ES2211878T3 - Sobre-expresion de moleculas de adnn monocatenario. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA LA SINTESIS DE NUEVOS Y UTILES DNAS DE HELICE SIMPLE QUE TIENEN UNA CONFIGURACION SS-SLDNA. EL METODO ES UN I (IN VIVO) O UNA SINTESIS (IN VITRO). TAMBIEN SE PRESENTAN LOS VEHICULOS REPLICADORES QUE PRODUCEN ESTOS SS-SLDNAS. SE DESCRIBEN LOS SS-SLDNAS. SE HAN DESCUBIERTOS USOS PARA ESTOS SS-SLDNAS. ESTOS PUEDEN SER UTILIZADOS PARA INTRODUCIR MUTACIONES ALEATORIOS, SE PRESTAN PARA LA REPLICACION MEDIANTE UNA VARIANTE DEL METODO PCR. TAMBIEN PUEDEN USARSE PARA REGULAR LA FUNCION DEL GEN. TAMBIEN SE PRESENTAN OTROS USOS.

Description

Sobre-expresión de moléculas de ADN monocatenario.

Solicitudes relacionadas

Esta es una continuación parcial de la solicitud en tramitación con nº de serie 08/024.676, presentada el 1 de marzo de 1993, Oshima y col., titulada "Method for Synthesizing Single-Stranded Stem-Loop DNAs, the Products and Uses Therefor", que a su vez es una continuación parcial de la solicitud en tramitación con nº de serie 07/753.111, titulada "Method for Synthesizing Single-Stranded Stem-Loop DNAs, the Products and Uses Therefor". Estas dos solicitudes de patentes (solicitudes parentales) se incorporan explícitamente en la presente memoria descriptiva palabra por palabra como si hubieran sido completamente reproducidas a continuación.

Campo de la invención

La invención trata del campo del ADN recombinante. Más particularmente, la invención trata de un método de síntesis de un nuevo y útil ADN monocatenario que presenta una configuración en horquilla (ADNmc-h). La invención trata de un método de síntesis in vitro e in vivo. Adicionalmente, la invención trata del vehículo de replicación que produce estos ADNmc-h. Además, la invención trata de estas nuevas estructuras y describe los usos de estas estructuras. Se describe un método para amplificar los ADNmc-h con o sin genes que codifican una proteína objetivo. Además, la invención describe un método para regular la función génica mediante el uso de ADNmc-h.

Antecedentes

Se sabe que la duplicación de parte del genoma se produce mediante un ARN intermedio que es retrotranscrito en un ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasa inversa. Como reseña, véase Weiner y col., Ann. Rev. Biochem., 55, 631 (1986). El consecuente flujo invertido de información genética se considera que ha jugado un importante papel en la diversificación evolutiva de los genomas eucariotas. Un mecanismo similar puede muy bien haber sido responsable de la evolución genómica de los procariotas, a la luz de los recientes descubrimientos de las transcriptasas bacterianas. Véase Inouye e Inouye, TIBS, 16, 18 (1991a), e Inouye e Inouye, Ann. Rev.. Microbiol, 45, 163 (1991b). Se cree que la duplicación de genes a través de la síntesis de ADNc mediante la transcriptasa inversa ha jugado un papel importante en la diversificación de los genomas a lo largo de la evolución.

La invención se originó en conexión con la investigación básica relacionada con la evolución del genoma. Se demostró la síntesis de un único ADNmc-h durante la replicación del ADN de plásmido. Podría especularse con que la producción del ADNh podría ser ampliamente predominante durante la replicación del ADN cromosómico tanto procariótico como eucariótico. Los elementos genéticos cromosómicos seguidos por estructuras RI pueden estar siempre sometidos a una duplicación en ADNh a una frecuencia dependiente de la estabilidad de la estructura RI y de la característica de la(s) polimerasa(s).

Se ha demostrado que hay numerosas estructuras repetidas invertidas (RI) (aproximadamente 1.000 copias en E. coli), conocidas como secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas, SRPEs, o unidades palindrómicas, UP. Hiigins y col., Nature, 298, 760 (1982), Gilson y col., EMBO. J., 3, 1417 (1984) y Gilson y col., Nucl. Acids Res., 19, 1375 (1991). Estas estructuras parecen estar asociadas a componentes celulares específicos, incluyendo la ADN polimerasa I, y pueden estar jugando un papel significativo en la organización cromosómica. Gilson y col., Nucl. Acids Res., 18, 3491 (1990) y Gilson y col., EMBO. J., 3, 1417 (1984). También debería advertirse que aproximadamente el 6% del genoma humano está ocupado con elementos denominados Alu, cuyos productos de transcripción han mostrado contener sustanciales estructuras secundarias. Simmett y col., J. Biol. Chem., 266, 8675 (1991).

Dado que la síntesis de ADNh no requiere ARN intermedios ni actividad de transcriptasa inversa, al contrario que la síntesis de ADNc, el ADNh puede ser producido más frecuentemente que el ADNc. Así, los ADNh podrían haber jugado un papel importante similar al ADNc en la evolución genómica tanto de procariotas como de eucariotas, mediante la duplicación de los elementos genéticos que después fueron dispersados o reorganizados dentro del genoma.

Resumen de la invención

Las solicitudes parentales tratan de procedimientos de síntesis de una nueva estructura de ADN monocatenario, ADNh, in vivo o in vitro, de estructuras de ADNh y de otras diversas construcciones genéticas. Las solicitudes parentales también tratan de ADNh portadores de un antigen en la porción monocatenaria del ADNh, que puede ser un fragmento antisentido que se une a un ARNm objetivo e inhibe la traducción del ARNm en proteína, o que se une a ADN bicatenario, formando así una triple hélice que inhibe la expresión del ADN objetivo.

La presente invención trata de la sobreexpresión de moléculas de ADN monocatenario, más particularmente ADNh, con rendimientos nunca antes conseguidos, del método para su producción y de las construcciones genéticas necesarias para conseguir estos objetivos.

Las estructuras de ADNh (según se han descrito anteriormente) son moléculas de ADN monocatenario que comprenden un bucle monocatenario y una cola monocatenaria de bases complementarias duplicadas, finalizando con un único 5' y un único 3' terminal, que pueden tener un saliente monocatenario el uno respecto del otro.

En vista del hecho de que las moléculas monocatenarias son notablemente inestables, no se esperaba que tales estructuras monocatenarias pudieran producirse con tales elevados rendimientos según la invención.

Según la presente invención, se ha realizado un hallazgo fundamental. Se ha averiguado que algunas porciones del genoma pueden ser duplicadas directamente a partir del genoma. Esta duplicación génica que se ha encontrado no requiere ni ARN intermedios ni transcriptasa inversa, y se produce durante la replicación del ADN.

En una breve descripción, la invención proporciona un método (o procedimiento) para sintetizar una nueva y útil molécula de ADN monocatenario (ADNmc). El método implica el uso de un ADN repetido invertido (RI) y de los componentes necesarios para iniciar y sintetizar una estructura monocatenaria. La invención también proporciona un sistema de síntesis de dicho ADN monocatenario con y a partir de los componentes necesarios, incluyendo un ADN repetido invertido. La invención proporciona adicionalmente vehículos de replicación competentes que incluyen todos los elementos necesarios para sintetizar las muevas moléculas de ADNmc. La invención también proporciona nuevas y útiles moléculas de ADNmc que forman una estructura única. La estructura tiene un tallo constituido por ADN duplicado de bases complementarias; el tallo termina en uno de sus extremos mediante dos terminales, respectivamente un 3' y un 5' terminales, y en el otro extremo mediante un ADNmc que forma un bucle.

La invención contempla llevar a cabo el método y los sistemas in vitro o in vivo.

Se describen varios usos de las nuevas moléculas, incluyendo un método para proporcionar mutaciones aleatorias en los genes con objeto de producir proteínas con propiedades biológicas nuevas o mejoradas. Otro interesante uso contemplado es la integración de la moléculas de ADNmc de la invención en ADN, para producir un ADN tricatenario de una estabilidad aumentada. Otro uso del ADNmc de la presente invención es como ADN antisentido. Otro uso es la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un único cebador.

La invención y sus múltiples realizaciones se describen en gran detalle a continuación.

Mediante el método de la invención se produce una molécula de ADNmc cuya estructura comprende una porción de tallo de ADN duplicado de bases complementarias apareadas dentro del ADNmc, cuyo tallo forma, en uno de sus extremos, los 5' y 3' terminales de la molécula de ADNmc, y en el otro extremo, un bucle, que está constituido por una hebra de bases no apareadas que se une a las dos hebras simples del tallo. En una realización específica, la hebra con un extremo 3' terminal es mayor que la otra hebra. Los ADNh pueden incluir segmentos de ADN capaces de codificar una proteína, más particularmente cualquier gen(es). El gen estará localizado entre el bucle y el extremo terminal. El gen puede ser un gen portador de mutación(es).

Uno de los mecanismos postulados para la síntesis de los ADNh se ilustra en las Figs. 6A y B. Se cree que la síntesis comprende, en resumen, el siguiente proceso: el ADN se inicia en el origen de replicación (OR), entonces se produce la replicación de una primera hebra (o "la" o "una" hebra) usando una de las hebras del ADN bicatenario como molde (mediante el mismo mecanismo que la replicación del ADN cromosómico (véase Tomizawa y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 74, 1865 (1977)), continuando a lo largo de la estructura RI, dando como resultado la replicación del genoma completo del plásmido, cuando se usa un plásmido. Sin embargo (como se describe con gran detalle a continuación), parte de la primera hebra forma una estructura en bucle según se desorganiza o termina la síntesis de la primera hebra dentro de la RI (Fig. 6, desde las etapas 2 a 3). El bucle forma una pequeña región duplicada que funciona como sitio cebador para continuar la síntesis de ADN. La elongación de la cadena de ADN se reanuda a partir del nuevo extremo 3' formado, formando ahora la segunda hebra (o "la otra" hebra) utilizando la primera hebra naciente como molde. A continuación se describe un proceso postulado de síntesis alternativa (o concurrente). Así, la dirección de la síntesis del ADN se invierte cambiando el molde para duplicar el fragmento de ADN (Fig. 6, desde las etapas 4 a 5). La nueva molécula de ADNh sintetizada se disocia ella misma de las hebras molde parentales, que sufren otro ciclo de replicación para formar otro ADNh. El ADNh se aísla, y si es necesario, se purifica.

En otra realización de la invención se prevé un vehículo de autorreplicación del ADN, por ejemplo, un plásmido, en el que se ha insertado un fragmento de ADN que contiene una estructura repetida invertida (RI), el fragmento de ADN servirá de molde par la síntesis del ADNmc y un sitio cebador adecuado, por ejemplo, un origen de replicación (OR), tal como el origen de replicación de E. coli (ColE1). La RI se sitúa secuencia abajo del OR. El vehículo de autorreplicación se replica en un hospedador adecuado, por ejemplo, una E. coli. El hospedador contendrá al menos una ADN polimerasa para sintetizar el ADNmc a partir del molde. En esta realización específica, se asume que hay dos polimerasas, una primera ADN polimerasa que contribuye a la elongación de la porción de ADNmc a partir del OR hacia la RI, la primera hebra, y una segunda ADN polimerasa que sintetiza la segunda hebra o de equilibrio de la hebra del ADNmc. Según termina la síntesis de la primera hebra, las bases complementarias se aparean para formar un bucle monocaternario no apareado. Entonces tiene lugar la síntesis de la segunda hebra. Se sintetiza una nueva estructura de ADN constituida por una tallo de ADN duplicado y una estructura en bucle monocatenaria en el extremo opuesto. Para esta nueva estructura de ADN se ha acuñado el término "en horquilla" o "ADNh".

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Otra realización específica proporciona un vehículo de replicación en el que se eliminado un promotor, específicamente el promotor lac. No obstante, se produjo un ADNh apoyado por el modelo de síntesis propuesto, según se describe adicionalmente en la presente memoria descriptiva.

El plásmido puede ser construido para contener cualquier secuencia de ADN seleccionada capaz de codificar una proteína entre el sitio cebador y la RI, en cuyo caso el ADNh sintetizado contendrá la secuencia de ADN o una mutación de la misma.

Esta invención proporciona un método para regular la función génica mediante el uso de ADNh.

Los ADNh de la invención no necesitan ser sintetizados mediante un vehículo de autorreplicación, pero pueden ser sintetizados en un sistema in vitro adecuado constituido por cualquier segmento de ADN, lineal o no, que contenga cualquier RI y los elementos necesarios para sintetizar el ADNmc. Dicho sistema se describe a continuación.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 ilustra un plásmido de la invención, el pUCK106.

La Fig. 2 muestra la secuencia de ADN de 215 pb insertados en el sitio XbaI de pUCK19.

La Fig. 3 muestra una tinción de bromuro de etidio en gel de poliacrilamida de la producción de un ADNh a partir de pUCK106 y sus características.

La Fig. 4 muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la formación del dímero de ADNh a partir de pUCK106.

La Fig. 5 ilustra la determinación de la secuencia de ADN del ADNh a partir de pUCK106.

(A)

muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la determinación de la secuencia de ADN de la región extremo 5' del ADNh.

(B)

muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la secuenciación del extremo 5' de la región del bucle del ADNh.

