JP2000350581A - 遺伝子の機能の制御方法 - Google Patents

遺伝子の機能の制御方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 好適な遺伝子制御方法を提供する。 【解決手段】 ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内
のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成さ
れ、そして一方の端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の
末端を形成し他方の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の
両末端を結合するＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造
内に、遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有する新
規な安定した人工のｓｌＤＮＡを用いることを特徴とす
る遺伝子の機能の制御方法。但し前記ｓｌＤＮＡは特定
の系において特定の方法によって生成される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本出願は、オオシマ ( Ohshima )等によって１９９３年
３月１日に出願された「一本鎖ステム−ループＤＮＡの
合成方法、その生成物、ならびにその使用」という名称
の係属中の米国特許出願第０８／０２４６７６号の一部
継続出願であり、この米国特許出願第０８／０２４６７
６号はさらに、「一本鎖ステム−ループＤＮＡの合成方
法、その生成物、ならびにその使用」という名称の係属
中の米国特許出願第０７／７５３１１１号の一部継続出
願である。本明細書は、これらの２件の特許出願（親出
願）の双方の一言一句を、それらの各件が以下に全編に
わたって再度記載されているかのごとく、明確に包含す
るものである。
【０００２】発明の分野 本発明は組換え体ＤＮＡの分野に関する。さらに詳しく
は、本発明はステム−ループ配列（ｓｓ−ｓｌＤＮＡ）
を有する新規で有用な一重鎖ＤＮＡの合成方法に関す
る。本発明はインビトロ及びインビボ合成方法に関す
る。さらに本発明はこれらのｓｓ−ｓｌＤＮＡを製造す
る複製ビークル ( replicating vehicle )に関する。さ
らに、本発明はこれらの新規な構造物に関し、これらの
新規な構造物の使用を開示する。さらに、標的タンパク
質をコードする遺伝子を用いた、または用いないｓｓ−
ｓｌＤＮＡ増幅方法をも開示する。さらにはまたｓｓ−
ｓｌＤＮＡを用いた遺伝子制御方法を開示する。
【０００３】背 景 逆転写酵素によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転
写されるRNA 中間体を介して、ゲノムの一部の重複が生
ずることが判明している。この点については、ワイナー
（Weiner）等のアニュアル・レビュー・オブ・バイオケ
ミストリー (Ann. Rev. Biochem. )５５、６３１（１９
８６）を参照されたい。結果として遺伝情報が逆流する
ことは真核ゲノムの進化の多様化に重要な役割を果すと
考えられる。細菌由来の逆転写酵素が最近発見されたこ
とを考慮すると、同様な機構が原核生物におけるゲノム
進化の原因であるとみなされるのも非常にもっともなこ
とだと思われる。この点についてはイノウエ（Inouye）
等のＴＩＢＳ、１６、１８（１９９１ａ）とイノウエ等
による、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオ
ロジー（Ann. Rev. Microbiol.）４５、１６３（１９９
１ｂ）を参照されたい。逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成
の結果生ずる遺伝子重複は進化中のゲノムの多様化に重
要な役割を果していると考えられる。
【０００４】本発明はゲノム進化に関連する基礎研究に
伴って生じたものである。プラスミドＤＮＡの複製に特
有のｓｓ−ｓｌＤＮＡの合成が実証された。ｓｌＤＮＡ
の形成は原核ならびに真核生物の染色体ＤＮＡ複製時に
広く行われる。ＩＲ構造を伴う染色体遺伝子要素は、Ｉ
Ｒ構造の安定性とポリメラーゼの性質によっては常にｓ
ｌＤＮＡへと複製しやすいと考えられる。
【０００５】反復遺伝子外パリンドローム塩基配列に対
してはＲＥＰとして知られ、パリンドローム単位に対し
てはＰＵとして知られる多くの逆方向反復（ＩＲ）構造
が存在する（大腸菌（E. coli.）中には約１０００コピ
ー）ことが判明している〔ヒギンス（Higgins ）等のネ
イチャー（Nature）２９８、７６０（１９８２）、ギル
ソン（ Gilson ）等、エンボ・ジャーナル（EMBO. J.）
３、１４１７（１９８４）及びギルソン等、ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids. Res. )１９、１
３７５（１９９１）〕。これらの構造はＤＮＡポリメラ
ーゼＩを含む特定の細胞成分と会合して、染色体組織に
重要な役割を果すと考えられる〔ギルソン等、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ１８、３９４１（１９９０）
とギルソン等、エンボ・ジャーナル３、１４１７（１９
８４）参照〕。ヒトゲノムの約６％がＡｌｕと呼ばれる
要素によって占められ、Ａｌｕの転写生成物は実質的な
第二構造を含むことが判明している〔シメット（Simmet
t ）等のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）２６６、８６７５（１９９１）
参照〕。
【０００６】ｓｌＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成とは対照的
にRNA 中間体も逆転写酵素活性も必要としないので、ｓ
ｌＤＮＡはｃＤＮＡよりも頻繁に形成される。従って、
ｓｌＤＮＡはゲノム内に分散または再配置された遺伝子
要素を重複させることによって、原核生物を真核生物の
両方のゲノム進化においてｃＤＮＡと同様な、重要な役
割を果すと考えられる。
【０００７】親出願は、双方とも、新規な一本鎖ＤＮＡ
構造物であるｓｌＤＮＡのインビボならびにインビトロ
での合成方法、ｓｌＤＮＡ構造物、ならびに他の各種の
遺伝的構造物に関するものである。これらの親出願は、
一本鎖部分にアンチ遺伝子を保持しているｓｌＤＮＡに
も関するものであり、このアンチジーンは、標的ｍＲＮ
Ａと結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害した
り、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡと結合して三重らせんを形成
し、標的ＤＮＡの発現を阻害したりするアンチセンスと
なることができる。
【０００８】本発明は、一本鎖ＤＮＡ分子、特に、ｓｌ
ＤＮＡ分子をこれまで達成しえなかった高収率で過剰発
現させることに関わるものであり、こうした製造を行う
方法、ならびにこうした目的を達成するための遺伝的構
築物に関するものである。
【０００９】（上述の）ｓｌＤＮＡ構造物は、一本鎖の
ループと、二重となった一本鎖の相補的な塩基からなる
尾部から構成されている。この尾部は、単一の５′末端
と、単一の３′末端で終端しており、一方の末端がもう
一方の末端からさらに延びて一本鎖のオーバーハング部
となっていてもよい。
【００１０】一本鎖の分子は不安定なことで有名である
という事実からしても、本発明で一本鎖の構造物がこの
ような高収率で生成しえたことは予期せざることであっ
た。
【００１１】本発明の概要 本発明によって、基本的な発見がなされた。ゲノムの一
部はゲノムから直接複製されることが判明した。判明し
たこの遺伝子複製はＲＮＡ中間体も逆転写酵素も必要と
せず、ＤＮＡ複製中に生ずる。
【００１２】簡単に説明すると、本発明は新規で有用な
一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法（又はプロ
セス）を提供する。この方法は一重鎖構造の合成を開始
するために、ＤＮＡ逆方向反復（ＩＲ）と必要な成分と
の使用を含む。本発明はまた、ＤＮＡ逆方向反復を含む
必要な成分からのこのようなｓｓＤＮＡの合成系をも提
供する。本発明はさらに、新規なｓｓＤＮＡ分子の合成
のための必要な成分の全てを含む適切な複製ビークルを
提供する。本発明はまた特有の構造を形成する新規で有
用なｓｓＤＮＡ分子をも提供する。この構造は相補的塩
基の二重鎖ＤＮＡからなるステムを含み、ステムはその
端部の一つにおいて２個の末端、それぞれ３′と５′末
端を有し、他方の端部ではループ形成ｓｓＤＮＡを有す
る。
【００１３】本発明はインビトロまたはインビボでの方
法及び系の実施を含む。
【００１４】本発明はまた改良された又は新規な生物学
的性質を有するタンパク質を形成する目的で遺伝子にラ
ンダムな突然変異を起こさせる方法を含めて、新しい分
子の種々な使用を開示する。他の重要な考えられる使用
法は、本発明ｓｓＤＮＡ分子をＤＮＡに加えて、安定性
の高い三重鎖ＤＮＡを形成することである。また本発明
ｓｓＤＮＡ分子のアンチセンスＤＮＡとしての使用であ
る。他の使用法は単一プライマーを用いるポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）の適用である。
【００１５】本発明とその幾つかの実施態様を下記でさ
らに詳述する。
【００１６】本発明の方法によるとｓｓＤＮＡ内のアニ
ールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡのステム部分を含
む構造を有するｓｓＤＮＡ分子が製造される。このステ
ムはその端部の一つにおいてｓｓＤＮＡ分子の５′と
３′末端を形成し、他端部において２本のステム一重鎖
を結合する非アニール塩基の一重鎖からなるループを形
成する。特定の実施態様では、３′末端を端部に有する
鎖は他方の鎖よりも長い。ｓｌＤＮＡはタンパク質をコ
ードしうるＤＮＡセグメント、特に遺伝子を含みうる。
遺伝子はループと末端との間に配置される。遺伝子は突
然変異を有する遺伝子でありうる。
【００１７】ｓｌＤＮＡ合成に対して仮定される機構を
図６のＡと図６のＢに示す。この合成は概略的に下記の
過程を含むと考えられる：ＤＮＡの合成は複製開始部位
にて始まり、第１鎖（または“特定”もしくは“不特
定”鎖）の複製は２本鎖ＤＮＡの鎖の一方を鋳型として
進行する（染色体ＤＮＡの複製と同じ機構によって）
〔トミザワ ( Tomizawa ) 等、プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A）、７４、１８６５（１９７７）参照〕、そしてプラ
スミドを用いる場合には、ＩＲ構造を通しての進行は全
プラスミドの複製を生ずる。しかし、以下で詳述するよ
うに、第１鎖合成が中断するまたはＩＲ内で終了した場
合に、第１鎖の一部はループ構造を形成する（図６、工
程２〜３）。このループは連続ＤＮＡ合成のプライミン
グ部位として機能する短い二重鎖部分を形成する。ＤＮ
Ａ鎖伸長は新たに形成された３′端部から再開し、テン
プレートとして発生期の第１鎖を用いて第２鎖（または
“他方の”鎖）を形成する。代替えの（または同時発生
の）考えられる合成過程は以下で説明する。このように
して、テンプレート切換えによってＤＮＡ合成方向は逆
になり、ＤＮＡフラグメントを二重にする（図６、工程
１〜４）。新しく合成されたｓｌＤＮＡ分子は親テンプ
レート鎖から解離され、親テンプレート鎖は他の複製ラ
ウンドを受けて他のｓｌＤＮＡを形成する。ｓｌＤＮＡ
を必要に応じて単離して精製する。
【００１８】本発明の他の実施態様では、ＤＮＡ自己複
製ビークル（self - replicating vehicle）、例えば逆
方向反復（ＩＲ）構造を含むＤＮＡフラグメントを挿入
されたプラスミドを提供する。このＤＮＡフラグメント
はｓｓＤＮＡ合成のテンプレートとして、及び適当なプ
ライミング部位、例えば大腸菌におけるＣｏｌＥ１の複
製始点として働く。ＩＲはＯＲの下流に存在する。自己
複製ビークルは適当なホスト（例えば大腸菌）中で複製
される。ホストは少なくとも１種のポリメラーゼを含ん
でテンプレートからｓｓＤＮＡを合成する。この特定の
実施態様では、２種のポリメラーゼ、ＯＲからＩＲまで
のｓｓＤＮＡ部分、第１鎖の伸長に寄与する第１ＤＮＡ
ポリメラーゼと、ｓｓＤＮＡ鎖の残部もしくは第２鎖を
合成する第２ＤＮＡポリメラーゼが存在すると推定され
る。第１鎖の合成が終了すると、相補的塩基がアニール
されて一重鎖非アニールループを形成する。その後に第
２鎖の合成が行われる。二重鎖ＤＮＡステムと反対端部
の一重鎖ループ構造とからなる、新しいＤＮＡ構造が合
成される。この新しいＤＮＡ構造に対して“ステム−ル
ープ”または“ｓｌＤＮＡ”なる名称が設けられてい
る。
【００１９】他の特定の実施態様はプロモーター、特に
ｌａｃプロモーター−オペレーターが欠如した複製ビー
クルを提供する。それでもなお、以下で詳述するよう
に、提案した合成モデルを支持してｓｌＤＮＡが製造さ
れた。
【００２０】プライミング部位とＩＲとの間のタンパク
質をコードしうる特定のＤＮＡ配列を含むようにプラス
ミドを構成することができ、合成されたｓｌＤＮＡはＤ
ＮＡ塩基配列またはその突然変異を含むと考えられる。
【００２１】また、本発明はｓｌＤＮＡを用いた遺伝子
制御方法を提供する。前記方法はＤＮＡポリメラーゼ合
成に必要な要素を含有し、そして（ａ）そのストランド
の片方が、プライミング部位および前記プライミング部
位の下流に逆方向反復配列（ＩＲ）を含有する鋳型ＤＮ
Ａである二重鎖ＤＮＡであって、前記鋳型ＤＮＡ中に、
その転写物が遺伝子の機能を調節するＤＮＡ配列が挿入
されている二重鎖ＤＮＡ、（ｂ）前記鋳型にＤＮＡの重
合を開始させるプライマー、および（ｃ）前記鋳型から
ｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼ、からなる系
において、ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内のア
ニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成され、そ
して一方の端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の末端を
形成し他方の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の両末端
を結合するＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造内に、
遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有する新規な安
定した人工のｓｌＤＮＡを用い、そして（１）前記鋳型
にＤＮＡの重合を開始させ、（２）前記ＤＮＡの二本鎖
のうち一方を鋳型として用いてプライマーからｓｓＤＮ
Ａを合成し、ＤＮＡ合成をＩＲ配列中に続け次いで合成
をＩＲ配列内で停止し、（３）ＩＲ配列において新しく
合成されたストランド内の相補的塩基をアニールして、
非二重鎖領域のループおよびそのループのネック部分に
二重鎖領域を形成させ、その二重鎖領域がＤＮＡの合成
を続けるためのプライミング部位として機能し、（４）
前記ＤＮＡの新しく合成されたストランドおよび／また
は他方のストランドを鋳型として用いてＤＮＡ合成を再
開し、次いで（５）ｓｌＤＮＡを生成する、ステップか
らなることを特徴とする。
【００２２】本発明のｓｌＤＮＡは自己複製ビークルに
