CN115029444A

CN115029444A - 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN115029444A
Application number: CN202111681940.8A
Authority: CN
Inventors: 张小雪; 李文馨; 汪晓娟; 王维民; 李发弟; 张德印
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-09-09

Abstract

本发明提供了一种与绵羊生长性状相关的分子标记，以及该分子标记的检测方法和应用。通过对绵羊PRKAA2基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段上存在一个G/A多态性位点，进一步使用KASPar引物对1128只湖羊和77只杜泊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与生长性状进行关联分析，最终确定了PRKAA2基因中如SEQ ID NO.1所示的序列及其多态性位点作为与绵羊生长性状相关的分子标记。本发明通过检测分子标记，可用于选留基因为AA纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的生长性状，有助于提高生产养殖业的经济效益。

Description

一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记制备及应用技术领域，具体涉及PRKAA2基因片段作为影响绵羊生长性状的分子标记及其应用。

背景技术

养羊业与国民经济的发展和各族人民生活水平的提高关系密切，特别是近20年来，现有养羊业发展迅速，在国民生产总值中的比重日益增加。据国家统计局数据显示，2017年绵、山羊存栏量达3.02亿只，羊肉产量达471.07万吨，是世界最大的羊肉生产和消费国(张小雪.不同剩余采食量羔羊生产性能和瘤胃微生物区系及肝脏转录组研究[D].兰州大学，2019.)。羊全身是宝，在医疗保健方面，羊更能发挥其独特的作用，具有较高的药用价值。绵羊是肉、奶制品和羊毛的重要来源，在全球农业经济中起着至关重要的作用。其中，体重和体型是绵羊产业的关键特征(Tao L，XY He，Pan L X，et al.Genome-wideassociation study of body weight and conformation traits in neonatal sheep[J].Animal Genetics，2020.)。因此，在羊的生产实践中，选择具有良好生长性状的羊是至关重要的，长势好增重快可大大节约生产成本。然而，过去的研究中，在羊的体重体型等方面对其潜在的遗传机制了解甚少。

PRKAA2(Protein Kinase AMP-Activated Catalytic Subunit Alpha 2)是一种蛋白质编码基因。该基因编码的蛋白是amp活化蛋白激酶(AMPK)的催化亚基。AMPK是一种异三聚体，由α催化亚基、非催化亚基和γ亚基组成；是一种重要的能量传感酶，可以监测细胞能量状态。在细胞代谢应激的反应中，AMPK被激活，从而磷酸化和失活乙酰辅酶a羧化酶(ACC)和β-羟基-甲基戊二酰辅酶a还原酶(HMGCR)，这些酶参与调节脂肪酸和胆固醇的新生生物合成，在调节细胞能量代谢中起关键作用。对PRKAA2基因(AMPKα2)进行了序列鉴定。共发现43个属间和属内SNP。其中，在水牛品种间检测到17个SNP(属内)。所有的SNP都是内含子的，可能参与基因调控和剪接模式。这些SNP可能与具有重要商业价值的生产性状有关，这是首次发现与水牛能量代谢和生产性状相关的新SNP(Khan W A，Hussain T，Babar M E，et al.Polymorphic Status of PRKAA2 Gene in Pakistani Buffaloes[J].International Journal of Agriculture and Biology，2015，18(5).)。在正常的高加索女性中，PRKAA2的变异与血清脂蛋白显著相关，并且显示AMPK基因亚基的变异与氯氮平和奥氮平激活的体重增加显著相关。该基因也被报道参与调节脂质、糖代谢和蛋白质合成(Khan W A，Hussain T，Babar M E，et al.Polymorphic Status of PRKAA2 Gene inPakistani Buffaloes[J].International Journal of Agriculture and Biology，2015，18(5).)。但是PRKAA2与绵羊的生长性状是否相关，或有什么关联并不清楚。

本发明通过对PRKAA2基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与绵羊生长性状的关联性，旨在为提高绵羊生长性状的遗传改良方面提供基因素材，加速拥有自主知识产权的优质肉羊的培育进程。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种作为与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记是从绵羊PRKAA2基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。通过扩增绵羊PRKAA2基因的DNA序列并测序，寻找PRKAA2基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊生长性状相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于新型优质肉羊新品种的培育中。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种与绵羊生长性状相关的分子标记，该分子标记通过对绵羊PRKAA2基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第200bp位的R表示G或A，由于上述序列在第200位碱基处有一个G/A突变，从而导致了绵羊PRKAA2基因在该位点的G/A多态性。

