JP2003513652A - 改変特性を有するバイオポリマーの作製方法 - Google Patents
改変特性を有するバイオポリマーの作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
改変された特性を有するバイオポリマーの作製方法、および該方法を実行するための使用説明書を含むキットについて開示する。
Description
【０００１】
本発明は、改変された特性を有するポリヌクレオチド分子を作製する方法、お
よび該方法を実行するための使用説明書を含むキットに関する。
よび該方法を実行するための使用説明書を含むキットに関する。
【０００２】
生体分子−および特に、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖類等のような
バイオポリマー−は、既知の生物学的営みの基礎であるのみならず、著しく多様
化した応用技術分野においてより頻繁に使用されつつある。新しい機能的な生体
分子、それらの単離または作製およびそれらの技術的な適用についての研究は、
最新のバイオテクノロジーにおける主題である。望ましい特性を示すこれまでに
未知の天然生体分子を偶然に発見すること（天然物質のスクリーニングを参照の
こと）に加えて、自然の進化の法則を実験的に模倣することにより、特定の特性
をもつ全く新しい生体分子を生み出す方法が近年現れた（国際公開公報第92/186
45号；EigenおよびRigler、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)、5740；Kolterma
nnおよびKettling、Biophys.Chem. 66(1997)、159；Kettlingら、Current Topic
s in Microbiol. & Immunol. 243(1999)、173）。このいわゆる進化バイオテク
ノロジーまたは方向付け分子進化は、長年に渡ってなされてきた理論的および実
践的な進化研究からの知見を用い、それらを生体分子の方向付け進化に適用する
。
バイオポリマー−は、既知の生物学的営みの基礎であるのみならず、著しく多様
化した応用技術分野においてより頻繁に使用されつつある。新しい機能的な生体
分子、それらの単離または作製およびそれらの技術的な適用についての研究は、
最新のバイオテクノロジーにおける主題である。望ましい特性を示すこれまでに
未知の天然生体分子を偶然に発見すること（天然物質のスクリーニングを参照の
こと）に加えて、自然の進化の法則を実験的に模倣することにより、特定の特性
をもつ全く新しい生体分子を生み出す方法が近年現れた（国際公開公報第92/186
45号；EigenおよびRigler、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)、5740；Kolterma
nnおよびKettling、Biophys.Chem. 66(1997)、159；Kettlingら、Current Topic
s in Microbiol. & Immunol. 243(1999)、173）。このいわゆる進化バイオテク
ノロジーまたは方向付け分子進化は、長年に渡ってなされてきた理論的および実
践的な進化研究からの知見を用い、それらを生体分子の方向付け進化に適用する
。
【０００３】
非常に手短に言えば、分子集団に対して作用する変異プロセスおよび選択プロ
セスの効果的な相互作用によって、分子機能の方向付け進化が起こる。変異は生
体分子の情報内容から始まる一方、選択は分子の表現型によって起こる。ポリヌ
クレオチド分子の情報（遺伝子型）は、ポリヌクレオチド分子における様々なモ
ノマーの連続的な順序を示す。ポリヌクレオチド分子の表現型は、ポリヌクレオ
チド分子の、およびポリヌクレオチドにコードされる転写産物または翻訳産物の
、機能および特性の総和を示す。配列情報および選択可能な表現型の連鎖は、増
幅を組合わせた選択（Kettling、PhD論文、Gottingen/TU Braunschweig(1999)）
、スクリーニングと呼ばれる区画化および機能的分析（国際公開公報第92/18645
号；同第99/34195号）、または遺伝子型および表現型の物理的連鎖ならびにそれ
らの選択（独国特許196 46 372；米国特許第5,849,545号；独国特許-A1 43 056
51）のいずれかによって達成できる。
セスの効果的な相互作用によって、分子機能の方向付け進化が起こる。変異は生
体分子の情報内容から始まる一方、選択は分子の表現型によって起こる。ポリヌ
クレオチド分子の情報（遺伝子型）は、ポリヌクレオチド分子における様々なモ
ノマーの連続的な順序を示す。ポリヌクレオチド分子の表現型は、ポリヌクレオ
チド分子の、およびポリヌクレオチドにコードされる転写産物または翻訳産物の
、機能および特性の総和を示す。配列情報および選択可能な表現型の連鎖は、増
幅を組合わせた選択（Kettling、PhD論文、Gottingen/TU Braunschweig(1999)）
、スクリーニングと呼ばれる区画化および機能的分析（国際公開公報第92/18645
号；同第99/34195号）、または遺伝子型および表現型の物理的連鎖ならびにそれ
らの選択（独国特許196 46 372；米国特許第5,849,545号；独国特許-A1 43 056
51）のいずれかによって達成できる。
【０００４】
変異プロセスおよび選択プロセスの相互作用の質は、方向付け進化の戦略を成
功させるために重要なものである。自然界および実験室において、準種の原理が
最も好結果を生じる戦略であることが証明された−1つの進化的世代および分子
機能の最適化に必要とされる時間により評価された。準種は、誤りのある複製か
ら生じる関連分子変異体（突然変異体）の動的集団を示す。準種の原理に対応し
て−野生型（準種の中心）ではなく全範囲が選択対象であることが示される。変
化させた選択条件下において有利な変異体は、それらの適応度の値に対応した該
突然変異体の分布で存在しており、その後の無作為な突然変異により形成する必
要はない。選択パラメータが変化した場合、進化的世代は、適応地形図の端に沿
った、陰関数的に方向づけられた準種の浮動に類似する。準種の生成およびこの
原理の進化バイオテクノロジーへの適用は、国際公開公報第92/18645号にて説明
されている。
功させるために重要なものである。自然界および実験室において、準種の原理が
最も好結果を生じる戦略であることが証明された−1つの進化的世代および分子
機能の最適化に必要とされる時間により評価された。準種は、誤りのある複製か
ら生じる関連分子変異体（突然変異体）の動的集団を示す。準種の原理に対応し
て−野生型（準種の中心）ではなく全範囲が選択対象であることが示される。変
化させた選択条件下において有利な変異体は、それらの適応度の値に対応した該
突然変異体の分布で存在しており、その後の無作為な突然変異により形成する必
要はない。選択パラメータが変化した場合、進化的世代は、適応地形図の端に沿
った、陰関数的に方向づけられた準種の浮動に類似する。準種の生成およびこの
原理の進化バイオテクノロジーへの適用は、国際公開公報第92/18645号にて説明
されている。
【０００５】
準種の生成の基礎は、分子変異体の誤りのある複製である。ポリヌクレオチド
が使用される場合、複製は、好ましくは複製酵素、即ち、ポリヌクレオチド分子
の鋳型に沿った合成を可能にするポリメラーゼによって行われる。エラーの導入
、即ち、分子情報の変異は、本来存在する誤りのある複製過程だけで達成され得
るが、ポリメラーゼの不正確性を意図的に増加させること（例えば、規定のモノ
マーの不均衡な添加、塩基類似体の添加、誤りのあるPCR、非常に高いエラー率
をもつポリメラーゼ）により、合成後のポリヌクレオチドの化学的修飾により、
モノマー混合物および／またはヌクレオチド類似体の少なくとも部分的な適用下
におけるポリヌクレオチドの完全な合成により、ならびにこれらの方法の組合わ
せにより達成できる。
が使用される場合、複製は、好ましくは複製酵素、即ち、ポリヌクレオチド分子
の鋳型に沿った合成を可能にするポリメラーゼによって行われる。エラーの導入
、即ち、分子情報の変異は、本来存在する誤りのある複製過程だけで達成され得
るが、ポリメラーゼの不正確性を意図的に増加させること（例えば、規定のモノ
マーの不均衡な添加、塩基類似体の添加、誤りのあるPCR、非常に高いエラー率
をもつポリメラーゼ）により、合成後のポリヌクレオチドの化学的修飾により、
モノマー混合物および／またはヌクレオチド類似体の少なくとも部分的な適用下
におけるポリヌクレオチドの完全な合成により、ならびにこれらの方法の組合わ
せにより達成できる。
【０００６】
定時の突然変異（塩基の置換、欠失、および挿入の形態における）を生じさせ
るこれらの方法に加え、天然の配列部分の組換えは、定時の突然変異を組合わせ
るため、またポリマー内にてドメインを組合わせるため、ヘテロ多量体のサブユ
ニットを組合わせるため、または遺伝子クラスターもしくはゲノム内にて遺伝子
変異体を組合わせるためにも、非常に成功率の高い方法である。特に相同的組換
え、即ち方向および読み枠を維持したままの、異なる変異体からの対応する配列
部分の組合わせは、非特異的組換えに伴う非関連配列のバックグラウンドノイズ
を回避することができるため、重要な役割を担う。準種の原理に従えば、相同的
組換えは、配列分布を拡張させるための意図的な手段である。基礎となる適応地
形図から生じるが、組換えをしないと適応地形図の端に沿った収斂の可能性が非
常に低いというような低い相対関連度をもつ準種の様々な関連小分布は、相同的
組換えにより著しく拡張できる。それによって、連続した突然変異の導入とは対
照的に、実験速度の上昇を導く進化的方法が現れる。さらに、原則として、技術
的に調節された相同的組換えの適用はまた、異なる選択圧下において生じた準種
分布の融合を可能にし、またゆえに、個々に選択された分子機能の融合も可能に
する。
るこれらの方法に加え、天然の配列部分の組換えは、定時の突然変異を組合わせ
るため、またポリマー内にてドメインを組合わせるため、ヘテロ多量体のサブユ
ニットを組合わせるため、または遺伝子クラスターもしくはゲノム内にて遺伝子
変異体を組合わせるためにも、非常に成功率の高い方法である。特に相同的組換
え、即ち方向および読み枠を維持したままの、異なる変異体からの対応する配列
部分の組合わせは、非特異的組換えに伴う非関連配列のバックグラウンドノイズ
を回避することができるため、重要な役割を担う。準種の原理に従えば、相同的
組換えは、配列分布を拡張させるための意図的な手段である。基礎となる適応地
形図から生じるが、組換えをしないと適応地形図の端に沿った収斂の可能性が非
常に低いというような低い相対関連度をもつ準種の様々な関連小分布は、相同的
組換えにより著しく拡張できる。それによって、連続した突然変異の導入とは対
照的に、実験速度の上昇を導く進化的方法が現れる。さらに、原則として、技術
的に調節された相同的組換えの適用はまた、異なる選択圧下において生じた準種
分布の融合を可能にし、またゆえに、個々に選択された分子機能の融合も可能に
する。
【０００７】
実験においては、組換えは異なる方法にて行うことができる：一方ではインビ
トロにおいて個々の酵素機能または規定の混合物、または一連の酵素を用いたプ
ロセシング段階を使用し、一方ではインビボにおいて細胞の組換えおよび／また
は修復プロセスを用いる。
トロにおいて個々の酵素機能または規定の混合物、または一連の酵素を用いたプ
ロセシング段階を使用し、一方ではインビボにおいて細胞の組換えおよび／また
は修復プロセスを用いる。
【０００８】
インビトロ法については、これまでのところ、主にPCRに基づく方法が技術的
に用いられている。最初に挙げるべきはDNAシャッフリング、セクシャルPCRとも
