CN115747347A - 与湖羊角型相关的snp分子标记、扩增引物和试剂盒及其应用、判断湖羊角型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于遗传生物学领域，具体涉及与湖羊角型相关的SNP分子标记、扩增引物和试剂盒及其应用、判断湖羊角型的方法。本发明提供了一种与湖羊角型相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为RXFP2基因3’UTR区插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(1780bp序列)。利用本发明所提供的SNP分子标记，可以鉴定湖羊角的表型特征，从而指导畜牧生产和地方品种保护，特别的，利用所述SNP分子标记可以获得纯合无角或隐角表型，维持湖羊品种的角型性状的稳定。为培育无角或隐角(角长为0cm)的湖羊品种提供依据。
Description
技术领域
本发明属于遗传生物学领域，具体涉及与湖羊角型相关的SNP分子标记、扩增引物和试剂盒及其应用、判断湖羊角型的方法。
背景技术
绵羊是最重要的农业动物之一，其角型在不同品种的绵羊中具有较大的差异，对角型的变异的研究无论对于研究绵羊遗传进化，还是对于提高养殖效率均具有重要意义。在不同绵羊品种中，大致可以将角型分为如下三类：(1)公羊及母羊均有明显的角，例如草地型藏羊、欧拉羊，小尾寒羊等；(2)公羊有角，而母羊一般无角，例如滩羊，泗水裘皮羊等；(3)公羊及母羊均普遍无角，例如萨福克羊、特克赛尔羊、无角陶赛特羊等。角型不仅包括有角或无角，也包括角的大小和形状，例如欧拉羊的角大而长，呈螺旋形向外生长；而小尾寒羊的角呈螺旋形紧贴脸部生长。此外还有镰刀型、鹿角状、姜芽状角。
湖羊长期以来均被认为是无角的，但根据实际养殖数据统计，纯种湖羊仍有不到1％的个体存在长角的性状，其角型包括大角(12cm以上)，残角或短角(两个角大小不一，且均短于12cm)，无角或隐角(完全无角或头顶有不明显角芽)。由于长大角消耗能量较大，因此长角湖羊的饲料转化率和生长性能较正常湖羊低，且角可能引发湖羊争斗导致的受伤，甚至卡到围栏中造成伤害，增加饲养管理难度；同时目前的湖羊养殖基本是集约化万只以上规模，养殖密度较高，即使有少量长角个体也会造成动物间伤害，同时影响售卖。因此，湖羊养殖户认为无角湖羊品种纯度更高，倾向选择隐角或无角的湖羊进行育肥和繁殖。因此，湖羊中调控角型的基因对于研究角型调控机制以及保证湖羊养殖企业经济效益具有重要的意义。
对绵羊角型性状的研究中，已有研究发现松弛素/胰岛素样肽受体(Relaxin/insulin-like familypeptide receptor2，RXFP2)基因对绵羊角的大小具有调控作用。发现了多个可能影响角大小的SNP，包括基因间区的一个SNP(chr10:29455959)与Soay羊的角大小有关，基因下游的一个SNP(chr10:29389966)与Merino的角大小有关。目前还没有研究报道湖羊中长角性状受哪种类型基因组变异影响。
发明内容
本发明的目的在于提供与湖羊角型相关的SNP分子标记、扩增引物和试剂盒及其应用、判断湖羊角型的方法，判断湖羊角型，为培育无角或隐角的湖羊品种提供依据。
本发明提供了与湖羊角型相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为RXFP2基因3’UTR区插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的SNP分子标记在选育和/或辅助选育无角或隐角湖羊中的应用。
本发明还提供了用于鉴定上述技术方案所述的SNP分子标记的引物，所述引物包括正向引物RUTR-F1和反向引物RUTR-R2；
所述正向引物RUTR-F1包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述反向引物RUTR-R2包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了用于选育和/或辅助选育无角或隐角湖羊的引物组合，所述引物组合包括上述技术方案所述的引物和反向引物RUTR-R1；
所述反向引物RUTR-R1包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了含有上述技术方案所述引物组合的试剂盒。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组合或试剂盒在选育/辅助选育无角或隐角湖羊中的应用。
本发明还提供了一种判断湖羊角型的方法，所述方法包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的引物组合对待测湖羊的基因组DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
当所述PCR扩增产物大小为608bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR1780bp+/+，角的长度为0cm，为无角或隐角；
