MXPA06009452A

MXPA06009452A - Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos.

Info

Publication number: MXPA06009452A
Application number: MXPA06009452A
Authority: MX
Inventors: Stephen Stewart Moore
Original assignee: Univ Alberta
Priority date: 2004-02-19
Filing date: 2005-02-19
Publication date: 2007-03-15
Also published as: CA2556911A1; AU2010200649A1; US7947444B2; AU2005244673A1; BRPI0507929A; WO2005112544A3; EP1718770B1; ATE510928T1; US20050202484A1; EP1718770A2; AU2010200649B2; JP2007525217A; AU2005244673B2; NZ549384A; WO2005112544A2; EP1718770A4; CA2556911C; US20080244763A1

Abstract

La presente invencion se relaciona a polimorfismos de nucleotidos sencillos (PNSs) en el promotor de leptin y a metodos la identificacion de animales que poseen alelos especificos de estos PNSs que estan asociados con niveles de leptin circulante, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventajas del canal y composicion del canal. La presente invencion proporciona oligonucleotidos que pueden ser usados como primarios y/o pruebas para amplificar y/o detectar estos PNSs y proporciona metodos para seleccionar y agrupar animales, en particular bovinos, de acuerdo al genotipo.

Description

POLIMORFISMOS DEL PROMOTOR DE LEPTIN Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a polimorfismos de nucleótidos sencillos en el leptin o gen ob, y a la asociación de estos SNPs con ciertos atributos que son económicamente importantes en especies de ganado, tal como niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventajas del canal y composición del canal. Se describen tres SNPs novedosos localizados en el promotor del gen promotor de leptin. La presente invención proporciona cebadores y sondas útiles en la detección de estos SNPs novedosos, y métodos para identificar y agrupar animales basados en su genotipo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las mejoras significantes en el desempeño del animal, eficiencia y calidad del canal y carne han sido hechas durante años a través de la aplicación de técnicas de reproducción y selección de animales estándares. Sin embargo, tales técnicas de reproducción animal clásicas requieren varios años de evaluación genética de registros de desempeño en animales individuales y sus allegados y por lo tanto son muy costosas. Se han hecho otros esfuerzos para mejorar la productividad y calidad a través de la aplicación de tales prácticas de manejo -como el uso de aditivos alimenticios, implantes hormonales de animales y quimioterapéuticas. Sin embargo, hay política significante y resistencia regulatoria a la introducción y uso de tales metodologías. Tales metodologías también no son heredables y necesitan ser aplicadas diferentemente en cada sistema de producción. Hay una necesidad por métodos que permitan la selección y reproducción relativamente fácil y más eficiente de animales de granja con una ventaja para una característica heredable de niveles de leptín circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventajas del canal y composición del canal. El significado económico del uso de marcadores genéticos que están asociados con los atributos económicamente importantes específicos (especialmente atributos con baja condición heredable) en el ganado a través de la selección asistida con marcadores por lo tanto no puede ser sobre enfatizada. El leptin, el producto de la hormona del gen ob (obeso) , ha sido mostrado para ser sintetizado y expresado predominantemente en los tejidos adiposos (Zhang y colaboradores, 1994, Ji y colaboradores 1998). Funciona como una señal fisiológica potente en la regulación del peso corporal, gasto de energía, ingesta de alimento, adiposidad, fertilidad y funciones inmunes (Houseknecht y colaboradores, 1998, Lord y colaboradores, 1998, García y colaboradores, 2002) . El leptin se ha propuesto como uno de los factores de mayor control que contribuye a la variación fenotípica y genética en el desempeño y eficiencia del ganado vacuno. Los polimorfismos en las regiones de codificación del gen de leptin en el ganado vacuno se han asociado con la producción y composición de leche (Liefers y colaboradores, 2002), ingesta de alimento (Liefers y colaboradores, 2002; Lagonigro y colaboradores, 2003), y grasa del cuerpo (Buchanan y colaboradores, 2002; Lagonigro y colaboradores, 2003) . Sin embargo, parecería que los polimorfismos localizados en la región promotora del gen de leptin (es decir la región del gen que • regula el nivel de expresión de leptin a través de sus elementos mejoradores y silenciadores asociados) puede tener un efecto más fuerte sobre la-regulación de estos atributos económicamente importantes, y por lo tanto ser de valor predictivo mayor. Los estudios en humanos por ejemplo, han mostrado que las mutaciones en la región de proteínas de enlace CCAAT/aumentador (C/EBP-a) del promotor de leptin anularon la inducibilidad del promotor mediante la C/EBP-a (Miller y colaboradores, 1996) . Masón y colaboradores, (1998) han mostrado que las mutaciones en las porciones C/EBP-a y TATA así como en un sitio Spl consenso de la actividad del promotor reducida de leptin por 10, 10 y 2.5 veces, respectivamente, y anularon el enlace de estos factores. Masón y colaboradores (1998) también mostraron que la regulación de la expresión del gen de leptin se enlaza parcialmente a un factor novedoso que se enlaza a una porción LP1 en el promotor. La función del receptor-? activado con proliferador de peroxizoma (PPAR-?) en la diferenciación de adipositos también se ha enlazado a la función del promotor de leptin (De Vos y colaboradores, 1996) . Aunque se han detectado varios polimorfismos en el promotor de leptin bovino (Liefers y colaboradores, 2003) , poco se ha hecho para asociar cualquiera de estos con cualquiera de los atributos económicamente importantes en el ganado vacuno. En la presente invención se ha mostrado sorprendentemente que tres polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs) previamente desconocidos en la región promotora del gen de leptin, y un SNP previamente conocido en el exón 2 del gen de leptin, están asociados fuertemente con varios de estos atributos económicamente importantes en el ganado vacuno. Para lo mejor del conocimiento de los inventores, los marcadores genéticos de la presente invención son los primeros a ser identificados que muestran una relación directa con el peso corporal y la ingesta de alimento. OBJETIVO Y BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente a tres polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs) previamente desconocidos en el promotor de leptin o el gen ob (SEQ ID NO: 1) , y a un SNP previamente conocido en el exón 2 del gen ob (SEQ ID NO: 5) , y a la asociación de cada uno de estos SNPs con ciertos atributos que son de importancia económica significante en las especies de ganado, tales como niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventajas del canal y composición del canal en especies de ganado. Los tres SNPs localizados en el promotor del gen de leptin se denominan UASMS1, UASMS2 y UASMS3. Estos tres SNPs, en el contexto de la secuencia del promotor del gen ob, se pueden observar en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. El SNP localizado en el exón 2 del gen de leptin se denomina EXON2-FB, y se puede observar en el contexto del exón 2 del gen ob en la SEQ ID NO: 6. En un aspecto la presente invención proporciona métodos para agrupar animales de acuerdo al genotipo en donde los animales de cada sub-grupo tienen un polimorfismo similar en el gen de leptin. Tales métodos comprenden determinar el genotipo de cada animal para ser sub-agrupado al determinar la presencia de un SNP en el gen de leptin, en donde el SNP se selecciona del grupo que consiste de ÜASMS1, ÜASMS2, y UASMS3 y EXON2-FB, y en donde los animales individuales se colocan en los sub-grupos donde cada animal en un sub-grupo tiene un polimorfismo similar en el gen de leptin. En una modalidad preferida el animal que se agrupa es un bovino y el gen de leptin es el gen de leptin bovino. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para identificar animales que tienen atributos deseables que se relacionan. a los niveles de leptin circulante, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja del canal y composición del canal, como son comparadas a la población general de animales de esas especies. Tales métodos comprenden determinar la presencia de un SNP en el gen de leptin del animal, en donde el polimorfismo se selecciona del grupo que consiste de UASMSl, ÜASMS2, y ÜASMS3, y EXON2-FB, y en donde la presencia de ya sea el SNP ÜASMS1, UASMS2, y UASMS3 o EXON2-FB es indicativo de una característica deseable que se relaciona a los niveles de leptín circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja del canal y composición del canal. En una modalidad preferida el animal que se agrupa es un bovino y el gen de leptin es el gen de leptin bovino. En una modalidad adicional la presente invención proporciona sondas de oligonucleótidos aislados que son útiles en la detección de los SNPs UASMSl, UASMS2, y UASMS3, y EXON2-FB en el gen ob. La presente invención ventajosamente proporciona sondas de oligonucleótidos para la detección de los dos alelos alternativos de cada SNP. Por ejemplo, en el caso del polimorfismo UASMSl, que constituye una sustitución de C a T en la posición del nucleótido 207 del promotor del gen ob, la presente invención proporciona sondas de oligonucleótidos que se pueden utilizar para detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene T. En el caso del polimorfismo UASMS2, que constituye una sustitución de C a T en la posición del nucleótido 528 del promotor del gen ob, la presente invención proporciona sondas de oligonucleótidos que se pueden utilizar para detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene T. En el caso del polimorfismo UASMS3, que constituye una sustitución de C a G en la posición del nucleótido 1759 del promotor del gen ob, la presente invención proporciona sondas de oligonucleótidos que se pueden utilizar para detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene G. Similarmente, en el caso del polimorfismo EXON2-FB, que constituye una sustitución de C a T en la posición del nucleótido 305 del exón 2 del gen ob, la presente invención proporciona sondas de oligonucleótidos que se pueden utilizar para detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene T. En una modalidad preferida, las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se marcan con una porción detectable, tal como por ejemplo, digoxigenina-dUTP, biotina, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, porciones electroquimioluminiscentes y s porciones radioactivas. En una modalidad adicional la presente invención proporciona cebadores aislados y pares de cebadores que son útiles en la amplificación de fragmentos del gen ob que abarca los SNPs UASMSl, UASMS2, UASMS3, y EX0N2-FB. En una modalidad los fragmentos del gen ob que se amplifican utilizando tales cebadores se detectan subsecuentemente utilizando las sondas de oligonucleótidos de la presente invención. . Las sondas de oligonucleótidos y cebadores descritos en la presente son útiles para identificar animales que tienen SNPs asociados con atributos deseables que se relacionan a los niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja del canal y composición del canal, como comparados a la población general de animales de esas especies. Una vez que los animales individuales posean estos SNPs que han sido identificados, los animales luego se pueden agrupar de acuerdo al genotipo, en donde los animales de cada subgrupo tienen un polimorfismo similar en el gen de leptin. La presente invención también proporciona ventajosamente composiciones y equipos que comprenden las sondas y cebadores de oligonucleótidos descritos en la presente. Estas y otras modalidades se describen o son obvias de, e incluidas por, la siguiente Descripción Detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En la siguiente Descripción Detallada y Ejemplos será hecha la referencia a los dibujos acompañantes, incorporados en la presente por referencia, en donde: la Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos para la región de promotor flanqueante 5' y exón 1 del gen ob bovino de "tipo silvestre". Esta secuencia de "tipo silvestre" tiene el número de acceso de GenBank AB070368 (Taniguchi y colaboradores IUBMB Life Vol. 53, p 131-135 (2002)), y se designa en la presente como SEQ ID NO: 1. La Figura 2 ilustra la secuencia de nucleótidos del polimorfismo de nucleótídos sencillo UASMSl en el promotor del gen ob bovino (SEQ ID NO. 2). Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia del gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 1) en que la posición del nucleótido 207 tiene una substitución de citosina a timina. La Figura 3 ilustra la secuencia de nucleótidos del polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMS2 del gen ob bovino (SEQ ID NO. 3) . Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia del gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 1) en que la posición del nucleótido 528 tiene una substitución de citosina a timina. La Figura 4 ilustra la secuencia de nucleótidos del polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMS3 del gen ob bovino (SEQ ID NO. 4) . Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia del gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 1) en que la posición del nucleótido 1759 tiene una substitución de citosina a guanina. La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos para el exón 2 del gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 5.). Esta secuencia de exón 2 de "tipo silvestre" tiene el número de acceso de GenBank AY138588. La Figura 6 ilustra la secuencia de nucleótidos para el polimorfismo de nucleótidos sencillo EXON2-FB del gen ob bovino (SEQ ID NO. 6) . Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia del gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 5) en que la posición del nucleótido 305 tiene una substitución de citosina a timina. La Figura 7 ilustra la utilización de una gráfica de flujo de cómo los animales se pueden clasificar por el SNP UASMSl, y cómo la información del genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para la reproducción de y/o el uso para la producción de alimento. La Figura 8 ilustra la utilización de una gráfica de flujo de cómo los animales se pueden clasificar para el SNP UASMS2 y cómo la información del genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para la reproducción de y/o el uso para la producción de alimento. La Figura 10 ilustra la utilización de una gráfica del flujo de cómo los animales se pueden clasificar para el SNP UASMS3 y cómo la información del genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para la reproducción de y/o el uso para la producción de alimento. DESCRIPCIÓN DETALLADA 1. Definiciones Como se utiliza en la presente, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos a menos que se especifique de otra manera. En esta descripción, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y los similares pueden tener el significado atribuido a ellos en la ley de patentes norteamericana y pueden significar "incluye", "que incluye" y los similares; "que consiste esencialmente de" o "consiste esencialmente" del mismo modo tiene el significado atribuido en la ley de patentes norteamericana y el término está abierto, permitiendo la presencia de más que aquel que se cite siempre que las atributos básicas o novedosas de aquella que se cite no se cambia por la presencia de más de aquella que se cite, pero excluye las modalidades de la técnica previa. El término "animal" se utiliza en la presente para incluir todos los animales vertebrados, incluyendo humanos. También incluye un animal individual y todas las etapas de desarrollo, incluyendo etapas embriónicas y fetales. Como se utiliza en la presente, el término "animales de producción" se utiliza intercambiablemente con "animales de ganado" y se refiere generalmente a animales criados principalmente para alimento. Por ejemplo, tales animales incluyen, pero no se limitan a, ganado vacuno (bovino) , oveja (ovino) , cerdos (porcinos o puercos), aves de corral (avíanos), y los similares. Como se utiliza en la presente, el término "vaca" o "ganado vacuno" se utiliza generalmente para referirse a un animal de origen bovino de cualquier edad. Los términos intercambiables incluyen "bovino", "ternero", "res", "toro", "vaquilla", "vaca" y los similares. Como se utiliza en la presente, el término "cerdo", se utiliza generalmente para referirse a un animal de origen porcino de cualquier edad. Los términos intercambiables incluyen "cerdito", "cerda" y los similares. Para el término "complementariedad" o "complementario" se propone, para los propósitos de la especificación o reivindicaciones, un número suficiente en el oligonucleótido de pares de base complementarios en su secuencia para interactuar específicamente (hibridizar) con la secuencia de ácido nucleico objetivo del polimorfismo del gen ob que se amplifica o se detectada. Como es conocido por aquellos expertos en la técnica, se necesita un grado muy alto de complementariedad para especificidad y sensibilidad que involucra la hibridízación, aunque no necesita ser el 100%. Así, por ejemplo, un oligonucleótido que es idéntico en la secuencia de nucleótidos a un oligonucleótido divulgado en la presente, excepto para un cambio o sustitución base, puede funcionar equivalentemente a los oligonucleótidos divulgados. Un gen de "DNA complementario" o "cDNA" incluye genes recombinantes sintetizados mediante la transcripción inversa del RNA mensajero ("mRNA") . Una "reacción mediada con polimerasa cíclica" se refiere a una reacción bioquímica en la que una molécula de plantilla o una población de moléculas de plantilla periódicamente y repetidamente se copian para crear una molécula de plantilla complementaria o moléculas de plantillas complementarias, incrementando de esta manera el número de las moléculas de plantilla a través del tiempo. "Desnaturalización" de una molécula de plantilla se refiere al desdoblamiento u otra alteración de la estructura de una plantilla a fin de hacer la plantilla accesible a la duplicación. En el caso del DNA, "desnaturalización" se refiere a la separación de las dos hebras complementarias de la hélice doble, creando de esta manera dos moléculas de plantilla de una sola hebra, complementarias. "La desnaturalización" se puede lograr en cualquiera de una variedad de rutas, que incluyen mediante calor o mediante tratamiento del DNA con una base u otro desnaturalizante. Una "cantidad detectable del producto" se refiere a una cantidad de ácido nucleico amplificado que se puede detectar utilizando herramientas de laboratorio estándares.

Un "marcador detectable" se refiere a un análogo de nucleótidos que permite la detección utilizando la visual u otro medio. Por ejemplo, los nucleótidos fluorescentemente marcados se pueden incorporar en un ácido nucleico durante una o más etapas de una reacción mediada con polimerasa cíclica, permitiendo de esta manera la detección del producto de la reacción utilizando, por ejemplo microscopía de fluorescencia u otra instrumentación de detección de fluorescencia . Para el término "porción detectable" se propone para los propósitos de la especificación o reivindicaciones, una molécula marcadora (isotópica o no isotópica) que se incorpora indirectamente o directamente en un oligonucleótido, en donde la molécula marcadora facilita la detección del oligonucleótido en el que se incorpora, por ejemplo cuando el oligonucleótido se hibridiza a las secuencias de polimorfismos del gen ob amplificados. Así, "porción detectable" se utiliza sinónimamente con "molécula marcadora". La síntesis de los oligonucleótidos se puede lograr mediante cualquiera de uno de varios métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las moléculas marcadoras, conocidas por aquellos expertos en la técnica ya que son útiles para la detección, incluyen moléculas quimioluminiscentes o fluorescentes. Varias moléculas fluorescentes son conocidas en la técnica las cuales son adecuadas para el uso para marcar un ácido nucleico para el método de la presente invención. El protocolo para tal incorporación puede variar dependiendo de la molécula fluorescente utilizada. Tales protocolos son conocidos en la técnica para la molécula fluorescente respectiva. Para "detectablemente marcado" se propone que un fragmento o un oligonucleótido contiene un nucleótido que es radioactivo o que se sustituye con un fluoróforo, o que se sustituye con algunas otra especies moleculares que inducen una respuesta física o química que se puede observar o detectar a simple vista o por medio de instrumentación tal como, sin limitación, contadores de centelleo, colorímetros, espectrofotómetros de UV y los similares. Como se utiliza en la presente, una "marca" o "etiqueta" se refiere a una molécula que, cuando se adjunta mediante, por ejemplo, sin limitación, el enlace o hibridización covalente, a otra molécula, por ejemplo, también sin limitación, un polinucleótido o fragmento de polinucleótido, proporciona o mejora un medio para detectar la otra molécula. Una marca o etiqueta de fluorescencia o fluorescente emite luz detectable en una longitud de onda particular cuando se estimula en una longitud de onda diferente. Una radiomarca o etiqueta radioactiva emite partículas radioactivas detectables con un instrumento tal como, sin limitación, un contador de centelleo. Otros métodos de detección de generación de señal incluyen: quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, raman, colorimétrico, análisis de protección de hibridización, y espectrometría de masas. "Amplificación de DNA", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier proceso que incrementa el número de copias de una secuencia de DNA específica al amplificar enzimáticamente la secuencia de ácido nucleico. Son conocidos una variedad de procesos. Uno de los más comúnmente utilizados es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual se define y se describe en las secciones posteriores enseguida. El proceso de la PCR de Mullís se describe en las patentes norteamericanas Nos. 4,683,195 y 4,683,202. La PCR involucra el uso de una polimerasa de DNA termoestable, las secuencias conocidas como cebadores, y ciclos de calentamiento, que separan las hebras, de ácido desoxiribonucléico (DNA), replicantes y exponencialmente amplifica un gen de interés. Se pueden utilizar cualquier tipo de PCR, tal como PCR cuantitativa, RT-PCR, PCR de inicio caliente, LAPCR, PCR múltiple, PCR de punto de contacto, etc. Ventajosamente, se utiliza la PCR de tiempo real. En general, el proceso de amplificación de la PCR involucra una reacción en cadena enzimática para preparar cantidades exponenciales de una secuencia de ácido nucleico específica. Esta requiere una cantidad pequeña de una secuencia para iniciar la reacción en cadena y los cebadores de oligonucleótidos que híbridizarán a la secuencia. En la PCR los cebadores se recocen para el ácido nucleico desnaturalizado seguido por la extensión con un agente de inducción (enzima) y nucleótidos. Esto da por resultado productos de extensión recientemente sintetizados. Puesto que estas secuencias recientemente sintetizadas llegan a ser plantillas para los cebadores, los ciclos repetidos de desnaturalización, recocido del cebador y extensión da por resultado la acumulación exponencial de la secuencia específica que se amplifica. El producto de extensión de la reacción en cadena será un ácido nucleico distinto doble con unas terminales que corresponden a los extremos de los cebadores específicos empleados. "DNA" se refiere a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) en ya sea forma de una hebra, o como una hélice de dos hebras. Este término se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a cualquiera de las formas terciarias particulares. Así, este término incluye DNA de dos hebras encontrado, inter alia , en moléculas de DNA lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En la discusión la estructura de las moléculas de DNA de dos hebras particulares, las secuencias se pueden describir en la presente de acuerdo a la convención normal para dar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de DNA (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al mRNA) . Para los términos "amplificar enzimáticamente" o "amplificar" se propone, para los propósitos de la especificación o reivindicaciones, la amplificación de DNA, es decir, un proceso por medio del cual las secuencias de ácido nucleico se amplifican en número. Hay diversos medios para amplificar enzimáticamente las secuencias de ácido nucleico. Actualmente el método más comúnmente utilizado es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Otros métodos de amplificación incluyen LCR (reacción en cadena de la ligasa) que utiliza la ligasa de DNA, y una sonda que consiste de dos mitades de un segmento de DNA que está complementariamente a la secuencia del DNA para ser amplificado, replicasa de enzima Qß y una plantilla de secuencia de ácido ribonucleico (RNA) adherida a una sonda complementaria al DNA para ser copiada que se utiliza para hacer una plantilla de DNA para la producción exponencial del RNA complementario; amplificación del desplazamiento de la hebra (SDA) ; amplificación de la replicasa de enzima Qß (QßRA) ; replicación auto-mantenida (3SR) ; y NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico) , que se puede realizar sobre RNA o DNA como la secuencia de ácido nucleico para ser amplificada.