呼ばれる方法である（国際公開公報第95/22625号：Stemmer、Nature 370(1994)
、389）。この方法においては、任意の重複する遺伝子断片が提供され、引き続
き、プライマーを加えないPCRにより元の長さの産物へと会合される。ゆえに、
各PCRサイクルにおける断片の相互プライミングにより、異なる起源の断片を付
随的に連結させ、相同となるように産物分子を形成させる。断片長を調整するこ
とにより、DNAシャッフリングは少なくとも原則として、組換え事象の頻度を制
限することを可能にする。その他のPCRに基づく方法は、ランダムプライマーを
用いたPCR法（国際公開公報第98/42728号：Shaoら、Nucl.Acids Res. 26(1998)
、681）である。この方法においては、ポリヌクレオチド内の無作為な位置にお
ける合成の開始を可能にする、無作為化した配列をもつプライマーを使用する。
ゆえに、DNAシャッフリングと同様に、短いポリヌクレオチド断片が形成され、
相互プライミングによって互いに組換えを行うことが可能である。この方法では
、組換え頻度の調節はほとんど不可能である。さらに、非特異的プライマーは、
比較的高い固有のエラー率へとつながり、感受性の高い配列部分および／または
長い遺伝子に関して問題を与える可能性がある。これらの方法の代わりに、付着
末端伸長プロセス（国際公開公報第98/42728号；Zhaoら、Nat. Biotechnol. 16(
1998)、258）では、PCR増幅中に鎖の置換を引き起こさせるために、改変PCRプロ
トコールを用いる。融解段階とアニーリング段階との間の、合成温度における非
常に短い段階を用い、不完全に形成された産物を新しい鋳型にハイブリダイズさ
せ、さらに伸長させる。組換え頻度の調整は、合成時間およびサイクル数の設定
により行うことができる。しかし、ある温度に対する非常に短い段階の正確な調
整には技術的限界がある。このPCRに基づく方法の代わりに、突然変異を有する
ポリヌクレオチド配列集団からヘテロ二本鎖を作製し、その後、インビボにおけ
る細胞への導入により、またはインビトロにおける細胞抽出物とのインキュベー
ションにより、統計的修復を施し、最初の集団における変異体の相対頻度に応じ
てある程度まで組換え分子変異体を形成する方法が報告されている（国際公開公
報第99/29902号）。非対合塩基を特異的に認識し、二重鎖の2つの鎖のうち1つを
統計的に修復する細胞修復システムの使用は、本方法に特徴的なものである。こ
の方法は、一方ではポリヌクレオチドの細胞への導入における限界効率により、
また他方では修復プロセスの制御可能性が欠けていることにより、制限される。
に用いられている。最初に挙げるべきはDNAシャッフリング、セクシャルPCRとも
呼ばれる方法である（国際公開公報第95/22625号：Stemmer、Nature 370(1994)
、389）。この方法においては、任意の重複する遺伝子断片が提供され、引き続
き、プライマーを加えないPCRにより元の長さの産物へと会合される。ゆえに、
各PCRサイクルにおける断片の相互プライミングにより、異なる起源の断片を付
随的に連結させ、相同となるように産物分子を形成させる。断片長を調整するこ
とにより、DNAシャッフリングは少なくとも原則として、組換え事象の頻度を制
限することを可能にする。その他のPCRに基づく方法は、ランダムプライマーを
用いたPCR法（国際公開公報第98/42728号：Shaoら、Nucl.Acids Res. 26(1998)
、681）である。この方法においては、ポリヌクレオチド内の無作為な位置にお
ける合成の開始を可能にする、無作為化した配列をもつプライマーを使用する。
ゆえに、DNAシャッフリングと同様に、短いポリヌクレオチド断片が形成され、
相互プライミングによって互いに組換えを行うことが可能である。この方法では
、組換え頻度の調節はほとんど不可能である。さらに、非特異的プライマーは、
比較的高い固有のエラー率へとつながり、感受性の高い配列部分および／または
長い遺伝子に関して問題を与える可能性がある。これらの方法の代わりに、付着
末端伸長プロセス（国際公開公報第98/42728号；Zhaoら、Nat. Biotechnol. 16(
1998)、258）では、PCR増幅中に鎖の置換を引き起こさせるために、改変PCRプロ
トコールを用いる。融解段階とアニーリング段階との間の、合成温度における非
常に短い段階を用い、不完全に形成された産物を新しい鋳型にハイブリダイズさ
せ、さらに伸長させる。組換え頻度の調整は、合成時間およびサイクル数の設定
により行うことができる。しかし、ある温度に対する非常に短い段階の正確な調
整には技術的限界がある。このPCRに基づく方法の代わりに、突然変異を有する
ポリヌクレオチド配列集団からヘテロ二本鎖を作製し、その後、インビボにおけ
る細胞への導入により、またはインビトロにおける細胞抽出物とのインキュベー
ションにより、統計的修復を施し、最初の集団における変異体の相対頻度に応じ
てある程度まで組換え分子変異体を形成する方法が報告されている（国際公開公
報第99/29902号）。非対合塩基を特異的に認識し、二重鎖の2つの鎖のうち1つを
統計的に修復する細胞修復システムの使用は、本方法に特徴的なものである。こ
の方法は、一方ではポリヌクレオチドの細胞への導入における限界効率により、
また他方では修復プロセスの制御可能性が欠けていることにより、制限される。
【０００９】
ゆえに、本発明の根底にある技術的課題は、上記の既知の方法の不都合な点を
回避し、ポリヌクレオチド分子の準種の遺伝子型の、効率のよい新しい組合わせ
を可能にすることにより、改変された表現型の形成を導くような、改変特性をも
つポリヌクレオチドの作製のための方法を提供することである。特に、その技術
的課題は、組換え事象の数の正確な制御可能性を位置選択的組換えの可能性と組
合わせる、インビトロの相同的組換え法を提供することである。
回避し、ポリヌクレオチド分子の準種の遺伝子型の、効率のよい新しい組合わせ
を可能にすることにより、改変された表現型の形成を導くような、改変特性をも
つポリヌクレオチドの作製のための方法を提供することである。特に、その技術
的課題は、組換え事象の数の正確な制御可能性を位置選択的組換えの可能性と組
合わせる、インビトロの相同的組換え法を提供することである。
【００１０】
この技術的課題は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供するこ
とにより解決された。
とにより解決された。
【００１１】
ゆえに、本発明は、以下の段階を含む少なくとも1回のサイクルを完了する、
改変された特性を有するポリヌクレオチド分子の作製方法に関する： (a) 一本鎖ポリヌクレオチド分子の集団を提供する段階であって、該集団の
個々のポリヌクレオチド分子が少なくとも1つの相同配列セグメントおよび少な
くとも2つの非相同配列セグメントを有し、且つ該集団中に、これらの一本鎖に
各々完全にまたは部分的に相補的であるような鎖も含まれる段階； (b) 異なる非相同な配列セグメントを有する二重鎖（ヘテロ二本鎖）を含む
、段階(a)に従って提供される一本鎖ポリヌクレオチド分子集団の二重鎖ポリヌ
クレオチド分子を形成する段階； (c) 段階(b)に従って作製された二重鎖ポリヌクレオチド分子を、部分的に、
エキソヌクレアーゼ作用により一本鎖分解する段階；および (d) 段階(c)に従って作製された、部分的に分解された二重鎖の分解された末
端から開始する、鋳型に沿って一本鎖合成する段階。 この方法において、段階(c)および段階(d)を連続してまたは同時に実行してもよ
い。
改変された特性を有するポリヌクレオチド分子の作製方法に関する： (a) 一本鎖ポリヌクレオチド分子の集団を提供する段階であって、該集団の
個々のポリヌクレオチド分子が少なくとも1つの相同配列セグメントおよび少な
くとも2つの非相同配列セグメントを有し、且つ該集団中に、これらの一本鎖に
各々完全にまたは部分的に相補的であるような鎖も含まれる段階； (b) 異なる非相同な配列セグメントを有する二重鎖（ヘテロ二本鎖）を含む
、段階(a)に従って提供される一本鎖ポリヌクレオチド分子集団の二重鎖ポリヌ
クレオチド分子を形成する段階； (c) 段階(b)に従って作製された二重鎖ポリヌクレオチド分子を、部分的に、
エキソヌクレアーゼ作用により一本鎖分解する段階；および (d) 段階(c)に従って作製された、部分的に分解された二重鎖の分解された末
端から開始する、鋳型に沿って一本鎖合成する段階。 この方法において、段階(c)および段階(d)を連続してまたは同時に実行してもよ
い。
【００１２】
図1は、以下に記載する、本方法にて可能な変異の1つの概要を示す。
【００１３】
要件に応じて、本発明の方法は、非相同配列セグメントの偶然的および調節さ
れた新しい組合わせの両方を可能にする。二重鎖ヘテロ二本鎖ポリヌクレオチド
の制限された部分の連続した一本鎖ポリヌクレオチド分解、およびそれに続く、
一本鎖ポリヌクレオチドの半保存的合成の原則もまた−完全な組換えに加え−非
相同配列セグメントの位置選択的組換えを可能にする。さらに、組換え頻度は高
く、サイクル数により正確に調整できる。そのような組換え頻度の調節は、これ
までに説明された方法である、DNAシャッフリングや付着末端伸長プロセスによ
ってもある程度は達成できる。ランダムプライミングにはこの可能性はなく、修
復システムではほとんど可能性がない。ランダムプライミングと同様に、付着末
端伸長プロセスには非組換え開始ポリヌクレオチドのバックグラウンドがあると
いう不利な点がある。これは、いずれの方法もこれらの開始ポリヌクレオチドの
増幅に基づくためである。DNAシャッフリングでは開始ポリヌクレオチドのバッ
クグラウンドは減少しているが、これは開始配列の断片化により達成され、その
プロセスには非常に高度な実験が必要となる。さらに、ランダムプライミングお
よび修復システムのように、それは位置選択的組換えのいかなる可能性をも提供
しない。ゆえに、本発明の方法は、今までに説明されたいずれの方法によっても
達成できていない、利点の組合せによって特徴付けられる（表1を参照のこと）
。本方法のさらなる利点は、それがより高度でない実験やより短い時間を必要と
し、自動化の可能性を提供するという事実である。
れた新しい組合わせの両方を可能にする。二重鎖ヘテロ二本鎖ポリヌクレオチド
の制限された部分の連続した一本鎖ポリヌクレオチド分解、およびそれに続く、
一本鎖ポリヌクレオチドの半保存的合成の原則もまた−完全な組換えに加え−非
相同配列セグメントの位置選択的組換えを可能にする。さらに、組換え頻度は高
く、サイクル数により正確に調整できる。そのような組換え頻度の調節は、これ
までに説明された方法である、DNAシャッフリングや付着末端伸長プロセスによ
ってもある程度は達成できる。ランダムプライミングにはこの可能性はなく、修
復システムではほとんど可能性がない。ランダムプライミングと同様に、付着末
端伸長プロセスには非組換え開始ポリヌクレオチドのバックグラウンドがあると
いう不利な点がある。これは、いずれの方法もこれらの開始ポリヌクレオチドの
増幅に基づくためである。DNAシャッフリングでは開始ポリヌクレオチドのバッ
クグラウンドは減少しているが、これは開始配列の断片化により達成され、その
プロセスには非常に高度な実験が必要となる。さらに、ランダムプライミングお
よび修復システムのように、それは位置選択的組換えのいかなる可能性をも提供
しない。ゆえに、本発明の方法は、今までに説明されたいずれの方法によっても
達成できていない、利点の組合せによって特徴付けられる（表1を参照のこと）
。本方法のさらなる利点は、それがより高度でない実験やより短い時間を必要と
し、自動化の可能性を提供するという事実である。
【００１４】
【表１】 様々なインビトロ組換え法の比較
【００１５】
より長いまたはより短い配列セグメントは3'末端または5'末端において維持さ
