CN110643716A - 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记应用。其中该分子标记表现为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的C/G突变多态性。本发明的分子标记与绵羊尾脂重紧密相关，可用于瘦尾型绵羊的育种和低脂型优质肉羊新品种的培育，为绵羊肉质的遗传改良提供了基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

Description

一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子标记制备技术领域，具体涉及与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用。
背景技术
绵羊是最早被驯化的草食家畜,在漫长的驯化过程中,动物的行为习惯、体型外貌以及重要经济性状因受到自然选择和强烈的人工选择而发生巨大变化(甘尚权,张伟,沈敏,等.绵羊X染色体59383635位点多态性与脂尾性状的相关性分析[J].遗传，2013,35(10):1209-1216.)。绵羊的脂尾和瘦尾是由环境和基因共同决定的复杂性状，而尾部脂肪沉积又与尾部脂肪组织中脂肪间质干细胞的增殖与成脂分化相关(杨敏，韩吉龙，刘建斌,等.绵羊尾部脂肪沉积基因定位及细胞生物学机制研究进展.[J]中国畜牧杂志.2018，54(6)：23-29.)。研究表明，野生绵羊最早属于瘦尾羊，但由于人工驯化和自然选择，瘦尾羊部分进化为脂尾型绵羊。脂尾型绵羊分布较广，全世界约有超过25％的绵羊品种属于脂尾(臀)型绵羊品种(Moradi M H,Nejati-Javaremi A,Moradi-Shahrbabak M,et al.Genomicscan of selective sweeps in thin and fat tail sheep breeds for identifying ofcandidate regions associated with fat deposition[J].BMC Genetics,2012,13(1):10.)；中国绵羊品种中约有80％为脂尾型绵羊(Wei C,Wang H,Liu G,et al.Genome-wideanalysis reveals population structure and selection in Chinese indigenoussheep breeds[J].BMC Genomics,2015,16(1):194.)，其中是以小尾寒羊、蒙古羊等为代表的蒙古系羊和以哈萨克羊为代表的哈萨克系羊为主。这些品种的绵羊具有较强的脂肪沉积能力，其主要特征是尾臀部充满大量脂肪，而脂肪是机体储存能量的主要方式。绵羊在水草丰美的夏季，大量沉积体内脂肪，以便在寒冬枯草季节利用其脂肪维持机体的新陈代谢需要得以“保命”。但近年来随着人们生活水平的不断提高，长期摄入高脂肪食物所引起的心脑血管疾病越来越受到人们的关注，高脂肉类逐渐受到冷落,脂尾型绵羊品种也越来越不受消费者欢迎。此外牧民定居点不断扩建、牧草种植等配套设施不断完善，尾脂的“保命”作用也已不值一提。而且从饲养成本考虑,生产1kg脂肪消耗的饲草可产生2kg瘦肉，显然过多的尾脂沉积也会加大饲养成本。因此在肉羊生产实践中，通过遗传改良减少绵羊尾部脂肪沉积是提高生产效益的有效途径，对低脂肉用型绵羊的培育具有重要的理论价值与实际意义。
本发明通过对绵羊13号染色体进行研究，寻找多态性位点并进行分型，探讨其不同基因型与绵羊尾脂重的关联性，旨在为绵羊肉质的遗传改良方面提供基因素材，加速我国自主知识产权的低脂型优质肉羊新品种的培育进程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用。
本发明基于全基因组重测序数据，使用两组间的遗传分化系数(Fst)检测尾脂选择信号，将Fst值较大的染色体区作为受选择的候选区域，结果发现在绵羊13号染色体48905555-49105512区域的Fst值较大，因此对其部分DNA序列进行PCR扩增和序列分析，发现在13号染色体第48979196位存在一个C/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对对570只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与尾脂重进行关联分析，最终确定了本发明扩增的片段可以作为与绵羊尾脂重相关的分子标记。
本发明的分子标记可用于瘦尾型绵羊的育种和低脂型优质肉羊新品种的培育，为绵羊肉质的遗传改良提供了基因工程手段，具有重大的实际应用价值。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
一方面，本发明提供了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，该分子标记通过对绵羊13号染色体48905555-49105512区域的部分DNA序列进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ACAAAGAGTCGGACATGACAGAACAACATGCTTTGAGTCACTTCTCTGCCTATCTTGCTGTGTAAATATATCCCAAAGTAACAACGATCACATGAAGACAATCCATTTTCTTCTATTTCTCTATTTTTGGCATAGAATCCAGGACAATTAATCAGAGAAGAGGAGTGTTGCACTGSCTTGACCTAAAACAATGGGGAGGGAGAGCATACAGTTCTCAGAAACCTCTTTGTCAATGGTAGATATTGGCCCCATGAGGGGACATCATGTCCCCATTTTCTTGGATTTCTCTATTTTTGGCATAGAATCCAGGACAATCAATCAGAGAAGAGGAGTGTTGCACTGGCTTGACCTAAAACAATGGGGAGGGAGAGCATACAGTTCTCAGAAACCTCTTTGTCAATGGTAGTTATTGGTCTCATGAGGGAACATGATGTCTCGGCCACAAGTGTGGCATTATACAAGGTAAATCAGCATAGGATAGGAGGAGATAATGCCTTCAAACTGGTCCTGGATCAGGTGGTGATGGTGTGGCTTGGTTCACAGTGAGAGCAAGCAGAGTGGCTCTCCTTGCCTCAGGGAAACAGAATGGAAGTCTTGACTGAAGTCCAACCCGCCCTCACCTCAGCCTCCTACACTGGTGTTTCCTTGTCAAGTGGAGATAGTGTTCATTGGGATCTGATGACAATTTATTTGCAATGGAATTATATTTCCTCTGAGATATTTTTCTTAAGTGCAGATTATATATACCATTTCTGTGATGTTTCTTTCTTGAACAGCTAATTAAGCAACAAGTTTTAACTCAAATTCTAGAAGCATATCCTATGAAGTTGCTCAAAATTGATTCATTGACAAAGTCAAACACAGTTAGGCCAAAATTA，其中S表示C或G，由于上述序列在第176位碱基处有一个C/G碱基突变，从而导致了绵羊13号染色体第48979196位碱基的C/G多态性。
第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：
正向引物M-F：5＇-ACAAAGAGTCGGACATGACA-3＇(SEQ ID NO:2)；
反向引物M-R：5＇-TAATTTTGGCCTAACTGTGT-3＇(SEQ ID NO:3)。
此外，本发明的引物对可以为KASPar引物对，优选地，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：
用于检测AlleleC的正向引物A1：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGAGGAGTGTTGCAC TGC(SEQ ID NO:4)；
用于检测AlleleG的正向引物A2:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGAGGAGTGTTGCA CTGG(SEQ ID NO:5)；
