CN115044682A - 与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用 - Google Patents

与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用。本发明通过对湖羊AHSG基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第234位存在一个T/C多态性位点，进一步使用KASPar引物对1481只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与生长性状进行关联分析，最终确定了本发明扩增的AHSG基因片段可以作为与湖羊平均日增重和饲料转化率相关的分子标记。本发明通过检测分子标记，可用于选留基因为CC纯合型湖羊进入核心群作为种羊，以改善湖羊的生长性状，有助于增加经济效益。

Description

与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用
技术领域
本发明属于分子标记的技术领域，具体涉及AHSG基因片段作为影响湖羊生长性状的分子标记、其检测方法及应用。
背景技术
湖羊α2-HS糖蛋白基因(AHSG)位于1号染色体上，属于3型半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白，AHSG是胰岛素刺激的IR-TK的天然抑制剂(Auberger et al.，1989；Srinivas etal.，1993)。AHSG基因参与动物体脂和胰岛素敏感性的调节，被认为是影响体脂含量和代谢的候选基因(Lavebratt&C.，2005)。而在人类中，AHSG是一种主要在肝脏合成的血浆蛋白(Yang，Chen，Bergeron，Cupples，&Friedrichs，1992)。此外，有报道称AHSG基因的Ser单倍型与男性的瘦弱有关(C.Lavebratt，Wahlqvist，Nor Df Ors，Hoffstedt，&Arner，2005)。Lavebratt等人(Lavebratt&C.,2005)研究表明，AHSG基因多态性与皮下脂肪细胞的脂解有关。敲除AHSG基因的小鼠体内脂肪含量较低，并且对体重增加有抵抗力，这表明AHSG在肥胖的发展中起着重要作用(Mathews et al.，2002)。然而，截至目前，AHSG基因在湖羊上的研究较少，具体对湖羊的作用也不清楚。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种作为与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用。本发明的分子标记是从湖羊AHSG基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过扩增湖羊AHSG基因的DNA序列并测序，寻找AHSG基因的多态性位点，分析不同的基因型与湖羊生长性状相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于新型优质肉羊新品种的培育中。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种与湖羊生长性状相关的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第234bp位的Y表示T或C，由于上述序列在第234位碱基处有一个T/C突变，从而导致了湖羊AHSG基因在该位点的T/C多态性。
一种检测上述分子标记的引物对，优选地，其包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F和反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。
一种检测上述分子标记的KASPar引物对，其包括正向引物1、正向引物2和反向引物C，所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向引物2如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物C如SEQ ID NO.6所示。
一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的PCR引物对或KASPar引物对。
一种检测与湖羊生长性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第234bp位的Y表示T或C，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对湖羊的基因组DNA进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
a)使用上述的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对湖羊基因组DNA进行扩增；
b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。
其中，在步骤b)中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
利用上述引物对检测与湖羊生长性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：
a)以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；
b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
如上述所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在湖羊生长性状检测中的应用，通过在待测湖羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定湖羊的生长性状的高低，进而筛选出快速生长型节粮型的湖羊。
如上所述的分子标记及其多态性位点、引物对或试剂盒的检测方法在湖羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对湖羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的AHSG基因的基因型，从而可以从中选育出快速生长节粮型的湖羊品种。
寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。
本发明通过对湖羊代表品种湖羊的AHSG基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第234位存在一个T/C多态性位点，并通过检测1418只湖羊多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与湖羊生长性状相关的分子标记，该分子标记可以用于优质肉羊新品种的培育，为湖羊生长性状的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。