れた一方、残りの配列は3'末端または5'末端において新規に合成された−態様に
応じて−ため、本発明の方法に係る個々のサイクルの結果生じる産物は、半保存
的な一本鎖ポリヌクレオチドである。
れた一方、残りの配列は3'末端または5'末端において新規に合成された−態様に
応じて−ため、本発明の方法に係る個々のサイクルの結果生じる産物は、半保存
的な一本鎖ポリヌクレオチドである。
【００１６】
好ましい態様においては、前述の段階(a)〜(d)を含む1回以上のサイクルを完
了する、即ち、少なくとも2回、好ましくは少なくとも5回、より好ましくは少な
くとも10回、および最も好ましくは少なくとも20回を完了する。
了する、即ち、少なくとも2回、好ましくは少なくとも5回、より好ましくは少な
くとも10回、および最も好ましくは少なくとも20回を完了する。
【００１７】
本発明の方法のサイクルの適用により、多数の新しく組合わせられた配列セグ
メントをもつポリヌクレオチドを、関連ポリヌクレオチド配列の開始プールから
作製することが可能になる。特に、サイクルの適用により、幾つかの非相同配列
セグメントを互いに組合わせることが可能になる。さらに、サイクル数により、
各ポリヌクレオチド鎖について組換え頻度を厳密に調節することが可能である。
サイクルの適用により、1サイクルから次への、新たな組合わせ間の平均距離を
も調節できる。
メントをもつポリヌクレオチドを、関連ポリヌクレオチド配列の開始プールから
作製することが可能になる。特に、サイクルの適用により、幾つかの非相同配列
セグメントを互いに組合わせることが可能になる。さらに、サイクル数により、
各ポリヌクレオチド鎖について組換え頻度を厳密に調節することが可能である。
サイクルの適用により、1サイクルから次への、新たな組合わせ間の平均距離を
も調節できる。
【００１８】
好ましい態様においては、サイクル数が増加した場合、本発明の方法の段階(c
)に従ったエキソヌクレアーゼ作用による分解の分解長は、より短くなる。これ
により、段階(a)に従って提供されるポリヌクレオチドの配列の全領域における
新たな組合わせが可能となる。
)に従ったエキソヌクレアーゼ作用による分解の分解長は、より短くなる。これ
により、段階(a)に従って提供されるポリヌクレオチドの配列の全領域における
新たな組合わせが可能となる。
【００１９】
本発明の方法の特に好ましい態様において、部分的に分解された鎖と新規に合
成された鎖との組合わせの位置選択性は、本方法の段階(c)に従った部分的なエ
キソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解の調節により制御される。
成された鎖との組合わせの位置選択性は、本方法の段階(c)に従った部分的なエ
キソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解の調節により制御される。
【００２０】
その他の好ましい態様においては、本発明の方法の1サイクル、数サイクル、
または全サイクルの後に、選択段階が実行される。この選択段階はポリヌクレオ
チドの遺伝子型もしくは表現型のいずれかに、または遺伝子型および表現型の双
方に関連付けることができる。
または全サイクルの後に、選択段階が実行される。この選択段階はポリヌクレオ
チドの遺伝子型もしくは表現型のいずれかに、または遺伝子型および表現型の双
方に関連付けることができる。
【００２１】
この場合、ポリヌクレオチドの遺伝子型は、ポリヌクレオチドにおける異なる
モノマーの連続的な順序である。表現型は、ポリヌクレオチド分子の、およびポ
リヌクレオチドによってコードされる転写産物または翻訳産物の、機能および特
性の総和である。
モノマーの連続的な順序である。表現型は、ポリヌクレオチド分子の、およびポ
リヌクレオチドによってコードされる転写産物または翻訳産物の、機能および特
性の総和である。
【００２２】
選択段階は当業者に既知の方法、例えば増幅を組み合わせた（天然）選択、物
理的分離による選択、またはスクリーニングによる選択（KoltermannおよびKett
ling、Biophys.Chem. 66(1997)、159；Kettlingら、Current Topics in Microbi
ol. and Immunol. 243(1999)、173）により実行できる。
理的分離による選択、またはスクリーニングによる選択（KoltermannおよびKett
ling、Biophys.Chem. 66(1997)、159；Kettlingら、Current Topics in Microbi
ol. and Immunol. 243(1999)、173）により実行できる。
【００２３】
本発明の方法の段階(a)に従って提供される一本鎖ポリヌクレオチド分子の集
団は、少なくとも2種類のポリヌクレオチド分子を含み、これらが少なくとも1つ
の相同配列セグメントおよび少なくとも2つの非相同配列セグメントを含むよう
な、任意の一本鎖ポリヌクレオチド分子の集団であってもよい。「一本鎖ポリヌ
クレオチド分子の集団」という用語は、分子間の特異的な塩基対合の形態におけ
る分子間の相互作用が妨げられているまたは存在しない、一連のポリヌクレオチ
ド分子を意味する。「ポリヌクレオチド」（核酸、オリゴヌクレオチド）という用
語は、DNAおよびRNAの両方を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二重鎖の
いずれかの、直鎖状の、方向性をもつ（5'-3'方向）ヘテロポリマーである。二
重鎖においては、2つの一本鎖は特異的な塩基対合の形態における相互作用によ
って結合している。原則として、ポリヌクレオチドは修飾されたモノマーを有す
るDNAまたはRNAでもあり得る。一般的には、本方法は同様に構築された人工的な
ポリマーについても用いることができる。
団は、少なくとも2種類のポリヌクレオチド分子を含み、これらが少なくとも1つ
の相同配列セグメントおよび少なくとも2つの非相同配列セグメントを含むよう
な、任意の一本鎖ポリヌクレオチド分子の集団であってもよい。「一本鎖ポリヌ
クレオチド分子の集団」という用語は、分子間の特異的な塩基対合の形態におけ
る分子間の相互作用が妨げられているまたは存在しない、一連のポリヌクレオチ
ド分子を意味する。「ポリヌクレオチド」（核酸、オリゴヌクレオチド）という用
語は、DNAおよびRNAの両方を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二重鎖の
いずれかの、直鎖状の、方向性をもつ（5'-3'方向）ヘテロポリマーである。二
重鎖においては、2つの一本鎖は特異的な塩基対合の形態における相互作用によ
って結合している。原則として、ポリヌクレオチドは修飾されたモノマーを有す
るDNAまたはRNAでもあり得る。一般的には、本方法は同様に構築された人工的な
ポリマーについても用いることができる。
【００２４】
「相同セグメント」という用語は、1つまたは複数のポリヌクレオチド分子上の
同一または相補的なセグメント、即ち、対応する位置において同じ情報をもつセ
グメントを意味する。
同一または相補的なセグメント、即ち、対応する位置において同じ情報をもつセ
グメントを意味する。
【００２５】
「非相同セグメント」という用語は、2つ以上のポリヌクレオチド分子上の同一
ではない、または相補的ではないセグメント、即ち、対応する位置において異な
る情報をもつセグメントを意味する。ポリヌクレオチド分子の情報（遺伝子型）
は、ポリヌクレオチド分子における様々なモノマーの連続的な順序である。非相
同配列セグメントは少なくとも1ヌクレオチド長であるが、はるかに長いものも
可能である。特に、非相同配列セグメントは2ヌクレオチド長、または例えばコ
ドンのように3ヌクレオチド長であってもよく、また、好ましくは5ヌクレオチド
長以上、最も好ましくは10ヌクレオチド長以上であり得る。原則として、非相同
セグメントの長さに関して上限はない。それにも関わらず、非相同セグメントの
長さは10,000ヌクレオチドを超えてはならず、好ましくは5,000ヌクレオチドよ
り長くならず、より好ましくは2,000ヌクレオチドより長くならず、および最も
好ましくは1,000ヌクレオチドより長くならない。そのような、より長い配列セ
グメントは、例えば、抗体をコードする配列の超可変領域、タンパク質のドメイ
ン、遺伝子クラスターにおける遺伝子、ゲノム領域等であってもよい。好ましく
は、非相同セグメントは、各々の塩基においてポリヌクレオチド分子が異なるよ
うな配列セグメントである。しかし、非相同セグメントは、ポリヌクレオチド分
子において、欠失、重複、挿入、逆位、付加または同様のものが存在する、もし
くは生じたということに基づくものであってもよい。
ではない、または相補的ではないセグメント、即ち、対応する位置において異な
る情報をもつセグメントを意味する。ポリヌクレオチド分子の情報（遺伝子型）
は、ポリヌクレオチド分子における様々なモノマーの連続的な順序である。非相
同配列セグメントは少なくとも1ヌクレオチド長であるが、はるかに長いものも
可能である。特に、非相同配列セグメントは2ヌクレオチド長、または例えばコ
ドンのように3ヌクレオチド長であってもよく、また、好ましくは5ヌクレオチド
長以上、最も好ましくは10ヌクレオチド長以上であり得る。原則として、非相同
セグメントの長さに関して上限はない。それにも関わらず、非相同セグメントの
長さは10,000ヌクレオチドを超えてはならず、好ましくは5,000ヌクレオチドよ
り長くならず、より好ましくは2,000ヌクレオチドより長くならず、および最も
好ましくは1,000ヌクレオチドより長くならない。そのような、より長い配列セ
グメントは、例えば、抗体をコードする配列の超可変領域、タンパク質のドメイ
ン、遺伝子クラスターにおける遺伝子、ゲノム領域等であってもよい。好ましく
は、非相同セグメントは、各々の塩基においてポリヌクレオチド分子が異なるよ
うな配列セグメントである。しかし、非相同セグメントは、ポリヌクレオチド分
子において、欠失、重複、挿入、逆位、付加または同様のものが存在する、もし
くは生じたということに基づくものであってもよい。
【００２６】
本発明に従い、本発明の方法の段階(a)に従って提供されるポリヌクレオチド
分子は、少なくとも1つの相同配列セグメントおよび少なくとも2つの非相同配列
セグメントを有する。しかし好ましくは、それらは複数の相同セグメントと非相
同セグメントとを有する。原則として、相同セグメントおよび非相同セグメント
の数に上限はない。
分子は、少なくとも1つの相同配列セグメントおよび少なくとも2つの非相同配列
セグメントを有する。しかし好ましくは、それらは複数の相同セグメントと非相
同セグメントとを有する。原則として、相同セグメントおよび非相同セグメント
の数に上限はない。
【００２７】
一本鎖ポリヌクレオチド分子における非相同セグメントは、相同セグメントに
より各々分断されている。相同セグメントは好ましくは少なくとも5、より好ま
しくは少なくとも10、および最も好ましくは少なくとも20ヌクレオチド長である
。非相同セグメントのように、相同セグメントもまた、はるかに長いものが可能
であり、原則として、それらの長さに上限はない。好ましくは、それらの長さは
50,000ヌクレオチド長を超えてはならず、より好ましくは20,000ヌクレオチド長
より長くならず、さらにより好ましくは10,000ヌクレオチド長より長くならず、
および最も好ましくは1,000ヌクレオチド長より長くならない。
より各々分断されている。相同セグメントは好ましくは少なくとも5、より好ま
しくは少なくとも10、および最も好ましくは少なくとも20ヌクレオチド長である
。非相同セグメントのように、相同セグメントもまた、はるかに長いものが可能
であり、原則として、それらの長さに上限はない。好ましくは、それらの長さは