Un "fragmento" de una molécula tal como una proteína o ácido nucleico se propone para referirse a cualquiera porción de la secuencia genética de aminoácidos o nucleótidos . Como se utiliza en la presente, el término "genoma" se refiere a todo el material genético en los cromosomas de un organismo particular. El tamaño generalmente es dado como su número total de pares de base. Dentro del genoma, el término "gen" se refiere a una secuencia ordenada de nucleótidos localizada en una porción particular sobre un cromosoma particular que codifica un producto funcional específico (por ejemplo, una proteína o molécula de DNA). Por ejemplo, se conoce que la proteína de leptin se codifica mediante el gen ob { obeso) y se manifiesta que está involucrado en la regulación del apetito, el metabolismo basal y la deposición de grasa. En general, unos atributos genéticos del animal, como se define por la secuencia de nucleótidos de su genoma, son conocidos como su "genotipo", mientras que los atributos físicos del animal se describen como su "fenotipo". Para "heterocigoto" o "polimorfismo heterocigoto" se propone que los dos alelos de una célula diploide u organismo en unos sitios dados son diferentes, esto es, que tienen un nucleótido diferente intercambiado para el mismo nucleótido en el mismo lugar en sus secuencias.

Para "homocigoto" o "polimorfismo homocigoto" se propone que los dos alelos de una célula diploide u organismo en unos sitios dados sean idénticos, esto es, que tienen el mismo nucleótido para el intercambio de nucleótidos en el mismo lugar en sus secuencias. Para "hibridización" o "que hibridiza", como se utiliza en la presente, se propone para la formación de pares de base A-T y C-G entre la secuencia de nucleótidos de un fragmento de un segmento de un polinucleótido y una secuencia de polinucléotidos complementaria de un oligonucleótido. Para complementario se propone que en los sitio de cada A, C, G o T (o U en un ribonucleótido) en la secuencia de fragmentos, el oligonucleótido secuenciado tiene un T, G, C o A, respectivamente. El fragmento/ oligonucleótido hibridizado es llamado un "doble" . Un "complejo de hibridización, tal como un análisis intercalado, se propone un complejo de moléculas de ácido nucleico que incluye por lo menos el ácido nucleico objetivo y una sonda sensora. También puede incluir una sonda fijadora. Para "inmovilizado sobre un soporte sólido" se propone que un fragmento, cebador u oligonucleótido se adhieran a una sustancia en una ubicación particular de tal manera que el sistema que contiene el fragmento, cebador u oligonucleótido inmovilizado se pueda someter al lavado u otra manipulación física o química sin que se desaloje de esa ubicación. Un número de soportes y medios sólidos para inmovilizar las moléculas que contienen nucleótidos se conocen en la técnica; cualquiera de estos soportes y medios se pueden utilizar en los métodos de esta invención. Como se utiliza en la presente, el término "ganancia de peso incrementada" se propone un incremento biológicamente significante en la ganancia de peso arriba del medio de una población dada. Como se utiliza en la presente, el término "sitios" o "sitio" se refiere al sitio de un gen en un cromosoma. Un alelo solo de cada uno de los sitios se hereda de cada padre. Cada combinación particular del animal de alelos se refiere como su "genotipo". Donde ambos alelos son idénticos, el individuo va a ser homozigo por la característica controlada para aquel par de alelos; donde los alelos son diferentes, el individuo va a ser heterozigo para la característica. Una "temperatura de fusión" se propone la temperatura en la que los dobles hibridizados se deshibridizan y regresan a su estado de una hebra. Del mismo modo, la deshibridización ocurrirá en primer lugar entre los dos oligonucleótidos, o, en la presente, un oligonucleótido y un fragmento a temperaturas arriba de la temperatura de fusión del doble resultante. Es actualmente ventajoso que la diferencia en las temperaturas de punto de fusión de los dobles de oligonucleótido-fragmento de esta invención sea de aproximadamente 1°C a aproximadamente 10 °C a fin de ser fácilmente detectable . Como se utiliza en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" se propone para incluir moléculas de DNA (por ejemplo cDNA o DNA genómico), molecular de RNA (por ejemplo, mRNA) , análogos del DNA o RNA generados utilizando análogos de nucleótidos y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos . La molécula de ácido nucleico puede ser de una hebra o de dos hebras, pero ventajosamente es DNA de dos hebras. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un "nucleósido" se refiere a una base unida a un azúcar. La base puede ser adenina (A) , guanina (G) (o sus substitutos, inosina (I) ) , citosina (C) , o timina (T) (o sus substitutos, uracilo U) ) . El azúcar puede ser ribosa (el azúcar de un nucleótido natural en el RNA) o 2-desoxirribosa (el azúcar de un nucleótido natural en el DNA) . Un "nucleótido" se refiere a un nucleósido unido a un grupo de fosfato solo. Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a una serie de residuos de nucleótidos unidos, lo cual el oligonucleótido tiene un número suficiente de bases de nucleótidos para ser utilizado en una reacción de PCR. Una secuencia de polinucleótidos corta, se puede basar en, o designar de, una secuencia genómica o cDNA que se utiliza para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un DNA o RNA idéntico, similar o complementario en una célula o tejido particular. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar químicamente y se pueden utilizar como cebadores o sondas. Oligonucleótidos se propone cualquier nucleótido de más de 3 bases de longitud utilizado para facilitar la detección o identificación de un ácido nucleico objetivo, incluyendo sonda y cebadores. "Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a una reacción de amplificación de DNA, mediada con polimerasa, termocíclica . Una PCR típicamente incluye moléculas de plantilla, cebadores de oligonucleótidos complementarios a cada hebra de las moléculas de plantilla, una polimerasa de DNA termoestable, y desoxirribonucleótidos, involucra tres procesos distintos que se repiten multiplicadamente para efectuar la amplificación del ácido nucleico original. Los tres procesos (desnaturalización, hibridización, y extensión del cebador) frecuentemente se realizan en distintas temperaturas, y en distintas etapas temporales. En muchas modalidades, sin embargo, los procesos de extensión de hibridización y del cebador se pueden realizar concurrentemente. La muestra de nucleótido que se analiza puede ser productos de amplificación de PCR proporcionados utilizando las técnicas y ciclos rápidos descritas en las patentes norteamericanas Nos. 6,569,672; 6,569,627; 6,562,298; 6,556,940; 6,569,672; 6,569,627; 6,562,298; 6,556,940; 6,489,112; 6,482,615; 6,472,156; 6,413,766; 6,387,621; 6,300,124; 6,270,723; 6,245,514; 6,232,079; 6,228,634; 6,218,193; 6,210,882; 6,197,520; 6,174,670; 6,132,996; 6,126,899; 6,124,138; 6,074,868; 6,036,923; 5,985,651; 5,958,763; 5,942,432; 5,935,522; 5,897,842; 5,882,918; 5,840,573; 5,795,784; 5,795,547; 5,785,926; 5,783,439; 5,736,106; 5,720,923; 5,720,406; 5,675,700; 5,616,301; 5,576,218 y 5,455,17, las descripciones las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades. Otros métodos de amplificación incluyen, sin limitación, NASBR, SDA, 3SR, TSA y replicación de círculo rodante. Se entiende que, en cualquier método para producir un polinucleótido que contiene nucleótidos modificados dados, se pueden utilizar una o varias polimerasas o métodos de amplificación. La selección de las condiciones de polimerización óptimas depende de la aplicación. Una "polimerasa" es una enzima que cataliza la adición secuencial de las unidades monoméricas a una cadena polimérica o enlaza dos o más unidades monoméricas para iniciar una cadena polimérica. En modalidades ventajosas de esta invención, la "polimerasa" trabajará al adicionar unidades monoméricas cuya identidad se determina mediante y que es complementaria a una molécula de plantilla de una secuencia específica. Por ejemplo, las polimerasas de DNA tales como pol 1 de DNA y polimerasa Taq adicionan desoxirribonucleótídos al extremo 3' de una cadena de polinucleótidos en una manera dependiente de la plantilla, sintetizando de esta manera un ácido nucleico que es complementario a la molécula de plantilla. Las polimerasas se pueden utilizar ya sea para extender un cebador una vez o repetidamente o para amplificar un polinucleótido mediante el cebado repetido de dos hebras complementarias utilizando dos cebadores. Un "polinucleótido" se refiere a una cadena lineal de nucleótidos utilizados mediante un enlace de fosfodiéster entre el grupo de 3 '-hidroxilo de un nucleósido y el grupo de 5' -hidroxilo de un segundo nucleósido que a su vez se enlaza a través de su grupo 3' -hidroxilo al grupo de 5' -hidroxilo de un tercer nucleósido y así sucesivamente para formar un polímero comprendido de nucleósidos enlazados por una cadena principal de fosfodiéster. Un "polinucleótido modificado" se refiere a un polinucleótido en el cual uno o más nucleótidos naturales han sido parcialmente o sustancialmente reemplazados con nucleótidos modificados. Un "cebador" es un oligonucleótido, la secuencia de por lo menos una porción de la cual es complementaria a un segmento de DNA de plantilla que se amplifica o se replica. Típicamente los cebadores se utilizan en el desempeño de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Un cebador hibridiza con (o "recoce" a) el DNA de plantilla y se utiliza por la enzima de polimerasa como el punto de inicio para el proceso de replicación/a plificació . Para "complementario" se propone que la secuencia de nucleótidos de un cebador sea tal que el cebador puede formar un complejo de enlace de hidrógeno estable con la plantilla; es decir, el cebador puede hibridizar o recocer la plantilla por la virtud de la formación de pares bases sobre una longitud de por lo menos diez pares base consecutivos. Los cebadores en la presente se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios a las hebras diferentes de una secuencia de DNA objetiva particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridizarse con sus hebras respectivas. Por lo tanto, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de nucleótidos no complementario se puede adherir al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia del cebador que es complementaria a la hebra. Alternativamente, las bases no complementarias o secuencias más largas pueden ser interdispersadas en el cebador, con la condición que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la hebra para hibridizar con la misma y formar de esta manera la plantilla para la síntesis del producto de extensión. "Sondas" se refiere a las secuencias de ácido nucleico de oligonucleótidos de longitud variable, utilizadas en la detección de las secuencias de ácido nucleico idénticos, similares o complementarias mediante la hibridización. Una secuencia de oligonucleótidos utilizada como una sonda de detección se puede marcar con una porción detectable. Son conocidas diversas porciones de marcado en la técnica. La porción puede, por ejemplo, ya sea ser un compuesto radioactivo, una enzima detectable (por ejemplo peroxidasa del rábano picante (HRP) ) o cualquier otra porción capaz de generar una señal detectable tal como una señal calorimétrica fluorescente quimioluminiscente o electroqui ioluminiscente . La porción detectable se puede detectar utilizando métodos conocidos. Como se utiliza en la presente, el término "proteína" se refiere a una molécula grande compuesta de una o más cadenas de aminoácidos en un orden específico. El orden se determina mediante la secuencia base de nucleótidos en el gen que codifica para la proteína. Las proteínas se requieren para la estructura, función, irregulación de las células, tejidos, y órganos del cuerpo. Cada proteína tiene una función única. Como se utilizan en la presente, los términos "atributos de calidad", "atributos" o "atributos físicos" se refieren a propiedades ventajosas del animal que resulta de las genéticas. Los atributos de calidad incluyen, pero no se limitan a, la habilidad genética del animal para metabolizar energía, producir leche, aumentar la grasa intramuscular, poner huevos, producir descendencia, producir proteínas particulares en la carne o leche, o retener proteínas en la leche. Los atributos físicos incluyen carnes marmóreas o magras. Los términos se utilizan intercambiablemente. Una "enzima de restricción" se refiere a una endonucleasa (una enzima que segmenta los enlaces de fosfodiéster dentro de una cadena de polínucleótidos) que segmenta el DNA en respuesta a un sitio de reconocimiento en el DNA. El sitio de reconocimiento (sitio de restricción) consiste de una secuencia específica de nucleótidos típicamente de aproximadamente 4-8 nucleótidos de largo. Un "polimorfismo de nucleótidos sencillo" o "SNP" se refiere al polinucleótido que refiere otro polinucleótido mediante un intercambio de nucleótidos sencillo. Por ejemplo, sin limitación, el intercambio de un A por un C, g o T en la secuencia completa de polinucleótidos constituye un SNP. Por su puesto, es posible tener más de un SNP en un polinucleótido particular. Por ejemplo, en unos sitios en un polinucleótido, un C se puede intercambiar por un T, en otros sitios un G se puede intercambiar por un A, y así sucesivamente. Cuando se refiere a los SNPs, el polinucleótido es más frecuente de DNA. Como se utiliza en la presente, una "plantilla" se refiere a una hebra de polinucleótidos objetivo, por ejemplo, sin limitación, una hebra de DNA que ocurre naturalmente no modificada, con una polimerasa que usa como un medio para reconocer que nucleótido debe incorporarse después en una hebra de crecimiento para polimerizar el complemento de la hebra que ocurre naturalmente. Tal hebra de DNA puede ser de una sola hebra o puede ser parte de una plantilla de DNA de dos hebras. En las aplicaciones de la presente invención que requieren ciclos repetidos de polimerización, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la hebra de plantilla misma puede llegar a ser modificada mediante la incorporación de nucleótidos modificados, todavía aun sirve como una plantilla para una polimerasa para sintetizar los polinucleótido adicionales. Una "reacción termocíclica" es una reacción de etapas múltiples en donde por lo menos dos etapas se logran al cambiar la temperatura de la reacción. Una "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima de polimerasa de DNA o RNA que puede someterse a temperaturas extremadamente altas, tal como aquellas que se acercan a 100°C. Frecuentemente, las polimerasas termoestables se derivan de organismos que viven en temperatura extremas, tal como termos acuáticos. Ejemplos de polimerasas incluyen Taq, Tuh, Pfu, Vent, deep vent, UITma y variaciones y derivaciones de las mismas. Una "variación" es una diferencia en la secuencia de nucleótidos entre los polinucleótidos relacionados. La diferencia puede ser la supresión de uno o más nucleótidos de la secuencia de un polinucleótido comparado a la secuencia de un polinucleótido relacionado, la adición de uno o más nucleótidos o la sustitución de un nucleótido por otro. Los términos "mutación", "polimorfismo" y "variación" se utilizan intercambiablemente en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "variación" en singular va a ser construido para incluir múltiples variaciones; es decir, dos o más adiciones, supresiones y/o sustituciones de nucleótidos en el mismo polinucleótido. Un "punto de mutación" se refiere a una sustitución sencilla de un nucleótido por otro. A menos que de otra manera se defina, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como comúnmente es entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica de la biología molecular. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen en la presente . Las definiciones adicionales se proporcionan en el contexto enseguida. A menos que de otra manera se defina, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como comúnmente es entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica de la biología molecular. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen en la presente. ii . Aspectos Generales de la. Invención La presente invención proporciona métodos para la identificación y selección de animales basados en la presencia de los SNPs en el gen ob (obeso) - un gen que codifica la proteína de leptin. El leptin es un polipéptido específico del adiposito 16-kDa involucrado en la regulación del apetito, metabolismo basal, deposición de grasa y producción de leche. El gen ob ha sido trazado para cromosomas específicos en diversos animales diferentes, permitiendo al gen que se secuencia en varias especies diferentes. Se ha encontrado que hay conservación significante de DNAs de ob y polipéptidos de leptin entre las especies. Los SNPs que tiene el mismo o efectos similares fenotípicos para aquellos de la presente invención puedan ocurrir en muchas especies animales diferentes. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para determinar si un animal o individuo de una especie de interés posee los SNPs descritos en la presente. En una modalidad preferida, el gen ob de un animal bovino se clasifica para la presencia del SNPs de la presente invención. En un aspecto, la presente invención se relaciona a la identificación de polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs) en el promotor de leptin y a métodos para la identificación de animales que llevan los alelos específicos de estos SNPs que se asocian con los niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, proporción de peso, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona a la asociación de un SNP previamente reportado en el exón 2 del gen de leptin, con niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. La presente invención también proporciona oligonucleótidos que se pueden utilizar como cebadores para amplificar las secuencias de ácido nucleico específicas del gen ob, y oligonucleótidos que se pueden utilizar como sondas en al detección de las secuencias de ácido nucleico del gen ob. La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos para la región de promotor flanqueante 5' y el exón 1 del gen o bovino del "tipo silvestre" . Esta secuencia de "tipo silvestre" tiene un número de acceso de GenBank AB070368 y se designa en la presente como SEQ ID NO.l. En la presente invención se ha observado sorprendentemente que 3 SNPs previamente desconocidos (especialmente UASMSl, UASMS2 y UASMS3) localizados en la región de promotor del ob, y un SNP previamente conocido en el exón 2 se asocian con ciertos atributos económicamente valiosos en los animales, en particular en el ganado bovino. El SNP llamado UASMSl constituye una substitución (C/T) de citosina (C) a timína (T) en la posición 207 del promotor del gen de leptin bovino. El SNP llamado UASMS2, constituye una substitución (substitución C/T) de citosina (C) a timina (T) en la posición 528 del promotor del gen del leptin bovino. El SNP llamado UASMS3 constituye una substitución (substitución C/G) de citosina (C) a guanina (G) en la posición 1759 del promotor de gen de leptin bovino. El sistema de numeración de nucleótidos utilizado en la presente para la identificación de los SNPs del promotor de leptin UASMSl, UASMS2 y UASMS3 es aquel utilizado para la secuencia del promotor de leptin bovino de "tipo silvestre" SEQ ID NO .1. Los polimorfismos UASMSl, UASMS2 y UASMS3 se localizan en la secuencia regulatoria 5' del gen de leptin, no la región de codificación del gen, y así no da por resultado cualquier sustitución de aminoácido en un producto del gen de leptin.

