CN109913559B - Ryr2基因作为影响绵羊饲料转化率的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及RYR2基因作为影响绵羊饲料转化率的分子标记，以及该分子标记的检测方法和应用。本发明通过对绵羊RYR2基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第342位存在一个A/C多态性位点，进一步使用KASPar引物对437只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与饲料转化率进行关联分析，最终确定了本发明扩增的RYR2基因片段可以作为与绵羊饲料转化率相关的分子标记。本发明的分子标记可用于节粮型绵羊的选育和节粮型优质肉羊新品种的培育，为绵羊饲料转化率的遗传改良提供了基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

Description

RYR2基因作为影响绵羊饲料转化率的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记制备技术领域，具体涉及RYR2基因作为影响绵羊饲料转化率的分子标记及其应用。

背景技术

随着经济的发展，人们对肉类的需求量越来越大，其中，羊肉为需求量比较大的食材之一。据统计，目前全国绵，山羊存栏3亿只左右(赵有璋.国内外养羊业发展趋势、问题和对策.现代畜牧兽医,2015,(09):63-68)，我国人口众多，但牧场有限，多数羊是在舍饲条件下喂养，对粮食依赖性大，如何最大程度的缓解人畜争食的矛盾，提高羊群饲料转化率，已经变得越来越重要。在不影响动物正常生长的前提下降低饲料投入的遗传改良所涉及的指标即畜禽的饲料利用率。动物的饲料利用率指其对所采食饲粮的利用效率，主要受饲粮以及动物两方面因素的影响。饲料效率(Feed efficiency，FE)是饲料转化率(Feedconversion ration，FCR)的简称，也叫饲料报酬，一般情况下饲料转化率是指动物增重1kg所消耗的饲料量，即料重比(feed intake/gain，F/G)，是长期以来人们使用的衡量饲料利用率高低的一项重要经济指标。另外，增重饲料比(gain/feed intake，G/F)都是表示畜禽增重和日粮采食量之间关系的指标(Lancaster P A,Carstens G E,Jr C D,etal.Phenotypic and genetic relationships of residual feed intake withperformance and ultrasound carcass traits in Brangus heifers.Journal ofAnimal Science,2009,87(12):3887-3896)，饲料转化率在国内外被广泛应用，在肉产品生产中用料肉比，而禽蛋生产中则用料蛋比。要改善饲料转化率就要从提高畜禽增重或肉蛋产量和降低饲料消耗两方面入手(Aggrey S E,Karnuah A B,Sebastian B,et al.Geneticproperties of feed efficiency parameters in meat-type chickens.GeneticsSelection Evolution,2010,42(1):1-5.Aggrey S E,Rekaya R.Dissection of Koch'sresidual feed intake:implications for selection.Poultry Science,2013,92(92):2600-2605)。研究表明饲料转化率的遗传力为0.26～0.41，属中等遗传力性状，受遗传控制且能够通过选择改良(Willems O W,Miller S P,Wood B J.Assessment of residualbody weight gain and residual intake and body weight gain as feed efficiencytraits in the turkey(Meleagris gallopavo).Genetics Selection Evolution,2013,45(1):1-8)。依据科学的数据，对羊群进行选种选配，遗传改良(莫负涛.不同RFI育肥羔羊生产性能和体组成及消化代谢研究.甘肃农业大学,2016)，是可行的方法之一。如何确定科学依据，是我们要解决的难题之一。目前，大多数指标是跟据动物表型进行分析，从基因层面上对绵羊饲料转化率进行的系统分析还很少。