50,000ヌクレオチド長を超えてはならず、より好ましくは20,000ヌクレオチド長
より長くならず、さらにより好ましくは10,000ヌクレオチド長より長くならず、
および最も好ましくは1,000ヌクレオチド長より長くならない。
【００２８】
一本鎖ポリヌクレオチド分子の集団はまた、一本鎖に対し全体的にまたは部分
的に相補的な鎖をも含む。「相補的」という用語は、それらの情報によって、特異
的な塩基対合の形態での相互作用により、これらのセグメントに制限された二重
鎖の形成を導き得る、2つ以上のポリペプチド分子上のセグメントを意味する。
的に相補的な鎖をも含む。「相補的」という用語は、それらの情報によって、特異
的な塩基対合の形態での相互作用により、これらのセグメントに制限された二重
鎖の形成を導き得る、2つ以上のポリペプチド分子上のセグメントを意味する。
【００２９】
本発明の方法の段階(a)に従って一本鎖ポリヌクレオチド分子を提供する段階
は、当業者に既知の方法により実行できる。これらは例えば、物理的、化学的、
生化学的、および生物学的方法を含む。これらの例には、アニーリング温度より
高い温度までの加熱によるポリヌクレオチド二重鎖の融解（Newton、PCR, Spekt
rum Akademischer Verlag(1994)；Lazurkin、Biopolymers 9(1970)、1253〜1306
）；変性試薬（尿素、界面活性剤等）の添加によるポリヌクレオチド二重鎖の変
性；二重鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドへ変換する酵素の添加、
例えば、二重鎖DNAのエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖DNAへの分解による、
もしくは逆転写酵素を加えるかもしくは加えずにDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いた一本鎖RNAの合成による；2つのプライマーのうち1つを過剰に用いることに
より好ましくは2つの産物鎖のうち1つが形成される、アシメトリックPCR（Newto
n、PCR, Spektrum Akademischer Verlag(1994)）；二重鎖DNA分子を乖離するタ
ンパク質または酵素（ジャイレース等）、および伸長する一本鎖DNA分子を安定
化するその他のタンパク質もしくは他の物質（一本鎖結合タンパク質、デンドリ
マー等）の添加、ならびに一本鎖ウイルス（M13、fd等）のゲノムへの配列の挿
入とそれに続く一本鎖ポリヌクレオチドゲノムの精製（Trower、Methods in Mol
.Biol. 58(1996)、363〜366；Ausubel、「分子生物学における最新プロトコール
（Current Protocols in Molecular Biology）」、Wiley(1987)；Sambrook、「
分子クローニング（Molecular Cloning）」、コールドスプリングハーバー研究
所出版、(1989)）が含まれる。当業者は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の化学合
成のようなさらなる方法に精通している。
は、当業者に既知の方法により実行できる。これらは例えば、物理的、化学的、
生化学的、および生物学的方法を含む。これらの例には、アニーリング温度より
高い温度までの加熱によるポリヌクレオチド二重鎖の融解（Newton、PCR, Spekt
rum Akademischer Verlag(1994)；Lazurkin、Biopolymers 9(1970)、1253〜1306
）；変性試薬（尿素、界面活性剤等）の添加によるポリヌクレオチド二重鎖の変
性；二重鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドへ変換する酵素の添加、
例えば、二重鎖DNAのエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖DNAへの分解による、
もしくは逆転写酵素を加えるかもしくは加えずにDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いた一本鎖RNAの合成による；2つのプライマーのうち1つを過剰に用いることに
より好ましくは2つの産物鎖のうち1つが形成される、アシメトリックPCR（Newto
n、PCR, Spektrum Akademischer Verlag(1994)）；二重鎖DNA分子を乖離するタ
ンパク質または酵素（ジャイレース等）、および伸長する一本鎖DNA分子を安定
化するその他のタンパク質もしくは他の物質（一本鎖結合タンパク質、デンドリ
マー等）の添加、ならびに一本鎖ウイルス（M13、fd等）のゲノムへの配列の挿
入とそれに続く一本鎖ポリヌクレオチドゲノムの精製（Trower、Methods in Mol
.Biol. 58(1996)、363〜366；Ausubel、「分子生物学における最新プロトコール
（Current Protocols in Molecular Biology）」、Wiley(1987)；Sambrook、「
分子クローニング（Molecular Cloning）」、コールドスプリングハーバー研究
所出版、(1989)）が含まれる。当業者は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の化学合
成のようなさらなる方法に精通している。
【００３０】
本発明の方法の特に好ましい態様においては、相同セグメントと非相同セグメ
ントとを有する一本鎖ポリヌクレオチドの集団を提供する（段階(a)、図1）ため
に、準種の突然変異体の分布の関連ポリヌクレオチド配列が使用される。この状
況において、「関連」という用語は、互いの間に相同セグメントと非相同セグメン
トとの両方を有するポリヌクレオチドを意味する。
ントとを有する一本鎖ポリヌクレオチドの集団を提供する（段階(a)、図1）ため
に、準種の突然変異体の分布の関連ポリヌクレオチド配列が使用される。この状
況において、「関連」という用語は、互いの間に相同セグメントと非相同セグメン
トとの両方を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００３１】
準種は、誤りのある複製により形成される、関連分子変異体（突然変異体）の
動態集団である。準種の原理に対応して、選択の対象となるのは野生型（準種の
中心）ではなく、分布全体であることが示され得る。変化させた選択条件下にお
いては、そのような突然変異体分布において有利な変異体が、それらの適応度の
値に従って既に含まれており、その後の無作為突然変異によって初めて形成され
る必要はない。選択パラメータを都合よく変化させた場合、進化的世代は、適応
地形図の端に沿った、陰関数的に方向づけられた準種の浮動に類似する。準種の
生成およびこの原理の進化テクノロジーへの適用は、国際公開公報第92/18645号
にて説明されている。
動態集団である。準種の原理に対応して、選択の対象となるのは野生型（準種の
中心）ではなく、分布全体であることが示され得る。変化させた選択条件下にお
いては、そのような突然変異体分布において有利な変異体が、それらの適応度の
値に従って既に含まれており、その後の無作為突然変異によって初めて形成され
る必要はない。選択パラメータを都合よく変化させた場合、進化的世代は、適応
地形図の端に沿った、陰関数的に方向づけられた準種の浮動に類似する。準種の
生成およびこの原理の進化テクノロジーへの適用は、国際公開公報第92/18645号
にて説明されている。
【００３２】
準種の生成の基礎は、分子変異体の誤りのある複製である。ポリヌクレオチド
が使用される場合、好ましくは、ポリヌクレオチド分子の鋳型に沿った合成を可
能にする複製酵素、即ちポリメラーゼによって複製が行われる。エラー、即ち分
子情報の変異の導入は、本来存在する誤りのある複製過程のみによって達成でき
るが、ポリメラーゼの不正確性の意図的な増加（例えば、モノマーの規定の不均
衡な添加、塩基類似体の添加、誤りのあるPCR、非常に高いエラー率をもつポリ
メラーゼ）によって、ポリヌクレオチドの合成後の化学的修飾によって、モノマ
ー混合物および／またはヌクレオチド類似体の少なくとも部分的な適用下におけ
るポリヌクレオチドの完全な合成によって、ならびにこれらの方法の組合わせに
よっても実施できる。
が使用される場合、好ましくは、ポリヌクレオチド分子の鋳型に沿った合成を可
能にする複製酵素、即ちポリメラーゼによって複製が行われる。エラー、即ち分
子情報の変異の導入は、本来存在する誤りのある複製過程のみによって達成でき
るが、ポリメラーゼの不正確性の意図的な増加（例えば、モノマーの規定の不均
衡な添加、塩基類似体の添加、誤りのあるPCR、非常に高いエラー率をもつポリ
メラーゼ）によって、ポリヌクレオチドの合成後の化学的修飾によって、モノマ
ー混合物および／またはヌクレオチド類似体の少なくとも部分的な適用下におけ
るポリヌクレオチドの完全な合成によって、ならびにこれらの方法の組合わせに
よっても実施できる。
【００３３】
好ましくは、準種の突然変異体の分布を、野生型と比較して既にその望ましい
分子機能の表現型特性がすでに改善されている準種の個々の突然変異体と共に使
用する。「ポリヌクレオチド分子の表現型」という用語は、ポリヌクレオチド分子
の、およびポリヌクレオチドによりコードされる転写産物または翻訳産物の、機
能および特性の総和を意味する。
分子機能の表現型特性がすでに改善されている準種の個々の突然変異体と共に使
用する。「ポリヌクレオチド分子の表現型」という用語は、ポリヌクレオチド分子
の、およびポリヌクレオチドによりコードされる転写産物または翻訳産物の、機
能および特性の総和を意味する。
【００３４】
さらに、多様な起源をもつ配列、とりわけ、異なる種の遺伝子ファミリーのポ
リヌクレオチド配列、著しく高いエラー率でインビボにおいて（例えばウイルス
、ミューテーター細菌、UV照射下における細菌等により）、またはインビトロに
おいて（例えばQβレプリカーゼ反応、誤りのあるPCR等により）複製されたポリ
ヌクレオチド配列、合成後に化学物質により突然変異が挿入されたポリヌクレオ
チド配列、もしくは相同セグメントおよび非相同セグメントを発現するような様
式で化学的に合成されたポリヌクレオチド配列、または前述の技術の組合せによ
り作製されたポリヌクレオチド配列が使用できる。
リヌクレオチド配列、著しく高いエラー率でインビボにおいて（例えばウイルス
、ミューテーター細菌、UV照射下における細菌等により）、またはインビトロに
おいて（例えばQβレプリカーゼ反応、誤りのあるPCR等により）複製されたポリ
ヌクレオチド配列、合成後に化学物質により突然変異が挿入されたポリヌクレオ
チド配列、もしくは相同セグメントおよび非相同セグメントを発現するような様
式で化学的に合成されたポリヌクレオチド配列、または前述の技術の組合せによ
り作製されたポリヌクレオチド配列が使用できる。
【００３５】
原則として、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、任意のポ
リヌクレオチド、特にDNA分子またはRNA分子が可能である。特に本方法の段階(b
)においては、DNA鎖およびRNA鎖からなる二重鎖（DNA/RNAハイブリッド）をも作
製できる。
リヌクレオチド、特にDNA分子またはRNA分子が可能である。特に本方法の段階(b
)においては、DNA鎖およびRNA鎖からなる二重鎖（DNA/RNAハイブリッド）をも作
製できる。
【００３６】
本発明の方法の段階(b)に従った二重鎖ヘテロ二本鎖ポリヌクレオチド（ヘテ
ロ二本鎖）の作製は、好ましくは相補的な一本鎖ポリヌクレオチドの相同セグメ
ントのハイブリダイゼーションによって達成される（Newton、PCR, Spektrum Ak