El SNP llamado EXON2-FB descrito en la presente se identificó previamente por Buchanan y colaboradores (2002) y constituye una mutación de mal sentido de citosina (C) a timina (T) en la posición 1759 en el exón 2 de la región de codificación del gen de leptin bovino de "tipo silvestre" (No. de acceso de GenBank AY138588, y SEQ ID NO. 5) . El sistema de numeración de nucleótidos utilizado en la presente para la identificación del SNP EXON2-FB es aquel utilizado para la secuencia exón 2 de leptin bovino de "tipo silvestre" SEQ ID NO. 5) . iii . Muestras de Tejido y DNA A fin de determinar el genotipo de un animal dado de acuerdo a los métodos de la presente invención, es necesario tener una muestra del DNA genómico de aquel animal. Típicamente, esa muestra del DNA genómico será obtenida a partir de una muestra de tejido o células tomadas de ese animal . Una muestra de tejido o células se puede tomar de un animal en cualquier tiempo en el tiempo de vida de un animal pero antes de que la identidad del canal se pierda. La muestra de tejido puede comprender pelo (incluyendo raíces), piel, hueso, estropajos bucales, sangre, saliva, semen, embriones, músculo o cualquiera de los órganos internos. En el método de la presente invención, la fuente de la muestra de tejido, y así también la fuente de la muestra de ácido nucleico de prueba, no es crítica. Por ejemplo, el ácido nucleico de prueba se puede obtener de células dentro de un fluido del cuerpo del animal, o de células que constituyen un tejido del cuerpo del animal. El fluido del cuerpo particular del cual las células se obtienen también no es crítico a la presente invención. Por ejemplo, el fluido del cuerpo se puede seleccionar del grupo que consiste de sangre, ascitis, fluido pleural y fluido espinal. Además, el tejido del cuerpo particular del cual las células se obtienen también no es crítico a la presente invención. Por ejemplo, el tejido del cuerpo se puede seleccionar del grupo que consiste de tejido de piel, endometrial, uterino y cérvico. Se pueden utilizar tejidos tanto normales como de tumor. Típicamente, la muestra de tejido se marca con un número de identificación u otros indicios que relacionan la muestra al animal individual del cual la muestra se tomó. La identidad de la muestra ventajosamente permanece constante por todos los métodos de la invención garantizando de esta manera la integridad y continuidad de la muestra durante la extracción y análisis. Alternativamente, los indicios se pueden cambiar en un modo regular que asegura que el dato, y cualquier otro dato asociado, se puedan relacionar otra vez al animal del que se obtuvo el dato. La cantidad/tamaño de la muestra requerida es conocida por aquellos expertos en la técnica. Idealmente, el tamaño/volumen de la muestra de tejido recogida debe ser tan consistente como sea posible dentro del tipo de la muestra y la especie del animal. Por ejemplo, para el ganado vacuno, ejemplos no limitativos de tamaños de muestra/métodos incluyen carne no grasa: 0.0002 g, 0.0010 g; piel: 0.0004 g a 0.0010 g; raíces de pelo: mayor que 5 y menor que 20; estropajos bucales: 15 a 20 segundos de frotación con presión moderada en el área entre el labio superior y la encía utilizando una brocha de citología Cytosoft®; hueso: 0.0020 g a 0.0040 g; y sangre: 30 a 70 µL. Generalmente, la muestra de tejido se coloca en un contenedor que se marca utilizando un sistema de numeración que lleva un código que corresponde al animal, por ejemplo, a la etiqueta de la oreja del animal. Por consiguiente, el genotipo de un animal particular es fácilmente rastreable todo el tiempo. En una modalidad de la invención, un dispositivo de muestreo y/o contenedor se puede suministrar al granjero, un matadero o un comerciante. El dispositivo de muestreo ventajosamente toma una muestra consistente y reproducible de los animales individuales mientras que simultáneamente evita cualquier contaminación cruzada del tejido. Por consiguiente, sería consistente el tamaño en volumen de los tejidos de muestra derivados de animales individuales. De acuerdo a la presente invención, una muestra de DNA genómico se obtiene de la muestra de tejido del animal de ganado de interés. Se utiliza cualquier fuente de células o tejidos, una cantidad suficiente de células se debe obtener para proporcionar una cantidad suficiente de DNA para el análisis. Está cantidad será conocida o fácilmente determinable por aquellos expertos en la técnica. El DNA se aisla del tejido/células mediante técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo las patentes norteamericanas Nos. 6,548,256 y 5,989,431, Hirota y colaboradores, Jinrui Idengaku Zasshi. Septiembre de 1989; 34 (3) : 217-23 y John y colaboradores, Nucleic Acids Res 1991 25 de Enero; 19 (2) : 408; las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades) . Por ejemplo, el DNA de peso molecular alto se puede purificar de célula o tejidos utilizando la extracción con proteinasa K y la precipitación con etanol. El DNA se puede extraer de un espécimen animal utilizando cualquier otro de los métodos adecuados conocidos en la técnica . iv. Determinación del Genotipo de un Animal de Interés Es un objetivo de la presente invención determinar el genotipo de un animal dado de interés, a fin de identificar los animales que llevan los alelos específicos de los SNPs de la invención que se asocian con los niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. Hay muchos métodos conocidos en la técnica par determinar el genotipo de un animal y para identificar si una muestra de DNA dada contiene un SNP particular. Cualquier método para determinar el genotipo se puede utilizar para determinar el genotipo ob en la presente invención. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación amplimer, secuenciación de DNA, espectroscopia de fluorescencia, análisis de hibridización basado en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (o "FRET") , clasificación de alto rendimiento, espectroscopia de masa, hibridización de ácido nucleico, reacción en cadena de polimerasa (PCR) análisis RFLP y cromatografía de tamaño (por ejemplo, cromatografía capilar o de gel) , todos de los cuales son bien conocidos por uno de habilidad en la técnica. En particular, los métodos para determinar los polimorfismos de nucleótidos, particularmente polimorfismos de nucleótidos sencillos, se describen en las patentes norteamericanas Nos. 6,514,700; 6,503,710; 6,468,742; 6,448,407; 6,410,231; 6,383,756; 6,358,679; 6,322,980; 6,316,230; y 6,287,766 y reexaminado por Chen and Sullivan, Pharmacogenomics J 2003; 3(2):77-96, las descripciones las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades. v. Determinación del Genotipo Mediante Secuenciación En una modalidad, la presencia o ausencia de los SNPs de la presente invención se determina al clasificar la región de la muestra de DNA genómica que abarca el sitio polimórfico. Muchos métodos de secuenciación de DNA genómico son conocidos en la técnica y cualquiera de tal método se puede utilizar, ver por ejemplo Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; A, Laboratory Manual 2d ed. (1989) . Por ejemplo, como se describe enseguida, un fragmento de DNA que abarca la ubicación del SNP de interés se puede amplificar utilizando la reacción en cadena de la polimerasa o alguna otra reacción de amplificación mediada con polimerasa cíclica. La región amplificada del DNA luego se puede secuenciar utilizando cualquiera método conocido en la técnica. Ventajosamente, la secuenciación de ácido nucleico es mediante métodos automatizados (reexaminado por Meldrum, Genome Res, 2000 Sep; 10(9): 1288-303, la descripción de la cual se incorpora por referencia en su totalidad) , por ejemplo utilizando un Sistema de Análisis Genético CEQ 8000 Beckman (Beckman Coulter Instruments, Inc.). Los métodos para la secuenciación de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de DNA fluorescente automatizado (ver, por ejemplo, Watts & MacBeath, Methods Mol Biol. 2001; 167:153-70 y MacBeath y colaboradores, Methods Mol Biol 2001; 167:119-52), electroforesis capilar (ver, por ejemplo, Bosserhoff y colaboradores, Comb Chem High Throughput Screen. 2000 Dec; 3 ( 6) : 455-66) , chips de secuenciación de DNA (ver, por ejemplo, Jain, Pharmacogenomics, 2000 Aus; 1 (3) : 289-307 ) , espectrometría de masas (ver, por ejemplo, Yates, Trends Genet, 2000 Jan; 16(1): 5-8), pirosecuenciación (ver, por ejemplo, Ronaghi, Genome Res. 2001 Jan; 11(1): 3-11), y electroforesis de gel de capa ultra delgada (ver, por ejemplo, Guttman & Ronai, Electrophoresis . 2000 Dec; 21 (18) : 3952-64) , las descripciones las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades. La secuenciación también se puede hacer mediante cualquier compañía comercial. Ejemplos de tales compañías incluyen, pero no se limitan a, the University of Georgia Molecular Genetics Instrumentation Facility (Athens, Georgia) o SeqWright DNA Technologies Services (Houston, Texas) . iv) Determinación del Genotipo Utilizando la Amplificación Mediada con Polimerasa Cíclica En ciertas modalidades de la presente invención, la detección de un SNP dado se puede realizar utilizando métodos de amplificación mediados con polimerasas cíclicas. Cualquiera de uno de los métodos conocidos en la técnica para la implicación del DNA se pueden utilizar, tal como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barany, F. , Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A) 88:189-193 (1991)), el análisis de desplazamiento de hebra (SDA) , o el análisis de ligación del oligonucleótido ("OLA") (Landegren, U. y colaboradores, Science 241:1077-1080 (1988)). Nickerson, D. A. y colaboradores han descrito un análisis de detección de ácido nucleico que combina los atributos de la PCR y OLA ( Nickerson, D. A. y colaboradores, Proc. Nati, Acad. Sci. (U.S.A.) 87:8923-8927 (1990)). También se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos, tal como sistemas de amplificación basados en la transcripción (Malek, L.T. y colaboradores, patente norteamericana No. 5,130,238; Davey, C. y colaboradores, solicitud de patente europea 329,822; Schuster y colaboradores, patente norteamericana No. 5,169,766; Millar, H. I. y colaboradores, solicitud de PCT WO89/96700; Kwoh, D. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci (S.S.A.) 86:1173 (1989) , Gingeras, T. R. y colaboradores, solicitud de PCT WO88/10315) ) , o métodos de amplificación isotérmicos (Walter, G.T. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:392-396 (1992) ) . El método más ventajoso para amplificar los fragmentos de DNA que contienen los SNPs de la invención emplean la PCR (ver por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,965,188; 5,066,584; 5,338,671; 5,348,853; 5,364,790; 5,374,553; 5,403,707; 5,405,774; 5,418,149; 5,451,512; 5,470,724; 5,487,993; 5,523,225; 5,527,510; 5,567,583; 5,567,809; 5,587,287; 5,597,910; 5,602,011; 5,622,820; 5,658,764; 5,674,679; 5,674,738; 5,681,741; 5, 702,901 5,710,381; 5,733,751; 5,741, 6 0 ; 5,741, 676; 5 753,467 5,756,285; 5,776, 686; 5,811,295; 5,817,797; 5 827, 657 5,869,249; 5,935,522; 6,001,645; 6,015, 534; 6 015,666 6,033,854; 6,043,028; 6,077, 664; 6,090,553; 6 , 168,918 6,174,668; 6,174, 670; 6,200,747; 6,225, 093; 6 r232,079 6,261,431; 6,287,769; 6,306,593; 6,440, 668; 6 468,743 6,485,909; 6,511,805; 6,544,782; 6, 566,067; 6, 569, 627; 6, 13,560; 6,613,560 y 6,632,645; las descripciones las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades), utilizando los pares de cebadores que son capaces de hibridizar a las secuencias próximas que definen o flanquean un sitio polimórfico en su forma de dos hebras. Para realizar una reacción de amplificación mediada con polimerasa cíclica de acuerdo a la presente invención, los cebadores se hibridizan o se recocen a las hebras opuestas del DNA objetivo, la temperatura luego se eleva para permitir que la polimerasa de DNA termoestable extienda los cebadores y así replica el segmento específico del DNA que abarca la región entre los dos cebadores. Luego la reacción se termocicla de modo que en cada ciclo la cantidad de DNA que representa las secuencias entre los dos cebadores se duplica, y la amplificación específica de las secuencias del DNA del gen ob, si está presente, resulta. Cualquiera de una variedad de polimerasas se puede utilizar en la presente invención. Para reacciones termocíclicas, las polimerasas son polímerasas termoestables tales como Taq, KlenTaq, Fragmento Sroffel, Deep Vent, Tth, Pfu, Vent, y UITma, cada una de las cuales son fácilmente disponibles de fuentes comerciales. Para las reacciones no termocíclicas, y en ciertas reacciones termocíclicas, la polimerasa frecuentemente será una de muchas polimerasas comúnmente utilizadas en el campo, y comercialmente disponibles, tal como pol 1 DNA, fragmento Klenow, polimerasa de DNT T7, y polimerasa de DNA T4. La guía para el uso de tales polimerasas fácilmente se puede encontrar en la literatura del producto y en general en las guías de biología moleculares . Típicamente, el recocido de los cebadores para la secuencia de DNA objetiva se lleva a cabo por aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 37-55°C, la extensión de la secuencia del cebador por la enzima de la polimerasa (tal como polimerasa Taq) en la presencia de trifosfatos nucleósidos se lleva a cabo por aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 70-75°C, la etapa de desnaturalización para liberar el cebador extendido se lleva a cabo por aproximadamente 1 minutos a aproximadamente 90-95°C. Sin embargo, estos parámetros se pueden variar, y una de habilidad en la técnica fácilmente conocería como ajustar los parámetros de temperatura y tiempo de la reacción para lograr los resultados deseados. Por ejemplo, los ciclos pueden ser tan cortos como 10, 8, 6, 5, 4.5, 4, 2, 1, 0.5 minutos o menos . También, las técnicas "de dos temperaturas" se pueden utilizar donde ambas etapas de recocido y extensión pueden ser llevadas a cabo en la misma temperatura, de manera típica entre aproximadamente 60-65 °C, reduciendo de esta manera la longitud de cada ciclo de amplificación y dando por resultado un tiempo de análisis más corto. Típicamente, las reacciones descritas en la presente ser repiten hasta que una cantidad detectable del producto se genere. Frecuentemente, tales cantidades detectables del producto están entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 100 ng, aunque las cantidades más grandes por ejemplo 200 ng, 500 ng, 1 mg o más también pueden, por supuesto, ser detectadas. En términos de concentración, la cantidad del producto detectable puede ser de aproximadamente 0.01 pmol, 1 pmol, 10 pmol, o más. Así, el número de ciclos de la reacción que se realizan puede ser variado, mientras más ciclos se realizan, más producto amplificado se produce. En ciertas modalidades, la reacción comprende 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más ciclos. Por ejemplo, la reacción de PCR se puede llevar a cabo utilizando aproximadamente 25-50 µl de muestras que contienen de aproximadamenteO .01 a 1.0 ng de la secuencia de amplificación de plantilla, aproximadamente 10 a 100 pmol de cada cebador genérico, aproximadamente 1.5 unidades de polimerasa de DNA Taq (Promega Corp.) a aproximadamente dDATP 0.2 mM, aproximadamente dCTP 0.2 M, aproximadamente dGTP 0.2 mM, aproximadamente dTTP 0.2 mM, aproximadamente MgCl2 15 mM, aproximadamente Tris-HCl 10 mM (pH 9.0), aproximadamente KCl 50 mM, aproximadamente 1 µg/ml de gelatina, y aproximadamente 10 µl/ml de Tritón X-100 (Saiki, 1988). Aquellos de habilidad en la técnica están consientes de la variedad de nucleótidos disponibles para el uso en las reacciones mediadas con polimerasas cíclica. Típicamente, los nucleótidos consistirán por lo menos en parte de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs) , que son fácilmente de manera comercial disponibles. Los parámetros para el uso óptimo de dNTPs también son conocidos por aquellos de habilidad, y se describen en la literatura. Además, un gran número de derivados de nucleótidos son bien conocidos por aquellos de habilidad y se pueden utilizar en la presente reacción. Tales derivados incluyen nucleótidos marcados fluorescentemente, y permiten la detención del producto que incluye tales nucleótidos marcados, como es descrito enseguida. También incluidos en este grupo están los nucleótidos que permiten la secuenciación de los ácidos nucleicos que incluyen tales nucleótidos, tales como nucleótidos de terminación de cadena, dideoxinucleótidos y nucleótidos resistentes a la nucleasa boronada. Los equipos comerciales que contienen los reactivos más típicamente utilizados para estos métodos de secuenciación de DNA están disponibles y ampliamente utilizados. Otros análogos de nucleótidos incluyen nucleótidos con bromo-yodo, u otros grupos de modificación, que afectan las propiedades numerosas de los ácidos nucleicos resultantes que incluyen su antigenicidad, su replicabilidad, sus temperaturas de fusión, sus propiedades de enlace, etc. Además, ciertos nucleótidos incluyen grupos laterales reactivos, tales como grupos de sulfidrilo, grupos amino, grupos de N~hidroxisuccinimidilo, que permiten la modificación adicional de ácidos nucleicos que los comprenden. La presente invención proporciona oligonucleótidos que se pueden utilizar como cebadores para amplificar las secuencias de ácido nucleico específicos del gen ob de las reacciones de amplificación mediadas con polimerasas cíclica, tal como reacciones PCR. Estos cebadores son útiles en detectar los SNPs UASMSl, UASMS2 o UASMS3 en el promotor de leptin, y el SNP exón 2-FB en el exón 2 del gen de leptin. Es ciertas modalidades, estos cebadores consisten de los fragmentos de oligonucleótidos. Tales fragmentos deben ser de longitud suficiente para permitir la cocción específica o hibridización a la muestra de ácido nucleico. La secuencias típicamente serán aproximadamente 8 a aproximadamente 44 nucleótidos en longitud, pero pueden ser más largos. Las secuencias más largas, por ejemplo, de3 aproximadamente 14 a aproximadamente 50, son ventajosas para ciertas modalidades. En modalidades donde se desea amplificar el fragmento de DNA que comprende los SNPs UAMS1, UASMS2 o UASMS3, se contemplan los cebadores que tienen estiramientos contiguos de nucleótidos de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 de SEQ ID NO: 1 (secuencia del promotor de leptin) . En modalidades donde de se desea amplificar un fragmento de DNA que comprende el SNP EXON2-FB, se contemplan los cebadores que tienen estiramientos contiguos de nucleótidos de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 SEQ ID NO: 5 (exón 2 del gen de leptin) . Aunque varias longitudes diferentes de cebadores se pueden utilizar, y la ubicación exacta del estiramiento de los nucleótidos contiguos en el gen de leptin utilizados para hacer que el cebador pueda variar, es importante que las secuencias por lo cual el cocido de los cebadores delanteros y traseros se localiza en cualquier lado de la posición del nucleótido particular que se sustituye en el SNP para ser amplificado. Por ejemplo, cuando se diseñan los cebadores para la amplificación del polimorfismo UASMSl, un cebador se debe localizar corriente arriba de la posición del nucleótido 207 (no con sobreposición) del promotor de leptin (SEQ ID NO: 1, o 2) y el otro cebador se debe localizar corriente debajo de la posición del nucleótido 207 (no con sobreposición) del promotor de leptin (SEQ ID NO: 1, o 2) . Cuando se designan los cebadores para la amplificación del polimorfismo UASNS2 un cebador primero se debe localizar corriente arriba de la posición de nucleótidos 528 (no con sobreposición) del promotor de leptin (SEQ ID NO: 1, o 3) , y el otro cebador se debe localizar corriente abajo de la posición del nucleótido 528 (no con sobreposición) del promotor de leptin (SEQ ID NO: 1, o 3) . Similarmente, cuando se designan los cebadores de amplificación del polimorfismo UASMS3 un cebador se debe localizar corriente arriba de la posición de nucleótidos 1759 (no con sobreposición) del promotor de leptin (SEQ ID NO: 1, o 4), y el otro cebador se debe localizar corriente abajo de la posición de nucleótidos 1759 (no con sobreposición) . Finalmente, cuando se designan los cebadores para la amplificación del polimorfismo EXON2-FB un cebador se debe localizar corriente arriba de la posición de nucleótidos 304 (no con sobreposición), del exón 2 (SEQ ID NO: 5) , y el otro cebador se debe localizar corriente abajo de la posición de nucleótidos 304 (no con sobreposición) del exón 2. En una modalidad preferida, un fragmento de DNA que abarca y que contiene la ubicación del polimorfismo UASMSl se amplifica desde una muestra de ácido nucleico utilizando un cebador delantero que tiene la secuencia 5'-GGCACAATCCTGTGTATTGGTAAGA-3' (SEQ ID NO: 7), y un cebador trasero que tiene la secuencia 5' GTCCATGTACCATTGCCCAATTT-3' (SEQ ID NO: 8) . Similarmente, en una modalidad preferida, un fragmento de DNA que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS2 se amplifica desde una muestra de ácido nucleico utilizando y un cebador delantero que tiene la secuencia 5'-AGGTGCCCAGGGACTCA-3' (SEQ ID NO: 11), y un cebador trasero que tiene la secuencia 5' -CAACAAAGGCCGTGTGACA-3' (SEQ ID NO: 12). Para la amplificación de un fragmento de DNA que abarca la ubicación del polimorfismo, se prefiere que se utilice un cebador delantero que tiene la secuencia 5'-ATGTATATTTGGTGTGAGAGTGTGTGT-3' (SEQ ID NO: 15) y un cebador trasero que tiene la secuencia 5'-AGCTGGAAAGAACGGATTATAAAATGGT-3' (SEQ ID NO: 16) . Del mismo modo, para la un fragmento de DNA que abarca la ubicación del polimorfismo EXON2-FB se prefiere que se utilice un cebador delantero que tiene la secuencia 5'GGCTTTGGCCCTATCTGTCTTAC~3' (SEQ ID NO: 19), y un cebador trasero que tiene la secuencia 5' -CTTGATGAGGGTTTTGGTGTCA-3' (SEQ ID NO: 20) . Los métodos anteriores emplean cebadores localizados en cualquier lado de, y no en la sobreposición, del SNP a fin de amplificar un fragmento de DNA que incluye la posición de nucleótidos en la que el SNP se localiza.

