CN115125309A - 一种与绵羊尾脂相关的分子标记及应用 - Google Patents

一种与绵羊尾脂相关的分子标记及应用 Download PDF

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崔盼盼
张小雪
张德印
李冲
黄永亮
赵利明
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Abstract

本发明提供了一种与绵羊尾脂相关的分子标记及应用。本发明通过对绵羊TRAPPC9基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第132位存在一个A/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对1162只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与脂肪性状进行关联分析，最终确定了本发明扩增的TRAPPC9基因片段可以作为与绵羊尾脂相关的分子标记。本发明通过检测分子标记，可选留GG纯合的绵羊进入核心群用于育种，可用于降低绵羊的尾部脂肪沉积，有助于增加经济效益。

Description

一种与绵羊尾脂相关的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子标记的技术领域，具体涉及TRAPPC9基因片段作为影响绵羊尾脂的分子标记及其应用。
背景技术
湖羊是中国太湖流域地区重要的畜牧品种之一。它们具有繁殖性能高(发情期长，平均产仔数2.06)、生长发育性能快、环境适应性强、泌乳性能好等优点。如今，羊可以根据尾巴的大小分为五种类型：短肥尾羊、长肥尾羊、短细尾羊、长细尾羊和肥臀羊；5000年前首次记录了重要的肥尾羊品种，湖羊属于短肥尾羊。脂肪组织在维持家畜体内稳态代谢过程的平衡中起着至关重要的作用；并且存在于绵羊身体的各个部位，包括肾周、肠系膜和尾巴；尾部脂肪是最典型的沉积脂肪类型。在恶劣的条件下，例如迁移、干旱和冬季导致的食物短缺，尾部脂肪可以提供能量。脂肪对人类具有附加价值，因为它可以在干旱和饥荒期间提供高能量食物。目前，随着人们生活水平和饮食结构的提高，消费者对自身健康和肉质的关注度越来越高。然而，对于肥尾羊来说，大部分脂肪沉积在尾部，导致身体其他部位的脂肪沉积减少，从而影响肉质。在现代羊肉生产系统中，尾部脂肪沉积需要更高的能源成本。此外，尾部脂肪占胴体重量的20％，大大降低了胴体的经济价值，增加了饲养成本。因此，减少尾部脂肪沉积已成为绵羊遗传改良的研究热点。
NIK和IKKβ结合蛋白(NIBP)，也称为运输蛋白颗粒复合物9(TRAPPC9)，是一种核因子kappa B(NF-κB)信号通路调节因子，已在人体神经细胞中检测到。很明显，根据其特定功能，TRAPP复合体可能以不同的形式存在。此外，NF-κB信号通路是肿瘤发生中细胞增殖、凋亡以及生理和病理事件的关键介质。王等人对中国荷斯坦奶牛进行了全基因组关联研究，结果支持存在显着的单核苷酸多态性(SNP)，主要位于中国荷斯坦奶牛的常染色体(BTA)14，揭示了一个新的候选基因，TRAPPC9与奶牛乳腺炎抗性相关的基因。另一项研究表明，小头畸形和肥胖是TRAPPC9缺陷患者(12/23例)的共同特征，并在TRAPPC9缺陷小鼠模型中总结了这种表型。Briollais等人表明纯母乳喂养(EBF)的平均效果与出生后头两年TRAPPC9CpG基因座的M值降低0.06相关，这导致体重指数(BMI)降低0.20kg/m2。在Liang等人的一项研究中，删除小鼠中的TRAPPC9会导致小鼠体重显着增加，得出的结论是TRAPPC9功能的丧失导致体重增加。刘等人结果表明TRAPPC9与猪的体型特征有关，其中它参与调节骨骼生长发育和营养吸收，并与肥胖有关。然而，目前还没有关于TRAPPC9的多态性与胡羊脂肪沉积相关性状相关的报道。
因此，在本研究中，我们分析了TRAPPC9的SNP与湖羊脂肪沉积相关性状之间的关系。该研究为胡羊育种提供了有价值的分子标记。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种作为与绵羊尾脂相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记是从绵羊TRAPPC9基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。通过扩增绵羊TRAPPC9基因的DNA序列并测序，寻找TRAPPC9基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊尾脂相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于尾部脂肪沉积新品种的培育中。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种与绵羊尾脂相关的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第132bp位的R表示A或G，由于上述序列在第132位碱基处有一个A/G突变，从而导致了绵羊TRAPPC9基因在该位点的A/G多态性。
一种检测上述分子标记的引物对，其包括如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物。
一种检测上述分子标记的KASPar引物对，其包括如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的A1，如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的A2和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的引物C。
检测上述分子标记的检测试剂盒，其包含了检测上述分子标记的PCR引物对或KASPar引物对。
检测与绵羊尾脂相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其中第132bp位的R表示A或G，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
1)使用上述的PCR引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；
2)对步骤1)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。
