CN117230210A - 一种与奶牛乳成分性状相关基因ldha的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与奶牛乳成分性状相关基因LDHA的SNP分子标记及其应用。本发明提供了用于检测SNP1位点g.26304153G>A的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用。本发明的实验证明，本发明通过对奶牛关联群体中LDHA基因的遗传变异分析，发现1个SNP，SNP1位于奶牛基因组中与乳成分性状相关的基因LDHA基因中，即序列表SEQ ID No.1的第794位。在本发明的实施例中SNP1位点的优势等位基因为A，说明SNP1位点可用于奶牛分子标记辅助选择育种和高乳成分性状奶牛品种的选育。

Description

一种与奶牛乳成分性状相关基因LDHA的SNP分子标记及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种与奶牛乳成分性状相关基因LDHA的SNP分子标记及其应用。

背景技术

LDHA基因位于牛29号染色体上，有8个外显子，基因全长9583bp，该基因编码的蛋白属于乳酸脱氢酶家族，乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解代谢的关键调控酶，主要作用是催化乳酸氧化为丙酮酸，将氢转移给NAD成为NADH。糖酵解代谢发生在几乎所有的生物中，是所有生物细胞糖代谢过程的第一步，是把葡萄糖转化成丙酮酸的代谢途径，共有10个步骤酶促反应的确定序列。在高等脊椎动物中，LDH是由3种亚基构成的四聚体。其中，M亚基由LDHA基因编码，主要在骨骼肌中大量表达，LDHA主要催化丙酮酸生成乳酸，伴随着还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidereduced，NADH)转化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，

有研究发现LDHA mRNA和蛋白在牦牛骨骼肌中的表达逐渐下降，而LDHB mRNA和蛋白在高海拔牦牛中表达最高，暗示了LDHA基因转录受到低氧诱导因子的调节并推测牦牛骨骼肌低氧适应性与该基因有关。并且有研究表明，LDH在多种恶性肿瘤细胞中高表达并可作为恶性肿瘤的预后标志分子之一。敲除LDHA可明显抑制肿瘤细胞对乏氧的耐受，动物实验证明敲除LDHA表达的荷瘤小鼠(实验组)比正常荷瘤小鼠(对照组)存活时间更长。大量研究也表明LDHA在肿瘤的代谢、发展、侵袭和患者预后中起重要作用。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。

发明内容

本发明的目的是提供一种与奶牛乳成分性状相关基因LDHA的SNP分子标记及其应用。

第一方面，本发明提供了用于检测SNP1位点g.26304153G>A的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用。

上述应用中，所述用于检测SNP1位点g.26304153G>A的多态性或基因型的物质，可为通过下述至少一种方法确定上述奶牛基因组中SNP1位点的核苷酸种类：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

上述SNP1位点g.26304153G>A为序列表SEQ ID No.1的第794位，其多态性为T或C，其基因型为GG、AA或GA。

进一步地，所述用于检测SNP1位点g.26304153G>A的多态性或基因型的物质，可为如下D1)、D2)或D3)：

D1)含有扩增包括所述SNP1位点在内的奶牛基因组DNA片段的PCR引物；

D2)含有D1)所述PCR引物的PCR试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

上述PCR引物为下面第六方面中的引物对2。

上述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如³²P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

第二方面，本发明提供了SNP1位点g.26304153G>A作为检测靶标在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用；

或，SNP1位点g.26304153G>A作为检测靶标在开发鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状产品中的应用。

上文所述应用中，所述产奶性状为产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量。

第三方面，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的方法，包括如下步骤：检测供试奶牛LDHA基因中SNP1位点g.26304153G>A的基因型；所述SNP1位点g.26304153G>A的基因型为AA或GA或GG；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG的供试奶牛的乳脂量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA或GA的供试奶牛；所述乳脂量为泌乳期1的乳脂量；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛的产奶量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA的供试奶牛；所述产奶量为泌乳期2的产奶量；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛的乳脂量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA的供试奶牛；所述乳脂量为泌乳期2的乳脂量；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛的乳蛋白量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA的供试奶牛；所述乳蛋白量为泌乳期2的乳蛋白量。

第四方面，本发明提供了第三方面所述方法在奶牛筛选或奶牛育种中的应用。

上文所述应用中，选取第三方面中SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛用于产奶或育种；

所述。

第五方面，本发明提供了一种奶牛育种的方法，包括如下步骤：

根据第三方面所述方法中的步骤鉴定各个SNP位点的基因型，选取SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛用于产奶或育种。