Tales métodos requieren etapas adicionales, tal como secuenciación del fragmento, o hibridización de las sondas específicas de alelo al fragmento, a fin de determinar el genotipo de sitio polimórfico. Sin embargo, en algunas modalidades de la presente invención, el método de amplificación es por si mismo un método para determinar el genotipo del sitio polimórfíco, como por ejemplo, el "la PCR específica de alelo". En la PCR específica de alelo, los pares de cebadores se seleccionan tal que la amplificación por si misma es dependiente del ácido nucleico de plantilla de entrada que contiene el polimorfismo de interés. En tales modalidades, los pares de cebadores se seleccionan tal que por lo menos un cebador abarca la posición de polinucleótido actual del SNP y es por lo tanto un cebador de oligonucleótido específico de alelo. Típicamente, los cebadores contienen un nucleótido específico de alelo solo en la terminal 3' precedida por las bases que son complementarias al gen de interés. Las condiciones de reacción de la PCR se ajustan tal que la amplificación mediante una polimerasa de DNA procede de las terminales del cebador 3' igualadas pero no procede donde ocurre una desigualdad. El PCR específico de alelo se puede realizar en la presencia de dos cebadores específicos de alelo diferentes, un específico para cada alelo, donde cada cebador se marca un tinte diferente, por ejemplo, un cebador específico de alelo se pude marcar con un tinte verde (por ejemplo fluoresceína) y el otro cebador específico de alelo marcado con un tinte rojo (por ejemplo sulforodamina) . Después de la amplificación, los productos se analizan para la fluorescencia verde y roja. El objetivo es para un genotipo homozigo para producir florescencia verde únicamente, el otro genotipo homozigo para dar fluorescencia roja únicamente, y el genotipo heterozigo para dar fluorescencia roja y verde mezclada. Así, para realizar la PCR específica de alelo para detectar el polimorfismo UASMSl, un cebador se debe sobreponer en la posición del nucleótido 207 de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal que la posición de nucleótido 207 está en la terminal 3' del cebador. Similarmente, para realizar el PCR específico de alelo para detectar el polimorfismo UASMS2, un cebador se debe proponer en la posición del nucleótido 528 de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 3 tal que la posición del nucleótido 528 está en la terminal 3' del cebador. Para realizar la PCR específica de alelo para detectar el polimorfismo UASMS3 un cebador se debe sobreponer en la posición del nucleótido 1759 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4 tal que la posición de nucleótido 1759 está en la terminal 3' del cebador. Finalmente, cuando se diseña los cebadores específicos de alelo para la detección del polimorfismo EXON2-FB, un cebador se debe sobreponer en la posición del nucleótido 304 de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 tal que la posición de nucleótido 304 está en la terminal 3' del cebador. Los métodos para realizar la PCR específica de alelo son bien conocidos en la técnica, y cualquiera de tales métodos se puede utilizar. Por ejemplo los métodos adecuados son enseñados en Myakishev y colaboradores, Genome Research, vol. 1, pl63-169 (2001), Alexander y colaboradores Mol Biotechnol vol 28(3), pl71-174 (2004) y Ruano y colaboradores Nucleic Acids Res. vol 17(20), p8392 (1989), los contenidos de los cuales se incorporan por referencia. En algunas modalidades de la presente invención, los cebadores específicos de alelo se seleccionan de modo que la amplificación crea un sitio de restricción, facilitando la identificación de un sitio polimórfico. Para realizar, la PCR específica de alelo las condiciones de reacción se deben ajustar cuidadosamente tal que el cebador específico de alelo únicamente se enlazará únicamente a un alelo y no al alelo alternativo, por ejemplo, en algunas modalidades las condiciones se ajustan de modo que los cebadores únicamente se enlazaran donde hay un 100% de igualamiento entre la secuencia del cebador y el DNA, y no enlazará si hay una desigualdad de nucleótidos sencilla. vii) Determinación del Genotipo utilizando Métodos Basados en Hibridización En ciertas modalidades de la presente invención, la detención un SNP dado se puede realizar utilizando sondas de oligonucleótidos que enlazan o hibridizan al DNA. La presente invención proporciona sondas del oligonucleótidos que detectan los SNPs UASM1, UASMS2 o UASMS3 en el promotor de leptin bovino, o el SNP EX0N2-FB en el exón 2 del gel de leptin bovino. En ciertas modalidades, estas sondas consisten de fragmentos de oligonucleótidos. Tales fragmentos deben ser de longitud suficiente para proporcionar hibridación específica a la mezcla de ácido nucleico. La secuencia típicamente serán de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos, pero pueden ser más largas. Las sondas de ácido nucleico que tienen estiramientos contiguos de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 23 de nucleótidos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 (promotor de leptin bovino de tipo silvestre) SEQ ID NO: 2 (promotor de leptin bovino con polimorfismo UASMSl), SEQ ID NO: 3 (promotor de leptin bovino con polimorfismo UASMS2) SEQ ID NO: 4 (promotor de leptm bovino con polimorfismo UASMS3) SEQ ID NO: 5 (exón 2 de leptin bovino de tipo silvestre) o SEQ ID NO: 6 (exón 2 de leptin con polimorfismo EXON2-FGB) son contemplados. Aunque varias longitudes diferentes de sondas se pueden utilizar, y la ubicación precisa del estiramiento de los nucleótidos contiguos en el gen de leptin de los cuales la secuencia de sonda se deriva puede variar, la secuencia de sonda debe abarcar la posición del nucleótido particular que se sustituye en el SNP particular para ser detectado. Por ejemplo, las sondas designadas para la detección del polimorfismo UASMSl bovino debe abarcar la posición del nucleótido 207 del promotor de leptin bovino (SEQ ID NO: 2) . Las sondas designadas para la detección del polimorfismo UASMS2 bovino deben abarcar la posición del nucleótido 528 del promotor de leptin bovino (SEQ ID NO: 3) . Similarmente, las sondas designadas para la detección del polimorfismo UASMS3 bovino deben abarcar la posición del nucleótido 1759 del promotor de leptin bovino (SEQ ID NO: 4). Finalmente, las sondas designadas para la detección del polimorfismo EXON2-FB bovino deben abarcar la posición del nucleótido 304 del exón 2 del gen de leptin bovino (SEQ ID NO: 3) . Estas sondas serán útiles en una variedad de modalidades de hibridización, tal como manchado del sur, manchado del norte, y análisis de interrupción de hibridización. También las sondas de la invención se pueden utilizar para detectar los SNPs consecuencias amplificadas tal como los productos de PCR amplificados generados utilizando los cebadores descritos en lo anterior. Por ejemplo, en una modalidad un ácido nucleico objetivo primero se amplifica, tal como por la PCR o la amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) , y el producto de DNA de dos hebras amplificado luego se desnaturaliza y se hibridiza con una sonda. En otras modalidades, el DNA de dos hebras (amplificado o no) se desnaturaliza y se hibridiza con una sonda de la presente invención, y luego el complejo de hibridización se somete a las condiciones de desestabilización o de interrupción. Para determinar el nivel de la energía de interrupción requerida en donde la sonda tiene energía de interrupción diferente para un alelo como es comparado a otro alelo, el genotipo de un gen de un sitio polimórfico se puede determinar. Un ejemplo, puede ver energía de interrupción más baja, por ejemplo, temperatura de fusión, para un alelo que alberga un residuo de citosina en un sitio polimórfico, y una energía requerida más alta para un alelo con un residuo de timina en el sitio polimórfico. Esto se puede lograr donde la sonda tiene 100% de homología con un alelo (una sonda perfectamente igualada) , pero tiene una desigualdad sola con el alelo alternativo. Puesto que la sonda perfectamente igualada se enlaza más ajustadamente al DNA objetivo que la sonda desigualada, requiere más energía para causar que la sonda hibridizada se disocie. En una modalidad las condiciones de desestabilización comprenden una elevación de temperatura. Mientras más alta es la temperatura, mayor es el grado de desestabilización. En otra modalidad, las condiciones de desestabilización comprenden someter el complejo de deshibridización a un gradiente de temperatura, mediante lo cual, conforme la temperatura se incrementa, el grado de desestabilización se incrementa. En una modalidad alternativa, las condiciones de desestabilización comprenden el tratamiento con un compuesto de desestabilización, o un gradiente que comprende incrementar las cantidades de tal compuesto. Los compuestos de desestabilización adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales y urea. Los métodos de desestabilización o desnaturalización de los complejos de hibridización son bien conocidos en la técnica, y cualquier método tal se puede utilizar de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los métodos de desestabilización o desnaturalización de los complejos de hibridización se enseñan por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2d ed. (1989) . Para la detección óptima de las desigualaciones de par de base sencilla, es preferible que haya aproximadamente una diferencia de 1°C a aproximadamente 10°C en la temperatura de fusión del complejo de sonda DNA cuando se enlaza a un alelo como es opuesto al alelo alternativo en el sitio polimórfico. Así, cuando la temperatura se eleva arriba de la temperatura de fusión de una sonda doble: DNA que corresponde a uno de los alelos, aquella sonda se disociará.

En una modalidad del método anterior, una segunda sonda ("fijadora") se puede utilizar. Generalmente, la sonda fijadora no es específica a cualquier alelo, pero hibridiza sin considerar que el nucleótido está presente en el sitio polimórfico. La sonda fijadora no afecta la energía de interrupción requerida para desasociar el complejo de hibridización pero, un lugar, contiene una marca complementaria para utilizarla con la primera sonda ("sensora") , por ejemplo para el uso en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o "FRET". Una sonda sensora adquiera energía de la sonda fijadora una vez que las condiciones son adecuadas para la hibridización entre el DNA objetivo en las sondas fijadoras y sensoras. Una vez que la hibridización ocurre, la sonda fijadora transfiere su energía fluorescente a la sonda sensora, que únicamente emitirá una longitud de oda específica después de que esta adquirió la energía de la sonda fijadora. La detección del SNP ocurre conforme la temperatura se eleve en una proporción determinada, y una lectura se adquiera de la luz fluorescente emitida. Si hay una desigualdad de base sencilla de la sonda y el DNA objetivo causada por la presencia de nucleótido polimórfico alternativo (es decir el SNP) la sonda sensora se disociará más pronto, o en una temperatura más baja, puesto la homología entre el DNA genómico y la sonda sensora será menor que aquella del DNA genómico que no alberga el nucleótido alterado o el SNP. Así, habrá una pérdida de fluorescencia que se puede detectar. Donde la sonda se designa para enlazar a la secuencia del tipo silvestre, la disociación de la sonda del DNA (es decir "la fusión" ocurrirá en una temperatura más baja si el SNP está presente, puesto que la estabilidad del enlace de la sonda al SNP es ligeramente menor que para la secuencia de tipo silvestre. Esto ocurre, obviamente, en ambos cromosomas al mismo tiempo, produciendo de esta manera ya sea una lectura de dos temperaturas de fusión idénticas para un homocigoto o una lectura de dos temperaturas de fusión diferentes para el heterocigoto. Por ejemplo, donde una sonda se designa para obtener la secuencia de alelo que contiene C del polimorfismo UASMSl, la sonda se disociará o se fundirá en una temperatura más baja en las muestras de DNA de los individuos que alojan dos copias de alelo que contiene T polimórfico, dos copias de alelo que contiene C. En otras modalidades, se pueden utilizar dos "sondas específicas de alelo" diferentes para los análisis de un SNP, en la primera sonda específica de alelo para la detección de un alelo, y una segunda sonda específica de alelo para la detección de alelo alternativo. Por ejemplo, en una modalidad los alelos diferentes del polimorfismo ob UASMSl se puede detectar utilizando dos sondas específicas de alelo, una para detectar el alelo que contiene T en la posición del nucleótido 207 del promotor del gen ob, y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 207 del promotor del gen or. En una modalidad preferida una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5' -CTTTCACCTAGTATATCTAG-3' (SEQ ID NO: 9) se utiliza para detectar el alelo que contiene T y una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5'-TCTTTCACCTAGTATGTCTAG-3' (SEQ ID NO 10) se utiliza para detectar el alelo que contiene C. En otra modalidad, los alelos diferentes del polimorfismo ob UASMS2 se pueden detectar utilizando dos sondas específicas de alelo diferentes, una para detectar el alelo que contiene T en la posición del nucleótído 528 del promotor del gen ob, y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 528 del promotor del gen ob. En una modalidad preferida una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5'-AAGCTCTAGAGCCTATGT-3' (SEQ ID NO: 13) se utiliza para detectar el alelo que contiene T, y una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5'-CAAGCTCTAGAGCCTGTGT-3' (SEQ ID NO 14) se utiliza para detectar el alelo que contiene C. En otra modalidad, los alelos diferentes del polimorfismo ob UASMS3 se pueden detectar utilizando dos sondas específicas de alelo diferentes, una para detectar el alelo que contiene G en la posición del nucleótido 1759 del promotor del gen ob, y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 1759 del promotor del gen ob . En una modalidad preferida una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5'-CACACATTCCAATCAA-3' (SEQ ID NO: 17) se utiliza para detectar el alelo que contiene g, y una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5' -CACATTGCAATCAA-3' (SEQ ID NO 18) se utiliza para detectar el alelo que contiene C. En una modalidad adicional los alelos diferentes del polimorfismo ob EXON2-FB se pueden detectar utilizando dos sondas específicas de alelo diferentes, una para detectar el alelo que contiene T en la posición del nucleótido 305 del exón 2 del gen ob, y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 305 del exón 2 del gen ob. En una modalidad preferida una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5' -CCTTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO: 21) se utiliza para detectar el alelo que contiene T, y una sonda de oligonucleótidos que tiene la secuencia de 5' -CCTTGCGGATGGG-3' (SEQ ID NO 22) se utiliza para detectar el alelo que contiene C. Cualquiera de las secuencias de sonda y métodos de hibridización se utilizan, un experto en la técnica puede fácilmente determinar las condiciones de hibridización adecuadas, tal como condiciones de temperatura y químicas.

Tales métodos de hibridización son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para las aplicaciones que requieren alta selectividad, una típicamente deseará emplear condiciones relativamente severas para las reacciones de hibridización, por ejemplo, una seleccionará relativamente condiciones de sal baja y/o temperatura alta, tal como se proporciona NaCl de 0.02 M a aproximadamente 0.10 M a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Tales condiciones de severidad altas toleran poco, si los hay, desigualdad entre la sonda y hebra de plantilla u objetiva, y son particularmente adecuadas para detectar los SNPs específicos de acuerdo a la presente invención. Generalmente se aprecia que las condiciones se pueden volver más severas mediante la adición de cantidades de incremento de formamida. Otras variaciones en las condiciones de reacción de hibridización son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2d ed (1989)). viii) Otras Secuencias de Cebador y Sonda Adecuadas Además de los SNP descritos en lo anterior, será apreciado por aquellos expertos en la técnica que otros polimorfismos de secuencia de DNA del gen ob pueden existir dentro de una población. Tales variaciones alélicas naturales típicamente pueden dar por resultado aproximadamentel-5% de variación en la secuencia de nucleótidos del gen. Por ejemplo, SEQ ID NO: 2: proporciona una secuencia de una región del promotor del gen ob que contiene un polimorfismo en la posición del nucleótido 207 (es decir el SNP UASMSl) . Es posible que otros sitios polimórficos también puedan existir dentro de este fragmento. Además de los variantes alélicos que ocurren naturalmente de la secuencia de nucleótidos, el artesano experto además expresará que los cambios se pueden introducir mediante la mutación en la secuencia de nucleótidos de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Cualquiera de todas las variaciones de nucleótidos adicionales tales se proponen para estar dentro del alcance de la invención. Así, por ejemplo, una sonda de acuerdo a la presente invención se puede designar para enlazar una secuencia del gen ob que contiene no únicamente el polimorfismo UASMSl, sino también otros SNPs que pueden ocurrir dentro de la misma región. Por otra parte, las moléculas de ácido nucleico que difieren de las secuencias de los cebadores y sondas divulgadas en la presente, se proponen para estar dentro del alcance de la invención. La secuencia de ácido nucleico que son complementarias a aquellas secuencias, o que son hibridizables a las secuencias descritas en la presente bajo condiciones de hibridización estándar o severa, y también análogos y derivados también se proponen para estar dentro del alcance de la invención. Ventajosamente, tales variaciones diferirán de las secuencias descritas en la presente por únicamente un número pequeño de nucleótidos, por ejemplo por los nucleótidos 1, 2 o 3. Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a los variantes alélicos naturales, homólogos (es decir, ácido nucleico derivados de otras especies) , u otras secuencias relacionadas (por ejemplo paralogas) de las secuencias descritas en la presente se pueden aislar basado en su homología a los ácidos nucleicos divulgados en la presente, por ejemplo al realizar reacciones de hibridización estándares o severas utilizando todo o una porción de la secuencias de la invención como sonda. Tales métodos para la hibridización y clonación de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. Similarmente, una molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir únicamente un fragmento de las secuencias específicas descritas. Los fragmentos proporcionados en la presente se definen como secuencias de por lo menos 6 ácidos nucleicos (contiguos) , una longitud suficiente para permitir la hibridización específica de los cebadores o sondas de ácido nucleico, y son a lo sumo una porción menor que una secuencia de longitud completa. Los fragmentos se pueden derivar de cualquier porción contigua de una secuencia de ácido nucleico de selección. Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o diferentes a la longitud completa, si el derivado o análogo contiene un ácido nucleico o aminoácido modificado, como es descrito enseguida. Los derivados, análogos, homólogos, y variantes de los ácidos nucleicos de la invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas que contiene regiones que son sustancialmente homologas a los ácidos nucleicos de la invención, en varias modalidades, pero por lo menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o aun 99% de identidad (con una identidad ventajosa de 80-99%) sobre una secuencia de ácido nucleico de tamaño idéntico o cuando se compara a una secuencia alineada en la que la alineación se hace mediante un programa de homología de computadora conocido en la técnica. Para los propósitos de la presente invención, la identidad u homología de secuencias se determina al comparar las secuencias cuando se alineas a fin de maximizar la sobreposición e identidad mientras que minimiza los espacios de secuencia. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar utilizando cualquiera de un número de alto algoritmos matemáticos. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin & Altschul, Proc, Nati. Acad. Sci USA 1990; 86: 2264-2268, modificado como en Karlin & Alrschul, Proc. Nati. Acad. Sci USA 1993; 90: 5873-5877. Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers % Millar, CABIOS 1988; 4: 11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar las secuencias de aminoácidos, se pueden utilizar una tabla de residuos ponderados PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12, y una sanción de espacio de 4. Todavía otro algoritmo útil para identificar regiones de similaridad y alineamiento de secuencia local es el algoritmo FASTA como es descrito en Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448. Ventajoso para el uso de acuerdo a la presente invención es el software versión 2.0 WU-BLAST (Washington University BLAST) . Los programas ejecutables de la versión 2.0 de WU-BLAST para varias plataformas UNIX se pueden descargar de ftp : //blast. wustl. edu/blast/executables . Este programa está basado en la versión 1.4 WU-BLAST, que a su vez está basado en la versión 1.4 NCBI-BLAST de dominio público (Altschul & Gish, 1996) , Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods en Enzymology 266: 460-480; Altschul y colaboradores Journal of Molecular Biology 1990; 215 403-410: Gish & Status, 1993; Nature Genetics 3: 266-272: Karin & Altschul, 1993; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; todo de lo cual se incorpora por referencia en la presente) En todos los programas de búsqueda en el conjunto de las rutinas de alineación espaciadas son integrales a la búsqueda de la base de datos por sí misma. El espaciamiento se puede apagar si se desea. La sanción de error (Q) para un espacio de una longitud es Q=9 para proteínas y BLASTP, y Q=10 para BLASTN, pero se puede cambiar a cualquier número entero. La sanción por resido de error para extender un espacio (R) es R=2 para proteínas y BLASTP, y R=10 para BLASTN, pero se puede cambiar a cualquier número entero. Cualquier combinación de valores para Q y R se puede utilizar a fin de alinear las secuencias a fin de maximizar la sobreposición e identidad mientras que minimiza los espacios de secuencia. La matriz de comparación del aminoácido de error es BLOSUM62, pero otras matrices de comparación de aminoácidos tales como PAM se pueden utilizar. Alternativamente o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre las dos secuencias. La homología de secuencia por ciento se puede calcular como (Nre/ - Ndi/) , donde Nd2/ es un número total en los residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nre/ es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, la secuencia de DNA AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (Nre/ = 8; Nda =2) . "Homología" o "identidad" pueden referirse al número de posiciones que los nucleótidos o aminoácidos idénticos divididos por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de la secuencia en donde la alineación de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lpman (Wilbur & Lipman, Proc Nati Acad Sci USA 1983; 80: 726, incorporada en la presente por referencia), por ejemplo, utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una sanción de especio de 4 , y el análisis asistido con computadora e interpretación de los datos de secuencia que incluyen la alineación se pueden realizar convenientemente utilizando los programas comercialmente disponibles (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Cuando las secuencias de RNA van a ser similares, o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con las secuencias de DNA, la timidina (T) en la secuencia del DNA se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de DNA. Así, las secuencias de RNA están dentro del alcance de la invención y se pueden derivar de las secuencias de DNA, para la timidina (T) en la secuencia de DNA que se considera igual al uracilo (U) en las secuencias de RNA. Sin la experimentación indebida, el experto habilidoso puede consultar con muchos otros programas o referencias para determinar la homología por ciento. ix) Producción de los cebadores y sondas de la invención Los cebadores y sondas descritas en la presente se pueden preparar fácilmente al, por ejemplo, sintetizar directamente el fragmento mediante medios químicos o al introducir secuencias seleccionadas de los vectores recombinantes para la producción recombinante. Los métodos para fabricar un vector o recombinantes o plásmido para amplificación del fragmento ya se in vivo o in vi tro se puede desear cualquier método, por ejemplo, un método que es para o análogo a los métodos divulgados en, o divulgados en los documentos citados en: las patentes norteamericanas Nos 4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051 4,769,331; 4,945,050; 5,494,807; 5,514,375; 5,744,140 5,744,141; 5,756,103; 5,762,938; 5,766,599; 5,990,091 5,174,993; 5,505,941; 5,338,683; 5,494,807; 5,591,639; 5,589,466; 5,677,178; 5,591,439; 5,552,143; 5,580,859; 6,130,066; 6,004,777; 6,130,066; 6,497,883; 6,464,984; 6,451,770; 6,391,314; 6,387,376; 6,376,473; 6,368,603 6,348,196; 6,306,400; 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883; 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6,153,199: 6,090,393 6,074,649; 6,045,803 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6,348,450 y 6;312,683; solicitud de patente norteamericana No. de serie 920,197, presentada el 16 de Octubre de 1986; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; LP 0 370 573; Andreansky y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93 : 11313-11318; Ballay y colaboradores, EMBO J. 1993;4:3861-65; Felgner y colaboradores, J. Biol. Chem. 1994;269:2550-2561;. Frolov y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93:1 1371-11377; Graham, Tibtech 1990;8:85-87; Grunhaus y colaboradores, Sem. Virol. 1992;3:237-52; Ju y colaboradores, Diabetologia 1998;41:736-739; Kitson y colaboradores, J. Virol. 1991;65:3068-3075; McClements y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11414-1 1420; Moss, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11341-11348; Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11349-11353; Pennock y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 1984;4:399-406; Richardson (Ed) , Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.; Smith y colaboradores (1983) Mol. Cell. Biol. 1983;3:2156-2165; Robertson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11334-11340; Robinson y colaboradores, Sem. Immunol. 1997; 9: 271; and Roizman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11307-11312. x) Marcación y Detección de los Cebadores y Sondas de la Invención Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas como cebadores o sondas de acuerdo a la presente invención se pueden marcar con una porción detectable. Como se utiliza en la presente el término "sensores" se refiere a tales cebadores o sondas marcados con una porción detectable. Varias porciones de marcado son conocidas en la técnica. Las porciones pueden ser, por ejemplo, una radiomarca (por ejemplo 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, etc.) enzima detectable (por ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, etc.), un tinte fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo de Texas, rodamina, Cy3, Cy5 Bodypi Rojo Bodipy Far, Amarillo Lucifer, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X y 5-CR 6G, y los similares), un marcador calorimétrico tal como oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo poliestireno, polipropileno, látex, etc.), cuentas, o cualquier otra porción capaz de generar una señal detectable tal como una señal calorimétrica, fluorescente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente (ECL) . Los cebadores o sondas se pueden marcar directamente o indirectamente con una porción detectable, o sintetizar al incorporar la porción detectable. En una modalidad, un marcador detectable se incorpora en un ácido nucleico durante por lo menos un ciclo de una reacción de amplificación mediada con polimerasa cíclica. Por ejemplo, las polimerasas se pueden utilizar para incorporar nucleótidos fluorescentes durante el curso de las reacciones de amplificación mediadas con polimerasa. Alternativamente, los nucleótidos fluorescentes se pueden incorporar mediante la síntesis de los cebadores o zonas de ácido nucleico. Para un oligonucleótido con el tinte fluorescente, uno de los métodos de marcación convencionalmente conocidos se puede utilizar (Nature Biotechnology, 14, 303-308, 1996; Applied and Environmental Microbiology, 63, 1143-1147, 1997; Nucleic Acids Research, 24, 4532-4535, 1996) . Una sonda ventajosa que es una marcada con un tinte fluorescente en el extremo 3' o 5' y que contiene G o C como la base en el extremo marcado. Si el extremo 5' se marca y el extremo 3' no se marca, el grupo OH en al átomo C en la posición 3' el extremo 3' de la ribosa o desoxirribosa se puede modificar con un grupo de fosfato o similar auque ninguna limitación se impone en este aspecto. El medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico, eléctrico, óptico o químico se puede utilizar para detectar tales marcas. El dispositivo y método de detección pueden incluir, pero no se limita a, imagen, óptica, imagen electrónica, imagen con una cámara de CCD, imagen óptica integrada, y espectrometría de masas. Además, la cantidad de la sonda marcada o no marcada enlazada al objetivo se puede cuantificar. Tal cuantificación puede incluir análisis estadísticos. En otras modalidades la detección puede ser por la vía de las diferencias de conductividad entre los sitios concordantes y discordantes, mediante el enfriado rápido, mediante el análisis de perturbación fluorescente, o mediante el transporte de electrones entre las moléculas donadoras y aceptoras .