一种检测上述分子标记的引物对，所述检测上述分子标记的引物对包括正向引物M-F和反向引物M-R，所述M-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。一种检测上述分子标记的KASPar引物对，所述KASPar引物对包括用于检测AlleleC的正向引物A1，用于检测AlleleT的正向引物A2和通用反向引物C，其中，A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，C的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的引物对或KASPar引物对。

一种检测与绵羊生长性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第200bp位的R表示G或A，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA进行检测，具体检测方法包括如下步骤：

a)使用上述的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤b)中，任何SNP分型方法均可适用于本发明中分子标记的检测，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

利用上述引物对检测与绵羊生长性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4-6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

如上述所述的分子标记及其多态性位点、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊生长性状检测中的应用，通过在待测绵羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊的生长性状的高低，进而筛选出新型绵羊。

如上所述的分子标记及其多态性位点、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的PRKAA2基因的基因型，从而可以从中选育出快速增重型的新型绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对绵羊PRKAA2进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第314位存在一个G/A多态性位点，并通过检测1128只湖羊和77只杜泊羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊生长性状相关的分子标记，该分子标记可以用于优质肉羊新品种的培育，为绵羊生长性状的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

本发明通过设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)所需的KASPar引物对上述分子标记进行检测，该检测方法不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，并具有较高的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了与绵羊生长性状相关的分子标记及其G/A的多态性位点，通过测定该多态性的基因型来有效鉴别是否为快速增重型的绵羊，为快速增重型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为AA纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的生长性状，有助于提高生养殖业的经济效益。

附图说明

图1为本发明中用于作为分子标记的绵羊PRKAA2基因片段的凝胶电泳图；其中，M泳道：DL 2000Marker，1-10泳道：PRKAA2基因扩增结果。

图2为本发明中绵羊PRKAA2基因突变位点的测序结果。

图3为本发明中绵羊PRKAA2基因g.200G>A突变位点KASPar SNP分型结果；其中，靠近左侧的红色点表示GG基因型，靠近中间的绿色点表示GA基因型，靠近右侧的蓝点表示AA基因型。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1PRKAA2基因的扩增

以绵羊PRKAA2基因DNA(GenBank收录号：NC_040260.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物：正向引物M-F和反向引物M-R，引物序列如下：

M-F(SEQ ID NO.2)：5’-ACTTCATTCTAACAATAGGCTT-3’

M-R(SEQ ID NO.3)：5’-GTCAATGCACTTCAACCAG-3’

(2)PRKAA2基因的扩增和测序

对提取绵羊全血细胞提取的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增，扩增的反应总体积为25μL，其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，M-F 0.8μL(浓度为10μmol/L)，M-R 0.8μL(浓度为10μmol/L)，ddH₂O 10μL。PCR扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，结果显示得到314bp特异扩增片段。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该片段中存在一个多态性位点，具体在第200bp位点的R是G或A，即扩增的PRKAA2基因片段(SEQ ID NO.1)在第200bp位点存在G/A多态性(见图2)。

其中，SEQ ID NO.1：ACTTCATTCTAACAATAGGCTTCAGTGTCATTTGATCTTCATTTGAAGTTCACTTGATCATAAGCATAAATAAGAAATGAGGTCCCTGAAATTGCATGGCTGTACTTGATTTTAAGGTTATATTATCTAAGACCTGTGGTCTAGATGATCCAAGTATATACAGGTTTTTAAAGATATCACAGGAATTAAAATATCACCTRTGTTCGCTCTTCTATTCTTTGTTTCCTTAACTTTAAAATGGGGATACTACATGGGCTGTTTGAGAATTATTGAGTTCTCATTGTTATAACGCCTGCTGGTTGAAGTGCATTGAC

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊PRKAA2基因DNA(GenBank收录号：NC_040260.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段的G/A多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleX的正向引物A1(SEQ ID NO.4)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAACAAAGAATAGAAGAGCGAACAT-3’；