よって合成される必要はなく、ＩＲと、ｓｓＤＮＡ合成
に必要な要素とを含む、線状もしくは非線状のＤＮＡセ
グメントから構成される適当なインビトロ系で合成され
ることができる。このような系を以下で説明する。
【００２３】
【実施例】下記実施例は説明のためのものであり、本発
明の如何なる限定もを意図しないものである。これらの
実施例では、全ての％は固体では重量％であり、液体で
は容量％であり、全ての温度は、他の注釈しないかぎ
り、摂氏度によるものである。なお、下記実施例におい
て用いられるプラスミドｐＵＣＫ１０６はアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受け入れ番
号No.６８６７９として寄託されており、プラスミドｐ
ＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯはＡＴＣＣによって受け入れ
番号No.６８６８０として寄託されている。
【００２４】便利さと簡潔さのために、実施例は図面に
関連し、図面の詳細な説明を提供する。
【００２５】実施例 １ 図１はｐＵＣＫ１０６（円形マップ）、以下に示すよう
に製造した特定のプラスミドを説明する。円形マップ中
の白抜きバー（open bar ）はカナマイシン耐性遺伝子
（Ｔｎ５から）を表す。上部右側に示す直線白抜きバー
はＸｂａＩ部位に挿入した２１５−ｂｐＤＮＡフラグメ
ントを表し、これは３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）塩基
配列を含有している。中実矢印（solid arrow )はＩＲ
構造を示す。中実円設定は複製の始点（Ori ）である。
長い白抜き矢印ＯＲからのＤＮＡ複製の方向を示す。小
さい白抜き矢印はｌａｃプロモーター−オペレーター
（ｌａｃＰＯ）の位置を示す。
【００２６】図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入
された、配列表の配列番号１及び配列番号２でそれぞれ
表されるＤＮＡより構成される２１５−ｂｐＤＮＡフラ
グメントの塩基配列を示す。このプラスミドはここでは
ｐＵＣＫ１０６と名づける。白抜き矢印はＩＲ塩基配列
を示す。ＨｉｎｄIII （ＡＡＧＣＴＴ）部位はＩＲの中
心を示す。
【００２７】ＩＲ中の不適正位置はスペース内に挿入さ
れた不適正塩基ＣとＴを含む矢印内の２個の白抜きスペ
ースによって示す。
【００２８】上記ＤＮＡフラグメント（ＩＲを含む）は
図２に示された配列を有する。
【００２９】実施例 ２ この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成と
その特徴とを説明する。
【００３０】（Ａ） 大腸菌ＣＬ８３をｐＵＣＫ１９，
ｐＵＣＫ１０６のいずれかとｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ
ＰＯとによって形質転換し、プラスミドＤＮＡ画分を形
成した。ＤＮＡ標本（リボヌクレアーゼＡ処理後）を電
気泳動のために５％アクリルアミドゲルに塗布した。ゲ
ルを臭化エチジウムによって染色した。図３のＡにおい
て、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２の
ＨａｅIII 消化体を示す。レーン２はｐＵＣＫ１９を収
容する細胞からのＤＮＡ標本；レーン３はｐＵＣＫ１０
６；レーン４はｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯを示す。ｐ
ＵＣＫ１９はｐＵＣ１９のカナマイシン変異体である。
【００３１】（Ｂ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ
をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、次
に種々の制限酵素消化を行った。消化体をポリアクリル
アミド（５％）ゲル電気泳動によって分析し、ゲルを臭
化エチジウムによって染色した。図３のＢにおいて、レ
ーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅ
III 消化体；レーン２は消化されないｓｌＤＮＡ；レー
ン３はＸｂａＩによって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン
４はＨｉｎｄIII によって消化されたｓｌＤＮＡ；レー
ン５はＰｖｕIIによって消化されたｓｌＤＮＡを示す。
【００３２】（Ｃ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ
の熱変性。精製ｓｌＤＮＡ（上記のような）を１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭ ＥＤＴＡ
中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３
分間インキュベートし、氷浴中で急冷した。サンプルを
Ａに述べたように分析した。図３のＣにおいて、レーン
１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII
消化体；レーン２は熱処理なしのｓｌＤＮＡ；レーン３
は熱変性後に急冷したｓｌＤＮＡを示す。
【００３３】このｓｌＤＮＡは、塩基５３個のループ、
塩基約４４０個のステム、ならびに塩基１５〜１８個の
オーバーハングした３′尾部を有している。
【００３４】実施例 ３ この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマ
ー形成を説明する。
【００３５】（Ａ） 実施例２について述べたようなｐ
ＵＣＫ１０６からの精製ｓｌＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 中に溶解した。このｓｌＤＮＡ
溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートしてから、
徐々に冷却する。再結合 ( renatured )ＤＮＡをＸｂａ
Ｉによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラ
グメントをそれらの末端において〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ
とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。こ
れらの生成物を５％ポリアクリルアミドゲルに塗布し
た。電気泳動後に、ゲルを乾燥させ、このゲルにオート
ラジオグラフィーを実施した。
【００３６】図４のＡにおいて、レーン１はサイズマー
カーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン
２はサイズマーカーとしてのλＤＮＡのＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄIII 消化体；レーン３は処理なしのｐＵＣＫ１０
６からのｓｌＤＮＡ；レーン４は非処理ｓｌＤＮＡのＸ
ｂａＩ消化体；レーン５は熱変性後に徐冷したｓｌＤＮ
Ａ；レーン６はレーン５からのｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消
化体を示す。帯を右手側において“ａ”から“ｅ”まで
マークを付した。
【００３７】（Ｂ） 図４のＡ中のフラグメント“ｄ”
の特性化（図４のＢ）。フラグメント“ｄ”はゲルから
精製した。レーン３は精製フラグメント“ｄ”のＨｉｎ
ｄIII 消化体；レーン４では精製フラグメント“ｄ”は
図３に関して述べたように熱変性し、急冷した。
【００３８】（Ｃ） （Ａ）と（Ｂ）に示した“ａ”〜
“ｂ”帯の概略図（図４のＣ）。ＸとＨはそれぞれＸｂ
ａＩとＨｉｎｄIII を示す。ＸｂａＩ部位に非常に近接
したバンド“ａ”中に２個の他のＨｉｎｄIII 部位があ
り、これはバンド“ｃ”中にある。これらのＨｉｎｄII
I 部位は図示せず。
【００３９】実施例 ４ この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのＤＮＡ
塩基配列の決定を説明する。
【００４０】（Ａ） ｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩
基配列の決定。単離、精製したｓｌＤＮＡ０．２μｇを
鎖停止方法 (chain termination method )による塩基
配列決定に用いた。始点（図５のＢ左側参照）から下流
の配列９６−ｂｐに相当する配列表の配列番号３で表さ
れるプライマー“ａ”（５′ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧ
ＡＡＴＣＡＧ３′）をプライマーとして用いた。
【００４１】（Ｂ） ｓｌＤＮＡのループ部分の５′端
部塩基配列の決定。ｓｌＤＮＡ０．５μｇをＳａｃIIに
よって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメ
ントを５′端部において〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼによって標識した。約４０−ｂ
ｐ移動したＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギ
ルバート（Maxam − Gilbert）法によって塩基配列を決
定した。
【００４２】（Ｃ） ｓｌＤＮＡのループ部分の３′端
部塩基配列の決定。ＳａｃII消化体ｓｌＤＮＡを末端デ
オキシヌクレオチジル転移酵素を用いて３′端部におい
て〔γ−３２Ｐ〕ジデオキシＡＴＰによって標識した。
ループ部分を含むＤＮＡフラグメントを単離し、マキサ
ム−ギルバート法によって塩基配列を決定した。
【００４３】（Ｄ） ｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩
基配列。ｓｌＤＮＡをＡｆｌIII によって消化させた
（図５のＤ参照）、５′端部を〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰと
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。標識
生成物を塩基配列決定用ゲルによって分離した。７６塩
基移動した一重鎖ＤＮＡを単離し、マキサム−ギルバー
ト法によって塩基配列決定した。図５のＣを参照する
と、数字はｐＵＣＫ１９の始点からの残基数を表す。
【００４４】（Ｅ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ
の構造。このｓｌＤＮＡは１１３７〜１１３９塩基の一
重鎖ＤＮＡからなる。ｓｌＤＮＡの５′端部は不均一で
あるように見える；一部は＋１から開始し、他の部分は
−１，＋２，＋３から開始する。＋１位置はＣｏｌＥｌ
ＤＮＡ複製の始点に相当する。従って、種々のｓｌＤ
ＮＡは異なる長さの５′末端鎖を有する。３′端部では
１６塩基の配列が５′末端の＋１位置を越えて伸長す
る。このループはＨｉｎｄIII 部位（ＡＡＧＣＴＴ）が
配置されるように設定されたＩＲ構造の中心の配列に相
当する４塩基配列（ＡＧＣＴ）によって形成されると考
えられる。ｐＵＣＫ１０６中のＩＲ構造中の不適正に相
当する塩基対はＣ・Ｔ（ｐＵＣＫ １０６）からＣ・Ｇ
（ｓｌＤＮＡ中）に変えられＳａｃII部位とＰｓｔＩ部
位との間に示される。図５のＡのＤＮＡ塩基配列決定に
用いられるプライマー“ａ”の位置は矢印によって示
す。
【００４５】このｓｌＤＮＡは、３００〜４０００個以
上の塩基からなるステムを有するよう構築することがで
きる。オーバーハング部は、たとえば、塩基１０〜８０
個程度の任意所望の長さ、たとえば塩基約５０個の長さ
に調整することができる。この部分の長さは、安定性が
損なわれることのないよう選ぶ必要がある。ｓｌＤＮＡ
は、所望の長さのループを有するよう構築することがで
きる。
【００４６】ｓｌＤＮＡの分離と精製は、モレキュラー
クローニング；ア ラボラトリーマニュアル（Molecu
lar Cloning；A Laboratory Manual ）、サムブルッ
ク（Sambrook）等、第２版（セクション１．１２１〜
１．４０）（“サムブルック”）に述べられている方法
に従って標準方法によって実施した。
【００４７】実施例 ５ この実施例は二つの可能なｓｌＤＮＡ合成方法を説明す
る（図６参照）。ＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の始点を中心
とする二重鎖ＤＮＡを上部に示す。斜線入り円は始点か
らＤＮＡ複製を開始するＤＮＡ複製複合体を表す。ＤＮ
Ａ鎖上の白抜き矢印はＤＮＡ塩基配列中の３５−ｂｐ逆
方向反復（ＩＲ）構造（図２参照）の位置を示す。ＩＲ
構造中の不適正塩基対（Ｃ・Ｔ）も矢印中に示す。
【００４８】工程１において、ＤＮＡ複製フォークは始
点（＋１位置）から斜線入り円によって示される位置に
まで進行する。新たに合成された第１鎖が始点（中実
円）から複製フォークまで伸長するのが示される。ＤＮ
Ａ複製複合体は中実矢印によって示されるＩＲ構造中の
不適正Ｔ残基の直前に達する。工程２では、この新たに
合成された第１鎖の３′末端がＤＮＡ複製複合体から剥
離して、２次構造がＩＲ構造によって形成される。工程
３では、ＤＮＡ合成がこの新たに合成された第１鎖（モ
デルＡ）または上部の親鎖（モデルＢ）をテンプレート
として用いてステーム−ループ構造の３′末端から再開
する。工程４では、ＤＮＡ合成が始点を越えて１６塩基
だけ進行する。
【００４９】モデルＡでは、ＤＮＡの５′末端に結合し
て残留するプライマーＲＮＡがテンプレートＲＮＡとし
て用いられる。続いて、ＲＮＡが除去されて、ｓｌＤＮ
Ａが形成される。モデルＢでは、ＤＮＡ合成が第２鎖Ｄ
ＮＡ合成の停止のために知られた機構と同様な機構によ
ってｔｅｒＨ部位において停止する。
【００５０】モデルＡとＢが合成を説明することがで
き、合成が両ルートによって、少なくとも一部の時間で
は、同時に進行しうることが考えられる。従って、第１
鎖のテンプレートであった鎖以外の第２鎖に対しては適
当なテンプレートが用いられる。
【００５１】実施例 ６ ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯの構成 ｌａｃプロモーター−オペレーターを含む１９９−ｂｐ
ＰｖｕII−ＨｉｎｃIIフラグメントがｐＵＣＫ１０６
（図１参照）から欠失すると、結果として生ずるｐＵＣ
Ｋ１０６ΔｌａｃＰＯは図３のＡ、レーン４の位置
（ｂ）に示すような、ｐＵＣＫ１０６からｓｌＤＮＡよ
りも迅速に移動する新しいｓｌＤＮＡを形成した。この
新しいｓｌＤＮＡのサイズは３６０−ｂｐ長さであり、
ｐＵＣＫ１０６ｓｌＤＮＡよりも、ｐＵＣＫ１０６Δｌ
ａｃＰＯ中の欠失サイズに殆ど等しい長さだけ短い。
【００５２】図３のＡでは、レーン３はｐＵＣＫ１０６
ΔｌａｃＰＯを収容する細胞からのＤＮＡ形成のｓｌＤ
ＮＡを示す。
【００５３】この実験は上記で提案したｓｌＤＮＡ合成
モデルを支持し、ｌａｃプロモーター−オペレーターが
ｓｌＤＮＡ合成にとって本質的でないことをも実証す
る。この解釈はｌａｃ誘導物質であるイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加がｐＵＣＫ１０６
からのｓｌＤＮＡの形成に影響しないという事実によっ
てさらに支持された。しかし、ｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ
ＰＯからのｓｌＤＮＡ合成減少の理由は現在まだ不明で
ある。
【００５４】実施例 ７ ｓｌＤＮＡの合成はｐＵＣＫ１０６に用いられるＩＲ構