En todavía otra modalidad, la detección puede ser por la vía de transferencia de energía las moléculas en los complejos de hibridización y las reacciones de PCR o hibridización, tal como mediante la transferencia de energía fluorescente (FET) o la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) . En los métodos FET y FRET, una o más sondas de ácido nucleico se marcan con moléculas fluorescentes, una de las cuales es capaz de actuar como un donador de energía y la otra de las cuales es una molécula aceptora de energía. Estas algunas veces conocidas como una molécula reportadora y una molécula de apagadora respectivamente. La molécula donadora se estimula con una longitud de onda específica de luz por lo cual ésta normalmente exhibirá una longitud de onda de emisión fluorescente. La molécula aceptora también se estimula en esta longitud de onda tal que ésta puede aceptar la energía de emisión de la molécula donadora mediante una variedad de mecanismo de transferencia de energía dependientes de la distancia. Generalmente la molécula aceptora acepta la energía de emisión de la molécula donadora cuando están en proximidad cercana (por ejemplo en la misma, o una molécula vecina) . Las técnicas FET y FRET son bien conocidas en la técnica, y se pueden utilizar fácilmente para detectar los SNPs de la presente invención. Ver por ejemplo las patentes norteamericanas Nos. 5,668,648, 5,707,804 5,728,528, 5,853,992,' y 5,869,255 (para una descripción de los tintes FRET), Tyagi y colaboradores, Nature Biotech. Vol 14, p303-8 (1996), y Tyagi y colaboradores, Nature Biotech. Vol 16, p49- 53 (1998) (para una descripción de las guías moleculares para el FET), y Mergny y colaboradores Nucleic Acid Res. Vol 22, p920-928, (1994) y Wolf y colaboradores PNAS vol 85, p8790-94 (1988) (para descripciones y métodos generales para el FET y FRET) , cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. xi) Composiciones y Equipos para Detección de los SNPs de la Invención Los cebadores y sondas de oligonucleótidos de la presente invención tienen aplicaciones comerciales en equipos de diagnósticos para la detección de los SNPs del gen ob UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB en especímenes de ganado. Un equipo de prueba de acuerdo a la invención puede comprender cualquiera de los cebadores o sondas de oligonucleótidos de acuerdo a la invención. Tal equipo de prueba puede comprender adicionalmente uno o más reactivos para el uso en las reacciones de amplificación mediadas con polimerasa cíclica, tal como polimerasa de DNA, nucleótidos (dNTPs), soluciones reguladoras y los similares. Un equipo de detención de de SNP también puede incluir, una solución reguladora usante para lisar células contenidas en el espécimen.

Un equipo de prueba de acuerdo a la invención puede comprender un par de cebadores de oligonucleótidos de acuerdo a la invención y una sonda que comprende un oligonucleótido de acuerdo a la invención. En algunas modalidades tal equipo contendrá dos sondas de oligonucleótidos específicos de alelos. Ventajosamente, el equipo además comprende medios adicionales, tales como reactivos, para detectar o medir el enlace o los cebadores y sondas de la presente invención, y también idealmente un control positivo y negativo. La presente invención además incluye sondas de acuerdo a la presente invención que se inmovilizan sobre un soporte sólido flexible, tal como papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chips, porta objetos de vidrio, microchips, microcuentas, o cualquier otra matriz tal, todas de los cuales están dentro del alcance de esta invención. La sonda de esta forma ahora es llamada "un chip de DNA". Estos chips de DNA se pueden utilizar para analizar los SNPs de la presente invención. La presente invención además incluye arreglos o microarreglos de moléculas de ácido nucleico que están basadas sobre una o más de las secuencias descritas en la presente. Como se utiliza en la presente "arreglos" o "microarreglos" se refiere a un arreglo de polinucleótidos u oligonucleótido distintos sintetizados sobre un soporte sólido o flexible, tal como papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos de vidrio, o cualquier otro soporte sólido adecuado. En una modalidad, el microarreglo se prepara y se utiliza de acuerdo a los métodos y dispositivos descritos en las patentes norteamericanas Nos. 5,446,603; 5,545,531; 5,807,522; 5,837,832; 5,874,219; 6,114,122; 6,238,910; 6,365,418; 6,410,229; 6,420,114; 6,432,696; 6,475,808 y 6,489,159 y la publicación del PCT No. WO 01/45843 A2, las divulgaciones de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades. xii) Métodos para Agrupar y Seleccionar Animales de Acuerdo al Genotipo SNP Como se describe en detalle en lo anterior, la presente invención proporciona reactivos y métodos para la detección de los SNPs UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EX0N2-FB en las muestras de DNA obtenidas de animales individuales . Por ejemplo, utilizando los métodos de la presente invención, uno puede determinar si un animal dado tiene una citosina o una timina en los sitios UASMSl polimórficos (localizados en la posición del nucleótido 207 del promotor del gen ob) . Habiéndose utilizado los métodos de la invención para determinar el genotipo de un animal de interés en ya sea el sitio polimórfico UASMSl, UASMS2, UASMS3 y/o EXON2-FB, es un objetivo adicional de la presente invención utilizar esta información de genotipo para seleccionar y/o agrupar animales de acuerdo a su genotipo. Como se describe en los ejemplos, ciertos alelos de los SNPs UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EX0N2-FB se asocian con ciertos atributos económicamente importantes tales como niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. Por ejemplo, la presente invención demuestra que el alelo T de los sitios UASMS2 significantemente se asocian con la concentración de leptin de suero, que es la más baja en los animales homozigos con el genotipo CC, intermedio en los animales heterozigos con el genotipo CT, y más alta en animales TT homozigos. Así en una modalidad, donde es deseable agrupar animales de acuerdo a la concentración de leptin circulante (por ejemplo para el uso en la producción alimenticia o para reproducción) , los animales se pueden seleccionar y agrupar de acuerdo a su genotipo en los sitios UASMSl polimórficos. Las asociaciones entre los genotipos de cada uno de los sitios polimórficos UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB y varias otros atributos económicamente importantes se describen en los ejemplos. Así, para cada uno de estos atributos, los animales se pueden de acuerdo al genotipo. Las Figuras 7, 8, 9 y 10 ilustran la utilización de gráficas de flujo de como los animales se pueden clasificar para los SNPs UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB respectivamente, e ilustran como la información del genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para reproducirlos de y/o el uso para la producción alimenticia. Los métodos perfilados en estas gráficas de flujo no se proponen ser limitativos, y aquellos expertos en la técnica reconocerán que varios aspectos de estos métodos podrían ser alterados sin afectar el resultado total. La Figura 7-10 ilustra algo de los atributos fenotípicos que se asocian con cada genotipo. Otros genotipos que muestran algún nivel de correlación para cada genotipo se muestran en la sección de ejemplos . Así, en una modalidad, la presente invención proporciona métodos para agrupar animales y métodos para en manejo de la producción de ganado que comprende el agrupamiento de animales de ganado, tales como ganado vacuno, de acuerdo al genotipo del sitio polimórfico UASMS1, UASMS2, UASMS3 y/o EX0N2-FB. Los métodos de selección y agrupamiento genético de la presente invención se pueden utilizar en conjunción con otros métodos de agrupamiento fenotípico convencionales, tales como agrupamiento de animales mediante atributos visibles tales como peso, tamaño de estructura, atributos de reproducción, y los similares. Los métodos de la presente invención sostienen que la selección de ganado tenga atributos heredables mejoradas, y se puede utilizar para optimizar el desempeño de las manadas de ganado en áreas tales como reproducción, consumo de alimento, calidad del canal/carne y producción de leche.

La presente invención proporciona métodos para clasificar el ganado para determinar aquellos que más probablemente desarrollen una condición de cuerpo deseada al identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo en los genes ob que se correlacionan por aquella condición del cuerpo. Como se describe en lo anterior, y en los Ejemplos, hay varios atributos fenotípicos con los cuales los SNPs de la presente invención se asocian. Cada uno de los atributos fenotípicos se puede probar utilizando los métodos descritos en los ejemplos, o utilizando cualquiera de los métodos adecuados conocidos en la técnica. Utilizando los métodos de la invención un granjero, un operador de lote de alimentación, o los similares, pueden agrupar ganado vacuno de acuerdo a cada propensión genética del animal para una característica deseada tal como niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. Como se determina por el genotipo SNP, además del presente criterio se utilizaría ordinariamente para el agrupamiento. El ganado vacuno se prueba para determinar la homozigocidad o heterozigocidad con respecto a los alelos UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB del gen ob de modo que se pueden agrupar tal que cada corral contiene ganado vacuno con genotipos similares. Cada corral de animales luego se puede alimentar y de otra manera mantener en una manera y por un tiempo determinado por el operador de lote de alimentación que es ideal para la producción de carne antes de la matanza, o para maximizar la producción de leche. Así el granjero u operador de lote de alimentación se presente con oportunidades para eficiencias considerables. En la presente, el alimentador alimenta todo su ganado vacuno lo mismo, incurriendo en los mismos puestos para cada animal, y típicamente, con prácticas de manejo excelentes, talvez el 40% será de grado AAA y recibirá el precio de primera calidad para el grado de aceptabilidad (dependiendo en varios otros factores, tal como edad del animal, como los investigadores saben que el ganado vacuno entre 17-24 meses de edad han incrementado la marmoración comparada a sus contrapartes más jóvenes. Aproximadamente 55% de ganado vacuno se sacrifica en una edad debajo de 16 meses, y 45% sería clasificado en una edad arriba de 17 meses) . De estos, un número significante tendrá exceso de grasa y así recibirá un grado de producción reducido. El balance del ganado vacuno, 60%, será de grado menor que AAA, y así recibe un precio reducido, aunque los costos de lote de alimento ocurrirán incurridos por el operador son los mismos. El agrupamiento y alimentación del ganado mediante el genotipo permite al granjero tratar cada grupo diferentemente con vista al incremento de la ganancia. Se contempla que, sin considerar la conveniencia y pago de primera calidad para cualquier calidad de carne particular en cualquier tiempo dado, proporcionando al granjero con un grupo más uniforme que tiene una calidad de carne pronosticable proporcionará al granjero con la oportunidad para exigir y recibir una recompensa, relativa a los grupos menos uniformes del ganado vacuno actualmente disponibles . Los métodos de la invención también son útiles en programas de reproducción para seleccionar aquellos animales que tiene genotipos deseables para varios atributos económicamente importantes, tales como niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, velocidad de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. La selección y reproducción continua de animales, tal como ganado, que son por lo menos heterozigos y ventajosamente homozigos para un polimorfismo deseable asociado con, por ejemplo, ventaja del canal mejorada, conduciría a una línea de reproducción, o población que tiene números más altos de descendencia y ventaja del canal mejorada. Así, los granjeros pueden incrementar el valor de sus terneros al utilizar los métodos de la presente invención para incrementar la ocurrencia de los alelos específicos en los terneros que se asocien con los atributos económicamente importantes. Así, los SNPs de la presente invención se pueden utilizar como herramientas de selección en programas de reproducción . Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir e ilustrar, pero no limitar, la invención reclamada. Aquellos de habilidad en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían ser cambiados o modificados para producir resultados esencialmente similares. EJEMPLOS Ejemplo 1: Animales y colección de datos fenotipicos Un total de 180 cabezas de ganado vacuno (139 reses y 41 toros) procreados por Angus Cherolais or University of Alberta Hibrid los toros se manejaron y se probaron para crecimiento y eficiencia de alimento bajo condiciones de lote de alimento. La ingesta de alimento se midió para cada animal utilizando el sistema de alimentación automatizado GrowSfe® (GrowSage® Systems Ltd, Airdrie, Alberta, Canadá) . El dato de desempeño y eficiencia completo estuvo disponible en un total de 150 animales, excluyendo a todos los toros en las dos pruebas (total de 21 animales) más 9 de otros animales que murieron o tuvieron que ser excluidos de la prueba debido a salud y otros problemas relacionados. Las medidas de peso de todos los animales se tomaron semanalmente. El dato de desempeño analizado incluye la ganancia diaria promedio (ADG) , peso de punto medio metabólico en prueba (MWT) , ingesta de alimento residual (RFI), relación de conversión de alimentación (FCR) , ingesta de materia seca diaria promedio (DMI), ingesta de energía metabolizable por unidad de peso metabólico (MEWT0'75) , y eficiencia parcial de crecimiento (PEG) . Cada ADG del animal durante la prueba se computó como el coeficiente de la regresión de la regresión lineal de peso (kg) sobre el tiempo (días) utilizando el procedimiento de regresión del SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, 1999). El MWT de cada animal sobre el período de prueba se computó como el peso corporal del punto medio0'75. La ingesta de alimento total de cada animal sobre el período de prueba de 70 días se utilizó para computar la ingesta de materia seca (DMI) para cada animal. La energía metabolizable se calculó como el producto de DMI y el contenido de energía dietética (12.14 MJ ME/kg) dividida por el peso metabólico de cada animal. La ingesta de alimento residual se completo para cada animal como la diferencia entre cada ingesta de alimento actual del animal de la ingesta de alimento diaria esperada pronosticada sobre la ganancia diaria promedio y el peso metabólico de cada animal sobre el período de prueba. La relación de conversión de alimento de cada animal se completo como la relación de la ingesta promedio de la prueba a la ganancia diaria promedio en la prueba. La eficiencia parcial del crecimiento (PEG) arriba del mantenimiento de cada animal se completó como la relación de ADG a la diferencia entre la ingesta de alimento promedio y la ingesta de alimento por mantenimiento. (a) Da tos de conducta alimenticia : La detección de un animal en una litera de alimento mediante el sistema Growsafe inicia un evento de alimentación y termina cuando el tiempo en que las dos lecturas para el mismo animal fue mayor que 300 segundos. La detección de un animal dentro de 300 segundos se consideró que es un evento de alimentación continua. El dato del evento de alimentación luego se utiliza para consultar la duración de alimentación promedio (FD) es la diferencia entre el final del tiempo menos el inicio del tiempo promedio. La duración de alimentación incluye el gasto del tiempo y comprensión, mascamiento, alejamiento de la litera y mascamiento, sociable, rascadura o lamedura. El tiempo hacia debajo de la cabeza alimentándose (FHD, o por otra parte, principalmente incluye el tiempo asociado con la comida y se determina con el número promedio de detecciones de un animal durante un evento de alimentación que regula punto de detección del sistema de 5.7 segundos. (b) Dato de ultrasonido : Las medidas de ultrasonido de 12/13 th de profundidad de grasa de las costillas, los registros del área y marmoración del músculo longissimus se tomaron aproximadamente cada 28 días con un ultrasonido de tiempo real de 500V Aloka con un transductor de arreglo lineal de 3.5-MHz. Cada animal tuvo cinco medidas de ultrasonido repetidas, excepto para los animales removidos antes del tiempo final de la prueba para los estudios metabólicos. En este caso el valor aproximado de la medida se pronosticó desde la proporción del cambio en aquel atributo de las medidas previas. (c) Predicción de las medidas del ultrasonido en peso corporal constante de 500 kg: No se requirió peso en la matanza para los animales Canadian Maturity I o jóvenes (canales jóvenes de alta calidad) bajo el sistema de graduación Canadian Beef Carcass. El peso de la matanza promedio generalmente varío de 550 a 600 kg para las reses que dan un peso de canal caliente promedio de aproximadamente 350 a 400 kg. Los pesos finales de los animales estuvieron abajo del peso de la matanza industrial mínima de 500 kg. Sin embargo, su deseo de terminar las medidas de ultrasonido finales del espesor de la grasa de la espalda, área longissimus thoracis y registro marmóreo del tiempo del peso de la matanza de la industria. Los procedimientos de regresión se utilizaron para pronosticar el espeso de la grasa de la espalda, registro marmóreo y área longissimus thoracis en un peso de cuerpo constante de 500 kg. Primero, las medidas para cada animal (ultrasonido del espesor de la grasa de la espalda, registro marmóreo o área del músculo longissimus) registrados en cinco períodos consecutivos se regresaron en el peso corporal medido en estos datos anteriores para cada animal. Esto produjo una ecuación de regresión Y = a+b(WT) para cada animal, donde Y es el valor del atributo que se predice (grasa de la espalda, marmórea o área longissimus thoracis) , a = el interceptor de la ecuación de regresión; b = el coeficiente de la regresión y WT es el peso corporal del animal (en este conjunto de casos a una constante de 500 kg) . Esta ecuación se utilizó para pronosticar un valor para cada atributo en un peso de cuerpo constante de 500 kg para cada animal. Esto dio por resultado la creación de un nuevo conjunto de datos para pronosticar el área de la grasa de la espalda o el ojo de la costilla, marmórea. El nuevo conjunto de datos luego se analizó para determinar las diferencias entre los genotipos diferentes de los marcadores diferentes. (d) Datos de la matanza y del canal : De los 150 animales con el dato de desempeño completo, 19 de ellos fueron toros que no se enviaron a sacrificar. Además, 20 animales del fenotipo de extremo para la RFI se seleccionaron para las medidas metabólicas y ningún dato del canal se recolectó en estos animales . El dato del canal estuvo disponible para únicamente 109 animales. Los rastros del canal se evaluaron de acuerdo al sistema de graduación Canadian beef carcass. El dato del canal estándar proporcionado bajo este sistema incluyó el peso de la matanza (peso vivo final) , el peso del canal, espesor de la grasa de la espalda promedio, grasa de grado del canal, área del ojo de la costilla, calidad de marmoración o grado de calidad, nivel de marmoración y producción de carne comerciable. El peso del canal de cada animal se determinó como peso de las mitades izquierda y derecha del canal después de un enfriamiento de 24 horas a -4°C. La grasa del grado del canal se midió a la costilla 12/13ava de cada canal. El grueso de la grasa de la espalda promedio se midió en dos ubicaciones diferentes a lo largo del músculo del ojo de la costilla diferente entre las costillas 13 y 13ava. El grado de calidad del canal (A, AA, AAA o lo mejor=4, 3, 2, 1 respectivamente) se decidieron de acuerdo al siguiente criterio: el animal debe ser fisiológicamente menor que 30 meses de edad; la carne debe ser roja brillante, firme y de grano fino; la musculatura debe variar de buena (sin ninguna deficiencia) a excelente; el grado de grasa debe ser firme y blanco (o ámbar) y no menor que 2 mm en el sitio de la medida (costilla 12/13th) . Para el registro A, AA, AAA o lo menor no está directamente dependiente en el nivel de marmoración. Asociado con cada uno de estos grados de calidad es un registro para el nivel de marmoración (que varía de 0 a 90 tal como AO, A50, AA10, AAAO, AAA40 etc.). Para obtener un valor cuantitativo para el marmóreo por lo tanto, el grado de calidad y el nivel marmóreo de cada canal graduado se combina para computar un valor para el registro marmóreo de acuerdo a la ecuación: registro marmóreo = (QG+ML) /100, donde QG es el grado de calidad (100, 200, 300 y 400 para A, AA, AAA, y lo mejor, respectivamente) y ML es el nivel marmóreo y varía de 0 a 90 en unidades de 10. El registro marmóreo es una medida de la grasa intramuscular del músculo del ojo de la costilla y se puede clasificar como 1 a <2 unidades=pequeñísimas cantidades marmóreo (grado de calidad A Canadá) ; 2 a <3 unidades=ligero marmóreo (grado de calidad AA Canadá) ; 3 a <4 unidades=pequeña a marmóreo moderado (grado de calidad AAA Canadá) o >4 unidades=ligeramente abundante o marmóreo (lo mejor Canadá) . El producto de carne magra es un espumado de la carne comerciable y se calculó de acuerdo a la ecuación: producto de carne magra %=57.96+ (0.202x . área L. thoracis, cm2)- (0.027 x peso del canal caliente, kg)- (0.703 x grueso de la grasa de la espalda promedio, mm) . El producto de carne magra del canal se puede utilizar para asignar un grado (grado de producto) para cada animal de acuerdo al Y 1 =>59%, Y 2=54 a <59% y Y3=<54%. Ejemplo 2: Muestreo de sangre, extracción de DNA y detección del SNP Las muestras de sangre se recolectaron de cada animal en el inicio de la prueba de la ingesta de alimento de la cual el DNA genómico se extrajo utilizando un procedimiento de fenol/cloroformo de sal saturado modificado (Sambrook y colaboradores, 1989) . La identificación de los polimorfismos en el promotor de leptin bovino utilizó la SEQ ID NO: 1 (número de acceso de GenBank AB070368, Taniguchi y colaboradores, 2002). El DNA genómico de un panel de 16 animales se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores delanteros y traseros designados para cubrir en la región promotora de leptin bovino completa. Los productos PCR de cada animal se secuenciaron sobre un Sistema de Análisis Genético 8000 CEQ Beckman (Beckman Coulter Instruments, Inc) . Los datos de secuencia para cada animal se analizaron para identificar los polimorfismos de nucleótidos sencillos putativos. El análisis identificó tres nodos polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs), especialmente UASMSl, UASMS2 y UASMS3 localizados, respectivamente en las posiciones 207 (sustitución C/T) , 528 (sustituciones C/T) y 1759 (sustituciones C/T) (la numeración es aquella de la SEQ ID NO: 1, número de acceso de GenBank AB70368) . El SNP del exón 2 identificado por Buchanan y colaboradores (2002) se localiza en la posición 305 (mutación de mal sentido C/T) (número de acceso de GenBank AY7138588). El genotipo de cada polimorfismo específico del gen de leptin se llevo a cabo utilizando el análisis de discriminación alélica de nucleasa 5' sobre un detector de secuencia 7700 PRISM™ ABI (Applied Biosystems Inc) . Los cebadores delanteros y traseros (Tabla 1) se asignaron para amplificar cada polimorfismo utilizando el DNA genómico de cada animal. Adicionalmente, se designaron dos sondas fluorogénicas Taiman® ABI (con un tinte reportero diferente en cada sonda) se designaron para dirigir los dos alelos de cada SNP (Tabla 1) . Tabla 1: Posición, información del cebador y sonda para el genotipo de cada polimorfismo a Las posiciones se designan de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 número de acceso de GenBank AB070368. b La posición se designa de acuerdo a la SEQ ID NO: 5 (número de acceso de GenBank AY138588) c Los nucleótidos en el objetivo marcado de los alelos específicos del SNP. Un subconjunto de los animales genotipados se secuenciaron a través de cada polimorfismo y los resultados de la secuencia se utilizaron para confirmar los genotipos obtenidos mediante los análisis de discriminación. Además de la manada experimental, un total de 160 animales de cinco líneas comerciales de ganado vacuno relativamente no relacionado (líneas de selección genética BeefBooster Ml, M2, M3, M4 y TX) también se genotiparon y se determinaron las frecuencias de los alelos de los SNPs en estos animales. La(s) reproducción (es) de fundación fueron Angus para Ml, Hereford para M2, varias reproducciones pequeñas para M3, Limousin and Gelbvieh para M4, y Charoláis para TX (Kress y colaboradores 1996) . Las pruebas de mínimos cuadrados se utilizaron para examinar las frecuencias de genotipo de cada polimorfismo para desviaciones del equilibrio Hardi-Weinberg para las poblaciones tanto experimentales como comerciales. Las diferencias entre las diversas líneas de selección de la manada comercial en las frecuencias de los alelos de los polimorfismos también se probaron mediante los análisis de mínimos cuadrados utilizando el procedimiento de Modelo Categórico de SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, 1999). Las asociaciones marcadoras sencillas luego se llevaron a cabo para evaluar la relación de los genotipos marcadores diferentes de cada marcado en la concentración de leptin de suero, velocidad de crecimiento, peso corporal, ingesta de alimento, deficiencia de alimento y atributos de ultrasonido. El dato se analizó utilizando el PROC MIXED de SAS (SAS Institute, Inc., NC, 1999). El modelo estadístico utilizado incluyó efectos fijos del SNP, grupo de prueba (uno y dos), sexo del animal (toro y res) y efectos de aditivo animal aleatorios. El animal se ajustó como un efecto aleatorio para contar para los genes de antecedentes . El peso de inicio del animal en la prueba, edad de la madre o edad del animal en la prueba se incluyeron en el modelo como covariados lineales. El modelo utiliza para analizar el dato del canal fue similar a aquel del dato del animal vivo pero es fluido de los efectos fijos del sexo ya que únicamente las reses se enviaron a sacrificar. Las asociaciones entre los diferentes polimorfismos y el grado de calidad del canal se probaron mediante los análisis de mínimos cuadrados utilizando el procedimiento de modelo categórico del SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC, 1999) . Los efectos aditivos se estimaron para las atributos que fueron significantemente diferentes (P < 0.10) entre los animales con genotipos SNP diferentes. Los efectos (a) genéticos aditivos significantes se computarizaron al sustraer la solución del estimado para el efecto de atributo de los dos genotipos homocigotos. Los investigadores estimaron la desviación de predominio (d) como la desviación del valor del genotipo TT del punto medio entre los valores genotípicos TT y CC. Ejemplo 3: Frecuencias del genotipo y los alelos Las Tablas 2 y 3 muestran las secuencias del genotipo y las pruebas de mínimos cuadrados del equilibrio Hardy-Weinberg para los diferentes polimorfismos en las poblaciones experimentales y comerciales, respectivamente. Las observaciones de los genotipos revelaron que todos los animales que tuvieron genotipos CC, CT o TR de UASMSl también tuvieron genotipos CC, CG o GG de UASMS3, respectivamente. Así, los dos polimorfismos estuvieron en desequilibrio de enlace completo y se designaron conjuntamente como UASMS1-3. Los alelos T-G de UASMS1-3 fueron 59% cada uno en la población experimental y los alelos T de UASMS2 fueron 21% y EX0N2-FB 44%. Simílarmente, las frecuencias de los alelos T-G o T de UASMS1-3, UASMS2 y EX0N2-FB fueron 48%, 20% y 53%, respectivamente, en la población comercial. Los análisis De mínimos cuadrados entre los genotipos observados y esperados mostraron que la frecuencia de todos los genotipos de los tres polimorfismos no se desviaron significantemente de las proporciones Hardy-Weinberg en ambas poblaciones (P > 0.10). Tabla 2: Frecuencias de genotipo y pruebas de mínimos cuadrados del equilibrio Hardy-Weinberg de los tres marcadores en la población experimental Polimorfismo CC/CC CT/CG TT/GG TOTAL T-G Mínimos Valor- % cuadrados2 p? UASMS1-3 33 82 65 180 0.59 0.63 0.73 Polimorfismo CC CT TT TOTAL T % Mínimos Valor cuadrados -p UASMS2 113 58 9 180 0.21 0.19 0.91 Polimorfismo CC CT TT TOTAL T % Mínimos Valor- cuadrados p EXON2-FB 59 84 37 180 0.44 0.50 0.78 2 Grado de desviación de las frecuencias del genotipo observadas desde las expectativas ? Probabilidad de un valor de mínimos cuadrados.