ademischer Verlag(1994)）。
ロ二本鎖）の作製は、好ましくは相補的な一本鎖ポリヌクレオチドの相同セグメ
ントのハイブリダイゼーションによって達成される（Newton、PCR, Spektrum Ak
ademischer Verlag(1994)）。
【００３７】
「ヘテロ二本鎖」という用語は、少なくとも1つの相同セグメントと少なくとも1
つの非相同セグメントとを有するポリヌクレオチド二重鎖を意味する。非相同セ
グメントをもつポリヌクレオチド配列集団を使用することによって、配列変異体
の相対頻度に対応する統計的確率でヘテロ二本鎖が形成される。例えば、2つの
異なる変異体において2つの非相同セグメントが等しい割合で存在する、理想的
に混合された集団から開始すると、ヘテロ二本鎖が統計上、二重鎖ポリヌクレオ
チド毎に生じる。変異体の数が個々の変異体の相対頻度よりも著しく多い場合、
ほとんどヘテロ二本鎖のみが形成される。
つの非相同セグメントとを有するポリヌクレオチド二重鎖を意味する。非相同セ
グメントをもつポリヌクレオチド配列集団を使用することによって、配列変異体
の相対頻度に対応する統計的確率でヘテロ二本鎖が形成される。例えば、2つの
異なる変異体において2つの非相同セグメントが等しい割合で存在する、理想的
に混合された集団から開始すると、ヘテロ二本鎖が統計上、二重鎖ポリヌクレオ
チド毎に生じる。変異体の数が個々の変異体の相対頻度よりも著しく多い場合、
ほとんどヘテロ二本鎖のみが形成される。
【００３８】
二重鎖ポリヌクレオチドを形成するための相補的な一本鎖ポリヌクレオチドの
ハイブリダイゼーションは、当業者に既知の方法に従って実行される。特に、一
本鎖を組合わせること、ならびに例えば温度を下げる、中性pH値を調整する、お
よび低い塩類濃度等のように、相補的なポリヌクレオチドのアニーリングを促進
する反応条件を調整することにより、達成できる。
ハイブリダイゼーションは、当業者に既知の方法に従って実行される。特に、一
本鎖を組合わせること、ならびに例えば温度を下げる、中性pH値を調整する、お
よび低い塩類濃度等のように、相補的なポリヌクレオチドのアニーリングを促進
する反応条件を調整することにより、達成できる。
【００３９】
本発明の方法の段階(c)に従ったヘテロ二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖のエ
キソヌクレアーゼ作用による分解によって、現在二重鎖の一部を形成している個
々のポリヌクレオチド分子が、エキソヌクレアーゼ作用で部分的に分解される。
エキソヌクレアーゼ作用による部分的な分解のみが生じることが必須である。二
重鎖ポリヌクレオチド分子のエキソヌクレアーゼ作用による分解は3'-5'方向、
もしくは5'-3'方向に、または3'-5'方向と5'-3'方向との双方に起こり得る。さ
らに、ポリヌクレオチド分子の非相同セグメントのより長い非対合一本鎖セグメ
ントの分解は、3'-5'方向と5'-3'方向との両方の一本鎖特異的エキソヌクレアー
ゼを添加することにより、エキソヌクレアーゼ作用で起こり得る。このようにし
て、一本鎖セグメントをもつ二重鎖ポリヌクレオチドが形成される。平均長およ
び、付随する3'-5'方向または5'-3'方向の一本鎖分解の分布をも、エキソヌクレ
アーゼ作用による分解の反応条件および反応時間によって調節できる。位置選択
的組換えの場合、分解反応は可能な限り同時に開始および終了するよう意図され
る一方、完全組換えの場合、分解反応の開始および終了は連続して行ってもよい
。さらに、一本鎖ポリヌクレオチドの合成においてホスホジエステルの代わりに
チオエステルを挿入することにより、一本鎖のエキソヌクレアーゼ作用による分
解を最初のチオエステルにて各々停止させ、統計的な一本鎖の分解も達成できる
。
キソヌクレアーゼ作用による分解によって、現在二重鎖の一部を形成している個
々のポリヌクレオチド分子が、エキソヌクレアーゼ作用で部分的に分解される。
エキソヌクレアーゼ作用による部分的な分解のみが生じることが必須である。二
重鎖ポリヌクレオチド分子のエキソヌクレアーゼ作用による分解は3'-5'方向、
もしくは5'-3'方向に、または3'-5'方向と5'-3'方向との双方に起こり得る。さ
らに、ポリヌクレオチド分子の非相同セグメントのより長い非対合一本鎖セグメ
ントの分解は、3'-5'方向と5'-3'方向との両方の一本鎖特異的エキソヌクレアー
ゼを添加することにより、エキソヌクレアーゼ作用で起こり得る。このようにし
て、一本鎖セグメントをもつ二重鎖ポリヌクレオチドが形成される。平均長およ
び、付随する3'-5'方向または5'-3'方向の一本鎖分解の分布をも、エキソヌクレ
アーゼ作用による分解の反応条件および反応時間によって調節できる。位置選択
的組換えの場合、分解反応は可能な限り同時に開始および終了するよう意図され
る一方、完全組換えの場合、分解反応の開始および終了は連続して行ってもよい
。さらに、一本鎖ポリヌクレオチドの合成においてホスホジエステルの代わりに
チオエステルを挿入することにより、一本鎖のエキソヌクレアーゼ作用による分
解を最初のチオエステルにて各々停止させ、統計的な一本鎖の分解も達成できる
。
【００４０】
3'-エキソヌクレアーゼ作用による分解または5'-エキソヌクレアーゼ作用によ
る分解を可能にする既知のエキソヌクレアーゼは複数存在する。1970年代初期に
は、様々なエキソヌクレアーゼが既に単離され、報告された（Lehmann、「酵素(T
he Enzymes)」、Boyer編、 Academic出版(1971)、251〜270）。現在では、著しく
多様な生物の、また非常に異なった機能をもつ、非常に多数の異なるエキソヌク
レアーゼが報告されている（Koonin、Curr. Biol.7(1997)、R 604〜6）。一般に
、エキソヌクレアーゼは多数の異なる細胞内の反応過程に関与している。著しく
多様化したエキソヌクレアーゼ作用活性については、例えば一本鎖DNAまたはRNA
のポリヌクレオチドの3'末端から5'末端への、またその逆の、両方のヌクレアー
ゼ作用による分解のように、技術文献において説明されている。二重鎖DNAにお
ける一本鎖もまた、エキソヌクレアーゼによって、ポリヌクレオチドの3'末端か
ら5'末端への、またその逆の両方で分解できる。二重鎖DNAのエキソヌクレアー
ゼ作用による分解、即ち二重鎖末端における5'末端および3'末端の同時の分解が
報告されている。
る分解を可能にする既知のエキソヌクレアーゼは複数存在する。1970年代初期に
は、様々なエキソヌクレアーゼが既に単離され、報告された（Lehmann、「酵素(T
he Enzymes)」、Boyer編、 Academic出版(1971)、251〜270）。現在では、著しく
多様な生物の、また非常に異なった機能をもつ、非常に多数の異なるエキソヌク
レアーゼが報告されている（Koonin、Curr. Biol.7(1997)、R 604〜6）。一般に
、エキソヌクレアーゼは多数の異なる細胞内の反応過程に関与している。著しく
多様化したエキソヌクレアーゼ作用活性については、例えば一本鎖DNAまたはRNA
のポリヌクレオチドの3'末端から5'末端への、またその逆の、両方のヌクレアー
ゼ作用による分解のように、技術文献において説明されている。二重鎖DNAにお
ける一本鎖もまた、エキソヌクレアーゼによって、ポリヌクレオチドの3'末端か
ら5'末端への、またその逆の両方で分解できる。二重鎖DNAのエキソヌクレアー
ゼ作用による分解、即ち二重鎖末端における5'末端および3'末端の同時の分解が
報告されている。
【００４１】
これらの酵素の幾つかは、既に市販されている。複数のエキソヌクレアーゼに
代えて、エキソヌクレアーゼIII（ExoIII）（E.C.3.1.11.2）が、エキソヌクレ
アーゼ作用をもつ酵素のクラスの一例として本明細書に述べられる。ExoIIIは例
えばUSB、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Roche Molecular Bioch
emicals）、ストラタジーン社（Stratagen）、ニューイングランドバイオラボ社
（New England Biolab）により販売されている。大腸菌のExoIIIは多様な活性を
もつ。酵素は非プロセッシブであり、DNA二重鎖における特異的な3'-5'-エキソ
ヌクレアーゼ作用活性、DNAのアプリン部位におけるDNA3'-ホスファターゼ活性
およびエンドヌクレアーゼ作用活性を有する。ExoIIIは好ましくはDNA二重鎖に
おける3'末端を分解する一方、突出した3'末端は分解されない。ロジャーズ（Ro
gers）およびワイス（Weiss）（Gene 11(1980)、187〜195）、ロジャーズ（Roge
rs）およびワイス（Weiss）（Methods Enzymol. 65(1980)、201〜211）、サムブ
ルック（Sambrook,）（同書）、ヘニコフ（Henikoff）（Gene 28(1984)、351〜3
59）、ルンキスト（Ljunquist）ら（J.Bacteriol. 126(1976)、646〜653）、バ
ンデヤー（Vandeyar）ら（Gene 65(1988)、129〜133）および、グオ（Guo）およ
びウー（Wu）（Nucl.Acids Res. 10(1982)、2065〜2084）は、ExoIIIの単離およ
び特徴付けについての概観を提供している。当業者には、例えば標識過程におけ
る一本鎖鋳型の形成（JamesおよびLeffak(Anal.Biochem. 141(1984)、33〜37)）
、および様々な配列決定技術（Smith(Nucl.Acids Res. 6(1979)、831〜848)、Gu
oおよびWu(Methods Enzymol. 100(1983)、60〜96)ならびにHoheislおよびPohl(J
.Mol.Biol. 193(1987)、447〜464)）、ならびに配列決定反応のための、DNAにお
いて挿入されたα-チオリン酸ヌクレオチドおよび、それらにおいて終結するExo
IIIによる分解による、DNA断片の作製（Putneyら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1
981)、7350〜7354)およびLabeitら(DNA 5(1986)、173〜177)）といった、ExoIII
の著しく多様化した技術的適用もまた知られている。二重鎖DNAにおける一本鎖
セグメントの導入およびそれらの突然変異源による処理（ShortleおよびNahtans
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75(1978)、2170〜2174)）または誤りのあるオリゴヌ
クレオチドへのハイブリダイゼーション（NakamayeおよびEckstein(Nucl.Acids
Res. 14(1986)、9679〜9698)）は、特定の領域に突然変異が誘発されたセグメン
トを生じさせる。技術文献において、DNAの修飾のためのExoIIIの多くの他の技
術的適用が説明されている（Masamuneら(J.Biol.Chem. 246(1971)、2680〜2691)
、Luckowら(Nucl.Acids Res. 15(1987)、417〜429)）、Robertsら(Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 76(1979)、760〜764)、Sakonjuら(Cell 19(1980)、13〜25)、Peters
およびBaumeister(J.Bacteriol. 167(1986)、1048〜1054)、Garonら(Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 72(1975)、3039〜3043)、RileyおよびWeintraub(Cell 13(1978)、