其中，在步骤2)中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、基因芯片法、荧光探针法、高分辨率溶解曲线法。
利用上述引物对检测与绵羊尾脂相关分子标记的方法，包括如下步骤：
a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；
b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
本发明通过设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)所需的KASPar引物对上述分子标记进行检测，该检测方法不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，并具有较高的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。
如上述所述的分子标记、PCR引物对、KASPar引物或试剂盒的检测方法在绵羊尾脂性状检测中的应用，通过在待测绵羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊尾部脂肪的高低，进而筛选出低尾脂沉积型的绵羊。
如上所述的分子标记PCR引物对、KASPar引物或试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的TRAPPC9基因的基因型，从而可以从中选育出低尾脂沉积型的绵羊品种。寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。
本发明通过对绵羊代表品种湖羊的TRAPPC9基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第132位存在一个A/G多态性位点，并通过检测1162只湖羊多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊低尾脂相关的分子标记，该分子标记可以用于低尾脂型绵羊的选育，为绵羊尾脂的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了与绵羊尾脂相关的分子标记及其A/G的多态性位点，通过检测该多态性的基因型来有效鉴别是否为低尾脂型的绵羊，为低尾脂型绵羊的选育提供有效的检测手段。
本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为GG纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的品质，有助于提高养殖业的经济效益。
附图说明
图1为本发明中用于作为分子标记的绵羊TRAPPC9基因片段的凝胶电泳图。
图2为本发明中绵羊TRAPPC9基因突变位点的测序结果。
图3为本发明中绵羊的TRAPPC9基因扩增片段的A/G多态性位点KASPar SNP分型结果。
具体实施方式
本发明分析了湖羊TRAPPC9基因的单核苷酸多态性与尾部脂肪沉积性状的关系。本发明可为湖羊育种提供有价值的分子标记。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
实施例1TRAPPC9基因的扩增
以绵羊TRAPPC9基因DNA(GenBank收录号：NC_056062)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物：上游引物和下游引物，引物序列如下：
上游引物(SEQ ID NO.2)：5’-AGCACATACCCCTTTCGTGA-3’
下游引物(SEQ ID NO.3)：5’-TGGCACACATTTAAACTAGGGA-3’
(2)TRAPPC9基因的扩增和测序
对绵羊的全血细胞进行提取基因组DNA，作为DNA模板进行PCR扩增，扩增的反应总体积为35μL，其中17.5μL 2×Easy Taq PCR Super Mix上游引物1.12μL(浓度为10μmol/L)，下游引物1.12μL(浓度为10μmol/L)，ddH2O 14μL，DNA模板1μL。PCR扩增反应条件：94℃下5min；然后在94℃、54℃和72℃下分别进行30秒和35次循环；最终在72℃下延长5分钟。PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，M泳道：分子量为2000Marker，1-10泳道：TRAPPC9基因扩增结果。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示得到988bp的扩增片段，该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该片段中存在一个多态性位点，具体在第132bp位点的R是A或G，即扩增的TRAPPC9基因片段(SEQ ID NO.1)在第132bp位点存在A/G多态性(见图2)。
其中，SEQ ID NO.1：
AGCACATACCCCTTTCGTGACCTTTATGCCTGTGAAATACACACGTGCATGTACGCATATATGAGAAATAAGTGCCTATACCCATGCATAGTATATGTATGTATATATGTTTTATTTACAAAAATGAGAGCRTCCTGTATAATTTTTTCTGCAGCTTGCTGCGTGCACTCAGCCATGTGTCATGGATAGCCTCCCATTTCAGGTTTGCTTGACCCTTTCAAACAGAGGCTCCTTCTAGTACGTGGGTGTAGTCATTGCTCCGTCAGTTCCTTTTGTGGGAGAAGGTCATGAATAAGACACCTGCAGCAGGGCCTAGTGCCTCCCCCTCAGAGTTCCCGGCTCACCCTGACTCACCCAGTTACCGTCTTATGGATGGACACTTAGGTTTTCCCACTGTCTCACTCTTAGGAAAAATGCTTTGACTGAACATTCTTAGTCTTGTCCAATAGATTCTTGTGTTCTTGTATGTTCTTGCGTTCCTTTAGTTAAGATTTCTGGAAGTTTAGTCACTGGATATGACACTTACATATATCATTGGTTACTTTCAAGTTACTCTCCAAATTTGTTCTCCAACCGGGGATGAAAAGATGGAGAATTACTCATTTAACCAATTTTCTATTACTGAGTATAACATACAGCCTAGACAGCACCCCAAACACAGGGAACTCCAAGGCAAACTATAACAGTAAGGACTTTACAGCCAATAATGTCTTAGGTCTTGTTTACAAAGTGTCAGCAGATTGCCAGGAAAGCTCTGTAAGAGAGTATTCTAAGAAAATACCAAAGAGAAAACCCATCAGGAAAAGATTCACTATATTAGAAGTGGTTTGACCACAACCTAAATGAAAAACCAAGTAAACAAAATGCAAGCAACATCAAGAAAAAGATCTGCGATGTATGTCCACGACAGACACGAAGCTAACACCCACAGTTTACAAAGAGCTATCACAGAGCAGTAAGAAGCGCTCCCTAGTTTAAATGTGTGCCA。