Tabla 3: Frecuencias del genotipo y pruebas de mínimos cuadrados y el equilibrio Hardy-Weinberg de los tres marcadores en la población comercial Polimorfismo CC/CC CT/CG TT/GG TOTAL* T-G Mínimos Valor- % cuadrados2 py UASMS1-3 41 84 35 160 0.48 0.42 0.81 Polimorfismo CC CT TT TOTAL T % Mínimos Valor cuadrados -p UASMS2 100 55 5 160 0.20 0.61 0.74 Polimorfismo CC CT TT TOTAL T % Mínimos Valor- cuadrados p EXON2-FB 32 86 43 161 0.53 0.87 0.65 2 Grado de desviación de las frecuencias del genotipo observadas desde las expectativas y Probabilidad de de mínimos cuadrados significante. x El tamaño de población total es de 162 animales. Dos muestras no logradas para amplificar para el UASMSl, 2 y 3 y una muestra no lograda para amplificar para el EXON2-FB. La Tabla 4 muestra las frecuencias de los diferentes polimorfismos en las diferentes razas de la población comercial. Las frecuencias de los alelos T-G de UASMS1-3 difirieron entre las diferentes líneas de la población comercial (P < 0.05, ?2 = 9.17) y se bajaron en la línea Ml (Angus) se compararon al TX (Charoláis) (P < 0.004, ?2 = 8.10), M2 (Hereford) (P < 0.10, ?2 = 2.86), M3 (producciones pequeñas) (P < 0.02, ?2 = 5.48) y M4 (Gelbvieh and Li ousin) (P < 0.04, ?2 = 4.10). Tabla 4 : Frecuencias del genotipo y alelo de los diversos marcadores en cinco razas de una población comercial de ganado vacuno UASMS1-3 UASMS2 EXON2-FB Alelos Alelo Linea Animales cace CT/CG TT/GG T-G CC CT TT Alelo T T CC CT TT Ml 31 13 16 2 0.32 ' 24 7 0 0.1 1 = 2 16 14 0.69a M2 33 8 19 6 0.47 b 19 11 3 0.26" 7 ' 15 1 1 0.563" M3 31 7 15 9 0.53 b 18 12 1 0.23 " 6 18 7 0.52" M4 33 7 19 7 0.50 23 9 1 0.17 ? 6 22 5 0.48" TX 32 6 15 I I 0.58 " 16 16 0 0.25 " I I 15 6 0.42" a'b'c Frecuencias de los alelos de UASMS1-3 (P = 0.01, ?2 = 9.17) UASMS2 (P < 0.05, ?2 = 5.7) y EXON2-FB (P < 0.04, ?2 = 9.93) en las columnas seguidas por los diferentes superíndices son diferentes.

La frecuencia del alelo T del UASMS2 difirió entre las líneas de selección (P < 0.05, ?2 = 5.71) y fue más alta para el Ml comparado a M2 (P < 0.05, ?2 = 4.19) y TX (P < 0.05, ?2 = 3.79). Las diferencias de los alelos del UASMS2 en las otras cepas no fue significante (P > 0.10) . No hubo diferencias en las frecuencias de los alelos del EX0N2-FB entre las líneas de selección de la población comercial (P < 0.041, ?2 = 9.93) . La línea de selección basada en Angus (Ml) tuvo una frecuencia más alta de alelo T del EXON2-FB comparada a las líneas basadas en (Gelbvieh and Limousin (M4) (?2 = 5.41, P < 0.05) y Charoláis (TX) (?2 = P < 0.01) y se inclinaron para ser más altas que la línea basada en diversas reproducciones pequeñas (M3) (?2 = 3.82, P < 0.10), pero no Hereford (M2) (P > 1.10). La frecuencia de los alelos del EON2-FB no difirió entre las otras líneas de selección de la población comercial (P > 0.10) .

Ejemplo 4: Asociaciones del UASMSl-3 con varios atributos fenotípicos La tabla 5 muestra el efecto de los diferentes genotipos del UASMS1-3 sobre las medidas de la concentración de leptin de suero, desempeño, eficiencia de alimentos y conducta de alimentación en la población experimental. El peso metabólico fue más alto (P < 0.01) para animales con el genotipo TT-GG que para el CC-CC (efecto de aditivo, a = -5.35 ± 1.65 kg75) . La ganancia diaria promedio se inclinó a ser más alta (P < 0.01) para animales con el genotipo TT-GG que para los animales con el genotipo CC-CC (efecto de aditivo, a = -0.12 ± 0.44 kg d_1) . La ingesta de materia seca fue significantemente más alta (efecto de aditivo, a = -0.88 ± 0.24 kg d_1) (P = 0.001) y la energía metabolizable por peso metabólico se inclinó para diferir de (P < 0.10) [efecto de aditivo, a = -9.06 ± 26.60 KJ (kg75d)-1] entre los animales con diferentes genotipos del UASMS1-3. Sin embargo, la concentración de leptin de suero, relación de conversión de alimento, ingesta de alimento residual y eficiencia parcial del crecimiento no mostró ningunas asociaciones significantes con los genotipos de UASMl-3 (P > 0.10) . Para las atributos de conducta de alimentación, la duración de alimentación fue diferente (P = 0.04) (efecto de aditivo, a = -7.66 ± 2.58 min d-1, ) entre los animales con diferentes genotipos del UASMS1-3. Por otra parte, la frecuencia de alimentación se inclinó para ser más baja (P < 0.10) (efecto de aditivo, a = -3.32 ± 1.07 eventos d_1) para los animales con el genotipo TT-GG que para el CC-CC.

Tabla 5: Efecto de diferentes genotipos del UASMS1-3 (menos-cuadrado ± error estándar) en las medidas de leptin de suero, desempeño, eficiencia y conducta de alimentación Genotipo marcador UAS11S1-3 Características CC-CC CT-CG TT-GG Valor By Número de animales 27 6S 55 Leptin de suero, desempeño y eficiencia. Nivel del leptin de suero, ng ml"1 12.48 ± 1.41 12.13 ±0.96 13.26 ± 1.00 0.60 Peso medio metabólico, kg-75 83.79 ±1.61 S5.62 1.10 89.14±1.13 0.002 Ganancia diaria promedio, kg d*"1 1.29 ±0.05 1.3 S± 0.04 1.42 ±0.04 O.OS Ingesta de alimento residual, kg d -1 •0.53 ± 0.59 -0.37± 0.57 -0.20 ±0.58 0.25 • Relación de conversión de alimento 6.04 ±0.18 5.95 ±0.13 6.11 ±0.13 0.57 Ingesta de materia seca, kg d"1 7.17 ±0.23 7.59 ±0.16 8.05 ±0.16 0.001 Ingesta de ME, KJ kg°-75d~1 1034.3 ±24.1 1073.26 ± 16.3 1093.4 ±24.1 0.07 Eficencia parcial de crecimiento, 0.34 ±0.01 0.34 ±0.01 0.32 ±0.01 0.15 Conducta, de Alimentación Duración de la alimentación, min d"1 50.25±2.27 52.66± 1.55 56-271.61 0.04 Tiempo hacia abajo de la cabeza , min d -1 34.72 ±2.25 36.76 ±1.53 38.41 ±1.59 0.29 Frecuencia de alimentación, eventos a-1 34.06 ±1.07 31.85 ±0.92 30.74 ±1.01 0.08 2 el UASMS1-3 se localiza en las posiciones 207 (sustitución C/T) y 1759 (sustitución C/G) en el promotor de leptin bovino de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 (AB070368) y valor P = probabilidad de las diferencias entre los genotipos marcadores diferentes.

La tabla 6 muestra el peso corporal, ultrasonido y medidas del canal de los animales con diferentes genotipos UASMSl-3. El peso corporal promedio (efecto de aditivo, a = -29.73 ± 10.49 gk) , peso vida final (efecto de aditivo, a = -33.39 ± 11.80) (P < 0.01), peso de la matanza (efecto de aditivo, a = -3.07 ± 13.79 kg) y peso del canal (efecto de aditivo, a = -18.49 + 8.59 kg) fueron más altos en animales con el genotipo TT-GG que para el CC-CC del UASMS1-3. Con excepción del grueso de la grasa de la espalda del ultrasonido final, el cual fue más alto en los animales con los genotipos TT-GG que para el CC-CC (P < 0.05), no hubo diferencias entre los genotipos en las diferentes medidas de ultra sonido (P > 1.10) . Además, la grasa de grado del canal, grueso de la grasa de la espalda, área del músculo longissimus, registro de marmoración y producto de la carne magra no difirieron entre los diferentes genotipos UASMS1-3. El análisis de datos categóricos de los grados del canal (A, AA, AAA) entre los genotipos de el UASMSl-3 no mostraron significante asociaciones entre el grado de calidad y los genotipos (?2 = 1.37, P = 0.50) (Tabla 11) - Tabla 6: Efecto de diferentes genotipos del UASMAl-3 (menos-cuadrado significa ± estándar) en las medidas del peso corporal, ultrasonido y ventaja del canal del ganado vacuno híbrido Genotipo marcador UASMSl-3= Atributos CC CT TT Valor B~ Número de animales 27 68 55 Peso y ultrasonido Medidas Iniciales (10 de Enero) eso corporal, kg 335.24± 8.88 339.51 ±6.09 355.12± 6.25 0.03 Grasa de la espalda de 5.54 ± 0.53 5.1C±0.47 5.13 ±0.49 0.15 ultrasonido Registro de marmoración de ultrasonido 4.25 ± 0.33 4.34 ± 0.32 4.31 ±0.33 0.68 Área longissimus thoracis, c 2 64.05 ± 1.15 62.88±0.79 61.95 ± 0.82 0.22 Medidas Finales (1 de Mayo) peso corporal, kg 477.46 ±11.60 485.24± 7-96 510.86±8.16 0.005 Grasa de la espalda de ultrasonido 5.84 ±0.91 5,41 ± 0.84 6.45±0.88 0.04 Registro de marmoración de ultrasonido 4.56 ±0.12 4.63 ± 0.08 5.69 ±0.09 0.61 rea longissimus thoracis, cm2 74.71 ± 1.35 73.22 ±0.92 73.45 ± 0.96 0.53 Medidas Promedio '? Peso corporal, kg 402.90 ± 10.24 412.35±7.02 432.64±6.20 0.01 Grasa de la espalda de ultrasonido 5.72 ± 0.61 5.26 ±0.55 5.83 ± 0.57 0.17 Registro de marmoración de ultrasonido 4.39 ±0.10 4.47±0.07 4.67± 0.08 0.76 Área longissimus thoracis, cm 2 69.32 ±0.87 68.02 ± 0.59 67.93 ± 0.62 0.26 Atributos del Canal Números de animales 22 49 38 Peso de la matanza, kg 490.6 ± 10.9 501.2±7.3 527.65 ± 8.31 0.01 peso del canal, kg 287.8±6.8 286.62±4.53 306.31±5.18 0.01 Grasa Grado, mm 9.52±0.71 8.11± 0.48 9.29 ± 0.54 0.15 Grasa de la espalda Prom. , mm 10.96 ± 0.75 9.67 ± 0.50 10.81 ±0.57 0.21 Registro de marmoración del canal 2.320.38 2.11 ±0.38 2.29±0.39 0.18 Área . thoracis, cm2 75.45± 1.39 76.58±0.92 76.63± 1.09 0.77 Producción de carne magra, % 57.52 ±0.75 58.86 ±0.50 57.93 ± 0.59 0.25 2 El polimorfismo UASMS1-3 se localiza en las posiciones 207 (sustitución C/T) y 1759 (sustituciones C/G) en el promotor de leptin bovino de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 (AB070368) y Valor P = probabilidad de las diferencias entre los diferentes genotipos marcadores . x Promedio de cinco medidas tomadas entre el 10 de Enero y el 1 de Mayo en intervalos mensuales aproximadamente Ejemplo 5 : Asociaciones del UASMS2 con varios atributos genotípicos El efecto de diferentes genotipos del UASMS2 en las medidas de concentración del leptin de suero, desempeño, eficiencia de alimento y ultrasonido y ventaja de canal se presentan en las tablas 7 y 8. El alelo T del UASMS2 se asoció altamente de manera significante con la concentración de leptin de suero (P < 0.0001), y fue más alta para los animales con el genotipo TT que para el CC (efecto de aditivo a = -11.79 + 2.76 ng ml"1) . El leptin de suero también fue más alto (P = 0.04) en los animales CT que en los animales CC (desviación de predominio, d = -3.38 + 1.81 ng ml1"1) . El peso metabólico difirió entre los genotipos (P < 0.05) y fue más alto para los animales con el genotipo TT que para el CC (efecto de aditivo a = -6.01 ± 2.76 ng ml"1) . La ganancia diaria promedio fue significantemente diferente (P< 0.01) entre los genotipos y fue más alta para los animales con el genotipo TT que para con los animales con el genotipo CC (efecto de aditivo a = -0.15 ± 0.04 kg ~1) .

Tabla 7 : Efecto de diferentes genotipos del UASMA2 (medio menos-cuadrados ± error estándar) en las medidas del leptin de suero desempeño, eficiencia y conducta de alimentación del ganado vacuno híbrido Genotipo marcador UASMS2= Atributos CC CT TT Valor P" Numero de animales 99 45 Leptin de suero, desempeño y eficiencia Nivel de leptin de suero, ng ml-1 11.92 ±0.93 14.43 ± 1.24 23.71 ±2.80 <0.0001 Peso medio metabólico, kg 15 85.77 ± 1.09 88.19 ±1.20 92.14 ±3.04 0.03 Ganancia diaria promedio , kg d _1 1.32 ±0.03 1.47 ±0.04 1.46 ±0.10 0.002 Ingesta de alimento residual, kg d -0.71 ±0.23 -0.41 ± 0.23 -0.95 ± 0.40 0.09 Relación de conversión de alimento 6.06 ±0.12 5.95 ±0.13 5.S2±0.34 0.63 Ingesta de materia seca, kg d 7.44 ±0.15 S.13±0.17 7.89 ±0.43 0.001 Ingesta de ME, KJ kg0,75d_1 1061.1 ±15.9 1110.1 ±18.2 1047.3 ±48.9 0.04 Eficiencia parcial de crecimiento 0.34 ±0.01 0.33 ±0.01 0.36 ± 0.02 0.64 Conducta de Alimentación Duración de alimentación, min d 49.69 ±3.39 54.89 ±3.31 49.96 ±5.39 0.02 Tiempo hacia abajo de la cabeza, mm d ~1 34.26 ±3.17 37.17±3.10 29.84 ±5.11 0.01 —1 Frecuencia de alimentación, eventos d 33.12± 1.87 30.86± 1.86 28.64 ±3.34 0.09 2 El polimorfismo UASMS2 es una sustitución C/T ubicada en la posición 528 del promotor de leptin de bovino de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 (AB070368) y Valor P = probabilidad de las diferencias entre los diferentes genotipos marcadores.