281〜293)、Wu(Nature 371(1985)、84〜87)、Henikoff(同書)、HoheislおよびPo
hl(Nucl.Acids Res. 14(1986)、3605)、およびHenikoff(Nucl.Acids Res. 18(19
90)、2961〜2966)）。市販のエキソヌクレアーゼにはまた、3'-5'-エキソヌクレ
アーゼ作用活性をもつ大腸菌のDNAポリメラーゼIIIサブユニットイプシロン（Kr
utyakov(Mol.Biol. 32(1998)、197〜199)）、二重鎖5'-リン酸化DNAにおいてラ
ムダ5'-3'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもつ大腸菌ファージラムダの、ニュー
イングランドバイオラボ社（New England Biolab）のラムダエキソヌクレアーゼ
もある。これらは二重鎖における非リン酸化5'末端および一本鎖DNAをも分解す
るが、その活性は著しく低減している。ラムダエキソヌクレアーゼは二重鎖DNA
のニックまたは一本鎖セグメントにおける活性を全く示さない（Little(Gene Am
plification & Analysis 2(1981)、135〜145)）。USB、ニューイングランドバイ
オラボ社（New England Biolab）、およびカンタムバイオテクノロジー社（Quan
tum Biotechnologies）のBal31ヌクレアーゼは、アルテロモナス・エスペジアナ
（Alteromonas espejiana）Bal31の培養培地から作製される。Bal31は5'末端お
よび3'末端の両方から二重鎖DNAを分解し、さらに、一本鎖DNAにおいてエンドヌ
クレアーゼ作用活性を有する（Grayら(Nucl.Acids Res. 2(1975)、1459〜1492)
、Legerskiら(Nucl.Acids Res. 5(1978)、1445〜1464)、Weiら(J.Biol.Chem. 25
8(1983)、13506〜13512)、Sambrook(同書)、Bencenら(J.Biol.Chem. 259(1984)
、13584〜13589)、HauserおよびGray(Genetic Analysis, Techniques & Applica
tions 8(1991)、139〜147)、ならびにZhenら(Biochemistry 25(1986)、6598〜66
03)）。エキソヌクレアーゼI（ExoI）はUSBによって販売されており、大腸菌に
由来する。ExoIはプロセッシブに3'-5'方向に、一本鎖DNAを特異的に分解する（
Brodyら(J.Biol.Chem. 261(1986)、7136〜7143)、BrodyおよびDoherty(Biochemi
stry 24(1985)、2072〜2076)、PhilipsおよびKushner(J.Biol.Chem. 262(1987)
、455〜459)、Prasherら(J.Biol.Chem. 258 (1983)、6340〜6343)、Prasherら(J
.Bacteriol. 153(1983)、903〜908)およびRayら(J.Biol.Chem. 249 (1974)、537
9〜5381)）。さらに市販のエキソヌクレアーゼには、ミクロコッカス・ルテウス
（Micrococcus luteus）（ATCC 4698）由来のUSBのエキソヌクレアーゼV（EC.1.
3.1.11.5）、大腸菌由来のUSBのエキソヌクレアーゼVII、バクテリオファージT7
由来のUSBのT7-5'-エキソヌクレアーゼ、Gene 6、およびバクテリオファージT5
由来のT5-5'-エキソヌクレアーゼが含まれる（SayersおよびEckstein(J.Biol.Ch
em. 265(1990)、18311〜18317)、Garforthら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)
、38〜49)および、MoyerおよびRothe(J.Virol. 24(1977)、177〜193)）。
代えて、エキソヌクレアーゼIII（ExoIII）（E.C.3.1.11.2）が、エキソヌクレ
アーゼ作用をもつ酵素のクラスの一例として本明細書に述べられる。ExoIIIは例
えばUSB、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Roche Molecular Bioch
emicals）、ストラタジーン社（Stratagen）、ニューイングランドバイオラボ社
（New England Biolab）により販売されている。大腸菌のExoIIIは多様な活性を
もつ。酵素は非プロセッシブであり、DNA二重鎖における特異的な3'-5'-エキソ
ヌクレアーゼ作用活性、DNAのアプリン部位におけるDNA3'-ホスファターゼ活性
およびエンドヌクレアーゼ作用活性を有する。ExoIIIは好ましくはDNA二重鎖に
おける3'末端を分解する一方、突出した3'末端は分解されない。ロジャーズ（Ro
gers）およびワイス（Weiss）（Gene 11(1980)、187〜195）、ロジャーズ（Roge
rs）およびワイス（Weiss）（Methods Enzymol. 65(1980)、201〜211）、サムブ
ルック（Sambrook,）（同書）、ヘニコフ（Henikoff）（Gene 28(1984)、351〜3
59）、ルンキスト（Ljunquist）ら（J.Bacteriol. 126(1976)、646〜653）、バ
ンデヤー（Vandeyar）ら（Gene 65(1988)、129〜133）および、グオ（Guo）およ
びウー（Wu）（Nucl.Acids Res. 10(1982)、2065〜2084）は、ExoIIIの単離およ
び特徴付けについての概観を提供している。当業者には、例えば標識過程におけ
る一本鎖鋳型の形成（JamesおよびLeffak(Anal.Biochem. 141(1984)、33〜37)）
、および様々な配列決定技術（Smith(Nucl.Acids Res. 6(1979)、831〜848)、Gu
oおよびWu(Methods Enzymol. 100(1983)、60〜96)ならびにHoheislおよびPohl(J
.Mol.Biol. 193(1987)、447〜464)）、ならびに配列決定反応のための、DNAにお
いて挿入されたα-チオリン酸ヌクレオチドおよび、それらにおいて終結するExo
IIIによる分解による、DNA断片の作製（Putneyら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1
981)、7350〜7354)およびLabeitら(DNA 5(1986)、173〜177)）といった、ExoIII
の著しく多様化した技術的適用もまた知られている。二重鎖DNAにおける一本鎖
セグメントの導入およびそれらの突然変異源による処理（ShortleおよびNahtans
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75(1978)、2170〜2174)）または誤りのあるオリゴヌ
クレオチドへのハイブリダイゼーション（NakamayeおよびEckstein(Nucl.Acids
Res. 14(1986)、9679〜9698)）は、特定の領域に突然変異が誘発されたセグメン
トを生じさせる。技術文献において、DNAの修飾のためのExoIIIの多くの他の技
術的適用が説明されている（Masamuneら(J.Biol.Chem. 246(1971)、2680〜2691)
、Luckowら(Nucl.Acids Res. 15(1987)、417〜429)）、Robertsら(Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 76(1979)、760〜764)、Sakonjuら(Cell 19(1980)、13〜25)、Peters
およびBaumeister(J.Bacteriol. 167(1986)、1048〜1054)、Garonら(Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 72(1975)、3039〜3043)、RileyおよびWeintraub(Cell 13(1978)、
281〜293)、Wu(Nature 371(1985)、84〜87)、Henikoff(同書)、HoheislおよびPo
hl(Nucl.Acids Res. 14(1986)、3605)、およびHenikoff(Nucl.Acids Res. 18(19
90)、2961〜2966)）。市販のエキソヌクレアーゼにはまた、3'-5'-エキソヌクレ
アーゼ作用活性をもつ大腸菌のDNAポリメラーゼIIIサブユニットイプシロン（Kr
utyakov(Mol.Biol. 32(1998)、197〜199)）、二重鎖5'-リン酸化DNAにおいてラ
ムダ5'-3'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもつ大腸菌ファージラムダの、ニュー
イングランドバイオラボ社（New England Biolab）のラムダエキソヌクレアーゼ
もある。これらは二重鎖における非リン酸化5'末端および一本鎖DNAをも分解す
るが、その活性は著しく低減している。ラムダエキソヌクレアーゼは二重鎖DNA
のニックまたは一本鎖セグメントにおける活性を全く示さない（Little(Gene Am
plification & Analysis 2(1981)、135〜145)）。USB、ニューイングランドバイ
オラボ社（New England Biolab）、およびカンタムバイオテクノロジー社（Quan
tum Biotechnologies）のBal31ヌクレアーゼは、アルテロモナス・エスペジアナ
（Alteromonas espejiana）Bal31の培養培地から作製される。Bal31は5'末端お
よび3'末端の両方から二重鎖DNAを分解し、さらに、一本鎖DNAにおいてエンドヌ
クレアーゼ作用活性を有する（Grayら(Nucl.Acids Res. 2(1975)、1459〜1492)
、Legerskiら(Nucl.Acids Res. 5(1978)、1445〜1464)、Weiら(J.Biol.Chem. 25
8(1983)、13506〜13512)、Sambrook(同書)、Bencenら(J.Biol.Chem. 259(1984)
、13584〜13589)、HauserおよびGray(Genetic Analysis, Techniques & Applica
tions 8(1991)、139〜147)、ならびにZhenら(Biochemistry 25(1986)、6598〜66
03)）。エキソヌクレアーゼI（ExoI）はUSBによって販売されており、大腸菌に
由来する。ExoIはプロセッシブに3'-5'方向に、一本鎖DNAを特異的に分解する（
Brodyら(J.Biol.Chem. 261(1986)、7136〜7143)、BrodyおよびDoherty(Biochemi
stry 24(1985)、2072〜2076)、PhilipsおよびKushner(J.Biol.Chem. 262(1987)
、455〜459)、Prasherら(J.Biol.Chem. 258 (1983)、6340〜6343)、Prasherら(J
.Bacteriol. 153(1983)、903〜908)およびRayら(J.Biol.Chem. 249 (1974)、537
9〜5381)）。さらに市販のエキソヌクレアーゼには、ミクロコッカス・ルテウス
（Micrococcus luteus）（ATCC 4698）由来のUSBのエキソヌクレアーゼV（EC.1.