第六方面，本发明提供了引物对2；

所述引物对2为引物2F和引物2R组成的引物对；

所述引物2F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子或将SEQ ID No.2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与SEQ ID No.2具有相同功能的核苷酸；

所述引物2R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子或将SEQ ID No.3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与SEQ ID No.3具有相同功能的核苷酸。

第七方面，本发明提供了第六方面所述引物对中任一一种或引物组合的应用，为如下(a)-(f)中任一种：

(a)鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状；

(b)奶牛筛选；

(c)奶牛育种；

(d)制备用于鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的产品；

(e)制备奶牛筛选的产品；

(f)制备奶牛育种的产品。

上文所述奶牛育种为培育高乳成分的奶牛品种。

上文所述乳成分具体可为乳脂量、乳蛋白量和/或产奶量。

上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测奶牛基因组中SNP1位点的多态性或基因型的物质。

本发明的实验证明，本发明通过对奶牛关联群体中LDHA基因的遗传变异分析，发现1个SNP，SNP1位于奶牛基因组中与乳成分性状相关的基因LDHA基因中，即序列表SEQ IDNo.1的第794位。在本发明的实施例中SNP1位点的优势等位基因为A，说明SNP1位点可用于奶牛分子标记辅助选择育种和高乳成分性状奶牛品种的选育。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的中国荷斯坦母牛来自北京首农畜牧发展有限公司。

实施例中的产奶量为个体305天产奶量，指自母牛产犊第一天开始到第305天为止的产奶总量。当实际挤奶天数不足305天时，以实际产奶量作为305天产奶量；当实际挤奶天数超出305天，306天以后的产奶量不计在内。产奶量由每月DHI(DHI，Dairy HerdImprovement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上DHI数据绘制产奶量泌乳曲线计算可得该泌乳期305天产奶量。

实施例中的乳脂量指的是305天乳脂量，305天乳脂量＝乳脂率×305天产奶量。乳脂率由每月DHI(DHI，Dairy Herd Improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上DHI数据绘制乳脂率泌乳曲线计算可得该泌乳期平均乳脂率。

实施例中的乳蛋白量指的是305天乳蛋白量，305天乳蛋白量＝乳蛋白率×305天产奶量。乳蛋白率由每月DHI(DHI，Dairy Herd Improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上DHI数据绘制乳蛋白率泌乳曲线计算可得该泌乳期平均乳蛋白率。

泌乳期1指的是第一次分娩后的泌乳期。泌乳期2指的是第二次分娩后的泌乳期。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、分子标记的发现

一、相关基础研究

发明人所在课题组基于iTRAQ技术对中国荷斯坦牛不同泌乳阶段(干奶期、泌乳初期和泌乳高峰期)的肝脏组织进行蛋白质组分析，一共鉴定到3252个蛋白质(FDR<0.01)，其中差异表达蛋白一共鉴定到905个(P<0.05，FCI>1.2)。发现LDHA基因在干奶期、泌乳初期和泌乳高峰期显著差异表达(P<0.01)，在糖酵解过程中参与丙酮酸催化为乳酸的反应，糖异生前体(乳酸)的变化可能影响脂肪的合成。

二、基因多态性检测

1、选择45头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体。将45头公牛冻精DNA随机混成2个DNA池，每个混池由22-23个冻精DNA基因组样品组成，利用核酸质量检测仪准确测定DNA的浓度，并将这些DNA均稀释成浓度为50ng/μL，并用于PCR扩增。

2、根据牛LDHA基因序列如SEQ ID No.1所示(Ensembl ID为ENSBTAG00000008683)，设计如表1的18对引物。

表1为LDHA基因PCR扩增引物序列信息

3、以步骤1得到的池DNA为模板，分别采用各引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系见表2，PCR反应条件见表3。