Tabla 8: Efecto de diferentes genotipos del UASMAS2 (menos -cuadrados significa ± estándar) en las medidas del peso corporal, ultrasonido y ventaja del canal del ganado vacuno híbrido Genotipo marcador UASMS2= Atributos Valor Ez CC CT TT Número de animales 99 45 Peso corporal y ultrasonido Medidas Iniciales (10 de Enero) Peso corporal, kg 339.93 ±5.95 352.53 ±6.54 363.26 ±16.59 0.01 Grasa de la espalda , mm 4.38 ±0.25 4.61 ±0.27 5.64 ±0.68 0.15 Registro de marmoración de ultrasonido 4.32 ±0.08 4.46 ±0.08 4.56 ±0.21 0.15 Área longissimus thoracis ,cm~ 62.97 ±0.76 62.17 ±0.82 60.13 ±2.13 0.32 Medidas Finales (1 de Mayo) Peso corporal, kg 488.33 ±7.86 502.86 ±8.64 530.35 ±21.93 0.07 Grasa de la espalda de ultrasonido 5.20 i 0.35 6.43 ±0.38 9.51 ±0.96 <0.0001 Registro de marmoración de ultrasonido 4.61 ±0.09 4.79 ± 0.10 5.52± 0.25 0.001 Área longissimus thoracis, cm~ 74.03 ± 0.09 72.64 ±0.10 68.43 ±2.48 0.05 Medidas Promedio x Peso corporal, kg 413.34 ±6.93 427.65 ±7.62 443.68± 19.32 0.10 Grasa de la espalda de ultrasonido 4.83 ±0.26 5.43 ±0.28 7.12 ± 0.73 0.003 Registro de marmoración de ultrasonido 4.41 ±0.08 4.58 ± 0.08 5.02 ± 0.21 0.006 Área longissimus thoracis ,cm2 68.37 ±0.57 67.77 ±0.62 64.34 ±1.60 0.04 Pronos ticadagdOO kg BN Grasa de la espalda de ultrasonido 5.34 ± 0.32 0.0002 Registro de marmoración de ultrasonido 4.57 ±0.40 4.77 ±0.40 5.36 ±.46 0.002 Área longissimus thoracis, cm- 74.65 ±0.79 73.06 ±0.86 70.21 ±2.19 0.05 Dato del canal Número de animales 76 29 4 Peso de la matanza, kg 500.9 ±6.0 516.7±9.9 537.27 ±26.2 0.20 Peso del canal , kg 290.6 ±3.8 299.4 ±6.2 295.9 ±16.5 . 0.48 .Grasa Grado, pun 8.34 ±0.43 9.54 ± 0.70 10.91 ±1.84 0.16 Grasa de la espalda Prom. , mm 9.76 ± 0.44 11.50 ±0.71 12.09 ±1.92 0.08 Registro de marmoración del canal 2.26 ± 0.07 2.42 ±0.11 2.71 ±0.30 0.20 Área L . thoracis , cm2 76.08 ± 0.75 77.30 ±1.22 74.63 ± 3.32 0.61 Producción de carne magra , % 58.62 ±0.41 57.39 ±0.65 56.90 ±1.77 0.22 2 El polimorfismo UASMS2 es una sustitución C/T localizada en la posición 528 del promotor de leptin de bovino de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 (AB070368) y Valor P = probabilidad de las diferencias entre los diferentes genotipos marcadores. x Promedio de cinco medidas tomadas entre el 10 de Enero y el 1 de mayo en intervalos mensuales aproximadamente La ingesta de materia seca fue significantemente diferente (P = 0.001) entre los genotipos de UASMS2 y fue más alta en los animales con el TT comparado al CC (efecto de aditivo a = -0.45 ± 0.19 kg d"1) y CT comparado al CC (efecto de predominio d = -0.69 ± 0.26 kg d_1) . La energía metabolizable por peso metabólico también difirió entre los genotipos del UASMS2 (P = 0.04) y fue más alta en el CT comparada el TT o CC (efecto de predominio d = -56.11 ± 25.24 KJ (kg75 d_1) UASMS2. La ingesta de DM más alta de los animales con el alelo T observados en este estudio es sorprendente como generalmente sería esperado que los animales con grasa de cuerpo más alta y leptin de suero significantemente más alto habría disminuido el consumo de alimento se puede argumentar que este resultado puede ser debido al hecho de que hubo únicamente muy pocos animales disponibles con el genotipo TT para comparación (como se observa por los errores estándares altos asociados con los valores del atributo de los animales TT) . Sin embargo, los resultados también mostraron que la ingesta de alimento fue más alta en los animales heterozigos, que indican que el alelo T del UASMS2 esta de hecho asociado con la ingesta de alimento incrementada. El dato reciente de las vacas diarias (Liefers y colaboradores 2003) muestra que las vacas con ingesta de materia seca más alta fueron significantemente más pesadas y tuvieron concentración de leptin de suero significantemente más alta. Además, estos autores también mostraron que las vacas con un balance de energía negativa (fuertemente relacionada al peso corporal más bajo y condición del cuerpo más baja) tuvo concentración de leptin de suero significantemente más baja comparada a las vacas del balance de energía positiva. En el dato presente las concentraciones de leptin de suero positivamente se relaciona a la ingesta de alimento (r = 0.26) y al peso corporal (r = 0.25), confirmando de esta manera que los descubrimientos por Liefers y colaboradores (2003). Será observado en ratones que el ratón obviamente obeso con leptin . de suero más alto continuo comiendo más (Houseknecht y colaboradores 1998). La evidencia en la literatura muestra que la -respuesta a los efectos de la alimentación posterior inhibitoria del leptin es más sensible en los animales magros, y sensiblemente se reduce mayormente en los animales con almacenamiento de grasa grandes (el ganado vacuno generalmente tiene el contenido de grasa del cuerpo más alta recordativo de la obesidad en otras especies), aunque las concentraciones circulantes del leptin en el último grupos son altas (Houseknech y colaboradores 1998) . Tal vez, los descubrimientos de este estudio pueden formar la base de la resistencia de leptin en el ganado vacuno. Este fenómeno de resistencia al leptin en ciertos individuos obesos todavía no es claramente entendido. Aunque se ha sugerido que algunas formas receptoras de leptin se pueden involucrar en la incidencia de la resistencia de leptin (Houseknech y colaboradores 1998). El grueso de la grasa de la espalda promedio (efecto de aditivo a = -2.29 ± 0.50 mm) ; grueso de la espalda final (efecto de aditivo a = -4.31 ± 0.95 mm) ; y grueso de la grasa de la espalda de ultrasonido fue significantemente más alto (P < 10.001) para los animales con el alelo T de UASMS2 para los animales con el alelo C. similarmente, el alelo T de UASMS2 se asoció significantemente con el registro de marmoración del ultrasonido promedio más alto (P < 1.01) (efecto de aditivo a = -0.61 ± 0.21) y el registro de marmoración final (efecto de aditivo a = -0.89 ± 0.25, P < 0.01) comparado el alelo C. . estos resultados no son sorprendentes como la correlación entre la marmoración de ultrasonido y el grueso de la grasa de la espalda en el conjunto de datos presente también fue alto (r = 0.54) (el dato no se muestra) . Tomando un peso de cuerpo constante de 500 kg a través de las pronosticaciones de regresión lineales, los animales con el genotipo TT del UASMS2 tuvieron los registros de la grasa de la espalda (P < 0.001) y marmoración (P < 0.01) de ultrasonido significantemente más altos comparados a los animales con los genotipos tipos CC. Los incrementos significantes en la gordura del cuerpo en animales con el alelo T del UASMS2 se asoció con reducciones ligeras (P < 0.05) en el final (efecto de aditivo a = -5.60 ± 2.50 cm2) y promedio (efecto de aditivo a = -4.03 ± 1.58 cm2) del área longissimus thoracis. Las medidas del peso de canal y grasa del cuerpo fueron generalmente más altas en los animales con el alelo T comparado al alelo C. sin embargo, hubo únicamente pocos animales del genotipo TT que hubo con el dato de canal para la comparación y así no hubo diferencias estadísticas entre los genotipos del UASMS2 en estos atributos del canal. Lo opuesto es verdad con las medidas del canal del producto de carne magra y el área del músculo flojísimos. Los análisis del dato categórico de los grados del canal (A, AA y AAA) entre los genotipos UASMS2 no mostraron significantes asociaciones entre el grado de calidad y los genotipos (?2 = 1.14, P = 0.56) (Tabla 11). La ingesta de alimento residual se inclinó a diferir (P < 1.10) entre los genotipos USMAS2 y fue más bajo en el CT (efecto de predominio, d = 0.42 ± 0.21 kg d_1) en los homocigotos. La relación de conversión de alimento y la eficiencia parcial de crecimiento no difirió (P > 0.30) entre los genotipos UASMS2. el presente dato también no mostró significado estadístico en el peso final, peso de cuerpo medio, peso de la matanza y peso del canal entre los animales de diferentes genotipos de UASMS2 (obviamente debido a que hubo muy pocos animales TT disponibles para la comparación y asociados con errores estándares altos del medio de genotipo) sin embargo el alelo T se asoció generalmente con los pesos del cuerpo más altos con las diferencias entre los animales TT y CC en el peso corporal medio, peso final y peso de la matanza de 30.34 kg, 42.01 kg y 36.37 kg, respectivamente. La duración de alimentación (efecto de predominio, d = 5.07 ± 2.61 min d_1) y el tiempo hacía debajo de cabeza de alimentación (efecto de predominio, d = 5.12 ± 2.51 min d_1) difirió entre los genotipos y fueron más altos en los heterocigotos de UASMS2 que los homocigotos (P < 0.05) . La frecuencia de alimentación se inclinó para diferir entre los genotipos (P < 0.10) entre los genotipo de UASMS2 y fue más alto para los animales CC que para los animales TT (efecto de aditivo a = -4.47 ± 2.86 cm2) .

Ejemplo 6: Asociaciones del EXON2-FB con varios atributos fenotípicos El efecto del diferente genotipo de EXON2-FB en las medidas de la concentración de leptin de suero, desempeño, eficiencia de alimento, conducta de alimentación y ultrasonido y ventaja del canal se presentan en las Tablas 9 y 10. El peso del punto medio metabólico fue menor (P < 0.05 para los animales con el genotipo TT que para el CC (efecto de aditivo a = -4.16 ± 1.61 kg75) . La ganancia diaria promedio se inclinó para diferir entre los genotipos (P < 0.10) y fue menor en los animales TT comparados a los animales CC (efecto de aditivo a = -0.12 ± 0.05 kg d_1) . EL grueso de la grasa de la espalda promedio (efecto de aditivo a = -0.56 ± 0.19 mm) y la grasa de la espalda del ultrasonido final (efecto de aditivo a = -1.07 ± 0.17 mm) fueron más bajas (P < 0.05) para los animales con el genotipo CC que para el TT (Buchanan y colaboradores, 2002). La duración de alimentación se inclinó para diferir (P = 0.08) entre los genotipos del EXON2-FB y fue más alto para los animales CC que para los animales CT (desviación de predominio a = -2.71 ± 1.63 eventos d"1) . La frecuencia de alimentación fue diferente (P = 0.01) entre los genotipos del EXON2-FB y fue más alta para los animales TT que para los animales CT (desviación de predominio a = -2.66 ± 1.11 eventos d"1) o animales CC (efecto de aditivo, a = -3.30 ± 1.51 eventos d"1) .