当所述PCR扩增产物大小为608bp和1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1780bp+/-，角的长度＞0cm且≤12cm，为小角或畸形角；
当所述PCR扩增产物大小为1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1780bp-/-，角的长度＞12cm，为大角。
优选的，所述PCR扩增使用的反应体系以25μL计，包括：待测湖羊的基因组DNA 1μL，上游引物RUTR-F11μL，下游引物RUTR-R11μL，下游引物RUTR-R21μL，2×Mix 12.5μL和余量的ddH2O。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃终延伸5min。
优选的，所述待测湖羊包括湖羊羔羊。
本发明提供了一种与湖羊角型相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为RXFP2基因3’UTR区插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的SNP分子标记，可以鉴定湖羊角的表型特征，从而指导畜牧生产和地方品种保护，特别的，利用所述SNP分子标记可以鉴定纯系湖羊，通过这一SNP位点的鉴定，可以获得纯合子表型，维持湖羊品种的角型性状的稳定。为培育无角或隐角(角长为0cm)的湖羊品种提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为以RXFP2-F1和RXFP2-R2为扩增引物进行扩增的结果；
图2-1～图2-5为扩增产物与参考序列进行基因比对的结果；
图3为待测湖羊的角型；
图4为以RXFP2-F1、RUTR-R1和RXFP2-R2为扩增引物进行扩增的结果；
图5为对得到的608bp序列进行测序(双向测通)，并与湖羊(版本号：Oarv4.0)RXFP2基因进行比对的结果；
图6为对得到的1759bp序列进行测序(双向测通)，并与湖羊(版本号：Oarv4.0)RXFP2基因进行比对，结果如图5～6所示。根据图5～6可以看出，测序结果与参考序列(Oar_V4.0)的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种与湖羊角型相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为RXFP2基因3’UTR区插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为：5’-CAGCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGGA CACAGGTGTCGTGAAAACCACCGTTAAACCTAAGCCAAAATGGGAAAGGAGAAGACCCACATCAACATCGTTGTCATTGGGCACGTAGATTCAGGGAAGTCTACCACGACTGGCCATCTGATCTACAAATGTGGCGGGATCGACAAGAGAACAATTGAAAAGTTCGAGAAGGAGGCAGCCGAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAATATGCCTGGGTCTTGGACAAACTGAAAGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGATATCTCCCTGTGGAAGTTTGAGACCAGCAAGTACTATGTTACCATCATTGATGCCCCAGGACACAGAGACTTCATCAAAAACATGATTACAG GCACATCCCAGGCTGACTGTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCTGGTGTTGGTGAATTTGAAGCCGGTATCTCCAAGAACGGGCAGACCCGTGAGCATGCCCTTCTGGCTTACACCCTGGGTGTGAAACAACTAATTGTTGGCGTTAACAAAATGGATTCTACTGAGCCACCCTATAGCCAGAAGAGATACGAGGAAATTGTTAAGGAAGTCAGCACCTACATTAAGAAAATTGGCTACAACCCCGACACAGTAGCATTTGTGCCAATTTCTGGCTGGAATGGTGACAACATGCTGGAGCCAAGTGCTAATATGCCATGGTTCAAGGGATGGAAAGTCACCCGTAAGGACGGCAATGCCAGTGGAACCACCCTGCTTGAAGCTCTGGATTGCATCCTGCCACCAACTCGCCCAACTGACAAACCCTTGCGTTTGCCTCTCCAGGATGTCTATAAAATTGGTGGTATTGGTACTGTACCTGTGGGTCGTGTGGAGACTGGTGTTCTCAAACCTGGCATGGTGGTCACCTTTGCTCCAGTCAATGTAACAACTGAGGTGAAGTCCGTAGAAATGCACCATGAAGCATTGAGTGAAGCCCTTCCTGGGGACAATGTGGGCTTCAATGTCAAGAACGTGTCTGTCAAAGATGTCCGTCGTGGCAATGTGGCTGGTGACAGCAAAAATGATCCACCCATGGAAGCTGCTGGCTTCACAGCTCAGGTGATTATTTTGAACCATCCAGGCCAAATCAGTGCTGGATATGCACCTGTGCTGGATTGTCACACAGCTCACATTGCTTGCAAGTTTGCTGAGCTGAAGGAGAAGATTGATCGTCGTTCTGGGAAAAAGCTGGAAGATGGCCCTAAATTCTTGAAATCTGGTGACGCTGCCATCGTTGATATGGTTCCTGGCAAGCCTATGTGTGTCGAGAGCTTTTCTGATTATCCTCCCCTGGGCCGTTTTGCTGTGCGTGACATGAGACAGACAGTCGCTGTGGGTGTCATCAAAGCAGTGGACAAGAAGGCAGCTGGAGCTGGCAAGGTCACCAAGTCTGCCCAGAAAGCTCAGAAGGCTAAATGAATATTATCCCCAATACCTGCCACCCCAGTCTTAATCAGTGGTGGAAGAACGGTCTCAGAACTGTTTGTCTCAATTGGCCATTTAAGTTTAATAGTAAAAGACTGGTTAATGATAACAATGCATCGTAAAACCTTCAGAAGGAAAGGAGAATGTTTTTGTGGACCATATGTTTTGTGTGTGGCAGTTTAAGTTATTAGTTTTTAAAATCAGTACTTTTTAATGAAAACAACTTGACCAAAAATCTGTCACAGAATTTGAGACCCATTAAAAAAAGTTTAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAATGACAGTG-3’，共1780bp。本发明所述SNP分子标记与湖羊的角型相关，利用该分子标记可以鉴定湖羊角的表型特征，鉴定纯系湖羊，获得纯合子表型，维持湖羊品种的角型性状的稳定。为培育无角或隐角(角长为0cm)的湖羊品种提供依据。
本发明还提供了上述技术方案所述的SNP分子标记在选育/辅助选育无角或隐角湖羊中的应用。
本发明还提供了用于鉴定上述技术方案所述的SNP分子标记的引物，所述引物包括正向引物RUTR-F1和反向引物RUTR-R2，使用所述引物可快速鉴定湖羊基因组中是否存在SEQ ID NO.1，并且无需扩增获得该序列，即可对湖羊角型进行鉴定；
所述正向引物RUTR-F1包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述反向引物RUTR-R2包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了用于选育/辅助选育无角或隐角湖羊的引物组合，所述引物组合包括上述技术方案所述的引物和反向引物RUTR-R1；所述反向引物RUTR-R1包括如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。本发明在选育/辅助选育无角或隐角湖羊时，设计2条正向引物和1条反向引物，可以扩增2条小片段，降低了PCR扩增的难度，具有辨识度高，检测容易的优势。
本发明各引物的核苷酸序列，从5’-3’依次如下：
SEQ ID NO.2：5’-TCTGCGTGTTCTGTGAAGGC-3’；
SEQ ID NO.3：5’-GGTAGACTTCCCTGAATCTACGTG-3’；
SEQ ID NO.4：5’-GGAGGATGTACCGAAGTTACATGC-3’。
本发明根据NCBI公布的湖羊(版本号Oar v4.0)RXFP2基因(序列号：NC_019467.2)的参考序列，针对湖羊RXFP2基因的3’UTR区设计序列扩增引物，利用该引物组合可以鉴定湖羊的角型。
本发明还提供了含有上述技术方案所述引物组合的试剂盒。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组合或试剂盒在选育/辅助选育无角或隐角湖羊中的应用。
本发明还提供了一种判断湖羊角型的方法，所述方法包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的引物组合对待测湖羊的基因组DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
当所述PCR扩增产物大小为608bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1782bp+/+，角的长度为0cm，为无角或隐角；
当所述PCR扩增产物大小为608bp和1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1780bp+/-，角的长度＞0cm且≤12cm，为小角或畸形角；
当所述PCR扩增产物大小为1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1780bp-/-，角的长度＞12cm，为大角。