兰尼碱受体2(Ryanodine receptor 2，RYR2)基因是目前在细胞内发现的最大的离子通道蛋白，主要表达于心肌，其功能紊乱与心律失常、心力衰竭、心房肥厚等多种心脏疾病有关(闻松男,阮燕菲,杜昕,et al.RyR2突变致心律失常机制与转化医学[J].生命科学,2015(10):1209-1217.)。胡等学者研究发现RYR2的表达异常，能够增加细胞内内质网系统中钙离子通道的异常，抑制钙离子通道的定时开放，导致心肌细胞的收缩功能异常，同时RYR2的表达的波动能够降低心肌细胞抗氧化能力，降低细胞膜的稳定性(胡亚南,杨吉操,王喜欢.冠心病患者的RyR2、BACH2、ICTP水平及其临床意义研究[J].实验与检验医学,2018,36(05):96-98.)；并且通过RYR2通道瞬间释放出大量的钙离子，是心肌兴奋收缩偶联的一个重要过程，而Ca²⁺通道异常会引起肌肉的收缩异常，从而引起心力衰竭(梅英武.钙离子通道RyR2的调节及其在慢性电刺激迷走神经和S107治疗心衰过程中的角色[D].吉林大学,2011.)。目前有关该基因的研究主要集中在人类医学方面，但是迄今为止，在绵羊上的研究相对较少。本发明通过对RYR2基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与绵羊饲料转化率的关联性，旨在为绵羊饲料转化率的遗传改良方面提供基因素材，加速我国自主知识产权的节粮型优质肉羊新品种的培育进程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种作为与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记从绵羊RYR2基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过扩增绵羊RYR2基因的DNA序列并测序，寻找RYR2基因的多态性位点，从而可以建立绵羊饲料转化率相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于节粮型优质肉羊新品种的培育中。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一方面，本发明提供了一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，该分子标记通过对绵羊RYR2基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，即GTCCCCTCAGGAGAACACGGAGAAGAGCAGCGGAGAACTGTTCATTACGAAGGTGGTGCTGTATCGGTTCATGCACGTTCCCTGTGGCGACTAGAGACACTAAGAGTTGCGTGGAGTGGAAGCCACATAAGGTGGGGACAACCTTTTCGACTACGCCATGTCACAACGGGAAAATACTTGAGTCTCATGGAAGACAAAAGCCTTCTACTCATGGACAAAGAAAAAGCTGATGTCAAATCAACTGCATTTACGTTCCGATCTTCCAAGGAAAAATTGGATGTAGGAGTGAGAAAAGAAGTTGATGGCATGGGAACCTCTGAAATAAAATATGGAGACTCGGTMTGTTATATACAGCATATCAATACAGGCTTGTGGCTCACTTACCAG，其中第342位的M表示A或者C，由于上述序列在第342位碱基处有一个A/C碱基突变，从而导致了绵羊RYR2基因在该位点的A/C多态性。

第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：

正向引物M-F：5＇-GTCCCCTCAGGAGAACACGG-3＇(SEQ ID NO:2)，

反向引物M-R：5＇-CTGGTAAGTGAGCCACAAGC-3＇(SEQ ID NO:3)。

此外，本发明的引物对可以为KASPar引物对，优选地，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleA的正向引物A1：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTGAAATAAAATATGGAGACTCGGTA(SEQ ID NO:4)；

用于检测AlleleC的正向引物A2：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAAATAAAATATGGAGACTCGGTC(SEQ ID NO:5)；

通用反向引物C:GTAAGTGAGCCACAAGCCTGTATTG(SEQ ID NO:6)。

第三方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了本发明第二方面的引物对或KASPar引物对。

第四方面，本发明提供了一种检测与绵羊饲料转化率相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊RYR2基因进行检测，具体的，本发明的检测方法包括如下步骤：

a)使用本发明的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤b)中，任何SNP分型方法均可适用于本发明中分子标记的检测，上述SNP分型的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

在本发明的分子标记序列和多态性位点已知的情况下，针对该多态性位点设计相应的探针，以及利用上述SNP分型方法对分子标记和多态性位点进行检测均属于本领域中较为常规且成熟的技术，针对该多态性位点设计的探针也可包含于本发明的第三方面的试剂盒中。

更为具体的，本发明中利用上述引物对检测与绵羊饲料转化率相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对绵羊RYR2基因进行PCR扩增，

b)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊饲料转化率相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO:4-6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

第五方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒或检测方法在绵羊饲料转化率检测中的应用，通过在待测绵羊中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊对饲料转化率的高低，进而筛选出高饲料转化率的绵羊。

第六方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒或检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对RYR2基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出节粮型绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对绵羊RYR2进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第342位存在一个A/C多态性位点，并通过检测437只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，该分子标记可以用于节粮型绵羊的选育和节粮型优质肉羊新品种的培育，为绵羊饲料转化率的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

本发明通过设计KASPar引物对分子标记进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针法金标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

附图说明

图1.本发明中用于作为分子标记的绵羊RYR2基因片段的凝胶电泳图。其中，1-6泳道：RYR2基因扩增结果；M泳道：DL 2000Marker。

图2.本发明中绵羊RYR2基因突变位点的测序结果。

图3.本发明中绵羊RYR2基因g.342A>C突变位点KASPar SNP分型结果。其中，靠近左侧的红色点表示CC基因型，靠近中间的绿色点表示CA基因型，靠近右侧的蓝点表示AA基因型。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

实施例1 RYR2基因的扩增

(1)引物设计

以绵羊RYR2基因DNA(GenBank收录号：NC_040276.1)为模板，利用Primer5.0软件设计一对引物M-F和M-R，引物序列如下

RYR2：

M-F：5＇-GTCCCCTCAGGAGAACACGG-3＇(SEQ ID NO:2)，

M-R：5＇-CTGGTAAGTGAGCCACAAGC-3＇(SEQ ID NO:3)。

(2)RYR2基因的扩增和测序

PCR反应总体积25μL,其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ddH2O 10μL。PCR扩增程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示得到387bp特异扩增片段(图1)。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中在该387bp片段中存在一个多态性位点，即扩增的RYR2基因片段在第342bp位点存在A/C多态性(图2)。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊RYR2基因DNA(GenBank收录号：NC_040276.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