(C)

muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la secuenciación del extremo 3' de la región del bucle del ADNh.

(D)

muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la secuencia de ADN de la región terminal 3' del ADNh.

(E)

muestra la estructura del ADNh a partir de pUCK106.

La Fig. 6 ilustra dos posibles modelos de síntesis del ADNh.

La Fig. 7, en los carriles 1 y 3, muestra el digerido HaeIII de pBR322 como marcadores de tamaño. El carril 2 muestra el ADNh de la preparación a partir de pUC7.

La Fig. 8 muestra el gen de la \beta-galactosidasa en un vector transformado.

La Fig. 9 muestra los plásmidos pUCK106d.P.O., pUCK106d.P.O.-I y pUCK106d.P.O.-II.

La Fig. 10 muestra la construcción del plásmido pXX566.

La Fig. 11 muestra la relación entre la concentración de ampicilina y el número de colonias en el ejemplo 9-3.

La Fig. 12 muestra los plásmidos pUCKA106d.P.O., pUCKAGT37 y pUCKACA-37.

La Fig. 13 muestra la secuencia del ADN insertado en pMS434 y la localización de los cebadores.

La Fig. 14 muestra la construcción de los plásmidos pYES2-8-106 y pYES2-9-106.

La Fig. 15 muestra los fragmentos de ADN producidos mediante digestión de pYES2-8-106, pYES2-9-106 y ADNh con SalI.

La Fig. 16 muestra el emplazamiento de tres cebadores para detectar el ADNh.

La Fig. 17 ilustra el esquema de construcción de un vehículo replicable de la invención para sobreexpresar los ADNh.

La Fig. 18 ilustra una construcción final, el pHS2870.

La Fig. 19 ilustra el esquema de construcción de la construcción pHS2870 (\sim480 pb), mostrando la inserción en el sitio de restricción HindIII, del fragmento HindIII de 49 bases y el plásmido denominado pHS2870GT (\sim500 pb).

La Fig. 20 ilustra la electroforesis en gel de los ADNh extraídos a partir de pHS2870 y a partir de pHS2870GT.

La Fig. 21 ilustra la construcción de E. coli MC4100\lambdapFTR1F'.

La Fig. 22 muestra la detección del nivel de expresión de la \beta-galactosidasa.

Depósito de material genético

El plásmido pUCK106 ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) con la Entrada nº 68679.

El plásmido pUCK106\Deltalac^{PO} ha sido depositado en la ATCC con la Entrada nº 68680.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo, y no pretenden en modo alguno limitar la invención. En estos ejemplos, todos los porcentajes son en peso para los sólidos y en volumen para los líquidos, y todas las temperaturas son en grados Celsius, salvo indicación contraria.

Por conveniencia y claridad, los Ejemplos también tratan y proporcionan una descripción detallada de las Figuras.

Ejemplo 1

La Fig. 1 ilustra el pUCK19 (mapa circular), un plásmido específico elaborado según se muestra a continuación. La barra blanca del mapa circular representa el gen de resistencia a la kanamicina (a partir de Tn 5). La barra abierta lineal mostrada en la parte superior derecha representa un fragmento de ADN de 215 pb insertado en el sitio XbaI que contiene secuencias repetidas invertidas (RI) de 35 pb. Las flechas oscuras muestran la estructura RI. El dibujo del círculo oscuro es el origen de replicación (Ori). La flecha blanca más larga indica la dirección de replicación del ADN a partir del OR. La flecha blanca más pequeña indica la posición del promotor-operador lac (lac^{PO}).

La Fig. 2 muestra la secuencia de ADN de 215 pb insertada en el sitio XbaI de pUCK19, consistente en los ADN mostrados como SEQ ID nº 1 y 2 respectivamente en la lista de secuencias. Este plásmido se denomina, en la presente memoria descriptiva, pUCK106. Las flechas blancas indican las secuencias RI. El sitio HindIII (AAGCTT) muestra el centro de la RI.

Las posiciones mal emparejadas en la RI se muestran mediante dos espacios abiertos en las flechas, con las bases mal apareadas C y T insertadas en los espacios.

El fragmento de ADN discutido anteriormente (que contiene la RI) tiene la siguiente secuencia mostrada como Fig. 2.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la producción de un ADNh a partir del pUCK106, y sus características.

(A) se transformó E. coli CL83 con uno de pUCK19, pUCK106 y pUCK106\Deltalac^{PO}, y se preparó una fracción de ADN de plásmido. Se aplicó una preparación de ADN (tras un tratamiento con ribonucleasa A) a un gel de acrilamida al 5% para electroforesis. El gel se tiñó con bromuro de etidio. Con respecto a la Fig. 3A, el carril 1 muestra el digerido Hae III de pBR322 como marcadores de tamaño. Los números mostrados son pares de bases; el carril 2, la preparación de ADN a partir de células portadoras del pUCK19; el carril 3, el pUCK106; y el carril 4, el pUCK106\Deltalac^{PO}.

El pUCK19 es una variante de kanamicina del pUC19.

(B) el ADNh a parir del pUCK106 se purificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida seguida de varias digestiones con enzimas de restricción. Los digeridos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (5%), y el gel se tiñó con bromuro de etidio. Con respecto a la Fig. 3B, el carril 1 es el digerido HaeIII de pBR322 como marcadores de tamaño; el carril 2, el ADNh sin digestión; el carril 3, el ADNh digerido con XbaI; el carril 4, con HindIII; y el carril 5, con PvuII.

(C) desnaturalización térmica del ADNh a partir de pUCK106. El ADNh purificado (según se describió anteriormente) se solubilizó en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM. La disolución de ADNh se incubó en un baño de agua hirviendo durante 3 minutos, y se enfrió rápidamente con un baño de hielo. Las muestras se analizaron según se describe en A. Con respecto a la Fig. 3C, el carril 1 es el digerido HaeIII de pBR322 como marcadores de tamaño; el carril 2, ADNh sin tratamiento térmico; y el carril 3, ADNh desnaturalizado térmicamente seguido de un rápido enfriamiento.

El ADNh tiene un bucle de 53 bases, un tallo de aproximadamente 440 bases y una cola saliente 3' de 15-18 bases.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la formación del dímero del ADNh a partir del pUCK106.

(A) el ADNh purificado a partir de pUCK106, según se describe en la Fig. 2, se solubilizó en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y MgCl_{2} 10 mM. La disolución de ADNh se incubó en una baño de agua hirviendo durante 3 minutos y después se enfrió gradualmente. El ADNh renaturalizado se digirió con XbaI, y los fragmentos de ADN así generados se marcaron en sus extremos 5' con [\gamma^{32}P]ATP y T4 polinucleótido quinasa. Estos productos se aplicaron sobre un gel de poliacrilamida al 5%. Tras la electroforesis, el gel se secó y se sometió a una autorradiografía.

Con respecto a la Fig. 4A, el carril es el digerido HaeIII de pBR322 como marcadores de tamaño; el carril 2, el digerido EcoRI y HindIII de ADN \lambda como marcadores de tamaño. Los números mostrados son en pares de bases; el carril 3, el ADNh tras la desnaturalización térmica seguida de un enfriamiento gradual; y el carril 6, el digerido XbaI del ADNh a partir del carril 5. Las bandas están marcadas como "a" a "e" en el lado derecho.

(B) caracterización del fragmento "d" de la Fig. 4A. El fragmento "d", purificado a partir del gel; el carril 3 es el digerido HindIII del fragmento "d" purificado; y el carril 4, el fragmento "d" purificado se desnaturalizó térmicamente y se enfrió rápidamente según se describe con respecto a la Fig. 3.

(C) representación esquemática de las bandas "a" a "e" mostradas en A y B (Fig. 4C). X y H representan los sitios Xba y HindIII, respectivamente. Estos son otros dos sitios HindIII del fragmento "a" muy cercanos a los sitios XbaI (dentro del fragmento "c"). Estos sitios HindIII no se muestran.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la determinación de la secuencia de ADN del ADNh a partir del pUCK106.

(A) determinación de la secuencia de ADN de la región extremo 5' del ADNh. Se usaron 0,2 \mug del ADNh aislado y purificado para la secuenciación mediante el método de la terminación de la cadena. Se usó el cebador "a" (^{5'}GGTTATCCACAGAATCAG^{3'}), mostrado como SEQ ID Nº 3 en la lista de secuencias, que corresponde la secuencia de 96 pb secuencia abajo a partir del origen (véase la Fig. 5B).

(B) secuenciación del extremo 5' de la región del bucle del ADNh. Se digirieron 0,5 \mug del ADNh con SacII, y los fragmentos de ADN así generados se marcaron en el extremo 5' con [\gamma^{32}P]ATP y T4 polinucleótido quinasa. El fragmento de ADN migró a aproximadamente 40 pb, se aisló y se secuenció por el método de Maxam-Gilbert.

(C) secuenciación del extremo 3' de la región del bucle del ADNh. El ADNh digerido con SacII se marcó en el extremo 3' con [\gamma^{32}P]didesoxiATP usando desoxinucleotidiltransferasa terminal. El fragmento de ADN que contenía la región del bucle se aisló y se secuenció por el método de Maxam-Gilbert.

(D) secuencia de ADN de la región del extremo 3' del ADNh. El ADNh se digirió con AflIII (véase Fig. 5E). Los extremos 5' se marcaron con [\gamma^{32}P]ATP y T4 polinucleótido quinasa. Los productos marcados se separaron con un gel de secuenciación. El ADN monocatenario que migró a 76 bases se aisló y se secuenció por el método de Maxam-Gilbert. Con respecto a la Fig. 5D, los números representan los números de residuo a partir del origen de pUCK19.

(E) estructura del ADNh a partir de pUCK106. El ADNh consiste en un ADN monocatenario de 1137 a 1139 bases. El extremo 5' del ADNh parece ser heterogéneo; unos comienzan a partir de + 1, mientras que otros comienzan a partir de - 1, + 2 y + 3. La posición + 1 corresponde al origen de la replicación del ADN ColE1. Así, diversos ADNh tienen diferentes longitudes de hebras en los extremos 5'. En el extremo 3' se extiende una secuencia de 16 bases más allá de la posición + 1 del extremo 5'. El bucle se considera formado por la secuencia de 4 bases (AGCT) correspondiente a la secuencia central de la estructura RI, donde está destinado colocar un sitio HindIII (AAGCTT). El ADNh tiene una cola de aproximadamente 400 bases. El par de bases correspondiente al mal apareamiento en la estructura RI de pUCK106 que se transformó, de C\cdotT (en pUCK106), a C\cdotG (en el ADNh), se muestra entre los sitios SacII y PstI. La posición del cebador "a" usado para la secuenciación del ADN en la Fig. 5A se muestra mediante una flecha.

Los ADNh pueden construirse con tallos de 300-4.000 bases o más. El saliente puede ajustarse a cualquier longitud deseada, como desde aproximadamente 10 hasta 80, como por ejemplo hasta aproximadamente 50. La longitud, preferiblemente, no debería ser tal como para sacrificar la estabilidad. Los ADNh se construirán con bucles de los tamaños deseados.

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Las separación y purificación de los ADNh se realiza de acuerdo con las técnicas estándar, como según los procedimientos descritos en Molecular Cloning, A laboratory Manual, Sambrook y col., 2ª Ed. (Secciones 1.121-1.40) ("Sambrook").

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra dos posibles modelos de síntesis de ADNh (véase la Fig. 6). El ADN bicatenario alrededor del origen de replicación del ADN ColE1 se muestra arriba. El círculo oscuro representa el complejo de replicación del ADN que inicia la replicación del ADN a partir del origen. Las flechas blancas en la hebra de ADN indican la posición de la estructura repetida invertida (RI) de 35 pb (véase la Fig. 2) en la secuencia de ADN. El par de bases mal apareado (C\cdotT) en la estructura RI también se indica dentro de las flechas.

En la etapa 1, la horquilla de replicación del ADN comienza a partir del origen (posición + 1) hacia la posición indicada por el círculo oscuro. La primera hebra recién sintetizada se muestra extendida a partir del origen (un círculo oscuro) hacia la horquilla de replicación. El complejo de replicación de ADN llega inmediatamente, antes del residuo T mal apareado en la estructura RI, que se muestra mediante flechas oscuras. En la etapa 2, el extremo 3' de la hebra naciente se desprende del complejo de replicación del ADN, y se forma una estructura secundaria mediante la estructura RI. En la etapa 3 se reinicia la síntesis de ADN a partir del extremo 3' de la estructura en horquilla utilizando como molde bien la hebra naciente (modelo A) o bien la hebra parental superior (modelo B). En la etapa 4, la síntesis de ADN prosigue más allá del origen, por 16 bases.

En el modelo A, el cebador de ARN, que permanece unido al extremo 5' del ADN, puede usarse como el cebador de ARN. Posteriormente, el ARN puede eliminarse, dando como resultado la formación de un ADNh. En el modelo B, la síntesis de ADN termina en el sitio Hter mediante un mecanismo similar conocido para la terminación de la síntesis de la segunda hebra de ADN.

Es concebible que ambos modelos A y B puedan explicar la síntesis, y puede que la síntesis se desarrolle por ambas vías concurrentemente, al menos durante parte del tiempo. Así, se usará un molde adecuado para la segunda hebra, diferente a la hebra que era el molde de la primera hebra.