通用反向引物C：CTGTATGCTCTCCCTCCCCATTG(SEQ ID NO:6)。
第三方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了本发明第二方面的引物对或KASPar引物对。
第四方面，本发明提供了一种检测与绵羊尾脂重相关的分子标记的方法，所述分子标记如SEQ ID NO:1所示，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊13号染色体第176位碱基进行检测，具体的，本发明的检测方法包括如下步骤:
a)使用本发明的引物对、KASPar引物对或者包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA或cDNA进行扩增；
b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。
其中，在步骤b)中，任何SNP分型方法均可适用于对本发明中分子标记的检测，上述SNP分型的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
在本发明的分子标记序列和多态性位点已知的情况下，针对该多态性位点设计相应的探针，以及利用上述SNP分型方法进行对分子标记和多态性位点进行检测均属于本领域中较为常规且成熟的技术，针对该多态性位点设计的探针也可包含于本发明的第三方面的试剂盒中。
更为具体的，本发明中利用上述引物对检测与绵羊尾脂重相关分子标记的方法，包括如下步骤：
a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对绵羊13号染色体第48979196位碱基进行PCR扩增，
b)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。
此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊尾脂重相关分子标记的方法，包括如下步骤：
a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO:4-6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；
b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
第五方面，本发明提供了上述分子标记、引物对、试剂盒或检测方法在在绵羊尾脂重检测中的应用，通过使用上述引物对、试剂盒或检测方法对待测绵羊的13号染色体第48979196位碱基进行检测，并分析多态性的类型，从而可以确定待测绵羊属于高脂型还是低脂型。
第六方面，本发明提供了上述分子标记、引物对、试剂盒或检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对13号染色体第48979196位碱基进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育中低脂型绵羊品种。
寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对绵羊13号染色体第48979196位碱基进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第176位存在一个C/G多态性位点，并通过检测570只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，该分子标记可以用于低脂型绵羊的选育和低脂型优质肉羊新品种的培育，具有重大的实际应用价值。
本发明通过设计KASPar引物对分子标记进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针法金标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。
需说明的是，本发明的与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用具有如下优点：
(1)本发明提供的与绵羊尾脂重相关的分子标记，可用于低脂型优质肉羊的选育，可加速选育进程；
(2)本发明所提供的一种检测与绵羊尾脂重相关的分子标记的方法，准确可靠，操作方便。
附图说明
图1.本发明中用于作为分子标记的绵羊13号染色体48905555-49105512区域的凝胶电泳图。其中，1-10泳道：部分DNA序列扩增结果；M泳道：DL 2000Marker。
图2.本发明中绵羊13号染色体第48979196位碱基突变测序结果。
图3.本发明中绵羊13号染色体第48979196位碱基g.176C>G突变位点KASPar SNP分型结果。其中，靠近左侧的红色圆点表示GG基因型，靠近中间的绿色点表示GC基因型，靠近右侧的蓝点表示CC基因型。
具体实施方式
下面结合实施例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。
实施例1 13号染色体第48979196位碱基的扩增
(1)引物设计
以绵羊13号染色体48905555-49105512区域的DNA为模板，利用Oligo 7.0软件设计一对引物M-F和M-R，引物序列如下
正向引物M-F：5＇-ACAAAGAGTCGGACATGACA-3＇(SEQ ID NO:2)；
反向引物M-R：5＇-TAATTTTGGCCTAACTGTGT-3＇(SEQ ID NO:3)。
(2)绵羊13号染色体48979196位碱基的扩增和测序
PCR反应总体积25μL，其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix12.5μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ddH2O 10μL。PCR扩增程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，63.7℃退火30s，72℃延伸30s，变性到延伸步骤循环35次，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到878bp的特异扩增片段，结果如图1所示。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序结果发现在该878bp片段中存在一个多态性位点，即绵羊13号染色体第48979196位点存在C/G多态性(图2)。
(3)DNA序列同源性检索鉴定：
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊13号染色体48905555-49105512区域的部分序列同源性达99％。
实施例2、基因分型检测方法的建立
(1)KASPar引物序列设计
针对实施例1扩增片段的C/G多态性位点设计KASPar引物对，从而用于所述多态性位点的特异性检测，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：
用于检测AlleleC的正向引物A1：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGAGGAGTGTTGCACTGC(SEQ ID NO:4)；
用于检测AlleleG的正向引物A2:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGAGGAGTGTTGCACTGG(SEQ ID NO:5)；
通用反向引物C：CTGTATGCTCTCCCTCCCCATTG(SEQ ID NO:6)。
以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30(引物A1：引物A2：引物C)的比例混匀备用。
(2)DNA质控
通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对提取得到的基因组DNA的质量进行检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8～2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8～2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA浓度成为10～20ng/μL备用。