表2为PCR反应体系

表3为PCR反应条件

4、将PCR扩增产物进行测序。结果发现，母牛群体LDHA基因在上游2000bp的侧翼序列中存在1个SNP标记(称为SNP1)。该SNP标记见表4。

表4为LDHA基因发现的1个SNP

基因位置	名称	SNPs	物理位置	多态形式
					5'调控区	SNP1	g.26304153G>A	Chr13:44595327bp	T/C

其中，SNP1对应于g.26304153G>A，是采用2F和2R组成的引物对进行PCR扩增得到的产物进行测序分析获得的(该PCR扩增产物如SEQ ID No.1的第437-818位所示)，其核苷酸为T或C，对应序列表中SEQ ID No.1自5’末端起第794位。序列表中SEQ ID No.1的Y表示T或C。

g.26304153G>A为SNP1的命名，SNP的命名一般根据第一次发现该SNP时的规律进行命名。DNA为双链结构且遵循碱基互补配对原则，本发明中的SEQ ID No.1与发现SNP1时的序列互为同一双链DNA的反向互补链。因此，本发明中g.26304153G>A的多态形式为T或C。

三、关联分析

(一)、获得供试群体

供试群体由926头中国荷斯坦牛母牛组成。

(二)、进行基因型分型

供试群体中的每个个体，分别进行基因型分型。

基于g.26304153G>A的基因型分型。

1、取供试个体的血液，提取基因组DNA。

2、以基因组DNA为模板，采用2F(如SEQ ID No.1的第437-456位所示)和2R(与SEQID No.1的第799-818位反向互补)组成的引物对进行PCR扩增，然后回收PCR扩增产物并进行测序。

PCR扩增的反应体系见表5。PCR扩增的反应条件见表6。

各个供试个体的PCR扩增产物均为382bp，其中第358位为g.26304153G>A，即SNP1(对应序列表中SEQ ID No.1自5’末端起第794位)。

表5为反应体系

表6为反应条件

(三)、检测产奶性状

供试群体中的每头牛，分别进行产奶性状性状检测。

产奶性状包括如下五个指标：产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率。

每个个体的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、祖父号、祖母号、外祖父号、外祖母号、出生日期、泌乳期、产犊日期、产奶量、乳脂量和乳蛋白量。

(四)、单个SNP位点与性状的关联分析模型

SNP1位点(即LDHA基因g.26304153G>A)的基因型与产奶性状表型如表7、表8和表9所示。

表7为926头中国荷斯坦牛母牛(部分)的产奶性状表型和SNP1位点的基因型

表8为926头中国荷斯坦牛母牛群体的5个产奶性状表型值描述性统计

性状	平均值	标准差	最小值	最大值	变异系数
						产奶量(kg)	8140.1308	1467.7241	12536.4375	3721.4801	0.1803
乳脂量(kg)	304.0847	72.2922	562.4322	98.5694	0.2377
						乳脂率(％)	3.7679	0.7615	6.9700	2.0000	0.2021
乳蛋白量(kg)	257.0603	46.0290	398.1886	114.1625	0.1791
						乳蛋白率(％)	3.1691	0.2591	4.0100	2.3400	0.0817

表9为LDHA基因SNP位点的等位基因频率、基因型频率

SNP1位点有3种基因型(简称SNP1基因型)，即GG、AA或GA，基因型GG是SNP1为G的纯合型，基因型AA是SNP1为A的纯合型，基因型GA是SNP1为G和A的杂合型。

采用SAS 9.4软件中的MIXED过程对产奶性状的五个指标和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：

Y＝μ+hys+b×M+G+a+e

其中，Y：产奶性状(产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值；μ：总体均值；hys：场年季效应；b：协变量M的回归系数；M：产犊月龄效应；G：基因型效应；a：个体随机加性遗传效应；e：随机残差效应。

SNP1位点(即LDHA基因g.26304153G>A)与产奶性状关联分析结果见表10。泌乳期1产奶的奶牛头数是926头，泌乳期2产奶的奶牛头数是632头。

表10为LDHA基因g.26304153G>A与产奶性状关联分析(最小二乘均值±标准误)

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注：^*P<0.05，表示差异显著；^**P<0.01，表示差异极显著。^a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；^A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。

由表10所得，在第一泌乳期时，SNP1与乳脂量达到极显著关联水平(P＝0.0155～P＝0.0001)。

在第二泌乳期时，该SNP位点与产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到极显著关联水平(P＝0.0159至P＝0.0015)。

对于SNP1，即LDHA基因g.26304153G>A，GG基因型母牛的乳脂量高于GA或AA基因型母牛，AA基因型母牛的乳脂量与GA基因型母牛无显著差异。所述乳脂量为泌乳期1的乳脂量。

对于SNP1，即LDHA基因g.26304153G>A，GG基因型母牛的产奶量高于AA基因型母牛，GA基因型母牛的产奶量高于AA基因型母牛。所述产奶量为泌乳期2的产奶量。