Ejemplo 6 Construcción de pUCK106\Deltalac^{PO}

Cuando el fragmento PvuII-HincII de 199 pb que contiene el promotor-operador lac se eliminó del pUCK106 (véase la Fig. 1), el pUCK106\Deltalac^{PO} resultante produjo un nuevo ADNh que migró más rápidamente que el ADNh a partir del pUCK106 mostrado en la posición (b) del carril 4, Fig. 3A. El tamaño de este nuevo ADNh era de una longitud de 360 pb, que es más corto que el ADNh del pUCK106, en una longitud prácticamente idéntica al tamaño de la deleción en pUCK106\Deltalac^{PO}.

En la Fig. 3A, el carril 3 muestra el ADNh de la preparación de ADN a partir de células portadoras del
pUCK106\Deltalac^{PO}.

Este experimento apoya el modelo de síntesis de ADNh propuesto anteriormente, y también indica que el promotor-operador lac no es esencial para la síntesis del ADNh. Esta idea fue apoyada además por el hecho de que la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido, un inductor de lac, no afectó a la producción del ADNh a partir del pUCK106. Sin embargo, actualmente no se conoce el motivo de la reducción de la síntesis del ADNh a partir del pUCK106\Deltalac^{PO}.

Ejemplo 7

La síntesis del ADNh no era dependiente de la secuencia primaria de la estructura RI usada para el pUCK106. Interesantemente, el vector pUC7, que tiene una estructura RI en el sitio policonector, también es capaz de producir por sí mismo un ADNh correspondiente al fragmento de ADN a partir del origen hacia el centro del sitio policonector.

El ADNh aislado y purificado producido a partir de pUC7 tenía una longitud de 252 pb. Se preparó una fracción de plásmido y se trató como en el Ejemplo 2, y se aplicó (y tiñó) en un gel de acrilamida para electroforesis.

En la Fig. 7, los carriles 1 y 3 muestran el digerido HaeIII de pBR322 como marcadores de tamaño. El carril 2 muestra el ADNh de la preparación a partir del pUC7.

El ADNh del pUC7 se amplificó mediante PCR (que se describe en mayor detalle en la presente memoria descriptiva), y el carril 4 (en la flecha) muestra el ADNh.

Ejemplo 8 Confirmación de la estructura del ADNh

La estructura y mecanismo del ADNh descritos anteriormente (ilustrados en la Fig. 6) se confirmaron como sigue.

El fragmento de ADN construido sintéticamente se proveyó intencionadamente con bases CT mal apareadas, en lugar de CG. Véase, en la Fig. 2, en los huecos abiertos de la RI. Tras la síntesis del ADNh (con la segunda hebra retrasada sobre la primera hebra), el mal apareamiento había sido reparado. Ahora, en la Fig. 5E, aparece CG. Si la estructura no fuera una estructura retrasada, la polimerasa habría leído correctamente a lo largo de la RI, habría leído la T e insertado una A; la nueva hebra aún tendría el mal apareamiento. Para reemplazar la T mal apareada, esa porción de RI tiene necesariamente que retrasarse sobre la primera hebra, permitiendo así que la polimerasa use la primera hebra sintetizada como molde para sintetizar la segunda hebra, y según la sintetiza, insertar la base complementaria, G, en lugar de la T mal apareada. Esto establece inequívocamente el mecanismo de síntesis y la estructura de los ADNh de la invención.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la regulación de la función génica mediante el uso de ADNh que contiene una secuencia antisentido (ADNh antisentido).

9-1 Construcción de plásmidos que producen ADNh

Se preparó pUCK106d.P.O. a partir de pUCK106 mediante la deleción del fragmento de 199 pb PvuII-HincII que contenía el promotor-operado lac (Fig. 9). Entonces los oligonucleótidos con las estructuras mostradas en la lista de secuencias como SEQ ID Nº 4 (antisentido) y Nº 5 (sentido) se sintetizaron, hibridaron e insertaron en el sitio HindIII del pUCK106d.P.O.. El plásmido que produjo el ADNh que contenía la secuencia sentido (ADNh sentido) se denominó pUCK106d.P.O.-I, y el plásmido que produjo el ADNh antisentido se denominó pUCK106d.P.O.-II (Fig. 9).

Se determinó que el ADNh tiene un bucle de 42 bases, un tallo de 360 bases duplicadas y una cola o saliente de 15-18 bases.

9-2 Preparación del hospedador E. coli que contiene el gen de la \beta-lactamasa

El fragmento EcoRI-HaeII de aproximadamente 1,6 kb que contiene el gen de la \beta-lactamasa a partir de pBR322 (Takara Shuzo) se cortó en extremos romos y se insertó en el sitio SmaI de pHSG399 (Takara Shuzo). El plásmido resultante se denominó pXX555. El fragmento de 1695 pb EcoRI-HindIII a partir de pXX555 se insertó en el sitio EcoRI-HindIII del pXX325 derivado del plásmido miniF (véase Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 80, 4784-4788, 1983). El plásmido resultante se denominó pXX566 (Fig. 10). La E. coli MC4100, que contiene el gen de la \beta-lactamasa, se preparó mediante transformación con pXX566. El transformante se denominó MC4100/pXX566.

9-3 Reducción de la expresión del gen de la \beta-lactamasa mediante el ADNh antisentido

Se prepararon E. coli MC4100/pXX566/I y E. coli MC4100/pXX566/II a partir de E. coli MC4100/pXX566 mediante transformación con pUCK106d.P.O.-I y pUCK106d.P.O.-II, respectivamente. Cada transformante se inoculó en un caldo L que contenía 50 \mug/ml de kanamicina y se incubó hasta el día siguiente a 37ºC. El cultivo se diluyó a 1:10.000 con caldo L, y 50 \mul de cada dilución se colocaron en placas de agar con caldo L que contenían 50 \mug/ml de kanamicina y 50-150 \mug/ml de ampicilina. Tras la incubación hasta el día siguiente a 37ºC se contó el número de colonias. La Tabla 1 y la Fig. 11 muestran el porcentaje relativo de los números (eje X: concentración de ampicilina, eje Y: porcentaje relativo, con 100% a la concentración de 50 \mug/ml de ampicilina). El aumento de la tasa relativa de muerte mostró que la expresión del gen de la \beta-lactamasa estaba reducida por el ADNh antisentido.

TABLA 1

1

9-4 Medida de la expresión de la \beta-lactamasa mediante transferencia Western

Cada colonia individual de MC4100/pXX566/I y II, como en el ejemplo 9-3, se eligió al azar y se inoculó con 5 ml de caldo L que contenía 20 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de kanamicina. Tras la incubación hasta el día siguiente a 37ºC, se inocularon 100 \mul de cada cultivo en el mismo medio fresco. Las células se recogieron en el momento en que la absorbancia a 600 nm alcanzó 1,2, se lavaron con tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,1) y se resuspendieron en 1 ml del mismo tampón. Se registró la densidad celular midiendo la absorbancia a 600 nm. Los lisados tratados con ultrasonidos de 5,36 x 10^{8} células se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al 15%, y las proteínas separadas se transfirieron a un segmento de filtro de membrana PVDF (Immobilon, Millipore). Posteriormente el filtro se expuso a anticuerpos policlonales anti-\beta-lactamasa de conejo (5 Prime-3 Prime, Inc.) y se realizó la detección con un Immno-Stain-Kit (Konica). Tras el tratamiento con un sustrato cromogénico aparecieron bandas coloreadas en sus posiciones adecuadas. Estas bandas indicaban que el nivel de actividad \beta-lactamasa en las células productoras del ADNh antisentido era un 30% inferior al de las células productoras de ADNh sentido.

Además, se demostró que las copia de los genes de los ADNh sentido y antisentido eran las mismas, y que ninguna molécula contenía deleciones o reordenaciones. Las fotografías de los geles que contienen los ADNh sentido y antisentido muestran que los ADNh producidos son del tamaño esperado, sugiriendo que no se produjo ninguna reordenación génica en estas construcciones. Además, la intensidad de las bandas de los ADNh sentido y antisentido es similar, lo que demuestra que el número de copias de ambos también es similar.

Estos resultados están adicionalmente apoyados por los resultados de los estudios sobre el gen de resistencia a la kanamicina. La expresión del gen de la kanamicina es independiente del sistema antisentido, y sirve por tanto como un control interno. Los geles de poliacrilamida de los extractos derivados a partir de células que expresan los ADNh sentido y antisentido muestran que la intensidad de las bandas que representan a la proteína de resistencia a la km es la misma. Además, la cantidad total de proteína en estos dos extractos, excepto para la \beta-lactamasa, es la misma. Estos resultados muestran que es el efecto antisentido lo que se está demostrando con los datos presentados. Así, los cambios en la expresión de la \beta-lactamasa observados no se producen como resultado de un efecto global sobre la transcripción y traducción celular, sino que se deben directamente a la expresión del ADNh antisentido.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra un ADNh capaz de formar una triple hélice (ADNh formador de triple hélice).

10-1 Construcción de pUCK106d.P.O.

La secuencia 106-NdeI, que consiste en las secuencias mostradas como SEQ ID Nº 6 y 7 en la lista de secuencias, se insertó en el sitio NdeI del pUCK19. El plásmido resultante se denominó pUCK106A. El plásmido pUCK106Ad.P.O. se construyó mediante la deleción del fragmento de 206 pb HincII-VspI que contenía la región del promotor-operador lac de pUCK106A.

10-2 Preparación del ADNh formador de triple hélice

El oligonucleótido mostrado como SEQ ID Nº 8 (secuencia GT37) de la lista de secuencias y el oligonucleótido mostrado como SEQ ID Nº 9 (secuencia CA37) de la lista de secuencias fueron sintetizados y fosforilados en el extremo 5'. El oligonucleótido duplicado se realizó mediante hibridación con estos oligonucleótidos, y se insertó en el sitio Hind III de pUCK106Ad.P.O. en el centro de la secuencia 106-Ndel. Cada plásmido que producía el ADNh que contenía la secuencia GT37 o la secuencia CA37 se denominó pUCKAGT37 opUCAKCA37, respectivamente (Fig. 12). Las E coli MC4100 fueron transformadas con estos plásmidos, y cada transformante se denominó MC4100/pUCKAGT37 o MC4100/pUCKACA37. Estos transformantes, y MC4100/pUCK106Ad.P.O., construidos en el Ejemplo 9-2, se cultivaron en caldo L que contenía 70 \mug/ml de kanamicina. El ADN se preparó mediante el método SDS-alcalino y se trató con RNasaA. El ADNh se purificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

10-3 Preparación del ADN objetivo

El oligonucleótido mostrado como SEQ ID Nº 10 en la lista de secuencias, y el oligonucleótido mostrado como SEQ ID Nº 11 en la lista de secuencias, fueron sintetizados y fosforilados en el extremo 5'. El oligonucleótido duplicado se realizó hibridando estos oligonucleótidos e insertándolos en el sitio XhoI-HindIII de pMS434 [véase Gene, 57, 89-99, (1987)]. Este plásmido se denominó pMSTR37.

El ADN objetivo de la formación de la triple hélice se amplificó mediante PCR con el cebador M4 mostrado como SEQ ID Nº 12 en la lista de secuencias y el cebador MSI mostrado como SEQ ID Nº 13 en la lista de secuencias como cebadores, y pMSTR37 como molde.

10-4 Formación de la triple hélice en el ADNh

El ADNh preparado en el Ejemplo 10-2 se marcó con [\gamma^{32}P]ATP mediante fosforilación. La triple hélice se formó mezclando el ADNh radiomarcado y un exceso de ADN objetivo en un tampón de NaCl 0,15 M/MgCl_{2} 10 mM/tris-acetato 5 mM (pH 7,0), y después incubándolos hasta el día siguiente a 37ºC. La formación de la triple hélice se detectó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en tampón tris-borato 50 mM/MgCl_{2} 5 mM (pH 8,3).

Como resultado se detectó la formación de la triple hélice sólo con el ADNh que contenía la secuencia GT37. Por otro lado, no se detectó formación de triple hélice ni con el ADNh que contenía la secuencia CA37 ni con ADNh intacto.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra la síntesis de ADNh en Saccharomyces cerevisiae.

11-1 Construcción de los plásmidos pYES2-8-106 y pYES2-9-106

El vector lanzadera pYES2 (Invitrogen), que contiene los orígenes ColE1 y 2\mu, se modificó según se ilustra en la Fig. 14, y los derivados se usaron para investigar si el ADNh puede ser producido en levaduras. Primero se eliminaron de pYES2 los sitios de clonaje múltiple y la región del promotor Gal I mediante digestión con MlUI y SspI. A continuación, el fragmento de ADN remanente se cortó en extremos romos con la T4 ADN polimerasa y después se autoligó (etapa 1). Segundo, el fragmento de ADN A o B, mostrado como SEQ ID Nº 14 ó 15 en la lista de secuencias, respectivamente, se insertó en el sitio de extremos romos AvaI del plásmido de la etapa 1 (etapa 2). Finalmente, el fragmento de ADN de 227 pb BamHI-SalI de pUCK106 se insertó en el sitio Bam HI-SalI de los plásmidos de la etapa 2 (etapa 3). Los derivados pYES2 resultantes se denominaron pYES2-8-106 (lado izquierdo de la Fig. 14) y pYES2-9-106 (lado derecho de la Fig. 14), respectivamente.