DNA序列同源性检索鉴定：
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊ALB基因DNA(GenBank收录号：NC_056062.1)的部分序列同源性达99％。
实施例2基因分型检测方法的建立
1、首先进行引物序列设计
针对实施例1中扩增片段的A/G多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的KASPar引物对的核苷酸序列为：
用于检测AlleleX的正向引物A1如下所示，
SEQ ID NO.4(正向引物A1)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTATATATGTTTTATTTACAAAAATGAGAGCG；
用于检测AlleleY的正向引物A2如下所示，
SEQ ID NO.5(正向引物A2)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATGTATATATGTTTTATTTACAAAAATGAGAGCA；
通用反向引物C如下所示，
SEQ ID NO.6(通用反向引物C)：GTGCACGCAGCAAGCTGCAGAAA。
以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成。将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照引物A1：A2：C的体积比为12:12:30的比例混匀备用。
2、其次对提取的基因组DNA进行质控
对绵羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对提取得到的基因组DNA的进行质量检测，采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测，合格的DNA要求：(1)琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散。(2)Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间；A260/230介于1.8-2.0之间；270nm没有明显的光吸收。并根据英国LGC公司的KASPar检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，将提取的基因组DNA稀释浓度成为10～20ng/μL作为DNA模板备用。
3、进行基因分型
首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5uL和空白对照(No template control，NTC，采用灭菌水)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。
将上述KASPar引物对中各引物均稀释成10μmol/L，并按照引物A1：A2：C的体积比为12:12:30的比例混匀作为引物混合液备用。
然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板，货号：Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪及Fusion激光封膜仪上进行封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：
94℃预变性，15分钟；
94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；
94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。
扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示。其中，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点，表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近中间的绿色圆点，表示该位点是杂合基因型“AG”；靠近右侧的蓝色圆点，表示该位点是纯合基因型“GG”；黑色圆点表示NTC，即为空白对照。
4、本发明的分子标记在绵羊生长性状关联分析中的应用
试验共检测了1162只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与生长性状进行关联分析。
Yijkl＝μ+Genotypei+Pj+Fk+Ml+εijkl
其中，Yijlk为体高的观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Pj为批次效应，Fk为父系效应，Ml为母系效应，εijkl为随机误差，假定εijkl相互独立，服从N(0，σ2)分布。
基因型检测结果表明在1162个个体中AA基因型有527个，AG基因型有509个个体，GG基因型有126个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示。表中的尾脂相对重(体重)表示尾脂重与宰前活重的比值，尾脂相对重量(胴体)表示尾脂重与胴体重的比值。
表1绵羊TRAPPC9基因多态性与尾脂关联分析
Figure BDA0003698367880000091
注：表中所有数据为平均值±标准误差。同列数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)