3.1.11.5）、大腸菌由来のUSBのエキソヌクレアーゼVII、バクテリオファージT7
由来のUSBのT7-5'-エキソヌクレアーゼ、Gene 6、およびバクテリオファージT5
由来のT5-5'-エキソヌクレアーゼが含まれる（SayersおよびEckstein(J.Biol.Ch
em. 265(1990)、18311〜18317)、Garforthら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)
、38〜49)および、MoyerおよびRothe(J.Virol. 24(1977)、177〜193)）。
【００４２】
市販されてはいないが、生化学および分子生物学の標準法によって当業者には
利用可能な非常に多数のエキソヌクレアーゼ、例えばサッカロミセス・セレヴィ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ YNT20（Ha
nekampおよびThorsness(Current Genetics 34(1999)、438〜448)）、ヒトWNR（K
amath-Loebら(J.Biol.Chem. 273(1998)、34145〜34150)、Huangら(Nat.Genet. 2
0(1998)、114〜116)）、様々な生物由来のp53（Mummenbrauerら(Cell 85(1996)
、1089〜1099)、Janusら(Mol.Cell. Biol. 19(1999)、2155〜2168)）、Bリンパ
球由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ（KenterおよびTredup(Mol.Cell.Biol. 11(1
991)、4398〜4404)）、哺乳動物由来のTREX1およびTREX2（MazurおよびPerrino(
J.Biol.Chem. 274(1999)、19655〜19660)）、ヒトMre11（Paullら(Molecular Ce
ll 1(1998)、969〜979)）、ヒト骨髄芽球由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ（Per
rinoら(J.Biol.Chem. 269(1994)、16357〜16363)）、ヒト急性リンパ芽球性白血
病H9細胞の細胞質ゾル由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ（Skalskiら(Biochemica
l Pharmacology 50(1995)、815〜821)）、およびヒトVDJP（ZhuおよびHalligan(
Biochem.Biophys.Res.Commun. 259(1999)、262〜270)）についても、技術文献に
て説明されている。多数の5'-3'-エキソヌクレアーゼについてもまた、技術文献
において説明されており、例えばヒト胎盤核由来のデオキシリボヌクレアーゼVI
I（PedriniおよびGrossman(J.Biol.Chem. 258(1983)、1536〜1543)）、バクテリ
オファージN4由来の5'-3'-エキソヌクレアーゼ（Guintaら(J.Biol.Chem. 261(19
86)、10736〜10743)）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の核由来のエキソヌクレアーゼV（Burgersら(J.Biol.Chem. 263(1988)、8
099〜8105)）、仔ウシ胸腺由来のエキソヌクレアーゼ（Siegalら(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 89(1992)、9377〜9381)、Muranteら(J.Biol.Chem. 269(1994)、1191
〜1196)）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の核
抽出物由来の5'-3'-エキソヌクレアーゼ（ExoI）（HuangおよびSymington(Mol.C
ell.Biol.(1993)、3125〜3134)；Fiorentiniら(Mol.Cell.Biol.17(1997)、2764
〜2773)）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来
の、またヒトXPG相同物由来のRAD2およびRTH1（Habrokenら(J.Biol.Chem. 269(1
994)、31342〜31345)、Sommersら(J.Biol.Chem. 270(1995)、4193〜4196)）、ウ
イルスポリメラーゼ関連エキソヌクレアーゼ（Sayers(Methods Enzymol.275(199
6)、227〜238)）、バクテリオファージT4由来のT4-リボヌクレアーゼH（Mueser
ら(Cell 85(1996)、1101〜1112)）、およびヒトヴェルナー症候群ヘリカーゼ（S
uzukiら(Nucl.Acids Res. 27(1999)、2361〜2368)）のように、生化学および分
子生物学の標準法によって当業者に利用可能である。加えて、以下に説明される
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ作用活性も使用できる。
利用可能な非常に多数のエキソヌクレアーゼ、例えばサッカロミセス・セレヴィ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ YNT20（Ha
nekampおよびThorsness(Current Genetics 34(1999)、438〜448)）、ヒトWNR（K
amath-Loebら(J.Biol.Chem. 273(1998)、34145〜34150)、Huangら(Nat.Genet. 2
0(1998)、114〜116)）、様々な生物由来のp53（Mummenbrauerら(Cell 85(1996)
、1089〜1099)、Janusら(Mol.Cell. Biol. 19(1999)、2155〜2168)）、Bリンパ
球由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ（KenterおよびTredup(Mol.Cell.Biol. 11(1
991)、4398〜4404)）、哺乳動物由来のTREX1およびTREX2（MazurおよびPerrino(
J.Biol.Chem. 274(1999)、19655〜19660)）、ヒトMre11（Paullら(Molecular Ce
ll 1(1998)、969〜979)）、ヒト骨髄芽球由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ（Per
rinoら(J.Biol.Chem. 269(1994)、16357〜16363)）、ヒト急性リンパ芽球性白血
病H9細胞の細胞質ゾル由来の3'-5'-エキソヌクレアーゼ（Skalskiら(Biochemica
l Pharmacology 50(1995)、815〜821)）、およびヒトVDJP（ZhuおよびHalligan(
Biochem.Biophys.Res.Commun. 259(1999)、262〜270)）についても、技術文献に
て説明されている。多数の5'-3'-エキソヌクレアーゼについてもまた、技術文献
において説明されており、例えばヒト胎盤核由来のデオキシリボヌクレアーゼVI
I（PedriniおよびGrossman(J.Biol.Chem. 258(1983)、1536〜1543)）、バクテリ
オファージN4由来の5'-3'-エキソヌクレアーゼ（Guintaら(J.Biol.Chem. 261(19
86)、10736〜10743)）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の核由来のエキソヌクレアーゼV（Burgersら(J.Biol.Chem. 263(1988)、8
099〜8105)）、仔ウシ胸腺由来のエキソヌクレアーゼ（Siegalら(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 89(1992)、9377〜9381)、Muranteら(J.Biol.Chem. 269(1994)、1191
〜1196)）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の核
抽出物由来の5'-3'-エキソヌクレアーゼ（ExoI）（HuangおよびSymington(Mol.C
ell.Biol.(1993)、3125〜3134)；Fiorentiniら(Mol.Cell.Biol.17(1997)、2764
〜2773)）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来
の、またヒトXPG相同物由来のRAD2およびRTH1（Habrokenら(J.Biol.Chem. 269(1
994)、31342〜31345)、Sommersら(J.Biol.Chem. 270(1995)、4193〜4196)）、ウ
イルスポリメラーゼ関連エキソヌクレアーゼ（Sayers(Methods Enzymol.275(199
6)、227〜238)）、バクテリオファージT4由来のT4-リボヌクレアーゼH（Mueser
ら(Cell 85(1996)、1101〜1112)）、およびヒトヴェルナー症候群ヘリカーゼ（S
uzukiら(Nucl.Acids Res. 27(1999)、2361〜2368)）のように、生化学および分
子生物学の標準法によって当業者に利用可能である。加えて、以下に説明される
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ作用活性も使用できる。
【００４３】
本発明の方法の好ましい態様において、本発明の方法の段階(c)に従った二重
鎖ポリヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が3'-5'方向
で実行される。
鎖ポリヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が3'-5'方向
で実行される。
【００４４】
特に好ましい態様において（態様A；図2、第一サイクルを参照のこと）、二重
鎖の1つの鎖は、本態様において2つのポリヌクレオチド鎖のうち1つのみがエキ
ソヌクレアーゼ作用による分解を受ける一方、段階(c)に従う鋳型に沿った一本
鎖合成において相補的な鎖が鋳型として働くよう、エキソヌクレアーゼ作用によ
る分解から保護される。
鎖の1つの鎖は、本態様において2つのポリヌクレオチド鎖のうち1つのみがエキ
ソヌクレアーゼ作用による分解を受ける一方、段階(c)に従う鋳型に沿った一本
鎖合成において相補的な鎖が鋳型として働くよう、エキソヌクレアーゼ作用によ
る分解から保護される。
【００４５】
その他の好ましい態様においては、両鎖がそれらの配列の一部を鋳型として使
用され、配列のその他の部分が半保存的一本鎖合成を受けるように、双方のポリ
ヌクレオチド鎖がエキソヌクレアーゼ作用による分解を受ける（態様B、図3、第
一サイクル）。
用され、配列のその他の部分が半保存的一本鎖合成を受けるように、双方のポリ
ヌクレオチド鎖がエキソヌクレアーゼ作用による分解を受ける（態様B、図3、第
一サイクル）。
【００４６】
段階(c)に従って作製されたヘテロ二本鎖ポリヌクレオチドにおける一本鎖ポ
リヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ作用による分解は、当業者に既知であり、
例えばロス（Ross）（Methods 17(1999)、52〜59）；ホヘーセル（Hoheisel）（
Anal.Biochem. 209(1993)、238〜246）およびオースベル（Ausubel）（「分子生
物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」
；Wiley(1987)）において説明されている方法に従って実行できる。特に、化学
的または生化学的方法が使用される。エキソヌクレアーゼ作用による分解は、例
えば、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIIIを用いた3'-エキソヌクレアーゼ作用
による分解のように、生化学的な様式で対応する特異的活性をもつ酵素によって
実施されることが好ましい。分解長およびそれによる新たな組合せの位置選択性
は、部分的な分解の反応条件および反応時間によって決定的に影響を受ける可能
性がある。例えば緩衝条件または温度を変化させることにより、補因子を添加す
ることにより、しかし好ましくはエキソヌクレアーゼを添加することにより、反
応は開始でき、例えば緩衝条件を変化させることにより、阻害剤またはプロテア
ーゼを添加することにより、温度を低下させることにより、しかし好ましくは温
度を上昇させることにより（例えば62℃におけるエキソヌクレアーゼIIIの変性
）、停止できる。エキソヌクレアーゼの分解速度は主に反応条件に依存し、広い
範囲で調整もできる。例えばエキソヌクレアーゼIIIの分解速度がある反応条件