11-2 Purificación del ADN del plásmido y del ADNh a partir de los transformantes

Las células YPH499 de Saccharomyces cerevisiae (Stratagene) se transformaron mediante pYES2-8-106 o pYES2-9-106 mediante el procedimiento del LiAc [véase Journal of Bacteriology, 153, 163-168, (1983)]. Estos transformantes se hicieron crecer en 100 ml de medio YPD (extracto de levadura al 1%, bacto-peptona al 2%, dextrosa al 2%) hasta una OD_{600} de aproximadamente 1,5. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron una vez con 10 ml de disolución SCE (182 g/l de sorbitol, 29,4 g/l de Na_{2}Citrato, 22,3 g/l de Na_{2}EDTA). A continuación, las células se suspendieron en disolución I (disolución de SCE que contiene \beta-mercaptoetanol al 0,1% y 0,5 mg/ml de Zimoliasa 100T) y se agitaron suavemente a 37ºC durante 2 horas para generar esferoplastos. A continuación se añadieron 8 ml de disolución II (NaOH 0,2 N, SDS al 1%) y las suspensiones se dejaron en hielo durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 6 ml de disolución III (60 ml de K-acetato 5 M, 11,5 ml de ácido acético glacial, 28,5 ml de H_{2}O), se dejaron en hielo durante 5 minutos adicionales y después se centrifugaron. Los ADN se precipitaron mediante la adición de isopropanol a los sobrenadantes, se lavaron con etanol al 70% y se resuspendieron en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,6). Los ADN se purificaron adicionalmente mediante extracción con fenol/cloroformo, precipitación con etanol y usando un filtro Qiagen 5 (Qiagen Inc.). Finalmente, los ADN purificados se suspendieron en 20 \mul de tampón TE.

11-3 Separación del ADNh a partir del ADN del plásmido

Se trataron 10 \mul de las muestras obtenidas en el Ejemplo 11-2 con SalI. Mediante este proceso, el ADN del plásmido debería cambiar a un fragmento de ADN lineal de 5024 pb, y el ADNh debería dividirse en dos fragmentos, a saber, un ADNh de 127 pb y un ADN lineal bicatenario de longitud desconocida (Fig. 15). Tras la adición de 2\mug de digerido ColE1-AfaI, compuesto de fragmentos de 29, 46, 60, 62, 69, 99, 120, 126, 130, 243, 252, 323, 413, 415, 564, 778, 950, 976 y 991 pb, las muestras se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%. La mitad inferior del gel se cortó y se tiñó con bromuro de etidio, y el gel de la región entre 120 pb y 130 pb se recuperó y se cortó en varios trozos. Los ADN se extrajeron del gel mediante incubación a 60ºC durante 30 min con la adición de agua esterilizada. Tras la centrifugación, se eliminaron las impurezas insolubles del sobrenadante mediante una columna de lana de vidrio. Entonces el sobrenadante se liofilizó. Finalmente, los ADN recuperados se suspendieron en 20 \mul de tampón TE.

11-4 Detección del ADNh mediante el método de PCR

La detección del ADNh de las muestras preparadas en el ejemplo 11-3 se llevó a cabo mediante el método de PCR. Se prepararon el cebador 1871 y el cebador 20261, mostrados como SQ ID Nº 16 y 17, respectivamente, en la lista de secuencias, para detectar el ADNh. El cebador 1870 mostrado como SEQ ID Nº 18 en la lista de secuencias se preparó para detectar el ADN contaminante del plásmido (Fig. 16). Las eficacias de amplificación con las dos combinaciones de cebadores 1871/20261 o 1871/1870 se comprobaron examinando las menores concentraciones del ADN del plásmido que puede detectarse mediante PCR. Como resultado, los menores valores de concentraciones detectables fueron de aproximadamente 2,5 x 10^{-20} moles del ADN molde en las mezclas de reacción de 50 \mul, en ambos casos.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con volúmenes de reacción de 50 \mul, en los que se incluyeron 1/100 volúmenes de ADN digerido con PstI obtenido en el ejemplo 11-3, como ADN molde. Se realizaron 25 ciclos de las siguientes etapas: a 94ºC durante 1 min, a 55ºC durante 1 min y a 72ºC durante 1 min. Tras las reacciones, se analizaron 5 \mul de los productos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%, se tiñeron con bromuro de etidio y se detectaron mediante FMBIO-100 (Takara Shuzo). En ambos casos, los ADN recuperados de las células transformadas mediante pYES2-8-106 o pYES2-9-106 se amplificaron con la combinación de los cebadores 1871 y 20261. Sin embargo, no se amplificaron fragmentos con los cebadores 1871 y 1870. Estas últimas observaciones mostraron que los fragmentos amplificados detectados en las primeras no derivaban del ADN contaminante del plásmido, sino del ADNh sintetizado en las células de levadura.

Los ADNh pueden ser expresados por otros eucariotas identificadas a continuación.

A partir de estos resultados se demostró claramente que el ADNh puede ser sintetizado en células eucariotas como las levaduras. Adicionalmente, el hecho de que el transformante que contiene pYHS2-9-106 produjo ADNh, sugirió que el ADNh no sólo se sintetizaba mediante una síntesis de hebra conductora, sino también mediante una síntesis de hebra retrasada.

Como será apreciable para el experto en la materia, a la luz de las enseñanzas de la anterior descripción, son fácilmente posibles muchas modificaciones, alteraciones y/o sustituciones en la práctica de la invención sin desviarse del espíritu o ámbito de la misma. Todos los medios que sean sustancialmente equivalentes en términos de metodología y construcciones genéticas, que consigan los mismos objetivos para sobreproducir ADNh independientemente de la replicación del plásmido - u otro vehículo competente - pretenden estar dentro del espíritu y ámbito de la invención.

Ejemplo 12 Producción de ADNh independientemente de la Replicación del Plásmido 12-1 Construcción del plásmido pHS2870

La secuencia 106-NdeI, que consiste en las secuencias mostradas como SEQ ID Nº 6 y 7 en la lista de secuencias, se insertó en el sitio NdeI de pUC19. El plásmido resultante se denominó pUC106A. El plásmido pUC106Ad.P.O. se construyó mediante la deleción del fragmento PvuII que contenía la región del promotor-operador lac de pUC106A. A continuación, el fragmento RNA1870 se preparó mediante PCR con el cebador RNAIIA mostrado como SEQ ID Nº 19 en la lista de secuencias, el cebador 1870 mostrado como SEQ ID Nº 20 en la lista de secuencias, y pUC106Ad.P.O. como molde. El cebador RNAII hibrida en el extremo 5' de la región RNAII del cebador de replicación, y el cebador 1870 hibrida con el extremo 3' de la secuencia 106-NdeI. Dado que cada cebador tiene un sitio XbaI en el extremo 5', el fragmento RNA1870 resultante tiene sitios XbaI en ambos extremos. A continuación, el fragmento RNA1870 se digirió con XbaI y se insertó en el sitio XbaI bajo la región del promotor-operador lac de pSTV28 (Takara Shuzo Co., Ltd. Otsu, Siga, 520-521, Japón). El plásmido resultante se denominó pSH2870. La Figura 17 muestra un protocolo para la construcción del pHS2870.

La Figura 18 muestra el pHS2870 resultante. Como se muestra en la Figura 18 en el plásmido pSH2870, la secuencia del cebador de ARN está situada bajo el control del promotor lac, y la secuencia repetida invertida está situada bajo p15A-Ori, que es un origen de replicación del propio plásmido.

12-2 Determinación de la cantidad e ADNh a partir de células portadoras de pHS2870

La E. coli JM109 se transformó mediante pHS2870, y el transformante se denominó JM109/pHS2870. Este transformante se cultivó en caldo L que contenía 100 \mug/ml de cloranfenicol, un recipiente con IPTG 2 mM y otro sin IPTG. El ADN se preparó mediante el método SDS-alcalino a partir de cada cultivo, y se trató con RNasaA. Estas muestras de ADN se aplicaron sobre el gel de electroforesis de poliacrilamida al 8%, y el gel se tiñó con bromuro de etidio. Como resultado, se determinó que el rendimiento de ADNh a partir de las células que se cultivaron con IPTG era 100 veces superior al de las células cultivadas sin IPTG.

Se determinó que los ADNh tenían un bucle de aproximadamente 4 bases, un saliente de 15-18 bases y un tallo de aproximadamente 440 bases.

Según se describió anteriormente, la síntesis del ADNh se controlaba independientemente de la replicación del plásmido controlando la producción del cebador de ARN.

Cuando se usa un plásmido que usa primasa para la síntesis del cebador de ARN, se controla la expresión de la primasa, produciendo así el ADNh independientemente de la replicación del plásmido. Para una iniciación mediante primasas, se realiza una función similar mediante la proteína del gen 4 del fago T7, y las proteínas de los genes 41 y 61 del fago T4. Véase DNA Replication, Kronberg, citado en la presente memoria descriptiva, capítulo 11-10.

Ejemplo 13 Inhibición de la Expresión Génica mediante el ADNh Formador de Triple Hélice en E. coli 13-1 Construcción de pHS2870GT

El oligonucleótido duplicado descrito en el Ejemplo 12, que está compuesto por los oligonucleótidos mostrados como SEQ ID Nº 8 y 9 en la lista de secuencias, se insertó en el sitio HindIII de pHS2870 (Figura 19). La dirección del fragmento HindIII se confirmó mediante secuenciación del ADN, y un plásmido que produce la secuencia GT37 que contiene el ADNh se denominó pHS2860GT (Figura 19).

13-2 Inducción de la expresión del ADNh mediante IPTG (Isopropiltio-\beta-D-galactósido)

Se transformó E. coli JM109 bien con pHS2870 o bien con pHS2870GT, y se incubó en 2 ml de caldo L (que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol) a 37ºC hasta el día siguiente. Este cultivo se diluyó 10^{2} veces con caldo L (que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol), y se añadió IPTG (concentración final 1 mM) cuando la OD_{600} del cultivo alcanzó \sim0,7, y después se incubó otras 2 h a 37ºC. El ADNh se aisló a partir del cultivo mediante el método SDS-alcalino y se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (Fig. 20). La expresión del ADNh (\sim480 pb: pHS2870, \sim500 pb: pHS2970GT) inducida por IPTG fue aproximadamente 20 veces mayor que sin IPTG.

Se determinó que los ADNh tenían un bucle de 53 bases, un tallo de aproximadamente 440 y un saliente de 15-18 bases.

13-3 Producción de E. coli MC4100\lambdapFTR1F

La E. coli MC4100\lambdapF13, que es \lambdapF13, [véase Gene, 57, págs. 89-99 (1987)]. La \lambdapF13, que es MC4100 lisogénica, se transformó con pMSTR37 (ATCC nº 35695). La \lambdapF13 está disponible en el Institute for Virus Research Kyoto University, Sakyo-ku, Kyoto 606, Japón. Mediante recombinación in vivo se aisló la \lambdapFTR1, que tiene una secuencia objetivo para ADNh formador de triple hélice en la región del promotor del gen de la \beta-galactosidasa. La MC4100\lambdapFTR1F' se produjo mediante lisogenización de MC4100 con \lambdapFTR1, seguida de la introducción del plásmido F' mediante conjugación con E. coli Nova Blue (Novegen) (Fig.21).

13-4 Detección del nivel de expresión de la \beta-galactosidasa mediante pulso y caza e inmunoprecipitación

La E. coli MC4100\lambdapFTR1F' se transformó bien con pHS2870 o bien con pHS2870GT y se incubó en 2 ml de caldo L (que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol y 15 \mug/ml de tetraciclina) a 37ºC hasta el día siguiente. Estos cultivos se diluyeron 50 veces con medio M9 modificado (1 x sales M9, glicerol al 0,2%, MgSO_{4} 1 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, tiamina-HCl al 0,001%, 40 \mug/ml de arginina, 5 \mug/ml de aminoácidos comunes [excepto metionina y cisteína]) y se incubó a 37ºC. Se añadió IPTG (concentración final 1 mM) cuando la OD_{600} del cultivo alcanzó \sim0,2, y la incubación se continuó durante otras 3 h a 37ºC. 0,5 ml de cada cultivo se marcaron con 407 kBq de ^{35}S-Met, Cys (43,5 TBq/mmol, Express [^{35}S] Protein Labeling Mix, NEN) durante 30 segundos a 37ºC, y la reacción se paró mediante la adición de 0,5 ml de TCA al 20%. El precipitado recuperado mediante centrifugación se lavó con 0,5 ml de acetona, y después se disolvió en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, SDS al 1%, EDTA 2 mM. Se midió la radioactividad de la proteína marcada mediante contaje en líquido de centelleo, y 1 x 10^{5} cpm de cada muestra se incubó con 1 \mul de anticuerpo anti-\beta-galactosidasa (COSMO BIO, AB-986) en 0,5 ml de TBS-Triton X-100 al 0,1% a 4ºC hasta el día siguiente. Para recuperar el complejo antígeno-anticuerpo se añadieron 20 \mul de IgG Sorb (The Enzyme Center, IGSL 10) a la mezcla de reacción y se incubó durante 1 h a 4ºC con agitación vigorosa. El precipitado final se recuperó mediante centrifugación y se lavó tres veces con TBS-Triton X-100al 0,1%, y después una vez con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. El precipitado final se resuspendió en 20 \mul de gel SDS-tampón de carga y se calentó durante 1 min a 95ºC. Las muestras inmunoprecipitadas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, y se analizaron mediante BIO IMAGE ANALYZER BAS2000 (FUGI PHOTO FILM) (Fig. 22). La intensidad de la señal de la banda de la \beta-galactosidasa en MC4100\lambdapFTR1F' tratada con IPTG y transformada con pHS2870GT fue aproximadamente un 50% más débil que la transformada con pHS2870.