造の一次塩基配列に依存しなかった。興味あることに
は、ポリリンカー部位にＩＲ構造を有するｐＵＣ７ベク
ター自体も、始点からポリリンカー中心までのＤＮＡフ
ラグメントに対応するｓｌＤＮＡを形成することができ
る。
【００５５】ｐＵＣ７から形成された単離精製されたｓ
ｌＤＮＡは２５２ｂｐ長さであった。プラスミド画分を
実施例２と同様に形成し、処理し、電気泳動のためにア
クリルアミドゲルに塗布し染色した。
【００５６】図７では、レーン１と３はサイズマーカー
としてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII消化体を示す。レー
ン２はｐＵＣ７から形成されたｓｌＤＮＡを示す。
【００５７】実施例 ８ ｓｌＤＮＡ構造の確認 上記ｓｌＤＮＡ構造と機構（図６に説明）は次のように
確認した：
【００５８】合成によって構築したＤＮＡフラグメント
に不適正塩基ＣＴをＣＧの代りに故意に加えた。図２の
ＩＲの開放スペースを参照のこと。ｓｌＤＮＡ合成（第
１鎖上にスナップ−バックした第２鎖を含む）後に、不
適正は修正された。なぜなら図５のＤでは、ＣＧが出現
している。もし構造がスナップ−バック構造でなかった
としたら、ポリメラーゼがＩＲ領域を正しく読み、Ｔを
鋳型として読みＡが挿入されるはずである。すなわち；
新しい鎖はまだ不適正を含むと思われる。不適正Ｔを置
換するために、ＩＲ部分は第１鎖に必然的にスナップ−
バックして、ポリメラーゼにテンプレートとして第１合
成鎖を使わせて、第２鎖を合成させ、第２鎖が合成され
るときに、不適正Ｔの代りに相補的Ｇを挿入させる。こ
れは本発明のｓｌＤＮＡの合成機構と構造を決定的に確
立する。
【００５９】実施例 ９ この実施例はアンチセンス配列を有するｓｌＤＮＡ（以
下、アンチセンスｓｌＤＮＡと称する）による遺伝子制
御を説明する。
【００６０】（１）ｓｌＤＮＡ生産プラスミドの構築 ｐＵＣＫ１０６のＰｖｕII−ＨｉｎｃII領域（１９９ｂ
ｐ）を削除し、ｌａｃＺのプロモーター／オペレーター
領域を欠失させたｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．を構築し
た（図９）。次に、配列表の配列番号４に示される配列
（アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチド及び
配列表の配列番号５に示される配列（センス配列）を有
するオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端をリン酸化
したのちアニーリングさせ、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．
Ｏ．のＨｉｎｄIIIサイトに挿入した。センス配列を有
するｓｌＤＮＡ（以下、センスｓｌＤＮＡと称する）を
生産するプラスミドをｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−
Ｉ，アンチセンスｓｌＤＮＡを生産するプラスミドをｐ
ＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIと命名した（図９）。
【００６１】このｓｌＤＮＡは、塩基４２個のループ、
塩基３６０個が二重らせん状となったステム、ならびに
塩基１５〜１８個の尾部、すなわちオーバーハング部を
有していた。
【００６２】（２）β−ラクタマーゼ遺伝子を有する宿
主大腸菌の創製 ｐＢＲ３２２（寳酒造社）をＥｃｏＲＩとＨａｅIIで切
断し、β−ラクタマーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂの断
片を得、該断片を末端平滑後ｐＨＳＧ３９９（寳酒造
社）のＳｍａＩサイトに挿入してｐＸＸ５５５を構築し
た。次に、ミニＦ（ｍｉｎｉＦ）由来のプラスミドｐＸ
Ｘ３２５〔プロシーディングズ オブ ザナショナル
アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳ
Ａ、第８０巻、第４７８４−４７８８頁、（１９８３）
に記載〕のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにβ−ラク
タマーゼ遺伝子を含むｐＸＸ５５５のＨｉｎｄIII−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を挿入し、プラスミドｐＸＸ５６６を構築
した（図１０）。ｐＸＸ５６６で大腸菌ＭＣ４１００を
形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子を有する大腸菌Ｍ
Ｃ４１００／ｐＸＸ５６６を得た。
【００６３】（３）アンチセンスｓｌＤＮＡによるβ−
ラクタマーゼ遺伝子の発現抑制 ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ、ｐＵＣＫ１０６ｄ．
Ｐ．Ｏ．−IIをそれぞれ大腸菌ＭＣ４１００／ｐＸＸ５
６６に導入し、それぞれＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／
Ｉ、ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIと命名した。それ
ぞれの形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む
Ｌ−ブロスで３７℃一昼夜培養し、その培養液を１００
００倍希釈して、その５０μｌを、カナマイシン５０μ
ｇ／ｍｌとアンピシリンを５０〜１５０μｇ／ｍｌ含む
Ｌ−ブロスプレートにまいて３７℃で一昼夜培養した。
各プレートのコロニー数を計算した。表１にアンピシリ
ン濃度５０μｌ／ｍｌの時のコロニー数を１００とした
ときの相対％を、図１１に縦軸にコロニー数（相対
％）、横軸にアンピシリン濃度をとったグラフを示す。
その結果、ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIではアンチ
センスｓｌＤＮＡによってβ−ラクタマーゼ遺伝子の発
現が抑制されアンピシリンに対する耐性が低下し、死滅
率が上昇した。
【００６４】
【表１】
【００６５】（４）ウエスタンブロッティングによるβ
−ラクタマーゼ発現量の測定 実施例９−（３）で得られたＭＣ４１００／ｐＸＸ５６
６／Ｉ及びＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIの単一コロ
ニーを無作為に選び、それぞれ５ｍｌのＬ−ブロス（２
０μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシ
ンを含む）に植菌し、３７℃で一昼夜培養した後、その
培養液１００μｌを同じ培地５ｍｌに植菌した。ＯＤ
６００ ＝１．２付近で集菌し、１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．１）で洗浄した後、同緩衝液１ｍ
ｌに懸濁しＯＤ６００ 数を測定した。各々０．７５Ｏ
Ｄ６００ 分の菌体を破砕し、その細胞抽出液を１５％
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。Ｐ
ＶＤＦ膜（イモビロン、ミリポア社）にブロッティング
した後、抗β−ラクタマーゼ抗体（５′プライム→３′
プライム社）を用いてウエスタンブロッティングを行っ
た。検出にはイムノステインキット（コニカ社）を使用
した。その結果、アンチセンスｓｌＤＮＡを生産してい
るＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIではセンスｓｌＤＮ
Ａを生産しているＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉに比
べて約３０％のβ−ラクタマーゼの発現量の低下が認め
られた。
【００６６】さらに、センスならびにアンチセンスｓｌ
ＤＮＡの遺伝子コピーが同一であり、いずれの分子も欠
失あるいは組換えを生じていないことが例証された。セ
ンスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡを含むゲルの写真
には、生成したｓｌＤＮＡが予想通りのサイズを有する
ことが示されており、これらの構築物中で遺伝子組換え
が生じていないことが示唆された。また、センスならび
にアンチセンスｓｌＤＮＡのバンドは似通った強度を有
しており、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡのコ
ピー数が似通ったものであることが示された。
【００６７】こうした結果は、カナマイシン耐性遺伝子
について調べた結果によって、さらに裏づけられるもの
である。カナマイシン遺伝子の発現は、アンチセンス系
とは独立しており、したがって、内部コントロールの役
目をはたす。センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡを
発現する細胞から誘導した抽出物のポリアクリルアミド
ゲルからは、Ｋｍ耐性タンパク質を表すバンドの強度が
同一であることが示される。さらに、これらの２種の抽
出物のβ−ラクタマーゼ以外のタンパク質の総量は同一
である。こうした結果から、観察データに示す影響が、
アンチセンスの影響であることがわかる。このように、
観察されるβ−ラクタマーゼの発現の変化は、細胞での
転写ならびに翻訳に対する全体的影響の結果として生じ
るのではなく、アンチセンスｓｌＤＮＡの発現に直接起
因するものなのである。
【００６８】実施例 １０ この実施例は三重鎖形成能を有するｓｌＤＮＡ（以下、
三重鎖形成ｓｌＤＮＡと称する）を説明する。 （１）ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．の構築 ｐＵＣＫ１９のＮｄｅＩサイトに配列表の配列番号６お
よび７で示される配列で構成される１０６ＮｄｅＩ配列
を挿入してｐＵＣＫ１０６Ａを構築した。次に、ｌａｃ
プロモーター／オペレーター領域を含むＨｉｎｃII−Ｖ
ｓｐＩ領域（２０６ｂｐ）を欠失させてｐＵＣＫ１０６
Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した。
【００６９】（２）三重鎖形成ｓｌＤＮＡの調製 配列表の配列番号８に示すオリゴヌクレオチド（ＧＴ３
７配列）及び配列表の配列番号９で示されるオリゴヌク
レオチド（ＣＡ３７配列）を合成し５′末端をリン酸化
したのちアニーリングさせ、ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．
Ｏ．の１０６ＮｄｅＩ配列中のＨｉｎｄIIIサイトに挿
入した。ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方
向に断片が挿入されているプラスミドをｐＵＣＫＡＧＴ
３７、ＣＡ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向
に断片が挿入されているプラスミドをｐＵＣＫＡＣＡ３
７と命名した（図１２）。これらのプラスミドで大腸菌
ＭＣ４１００を形質転換し、これらの形質転換体をそれ
ぞれＭＣ４１００／ｐＵＣＫＡＧＴ３７、ＭＣ４１００
／ｐＵＣＫＡＣＡ３７と命名した。これらの形質転換体
及び実施例９−（２）で作製したＭＣ４１００／ｐＵＣ
Ｋ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．をＬ−ブロス（７０μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含む）にて培養後アルカリ−ＳＤＳ法
にてＤＮＡを抽出し、次にＲＮａｓｅＡで処理した。こ
の抽出液をポリアクリルアミド電気泳動に供し、各々の
精製ｓｌＤＮＡを得た。
【００７０】（３）標的ＤＮＡの調製 配列表の配列番号１０及び１１に示されるオリゴヌクレ
オチドを合成し、５′末端をリン酸化した後アニーリン
グさせ、ｐＭＳ４３４〔ジーン（Gene）、第５７巻、第
８９〜９９頁、（１９８７）に記載〕のＸｈｏＩ−Ｈｉ
ｎｄIIIサイトに挿入し、ｐＭＳＴＲ３７を構築した。
３７をテンプレートとし、配列表の配列番号１２で示さ
れるプライマーＭＳ１と配列表の配列番号１３で示され
るプライマーＭ４でＰＣＲを行い、挿入断片を増幅し、
該増幅断片を標的ＤＮＡとした（図１３）。
【００７１】（４）三重鎖形成の確認 実施例１０−（２）で調製した各ｓｌＤＮＡの５′末端
を３２Ｐで放射性標識した。次に、各々の３２Ｐ標識ｓ
ｌＤＮＡと実施例１０−（２）で調製した過剰量の標的
ＤＮＡを１０ｍｌの三重鎖形成用緩衝液（５ｍＭトリス
−酢酸 ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ ）中で３７℃で一昼夜処理した。
【００７２】該処理液を、５０ｍＭトリス−ホウ酸、５
ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、ｐＨ８．５の泳動用緩衝液を用い
る１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、三重
鎖形成をゲルシフトアッセイにより検出した。その結
果、ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡは三重鎖を形成して
ゲルシフトした。一方、ＣＡ３７配列を含むｓｌＤＮＡ
及び挿入配列のないｓｌＤＮＡはゲルシフトしなかっ
た。
【００７３】実施例 １１ この実施例は酵母におけるｓｌＤＮＡ生産を説明する。 （１）プラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６及びｐＹＥＳ
２−９−１０６の構築ＣｏｌＥｌと２μの複製開始点を
持つシャトルベクターｐＹＥＳ２（インビトロジョン
社）を用い、酵母でのｓｌＤＮＡ生産を調べた。
【００７４】ｐＹＥＳ２をＭｕｌＩ及びＳｓｐＩで切断
した後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い平滑化し
環状化することによりＭＣＳ及びＧａｌＩプロモーター
領域を除いた（ステップ１）。次に、このプラスミドを
ＡｖａＩで切断し、末端を平滑化した後、配列表の配列
番号１４，１５でそれぞれ示されるＤＮＡ断片Ａ又はＢ
を挿入した（ステップ２）。次に、これらのプラスミド
をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、そこにｐＵＣＫ１０
６のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（２２７ｂｐ）を挿入し
た（ステップ３）。構築されたプラスミドをそれぞれｐ
ＹＥＳ２−８−１０６（図１４、左側）、ｐＹＥＳ２−
９−１０６（図１４、右側）と命名した。
【００７５】（２）形質転換体からのプラスミドＤＮＡ
とｓｌＤＮＡの回収 酢酸リチウム法（ジャーナル オブ バクテリオロジー
( Journal of Bacteriology ) 、第１５３巻、第１６
３〜１６８頁、（１９８３））によってサッカロミセス
セレビシエ ( Saccharomyces cerevisiae )ＹＰＨ４
９９（ストラタジーン社）をプラスミドｐＹＥＳ２−８
−１０６又はｐＹＥＳ２−９−１０６で形質転換した。
各々の形質転換体を１００ｍｌのＹＰＤ培地（１％バク
トイーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％
デキストロース）にてＯＤ６００がおよそ１．５になる
まで培養した後、集菌した。該菌体を１０ｍｌのＳＣＥ
液（１８２ｇ／ｌ ソルビトール、２９．４ｇ／ｌ ク
エン酸２ナトリウム、２２．３ｇ／ｌ ＥＤＴＡ２ナト
リウム）で１回洗浄し、次に４ｍｌの溶液Ｉ（ＳＣＥ１