(1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段的A/C多态性位点设计KASPar引物对，从而用于所述多态性位点的特异性检测，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleA的正向引物A1：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTGAAATAAAATATGGAGACTCGGTA(SEQ ID NO:4)；

用于检测AlleleC的正向引物A2：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAAATAAAATATGGAGACTCGGTC(SEQ ID NO:5)；

通用反向引物C:GTAAGTGAGCCACAAGCCTGTATTG(SEQ ID NO:6)。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30(引物A1：引物A2：引物C)的比例混匀备用。

(2)DNA质控

通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对提取得到的基因组DNA的质量进行检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA浓度成为10～20ng/μL备用。

(3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5uL和空白对照(No template control,NTC)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(384孔板货号Part No.KBS-1016-002)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“CA”或“AC”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即为水对照。

(4)本发明的分子标记在绵羊饲料转化率标记性状关联分析中的应用

试验共检测了437只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与饲料转化率进行关联分析。

Yijl＝μ+Genotypei+Pj+Combinationl+εijl

其中，Yijl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Pj为批次效应，Combinationl为组合的效应，εijl为随机误差，假定εijl相互独立，服从N(0，σ2)分布。

本发明中，绵羊饲料转化率的测定方法是根据试验羊只的平均日增重与平均日采食量，按照如下公式计算(易国强.利用二代测序挖掘鸡拷贝数变异及影响饲料效率的候选基因[D].中国农业大学,2015.)：饲料转化率(Feed conversion rate，FCR)＝平均日采食量(kg/d)/平均日增重(kg/d)。

基因型检测结果表明在437个个体中AA基因型有21个，CA基因型有161个个体，CC基因型有255个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，结果显示，g.342A>C突变位点与湖羊饲料转化率显著相关。其中AA基因型个体的FCR为5.57±0.67，显著高于CA(FCR＝5.19±0.66)和CC型(FCR＝5.24±0.58)个体(P<0.05)，AA型个体每增重1kg消耗的饲料量比CA和CC型个体多0.38和0.33kg。

表1绵羊RYR2基因多态性与饲料转化率关联分析

注：同列数据间角标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110> 甘肃农业大学

<120> RYR2基因作为影响绵羊饲料转化率的分子标记及其应用

<130> 20190321

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 387

<212> DNA

<213> 绵羊

<223> m is a or c

<400> 1

gtcccctcag gagaacacgg agaagagcag cggagaactg ttcattacga aggtggtgct 60

gtatcggttc atgcacgttc cctgtggcga ctagagacac taagagttgc gtggagtgga 120

agccacataa ggtggggaca accttttcga ctacgccatg tcacaacggg aaaatacttg 180

agtctcatgg aagacaaaag ccttctactc atggacaaag aaaaagctga tgtcaaatca 240

actgcattta cgttccgatc ttccaaggaa aaattggatg taggagtgag aaaagaagtt 300

gatggcatgg gaacctctga aataaaatat ggagactcgg tmtgttatat acagcatatc 360

aatacaggct tgtggctcac ttaccag 387

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcccctcag gagaacacgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggtaagtg agccacaagc 20

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc ttctgaaata aaatatggag actcggta 48

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tctgaaataa aatatggaga ctcggtc 47

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtaagtgagc cacaagcctg tattg 25

Claims (9)

1.一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，其特征在于，所述 分子标记的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示，其中第 342bp 处的 M 是 A 或 C，该突变导致分子标记的 A/C 多态性。

2.一种检测权利要求 1 所述的分子标记的 PCR 引物对，其特征 在于，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示， 反向引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示。

3.一种检测权利要求 1 所述的分子标记的 KASPar 引物对，其特 征在于，所述KASPar 引物对中：用于检测 AlleleA 的正向引物 A1 的核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示，用于检测 AlleleG 的正向引物 A2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO:5 所示，通用反向引物 C 的核苷酸序 列如 SEQ ID NO:6 所示。

4.一种检测权利要求 1 所述的分子标记的试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求 2 或 3 所述的引物对。

5.一种检测权利要求 1 所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求 2 或 3 所述的引物对，或者使用权利要求 4 所述 的试剂盒，对绵羊基因组 DNA 进行扩增；

b)对步骤 a)获得扩增产物的多态性位点进行鉴定。

6.根据权利要求 5 所述的方法，其特征在于，步骤 b)中的鉴定 方法选自测序法、荧光探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

7.根据权利要求 5 所述的方法，其特征在于，利用权利要求 3 所述的 KASPar 引物对进行 PCR 扩增，扩增结束后，再通过检测荧 光信号确定分型结果。

8.权利要求 2 或 3 所述的引物对，或权利要求 4 所述的试剂盒，或权利要求 5-7任一项所述的方法在绵羊饲料转化率检测中的应用。

9.权利要求 2 或 3 所述的引物对，或权利要求 4 所述的试剂盒， 或权利要求 5-7任一项所述的方法在培育节粮型绵羊中的应用。

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