Tabla 9: Efecto de diferentes genotipos del EX0N2-FB (medio menos-cuadrados ± error estándar) en las medidas, del leptin de suero desempeño, eficiencia y conducta de alimentación del ganado vacuno híbrido Genotipo marcador EXON2-FB - Atributos CC CT TT Valor P Húmero de animales 50 68 32 Leptin de suero, desempeño y eficiencia Nivel de leptin de suero, ng ml 13.69 ±1.13 12.86 ±0.99 13.02± 1.43 0.78 Peso medio metabolico , kg 88.93 ±1.24 86.17 ±1.07 84.77 ±1.57 0.02 Ganancia diaria promedio, kg d"1 1.43 ±0.04 1.36 ±0.04 1.32 ±0.05 0.07 Ingesta de alimento residual, kg d -0.44 ±0.24 -0.63 ±0.24 -0.61 ±0.27 0.40 Relación de conversión de alimento 6.07 ±0.14 6.01 ±0.12 6.08 ±0.18 0.89 Ingesta de materia seca , kg d 7-73 ±0.53 7.51 ±0.53 7-45 ±0.54 0.21 Ingesta de ME, KJ kg°' 5d"1 1069.3±62.7 1041.2 ±62.9 1035.5 ±64.4 0.22 Eficiencia Parcial de crecimiento , 0.33 ±0.02 0.34 ±0.02 0.33 ±0.02 0.50 Conducta de Alimentación Duración de alimentación , min d 56.19 ±7.40 52.05 ±7.46 52.96 ±7.58 0.08 Tiempo hacia abajo de la cabeza, 36.44 ±3.24 min d —^ 33.19 ±3.09 33.55 ±3.35 0.18 Frecuencia de alimentación, eventos d-i 32.04 ±1.88 31.03 ±1.81 35.34 ±2.08 0.01 2 El polimorfismo EX0N2-FB es una sustitución C/T localizada en la posición 305 del exón 2 del gen de leptin bovino de acuerdo a la SEQ ID NO: 5 (No. de acceso de Gen bank AY138588 - Buchanan y colaboradores, 2002) . y Valor P = probabilidad de las diferencias entre los genotipos marcadores diferentes Tabla 10: Efecto de diferentes genotipos del EX0N2-FB (medio menos-cuadrados ± error estándar) en las medidas del leptin de suero desempeño, eficiencia y conducta de alimentación del ganado vacuno híbrido Genotipo marcador EX0H2-FB = Atributos 'Valor V' CC CT TT Número de animales 50 68 32 Datos del peso corporal y ultrasonido Hedidas Iniciales (10 de Enero) Peso corporal, kg 353. 9± 6.68 341.70 ±5.84 337.74±8.47 0.12 Grasa de la espalda de ultrasonido , mm 4.37 ± 0.27 4.72 ±0.23 5.00 ±0.34 0.17 Registro de marmoración de 4.36 i 0.03 4.35 ± 0.03 4.31 ±0.04 0.47 ultrasonido Área longissimus thoracis, cm~ 61.90 ±0.37 61.72 ±0.32 61.69 ±0.46 0.91 Medidas Finales (1 de Mayo) Peso corporal, kg 510.43 ±'8.73 489.68 ±7.63 480.11 ±11.07 0.02 Grasa de la espalda de ultrasonido 640 ±0.15 6.90 ±0.13 7.47 ±0.19 0.03 Registro de marmoración de 4.98 ±0.09 4.96 ±0.07 ultrasonido 5.10 ±0.08 0.52 Área longissimus thoracis , 74.30 ±1.11 73.07 ±0.97 72.71 ± 1-41 0.46 Medidas promedio x Peso corporal, kg 416.9 ± 2.44 415.04 ±2.31 413.92 ±2.49 0.28 Grasa de la espalda de ultrasonido 4.82±0.16 5.05 ±0.14 5.38 ±0.21 0.04 Registro de marmoración de ultrasonido 4.34 ±0.06 4.35 ±0.06 4.35 ±0.07 0.94 Área longissi us thoracis , cm 68.01 ±0.46 68.10 ±0.40 68.46 ± 0.58 0.74 Pronosticado@50Okg Grasa de la espalda de ultrasonido 54.4- Q^ j 6.47 ±0.26 7.22 ±0.38 0.19 Registro de marmoración de ultrasonido 4.89 ±0.08 4.87±0.07 5.05 ±0.10 0.33 Área longissimus thoracis, cm2 71.49±0.79 71.61 ±0.68 71.41 ±0.99 0.98 Dato del canal Numero de animales 36 47 26 Peso de la matanza, kg 510.23 ±8.85 489.62 ±7.67 479.87± 11.21 0.02 Peso del canal , kg 306.99 ±5.28 286.81 ±4.63 287.17 ±6.27 0.01 Grasa Grado , mm 8.98 ±0.56 8.19 ±0.48 9.55x0.65 0.23 Grasa de la espalda Prora. , rao 10.51 ±0.58 9.72 ±0.50 10.99 ±0.68 0.29 Registro de marmoración del canal 2.37 ±0.09 2.21 ±0.08 2.44 ±0.11 0.20 rea . thoracis, cm2 76.12 ±2.73 75.18 ±2.60 74.63 ±2.54 0.67 Producción de carne magra, % r fl7 ± ? 54 58.76 ±0.46 57.63 ±0.63 0.32 2 El polimorfismo EX0N2-FB es una sustitución C/T localizada en la posición 305 del exón 2 del gen de leptin bovino de acuerdo a la SEQ ID NO: 5 (No. de acceso de Gen bank AY138588 - ver también Buchanan y colaboradores, 2'002) . y Valor P = probabilidad de diferencias entre los genotipos marcadores diferentes. x Promedio de cinco medidas tomadas entre 10 de Enero y 01 de Mayo en intervalos mensuales aproximadamente El peso corporal final (efecto de aditivo, a = 30.32 ± 9.9 kg) y el peso del canal (efecto de aditivo, a = 19.82 ± 5.78 kg) , P = 0.01) fueron menores (P < 0.05) para los animales TT del EXON2-FB comparados a los animales CC. Ningunas asociaciones significantes se detectaron entre el EXON2-FB y los otros atributos estudiados. Las medidas de la gordura del canal fueron generalmente más altas de las medidas del producto de carne magra del canal y el área del músculo longísimos fueron menores para los animales TT comparados a los animales CC del EXON2-FB, aunque no se detectó significado estadístico. El análisis De mínimos cuadrados de los grados del canal (A, AA, AAA) entre los genotipos del EXON2-FB no mostraron asociaciones significantes entre el grado de calidad y los genotipos (?2 = 0.95, P = 0.62) (Tabla 11) . Se asocian tres polimorfismos en el promotor de leptin bovino con la proporción de crecimiento, peso corporal, ingesta de alimento, conducta de alimentación y ventaja de ultrasonido. Aunque unas diferencias en la gordura de canal se detectaron, no hubo significado estadístico, posiblemente debido a la remoción de algunos animales extremos basados en la ingesta de alimento residual (correlación entre la RFI y la grasa, de la espalda es de aproximadamente r = 0.25) para algunos estudios metabólicos. Además, uno de los marcadores, del UASMS2 se asocia con los niveles de leptin de suero en el ganado vacuno. La frecuencia de este SNP fue muy baja en tanto la población experimental como las cinco líneas comerciales del ganado vacuno estudiado . Tabla 11: Distribución de los grados de calidad del canal entre los genotipos de los marcadores diferentes Grados de calidad del canal Prueba de mínimos Pol imo r f i smo Genotipo A AA AAA cuadrados CC-CC . 5 10 7 UASMSl -3 CT-CG 13 27 9 ?2 = 1.37, P = 0.50 TT-GG 7 23 8 CC 20 40 16 UASMS2 • CT 4 18 7 ?2 = 1.14, P = 0.56 TT 1 2 1 CC 6 22 8 EXON2-FB CT 14 25 d ?2 = 0.95, P = 0.62 TT 5 13 8 Diferentes a los polimorfismos UASMSl y UASMS3, los polimorfismos ÜASMS2 y UASMS3 no están enlazados. Esto se puede observar en la tabla 12 que ilustra el desequilibrio del enlace entre los polimorfismos ÜASMS2 y UASMS3. Tabla 12 Prueba del desequilibrio del enlace utilizando desviaciones de porcentaje de las observadas de las combinaciones de los genotipos de dos en dos esperados del UASMS3 y UASMS2 Genotipos UAS S3 CC CG GG Genotipos UASMS2 Frecuencia 0.18 0.46 0.36 CC 0.63 6.96 -0.68 -6.5Í CT 0.32 -5.76 2.58 3.58 TT 0.05 -2.30 -0.90 3.20 La invención se describe adicionalmente por los siguientes párrafos numerados: 1. ün método para subagrupar animales de acuerdo al genotipo en donde los animales de cada sub-grupo tienen un polimorfismo similar en el gen de leptin que comprende: (a) determinar el genotipo de cada animal que se subagrupa al determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótidos sencillo en el gen de leptin en donde el polimorfismo se selecciona del grupo que consiste de ÜASMSl, ' ÜASMS2, ÜASMS3 y EX0N2-FB, y (b) segregar animales individuales en los subgrupos en donde cada animal en un subgrupo tiene un polimorfismo similar en el gen de leptin. 2. El método del párrafo 1 en donde el animal es un bovino. 3. El método del párrafo 2 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 4. Un método para subagrupar animales de acuerdo al genotipo en donde los animales de cada subgrupo tienen un genotipo similar en el gen de leptin que comprende: (a) determinar el genotipo de cada animal que se agrupa al determinar la presencia de un (os) polimorfismo (s) de nucleótidos sencillo, UASMSl, ÜASMS2, UASMS3 y EXON2-FB, en el gen de leptin, (b) segregar los animales individuales . en los subgrupos dependiendo si los animales tienen o no tienen, el (os) polimorfismo (s) de nucleótidos sencillo (s) UASM1, ÜASMS2, y/o UASMS3. 5. El método del párrafo 4 en donde el animal es un bovino . 6. El método del párrafo 5 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 7. ün método para subagrupar animales de acuerdo al genotipo en donde los animales de cada subgrupo tienen un genotipo similar en la región promotora del gen de leptin que comprende: (a) determinar el genotipo de cada animal que se subagrupa al determinar la presencia del polimorfismo de polinucleótidos sencillo UASMSl en la región promotora del gen de leptin, y (b) segregar los animales individuales en los subgrupos dependiendo de si los animales tienen, o no tienen, el polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMSl en la región promotora del gen de leptin. 8. El método del párrafo 7 en donde el animal es un bovino. 9. El método del párrafo 8 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 10. Un método para subagrupar animales de acuerdo al genotipo en donde los animales de cada subgrupo tienen un genotipo similar en la región promotora del gen de leptin que comprende : (a) determinar el genotipo de cada animal que se subagrupa al determinar la presencia del polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMS2 en la región promotora del gen de leptin, y (b) segregar los animales individuales en los subgrupos dependiendo si los animales tienen, o no tienen, el polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMS2 en la región promotora del gen de leptin. 11. El método del párrafo 10 en donde el animal es un bovino . 12. El método del párrafo 11 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 13. ün método para subagrupar animales de acuerdo al genotipo en donde los animales de cada subgrupo tienen un genotipo similar en la región promotora del gen de leptin que comprende : (a) determinar el genotipo de cada animal que se agrupa al determinar la presencia del polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMS3 en l'a región promotora del gen de leptin, y (b) segregar los animales individuales en los subgrupos dependiendo si los animales tienen, o no tienen, el polimorfismo de nucleótidos sencillo UASMS3 en la región promotora del gen de leptin. 14. El método del párrafo 13 en donde el animal es un bovino. 15. El método del párrafo 14 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 16. ün método para subagrupar animales de acuerdo al , genotipo en donde los animales de cada subgrupo tienen un genotipo similar en el exón 2 del gen de leptin que comprende : (a) determinar el genotipo de cada animal que se subagrupa al determinar la presencia del polimorfismo de nucleótidos sencillo exón2-FB en el exón 2 del gen de leptin, y (b) segregar los animales individuales en los subgrupos dependiendo sí los animales tienen, o no tienen, el polimorfismo de nucleótidos sencillo exón2-FB en la región promotora del gen de leptin. 17. El método del párrafo 16 en donde el animal es un bovino . 18. El método del párrafo 27 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 19. Un método para identificar un animal que tiene un fenotipo que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal y producción de leche, como es comparado a la población general de animales de esas especies, que comprende determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótido sencillo en el gen de leptin del animal, en donde el polimorfismo se selecciona del grupo que consiste de UASMSl, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB, en donde la presencia de ya sea el polimorfismo de nucleótido sencillo ÜASMSl, ÜASMS2, UASMS3 o EXON2-FB es indicativo de un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. 20. El método del párrafo 1 en donde el animal es un bovino . 21. El método del párrafo 2 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 22. ün método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche, como es comparado a la población de animales de esas especies, que comprenden determinar la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo UASMSl en la región promotora del gen de leptin del animal, en donde la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo UASMSl es indicativo de un genotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. 23. El método del párrafo 22 en donde el animal es un bovino. 24. El método del párrafo 2 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 25. ün método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche, como es comparado a la población general de animales de esas especies, que comprenden determinar la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo UASMS2 en la región promotora del gen de leptin del animal, en donde la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo UASMS2 es indicativo de un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. 26. El método del párrafo 25 donde el animal es un bovino . 27. El método del párrafo 26 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 28. ün método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche, como es comparado a la población de animales de esas especies, que comprenden determinar la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo UASMS3 en la región promotora del gen de leptin del animal, en donde la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo UASMS3 es indicativo de un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. 29. El método del párrafo 28 en donde el animal es un bovino . 30. El método del párrafo 29 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 31. ün método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche, como es comparado a la población general de animales de esas especies, que comprenden determinar la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo EXON2-FB en el gen de leptin del animal, en donde la presencia del polimorfismo de nucleótido sencillo EXON2-FB es indicativo de un fenotipo deseable que se relaciona a cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja y composición del canal, y producción de leche. 32. El método del párrafo 31 en donde el animal es un bovino . 33. El método del párrafo 32 en donde el gen de leptin es el gen de leptin bovino. 34. Una sonda de oligonucleótido aislado para determinar el polimorfismo del gen ob ÜASMSl, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO; 2, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan la posición de nucleótidos 207 de SEQ ID NO: 2. 35. Una sonda de oligonucleótido aislado para determinar el alelo que contiene T en la posición de nucleótidos 207 del promotor del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO; 2, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan el nucleótido T en la posición 207 de SEQ ID NO: 2. 36. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene C en la posición en la posición de nucleótidos 207 del promotor del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucelótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 y en donde 10 nucleótidos contiguos abarcan el nucleótido C en la posición 207 de SEQ ID NO: 1. 37. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene T en la posición de nucleótidos 207 del promotor del gen ob, en donde la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9. 38. Una sonda de oligonucleótido aislado para determinar el alelo que contiene C en la posición de nucleótidos 207 del promotor del gen ob, en donde la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 10. 39. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el polimorfismo del gen ob, UASMS2 en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de de SEQ ID NO: 3, y en donde los 10 nucleótidos contiguos de de SEQ ID NO : 2. 40. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar un alelo que contiene T en la posición de nucleótido 528 del promotor del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de de SEQ ID NO: 3, y en donde los 10 nucleótidos abarcan el nucleótido T en la posición 528 de SEQ ID NO: 3. 41. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 528 del promotor del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de de SEQ ID NO: 1, y en donde los 10 nucleótidos abarcan el nucleótido C en la posición 528 de SEQ ID NO: 1. 42. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene T en la posición de nucleótido 528 del promotor del gen ob, en donde la sonda tiene la secuencia de de SEQ ID NO: 14. 43. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 528 del promotor del gen ob, en donde la sonda tiene la secuencia de de SEQ ID NO: 13. 44. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el polimorfismo del gen ob UASMS3, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan la posición de nucleótidos 1759 de SEQ ID NO: 4. 45. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene G en la posición de nucleótido 1759 del promotor del gen ob , en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan la posición el nucleótido G en la posición 1759 de SEQ ID NO: 4. 46. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 1759 del promotor del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan el nucleótido C en la posición 1759 de SEQ ID NO: 1. 47. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene G en la posición de nucleótido 1759 del promotor del gen ob, en donde la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 17. 49. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el polimorfismo del gen ob EXON2-FB, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 6, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan la posición el nucleótído 305 de SEQ ID NO: 6. 50. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 305 del EXON2-FB del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 5, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan el nucleótido C en la posición 305 de SEQ ID NO: 5. 51. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene T en la posición de nucleótido 305 del exón 2 del gen ob, en donde la sonda comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 6, y en donde los 10 nucleótidos contiguos abarcan el nucleótido T en la posición 305 de SEQ ID NO: 6. 52. Una sonda de Oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 305 del exón 2 del gen ob , en donde la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22. 53. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar el alelo que contiene T en la posición de nucleótido 305 del exón 2 del gen ob, en donde la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 21. 54. Una composición para la detección de polimorfismo del gen ob, que comprende por lo menos una sonda de oligonucleótidos de acuerdo a cualquiera de uno de los párrafos 34 al 53. 55. Una sonda de oligonucleótido aislado de acuerdo a cualquiera de una de los párrafos 34 al 53 en donde el oligonucleót.ido se marca con una porción detectable. 56. Una composición para la detección de polimorfismo del gen ob, que comprende por lo menos una sonda de oligonucleótido de acuerdo a cualquiera de uno de los párrafos 55. 57. Una sonda de oligonucleótido aislado de acuerdo al párrafo 55 en donde la porción detectable se selecciona del grupo que consiste de una radiomarca 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, una enzima detectable, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, tinte fluorescente, fluoresceína de isotiocianato, red de Texas, rodamina, Cy3, Cy5, Bodipy, rojo Bodipy Far, Amarillo Lucifer, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X, 5-CR 6G, un marcador calorimétrico, digoxigenin-dUTP, o biotina. 58. Una composición para la detección del polimorfismo del gen ob, que comprende por lo menos una sonda de oligonucleótidos de acuerdo al párrafo 57. 59. Una sonda de oligonucleótidos aislados de acuerdo al párrafo 55 en donde la porción detectable es un componente fluorescente que genera una señal fluorescente. 60. Una composición para la detección de un polimorfismo del gen ob, que comprende por lo menos una sonda de oligonucleótidos de acuerdo al párrafo 59. 61. Un oligonucleótido aislado de acuerdo a cualquiera de uno de los párrafos 34 a 53 en donde el oligonucleótido se inmoviliza sobre un soporte sólido. 62. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo ÜASMSl, que compren de un par de oligonucleótidos que complementan y específicamente recocen el promotor del gen ob, en donde el primer miembro del par de cebadores recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente arriba (5' ) de la posición de nucleótido 207, y el segundo miembro del par de cebadores recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente abajo (3' ) de la posición de nucleótido 207. 63. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo ÜASMSl, que comprende un cebador delantero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7, y un cebador trasero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8. 64. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMSl, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7. 65. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo ÜASMSl, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8. 66. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS2, que compren de un par de oligonucleótidos que complementan y específicamente recocen al promotor del gen ob, en donde el primer miembro del par de cebadores recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente arriba (5' ) de la posición de nucleótido 528, y el segundo miembro del par de cebadores recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente abajo (3') de la posición de nucleótido 528. 67. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS2, que comprenden un cebador delantero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11, y un cebador trasero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12. 68. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS2, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11. 69. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS2, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11. 70. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo ÜASMS3, que comprenden un par de oligonucleótidos que complementan y específicamente recocen al promotor del gen ob, en donde el primer miembro del par de cebadores recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente arriba (5' ) de la posición de nucleótido 1759, y el segundo miembro del par de cebadores recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente abajo (3' ) de la posición de nucleótido 1759. 71. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS3, que comprenden un cebador delantero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15, y un cebador trasero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16. 72. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS3, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16. 73. ün cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del promotor del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo UASMS3, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15. 74. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo EX0N2-FB, que comprenden un par de oligonucleótidos que complementan específicamente recocen al gen ob, en donde el primer miembro del par de cebadores recoce al gen ob en una ubicación corriente arriba (5' ) de la posición de nucleótidos 305 del exón 2, y el segundo miembro del par de cebadores recoce al gen ob en la ubicación corriente abajo (3' ) de la posición de nucleótidos 305 del exón 2. 75. Un par de cebadores para la amplificación enzimática de un fragmento del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo EXON2-FB, que comprende un cebador delantero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 19, y un cebador trasero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 20. 76. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo EXON2-FB, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 19. 77. Un cebador aislado útil en la amplificación enzimática de un fragmento del gen ob que abarca la ubicación del polimorfismo EXON2-FB, en donde el cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO: 20. 78. ün método para determinar el genotipo de un animal en los sitios UASMSl polimórficos del gen ob que comprende : a) obtener una muestra de DNA del animal b) poner en contacto la muestra de DNA con el par de cebadores de oligonucleótidos de SEQ ID IN: 7 y SEQ ID NO: 8 bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de los cebadores de oligonucleótidos a la muestra de DNA, c) amplificar enzimáticamente una región específica del gen ob utilizando el par de cebadores de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para formar los productos de amplificación de ácido nucleico, d) poner contacto los productos de amplificación de la etapa C con las sondas específicas de alelos marcados que comprenden SEQ ID NO 9 y SEQ ID NO: 10, marcados con una porción detectable bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de las sondas específicas de alelos marcados a los productos de amplificación, y e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas específicas de alelos marcados hibridizados a los productos de amplificación. 79. Un método para determinar el genotipo de un animal en los sitios ÜASMS2 polimórficos del gen ob que comprende: a) obtener una muestra de DNA del animal b) poner en contacto la muestra de DNA con el par de cebadores de oligonucleótidos de SEQ ID IN: lly SEQ ID NO: 12 bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de los cebadores de oligonucleótidos a la muestra de DNA, c) amplificar enzimáticamente una región específica del gen ob utilizando el par de cebadores de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para formar los productos de amplificación de ácido nucleico, d) poner contacto los productos de amplificación de la etapa C con las sondas específicas de alelos marcados que comprenden de SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO: 14, marcados con una porción detectable bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de las sondas específicas de alelos marcados a los productos de amplificación, y e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas específicas de alelos marcados hibridizados a los productos de amplificación. 80. Un método para determinar el genotipo de un animal en los sitios UASMS3 polimórficos del gen ob que comprende : a) obtener una muestra de DNA del animal b) poner en contacto la muestra de DNA con el par de cebadores de oligonucleótidos de SEQ ID IN: 15 y SEQ ID NO: 16 bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de los cebadores de oligonucleótidos a la muestra de DNA, c) amplificar enzimáticamente una región específica del gen ob utilizando el par de cebadores de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para formar los productos de amplificación de ácido nucleico, d) poner contacto los productos de amplificación de la etapa C con las sondas específicas de alelos marcados que comprenden SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO: 18, marcados con una porción detectable bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de las sondas específicas de alelos marcados a los productos de amplificación, y e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas específicas de alelos marcados hibridizados a los productos de amplificación. 81. ün método para determinar el genotipo de un animal en los sitios EX0N2-FB polimórficos del gen ob que comprende : a) obtener una muestra de DNA del animal b) poner en contacto la muestra de DNA con el par de cebadores de oligonucleótidos de SEQ ID IN : 19 y SEQ ID NO: 20 bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de los cebadores de oligonucleótidos a la muestra de DNA, c) amplificar enzimáticamente una región específica del gen ob utilizando el par de cebadores de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para formar los productos de amplificación de ácido nucleico,' d) poner contacto los productos de amplificación de la etapa C con las sondas específicas de alelos marcados que comprenden SEQ ID NO 21 y SEQ ID NO: 22, marcados con una porción detectable bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridización de las sondas específicas de alelos marcados a los productos de amplificación, y e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas específicas de alelos marcados hibridizados a los productos de amplificación.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar a un animal bovino que tiene un fenotipo deseable que se relaciona a la ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja del canal o composición del canal, como es comparado a la población general de animales bovinos, caracterizado porque comprende detectar la presencia de un polimorfismo de nucleótido sencillo en el gen de leptin, en donde el polimorfismo de nucleótido sencillo se selecciona del grupo que consiste de UASMSl, UASMS2, UASMS3, y EXON2-FB, en donde la presencia de un genotipo particular en ya sea el polimorfismo de nucleótido sencillo UASMSl, UASMA2, UASMS3 o EXON2-FB es indicativo de un atributo fenotípico que se relaciona a los niveles de leptin circulantes, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso corporal, ventaja del canal y/o composición del canal. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el .polimorfismo de nucleótido sencillo es el polimorfismo UASM1, y en donde (a) los animales que tienen el genotipo CC tienen el peso corporal final más bajo, peso corporal promedio, peso de la matanza, peso del canal y/o ingesta de materia seca como es comparado a animales que tienen los genotipos CT o TT, (b) los animales que tienen el genotipo TT tienen el peso corporal final más alto, peso corporal promedio, peso de la matanza, peso del canal y/o ingesta de materia seca comparado a los animales que tienen los genotipos CT o CC, y c) los animales que tienen el genotipo CT tienen los pesos corporales finales, pesos corporales promedio, pesos de la matanza, pesos del canal y niveles de ingesta de materia seca que son intermedios a los niveles en los animales que tienen los genotipos CC o TT . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfismo de nucleótido sencillo es el polimorfismo ÜASMS2, y en donde (a) los animales que tienen el genotipo CC tienen niveles de léptin de suero más bajo, ganancia diaria promedio, ingesta de materia seca, registro de marmoración y/o grasa de la espalda de ultrasonido - comparado a los animales que tienen los genotipos CT o TT, (b) los animales que tienen el genotipo TT tienen niveles de leptin de suero intermedios, registro de marmoración y grasa de la espalda de ultrasonido comparado a los animales que tienen los genotipos CC o TT, y ganancia diaria promedia más alta e ingesta de materia seca comparado a los animales que tienen el genotipo CC, y c) los animales que tienen el genotipo CT tienen niveles de leptin de suero más altos, registro de marmoración y/o grasa de la espalda de ultrasonido comparado a los animales que tienen los genotipos CT o CC, y ganancia diaria promedio y/o ingesta de materia seca comparado a los animales que tienen el genotipo CC. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfismo de nucleótido sencillo es el polimorfismo UASMS3, y en donde a) los animales que tienen el genotipo CC tienen el peso corporal final más bajo, peso corporal promedio, peso de la matanza, peso del canal y/o ingesta de materia seca comparado a los animales que tienen los genotipos CG o GG, b) animales que tienen el genotipo GG tienen el peso corporal final más alto, peso corporal promedio, peso de la matanza, peso del canal y/o ingesta de materia seca comparado a los animales que tienen los genotipos CC o CG, y c) los animales que tienen el genotipo CG tienen el peso corporal final, intermedio, peso corporal promedio, peso de la matanza, peso del canal y/o ingesta de materia seca comparado a los animales que tienen los genotipos CC o GG. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfismo de nucleótido sencillo es el polimorfismo EXON2-FB, y en donde a) los animales que tienen el genotipo CC tienen la grasa de la espalda del ultrasonido más baja y el peso medio metabólico más bajo, peso corporal final, peso de la matanza, y/o peso del canal, comparado a los animales que tienen los genotipos CT o TT, b) animales que tienen el genotipo TT tienen la grasa de la espalda del ultrasonido más alta y el peso medio metabólico más bajo, peso corporal final y/o peso de la matanza comparado a los anímales que tienen los genotipos CT o CC, y c) los animales que tienen el genotipo CT tienen la grasa de la espalda del ultrasonido intermedio, peso medio metabólico, peso de la matanza, y/o peso del canal, comparado a los animales que tienen los genotipos CC o TT. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los polimorfismos UASMSl y UASMS3 están en el enlace completo tal que a) un animal con el genotipo CC en los sitios UASMSl tienen el genotipo CC en los sitios UASMS3, b) un animal con el genotipo CT en los sitios UASMSl tiene el genotipo CG en los sitios UASMS3, y c) un animal con el genotipo TT en los sitios UASMSl tiene el genotipo GG en los sitios UASMS3. 7. Una sonda de oligonucleótido aislado para detectar un polimorfismo de nucleótido sencillo en el gen ob bovino, caracterizado porque el oligonucleótido aislado se selecciona del grupo que comprende: a) 10 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 que incluyen la posición de nucleótido 207 de SEQ ID NO: 1. b) 10 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 2 que incluyen la posición de nucleótido 207 de SEQ ID NO: 2. c) 10 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3 que incluyen la posición de nucleótido 528 de SEQ ID NO: 3. d) 10 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4 que incluyen la posición de nucleótido 1759 de SEQ ID NO: 4. e) 10 o más .nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 5 que incluyen la posición de nucleótido 305 de SEQ ID NO: 5. f) 10 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 6 que incluyen la posición de nucleótido 305 de SEQ ID NO: 4. g) SEQ ID NO: 9 h) SEQ ID NO: 10 i) SEQ ID NO: 13 j) SEQ ID NO: 14 k) SEQ ID NO: 17 1) SEQ ID NO: 18 m) SEQ ID NO: 21 n) SEQ ID NO: 22 8. Un par de cebadores aislados útiles en la amplificación de un fragmento del gen ob bovino que abarca la ubicación de los polimorfismos de nucleótidos sencillos UASMSl, UASMS2, UASMS3, o EXON2-FB, caracterizados porque el par de cebadores se seleccionan del grupo que comprende: a) un primer cebador que recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente arriba de la posición de nucleótido 207 de SEQ ID NO: 1, y un segundo cebador que recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente abajo de la posición de nucleótido 207 de SEQ ID NO: 1. b) un primer cebador que recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente arriba de la posición de nucleótido 528 de SEQ ID NO: 1, y un segundo cebador que recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente abajo de la posición de nucleótido 528 de SEQ ID NO: 1. c) un primer cebador que recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente arriba de la posición de nucleótido 1759 de SEQ ID NO: 1, y un segundo cebador que recoce al promotor del gen ob en una ubicación corriente abajo de la posición de nucleótido 1759 de SEQ ID NO: 1. d) un primer cebador que recoce al exón 2. del gen ob en una ubicación corriente arriba de la posición de nucleótido 305 de SEQ ID NO: 5, y un segundo cebador que recoce al exón 2 del gen ob en una ubicación corriente abajo de la posición de nucleótido 305 de SEQ ID NO: 5. e) un primer cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 y un segundo cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8. f) un primer cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y un segundo cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12. g) un primer cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15 y un segundo cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16. h) un primer cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 20.