０ｍｌ中に１０μｌのβ−メルカプトエタノールと５ｍ
ｇのザイモリアーゼ１００Ｔを含む溶液）に懸濁し３７
℃で２時間ゆっくり振とうしスフェロプラスト化した。
次に、８ｍｌの溶液II（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１
％ラウリル硫酸ナトリウム）を加え５分間氷中に静置
し、次に、６ｍｌの溶液III（６０ｍＭ酢酸カリウム、
氷酢酸１１．５ｍｌ、水２８．５ｍｌ）を加え５分間氷
中に静置した後、遠心して上清を回収した。該上清にイ
ソプロパノールを加えてＤＮＡを沈澱として回収し、該
沈澱を７０％エタノールで洗浄後ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）に溶解
した。フェノール／クロロホルム混合液により除蛋白操
作を行った後、エタノールで沈澱化し、更に、キアーゲ
ンチップ５（Qiagen tip ５、キアーゲン社）でＤＮＡ
を精製し、回収したＤＮＡ画分を２０μｌのＴＥ緩衝液
に溶解した。
【００７６】（３）プラスミドＤＮＡとｓｌＤＮＡの分
離 実施例１１−（２）で得られた試料のうち１０μｌ分を
ＳａｌＩにて処理した。これによりプラスミドＤＮＡは
線状化して５０２４ｂｐの２本鎖線状ＤＮＡになり、ｓ
ｌＤＮＡは１２７ｂｐのｓｌＤＮＡと長さ不明の２本鎖
線状ＤＮＡ断片に分離される（図１５）。これに、２μ
ｌのＣｏｌＥｌのＡｆａＩ分解物（２９，４６，６０，
６２，６９，９９，１２０，１２６，１３０，２４３，
２５２，３２３，４１３，４１５，５６４，７７８，９
５０，９７６，９９１ｂｐの各断片を含む）を混合し
て、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
泳動後、ゲルの下半分をエチジウムブロマイドで染色
し、１２０〜１３０ｂｐの間のゲルを切り出し細かく切
断後、回収し、滅菌水を加えて６０℃で３０分間処理し
た。遠心後、その上清からグラスウールカラムにより不
溶物を取り除き、凍結乾燥してＤＮＡを回収した。回収
したＤＮＡを２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００７７】（４）ＰＣＲによるｓｌＤＮＡの検出 図１６に示すように、配列表の配列番号１６に示される
プライマー１８７１と配列表の配列番号１７に示される
プライマー２０２６１を用いてＰＣＲを行い、ｓｌＤＮ
Ａの存在を目的のDNA 断片が増幅されるか否かで判定し
た。このとき、プラスミドＤＮＡの混入の可能性を否定
するため、同時に配列表の配列番号１８で示されるプラ
イマー１８７０とプライマー１８７１を用いてＰＣＲを
行った。なお、両プライマーの組合せによるＰＣＲ反応
の効率をみるためプラスミドＤＮＡを段階的に希釈して
検出限界の濃度を調べ、どちらも約２．５×１０−２０
モル分子であり差がないことを確認した。
【００７８】まず、実施例１１−（３）で得られた試料
をＰｓｔＩで処理し、その反応液の１００分の１を用い
て５０μｌのスケールでＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応
条件は、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分で２５サ
イクル行いプライマーの濃度は５００ｎＭで行った。反
応後、反応液の５μｌを６％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色後ＦＭＢＩＯ
−１００（寳酒造社）により生成物を検出した。その結
果、ｐＹＥＳ２−８−１０６、ｐＹＥＳ２−９−１０６
のいずれで形質転換した形質転換体もプライマー１８７
１とプライマー２０２６１の組合せの場合のみ９３ｂｐ
の増幅物が確認され、ｓｌＤＮＡの生産が確認できた。
また、いずれもプライマー１８７０とプライマー１８７
１の組合せでは増幅物は検出されずプラスミドの混入は
否定された。
【００７９】ｓｌＤＮＡは、後述する他の真核生物から
発現させることもできる。
【００８０】以上より、酵母のような真核細胞でもｓｌ
ＤＮＡが生産できることが明らかになった。またｐＹＥ
Ｓ２−９−１０６でもｓｌＤＮＡが生産されることよ
り、リーディング鎖だけでなくラギング鎖合成において
もｓｌＤＮＡが合成されることが示唆された。
【００８１】実施例 １２ プラスミドの複製に依存しないｓｌ−ＤＮＡの生産 （１）ｐＨＳ２８７０の構築 配列表の配列番号６と７で表される配列からなる１０６
−ＮｄｅＩリンカーをｐＵＣ１９のＮｄｅＩサイトに挿
入し、当該プラスミドをｐＵＣ１０６Ａと命名した。ｐ
ＵＣ１０６Ａからｌａｃプロモーター−オペレーター領
域を含むＰｖｕII断片を欠失させてプラスミドｐＵＣ１
０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した。次に、配列表の配列番
号１９で表されるＲＮＡIIＡプライマーと配列表の配列
番号２０で表される１８７０プライマーとテンプレート
にｐＵＣ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を用いてＰＣＲを行い、
ＲＮＡ１８７０断片を調製した。なお、ＲＮＡIIＡプラ
イマーは複製プライマーＲＮＡII領域の５′末端にアニ
ールし、１８７０プライマーは１０６−ＮｄｅＩリンカ
ーの３′末端にアニールする。さらに、これら二つのプ
ライマーはそれぞれ５′末端にＸｂａＩサイトを含んで
おり、その結果、ＲＮＡ１８７０断片は両側にＸｂａＩ
サイトをもつ。次に、ＲＮＡ１８７０をＸｂａＩで消化
してｐＳＴＶ２８（寳酒造社）のｌａｃプロモーター−
オペレーター下流のＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＨＳ２
８７０を構築した。図１７にｐＨＳ２８７０の構築方法
を示す。
【００８２】図１８にｐＨＳ２８７０の構造を示す。図
１８が示すように、ｐＨＳ２８７０ではプライマーＲＮ
Ａはｌａｃプロモーターの下流におかれており、逆方向
反復配列はプラスミド自身の複製をするｐ１５Ａのオリ
ジンの上流に置かれている。
【００８３】（２）ｐＨＳ２８７０をもつ細胞でのｓｌ
−ＤＮＡの生産量の解析 大腸菌ＪＭ１０９株をｐＨＳ２８７０で形質転換し、Ｊ
Ｍ１０９／ｐＨＳ２８７０を得た。この形質転換体を１
００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ−ブロ
スで２ｍＭのＩＰＴＧ存在下、非存在下の両条件で培養
した。アルカリＳＤＳ法にてＤＮＡを調製し、ＲＮａｓ
ｅ処理した。これらのＤＮＡサンプルを６％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色
した。その結果、ＩＰＴＧ存在下では非存在下に比べ
て、１００倍以上のｓｌＤＮＡの生産が確認された。
【００８４】このｓｌＤＮＡは４塩基のループと１５〜
１８塩基のオーバーハングと４４０塩基のステムをもっ
ている。
【００８５】以上より、このｓｌＤＮＡ生産はプラスミ
ドの複製に依存せず、プライマーＲＮＡをコントロール
することによりコントロールされている。
【００８６】プライマーＲＮＡの合成にプライマーゼを
利用する場合は、プライマーゼの生産をコントロールす
ることにより、ｓｌＤＮＡの生産がプラスミドの複製と
は関係なくコントロールされる。プライマーゼを利用す
る系としては、Ｔ７ファージの遺伝子４やＴ４ファージ
の遺伝子４１，６１がある。コーンベルグ（Kornberg）
著、「ＤＮＡレプリケション（DNA Replication）」の
第１１−１０章を参照。
【００８７】実施例 １３ 大腸菌における三重鎖形成ｓｌＤＮＡによる遺伝子発現
阻害 （１）ｐＨＳ２８７０ＧＴの構築 配列番号８および９に示されたオリゴヌクレオチドから
なる実施例１２に示された二本鎖オリゴヌクレオチドを
ｐＨＳ２８７０のＨｉｎｄIII サイトに導入した（図
１９）。ＨｉｎｄIII フラグメントの方向をＤＮＡシー
クエンスにより確認し、ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡ
が生産される方向に断片が挿入されているプラスミドを
ｐＨＳ２８７０ＧＴと命名した（図１９）。
【００８８】（２）ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogal
actoside )によるｓｌＤＮＡ発現の誘導 ｐＨＳ２８７０またはｐＨＳ２８７０ＧＴで大腸菌ＪＭ
１０９を形質転換し、２ｍｌのＬ−ブロス（５０μｇ／
ｍｌクロラムフェニコールを含む）中３７℃で一晩培養
した。この培養液をＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラ
ムフェニコールを含む）で１０２ 倍希釈し、培養液の
ＯＤ６００ が約０．７に到達した時点でＩＰＴＧ（終
濃度１ｍＭ）を加え３７℃でさらに２時間培養した。こ
の培養液からアルカリ−ＳＤＳ法でｓｌＤＮＡを調製
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した（図２
０）。ＩＰＴＧを加えた場合のｓｌＤＮＡ（〜４８０ｂ
ｐ：ｐＨＳ２８７０，〜５００ｂｐ：ｐＨＳ２８７０Ｇ
Ｔ）の発現量はＩＰＴＧを加えない場合より約２０倍増
加した。
【００８９】ｓｌＤＮＡは５３塩基のループ、約４４０
塩基対のステム及び１５〜１８塩基のオーバーハングを
有する。
【００９０】（３）大腸菌ＭＣ４１００ｌｐＦＴＲｌ
Ｆ′の創製 大腸菌ＭＣ４１００をラムダファージλｐＦ１３（ジー
ン、第５７巻、第８９〜９９頁（１９８７）に記載）で
溶原化した大腸菌ＭＣ４１００λｐＦ１３を、プラスミ
ドｐＭＳＴＲ３７（ＡＴＣＣ No.３５６９５）で形質転
換した。λｐＦ１３は京都大学ウイルス研究所（京都市
左京区）から入手可能である。ｉｎ ｖｉｖｏ組換えに
よりβガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域に三
重鎖形成ｓｌＤＮＡのターゲット配列を有するラムダフ
ァージλｐＦＴＲ１を得た。このλｐＦＴＲ１を用いて
大腸菌ＭＣ４１００を溶原化し、さらに大腸菌 Nova B
lue ( Novagen 社）との接合によりＦ′を導入すること
によりＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′を創製した（図２
１）。
【００９１】（４）パルスラベルと免疫沈澱法によるβ
ガラクトシダーゼ発現量の検出 大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′をｐＨＳ２８７０
またはｐＨＳ２８７０ＧＴで形質転換し、２ｍｌのＬ−
ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１５μ
ｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む）中３７℃で一晩培養
した。この終夜培養液をＭ９改変培地（ｌｘＭ９塩、
０．２％グリセロール、１ｍＭ ＭｇＳＯ ４ 、０．１
ｍＭ ＣａＣｌ２ 、０．００１％塩酸チアミン、４０
μｇ／ｍｌアルギニン、５μｇ／ｍｌ各種アミノ酸（メ
チオニン、システインを除く））で５０倍希釈し３７℃
で培養した。培養液のＯＤ６００ が約０．２に達した
時点でＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え、さらに３７℃
で３時間培養した。この培養液０．５ｍｌに４０７ｋＢ
ｑの３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓ（４３．５ＴＢｑ／ｍｍｏ
ｌ、エキスプレス〔３５Ｓ〕プロテインラベリングミッ
クス（ Express〔３５Ｓ〕Protein Labeling Mix）、
ＮＥＮ社）を加え３７℃で３０秒標識後、０．５ｍｌの
２０％ＴＣＡを加え反応を停止した。沈澱を遠心により
回収し、０．５ｍｌのアセトンで洗浄後、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡに溶解した。標識されたタンパク質の放射活性を液
体シンチレーションカウンターで測定し、１×１０６
ｃｐｍ相当の試料を１μｌの抗βガラクトシダーゼ抗体
（コスモバイオ社、ＡＢ−９８６）と０．５ｍｌのＴＢ
Ｓ−０．１％ Triton Ｘ−１００溶液中、４℃で一晩反
応させた。抗原−抗体複合体を回収するために、この反
応液に２０μｌの IgG Sorb（ジエンザイムセンター
（ The Enzyme Center）社、ＩＧＳＬ１０）を加え、
４℃で１時間激しく振盪した。沈澱を遠心で回収し、Ｔ
ＢＳ−０．１％ Triton Ｘ−１００で３回、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０で１回洗浄した。最終沈澱
を２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料液に懸濁し９５℃で
１分間加熱した。この免疫沈澱した試料をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分離し、バイオイメージ
ングアナライザーＢＡＳ２０００（フジ写真フィルム
社）で解析した（図２２）。ｐＨＳ２８７０ＧＴで形質
転換したＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′をＩＰＴＧで処
理した場合のβガラクトシダーゼのバンドの放射活性は
ｐＨＳ２８７０で形質転換した場合よりも約５０％減少
していた。
【００９２】当業者であれば以上に開示した教示内容か
らわかるように、本発明を実施するにあたっては、本発
明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、おおくの
改変、変更、および／または置換をたやすく行うことが
できる。本発明の精神および範囲には、方法論として実
質的に同等な手段、ならびに、プラスミドの複製とは独
立にｓｌＤＮＡを過剰生成するという、本発明と同一の
目的を達成する遺伝的構築物、あるいは他の適当なビー
クルも含まれるものである。
【００９３】本発明の種々の実施態様の詳細な説明 本発明者は、ゲノムの一部が直接ゲノムから複製される
という基本的な発見をした。開示する機構は周知のよう
な、ＲＮＡ中間体も逆転写酵素（ＲＴ）も必要としな
い。ワイナー等、アニュアル・レビュー・オブ・バイオ
ケミストリー５５、６３１（１９８６）；コーンベルグ
（Kornberg）、ＤＮＡレプリケーション（DNA Replica
tion ）〔ダブリュ・エッチ・フリーマン・アンド・カ
ンパニー（W. H. Freeman and Company）、カルフォ
ルニア州サンフランシスコ、１９８０〕、１０１〜１６
６頁参照。ステム−ループＤＮＡ（ｓｌＤＮＡ）と呼ば
れる新しい、有用なＤＮＡ構造が発見された。
【００９４】はじめに、本発明は幾つかの実施態様を提
供する。一実施態様は新規で有用なｓｓＤＮＡ分子の合
成方法（又はプロセス）である。他の実施態様は適当な
プライミング部位と、逆方向反復（ＩＲ）と、ｓｌＤＮ
Ａ合成の他の必要な成分とを有するＤＮＡフラグメント
を含む、このような分子を合成するためのインビボ及び
インビトロ系である。
【００９５】このような分子を合成するためのインビボ
系はコンピテント自己複製ビークルと系の他の成分とを
用いる。この実施態様の他の面は逆方向反復、ｓｌＤＮ
Ａの第１鎖の複製のためのテンプレートとして役立つＤ
ＮＡ、逆配向のＤＮＡ合成をテンプレートに開始させる
ための適当なプライミング部位、及び必要な場合の親Ｄ
ＮＡの第２鎖と以下で述べる他の成分を含む自己複製ビ
ークルである。
【００９６】もう一つの実施態様は新規なｓｓ−ｓｌＤ
ＮＡ分子である。