对于SNP1，即LDHA基因g.26304153G>A，GG基因型母牛的乳脂量高于AA基因型母牛，GA基因型母牛的乳脂量高于AA基因型母牛，GG基因型母牛的乳脂量与GA基因型母牛无显著差异。所述乳脂量为泌乳期2的乳脂量。

对于SNP1，即LDHA基因g.26304153G>A，GG基因型母牛的乳蛋白量高于AA基因型母牛，GA基因型母牛的乳蛋白量高于AA基因型母牛，GG基因型母牛的乳蛋白量与GA基因型母牛无显著差异。所述乳蛋白量为泌乳期2的乳蛋白量。

(五)、遗传效应分析

利用SAS9.4软件进行SNP加性效应、显性效应及替代效应显著性检验。

基本计算公式如下：

a＝(AA-BB)/2，d＝AB-(AA+BB)/2，α＝a+d(q-p)；a为加性效应，d为显性效应，α为等位基因替代效应；AA、AB、BB为相应基因型产奶性状最小二乘均值；p为等位基因A的频率，q为等位基因B的频率。

加性效应、显性效应和等位基因替代效应检验结果如表11所示。

表11为LDHA基因等位基因加性效应、显性效应和替代效应检验结果

注：^*P<0.05，表示差异显著；^**P<0.01，表示差异极显著。

对于第一泌乳期数据：该SNP位点的加性效应、等位基因显性效应和等位基因替代效应主要体现在乳脂量性状上，SNP1(g.26304153G>A)位点对乳脂量的等位基因等位基因替代效应达到显著或极显著，即每个A等位基因替代G等位基因会导致乳脂量减少7.7524kg(P＜0.01)。

对于第二泌乳期数据：该SNP位点的加性效应、等位基因显性效应和等位基因替代效应主要体现在乳脂量、乳脂率和乳蛋白量性状上，SNP1(g.26304153G>A)位点对产奶量的等位基因加性效应和等位基因替代效应、乳脂量的等位基因加性效应和等位基因替代效应和乳蛋白量的等位基因加性效应和等位基因替代效应达到显著或极显著，即每个A等位基因替代G等位基因会导致产奶量减少222.87kg(P＜0.01)、乳脂量减少6.9202kg(P＜0.01)、乳蛋白量减少5.2527kg(P＜0.01)。

本发明公开的分子标记可以应用于辅助鉴定具有优良乳成分性状(乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率)的奶牛群体，具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.用于检测SNP1位点g.26304153G>A的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用。

2.SNP1位点g.26304153G>A作为检测靶标在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用；

或，SNP1位点g.26304153G>A作为检测靶标在开发鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状产品中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产奶性状为产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量。

4.一种鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的方法，包括如下步骤：检测供试奶牛LDHA基因中SNP1位点g.26304153G>A的基因型；所述SNP1位点g.26304153G>A的基因型为AA或GA或GG；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG的供试奶牛的乳脂量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA或GA的供试奶牛；所述乳脂量为泌乳期1的乳脂量；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛的产奶量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA的供试奶牛；所述产奶量为泌乳期2的产奶量；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛的乳脂量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA的供试奶牛；所述乳脂量为泌乳期2的乳脂量；

所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛的乳蛋白量优于或辅助优于所述SNP1位点g.26304153G>A基因型为AA的供试奶牛；所述乳蛋白量为泌乳期2的乳蛋白量。

5.权利要求4所述方法在奶牛筛选或奶牛育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述应用中，选取权利要求4中SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛用于产奶或育种。

7.一种奶牛育种的方法，包括如下步骤：

根据权利要求4所述方法中的步骤鉴定各个SNP位点的基因型，选取SNP1位点g.26304153G>A基因型为GG或GA的供试奶牛用于产奶或育种。

8.引物对2；

所述引物对2为引物2F和引物2R组成的引物对；

所述引物2F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子或将SEQ ID No.2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与SEQ ID No.2具有相同功能的核苷酸；

所述引物2R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子或将SEQ ID No.3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与SEQ ID No.3具有相同功能的核苷酸。

9.权利要求8所述引物对中任一一种或引物组合的应用，为如下(a)-(f)中任一种：

(a)鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状；

(b)奶牛筛选；

(c)奶牛育种；

(d)制备用于鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的产品；

(e)制备奶牛筛选的产品；

(f)制备奶牛育种的产品。