结果显示，随着测定周期的延长，如SEQ ID NO.1所示序列第132bp处的A/G突变位点与绵羊尾脂显著相关。尾部脂肪沉积需要更高的能源成本和饲料成本，携带GG基因型羊的平均尾部脂肪重显著低于携带AA基因型的尾部脂肪重。因此，携带GG基因型羊的尾部脂肪重要优于携带AA基因型的羊(P<0.05)。由此可知G等位基因为优势等位基因。表明TRAPPC9g.988A>G突变位点可作为影响湖羊尾脂的潜在分子标记(P<0.05)。在育种时选择GG基因型进行保种，获得具有较低脂肪含量的羊只，并极大提升羊肉的品质和口感，从而得到低尾脂具有优势的羊群。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种与绵羊尾脂相关的分子标记及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 988
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcacatacc cctttcgtga cctttatgcc tgtgaaatac acacgtgcat gtacgcatat 60
atgagaaata agtgcctata cccatgcata gtatatgtat gtatatatgt tttatttaca 120
aaaatgagag crtcctgtat aattttttct gcagcttgct gcgtgcactc agccatgtgt 180
catggatagc ctcccatttc aggtttgctt gaccctttca aacagaggct ccttctagta 240
cgtgggtgta gtcattgctc cgtcagttcc ttttgtggga gaaggtcatg aataagacac 300
ctgcagcagg gcctagtgcc tccccctcag agttcccggc tcaccctgac tcacccagtt 360
accgtcttat ggatggacac ttaggttttc ccactgtctc actcttagga aaaatgcttt 420
gactgaacat tcttagtctt gtccaataga ttcttgtgtt cttgtatgtt cttgcgttcc 480
tttagttaag atttctggaa gtttagtcac tggatatgac acttacatat atcattggtt 540
actttcaagt tactctccaa atttgttctc caaccgggga tgaaaagatg gagaattact 600
catttaacca attttctatt actgagtata acatacagcc tagacagcac cccaaacaca 660
gggaactcca aggcaaacta taacagtaag gactttacag ccaataatgt cttaggtctt 720
gtttacaaag tgtcagcaga ttgccaggaa agctctgtaa gagagtattc taagaaaata 780
ccaaagagaa aacccatcag gaaaagattc actatattag aagtggtttg accacaacct 840
aaatgaaaaa ccaagtaaac aaaatgcaag caacatcaag aaaaagatct gcgatgtatg 900
tccacgacag acacgaagct aacacccaca gtttacaaag agctatcaca gagcagtaag 960
aagcgctccc tagtttaaat gtgtgcca 988
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcacatacc cctttcgtga 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcacacat ttaaactagg ga 22
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tgtatatatg ttttatttac aaaaatgaga gcg 53
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tatgtatata tgttttattt acaaaaatga gagca 55
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgcacgcag caagctgcag aaa 23

Claims (10)

1.一种与绵羊尾脂性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第132bp处的R表示A或G，该突变导致分子标记的A/G多态性。
2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括如SEQ IDNO.2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物。
3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括如SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的A1，如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的A2和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的引物C。
4.检测权利要求1所述的分子标记的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对。
5.检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：
1)使用权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；
2)对步骤1)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的分型鉴定方法为测序法、基因芯片法、荧光探针法或高分辨率溶解曲线法。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。
8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊尾脂性状检测中的应用。
9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其育种目的是为挑选出低尾脂沉积型绵羊。
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