【００９７】本発明は新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮ
Ａ）分子の合成方法を提供する。この分子は、ステムが
ｓｓＤＮＡ中のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮ
Ａからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′
末端を形成し、他端において二重鎖 DNAの反対端部を結
合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−ループ
構造（ｓｌＤＮＡ）を含む。この方法はＤＮＡ合成の通
常の成分と下記成分： （ａ）適当なプライミング部位と、前記プライミング部
位の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤ
ＮＡ； （ｂ）テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるためのプ
ライマー；及び （ｃ）テンプレートからｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポ
リメラーゼ を含む系において実施される。
【００９８】この方法は次の工程： （１）ＤＮＡ重合を開始させるためのＤＮＡテンプレー
トのプライミング工程； （２）テンプレートとしてＤＮＡの二重鎖の一つを用い
てプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、一つの鎖を形成
し、ＩＲ塩基配列に入るまで鎖のＤＮＡ合成を続け、Ｉ
Ｒ塩基配列内で合成を停止させる工程； （３）新しく合成された鎖内のＩＲ塩基配列における相
補的塩基がその端において非重複部分を重複部分とから
なるループを形作するために、アニールし、重複部分を
連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能させる工
程； （４）テンプレートとしてＤＮＡの新たに合成された鎖
及び／又は他の鎖を用いてＤＮＡ合成を再開する工程； （５）ｓｌＤＮＡを形成する工程；及び （６）必要に応じてｓｌＤＮＡを分離し、単離する工程
を含む。
【００９９】この方法はＤＮＡ合成のために必要な通常
の成分の全てを含む系で実施される。これらの成分はイ
ンビボでこの方法が実施されるときに本質的に存在し；
この方法をインビトロで実施するときに通常、系に導入
される。
【０１００】この方法は、適当なプライミング部分と、
このプライミング部位から下流の逆方向反復とを有する
ＤＮＡの存在を必要とする。ＤＮＡはＤＮＡ複製を導く
ためのテンプレートとして機能する。プライマーは、Ｄ
ＮＡ鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合
成を開始させるように作用しうるオリゴヌクレオチド
（天然に生成又は合成的の製造）でありうる。ＤＮＡ複
製の開始方法は当然周知である。ワトソン（Watson）、
モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（Mole
cular Biology of the Gene ）、第３版、ダブリュ
・エイ・ベンジャミン社（W. A. Benjamin. Inc.）；Ｄ
ＮＡシンセシス：プレゼント・アンド・フューチャー
（DNA Synthesis : Present and Future ）、モリ
ノイクス（ Molineux ）とコイヤマ（ Kohiyama ）編
集、（１９７７）第Ｖ部、“Ｇ４アンドＳＴ−１ＤＮＡ
シンセシス・イン・ビトロ（Ｇ４ and ST− 1DNA Syn
thesisin Vitro）”ワーカー著；第VII 部、“ＤＮＡ・
シンセシス・イン・パーミアブル・セル・シンセシス・
フロム・サッカロマイセス・セレヴィジュ（DNA Synth
esis in Permeable Cell Systems from Saccharo
myces cerevisiae ）オエルテル（Oertel）とゴーリア
ン（Goulian ）著を参照のこと。第１鎖の合成に寄与す
るポリメラーゼに対して、第２鎖の合成には異なるポリ
メラーゼが寄与する。プライマーはＤＮＡ又はＲＮＡプ
ライマーのいずれでも良い。合成はヌクレオチドと、例
えばＤＮＡポリメラーゼのような重合剤との存在下、適
当な温度及びｐＨにおいて誘導される。
【０１０１】本発明の方法は、テンプレートに沿った鎖
の合成を触媒する酵素のような重合剤を用いる。このた
めの適当な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
ＩもしくはIII 、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ウ（Klenow）フラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）；ウイル
スポリメラーゼがあり、熱安定性酵素をも含まれる。そ
のＤＮＡ複製開始部位を認識するポリメラーゼが適当で
ある。一般に、このプロセスをインビボで実施する場合
に、これらの遺伝要素が存在すると考えられ；インビボ
で実施しない場合又はインビトロで実施する場合には、
これらを系に加えることになる。
【０１０２】開始部位を認識するポリメラーゼは重合を
惹起させる又は重合に寄与する。発明者はこの場合に特
定の理論にしばられるのを望むわけではないが、第１Ｄ
ＮＡ鎖の合成に寄与するポリメラーゼが他方のすなわち
第２ＤＮＡ鎖の合成にも寄与することを除外することは
できない。従って、この方法は第２鎖が第１合成鎖の
５′末端を越えて３′末端において停止するまで、第２
鎖の合成を続けることを含む。このように、ｓｌＤＮＡ
の重複ステムが形成される。
【０１０３】ＤＮＡポリメラーゼについての情報は入手
可能である。例えば、コーンベルグによるＤＮＡレプリ
ケーション（DNA Replication）（ダブリュ・エッチ・
フリーマン・アンド・カンパニー、カリフォルニア州、
サンフランシスコ）、１０１〜１６０頁、第４章、ＤＮ
Ａポリメラーゼ・オブ・イー・コリ（DNA Polymerase
I of E. Coli ）、第５章、アザー・プロカリオテ
ィック・ポリメラーゼズ（Other Procaryotic Polyme
rases ）、第６章、ユーカリオティック・ＤＮＡ・ポリ
メラーゼズ（ Eucaryotic DNA Polymerases ）及び第
７章を参照のこと。
【０１０４】ｃＤＮＡ中の第２鎖合成に有用であるポリ
メラーゼのような、他のポリメラーゼも考えられる。
【０１０５】上記の特定の説明では、ポリメラーゼが２
種類：ＤＮＡポリメラーゼIII とポリメラーゼＩである
ことが考えられる。
【０１０６】もし蛋白質をコードしうる好ましいもしく
は標的となる核酸塩基配列を例えば合成されたｓｌＤＮ
Ａ部分遺伝子として複製することが望ましい場合にはこ
の塩基配列をＩＲの上流に配置する。例えば、複製始点
（ＯＲ）を有する、例えばｐＵＣＫ１０６等のベクター
のような、複製ビークル中で複製が行われる場合には、
標的核酸配列はＩＲとＯＲとの間に位置する。
【０１０７】本発明の方法は、上述したように、プライ
ミング部位と逆方向反復（ＩＲ）すなわち逆配向で存在
する二つの同じ塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメン
トを用いる。ＩＲは塩基配列又は“パリンドローム”と
して存在しうる。
【０１０８】後に述べるように、核酸配列へのランダム
点突然変異の導入を容易にすることが好ましい場合に
は、例えばＲＴのような、ある特定の酵素が特に好まし
い。
【０１０９】第１鎖の合成がｄｓＤＮＡテンプレートに
沿って接触しながら、ＩＲを通って進行して、全プラス
ミドゲノムの複製を生ずる。一定の周期で、ＤＮＡ鎖の
合成はＩＲ内で停止して、それ自体に相補的である塩基
配列の短い部分を形成し、ループを形成し、ＩＲ塩基配
列においてそれ自体にアニールする。新たに合成された
鎖内のこの二重鎖部分は第２鎖又は他のＤＮＡ鎖のプラ
イミング部位として認識される。第２鎖の合成はＤＮＡ
の最初に形成された鎖及び／又は他の親鎖をテンプレー
トとして用いて出発する。従って、テンプレート切換え
が生ずると考えられる。
【０１１０】ヌクレオチドを含むポリメラーゼによって
第２鎖が合成されるので、アニールされた相補的塩基か
らステムが形成され、内部相補性を有する二重構造が生
ずる。
【０１１１】第２鎖の合成は第１合成鎖の第１ヌクレオ
チドをはるかに過ぎて、この第１鎖のＲＮＡプライマー
を通って進行する。第１鎖は結局は減成して、３′−オ
ーバーハングを形成する。一つの特定の説明では、ＤＮ
Ａ合成はダスグプタ（Dasgupta）等、セル（ Call ）５
１、１１１３（１９８７）に述べられている方法と同様
な方法によってｔｅｒＨ部位において停止すると考えら
れる。
【０１１２】適当な処置によって、３′末端オーバーハ
ングの長さは、例えば延ばすように、ｔｅｒＨ部位をプ
ライミング位置から下流へ動かすことによって制御する
ことができる。
【０１１３】さらに、３′末端オーバーハングを有する
ステムの代りに、適当な停止部位、例えばｔｅｒＨをプ
ライミング部位の上流に配置することによって、第１鎖
の端部の前で第２鎖の合成をブロックすることが可能で
あると考えられる。従って、いずれかの鎖が他方に比べ
てかなりの長さで長くなると考えられる。
【０１１４】第２鎖合成が停止したときに、テンプレー
トと形成されたｓｌＤＮＡが分離する。
【０１１５】本発明の方法は望ましい頻度のサイクルで
くり返すことができる。必要な成分のいずれかが欠乏す
ると、必要に応じて補充することができる。
【０１１６】この方法をインビボで実施する場合には、
プライミング部位とこのプライミング部位の下流のＩＲ
とを含む、適当なコンピテント複製ビークルが形成され
る。ＩＲを有するＤＮＡフラグメントは通常、ポリリン
カー塩基配列中に特有の制限部位に挿入される。ポリリ
ンカーがＩＲ（及び対称的制限部位）を有するプラスミ
ドが用いられている。本質的に存在しない場合には、Ｄ
ＮＡフラグメントにＤＮＡ塩基配列へのプライマーが供
給される；ポリメラーゼはビークルに固有であっても固
有でなくても良い。ビークルは複製とｓｌＤＮＡ形成と
に必要な、他の全ての成分を含む。
【０１１７】上述したことから、テンプレートとして役
立つＤＮＡフラグメント、ＩＲ塩基配列、ｓｌＤＮＡを
形成する鎖の複製をプライムし、続けるために必要な要
素を含む自己複製ビークルがｓｌＤＮＡの合成に適する
ことが理解されるであろう。
【０１１８】本発明の他の主要な実施態様は新しいｓｌ
ＤＮＡを形成する。これらの構造はすでに上述した、以
下では補足の説明を述べる。
【０１１９】“ステム−ループ”又は“ｓｌＤＮＡ ”
と名づけられた新しい構造は一重鎖である。ｓｌＤＮＡ
の説明は図５のＥ（ｐＵＣＫ１０６から）と図７（ｐＵ
Ｃ７から）に示す。
【０１２０】典型的なｓｌＤＮＡはアニールされた相補
的塩基の重複二重鎖ステムとステムの２鎖を結合する一
重鎖ヌクレオチドのループとを含む。ループの一重鎖性
は本発明のｓｌＤＮＡのもう一つの興味ある特徴であ
る。ｓｌＤＮＡはヌクレオチドの非常に短い配列または
かなり長い配列のループを含むことができる。ｓｌＤＮ
Ａはループを形成するために充分な長さのヌクレオチド
配列と短い重複二重鎖を形成する塩基対合を含むことが
できる。最小サイズは第２鎖の合成開始のためのプライ
ミング部位を形成するために充分な塩基対合を与えるも
のであるべきである。ループの最小サイズは安定構造に
なるための塩基対合を阻止する塩基上の歪み（strain）
によって限定される。最大サイズはｓｌＤＮＡに予定さ
れた用途によって影響される。図５のＢに図示したルー
プは４塩基からなるが；１０塩基、２０塩基又はそれ以
上の塩基のループも考えられる。ｓｌＤＮＡループの一
重鎖性はｓｌＤＮＡに提案される用途に非常に有用であ
る特徴である。
【０１２１】ｓｌＤＮＡに考えられる他の興味ある構造
は二重体ｓｌＤＮＡである。この構造では、二つのｓｌ
ＤＮＡの一重鎖の自由端部が結合する。この構造は非常
に安定であると期待される。通常ＤＮＡを変性させるよ
うな条件に暴露されると、これらのｓｓＤＮＡはそれら
のオリジナル構造に“スナップ−バック”しがちであ
る。鎖の結合はＤＮＡ及び／又はＲＮＡリガーゼによる
通常の方法によって実施される。このような構造は蛋白
質をコードするための特定の遺伝子をも有し、それによ
って興味ある新しい実用的可能性を提供する。
【０１２２】ｓｌＤＮＡの重要な性質である安定性は重
複端部（tail）が長くなると共に増加する傾向があると
考えられる；従って、このような構造はこのことが強調
されるべき特性である場合に好ましい。同一の複製ビー
クルから形成されるｓｌＤＮＡの全てが必ずしも同じサ
イズでないことに注目すべきである。上記説明では、ｐ
ＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡにおいて、第１鎖の５′
末端は不均一であるように思われ、一部の鎖は＋１位置
（ＣｏｌＥｌ複製の始点に相当）から出発するが〔トミ
ザワ等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザイ・ＵＳ
Ａ、７４、１８８５（１９７７）を参照のこと〕、他の
鎖は、−１，＋２，＋３から出発する。従って、ＤＮＡ
は類似したｓｌＤＮＡの類と見なすことができる。
【０１２３】ＤＮＡフラグメント内にＩＲを越えて一つ
以上の不適正が存在することがｓｌＤＮＡの合成にも構
造にも不利な影響を与えないことが認められる。このこ
とはこの場合にパリンドロームの中心から２５ヌクレオ
チド離れたＧに対する不適正Ｔによって説明される（図
２参照）。この不適正はｓｌＤＮＡの合成において修復
された。
【０１２４】端部の１未満の他方の末端をこえたｓｓＤ
ＮＡオーバーハングを利用した、本発明のｓｌＤＮＡの
幾つかの用途が提案される。それ故、このことが本発明
の新しい構造の重要な特徴であることは理解されよう。
【０１２５】図示したプラスミド内のｓｌＤＮＡの合成
は本発明の最も良い形式（mode）を説明する。
【０１２６】しかし、ＩＲとここに述べる他の成分とを
含むベクターはｓｌＤＮＡの合成に適切である。
【０１２７】ＩＲは原核生物と真核生物にしばしば出現
する構造である。このようなＩＲは本発明に使用可能で
ある。ＩＲ塩基配列は合成的に製造することもできる。
１例は図２に示す合成ＩＲである。
【０１２８】ＩＲの塩基配列又はパリンドローム塩基配
列は大腸菌から得られている〔ギルソン（Gilson）等、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１８、３９４１（１
９９０）〕；ギルソン等のヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ１９、１３７５（１９９１）は大腸菌とサルモネ
ラエンテリチカ（Salmonella enteritica）からのパリ
ンドローム塩基配列を報告している（パリンドローム単
位配列４０ヌクレオチド長さ）。チャルカー（Chalher
）等のジーン（Gene）７１、（１）：２０１−５（１
９８８）は大腸菌における５７１−ｂｐパリンドローム
の増殖を報告している；逆方向反復はルイス（ Lewis）
等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J. Mol. Biol）（イングランド）２１５、（１）：７
３〜８４（１９９０）によって枯草菌（Bacillus subt
ilis）において報告されている（２６−塩基対反復）、
サウリン（Saurin）のコンピュータ・アプリケーション
ズ・イン・ザ・バイオサイエンシーズ（Comput. Appl.
