DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，从图中可以看出黄牛基因组DNA的质量非常高，可用于下一步扩增。

4、PCR扩增引物设计

从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得牛的GenBank登录号为：NC_007300的PLIN2基因DNA序列，以该基因序列保守区序列为参考利用Primer Premier5.0设计黄牛PLIN2基因第6外显子176bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物P1：5’TGATGATGGCTGGTTTACA 3’；

下游引物P2：5’TCCAGCCAGGACAGATAGA 3’。

5、PCR扩增黄牛PLIN2基因

分别以4个黄牛品种的DNA为模版，用设计的特定引物P1、P2进行PCR扩增，PCR总反应体系为15μL，见表2；PCR总反应程序，见表3。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

6、PCR扩增产物的电泳检测

用1％的琼脂糖对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2，从图2中可以看出扩增产物的质量非常高，可用作下一步分析。

7、PCR-SSCP分析

(1)变性：取4μL PCR产物与6μL变性剂(如甲酰胺、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、甘油、0.025％二甲苯青或0.025％溴酚蓝等)混合，98℃变性10min，取出后迅速置于准备好的碎冰中，保证至少5min后开始点样。

(2)电泳：开始10min 300～400V高压电泳，然后140～200V电泳14h左右。

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：根据图像人工初步判断基因型，经过测序后最终判断基因型。当PLIN2基因第6458位发生G>T突变时，由于黄牛为2倍体动物，所以当发生G>T的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为GG、GT、TT，其SSCP凝胶检测的结果如图3所示：其中，GG型表现为下一条带；TT型表现为上一条带；杂合子GT型表现为上下结合的两条带。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

根据条带的类型，如图3所示的凝胶电泳检测结果能够基本判定是否发生了点突变，再结合如图4所示的DNA测序结果，就可以确定是否发生了突变，从而检测其SNP多态性。

b、黄牛PLIN2基因第6458位的SNP作为分子标记在不同黄牛群体多态性中的应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对郏县红牛374份DNA样品、南阳牛271份DNA样品、秦川牛115份DNA样品和鲁西牛60份DNA样品，分别进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率以及与性状的关联情况。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4 黄牛PLIN2基因第6458位SNP基因频率分布表

从表4可以看出:郏县红牛、南阳牛、秦川牛和鲁西牛的G等位基因频率远高于T等位基因，这表明等位基因可能GG可能是优势基因型。

3、基因效应的关联分析

基因型数据：基因型GG、GT和TT

生产数据：体尺数据(体长、体高、胸围、管围)

关联分析模型：

利用SPSS(17.0)软件分析基因位点、公畜、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+Age_m+X_n+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；Age_m为年龄效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应,如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(17.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验。

结果表明(见表5～表7)：对于第6458位的SNP位点，GG基因型为优势基因型；对于体重、体高、体长和胸围，GG基因型个体的数值显著高于GT基因型个体或TT基因型个体，这说明GG基因型可以成为一个提高黄牛生长性状育种速度的分子遗传标记。

表5 第6458位多态位点与郏县红牛体尺之间的方差分析

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表6 第6458位多态位点与秦川牛体尺之间的方差分析

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表7 第6458位多态位点与南阳牛体尺之间的方差分析

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)。

Claims

1.黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

所述的引物对P为：

上游引物P1：5’TGATGATGGCTGGTTTACA3’；

下游引物P2：5’TCCAGCCAGGACAGATAGA3’

(2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型，所述多态性位点为扩增产物5’GTTCTAGAGTGAACTTG 3’序列段中第9位为G或T的碱基多态性位点，表现为GG、GT以及TT三种基因型。

2.如权利要求1所述黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，58.7℃退火45s，72℃延伸60s，34个循环；最后72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10％的聚丙烯酰胺凝胶。

4.如权利要求1所述黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述变性处理包括以下步骤：取4μL PCR扩增产物与6μL SSCP变性剂混合，然后于98℃变性10min，然后再冰浴5min。

5.黄牛PLIN2基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，其特征在于：包括引物对P，所述的引物对P为：

上游引物P1：5’TGATGATGGCTGGTTTACA3’；

下游引物P2：5’TCCAGCCAGGACAGATAGA3’。