Descripción detallada de varias realizaciones de la invención

Los inventores han realizado el descubrimiento fundamental de que parte del genoma se duplica directamente a partir del genoma. El mecanismo descubierto no requiere ni un ARN intermedio ni transcriptasa inversa (TI), ya que es bien conocido. Véase Weiner y col., Ann. Rev. Biochem., 55, 631 (1986); Komberg, en DNA Replication (W. H. Freeman and Company, San Francisco, CA, 1980), págs. 101-166. Se han descubierto nuevas y útiles estructuras de ADN denominadas en horquilla (ADNh).

A modo de introducción, la invención proporciona numerosas realizaciones. Una realización es un método (o procedimiento) para sintetizar una nueva y útil molécula (o estructura) de ADNmc. Otra realización es un sistema in vivo e in vitro para sintetizar dicha molécula que incluye un fragmento de ADN que contiene un sitio cebador adecuado, una repetición invertida (RI) y otros componentes necesarios para sintetizar los ADNh.

Un sistema para sintetizar in vivo dichas moléculas usa un vehículo de autorreplicación competente y otros componentes del sistema. Otro aspecto de esta realización es el vehículo de autorreplicación, que contiene una repetición invertida, un ADN que sirve de molde para la replicación de una primera hebra del ADNh, un sitio cebador adecuado para que comience la síntesis de ADN, a parir del molde, en la orientación opuesta y cuando se necesite, la segunda hebra del ADN parental y otros componentes adicionalmente descritos.

Otra realización de la invención son las nuevas moléculas de ADNmc-h.

La invención proporciona un método para sintetizar una nueva molécula de ADN monocatenario (ADNmc). La molécula comprende una estructura en horquilla (ADNh) cuyo tallo está constituido por ADN duplicado de bases complementarias apareadas dentro del ADNmc, cuyo tallo forma, en un extremo, los 5' y 3' terminales de la molécula de ADNmc, y en el otro extremo, un bucle monocatenario de ADN unido a los extremos opuestos del ADN duplicado. El método se lleva a cabo en un sistema que contiene los componentes convencionales para la síntesis de ADN, y los siguientes componentes:

\newpage

(a)

un ADN molde que contiene un sitio cebador adecuado y una repetición invertida (RI) secuencia abajo de dicho sitio cebador,

(b)

un cebador para el molde que permita el comienzo de la polimerización del ADN, y

(c)

una ADN polimerasa para replicar el ADNh a partir del molde.

El método comprende las etapas de:

(1)

cebar el molde de ADN para permitir el comienzo de la polimerización del ADN,

(2)

sintetizar el ADNmc a partir del cebador usando una de las dos hebras del ADN como molde, formando así otra hebra, y continuar la síntesis del ADN de la hebra hacia la secuencia RI, y permitir el cese de la síntesis dentro de la secuencia RI,

(3)

permitir que las bases complementarias de la secuencia RI de la hebra recién sintetizada se apareen, formando, en un extremo, un bucle de una región no duplicada y una región duplicada, funcionando la región duplicada como sitio cebador, para continuar la síntesis de ADN,

(4)

reanudar la síntesis de ADN usando como molde la hebra recién sintetizada y/o la otra hebra del ADN,

(5)

formar el ADNh, y

(6)

separar y aislar el ADNh.

El método se lleva a cabo en un sistema que contiene todos los componentes convencionales necesarios para la síntesis de ADN. Estos componentes pueden estar presentes intrínsecamente, como cuando el método se lleva a cabo in vivo; normalmente, serán introducidos en el sistema cuando el método se lleva a cabo in vitro.

El método demanda la presencia de un ADN que tenga un sitio cebador adecuado, y una repetición invertida secuencia abajo del sitio cebador. El ADN sirve de molde para dirigir la replicación del ADN. El cebador puede ser cualquier oligonucleótido (ya sea natural o producido sintéticamente) que sea capaz de actuar para iniciar la síntesis de un primer producto de extensión que es complementario de una hebra de ácido nucleico. El método de iniciación del ADN es por supuesto bien conocido. Véase Watson, Molecular Biology of the Gene, 3ª Ed., W. A. Benjamin, Inc.; DNA Synthesis: Present and Future, Molineux and Kohiyama, Eds., (1977) parte V, "G4 and ST-1 Synthesis in vitro", de Wickner; parte VII, "DNA Synthesis in Permeable Cell Systems from Saccharomyces cerevisiae", de Oertel y Goulian. Diferentes polimerasas pueden contribuir a la síntesis de la segunda hebra, al contrario que las que contribuyen a la síntesis de la primera hebra. El cebador puede ser un cebador de ADN o de ARN. La síntesis es inducida en presencia de nucleótidos y un agente de polimerización, tal como la ADN polimerasa, a una temperatura y pH adecuados.

El método de la invención usa una agente de polimerización tal como una enzima, que cataliza la síntesis de la hebra a lo largo del molde. Algunas enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejmplo, cualquier ADN polimerasa, como la ADN polimerasa I ó III de E. coli, un fragmento Klenow de la ADN polimersa I de E. coli, la ADN polimerasa T4, la ADN polimerasa T7, una transcriptasa inversa (TI), polimerasas víricas, incluyendo enzimas termoestables. Es adecuada cualquier polimerasa que reconozca su sitio de iniciación para la replicación del ADN. Generalmente, cuando el proceso se lleva a cabo in vivo, estarán presentes estos elementos genéticos; si no, o si se realiza in vitro, serán añadidos al sistema.

Cualquier polimerasa que reconozca el sitio de iniciación puede causar o contribuir a la polimerización. Aunque los inventores no desean comprometerse con una teoría en particular en este momento, no debe excluirse que la polimerasa que contribuye a la síntesis de la primera hebra de ADN también contribuya a sintetizar la otra hebra o segunda de ADN. El método proporciona así la continuación de la síntesis de la segunda hebra hasta que esta termina en el 3' terminal más allá del 5' terminal de la primera hebra formada. Así, se forma el tallo duplicado del ADNh.

La información sobre las ADN polimerasas está disponible. Por ejemplo, véase Kromberg, en DNA Replication (W. H. Freeman and Company, San Francisco, CA, 1980), págs. 101-168, el capítulo 4, DNA Polymerase I of E. coli, el capítulo 5, Other Procaryotic Polymerases, el capítulo 6, Eucaryotic DNA Polimerases y el capítulo 7.

Pueden considerarse otras polimerasas, tales como aquellas que son útiles en la síntesis de la segunda hebra en el ADNc.

En un ejemplo específico descrito anteriormente, se postula que las polimerasas son dos: ADN polimerasa III y polimerasa I.

Cuando se desea replicar una secuencia de ácido nucleico deseada u objetivo que sea capaz de codificar una proteína, por ejemplo, un gen como parte de los ADNh sintetizados, la secuencia se posicionará secuencia arriba de la RI. Por ejemplo, cuando la replicación tiene lugar en un vehículo de replicación como un vector, por ejemplo, pUCK106, que tiene un origen de replicación (OR), la secuencia de ácido nucleico objetivo se posicionará entre la RI y el OR.

El método de la invención usa un fragmento de ADN bicatenario que tiene, según se ha descrito, un sitio cebador y también una repetición invertida (RI), es decir, dos copias de una secuencia idéntica presentes en la orientación inversa. La RI puede estar presente como una secuencia o "palíndromo".

Como se describirá a continuación, se preferirán ciertas enzimas frente a otras, tales como TI, cuando se desea favorecer la introducción aleatoria de mutaciones puntuales en una secuencia de ácido nucleico.

La síntesis de la primera hebra se produce de forma continua a lo largo del molde de ADNbc a través de la RI, dando como resultado la replicación del genoma completo del plásmido. A una cierta frecuencia, la síntesis de la hebra de ADN cesa dentro de la RI, formando una corta región de secuencia que es complementaria de sí misma, forma un bucle y en la secuencia RI hibrida consigo misma. Esta región bicaternaria dentro de la hebra recién sintetizada es reconocida como el sitio cebador para la segunda u otra hebra de ADN. La síntesis de la segunda hebra comienza usando como molde la primera hebra formada y/o la otra hebra parental del ADN. Así, se cree que se produce una alternancia de moldes.

Según se sintetiza la segunda hebra mediante la incorporación de nucleótidos por parte de la polimerasa, se forma el tallo con bases complementarias apareadas, dando como resultado su estructura duplicada con complementariedad interna.

La síntesis de la segunda hebra se produce hasta sobrepasar el primer nucleótido de la primera hebra sintetizada a través del cebador de ARN de esta primera hebra, que eventualmente se degrada, proporcionando así un saliente 3'. En un ejemplo específico, se cree que la síntesis de ADN termina en el sitio Hter mediante un mecanismo similar, según se describe en Dasgupta y col., Cell, 51, 1113 (1987).

Mediante las manipulaciones adecuadas, la longitud del extremo 3' saliente puede controlarse, por ejemplo, prolongarse, desplazando el sitio Hter secuencia abajo a partir del sitio cebador.

Además, en lugar de un tallo con un extremo 3' saliente, se considera admisible bloquear la síntesis de la segunda hebra antes del final de la primera hebra, colocando un sitio de terminación adecuado, por ejemplo, Hter secuencia arriba del sitio cebador. Así, se contempla que cualquiera de las hebras puede ser más larga, en una longitud predeterminada, con respecto a la otra.

Al cesar la síntesis de la segunda hebra, el molde y el ADNh formado se separan.

El método de la invención puede repetirse cíclicamente tan a menudo como se desee. Si alguno de los componentes llegara a agotarse, se repone según vaya siendo necesario.

Cuando el método se lleva a cabo in vivo, se prevé un vehículo de replicación competente adecuado que lleve el fragmento molde de ADN necesario, con un sitio cebador y una RI secuencia abajo del sitio cebador. El fragmento de ADN portador de la RI se insertará normalmente en un sitio de restricción único en una secuencia de policonexión. Se ha usado un plásmido en el que el policonector tiene una RI (y sitios de restricción simétricos). Cuando no está presente intrínsecamente, el fragmento de ADN estará provisto de un cebador de la secuencia de ADN; la polimerasa puede ser o no autóctona del vehículo. El vehículo contendrá todos los demás elementos necesarios para la replicación y formación de los ADNh.

A partir de lo anterior se comprenderá que cualquier vector de autorreplicación que contenga un fragmento de ADN para servir como molde, una secuencia RI y los elementos necesarios para cebar y continuar la replicación de la hebra que formará el ADNh, es adecuado para sintetizar los ADNh.

Otra realización importante de la invención proporciona los nuevos ADNmc-h. Estas estructuras ya han sido descritas anteriormente. A continuación se proporciona una descripción adicional.

La nueva estructura, que se ha denominado "en horquilla" o "ADNh" es monocatenaria. En la Fig. 5E (a partir de pUCK106) y en la Fig. 7 (a partir de pUC7) se muestra un ejemplo de un ADNh.

Los ADNh típicos contienen un tallo duplicado bicatenario de bases complementarias apareadas, y un bucle de una monohebra de nucleótidos que conecta las dos hebras del tallo. La monocatenareidad del bucle es otra característica interesante de los ADNh de la invención. Los ADNh pueden incluir un bucle de una secuencia muy corta de nucleótidos u otras considerablemente más largas. Los ADNh pueden contener una secuencia nucleotídica con la longitud suficiente como para formar el bucle, y los pares de bases formando una doble hebra corta duplicada. El tamaño mínimo debería permitir los suficientes pares de bases como para proporcionar un sitio cebador para el comienzo de la síntesis de la segunda hebra. El tamaño mínimo del bucle puede estar limitado por las hebras, basándose en que podrían evitar su apareamiento para formar una estructura estable. El tamaño máximo está influido por el uso pretendido de los ADNh. El bucle ilustrado en la Fig. 5b está constituido por cuatro bases; pueden concebirse bucles de 10, 20 o más bases. La monocatenareidad del bucle de los ADNh es una característica que puede ser bastante útil en las utilidades propuestas para los ADNh.

Otra interesante estructura más contemplada para los ADNh son los ADNh dobles. En esta estructura, los extremos libres de las hebras simples de los dos ADNh están ligados. Se espera que la estructura sea extremadamente estable. Cuando se exponen a condiciones que normalmente desnaturalizarían los ADN, estos ADNbc parecen "retroceder" a su estructura original. La unión de las hebras puede llevarse a cabo mediante procedimientos convencionales, con ADN y/o ARN ligasas. Tales estructuras también pueden portar genes seleccionados que codifiquen proteínas, y proporcionar así nuevas e interesantes posibilidades prácticas.