Biosci. ）３、（２）：１２１−７（１９８７）は大腸
菌における反復パリンドローム構造を系統的に研究する
ための新しいコンピュータプログラムの使用を考察して
いる。下記米国特許はポリドンローム塩基配列を開示す
る：第４９７５３７６号；第４８６３８５８号；第４８
４０９０１号；第４７４６６０９号；第４７１９１７９
号；第４６９３９８０号及び第４６９３９７９号。
【０１２９】ｓｌＤＮＡは、その当該使用目的に即し
て、様々な長さのループならびにステムを、尾部（すな
わち３′末端あるいは５′末端のオーバーハング部）と
ともに有するよう構築することができる。ステムは、塩
基１００個、好ましくは３００個から５０００個以上、
好ましくは約４０００個の鎖長となるよう構築すること
ができる。一方の末端からもう一方の末端がさらに延び
ているオーバーハング部は、ヌクレオチド１５〜１８
個、あるいは１５〜３０個といった比較的短い鎖長か
ら、塩基約５０〜１００個、あるいはそれ以上の比較的
長い鎖長までの範囲とすることができる。一本鎖のオー
バーハング部は、ＤＮＡアンチジーン断片を含んでいる
可能性があるので、３′あるいは５′末端の尾部のオー
バーハング部は、ＤＮＡアンチジーン断片の鎖長に対し
て合理的な鎖長となるようにして、アンチジーン断片が
必要に応じてアンチセンスあるいは三重らせんとして機
能しうるようにするのが一般に好ましい。ｓｌＤＮＡの
ループの鎖長を決定する際にも、同様のことを考慮する
のが好ましい。塩基４個から８０個の鎖長のループを想
定しうるものの、実施するうえでは、他の条件も勘案し
て、塩基４０個から６０個のループが好ましい。
【０１３０】パリンドロームは殆ど同じ（必ずしも同一
ではない）塩基配列が逆方向にランする逆方向反復を含
むと定義されている。一部は短いが（一方向に３〜１０
塩基）、他の配列は数百の塩基対を含めて、非常に長
い。ワトソン（Watson）、モレキュラー・バイオロジー
・オブ・ザ・ジーン第３版、２２４〜２２５頁。
【０１３１】ＤＮＡフラグメント中のＩＲはサイズがか
なり変化しうる。限定するわけではなく、１０から３０
以上のヌクレオチドの逆方向反復を含むｓｌＤＮＡが考
えられる。逆方向反復は３００を越えるｂｐを含むと報
告されている。カレント プロトコール（Current Pro
tocols）、セクション１．４．１０．
【０１３２】ｓｌＤＮＡは原核生物又は真核生物のホス
ト発現（例えば細菌、酵母及び哺乳動物細胞）の合成生
成物であり得る。
【０１３３】プラスミドのような適当なベクターの例と
これによって形質転換されるホスト細胞は、当業者に周
知である。必要な成分を有するプラスミドの適当なホス
トには、原核生物と真核生物とが存在する。原核生物
は、例えばエシエリキア（Escherichia ）属、特に大腸
菌；バチルス（Bacillus）属；特に枯草菌のような微細
物を含む。真核生物は、例えば酵母、動物、植物等であ
り、動物細胞、植物細胞等のような微細物を含む。
【０１３４】大腸菌を形質転換することのできるプラス
ミドは、例えばｐＵＣ型とＣｏｌＥｌ型プラスミドがあ
る。米国特許第４９１０１４１号参照、大腸菌を形質転
換することができるプラスミドは例えば、一般にＣｏｌ
Ｅｌ型プラスミドを含む。大腸菌の形質転換に適当な、
他のプラスミドを下記に挙げる：ｐＳＣ１０１、ｐＳＦ
２１２４、ｐＭＢ８、ｐＭＢ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐ
ＡＣＹＣ１７７、ｐＣＫ１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３１２、ｐ
ＢＲ３１３、ｐＭＬ２、ｐＭＬ２１、ＣｏｌＥｌＡＰ、
ＲＳＦ１０１０、ｐＶＨ５１、ｐＶＨ１５３。
【０１３５】枯草菌を形質転換することのできるプラス
ミドを下記に挙げる：ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２
２３、ｐＵＢ１１２、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４、ｐＵＢ
１１０、ｐＳＡ０５０１、ｐＳＡ２１００、ｐＴＰ４、
ｐＴＰ５及びこれらの誘導体。
【０１３６】枯草菌と大腸菌の両方を形質転換すること
のできるプラスミドは、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）１４５、４２２〜４２８（１
９８２）；プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳ
Ａ、７５、１４３３〜１４３６（１９７８）及びプリン
シプルズ・オブ・ジーン・マニピュレーション（Princi
ples of Gene Manipulation）第２版、カル（ Carr
）等編集、カリフォルニア大学出版局（バークレ
イ）、１９８１、４８頁に述べられている。
【０１３７】真核生物においてｓｌＤＮＡ合成を実施す
るために特に重要であるのは、サッカロマイセス・セレ
ヴィジェを形質転換することのできるプラスミド：ｐＭ
Ｐ７８、ＹＥｐ１３、ｐＢＴＩ１、ｐＬＣ５４４、ＹＥ
ｐ２、ＹＲｐ１７、ｐＲＢ８（ＹＩｐ３０）、ｐＢＴ１
７、ｐＢＴ１９、ｐＢＴ１１０、ｐＡＣ１、ｐＳＬｅ
１、ｐＪＤＢ２１９、ｐＤＢ２４８及びＹＲｐ７であ
る。ＹＩｐ５、ｐＵＣ−ＵＲＡ３、ｐＵＣ−ＬＵＥ２及
びｐＵＣ−ＨＩＳ３も考えられる。メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology ）１９４
巻、２８５、３７３〜３７８頁「ガイド・トゥ・イース
ト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロ
ジー（Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology ）」、グスリー（Guthrie ）とフィンク（Fen
k）編集（１９９１）、アカデミック プレス社（Acade
mic Press. Inc.）を参照のこと。他の酵母ベクター
はエクスペリメンタル・マニピュレーション・オブ・ジ
ーン・イクスプレッション（Experimental Manipulati
onof Gene Expression）イノウエ マサヨリ（Masayo
riInouye）編集、アカデミック プレス社（１９８
３）、１００〜１０４頁に述べられている。
【０１３８】さらに、大腸菌ならびに例えばエス・セレ
ヴィジェのような酵母の形質転換に用いることができる
シャトルベクターが特に重要である。このようなベクタ
ーはｐｋｂ４２とｐＹＣ１を含む。他の例はア・プラク
ティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング
（A Practical Guide to Molecular Cloning ）ベ
ルナード ペルバル（Bernard Perbal ）による第２版
（ウイリーアンドサンズ）中の“コスミド・ベクター・
フォー・ロー・アンド・ハイカー・ユーカリオーツ（ C
osmid Vector for Low and Hiher Eucaryotes）”
に関するセクションに挙げられている。他の適当なベク
ターはカレント プロトコール、２巻、セクション１
３．４．１、１３．４．２（１９８９）に述べられる。
他の適当なビークルはＹＥｐ２４〔ボトシュタイン（Bo
tstein）等、ジーン、８、１７（１８７９）〕とｐＪＤ
Ｂ２０７〔ベッグ（Beggs ）、ゲネチック エンジニヤ
リング（Genetic Engineering）（ウィリアムソン（Wi
lliamson）編集）２巻、１７５頁、アカデミック プレ
ス（１９８２）のような、一般のマルチコピーベクター
を含む。選択可能な、他のベクターは、ＹＥｐ５１、Ｙ
Ｅｐ５２、ｐＹＥＳ２のようなＹＥｐクラスのプラスミ
ドを含む。
【０１３９】本発明の実施するための商業的に入手可能
な真核ベクターの例は、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅ
Ｌａ細胞におけるｐＳＶＬとｐＫＳＶ−１０である。他
の例はア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラ
ー・クローニングに挙げられている。
【０１４０】こうした複製可能な遺伝的ビークルは、ビ
ークルの複製に適した遺伝的要素、たとえばビークルの
複製起点、プロモーターなどを含んでいるので、本明細
書に記載する逆方向反復配列をはじめとする要素が挿入
されると、ｓｌＤＮＡが発現されることとなる。しか
し、本明細書に記載する本発明の改善策、すなわちｓｌ
ＤＮＡの過剰発現においては、ｓｌＤＮＡの合成ならび
に生成は、ビークルの複製を支配している要素とは異な
った、すなわち、ビークルの複製を支配している要素と
は異なる要素に対して応答あるいは作動する独立に誘導
可能なプロモーターおよび遺伝的要素によって、ビーク
ル、たとえばベクターの複製とは独立に制御するのが好
適である。
【０１４１】形質転換ホストの培養と発酵は技術上公知
の標準的な一般方法によって実施される。例えば、メソ
ッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、ジーン・エ
クスプレッション・テクノロジー（Gene Expression
Technology）〔編集者ゴッデル（Goeddel ）〕１９９０
（特に、グロス・オブ・セル・ラインズ（Groth ofCel
l Lines））を参照、酵母に関しては、メソッズ イン
エンザイモロジー、１９４巻、ガイド・トゥ・イース
ト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロ
ジーを参照；大腸菌の増殖条件は、カレント プロトコ
ール インモレキュラー バイオロジー（Current Pro
tocols in Molecular Biology）、１巻、１．１．
１、１．１．２、１．１．３、１．１．４、１．３．１
頁及びモレキュラー クローニング：ア ラボラトリー
マニュアル（MoloecularCloning ：A Laboratory M
anual ）第２版、１．２１頁に述べられており、プラス
ミドＤＮＡの精製は、１．２３頁に述べられており、哺
乳動物細胞に適した培養増殖条件がカレント プロトコ
ール、１巻と２巻、９．０．４〜９．０．６、９．１、
９．１．２、９．１．３、９．２．５、９．４．３、１
１．５．２、１１．６．２及び１１．７．３頁に述べら
れている。
【０１４２】要約すると、一重第１鎖の複製開始と合成
のために必要な成分、すなわち開始部位を含むＤＮＡテ
ンプレートフラグメントとＩＲ（及びポリメラーゼ）を
複製ビークル中に供給すると、ｓｌＤＮＡが形成される
と期待される。
【０１４３】本発明のｓｌＤＮＡの合成をインビトロで
実施する場合に、合成はテンプレートとしてＤＮＡフラ
グメントを用いるヌクレオチド鎖の合成のための通常の
成分を含む培質中で実施する。一般に、合成は好ましく
はｐＨ７〜９の緩衝化水溶液中で行われる。ＤＮＡテン
プレート鎖上にモル過剰量のオリゴヌクレオチドが存在
することが好ましい、デオキシリボヌクレオシド三リン
酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰも合成混合
物の成分である。溶液を加熱し、次に冷却する。次にポ
リメラーゼを加えると、合成が進行する。これらの成分
はここに述べる本発明のための「通常成分」と呼ばれ
る。
【０１４４】オリゴヌクレオチド合成は、米国特許第４
４１５７３４号と、マットイシ（Matteuci）等ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J.
Am.Chem. Soc. ）１０３（１１）：３１８５〜３１９
１頁（１９８１）；アダムス（Adams ）等、ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー１０５
（３）：６６１〜６６３頁（１９８３）；及びベムケー
ジ（Bemcage ）等、テトラヘドロン レタース（Tetrah
edron Letters）２２（２０）：１８５９〜１８６７
（１９８１）に述べられている。
【０１４５】本発明の方法は遺伝子工学の技術と分子ク
ローニングを利用する。遺伝子工学の一般的技術と分子
クローニングは下記文献に含まれる：サムブロック（Sa
mbrook）等、モノキュラー クローニング：ア ラボラ
トリー マニュアル、第２版、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Labo
ratory）、１９９０、ア・プラクティカル・ガイド・ト
ゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guid
e to Molecular Cloning ）、第２版、バーナード
ペルバル（１９８８）；メソッズ イン エンザイモロ
ジー、６８巻、リコンビナントＤＮＡ（Recombinant D
NA）〔ウー（Wu）編集者〕、アカデミック プレス、N.
Y. 、１９７９；メソッズ イン エンザイモロジー、
１８５巻、ジーン・エクスプレッション・テクノロジー
（Gene Expression Technology）〔ゴエデル（Goedde
l ）編集者〕１９９０、カレント プロトコールス イ
ンモレキュラー バイオロジー、１，２及び３巻。
【０１４６】本発明のｓｌＤＮＡは幾つかの重要な用途
を有する。本発明の方法は特定の遺伝子にランダム突然
変異を導入するために利用することができる。このよう
な系は形質転換ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの遺
伝子を示す図７に説明される。
【０１４７】この方法は、ステム中の配置された重要な
遺伝子を含むｓｌＤＮＡの合成、ｓｌＤＮＡの単離、ｓ
ｌＤＮＡから遺伝子の切断、適当な複製ビークルへのそ
れのクローニング及びその遺伝子によってコードされる
蛋白質の表現を含む。蛋白質は目的の活性に関して試験
することができる。標準方法によって、コロニーを検査
して、突然変異遺伝子を有するコロニーを確認すること
ができる。
【０１４８】突然変異の発生と確認の説明は次のように
進める。ｌａｃＺ遺伝子を収容するｐＵＣＫ１９（実施
例１参照）中に、ＤＮＡフラグメントとＯＲ（実施例１
に示す）との間に３５ｂｐＩＲ（実施例に説明）を含む
前出の配列表の配列番号１及び２で構成され、図２で示
す２１５ｂｐＤＮＡフラグメントを結合させる。このプ
ラスミドを標準条件下で増殖するコンピテント大腸菌Ｃ
Ｌ８３に形質転換させる。その後、ｓｌＤＮＡを単離
し、ｌａｃＺ遺伝子を切断して、ｐＵＣ１９中（ＩＲ含
有フラグメントをもっていない）に挿入する。次いでこ
のプラスミドを大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。突然
変異の頻度をβ−ｇａｌ、無色基質を用いて公知のイン
ビボ試験によって評価する、前記無色基質は加水分解さ
れると暗青色生成物を生ずる。コロニーが無色である場
合には、このことがβ−ガラクトシダーゼが製造されな
いことを示唆する。
【０１４９】ｌａｃ遺伝子類の他の遺伝子、例えばｌａ
ｃＹもしくはｌａｃＡ又は他の適当な遺伝子をこのスク
リーニング試験に用いることができる。重要な蛋白質
（又はポリペプチド）をコードする遺伝子も、突然変異
の頻度決定と、誘導蛋白質（又はポリペプチド）をコー
ドする適当な遺伝子の選択とに用いることができる。
【０１５０】スクリーニング方法は標的遺伝子に突然変
異を導入し、突然変異率を増加させやすい、ポリメラー
ゼの選択を可能にする。従って、例えばｌａｃＺ遺伝子
のような適当な遺伝子をスクリーニング遺伝子として用
いることができる。複製確実度（replication fidelit
y ）の低いことが知られる逆転写酵素は目的蛋白質をコ
ードする標的遺伝子に突然変異を導入するために選択す
べき酵素であるように思われる。
【０１５１】好ましい標的蛋白質は、好ましい生物学的
性質のために選択された、突然変異遺伝子を有する、特
定のコンピテント形質転換ホストによって表現される。
【０１５２】突然変異の頻度は、複製における確実度の
低いことが知られる適当な酵素を選択することによって
影響されやすいと考えられる。従って、標的ＤＮＡフラ
グメント又は遺伝子を増幅する場合に、系は複製確実度
又は不確実度すなわち挿入ＤＮＡフラグメント又は遺伝
子の複製におけるＤＮＡポリメラーゼによってなされる
エラー（error ）頻度に依存する。このようにして、各
複製エラーに対してランダム突然変異が遺伝子に導入さ
れる。ＤＮＡポリメラーゼの不確実度が高ければ高いほ
ど、突然変異遺伝子類は大きくなる（この逆もいえ
る）。
【０１５３】ＰｏｌIII とＰｏｌＩとが有効であると考
えられる本発明の上記実施態様の一つでは、ＰｏｌＩが
自己修正機能を有することが知られているので、Ｐｏｌ
IIが低い確実性を有すると考えられる。このようにし
て、系の複製確実度はＤＮＡポリメラーゼの適当な選択
によって調節することができる。一般に、ランダム突然
変異は第２鎖を合成するポリメラーゼによって導入され
やすいと考えられる。興味ある候補ポリメラーゼはＲＴ
である。
【０１５４】好ましい突然変異を有する遺伝子は染色体
交差（chromosomal crossover）に有用である。この方
法によって、重要な遺伝子又は突然変異遺伝子を有する
ｓｌＤＮＡを用いて、同種の一つの分子からもう一つの
分子への遺伝情報を融和させ、交換することができる。
突然変異遺伝子はゲノム内にベクター塩基配列に類似し
た塩基配列を配置し、相同な遺伝子が突然変異遺伝子に
よって複製される。
【０１５５】このようにして、突然変異遺伝子を含み、
好ましい蛋白質を表現する微生物の新しい系統が発生す
ることができる。突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡは
インビトロ又はインビボで製造することができる。
【０１５６】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡ
の特定セグメントをインビトロ酵素増幅するための迅速
手段である。標準ＰＣＲ方法は増幅すべき二重鎖ＤＮＡ
セグメント、セグメントと側面を接する常に二つの一重
鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラー
ゼ、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、バッファー及び塩を必要とする。カレント プロ
トコール セクション１５参照のこと。
【０１５７】本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡは単一プライマ
ーによって増幅することができる。この特徴は増幅をか
なり簡単化し、プライマーがその適当な複製開始部位を
見出す問題の解決を助け、これをさらに経済的にし、従
来のＰＣＲ方法に付随する問題の解決を助ける。
【０１５８】ｓｌＤＮＡの増幅はｓｌＤＮＡを変性し
て、一重鎖ＤＮＡ（３′から５′末端まで）を形成する
ことを含む。この反応は通常の順序：３′末端からのプ
ライミング、ポリメラーゼ反応、変性とアニーリングに
従って行われる。これが２５サイクル実施されると、ｓ
ｌＤＮＡの１００万倍増幅が生ずる。ｓｌＤＮＡは標的
蛋白質をコードする遺伝子を有することができる。