(3)基因分型
首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.0μL和空白对照(No template control,NTC)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(LGC公司，KBS-1016-002)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜,利用Hydrocycler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：
94℃预变性，15分钟；
94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；
94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。
扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“GC”或“CG”；粉色圆点表示分型失败；黑色圆点表示NTC，即为水对照。
(4)本发明的分子标记在绵羊尾脂重性状关联分析中的应用
试验共检测了570只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与尾脂重的关联分析。
Yijl＝μ+Genotypei+Pj+Combinationl+εijl
其中，Yijl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Pj为批次效应，Combinationl为组合的效应，εijl为随机误差，假定εijl相互独立，服从N(0，σ2)分布。
基因型检测结果表明在570个个体中，CC基因型有16个，GC基因型有138个个体，GG基因型有401个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，结果显示，g.176C>G突变位点与湖羊尾脂重显著关联。其中GG基因型个体的尾脂重极显著高于CC型个体和GC型个体(P<0.01)。CC型个体与GC型个体间的差异不显著，随着C等位基因数的增加其个体尾脂重减小，由此可知C等位基因为优势等位基因。
表1绵羊13号染色体48979196位碱基多态性与尾脂重关联分析
Figure BDA0002238536970000121
注：同列数据间角标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
序 列 表
<110> 甘肃农业大学
<120> 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用
<130> 12
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 878
<212> DNA
<213> 绵羊
<400> 1
acaaagagtc ggacatgaca gaacaacatg ctttgagtca cttctctgcc tatcttgctg 60
tgtaaatata tcccaaagta acaacgatca catgaagaca atccattttc ttctatttct 120
ctatttttgg catagaatcc aggacaatta atcagagaag aggagtgttg cactgscttg 180
acctaaaaca atggggaggg agagcataca gttctcagaa acctctttgt caatggtaga 240
tattggcccc atgaggggac atcatgtccc cattttcttg gatttctcta tttttggcat 300
agaatccagg acaatcaatc agagaagagg agtgttgcac tggcttgacc taaaacaatg 360
gggagggaga gcatacagtt ctcagaaacc tctttgtcaa tggtagttat tggtctcatg 420
agggaacatg atgtctcggc cacaagtgtg gcattataca aggtaaatca gcataggata 480
ggaggagata atgccttcaa actggtcctg gatcaggtgg tgatggtgtg gcttggttca 540
cagtgagagc aagcagagtg gctctccttg cctcagggaa acagaatgga agtcttgact 600
gaagtccaac ccgccctcac ctcagcctcc tacactggtg tttccttgtc aagtggagat 660
agtgttcatt gggatctgat gacaatttat ttgcaatgga attatatttc ctctgagata 720
tttttcttaa gtgcagatta tatataccat ttctgtgatg tttctttctt gaacagctaa 780
ttaagcaaca agttttaact caaattctag aagcatatcc tatgaagttg ctcaaaattg 840
attcattgac aaagtcaaac acagttaggc caaaatta 878
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acaaagagtc ggacatgaca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taattttggc ctaactgtgt 20
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tgagaagagg agtgttgcac tgc 43
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgagaagagg agtgttgcac tgg 43
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgtatgctc tccctcccca ttg 23

Claims (10)

1.一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其中第176bp处的S是C或G，该突变导致分子标记的C/G多态性。
2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，所述KASPar引物对中：
用于检测Allele C的正向引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测AlleleG的正向引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，通用反向引物C的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的引物对。
5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：
a)使用权利要求2或3所述的引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊基因组DNA或cDNA进行扩增；
b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述鉴定方法可选自测序法、荧光探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。
8.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊尾脂重检测中的应用。
9.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述育种为培育低脂型绵羊。
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