Se cree que la estabilidad, una importante propiedad de los ADNh, tiende a aumentar con tallos duplicados más largos; así, tales estructuras se favorecen cuando tiene que enfatizarse esta propiedad. Debería advertirse que todos los ADNh producidos a partir de un solo vehículo de replicación no son necesariamente idénticos en tamaño. En el ejemplo anterior, en el ADNh a partir de pUCK106, el extremo 5' de la primera hebra parece ser heterogéneo, partiendo algunas hebras de la posición + 1 (que corresponde al origen de replicación ColE1) (véase Tomizawa y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 74, 1865 (1977)), mientras que otras hebras parten de - 1, + 2 y + 3. Así, los ADN pueden considerarse como una familia de ADNh análogos.

Debería advertirse que la presencia de uno o más mal emparejamientos en el fragmento de ADN más allá de las RI no afectan negativamente a la síntesis ni a la estructura de los ADNh. Esto se ilustra mediante el mal apareamiento T por G, en este caso 25 nucleótidos lejos del centro del palíndromo (véase la Fig. 2). Este mal apareamiento fue reparado en la síntesis del ADNh.

En la presente memoria descriptiva se proponen síntesis de diversas utilidades para los ADNh de la invención, que se benefician del saliente del ADNmc de un extremo del tallo sobre el otro. Se apreciará por tanto que es una característica importante de las nuevas estructuras de la invención.

La síntesis de los ADNh en el plásmido del ejemplo es una descripción de un mejor modo de la invención. Sin embargo, cualquier vector que contenga la RI y otros componentes descritos en la presente memoria descriptiva es adecuado para sintetizar los ADNh.

La RI es una estructura que aparece con frecuencia en procariotas y en eucariotas. Cualquiera de dichas RI puede usarse en la invención. Las secuencias RI también pueden preparase sintéticamente. Un ejemplo es la RI sintetizada y mostrada en la Fig. 2.

Se han obtenido secuencias RI o secuencias palindrómicas a partir de E. coli (Gilson y col., Nucl. Acids Res., 18, 3941 (1990)); Gilson y col., Nucl. Acids Res., 19, 1375 (1991) informaron sobre secuencias palidrómicas a partir de E. coli y Salmonella enteritica (una unidad de secuencia palindrómica de 40 nucleótidos de largo). Chalker y col., Gene, 71, (1): 201-5 (1988) informa sobre la propagación de un palíndromo de 571 pb en E. coli; Lewis y col., J. Mol. Biol. (Inglaterra), 215, (1): 73-84 (1990), informan sobre repeticiones invertidas en Bacillus subtilis (una repetición de 26 pares de bases), y Saurin, Comput. Appl. Biosci., 3, (2): 121-7 (1987) discute el uso de un nuevo programa informático para buscar sistemáticamente estructuras palindrómicas repetitivas en E. coli. Las siguientes patentes de EE.UU. describen secuencias palindrómicas: 4.975.376; 4.863.858; 4.840.901; 4.746.609; 4.719.179; 4.693.980 y 4.693.979.

Los ADNh pueden construirse de forma que tengan bucles y tallos de tamaños variables, con colas (o salientes en el extremo 3' ó 5') que cumplan mejor con el propósito pretendido para los ADNh. El tallo puede construirse para que sea de 100, preferiblemente al menos 300 hasta más de 5.000, preferiblemente hasta aproximadamente 4.000 bases de largo. El saliente de un terminal sobre el otro puede variar en unos pocos nucleótidos, por ejemplo, 15-18, 15 a 30 o más largo, de hasta aproximadamente 50 a 100 bases o más. Dado que el saliente monocatenario puede contener un fragmento de ADN antigen, es generalmente conveniente que la cola saliente del terminal 3' ó 5' sea dimensionado razonablemente en relación con el tamaño del fragmento de ADN antigen, de forma que pueda funcionar opcionalmente como un antisentido o para formar una triple hélice. Debería tenerse en cuenta una consideración similar a la hora de dimensionar el bucle del ADNh. Pueden considerarse los bucles cuyo tamaño varía entre 4 y 80. Debido a consideraciones prácticas y a otras consideraciones, parece que son satisfactorios los bucles de 40 hasta aproximadamente 60.

Se ha definido que los palíndromos incluyen secuencias repetidas invertidas, en las que prácticamente las mismas secuencias (no necesariamente las mismas) avanzan en dirección opuesta. Aunque algunas son cortas (3-10 bases en una dirección), otras son mucho más largas, comprendiendo cientos de pares de bases. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3ª Ed., págs. 224-225.

La RI en el fragmento de ADN puede variar considerablemente en tamaño. Sin intención de limitar, pueden considerarse los ADNh con repeticiones invertidas de 10 a 30 o nucleótidos más largos. Se ha informado de que las repeticiones invertidas contienen más de 300 pb. Current Protocols, sección 1.4.10.

Los ADNh pueden ser los productos de síntesis de la expresión de hospedadores procariotas o eucariotas (por ejemplo, células de bacterias, de levaduras y de mamíferos).

Los ejemplos de vectores adecuados, tales como un plásmido y una célula hospedadora transformada por este, son bien conocidos para el experto en la materia. Entre los hospedadores adecuados para plásmidos portadores de los componentes necesarios hay procariotas y eucariotas. Los procariotas incluyen microorganismos tales como los del género Escherichia, en particular E. coli; del género Bacillus, en particular B. subtilis. Los eucariotas incluyen organismos tales como levaduras, animales y plantas, y también incluyen microorganismos tales como células de animales y de plantas.

Los plásmidos capaces de transformar E. coli incluyen, por ejemplo, los plásmidos del tipo pUC y ColE1. Véase la patente de EE.UU. nº 4.910.141. los plásmidos capaces de transformar E. coli incluyen, por ejemplo, los plásmidos del tipo ColE1 en general. Otros plásmidos adecuados para transformar E. coli incluyen: pSC101, pSF2124, pMB8, pMB9, pACYC184, pACYC177, pCKI, R6K, pBR312, pBR313, pML2, pML21, ColE1AP, RSF1010, pVH51 y pVH153.

Los plásmidos capaces de transformar B. subtilis incluyen: pC194, pC221, pC223, pUB112, pT127, pE194, pUB110, pSA0501, pSA2100, pTP4, pTP5 y sus derivados. Los plásmidos capaces de transformar tanto B. subtilis como E. coli se describen en J. Bacteriol., 145, 422-428 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 75, 1433-1436 (1978) y Principles of Gene Manipulation, 2ª Ed., Carr. Y col., Eds., University of Ca. Press., Berkeley, 1981, pág. 48.

Son de especial interés, para llevar a cabo la síntesis de los ADNh en eucariotas, los plásmidos capaces de transformar S, cerevisiae: pMP78, YEp13, pBTI1, pLC544, YEp2, YRp17, pRB8 (Ylp30), pBTI7, pBTI9, pBTI10, pAC1, pSLe1, pJDB219, Pdb248 e YRp7. También deben considerarse Yip5, pUC-URA3, pUC-LEU2 y pUC-HIS3. Véanse las páginas 285 y 373-378 de Methods in Enzimology, vol. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", editado por Guthrie and Fink (1991), Academic Press, Inc.. Otros vectores de levaduras se describen en las páginas 100-104 de Experimental Manipulation of Gene Expresión, editado por Massayori Inouye, Academic Press, Inc. (1983).

Además, son de particular interés los vectores lanzadera que pueden usarse para transformar E. coli, así como levaduras como S. cerevisiae. Tales vectores incluyen los siguientes: pKB42 y pYC1. En la sección "Cosmid Vectors for Low and Higher Eucaryiotes" de A Practical Guide to Molecular Cloning, 2ª edición, de Bernard Perbal (1988), Wiley and Sons, se enumeran otros ejemplos. Otros vectores adecuados se describen en el vol. 2, secciones 13.4.1, 13.4.2 (1989), Current Protocols. Otros vehículos adecuados incluyen vectores multicopias tan populares como YEp24 (Botstein y col., Gene, 8, 17 (1979)) y pJDB207 (Beggs, Genetic Engineering (Ed. Williamson), vol. 2, pág. 175, Academic Press, (1982)). Otros que pueden elegirse incluyen plásmidos de las clases YEp, tales como YEp51, YEp52 y pYES2.

Algunos ejemplos de vectores eucariotas disponibles comercialmente para llevar a cabo la presente invención son pSVL y pKSV-10 en, por ejemplo, células COS, CHO y HeLa. En A Practical Guide to Molecular Cloning se enumeran otros ejemplos.

Estos vehículos genéticos replicables contienen los elementos genéticos adecuados para la replicación del vehículo, incluyendo su origen de replicación, promotores, etc., de forma que tras la inserción de la repetición invertida y de los otros elementos descritos en la presente memoria descriptiva, se expresarán los ADNh. Sin embargo, en la mejora de la invención descrita en la presente memoria descriptiva, a saber, la sobreexpresión de los ADNh, es preferible que la síntesis y la producción de los ADNh sea controlada independientemente de la replicación del vehículo, por ejemplo, un vector a partir de un promotor inducible independientemente y elementos genéticos diferentes a éstos o sensibles a u operativos con elementos diferentes a los que gobiernan la replicación del vehículo.

El cultivo y la fermentación de los hospedadores transformados se lleva a cabo mediante métodos estándar y convencionales conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, vol. 185, Gene Expression Technology (editor: Goeddel), 1990 (en particular, Growth of Cell Lines); para levaduras, véase Methods in Enzymology, vol. 194, Guide to Yeasts Genetics & Molecular Biology; las condiciones de crecimiento de E. coli se describen en Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, en las páginas 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4 y 1.3.1, y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, en la página 1.21; y la purificación de ADN de plásmido se describe en la página 1.23; las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de células de mamíferos se describen en Current Protocols, vols. 1 y 2, en las páginas 9.0.4-9.0.6, 9.1.1, 9.1.3, 9.2.5, 9.4.3, 11.5.2, 11.6.2 y 11.7.3.

En resumen, cuando en un vehículo de replicación están presentes los componentes necesarios para iniciar la síntesis de la primera hebra simple, a saber, un fragmento de ADN molde con un sitio de iniciación y una RI (y la(s) polimerasa(s)), se espera que se forme un ADNh.

Cuando la síntesis de los ADNh de la invención se realiza in vitro, esta síntesis se realizará en un medio que incluya los componentes convencionales para la síntesis de hebras de nucleótidos usando el fragmento de ADN como molde. Generalmente, la síntesis tendrá lugar en una disolución acuosa tamponada, preferiblemente a un pH de 7-9. Preferiblemente, con un exceso molar de oligonucleótidos con respecto a la hebra molde de ADN. Los desoxirribonucleósidos trifosfato, dATP, DCTP, dGTP y TTP, también son un componente de la mezcla de síntesis. Se realiza un calentamiento y después un enfriamiento de la disolución. Entonces se añade la polimerasa, y la síntesis comienza. Estos componentes se denominan "componentes convencionales" para el propósito de la invención descrita en la presente memoria descriptiva.

La síntesis de oligonucleótidos puede llevarse a cabo mediante diversos métodos, incluyendo los descritos en la patente de EE.UU. nº 4.415.734, y en Matteuci y col., J. Am. Chem. Soc., 103, (11): 3185-3191 (1981), Adams y col., J. Am.Chem. Soc., 105, (3): 661-663 (1983), y Bemcage y col., Tetrahedron Letters, 22, (20): 1859-1867 (1981).

Los métodos de la presente invención hacen uso de técnicas de ingeniería genética y de clonaje molecular. Las técnicas generales de ingeniería genética y clonaje molecular están incluidas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1990; A Practical Guide to Molecular Cloning, 2ª Ed., Bernard Perbal (1988); Methods in Enzymology, volumen 68, Recombinant DNA (editor: Wu), Academic Press, N.Y., 1979; Methods in Enzymology, volumen 185, Gene Expression Technology (editor: Goeddel), 1990; Current Protocols in Molecular Biology, vols. 1, 2 y 3.

Los ADNh de la invención tiene múltiples utilidades interesantes. El método de la invención puede usarse para proporcionar mutaciones aleatorias en un gen seleccionado. Tal sistema se ilustra en la Fig. 8, que muestra el gen de la \beta-galactosidasa en un vector transformado.

El método comprende la síntesis de un ADNh que contiene un gen de interés localizado en el tallo, el aislamiento del ADNh, el corte del gen a partir del ADNh, su clonaje en un vehículo de replicación adecuado y la expresión de la proteína codificada por el gen. Las proteínas pueden ensayarse para la actividad deseada. Mediante procedimientos estándar, las colonias pueden cribarse para identificar aquellas con genes mutados.

Un ejemplo de producción e identificación de mutaciones se realiza como sigue: en pUCK19 (véase el Ejemplo 1), que porta el gen lacZ, se liga un fragmento de ADN de 215 pb consistente en los ADN mostrados como SEQ ID Nº 1 y 2 en la lista de secuencias, respectivamente, que contiene la RI de 35 pb (descrita en el Ejemplo 1) entre el fragmento de ADN y el OR (según se muestra en el Ejemplo 1). El plásmido se transforma en E. coli CL83 competente, que se hace crecer en condiciones estándar. A continuación se aísla el gen lacZ y se inserta en pUCK19 (sin el fragmento que contiene la RI). El pUCK19 se digiere con KasI y EcoRI, y el gen lacZ aislado se transforma en E. coli CL83. La frecuencia de mutaciones se califica según el ensayo in vivo conocido usando \beta-gal, un sustrato incoloro, que es hidrolizado para dar un producto azul oscuro. Cuando las colonias son incoloras es indicativo de que no se ha producido \beta-galactosidasa.