本发明提取待测湖羊的基因组DNA，所述待测湖羊包括湖羊羔羊。本发明对提取待测湖羊的基因组DNA的具体方式没有严格要求，常规操作即可。本发明对所述待测湖羊的来源和年龄均没有严格要求，常规选择即可。本发明具体实施过程中，待测湖羊羔羊为太湖流域的江苏省盐城市湖羊群体。
得到所述基因组DNA后，本发明利用上述技术方案所述的引物组合对待测湖羊的基因组DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物。本发明所述PCR扩增使用的反应体系优选以25μL计，优选包括：待测湖羊的基因组DNA 1μL，上游引物RUTR-F11μL，下游引物RUTR-R11μL，下游引物RUTR-R21μL，2×Mix12.5μL和余量的ddH2O；所述上游引物RUTR-F1的浓度优选为10μM，下游引物RUTR-R1的浓度优选为10μM，下游引物RUTR-R2的浓度优选为10μM；所述PCR扩增的程序优选为：第一阶段95℃预变性5min；第二阶段95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；第三阶段：72℃终延伸5min，4℃保存。本发明所述2×Mix优选购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司的扩增酶PhantaMax mix，货号P525-03。
得到所述PCR扩增产物后，本发明优选利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，判断湖羊角型，具体的：当所述PCR扩增产物大小为608bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR1780bp+/+，角的长度为0cm，为无角或隐角；当所述PCR扩增产物大小为608bp和1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1780bp bp+/-，角的长度＞0cm且≤12cm，为小角或畸形角；当所述PCR扩增产物大小为1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR 1780bp bp-/-，角的长度＞12cm，为大角。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的具体操作步骤没有严格要求，常规操作即可。本发明通过对待测湖羊的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，能够预测羔羊后续是否会长角，以及角的表型，决定羔羊的去留。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的与湖羊角型相关的SNP分子标记、扩增引物和试剂盒及其应用、判断湖羊角型的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.根据NCBI公布的湖羊(版本号：Oar v4.0)RXFP2基因(序列号：NC_019467.2)3’UTR区设计上游引物RXFP2-F1和下游引物RXFP2-R2，以湖羊基因组DNA为模板，RXFP2-F1和RXFP2-R2为扩增引物进行扩增，其中扩增的体系中不添加下游引物RUTR-R1，并且在扩增程序中，延伸时间为3min，其余均与表2相同，最终获得3539bp序列，扩增结果如图1所示；
使用RUTR-F1和RUTR-R2，对得到的3539bp序列进行测序(双向测通)与参考序列(NCBI公布的湖羊(版本号：Oar v4.0)RXFP2基因(序列号：NC_019467.2))进行比对，结果如图2-1～图2-5所示。根据图2-1～图2-5可以看出，获得的3539bp序列中存在SEQ ID NO.1所示的特征性序列(1780bp序列)，与参考序列(Oar_V4.0)相比，存在一个位点碱基缺失，11个碱基突变，具体为Chr10:29434002T>C、Chr10:29434024C>T、Chr10:29434601G>A、Chr10:29434604G>A、Chr10:29434624T>C、Chr10:294344631A>C、Chr10:29434648A>G、Chr10:2943477Adel、Chr10:29434876A>G、Chr10:29434877A>T、Chr10:29434880T>A和Chr10:29434885A>G。
2.以步骤1中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计下游引物RXFP2-R1。
3.以212只湖羊为待测样品，对被测湖羊的角长和角型进行测量记录，其中，在测量过程中定义无角或隐角为0cm，共计112只；小角的长度为0～12cm(不含0cm，含12cm)，共计71只；大角的长度为12cm以上，共计29只；不同角长和角型的待测品种随机选取5只，具体角型情况如表1和图3，其中图3从左到右依次为大角湖羊、小角或畸形角湖羊和无角或隐角湖羊的照片。
表1 15只湖羊的角型