本发明通过设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)所需的KASPar引物对上述分子标记进行检测，该检测方法不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，并具有较高的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了与湖羊生长性状相关的分子标记，具体为SEQ ID NO.1片段的第234位的T/C的多态性位点，通过测定该多态性的基因型来有效鉴别是否为快速生长型的湖羊，为快速生长型湖羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致该多态性位点的检测，可用于选留基因为CC纯合型湖羊作为种羊，用于育种，用以提高湖羊的生长性状，有助于提高湖羊养殖业的经济效益。
附图说明
图1为本发明中用于作为分子标记的湖羊AHSG基因片段的凝胶电泳图。
图2为本发明中湖羊AHSG基因突变位点的测序结果。
图3为本发明中湖羊AHSG基因g.2454T>C突变位点KASPar SNP分型结果。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
实施例1AHSG基因的扩增
以湖羊AHSG基因DNA(GenBank收录号：NC_040252.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物：正向引物F和反向引物R，引物序列如下：
正向引物F如SEQ ID NO.2所示：5’-AGCCCCAAGATATAAACTTGC-3’
反向引物R如SEQ ID NO.3所示：5’-GCCCTTAAAACCCAATGTCC-3’
(2)AHSG基因的扩增和测序
对湖羊全血细胞提取的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增，扩增的反应总体积为25μL，包括DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，正向引物F取0.8μL(浓度为10μmol/L)，反向引物R取0.8μL(浓度为10μmol/L)和ddH2O 10μL。
PCR扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。
对PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，M泳道：DL 2000Marker，1-10泳道：AHSG基因扩增的结果。结果显示得到369bp特异扩增片段。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该片段中存在一个多态性位点，具体在第234bp位点的Y是T或C，即扩增的AHSG基因片段(SEQ ID NO.1)在第234bp位点存在T/C多态性(见图2)。
其中，SEQ ID NO.1：
AGCCCCAAGATATAAACTTGCTCTAAGAATGTTCTGTTCCATGACCAGCTTTGCCTGGCCCGCTCACCTTTTCTGCCAGTAGGTTGCACTTGGTTGGATCTACGACCTCTTTAGCAATACAGTCAGTAGCAGCCACTGCAAACTCCACAGAGACAGAACCTGGAAGAGGCTGATGAAGATATATAAATTTTCATGAAGCAACATGACAGCATGAGAAAGGCAGGGAAGGAGAGYCCAGAGGGAAGTAGTGAGGGCCATGGTACTACGTAGTCCAGGGAGCACCATTCACGTAGACCGCACTGTGTGGCCAGGAAACATGCCCCTGGTGGCTTACACAGGGCTCACATGGGGACATTGGGTTTTAAGGGC。
DNA序列同源性检索鉴定：
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与湖羊AHSG基因DNA(GenBank收录号：NC_040252.1)的部分序列同源性达99％。
实施例2基因分型检测方法的建立
1、引物序列设计
针对实施例1中扩增片段SEQ ID NO.1中所示的T/C多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的KASPar引物对的核苷酸序列为：
用于检测AlleleX的正向引物A1如SEQ ID NO.4所示：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTGTTTTCCCCACGTGGAAC-3’；
用于检测AlleleY的正向引物A2如SEQ ID NO.5所示：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGTGTTTTCCCCACGTGGAAT-3’；
通用反向引物C如SEQ ID NO.6所示：5’-CCTCAGTGGAGTCGGCCT CG-3’。
以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成。将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C的体积比为12:12:30的比例混匀备用。
2、DNA质控
对湖羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对提取得到的基因组DNA的进行质量检测，采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测，合格的DNA要求到达：(1)琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散。(2)Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间；A260/230介于1.8-2.0之间；270nm没有明显的光吸收。并根据英国LGC公司的KASPar检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，将提取的基因组DNA稀释浓度成为10～20ng/μL作为DNA模板备用。
3、基因分型检测
首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5μL和空白对照(No template control，NTC，采用灭菌水)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。
将上述KASPar引物对中各引物均稀释成10μmol/L，并按照正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C的体积比为12:12:30的比例混匀作为引物混合液备用。
然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板，货号：Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪及Fusion激光封膜仪上进行封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：
94℃预变性，15分钟；
94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；
94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。
扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示。图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点，表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近中间的绿色圆点，表示该位点是杂合基因型“CT”或“TC”；靠近右侧的蓝色圆点，表示该位点是纯合基因型“TT”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即为空白对照。
4、本发明的分子标记在湖羊生长性状关联分析中的应用
试验共检测了1418只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与生长性状进行关联分析。
Yijkl＝μ+Genotypei+Pj+Fk+Ml+εijkl
其中，Yijkl是生长性状的观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Pj为批次效应，Fk为父系效应，Ml为母系效应，εijkl为随机误差，假定εijkl相互独立，服从N(0，σ2)分布。
基因型检测结果表明在1418个个体中CC因型有474个，CT基因型有720个个体，TT基因型有224个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，表中ADG表示日增重，单位为kg。ADG100-120表示湖羊第100-120天的平均日增重；ADG100-140表示湖羊第100-140天的平均日增重；ADG100-160表示湖羊第100-160天的平均日增重；ADG100-180表示湖羊第100-180天的平均日增重；FCR表示饲料转化率，即动物每公斤增加体重所消耗的饲料量，FCR80-100表示湖羊第80-100天的饲料转化率，FCR 100-120表示湖羊第100-120天的饲料转化率；FCR 120-140表示湖羊第120-140天的饲料转化率；FCR 140-160表示湖羊第140-160天的饲料转化率；FCR 160-180表示湖羊第160-180的天饲料转化率。
Figure BDA0003693123960000081
注：P<0.05表示差异显著。
结果显示，随着测定周期的延长，AHSG g.2454T>C突变位点与湖羊平均日增重和饲料转化率显著相关。携带CC基因型湖羊的100-140天平均日增重、80-100天、140-160天饲料转化率要优于携带TT基因型的湖羊(P<0.05)，即携带CC基因型羊的阶段性日增和饲料转化率重要优于携带TT基因型的羊(P<0.05)。由此可知C等位基因为优势等位基因。在育种时选择CC基因型进行保种，繁育时以CC基因型作为种羊，与其它羊进行杂交。尤其是采用CC基因型种公羊精液进行人工授精，可以极大提升繁育效率，得到生长速度具有优势和节粮型的羊群。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agccccaaga tataaacttg ctctaagaat gttctgttcc atgaccagct ttgcctggcc 60
cgctcacctt ttctgccagt aggttgcact tggttggatc tacgacctct ttagcaatac 120
agtcagtagc agccactgca aactccacag agacagaacc tggaagaggc tgatgaagat 180
atataaattt tcatgaagca acatgacagc atgagaaagg cagggaagga gagyccagag 240
ggaagtagtg agggccatgg tactacgtag tccagggagc accattcacg tagaccgcac 300
tgtgtggcca ggaaacatgc ccctggtggc ttacacaggg ctcacatggg gacattgggt 360
tttaagggc 369
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccccaaga tataaacttg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccttaaaa cccaatgtcc 20
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tggtgttttc cccacgtgga ac 42
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgggtgtttt ccccacgtgg aat 43
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctcagtgga gtcggcctcg 20

Claims (10)

1.一种与湖羊生长性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第234bp处的Y表示T或C，该突变导致分子标记的T/C多态性。
2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F和反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。
3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括正向引物1、正向引物2和反向引物C，所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向引物2如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物C如SEQ ID NO.6所示。
4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对。
5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：
a)使用权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对湖羊基因组DNA进行扩增；
b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的分型鉴定方法为测序法、荧光探针法、基因芯片法或高分辨率溶解曲线法。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。
8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在湖羊生长性状检测中的应用。
9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在湖羊育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其育种目的是为挑选出快速生长节粮型湖羊。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115747347A (zh) * 2022-12-23 2023-03-07 江苏乾宝牧业有限公司 与湖羊角型相关的snp分子标记、扩增引物和试剂盒及其应用、判断湖羊角型的方法

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