Pueden usarse otros genes de la familia lac, por ejemplo, lacY o lacA, u otros genes adecuados, para este ensayo de cribado. El gen que codifica la proteína (o polipéptido) de interés también puede usarse para determinar la frecuencia de mutaciones y seleccionar el gen adecuado que codifique la proteína (o polipéptido) derivado.

Este procedimiento de cribado permite la selección de vectores competentes, distintos a las polimerasas, que más probablemente introducirán o aumentarán la tasa de mutaciones en el gen objetivo. Así, puede usarse un gen seleccionado, tal como el gen lacZ, como el gen de cribado. La transcriptasa inversa, de la que se sabe que tiene una fidelidad de replicación menor, parece ser una enzima de elección para el propósito de introducir mutaciones en un gen objetivo que codifica una proteína deseada.

La(s) proteína(s) objetivo deseada(s) se expresa(n) entonces mediante un hospedador competente transformado seleccionado portador del gen mutado y elegido por sus deseables propiedades biológicas.

Se cree que la frecuencia de mutaciones puede influirse mediante la selección de las enzimas adecuadas, de las que se sabe que tienen una menor fidelidad de replicación. Así, cuando se amplifican fragmentos de ADN o genes objetivo, el sistema depende del grado de fidelidad o infidelidad de replicación, es decir, la frecuencia de errores cometidos por las ADN polimerasas al replicar el fragmento de ADN o el gen insertado. Así, por cada error de replicación se introducen mutaciones aleatorias en los genes. Cuanto mayor sea el grado de infidelidad de la ADN polimerasa, mayor será el número de genes mutados, y viceversa.

En una realización de la invención ilustrada anteriormente, en la que se cree que eran activas la PolIII y la PolI, se espera que la primera tenga menos fidelidad, dado que se sabe que la PolI tiene una función de autocorrección. Así, la fidelidad de replicación del sistema puede ser regulada mediante la adecuada selección de las ADN polimerasas. Generalmente, se cree que las mutaciones aleatorias pueden ser introducidas con mayor probabilidad por la polimerasa que sintetiza la segunda hebra. Un candidato interesante sería la TI.

Los genes portadores de la(s) mutación(es) deseada(s) son útiles en el entrecruzamiento cromosómico. Mediante este método, puede hacerse que los genes de interés, o el ADNh portador del gen mutado de interés, se integren e intercambien información genética de una molécula similar a otra. El gen mutado localiza dentro del genoma una secuencia que es similar a la secuencia del vector, y el gen homólogo es replicado por el gen mutado.

De esta forma pueden producirse nuevas cepas de microorganismos (u hospedadores) que contengan el gen mutado y que expresarán una proteína deseada. El ADNh portador del gen mutado puede ser producido in vitro o in vivo.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento rápido para la amplificación enzimática in vitro de un segmento específico de ADN. El método estándar de PCR requiere un segmento de ADN bicatenario a amplificar, y siempre dos cebadores oligonucleótidos monocatenarios flanqueando el segmento, una ADN polimerasa, los desoxirribonucleósidos trifosfato adecuados (dNTP), un tampón y sales. Véase Current Protocols, sección 15.

El ADNmc-h de la invención puede amplificarse con un único cebador. Esta característica simplifica considerablemente la amplificación, ayuda a superar el problema de que cada cebador encuentre su sitio de iniciación adecuado, hace el proceso más económico y ayuda a superar los problemas asociados con el método de PCR tradicional.

La amplificación del ADNh comprende la desnaturalización del ADNh para formar un ADN monocatenario (desde el extremo 3' al 5')l la reacción sigue la secuencia habitual: cebado a partir del extremo 3', reacción de la polimerasa, desnaturalización e hibridación. Se llevan a cabo 25 ciclos, lo que da lugar a una amplificación del ADNh de un millón de veces. El ADNh puede ser portador de un gen que codifique una proteína objetivo.

Un reciente informe de Science, 252, 1643-2650 (21 de junio de 1991), titulado "Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction", de Erlich y col., discute los problemas asociado con los cebadores y las mejoras que se están proponiendo para el método de PCR.

Como consecuencia, es de gran interés un método para la amplificación de las estructuras de ADNmc-h de la invención mediante un método que usa un cebador. El ADNh podría ser portador de un gen de interés, tal como un gen mutado con propiedades biológicas mejoradas.

La producción in vivo de los ADNh de la invención puede ser así manipulada para proporcionar una secuencia deseada. Los ADNh así producidos pueden usarse entonces como ADN antisentido.

Una utilidad fascinante que se está considerando es el papel que los ADNh de la invención pueden jugar en la formación de una triple hélice de ADN, o ADN triple, y las nuevas estructuras de ADNh triple resultantes. Un reciente informe de Science, 252, 1374-1375 (27 de junio de 1991), "Triples DNA Finally Comes of Age", destaca la oportunidad de la presente invención. El ADN triple puede formarse mediante la unión de una tercera hebra en sitios específicos reconocidos del ADN cromosómico. Se discute sobre hebras sintéticas cuyos tamaños contengan preferiblemente las bases complementarias completas (tal como 11-15 y superiores). Los ADNh de la invención, con extremos 3' (o 5') largos (y el bucle de bases no duplicadas), parecerían ser excelentes candidatos. Se espera que el ADN triple resultante tenga una estabilidad y utilidad aumentadas. En el informe se proponen nuevas terapias basadas en la formación de la triple hélice, incluyendo el tratamiento del SIDA y la inhibición génica selectiva, y otros.

En una importante realización de la invención, los ADNh comprenden en su porción monocatenaria un antigen, que es una secuencia de ADN que regula la función génica, como un fragmento antisentido o una secuencia que forma una triple hélice.

El ADNh que contiene la secuencia de ADN reguladora o controladora de la función génica, como una secuencia antisentido y una secuencia con la capacidad de formar una triple hélice (denominada en lo sucesivo "antigen"), puede ser producido y usado in vivo como una molécula de ADN reguladora de la función génica mediante la presente invención.

La forma más efectiva de regular la expresión de un gen específico es actuar directamente sobre el gen.

La presente invención proporciona métodos para regular la expresión génica, por ejemplo, mediante la utilización de ARN antisentido, ADN antisentido o el ADN con la capacidad de formar una triple hélice. Como los ARN o ADN antisentido, hibridan con el ARNm objetivo porque son complementarios del gen objetivo, e inhiben la traducción de la proteína desde el ARNm mediante la formación de una doble hebra. Los ARN antisentido pueden producirse en una célula mediante un promotor, pero es difícil producir ADN antisentido in vivo debido a su ADN monocatenario. De forma que mediante la presente invención, se suministra un ADN sintético como ADN antisentido a la célula, para regular la expresión génica.

Como para el ADN con la formación de triple hélice, la presente invención proporciona un tercer ADN monocatenario que se une al ADN bicatenario que tiene una polipurina (G o A) en una hebra, y una polipirimidina (C o T) en la otra hebra, mediante la actividad de apareamiento de Hoogsteen. Este tercer ADN monocatenario tiene la capacidad de formar una triple hélice. Sus muchas aplicaciones son adecuadas no sólo para la regulación génica, sino también en el campo de la tecnología génica. Como los ADN antisentido, la producción in vivo de ADN monocatenario con capacidad para formar una triple hélice es muy difícil, y por tanto, mediante la presente invención, se suministra un ADN sintético a la célula, para regular la expresión génica. Mediante un sintetizador de ADN se proporciona la producción in vitro de un ADN antisentido o de un ADN con capacidad de formar una triple hélice. Sin embargo, no se conoce la producción artificial de ADN monocatenario in vivo salvo por ADNmc-c. Pero el ADNmc-c es un ADNc monocatenario transcrito a partir de ARNm mediante la transcriptasa inversa en una célula, y por tanto su aplicación práctica es muy difícil debido a su complejo proceso sintético. Por otro lado, el ADNh de la presente invención que contiene la secuencia para la regulación génica puede producirse in vivo sin un ARNm intermedio, y puede ser útil para la regulación génica.

Cuando hay una secuencia repetida invertida (secuencia RI), la primera hebra de ADN sintetizada híbrida con otro ADN molde en la secuencia RI, y entonces comienza la síntesis de la segunda hebra de ADN. La síntesis de ADN prosigue hasta el origen de replicación de la duplicación del ADN, y termina en el sitio de terminación de la transcripción. Finalmente, este ADN monocatenario se separa del molde original de ADN como ADNh. La región del bucle y el extremo 3' o el extremo 5' del ADNh forman una hebra simple. De forma que, mediante la presente invención, es posible insertar un ADN antisentido o un ADN con capacidad de formar una triple hélice en estas regiones monocatenarias. El ADNh con la secuancia de ADN antisentido hibrida con el ARN objetivo para inhibir la función génica, y adicionalmente, el ARN objetivo es cortado por la actividad H RNAsa celular. Como en la duplicación del gen también se produce ADNh con capacidad de formar una triple hélice, siempre es producido in vivo. Esto permite la regulación del ADN bicatenario objetivo. El método de la invención de insertar ADN antisentido o ADN con la capacidad de formar una triple hélice en el ADNh se describe en detalle a continuación.

Para insertar un ADN antigen en el ADNh, en la realización que usa un plásmido, la secuencia RI debería estar de camino en la dirección de la duplicación del plásmido, y la secuencia antigen debería ser clonada entre dos secuencias RI. Tras la transformación, la célula que contiene este plásmido produce ADNh antigen continuamente según se duplica el plásmido. El ADNh tiene una estructura saliente en el extremo 5' o en el extremo 3' porque en el proceso de la síntesis del ADNh, el sitio cebador del extremo 5' del ADNh es diferente al sitio terminal del extremo 3'. Por lo tanto, es posible insertar un antigen en estas regiones salientes del ADNh. Para producir el ADNh que contiene un antigen en el extremo 3' ó 5', la secuencia antigen debería ser clonada entre el sitio cebador y el sitio de terminación del ADNh a partir del plásmido con la secuencia RI. Y después de la transformación, se produce un ADN monocatenario con un antigen en el extremo 5' ó 3' del ADNh.

Originalmente, el ADNh fue descubierto en E. coli. El ADNh también puede ser expresado en levaduras. El ADNh de la presente invención también es útil para la producción de antigenes y la regulación génica en eucariotas, tales como los mamíferos.

Puede observarse que la presente invención proporciona una contribución significativa a las artes y las ciencias.

Según se ha descrito anteriormente, los ADNh son valiosas construcciones genéticas. Hay por tanto una importante necesidad de producir tales ADNh con rendimientos hasta ahora no conseguidos.

La presente invención proporciona un proceso y las construcciones genéticas mediante las cuales los ADNh son expresados con altos rendimientos. En el proceso de las realizaciones previamente descritas, los niveles de producción de ADNh venían dados y limitados por el nivel endógeno del cebador que iniciaba la replicación a partir del origen de replicación del vehículo de ADN recombinante. Según esta realización de la invención, se ha construido un sistema en el que, para un mejor resultado, la construcción del ADN recombinante comprende un grupo de elementos que operan independientemente de los elementos genéticos que controlan la replicación del vehículo. En este sistema - o grupo de elementos - el nivel celular de cebadores para la síntesis de los ADNh se ha aumentado considerablemente, iniciando por tanto la síntesis y la expresión de los valiosos ADNh con altos rendimientos.

Los ADNh pueden ser expresados en procariotas o en eucariotas. El método para expresar las células comprende el cultivo de un hospedador procariótico o eucariótico transformado con un vehículo de ADN recombinante autorreplicable capaz de dirigir la expresión del ADNh. El vehículo de ADN recombinante comprende los siguientes elementos unidos operativamente: una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, preferiblemente un promotor-operador fuerte que tras su introducción produce un cebador de ARN o una proteína, por ejemplo, una enzima como la primasa, que funciona iniciando la síntesis del ADNh utilizando los sustratos adecuados, y una ADN polimerasa endógena de la célula hospedadora. El vehículo comprende además una repetición invertida secuencia debajo de la secuencia de ADN que codifica el cebador de ARN o la primasa. Además, el vehículo de ADN recombinante comprende un origen de replicación que funciona en la replicación del propio vehículo de ADN, y un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen que confiere resistencia a un antibiótico.

En la realización preferible de la invención, la iniciación de la síntesis de ADNh no está acoplada a ni depende de la replicación del vehículo de ADN recombinante. Sin embargo, también se contempla que un vehículo de ADN recombinante pueda ser construido de forma que el cebador que inicia la síntesis del ADNh inicie también la replicación del plásmido.

Cuando se desea sobreexpresar los ADNh que incluyen en su porción monocatenaria un fragmento antigen, el vehículo replicable comprende el fragmento antigen bien entre las dos secuencias repetidas invertidas opuestas o bien entre el sitio cebador utilizado para iniciar la síntesis del ADNh y la repetición invertida. Los ADNh portadores del fragmento antigen se producen así con altos rendimientos.