用于检测AlleleY的正向引物A2(SEQ ID NO.5)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAACAAAGAATAGAAGAGCGAACAC-3’；

通用反向引物C(SEQ ID NO.6)：5’-CAGGTTTTTAAAGATATCACAGGAATTAAAATATC-3’。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成。将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照引物A1：A2：C的体积比为12:12:30的比例混匀备用。

2)DNA质控

对绵羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对提取得到的基因组DNA的进行质量检测，采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测，合格的DNA要求：(1)琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散。(2)Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间；A260/230介于1.8-2.0之间；270nm没有明显的光吸收。并根据英国LGC公司的KASPar检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，将提取的基因组DNA稀释浓度成为10～20ng/μL作为DNA模板备用。

3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5uL和空白对照(No template control，NTC，采用灭菌水)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。

将上述KASPar引物对中各引物均稀释成10μmol/L，并按照引物A1：A2：C的体积比为12:12:30的比例混匀作为引物混合液备用。

然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板，货号：Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪及Fusion激光封膜仪上进行封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示。图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点，表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近右侧的蓝色圆点，表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近中间的绿色圆点，表示该位点是杂合基因型“GA”或“AG”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即为空白对照。

4)本发明的分子标记在绵羊生长性状关联分析中的应用

试验共检测了1128只湖羊和77只杜泊羊，共1205只绵羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与生长性状进行关联分析。

Y_ijk＝μ+G_i+B_j+B_k++ε_ijk

其中，Y_ijk是生长性状的表型观察，μ为总体均数，G_i为基因型效应，B_j为批次效应(j＝1，2，3,，4，5)，B_k为不同品种的影响(K＝绵羊，杜泊)，ε_ijk为随机误差，当P值为(P<0.05)认为具有统计学意义。

基因型检测结果表明在1205个个体中GG基因型有346个，GA基因型有586个个体，AA基因型有273个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，表中BW80表示绵羊第80天日龄的体重；BW100天表示绵羊第100天日龄的体重；BW120表示绵羊第120天日龄的体重；BW140表示绵羊第140天日龄的体重；BW160表示绵羊第160天日龄的体重；BW180表示绵羊第180天日龄的体重，体重为各基因型的平均值，单位为kg。

表1绵羊PRKAA2 g.200G>A基因多态性与生长性状关联分析

注：同列数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

结果显示，随着测定周期的延长，PRKAA2 g.200G>A突变位点与绵羊生长性状显著相关。其中AA基因型个体的体重显著高于GA型个体和GG型个体(P<0.05)，由此可知A等位基因为优势等位基因。表明PRKAA2 g.200G>A突变位点可作为影响绵羊生长性状的分子标记位点(P<0.05)；并为在育种中鉴别是否为快速增重型的绵羊提供检测技术手段。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acttcattct aacaataggc ttcagtgtca tttgatcttc atttgaagtt cacttgatca 60

taagcataaa taagaaatga ggtccctgaa attgcatggc tgtacttgat tttaaggtta 120

tattatctaa gacctgtggt ctagatgatc caagtatata caggttttta aagatatcac 180

aggaattaaa atatcacctr tgttcgctct tctattcttt gtttccttaa ctttaaaatg 240

gggatactac atgggctgtt tgagaattat tgagttctca ttgttataac gcctgctggt 300

tgaagtgcat tgac 314

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acttcattct aacaataggc tt 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcaatgcac ttcaaccag 19

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tggaaacaaa gaatagaaga gcgaacat 48

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tgaaacaaag aatagaagag cgaacac 47

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caggttttta aagatatcac aggaattaaa atatc 35

Claims

1.一种与绵羊生长性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第200bp处的R表示G或A，该突变导致分子标记的G/A多态性。

2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括正向引物M-F和反向引物M-R，其中，所述M-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，所述KASPar引物对包括用于检测AlleleC的正向引物A1，用于检测AlleleT的正向引物A2和通用反向引物C，其中，A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的引物对。

5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求2或3所述的引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的分型鉴定方法为测序法、荧光探针法、基因芯片法或高分辨率溶解曲线法。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记及其多态性位点、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊生长性状检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记及其多态性位点、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其育种目的是为挑选出快速增重型绵羊。