4.分别以步骤3中15只湖羊的基因组DNA为模板，利用步骤1和2设计的引物进PCR扩增，扩增产物测序后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR产物的具体条带大小，结果如图4所示。PCR扩增体系和扩增程序如下表2。
表2PCR扩增体系和扩增程序
根据图4可以看出，通过引物组合RUTR-F1、RUTRR1及RUTR-R2，以湖羊基因组DNA为模板进行扩增，PCR扩增结果分别为：无角或隐角湖羊由RU TR-F1和RUTR-R1扩增获得608bp序列，共一条序列，基因型为3’UTR 1780bp+/+；大角湖羊由RUTR-F1和RUTR-R2扩增获得1759bp序列，共一条序列，基因型为3’UTR 1780bp-/-；小角或畸形角湖羊由RUTR-F1和RUTR-R1扩增获得608bp序列，由RUTR-F1和RUTR-R2扩增获得1759bp序列，共两条序列，基因型为3’UTR 1780bp+/-。
使用RUTR-F1和RUTR-R1，对得到的608bp序列进行测序(双向测通)，使用RUTR-F1和RUTR-R2，对得到的1759bp序列进行测序(双向测通)，分别与湖羊(版本号：Oar v4.0)RXFP2基因进行比对，结果如图5～6所示。根据图5～6可以看出，测序结果与参考序列(Oar_V4.0)一致。
本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列可以作为判断湖羊角型的标记，为培育无角或隐角的湖羊品种提供依据，利用本发明针对湖羊RXFP2基因3’UT R区域3’UTR 1780bp序列的特异性扩增引物对能够鉴定湖羊基因组中是否存在RXFP2基因3’UTR区域的1780bp序列，判断湖羊角型。其中608bp序列具体如SEQ ID NO.5所示：5’-TCTGCGTGTTCTGTGAAGGCAGAACTTGCC AGCAACAGGGATGATGCTCTACAGAAATTATATTTTAAAACATATGGAAATGTAGTTTTTGGCAGTTGTAATGCCCAATTTTCCTCTGTGGTGTGGGCAACCTTAAGAAACATATTTTGAGAGCACAGCTCTTCTGACATCACATACAAGCCAAAAAGGTGAATGGTACCAGGTAGTCAGCACGCCTCTCTGGTCATATATTAGACTTCGAACCTTGTGCAAAGTTCTATTTTCAAAGCTGCTGCTCCACTGGCCTCCTTAGGGAGGCCTTGAGGTGGAAGTCCTTTTGCTACCACTTCCTCAGAAGTCCTTTTGCTATCACTTCAGCAGGATGCTGATGGATTCATTTGACATTGGAAAAGCAAGGAAAGTGATTTAGGCTTCATGTGATTATGGCCACGCTAGAATTAGATGTCATGAGTGTTTTTATTTAATGACAGTGCAGCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGGACACAGGTGTCGTGAAAACCACCGTTAAACCTAAGCCAAAATGGGAAAGGAGAAGACCCACATCAACATCGTTGTCATTGGGCACGTAGATTCAGGGAAGTCTACC-3’，1759bp序列具体如SEQ ID NO.6所示：5’-TCTGC GTGTTCTGTGAAGGCAGAACTTGCCAGCAACAGGGATGATGCTCTACAGAAATTATATTTTAAAACATATGGAAATGTAGTTTTTGGCAGTTGTAATGCCCAATTTTCCTCTGTGGTGTGGGCAACCTTAAGAAACATATTTTGAGAGCACAGC TCTTCTGACATCACATACAAGCCAAAAAGGTGAATGGTACCAGGTAGTCAGCACGCCTCTCTGGTCATATATTAGACTTCGAACCTTGTGCAAAGTTCTATTTTCAAAGCTGCTGCTCCACTGGCCTCCTTAGGGAGGCCTTGAGGTGGAAGTCCTTTTGCTACCACTTCCTCAGAAGTCCTTTTGCTATCACTTCAGCAGGATGCTGATGGATTCATTTGACATTGGAAAAGCAAGGAAAGTGATTTAGGCTTCATGTGATTATGGCCACGCTAGAATTAGATGTCATGAGTGTTTTTATTTAATGACAGTGCAACTCAATTTAAGAGCAGACTGTGCAGGGCCAAGGGGTGGGCATCCACTGGTAGGCTGGCCGTGCTGCAGAGATAGAGATCCACTGCCCATCAGCCTGCTGTTTATGGATCCATTAGTGCATCACAGGCATGTTGGGGTGAGGAGACCTTCAGGTACAGTCCTCAGTTAAACACCACGGCTGCCTTCGGAACGTCATGCCTGACACCCTCCTACTATGCTCCCAGTGCAGTCAAGTTTTGCTCTCAGTAAAGATGAAAAGTGTTGCAGGCGTCATCTTCCAAACGCTGTGCTTTTTCAGGTAGTCCATTTGAAGCCCAGTGCTCCAAAACCATGACTAGGAAACTGGTTTCACTATATTGTCCTCAAGGTTTATTTTGTTCAAAGCCCCAAGTTTAAGTGCAGAGGAGTCATCCCCCCACACGATGGAAGTAGACACACTTTTTTTCTTAGTTTTGAAAATCGATTTTCTCCGATGTTTGTGCAGCAGCTGTTTCAACTTGTCCTTGAAAAAGCTGGTTGTGAGAGTGTAGAGGATTGGGTTCAAGGCACTGTTTACTGGAAGGAAAAGAATGACGACCCAGGAGGTGATTGTGCCTGGAGAAGGAAACGAAACGTGAAAGAAAGGTGAAGATTTAATACACACAAAACACATTACATGCTATAGTTAATGCTGTTTTTGAGAGGGTTACCTGTTCCATCTAAGTCTTCTTTCACCTTATGGAAAATCTTTGCCAGAAGAGCATAGGAGCTACGGATTCAAGGTCCTACATGAACTTTTCTGAGTTTCAGTAACTACTCTGTAGTTTGTCGTAAATCAACACGGGAGGAAACATTATGTGAAAACACTTTATAAACTATAAATTGATATGTACTTTTCTAGTTTTTATTGCCTTTCCTTATAGAAAAATAGGAAAAAGAGCAATTAATTGGACAGTGTCCAGGAATCTTCTGGTTTGGAGTCAGATCTGAACTTGGTCTAAATTTCAGTCCTGAAGATCTTCCTGCCTTACGCTATTATATTCAGAATGGAGTCAGAAGATCTGAGGAGCAAAAATAAATATATCTCCAAACTCAGTGAATTCCTTCTGTGTGAAGCCTTTCAAAGGCTAATAGAATATAAGGGAAATGTTTCACAAAAAGGGAGGAGATATTTTGGATGACAGAGCATTTTCTGAATTCAGTTGTCCCTTGATATCCACGGTGGGACATATACTAAAATCAGCAGATTCTTAAGTCCCTTATAGAAAATGGCATAGTATTTGCATGTAA CTTCGGTACATCCTCC-3’。
对比例1
同实施例1，区别在于步骤4利用核苷酸序列如SEQ ID NO.7所述的正向引物1替换RUTR-F1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所述的反向引物1替换RUTR-R1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述的反向引物2替换RUTR-R2，正向引物1、反向引物1和反向引物2的氨基酸序列具体如下：
正向引物1(SEQ ID NO.7)：5’-CCTATCAGTGGTCTTTGCTGGTC-3’；
反向引物1(SEQ ID NO.8)：5’-TCCCGCCACATTTGTAGATCAGATG-3’；
反向引物2(SEQ ID NO.9)：5’-TGTCCCACCGTGGATATCAAGG-3’。
利用上述引扩增得到的胶图上没有条带信息物，无法扩增处正确条带。
对比例2
同实施例1，区别在于步骤4利用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所述的正向引物2替换RUTR-F1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所述的反向引物1替换RUTR-R1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.11所述的反向引物3替换RUTR-R2，正向引物1、反向引物1和反向引物2的氨基酸序列具体如下：
正向引物2(SEQ ID NO.10)：5’-AGTGCAGAAGACATGGGAGACAC-3’；
反向引物1(SEQ ID NO.8)：5’-TCCCGCCACATTTGTAGATCAGATG-3’；
反向引物3(SEQ ID NO.11)：5’-TCCGTAGCTCCTATGCTCTTCTG-3’。
利用上述引扩增得到的胶图上没有条带信息物，无法扩增处正确条带。
对比例3
同实施例1，区别在于步骤4利用核苷酸序列如SEQ ID NO.7所述的正向引物2替换RUTR-F1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所述的反向引物1替换RUTR-R1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.11所述的反向引物3替换RUTR-R2，正向引物1、反向引物1和反向引物2的氨基酸序列具体如下：
正向引物1(SEQ ID NO.7)：5’-CCTATCAGTGGTCTTTGCTGGTC-3’；
反向引物1(SEQ ID NO.8)：5’-TCCCGCCACATTTGTAGATCAGATG-3’；
反向引物3(SEQ ID NO.11)：5’-TCCGTAGCTCCTATGCTCTTCTG-3’。
利用上述引扩增得到的胶图上没有条带信息物，无法扩增处正确条带。