【０１５９】エルリッヒ（Erlich）等による“リーセン
ト・アドバンシーズ・イン・ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション（Recent Advances in Polymerase Ch
ainReaction ）”なるタイトルのサイエンス（Science
）２５２、１６４３〜１６５０（１９９１年６月２１
日）内の最近の報告はプライマーに関連する問題と、Ｐ
ＣＲ方法に提案されている改良とを考察している。
【０１６０】従って、本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡ構造を
１プライマーを用いる方法によって増幅する方法は非常
に重要である。ｓｌＤＮＡは例えば改良された生物学的
特性を有する突然変異遺伝子のような、重要な遺伝子を
有することができる。
【０１６１】本発明のｓｌＤＮＡのインビボ製造は目的
の塩基配列を形成するように操作されることができる。
このようにして製造されたｓｌＤＮＡを次に、アンチセ
ンス（antisense ）ＤＮＡとして用いることができる。
【０１６２】現在考えられている魅力的な用途は、本発
明のｓｌＤＮＡが三重鎖らせんＤＮＡ、すなわち三重鎖
ＤＮＡを形成し、結果としての新しい三重鎖ｓｌＤＮＡ
の形成に果たす役割である。サイエンス、２５２、１３
７４〜１３７５（１９９１年６月２７日）における最近
の報告、“トリプレックス・ＤＮＡ・ファイナリー・カ
ムズ・オブ・エイジ（Triplex DNA Finally Comes
of Age ）”は本発明の適時性を強調している。三重鎖
ＤＮＡは第３鎖を染色体ＤＮＡ上の特定認識部位に結合
させることによって製造することができる。好ましくは
塩基の完全量（full complement）（例えば１１〜１５
以上）を含むサイズの合成鎖を検討している。長い３′
（又は５′）末端（及び非重複塩基のループ）を有する
本発明のｓｌＤＮＡは良好な候補であるように思われ
る。結果として生ずる三重鎖ＤＮＡは大きな安定性と有
用性とを有するように思われる。ＡＩＤＳ療法、選択的
遺伝子阻害等を含めた三重鎖らせん形成に基づく新しい
療法がこの報告に提案されている。
【０１６３】本発明の重要な実施態様の一つでは、ｓｌ
ＤＮＡは、その一本鎖部分に、アンチセンス断片あるい
は三重らせん形成能をもつ配列として遺伝子機能を調節
するＤＮＡ配列であるアンチジーンを有している。
【０１６４】アンチセンス配列、三重鎖形成配列等の遺
伝子制御配列（以下、アンチジーンと称す）を有するｓ
ｌＤＮＡはインビボの系において遺伝子制御ＤＮＡとし
て生成、利用できる。
【０１６５】生命現象はその根元をたどると遺伝子に組
み込まれた情報によってつかさどられているので、その
遺伝子に何らかの方法で直接働きかけることは特定の遺
伝子の発現制御をするうえで最も効果的な手法である。
遺伝子工学的手法で遺伝子の発現制御する方法としてア
ンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、それに三重鎖
形成能をもつ核酸等を使用する方法が知られている。ア
ンチセンスＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡに関しては、
ターゲット遺伝子から生産されるメッセンジャーＲＮＡ
と相補的な配列を持つＲＮＡ又はＤＮＡを細胞内に供給
することによりメッセンジャーＲＮＡとアニーリング
し、部分的に二重鎖の核酸を形成し、メッセンジャーＲ
ＮＡから蛋白へと翻訳されるのを阻害する。このアンチ
センスＲＮＡは適当なプロモーターによって細胞内で生
産させることができるが、アンチセンスＤＮＡは一重鎖
ＤＮＡであるがゆえにインビボでの生産は難しく、合成
したＤＮＡをアンチセンスＤＮＡとして細胞の外から供
給し、遺伝子制御効果を見るにとどまっている。
【０１６６】次に三重鎖ＤＮＡ形成能を持つ核酸に関し
て述べると、例えばプリン塩基（ＧあるいはＡ）、他方
に相補的なピリミジン塩基（ＣあるいはＴ）が並んだ二
重鎖のポリプリン、ポリピリミジン配列に対してはHoog
steen 型の結合を介して三本目の鎖が形成し、部分的に
三重鎖になることが知られている。この三本目の鎖が三
重鎖形成能を持つ核酸であり、遺伝子の制御ばかりでは
なく遺伝子工学的にも様々な応用例が提唱されている。
しかし、実際に遺伝子の発現の調節という観点から治療
法へと結びつけるにあたり、この三重鎖形成能を持つ核
酸を細胞内で生産させることはアンチセンスＤＮＡ同様
難しく、合成ＤＮＡを細胞の外から供給し遺伝子制御の
効果を見るにとどまっている。
【０１６７】インビトロの系においてアンチセンスＤＮ
Ａ、三重鎖形成能を持つＤＮＡを生成させることは、最
近のＤＮＡ合成機の進歩によってもはや簡単に作ること
ができるようになった。しかし、インビボの系において
このような一重鎖ＤＮＡを人為的に生産させることはｍ
ｓＤＮＡを除いて知られていない。しかし、ｍｓＤＮＡ
は細胞内でmRNAを生成させ逆転写酵素によって一重鎖ｃ
ＤＮＡを合成するもので、その生成過程の複雑さから応
用面に至ることが非常に難しい。
【０１６８】一方、アンチジーンを有するｓｌＤＮＡは
インビボで生成させるにあたりｍＲＮＡの中間体を介さ
ずに直接二重鎖のＤＮＡから一重鎖ＤＮＡを生成させ、
それを遺伝子制御に応用させ得る。
【０１６９】遺伝子が複製する際にその複製方向の途中
に逆方向反復配列（ＩＲ配列）が存在すると、第一鎖Ｄ
ＮＡ合成がそのＩＲ配列内でそれまで鋳型としていたＤ
ＮＡとは別の同じＩＲ配列を持つ鋳型ＤＮＡとアニーリ
ングし、そこから第二鎖のＤＮＡ合成が始まり複製開始
点に向かって合成が進む。そして適当な転写終結部位に
おいてＤＮＡ合成が終わり、第一鎖ＤＮＡ合成の際に鋳
型とした遺伝子からｓｌＤＮＡとして遊離する。ｓｌＤ
ＮＡはループを形成している部分及び３′末端または
５′末端が一重鎖構造を有していて、アンチセンスＤＮ
Ａまたは三重鎖形成能を持つＤＮＡはこれらの部位にそ
の塩基配列を入れることができる。すると遺伝子が複製
する過程においてこれらアンチジーンの配列を持つｓｌ
ＤＮＡが生成され、インビボの系においてもアンチセン
スＤＮＡ、または三重鎖形成能を持つ一重鎖ＤＮＡを生
成させることができる。
【０１７０】アンチセンスＤＮＡ配列を持つｓｌＤＮＡ
はターゲットのＲＮＡとアニーリングし、その遺伝子機
能を阻害するばかりでなく、アンチセンスＤＮＡを持つ
ｓｌＤＮＡとアニーリングしたターゲットＲＮＡは通常
細胞内に内在するＲＮａｓｅＨによって分解されてい
く。
【０１７１】三重鎖形成能を持つＤＮＡを含むｓｌＤＮ
Ａも遺伝子が複製する際ｓｌＤＮＡとして生産されるの
でインビボで常時三重鎖形成能を持つ一重鎖ＤＮＡが生
産され、該ＤＮＡによるターゲット遺伝子の二重鎖ＤＮ
Ａの制御が可能となる。
【０１７２】次に、実際にアンチセンスＤＮＡまたは三
重鎖形成能を持つＤＮＡといったアンチジーンをｓｌＤ
ＮＡ内に組み込み、発現させる方法について詳細に説明
する。
【０１７３】まずｓｌＤＮＡのループ内にアンチジーン
を入れるには、例えばプラスミドを用いてｓｌＤＮＡを
生成させる場合にはプラスミドの複製方向の途中にＩＲ
配列を挿入し、アンチジーン配列は二つの反復配列の間
にクローニングすればよい。そしてこのプラスミドで細
胞を形質転換することによって、このプラスミドを持つ
細胞はプラスミドが複製する際にアンチジーンを持つｓ
ｌＤＮＡを生産し続ける。
【０１７４】またｓｌＤＮＡはその生産過程において、
５′末端のプライミング位置と転写終結部位とが異なる
場合が多く、５′末端または３′末端が突出した構造を
とっている。そこでこの突出した部分にアンチジーンを
挿入することができる。ｓｌＤＮＡの３′末端または
５′末端の突出した部分にアンチジーンの入ったｓｌＤ
ＮＡを生産させるには、ＩＲ配列を含むプラスミドのｓ
ｌＤＮＡが複製を開始する部分と転写終結する部分の間
にアンチジーンの配列をクローニングすればよい。そし
てこのプラスミドで細胞を形質転換しｓｌＤＮＡを生産
させると、ｓｌＤＮＡの５′末端または３′末端のいず
れか突出した部分にアンチジーンの配列の入った一重鎖
ＤＮＡが生成する。
【０１７５】ｓｌＤＮＡは原核生物である大腸菌で発見
されたが、真核生物である酵母においてもｓｌＤＮＡは
生産され、アンチジーンを持つｓｌＤＮＡが様々な真核
細胞（例えば動物細胞）においても生産され、遺伝子制
御に用いることができる。
【０１７６】本発明が技術と科学に有為な貢献をするこ
とは認められるであろう。
【０１７７】以上に述べたように、ｓｌＤＮＡは価値あ
る遺伝的構築物である。したがって、こうしたｓｌＤＮ
Ａを、これまで達成しえなかった収率で生成するという
重要な必要性が存在するのである。
【０１７８】本発明は、ｓｌＤＮＡを高収率で発現する
方法ならびに遺伝的構築物を提供するものである。従来
記載されてきた態様の方法では、組換え型ＤＮＡのビー
クルの複製起点からの複製を開始するプライマーの内在
的レベルによって、ｓｌＤＮＡの生成レベルが決定かつ
制限されていた。本発明のこの実施態様では、最良の結
果をうるべく、組換え型ＤＮＡ構築物が、ビークルの複
製を制御する遺伝的要素とは独立に作動する一群の要素
を含む系を構築した。この系、すなわち一群の要素で
は、ｓｌＤＮＡ合成に関わるプライマーの細胞でのソベ
ルが劇的に上昇しているので、価値あるｓｌＤＮＡの合
成が高率で開始され、高収率で発現される。
【０１７９】ｓｌＤＮＡは原核生物あるいは真核生物で
発現させることができる。細胞の発現方法は、ｓｌＤＮ
Ａの発現を誘導しうる、組換え型ＤＮＡが自己複製可能
なビークルで形質転換した原核生物あるいは真核生物の
宿主を培養する工程からなるものである。この組換え型
ＤＮＡビークルは、以下の要素が作動可能に連結された
ものである。すなわち、このビークルは、誘導可能なプ
ロモーター、好ましくは強力なプロモーター−オペレー
ターをコードするＤＮＡ配列を含んでおり、この誘導可
能なプロモーターが誘導されると、ＲＮＡプライマーあ
るいはタンパク質、たとえばプライマーゼのような酵素
が生成され、このＲＮＡプライマーあるいはタンパク質
が、宿主細胞に内在する適当な基質ならびにＤＮＡポリ
メラーゼを利用したｓｌＤＮＡの合成を開始するべく機
能する。さらに、このビークルは、ＲＮＡプライマーあ
るいはプライマーゼをコードしているＤＮＡ配列の下流
側に、逆方向反復配列を有している。さらに、この組換
え型ＤＮＡビークルは、ＤＮＡビークル自体の複製に際
して機能する複製起点、ならびに選択を可能とするマー
カー、たとえば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝
子を有している。
【０１８０】本発明の好適実施態様では、ｓｌＤＮＡの
合成の開始は、組換え型ＤＮＡビークルの複製に付随、
あるいは依存するものではない。しかし、本発明は、ｓ
ｌＤＮＡの合成を開始するプライマーがプラスミドの複
製も開始するように組換え型ＤＮＡビークルを構築する
ことも包含するものである。
【０１８１】一本鎖部分にアンチジーン断片を含むｓｌ
ＤＮＡを過剰発現させようとする場合には、複製可能な
ビークルは、二つの反対向きの逆方向反復配列の間、あ
るいはｓｌＤＮＡの合成開始に際して使用されるプライ
ミング部位と逆方向反復配列との間にアンチジーン断片
を有するものとする。かくして、アンチジーン断片を保
持するｓｌＤＮＡが高収率で生成されることとなる。
【０１８２】ＲＮＡプライマーあるいはプライマーゼタ
ンパク質をコードしているＤＮＡ断片の発現を誘導する
うえで有用な誘導可能なプロモーターとしては、たとえ
ば、ＳＶ４０の初期あるいは後期プロモーター、ｌａｃ
プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃあるいはＴ
ＲＣプロモーター、λファージの主要なプロモーター、
たとえばλｐｌ、λｐｒなど、ｆｄコートタンパク質の
プロモーター、ｅ−ホスホグリセレートキナーゼ等の解
糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモータ
ー、酵母交配因子のプロモーターをはじめとする、真核
生物あるいは原核生物の細胞、またはそれらのウイルス
の遺伝子の発現を制御していることが既知の種々の配列
を挙げることができる。ｓｌＤＮＡを哺乳動物の細胞で
発現しようとする場合には、遺伝子をデヒドロ葉酸還元
酵素をコードしている遺伝子に結合し、所望の遺伝子を
増幅することとなる細胞の選択を行うことによって、発
現単位を増幅することも可能である。
【０１８３】有用なプロモーターは、適当な誘導物質で
誘導することが可能である。たとえば、ｌａｃならびに
ｔａｃプロモーターは、ＩＰＴＧで誘導され、λｐｌあ
るいはλｐｒプロモーターの発現を誘導する際には、マ
リディクシック（malidixic）酸が一般に使用される。
こうした組み合わせは、当業界で他にも公知である。た
とえば、下記で引用するコーンバーグ（Kornberg）の
「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、な
らびに「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular
Biology ）」、アウスベット（Ausubet ）ら、ジョン
・ウィリー・アンド・サンズ社（John Wiley ＆Sons，
Inc.）、１９９４（「カレント・プロトコール（Curren
t Protocols）」）を参照されたい。
【０１８４】真核生物、たとえば上述のような酵母細
胞、あるいは哺乳動物の細胞中でｓｌＤＮＡを過剰発現
しようとする場合には、酵母細胞の複製系がｓｌＤＮＡ
の合成系とは分離され、酵母細胞から発現されるｓｌＤ
ＮＡが、酵母細胞の複製より高レベルかつ高速に、しか
も酵母細胞の複製とは独立に発現される、上述のような
プロトコールを使用するものである。各種の適切な技
法、ならびに酵母の分子生物学については、「ガイド・
トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラ
ー・バイオロジー（Guide to Yeast Genetics and
Molecular Biology ）」、ガスリーら（Guthrie お
よび Fink ）編、アカデミック・プレス社（Academic
Press ，Inc.）、ならびにメソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（ Methods in Enzymology）、１９４巻、１９
９１をはじめとする本明細書に引用した参考文献を参照
されたい。また、「エキスペリメンタル・マニピュレー
ション・オブ・ジーン・エキスプレッション（Experime
ntal Manipulation of GeneExpression）」、井上
（ Masayori Inouye）編、アカデミック・プレス（Acad
emic Press ）、１９８３の全体ならびに第５章、「ベ
クターズ・フォー・ハイ・レベル，インダストリアル・
エキスプレッション・オブ・クローンド・ジーンズ・イ
ン・イースト（Vectors for High Level , Inducibl
e Expression ofCloned Genes in Yeast ）」も参
照されたい。
【０１８５】図１７および１８は、本発明の好適な構築
物を構成するプロトコールを例示するものである。図１
７に示すように、ｓｌＤＮＡの合成を開始するべく機能
するプライミング部位は、プラスミド、たとえば図１７
のｐＵＣ１９の複製起点から誘導される。しかし、その
最終形態では、このプライミング部位が、ｓｌＤＮＡを
コードする組換え型ＤＮＡビークルの複製において機能
することはなく、組換え型ＤＮＡビークルはそれ自身の
機能的な複製起点を有している。
【０１８６】他の複製起点を使用してｓｌＤＮＡの合成
を誘導することもでき、例としては、ｐＭＢ１、Ｃｏｌ
Ｅｌ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、
Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、Ｒｔｓ１、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥ
II、ＣｏｌＥIII 、ｐ１５Ａ、Ｔ４バクテリオファー
ジ、Ｔ７バクテリオファージ、ＲＳＦ１０３０、ｐＢ
Ｒ、ならびにｐＵＣを挙げることができる。
【０１８７】当業界でも周知のように、こうした複製起
点の中には、効率良く作用するうえでタンパク質を必要
とするものがある。合成開始のプライミング部位がこう
した複製起点に由来する場合に、誘導可能なプロモータ
ーを、こうした状況において、この種のタンパク質の発
現を誘導しうるものとすることも、本発明の範囲に包含
される。本発明は、フライミング部位を、図１７に示し
た以外の複製起点から誘導する場合も包含するものであ
る。使用が可能な図１７以外の複製起点としては、ｐＭ
Ｂ１、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ
Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、ＲＴｓｌ、ＲＫ２、Ｐ
１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、ｐ１５Ａ、ＲＤＦ１０
３０、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファー
ジ、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣがある。また、本発明は、
組換え型ＤＮＡビークルの複製を誘導する機能的複製起
点を、図１７に示したｐ１５Ａ以外のものとすることも
包含するものであり、こうした複製起点としては、ｐＭ
ＢＩ、ＣｏｌＥl 、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ
Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、ＲＴｓｌ、ＲＫ２、Ｐ
１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、Ｔ４バクテリオファー
ジ、Ｔ７バクテリオファージ、ｐ１５Ａ、ＲＳＦ１０３
０、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣがある。当業界では、これ
ら以外にも各種の複製起点が知られている。「ＤＮＡレ
プリケーション（DNA Replication）」、オックスフォ
ード大学出版局（Oxford UniversityPress ）、１９９
１；「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replicatio
n）」、W.H. コーンバーグ（Kornberg ,W. H. ）、フリ
ーマン・アンド・カンパニー（Freeman and Company
）、１９８０。
【０１８８】出発プラスミドとしては、ｐＵＣ１０６以
外にも、適切な複製起点を有するものが多数あり、例と
して、たとえば、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｍｉｎｉ
Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、Ｒｔｓｌ、ＲＫ２、Ｆ、