Algunos promotores inducibles útiles para controlar la expresión del fragmento de ADN que codifica el cebador de ARN o la proteína primasa incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, el promotor lac, el promotor trp, o los promotores tac o TRC, los principales promotores del fago \lambda, por ejemplo, \lambdapl o \lambdapr, etc.; el promotor de la proteína de cubierta fd, el promotor de la e-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, el promotor de la fosfatasa ácida, los promotores de los factores de apareamiento de las levaduras, y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de los genes de células procariotas o eucariotas o sus virus. Cuando se desea expresar los ADNh en células de mamífero, es adicionalmente posible amplificar las unidades de expresión uniendo el gen al que codifica la deshidrofolato reductasa y aplicando una selección a esta células, lo que da como resultado una amplificación del gen deseado.

Los promotores útiles son inducibles mediante un agente de inducción adecuado. Por ejemplo, los promotores lac y tac son inducidos mediante IPTG; el ácido malidíxico se usa habitualmente para inducir la expresión de los promotores \lambdapl o \lambdapr. También se conocen otras combinaciones similares en la materia. Véase, por ejemplo, DNA Replication Komberg, citado a continuación. Current Protocols Molecular Biology, Ausubet y col., John Wiley & Sons, Inc. 1994 (Current Protocols).

Cuando se desea sobreexpresar los ADNh en células eucariotas tales como células de levaduras, según se ha mostrado anteriormente, o en células de mamíferos, se usará el esquema descrito anteriormente separando el sistema que replica las células de levadura del que sintetiza el ADNh, provocando así que los ADNh expresados a partir de las células de levadura se expresen en un nivel y tasa mayores, independientemente de la replicación de las células de levadura. Para una variedad de técnicas adecuadas y biología molecular de levaduras, véase Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Ed. Guthrie and Fink, Academic Press, Inc., Methods in Enzymology, volumen 194, 1991, y otras referencias citadas en la presente memoria descriptiva. Véase también Experimental Manipulation of Gene Expression, Ed. Masayori Inouye, Academic Press, 1983, en general y el capítulo 5, Vectors for High Level, Inducible Expression of Cloned Genes in Yeast.

Las Figuras 17 y 18 ilustran un protocolo para construir una construcción preferible de la invención. Como se muestra en la Figura 17, el sitio cebador que funciona para iniciar la síntesis de ADNh deriva de un origen de replicación de un plásmido, por ejemplo, pUC19, en la Figura 17. Sin embargo, en su forma final, este sitio cebador no funciona en la replicación del vehículo de ADN recombinante que codifica el ADNh, sino que el vehículo de ADN recombinante contiene su propio origen de replicación funcional.

Otros orígenes de replicación que también pueden usarse para dirigir la síntesis del ADNh incluyen, por ejemplo, pMB1, ColE1, pSC101, R6-5, mini F, R1, R100, R6K, Rts1, RK2, P1, ColEII, ColEIII, p15A, bacteriófago T4, bacteriófago T7, RSF1030, pBR y pUC.

Algunos de estos orígenes de replicación pueden requerir, como se sabe en la materia, proteínas para su actividad eficaz. Si el sitio cebador que inicia la síntesis deriva de un origen así, esta en el ámbito de la invención que el promotor inducible pueda inducir y dirigir la expresión de esa proteína en estas situaciones. Se contempla que el sitio cebador pueda derivar de otros orígenes de replicación, diferentes a los mostrados en la Figura 17. Por ejemplo, otros orígenes de replicación que pueden ser usados incluyen pMB1, ColE1, pSC101, R6-5, mini F, R1, R100, R6K, Rts1, RK2, P1, ColEII, ColEIII, p15A, RDF1030, bacteriófago T4, bacteriófago T7, pBR y pUC. Además, también está en el ámbito de la invención que el origen de replicación funcional que dirige la replicación del vehículo de ADN recombinante no esté limitado a p15A, según se muestra en la Figura 17, sino que puede incluir, por ejemplo, pMB1, ColE1, pSC101, R6-5, mini F, R1, R100, R6K, Rts1, RK2, P1, ColEII, ColEIII, bacteriófago T4, bacteriófago T7, p15A, RSF1030, pBR y pUC. Se conocen en la materia otros diversos orígenes de replicación. DNA Replication, Oxford University Press 1991; DNA Replication, Kromberg, W. H. Freeman and Company, 1980.

Existe un buen número de plásmidos de iniciación adecuados distintos a pUC106 que tienen orígenes de replicación adecuados, tales como pMB1, ColE1, mini F, R1, R100, R6K, Rts1, RK2, F, P1, bacteriófago T4, bacteriofase T4, ColEII, ColEIII y otros.

Los métodos para cultivar el hospedador transformado o transfectado con el vehículo de ADN recombinante son bien conocidos. Comprenden el cultivo del hospedador en unas condiciones adecuadas de crecimiento, y la obtención del ADNh deseado a partir del cultivo. Véase Current Protocols, citado en la presente memoria descriptiva.

Descripción detallada de una realización preferible

En relación con las Figuras 17 y 18 puede describirse fácilmente una realización preferible de la invención.

Como puede observarse a partir de la Figura 17, la construcción del vehículo de ADN recombinante pHS2870 comprende un origen de replicación funcional p15A, es decir, una región del plásmido que codifica los cebadores de iniciación RNAI, RNAII y la proteína ROP, que funcionan juntos en la replicación del plásmido. Como puede verse, la región Ori p15A se origina a partir de pSVT28.

Este conjunto de elementos es responsable de la replicación del propio plásmido, y no dirige la síntesis de los ADNh. Esta función la realiza un conjunto de elementos que dirige la síntesis de los ADNh independientemente de la replicación del plásmido. Este conjunto de elementos comprende un fuerte promotor-operador inducible que tras la inducción produce un cebador localizado secuencia arriba de la repetición invertida. Además, adyacente al promotor-operador, y secuencia abajo del mismo, el plásmido porta un fragmento de ADN que codifica un cebador de ARN, por ejemplo, RNAII o una proteína, por ejemplo, la primasa, según se discutió anteriormente, para comenzar la síntesis de los ADNh. Secuencia abajo de este fragmento de ADN se localiza una repetición invertida que, como se describió anteriormente, participa en la síntesis y forma parte del ADNh. Cuando se desea que el ADNh porte un antigen, ese antigen se coloca secuencia arriba de la repetición invertida y secuencia abajo del ADN que codifica el cebador, es decir, entre estos dos elementos o entre los dos segmentos opuestos de las repeticiones invertidas, por ejemplo, insertado en un sitio de restricción adecuado. La secuencia antigen, según se discutió anteriormente, es un fragmento que puede hibridar con un ARNm objetivo e inhibir la traducción del ARNm en proteína, o unirse a un ADNbc, formando así una triple hélice que inhibe la expresión del ADN objetivo.

Como puede apreciarse a partir de esta descripción, los elementos que operan en la síntesis de los ADNh pueden proceder de construcciones genéticas diferentes a las que controlan la replicación del plásmido, pero esto no tiene por qué ser necesariamente así.

Como se explica en la presente memoria descriptiva, se proporciona un esquema general para la construcción de un plásmido que sintetiza ADNh independientemente de la replicación del plásmido. De acuerdo con este esquema, en cualquier vehículo de replicación hay insertado un fragmento de ADN cualquiera que contiene una repetición invertida de la longitud deseada, que participará en las síntesis de los ADNh y constituirá el tallo de los ADNh. Es por tanto posible, según la invención, regular la replicación de los ADNh independientemente y en exceso de la síntesis del propio plásmido.

Es importante destacar que la invención no está limitada a las construcciones en particular ilustradas o a las construcciones a partir de las cuales se originan los elementos funcionales. Ni tampoco se limita la invención a ningún plásmido en particular. Se pueden elegir otros plásmidos o vehículos que aportarán los elementos genéticos necesarios para la construcción final.

Tampoco se limita la invención a los elementos genéticos ilustrados en particular. Siguiendo el concepto general de la invención, el experto en la materia construirá con facilidad los medios adecuados para implementar ese concepto de la invención.

Anteriormente se ha descrito un buen número de realizaciones de la invención. A partir de la descripción es apreciable que pueden utilizarse otras realizaciones que utilicen enseñanzas de su invención, que alcanzarán sustancialmente el mismo resultado de sobreexpresión de una molécula monocatenaria como el ADNh.

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Claims (24)

1. Una molécula de ADN recombinante autorreplicable para sobreexpresar un ADN en horquilla en un hospedador compatible que comprende los siguientes elementos:

-

un fuerte promotor-operador inducible,

-

una secuencia de ADN que codifica un cebador o una proteína localizada adyacentemente y secuencia abajo de dicho promotor/operador,

-

una repetición invertida, localizada secuencia abajo de dicha secuencia de ADN que codifica un cebador o una proteína, y

-

un origen de replicación,

en la que dicho promotor-operador, dicha secuencia de ADN que codifica un cebador o una proteína y dicha repetición invertida operan para replicar el ADN en horquilla independientemente de la replicación de la molécula de ADN, y en la que dicho origen de replicación dirige la replicación del plásmido independientemente de la síntesis del ADN en horquilla.

2. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que el cebador que se produce tras la inducción del promotor hibrida sólo con el origen de replicación codificado por el fragmento de ADN secuencia arriba de la repetición invertida.

3. La molécula de ADN de la reivindicación 2, en la que los elementos genéticos que provocan la replicación de la molécula de ADN se originan a partir de una molécula genética diferente a los elementos genéticos que provocan las síntesis del ADN en horquilla.

4. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica una proteína cebadora, codifica además un origen de replicación para dirigir la síntesis del ADN en horquilla.

5. La molécula de ADN de la reivindicación 4, en la que el cebador codificado por la secuencia de ADN es un cebador de ARN.

6. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la proteína codificada por la secuencia de ADN es la primasa.

7. La molécula de ADN de la reivindicación 4, en la que el cebador para el origen de replicación de los elementos de replicación para el ADN en horquilla es un cebador RNAII.

8. La molécula de ADN de la reivindicación 3, en la que el origen de replicación que dirige la replicación de la molécula deriva a partir de un plásmido distinto a los plásmidos del tipo pUC.

9. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que el vehículo es un plásmido.

10. La molécula de ADN de la reivindicación 9, en la que el plásmido es un plásmido de E. coli.

11. La molécula de ADN de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una secuencia antisentido de ADN foráneo localizada bien entre la secuencia de ADN que codifica el cebador o la proteína y la repetición invertida o bien en la repetición invertida entre las dos secuencias opuestas de la misma.

12. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que el ADN antisentido está localizado en la repetición invertida.

13. Un método para mejorar la expresión de un ADN en horquilla que comprende: el cultivo de un hospedador transformado con una molécula de ADN recombinante que provoca la expresión de un ADN en horquilla con altos rendimientos en el hospedador procariótico, independientemente de la replicación de la molécula de ADN, comprendiendo la molécula de ADN los siguientes elementos:

-

un fuerte promotor-operador inducible,

-

una secuencia de ADN que codifica un cebador o una proteína localizada adyacentemente y secuencia abajo de dicho promotor/operador de ADN,

-

una repetición invertida localizada secuencia abajo de dicho ADN que codifica un cebador o una proteína, y

-

un origen de replicación,

en la que dicho promotor-operador, dicha secuencia de ADN que codifica un cebador o una proteína y dicha repetición invertida operan para replicar el ADN en horquilla independientemente de la replicación de la molécula de ADN, y en la que dicho origen de replicación dirige la replicación del plásmido independientemente de la síntesis del ADN en horquilla.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el cebador que se produce tras la inducción del promotor hibrida únicamente con el origen de replicación codificado por el fragmento de ADN secuencia arriba de la repetición invertida.

15. El método de la reivindicación 13, en el que los elementos genéticos que provocan la replicación de la molécula de ADN se originan a partir de una molécula genética diferente a los elementos genéticos que provocan la síntesis del ADN en horquilla.

16. El método de la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de ADN que codifica una proteína cebadora, codifica además un origen de replicación para dirigir la síntesis del ADN en horquilla.

17. El método de la reivindicación 15, en el que el cebador codificado por la secuencia de ADN es un cebador de ARN.

18. El método de la reivindicación 13, en el que la proteína codificada por la secuencia de ADN es la primasa.

19. El método de la reivindicación 13, en el que el origen de replicación que dirige la replicación de la molécula deriva a partir de un plásmido distinto a los plásmidos del tipo pUC.

20. El método de la reivindicación 13, en el que el cebador es un cebador de RNAII.

21. El método de la reivindicación 15, en el que los elementos genéticos que operan para replicar la molécula de ADN funcionan independientemente de los elementos genéticos que funcionan para sintetizar el ADN en horquilla.

22. El método de la reivindicación 13, en el que la molécula de ADN comprende adicionalmente una secuencia antisentido de ADN foráneo localizada bien entre la secuencia de ADN que codifica el cebador o la proteína y la repetición invertida o bien en la repetición invertida entre las dos secuencias opuestas de la misma.

23. El método de la reivindicación 22, en el que el ADN antisentido está localizado en la repetición invertida.

24. Un hospedador procariota transformado con la molécula recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 8 y 9.