对比例4
同实施例1，区别在于步骤4利用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所述的正向引物1替换RUTR-F1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所述的反向引物1替换RUTR-R1；利用核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述的反向引物2替换RUTR-R2，正向引物1、反向引物1和反向引物2的氨基酸序列具体如下：
正向引物2(SEQ ID NO.10)：5’-AGTGCAGAAGACATGGGAGACAC-3’；
反向引物1(SEQ ID NO.8)：5’-TCCCGCCACATTTGTAGATCAGATG-3’；
反向引物2(SEQ ID NO.9)：5’-TGTCCCACCGTGGATATCAAGG-3’。
利用上述引扩增得到的胶图上没有条带信息物，无法扩增处正确条带。
根据上述实施例可以看出，利用本发明所述与湖羊角型相关的SNP分子标记可以判断湖羊角型，为培育无角或隐角的湖羊品种提供依据。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种与湖羊角型相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为RXFP2基因3’UTR区插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的SNP分子标记在选育和/或辅助选育无角或隐角湖羊中的应用。
3.用于鉴定权利要求1所述的SNP分子标记的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物RUTR-F1和反向引物RUTR-R2；
所述正向引物RUTR-F1包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述反向引物RUTR-R2包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
4.用于选育和/或辅助选育无角或隐角湖羊的引物组合，其特征在于，所述引物包括权利要求3所述的引物和反向引物RUTR-R1；
所述反向引物RUTR-R1包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
5.含有如权利要求4所述引物组合的试剂盒。
6.权利要求4所述的引物组合或权利要求5所述的试剂盒在选育/辅助选育无角或隐角湖羊中的应用。
7.一种判断湖羊角型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
利用权利要求4所述的引物组合对待测湖羊的基因组DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
当所述PCR扩增产物大小为608bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR1780bp+/+，角的长度为0cm，为无角或隐角；
当所述PCR扩增产物大小为608bp和1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR1780bp+/-，角的长度＞0cm且≤12cm，为小角或畸形角；
当所述PCR扩增产物大小为1759bp，则待测湖羊的基因型为3’UTR1780bp-/-，角的长度＞12cm，为大角。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的反应体系以25μL计，包括：待测湖羊的基因组DNA1μL，上游引物RUTR-F11μL，下游引物RUTR-R11μL，下游引物RUTR-R21μL，2×Mix12.5μL和余量的ddH2O。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃终延伸5min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测湖羊包括湖羊羔羊。
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| CN105483125A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-13 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊角表型相关的rxfp2基因snp标记组合及其应用 |
| CN115044682A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-09-13 | 兰州大学 | 与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用 |
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