Ｐ１、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファー
ジ、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII などを挙げることができ
る。
【０１８９】ＤＮＡ組換え型ビークルで形質転換あるい
はトランスフェクションした宿主を培養する方法は周知
である。こうした方法では、宿主を適当な成長条件で培
養し、所望のｓｌＤＮＡを培養から集める。本明細書に
引用した「カレント・プロトコール（Current Protoco
ls）」を参照されたい。
【０１９０】好適実施態様の詳細な説明 本発明の好適実施態様は、図１７および１８を参照する
ことによって容易に説明することができる。
【０１９１】図１７からわかるように、構築物である組
換え型ＤＮＡビークルｐＨＳ２７８０は、機能的複製起
点ｐ１５Ａ、すなわち、プラスミドの複製に際してとも
に機能する開始プライマーＲＮＡＩ、ＲＮＡII、ならび
にＲＯＰタンパク質をコードしているプラスミドの領域
を有している。図からわかるように、ｐ１５Ａ Ｏｒｉ
領域は、ｐＳＴＶ２８に由来するものである。
【０１９２】この一組の要素は、プラスミド自体の複製
をつかさどるものであって、ｓｌＤＮＡの合成を誘導す
るものではない。ｓｌＤＮＡを合成する機能を担ってい
るのは、プラスミドの複製とは独立にｓｌＤＮＡの合成
を誘導する一組の要素である。この一組の要素は、誘導
されると逆方向反復配列の上流側に位置するプライマー
を生成する、誘導可能な強力なプロモーター−オペレー
ターを有している。またこのプロモーター−オペロンの
下流側に隣接して、このプラスミドは、ｓｌＤＮＡの合
成を開始するＲＮＡプライマー、たとえばＲＮＡIIある
いはタンパク質、たとえば上述のプライマーゼをコード
するＤＮＡ断片を有している。このＤＮＡ断片の下流に
は、上述したようにｓｌＤＮＡの合成に関わり、ｓｌＤ
ＮＡの一部を構成する逆方向反復が位置している。ｓｌ
ＤＮＡがアンチジーンを有していることが望ましい場合
には、このアンチジーンは、逆方向反復の上流側、かつ
プライマーをコードするＤＮＡの下流側、すなわちこれ
らの２要素の間、あるいは逆方向反復配列の二つの反対
向きのセグメントの間に、たとえば適当な制限部位への
挿入によって位置させるものとする。上述したように、
このアンチ遺伝子は、標的ｍＲＮＡにアニーリングし
て、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害するか、ある
いは、ｄｓＤＮＡと結合して三重らせんを形成すること
によって、標的ＤＮＡの発現を阻害することのできる断
片である。
【０１９３】こうした説明から明らかなように、ｓｌＤ
ＮＡの合成に際して作動する諸要素は、プラスミドの複
製を制御する諸要素とは異なった各種の遺伝的構築物を
起源としうるものであるが、必ずしもそうでなくともか
まわない。
【０１９４】本明細書に教示するように、本発明は、ｓ
ｌＤＮＡを、プラスミド自体の複製とは独立に合成する
プラスミドを構築するにあたっての一般的なスキームを
提供するものである。このスキームでは、ｓｌＤＮＡの
合成に関与し、ｓｌＤＮＡのステムを構成する所望の長
さの逆方向反復配列を含むＤＮＡ断片が、任意所望の複
製可能なビークルに挿入される。したがって、本発明で
は、プラスミド自体の合成とは独立に、またプラスミド
自体の合成より過剰となるように、ｓｌＤＮＡの複製を
調節することが可能となるものである。
【０１９５】本発明は、例示した特定の構築物、あるい
は機能的要素の起源となる構築物に限定されるものでは
ないことに留意することが肝要である。また、本発明
は、特定のプラスミドに限定されるものでもなく、最終
構築物に必要とされる遺伝的要素を提供するような任意
の他のプラスミドあるいはビークルを選択することが可
能である。
【０１９６】また、本発明は、例示した特定の遺伝的要
素に限定されるものでもない。当業者であれば、本発明
の概念を本発明の一般的概念にしたがって実施する適当
な手段を容易に構築しうるはずである。
【０１９７】以上では、本発明の実施態様をいくつか記
載した。以上の記載から、本発明の教示内容を利用する
ことによって、ｓｌＤＮＡのような一本鎖分子を過剰発
現するのと実質的に同一の結果をもたらすもっと別の実
施態様も利用可能となることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０６の
説明図である。
【図２】図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入され
た２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す。
【図３】図３Ａ，３Ｂ，３ＣはｐＵＣＫ１０６からのｓ
ｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明するポリアクリルア
ミドゲルの臭化エチジウム染色を示す。
【図４】図４Ａ，４Ｂ，４ＣはｐＵＣＫ１０６からのｓ
ｌＤＮＡのダイマー形成を説明するポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラフを示す。
【図５Ａ】図５ＡはｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基
配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオー
トラジオグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂの左側はｓｌＤＮＡのループ部分の
５′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミ
ドゲルのオートラジオグラフである。図５Ｂの右側はｓ
ｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列決定を説明す
る乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフで
ある。
【図５Ｃ】図５ＣはｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基
配列の乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラ
フである。
【図５Ｄ】図５ＤはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの
構造を説明する。
【図６Ａ】図６ＡはｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデ
ルのうちの一つを説明する図である。
【図６Ｂ】図６ＢはｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデ
ルのうちの他の一つを説明する図である。
【図７】図７のレーン１と３はサイズマーカーとしての
ｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体（digest）を示し、レ
ーン２はｐＵＣ７からのｓｌＤＮＡを示す。
【図８】図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺伝子に
ランダムミューテーションを導入する具体例を示す。
【図９】図９はプラスミドｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．
Ｏ．、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ、及びｐＵＣＫ
１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIを説明する図である。
【図１０】図１０はプラスミドｐＸＸ５６６の構築図で
ある。
【図１１】図１１は実施例９−（３）におけるアンピシ
リン濃度とコロニー数の関係を示す図である。
【図１２】図１２はプラスミドｐＵＣＫＡ１０６ｄ．
Ｐ．Ｏ．、ｐＵＣＫＡＧＴ３７、及びｐＵＣＫＡＣＡ３
７を説明する図である。
【図１３】図１３はプラスミドｐＭＳＴＲ３７に挿入さ
れている塩基配列及びプライマーの位置を示す図であ
る。
【図１４】図１４はプラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６
及びｐＹＥＳ２−９−１０６の構築図である。
【図１５】図１５はｐＹＥＳ２−８−１０６，ｐＹＥＳ
２−９−１０６、及び生産されたｓｌＤＮＡをＳａｌＩ
で切断したときの生成断片を説明する図である。
【図１６】図１６はｓｌＤＮＡの検出に用いた３種のプ
ライマーの位置を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明のｓｌＤＮＡを過剰発現さ
せるための複製可能なビークルを構築する過程を示す模
式図である。
【図１８】図１８は、最終構築物であるｐＨＳ２８７０
を示す。
【図１９】図１９は、構築物ｐＨＳ２８７０（約４８０
ｂｐ）と、このｐＨＳ２８７０のＨｉｎｄIII 制限部位
に塩基４９個のＨｉｎｄIII 断片を挿入することによっ
て構築されるｐＨＳ２８７０ＧＴと称されるプラスミド
（約５００ｂｐ）の構築過程を示す模式図である。
【図２０】図２０は、ｐＨＳ２８７０ならびにｐＨＳ２
８７０ＧＴから抽出したｓｌＤＮＡの電気泳動を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴ
ＲｌＦ′の構築過程を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴ
ＲｌＦ′の構築過程を示す。
【図２２】図２２は、β−ガラクトシダーゼの発現レベ
ルの検出を示す。
【参考文献】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (72)発明者 井上 すみ子 アメリカ合衆国， ニュージャージー 08807，ブリッジウォーター， リンベイ ル レーン ３ (72)発明者 井上 正順 アメリカ合衆国， ニュージャージー 08807，ブリッジウォーター， リンベイ ル レーン ３

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＤＮＡポリメラーゼ合成に必要な要素を
    含有し、そして（ａ）そのストランドの片方が、プライ
    ミング部位および前記プライミング部位の下流に逆方向
    反復配列（ＩＲ）を含有する鋳型ＤＮＡである二重鎖Ｄ
    ＮＡであって、前記鋳型ＤＮＡ中に、その転写物が遺伝
    子の機能を調節するＤＮＡ配列が挿入されている二重鎖
    ＤＮＡ、 （ｂ）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させるプライマ
    ー、および（ｃ）前記鋳型からｓｌＤＮＡを複製するＤ
    ＮＡポリメラーゼ、からなる系において、 ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内のアニールされ
    た相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成され、そして一方の
    端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の末端を形成し他方
    の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の両末端を結合する
    ＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造内に、遺伝子の機
    能を制御するＤＮＡ配列を含有する新規な安定した人工
    のｓｌＤＮＡを用い、そして （１）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させ、 （２）前記ＤＮＡの二本鎖のうち一方を鋳型として用い
    てプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、ＤＮＡ合成をＩ
    Ｒ配列中に続け次いで合成をＩＲ配列内で停止し、 （３）ＩＲ配列において新しく合成されたストランド内
    の相補的塩基をアニールして、非二重鎖領域のループお
    よびそのループのネック部分に二重鎖領域を形成させ、
    その二重鎖領域がＤＮＡの合成を続けるためのプライミ
    ング部位として機能し、 （４）前記ＤＮＡの新しく合成されたストランドおよび
    ／または他方のストランドを鋳型として用いてＤＮＡ合
    成を再開し、次いで （５）ｓｌＤＮＡを生成する、ステップからなることを
    特徴とする遺伝子の機能の制御方法。
  2. 【請求項２】 遺伝子が、インビボで、ｓｌＤＮＡが生
    成することによって制御される請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 遺伝子が、真核生物内で、ｓｌＤＮＡが
    生成することによって制御される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記真核生物が、動物、植物または酵母
    である請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 遺伝子が、原核生物内で、ｓｌＤＮＡが
    生成することによって制御される請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記原核生物が、イー・コリまたはビー
    ・サブチリスである請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 遺伝子が、インビトロで、ｓｌＤＮＡが
    生成することによって制御される請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ｓｌＤＮＡが、遺伝子の機能を制御
    するＤＮＡ配列として、アンチセンスＤＮＡ配列または
    三重らせん構造を形成できるＤＮＡ配列を含有する請求
    項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ｓｌＤＮＡが、ループ内にまたはス
    テムの長い方のストランドの３′末端もしくは５′末端
    に配置された、遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含
    有している請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ＤＮＡポリメラーゼ合成に必要な要素
    を含有し、そして （ａ）そのストランドの片方が、プライミング部位およ
    び前記プライミング部位の下流に逆方向反復配列（Ｉ
    Ｒ）を含有する鋳型ＤＮＡである二重鎖ＤＮＡであっ
    て、前記鋳型ＤＮＡ中に、その転写物が遺伝子の機能を
    制御するＤＮＡ配列が挿入されている二重鎖ＤＮＡ （ｂ）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させるプライマ
    ー、および （ｃ）前記の新しく合成された鋳型から、またはＤＮＡ
    断片の第二ストランドからｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡ
    ポリメラーゼからなる系において、 ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内のアニールされ
    た相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成され、そして一方の
    端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の末端を形成し他方
    の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の両末端を結合する
    ＤＮＡの一本鎖ループを形成するステム−ループ構造物
    （ｓｌＤＮＡ）からなる新規な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮ
    Ａ）分子を合成するための系。
  11. 【請求項１１】 ｓｌＤＮＡを合成するための系が、イ
    ンビトロの系である請求項１０記載の系。
  12. 【請求項１２】 ｓｌＤＮＡを合成するための系が真核
    生物の系である請求項１１記載の系。
  13. 【請求項１３】 真核生物が、動物、植物または酵母で
    ある請求項１２記載の系。
  14. 【請求項１４】 ｓｌＤＮＡを合成するための系が原核
    細胞の系である請求項１１記載の系。
  15. 【請求項１５】 原核生物が、イー・コリまたはビー・
    サブチリスである請求項１４記載の系。
  16. 【請求項１６】 ｓｌＤＮＡを合成するための系が、イ
    ンビトロの系である請求項１０記載の系。
  17. 【請求項１７】 転写物が、アンチセンスＤＮＡ配列ま
    たは三重らせん構造を形成できるＤＮＡ配列を含有して
    いる請求項１０記載の系。
  18. 【請求項１８】 その転写物が遺伝子の機能を制御する
    ＤＮＡ配列が、プライミング部位、または人工のＤＮＡ
    鋳型である二重鎖ＤＮＡの転写終止部位における、ＩＲ
    を構成する相補的配列の間に配置されている請求項１０
    記載の系。
  19. 【請求項１９】 ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ
    内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成さ
    れ、そして一方の端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の
    末端を形成し他方の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の
    両末端を結合するＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造
    内に、遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有する新
    規で安定な人工のｓｌＤＮＡ。
  20. 【請求項２０】 遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列
    が、アンチセンスまたは三重らせん構造を形成できるＤ
    ＮＡ配列である請求項１９記載のｓｌＤＮＡ。
  21. 【請求項２１】 遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列
    が、ループ内、またはステムの長い方のストランドの
    ３′末端もしくは５′末端に配置されている請求項１９
    記載のｓｌＤＮＡ。
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