下において1分当たり400ヌクレオチドの場合、または好ましくは25ヌクレオチド
の場合、インキュベーション時間を選択することによって、例えば正確性が20〜
30 ntヌクレオチドの範囲であるよう、範囲を調整できる。例えば実施例2および
図8において示されるように、エキソヌクレアーゼ作用による分解を調節するた
めに異なる条件を調整するのは当業者には一般的な知識である。
リヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ作用による分解は、当業者に既知であり、
例えばロス（Ross）（Methods 17(1999)、52〜59）；ホヘーセル（Hoheisel）（
Anal.Biochem. 209(1993)、238〜246）およびオースベル（Ausubel）（「分子生
物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」
；Wiley(1987)）において説明されている方法に従って実行できる。特に、化学
的または生化学的方法が使用される。エキソヌクレアーゼ作用による分解は、例
えば、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIIIを用いた3'-エキソヌクレアーゼ作用
による分解のように、生化学的な様式で対応する特異的活性をもつ酵素によって
実施されることが好ましい。分解長およびそれによる新たな組合せの位置選択性
は、部分的な分解の反応条件および反応時間によって決定的に影響を受ける可能
性がある。例えば緩衝条件または温度を変化させることにより、補因子を添加す
ることにより、しかし好ましくはエキソヌクレアーゼを添加することにより、反
応は開始でき、例えば緩衝条件を変化させることにより、阻害剤またはプロテア
ーゼを添加することにより、温度を低下させることにより、しかし好ましくは温
度を上昇させることにより（例えば62℃におけるエキソヌクレアーゼIIIの変性
）、停止できる。エキソヌクレアーゼの分解速度は主に反応条件に依存し、広い
範囲で調整もできる。例えばエキソヌクレアーゼIIIの分解速度がある反応条件
下において1分当たり400ヌクレオチドの場合、または好ましくは25ヌクレオチド
の場合、インキュベーション時間を選択することによって、例えば正確性が20〜
30 ntヌクレオチドの範囲であるよう、範囲を調整できる。例えば実施例2および
図8において示されるように、エキソヌクレアーゼ作用による分解を調節するた
めに異なる条件を調整するのは当業者には一般的な知識である。
【００４７】
または、3'-5'-エキソヌクレアーゼ作用活性もまた、このポリメラーゼが対応
するエキソヌクレアーゼ機能を果たし得る限りにおいては、段階(d)において使
用されるポリメラーゼによって提供できる。
するエキソヌクレアーゼ機能を果たし得る限りにおいては、段階(d)において使
用されるポリメラーゼによって提供できる。
【００４８】
1つの鎖が3'-エキソヌクレアーゼ作用による分解から保護される、図2に示さ
れる態様Aに関して、3'末端をエキソヌクレアーゼ作用による分解から保護する
ためには、例えばホスホリボース骨格の3'末端におけるホスホジエステルの代わ
りにチオエステルを挿入することによる等、様々な方法がある。両側チオエステ
ル修飾の場合、配列における1つだけの制限部位の事前の挿入、およびそれに続
く制限酵素による切断によって、2つの鎖のうち1つを選択的に保護できる（態様
A-1）。さらに、最初に環状一本鎖として2つの鎖のうち1つを提供すること（例
えば、ウイルス一本鎖ゲノムを使用することによる、態様A-2）により、または4
塩基以上からなる一本鎖3'-突出部（即ち、エキソヌクレアーゼIIIが使用される
場合に可能である、態様A-3）を作製することにより、1つの鎖を保護できる。さ
らに、リガーゼにより、二重鎖の片側の両末端は、環状一本鎖を付着することに
より共有結合できる（態様A-4）。
れる態様Aに関して、3'末端をエキソヌクレアーゼ作用による分解から保護する
ためには、例えばホスホリボース骨格の3'末端におけるホスホジエステルの代わ
りにチオエステルを挿入することによる等、様々な方法がある。両側チオエステ
ル修飾の場合、配列における1つだけの制限部位の事前の挿入、およびそれに続
く制限酵素による切断によって、2つの鎖のうち1つを選択的に保護できる（態様
A-1）。さらに、最初に環状一本鎖として2つの鎖のうち1つを提供すること（例
えば、ウイルス一本鎖ゲノムを使用することによる、態様A-2）により、または4
塩基以上からなる一本鎖3'-突出部（即ち、エキソヌクレアーゼIIIが使用される
場合に可能である、態様A-3）を作製することにより、1つの鎖を保護できる。さ
らに、リガーゼにより、二重鎖の片側の両末端は、環状一本鎖を付着することに
より共有結合できる（態様A-4）。
【００４９】
本発明に係る方法の別の好ましい態様において、ヘテロ二本鎖の非対合セグメ
ントは、例えば大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIにより3'-5'方向に分解される
ように、段階(c)において一本鎖特異的なエキソヌクレアーゼによりエキソヌク
レアーゼ作用で分解される。
ントは、例えば大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIにより3'-5'方向に分解される
ように、段階(c)において一本鎖特異的なエキソヌクレアーゼによりエキソヌク
レアーゼ作用で分解される。
【００５０】
本発明の方法のその他の変異体においては、段階(c)に従った二重鎖ポリヌク
レオチド分子のエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が5'-3'方向にて実
行される。好ましくは、バクテリオファージT7由来のT7-エキソヌクレアーゼGen
e 6を使用する。
レオチド分子のエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が5'-3'方向にて実
行される。好ましくは、バクテリオファージT7由来のT7-エキソヌクレアーゼGen
e 6を使用する。
【００５１】
さらに、好ましい態様においては、例えば大腸菌由来のエキソヌクレアーゼVI
Iによって、ヘテロ二本鎖の非対合セグメントが5'-3'方向にてエキソヌクレアー
ゼ作用で分解される。加えて、ポリヌクレオチド二重鎖の5'末端が5'-エキソヌ
クレアーゼ作用による一本鎖分解から保護されるような様式で修飾されることが
好ましい。
Iによって、ヘテロ二本鎖の非対合セグメントが5'-3'方向にてエキソヌクレアー
ゼ作用で分解される。加えて、ポリヌクレオチド二重鎖の5'末端が5'-エキソヌ
クレアーゼ作用による一本鎖分解から保護されるような様式で修飾されることが
好ましい。
【００５２】
本発明の方法の別の好ましい態様において、本発明の方法の段階(c)に従った
エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が実行される前に、二重鎖ポリヌク
レオチド分子において一本鎖ニックが挿入される（態様C、図4、第一サイクル）
。平均的には、二重鎖ポリヌクレオチド分子当たり1つまたはそれ未満の一本鎖
ニックが存在する。
エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が実行される前に、二重鎖ポリヌク
レオチド分子において一本鎖ニックが挿入される（態様C、図4、第一サイクル）
。平均的には、二重鎖ポリヌクレオチド分子当たり1つまたはそれ未満の一本鎖
ニックが存在する。
【００５３】
例えば配列特異的なニッキング酵素によって、一本鎖ニックは挿入できる。そ
のようなニッキング酵素の例は、バチルス・シチノスポラス（Bacillus chitino
sporus）由来のニッキング酵素V.BchI、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ba
cillus stearothermophilus）由来のN.BstNBI、バチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）由来のN.BstSEI、クロレラNC64A株由来の
N.CviPII、クロレラNC64A株由来のN.CviQXI、大腸菌由来のV.EcoDcm、ヘモフィ
ルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae）由来のV.HpaII、ノ
カルジア・アエロコロニジンズ（Nocardia aerocolonigenes）由来のV.NeaI、お
よびキサントモナス・オリザ（Xanthomonas oryzae）由来のV.XorIIである。
のようなニッキング酵素の例は、バチルス・シチノスポラス（Bacillus chitino
sporus）由来のニッキング酵素V.BchI、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ba
cillus stearothermophilus）由来のN.BstNBI、バチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）由来のN.BstSEI、クロレラNC64A株由来の
N.CviPII、クロレラNC64A株由来のN.CviQXI、大腸菌由来のV.EcoDcm、ヘモフィ
ルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae）由来のV.HpaII、ノ
カルジア・アエロコロニジンズ（Nocardia aerocolonigenes）由来のV.NeaI、お
よびキサントモナス・オリザ（Xanthomonas oryzae）由来のV.XorIIである。
【００５４】
または、一本鎖ニックは、配列非特異的なニッキング酵素によっても二重鎖ポ
リヌクレオチドに導入できる。この場合、Mg2+を補因子として仔ウシの膵臓由来
のデオキシリボヌクレアーゼIを使用することができる（Kunitz, J.Genetic Phy
siology 33(1950)、349；Kunitz, J.Genetic Physiology 33(1950)、363および
、Melgacおよび Goldthwaite、J.Biolog.Chem. 243(1968)、4409）。
リヌクレオチドに導入できる。この場合、Mg2+を補因子として仔ウシの膵臓由来
のデオキシリボヌクレアーゼIを使用することができる（Kunitz, J.Genetic Phy
siology 33(1950)、349；Kunitz, J.Genetic Physiology 33(1950)、363および
、Melgacおよび Goldthwaite、J.Biolog.Chem. 243(1968)、4409）。
【００５５】
その他の好ましい態様においては、一本鎖ニックを挿入する場合、引き続き一
本鎖ニックにて開始する、5'-3'方向における本方法の段階(c)に従ったエキソヌ
クレアーゼ作用による一本鎖の分解が行われる。この場合、再度、例えばバクテ
リオファージT7由来のT7-エキソヌクレアーゼ Gene 6を使用できる。
本鎖ニックにて開始する、5'-3'方向における本方法の段階(c)に従ったエキソヌ
クレアーゼ作用による一本鎖の分解が行われる。この場合、再度、例えばバクテ
リオファージT7由来のT7-エキソヌクレアーゼ Gene 6を使用できる。
【００５６】
さらに、ヘテロ二本鎖の非対合セグメントは、大腸菌由来のエキソヌクレアー
ゼVIIによって、エキソヌクレアーゼ作用で分解されることが好ましい。
ゼVIIによって、エキソヌクレアーゼ作用で分解されることが好ましい。
【００５７】
本発明の方法の別の好ましい態様においては、一本鎖ニックを挿入する場合、
引き続き一本鎖ニックにて開始する、3'-5'方向における本方法の段階(c)に従っ
たエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が行われる。この場合、大腸菌由
来のエキソヌクレアーゼIIIを使用することが好ましい。
引き続き一本鎖ニックにて開始する、3'-5'方向における本方法の段階(c)に従っ
たエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が行われる。この場合、大腸菌由
来のエキソヌクレアーゼIIIを使用することが好ましい。
【００５８】
好ましくは、さらに、ヘテロ二本鎖の非対合セグメントは、例えば大腸菌由来
のエキソヌクレアーゼIによって3'-5'方向にてエキソヌクレアーゼ作用で分解さ
れる。
のエキソヌクレアーゼIによって3'-5'方向にてエキソヌクレアーゼ作用で分解さ
れる。
【００５９】
本発明の方法の別の好ましい態様においては、一本鎖ニックを挿入する場合、
引き続き一本鎖ニックにて開始する、5'-3'方向および3'-5'方向の両方における
、段階(c)に従ったエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が行われる。こ
の場合、前述の酵素を使用できる。好ましくは、アルテロモナス・エスペジアナ
（Alteromonas espejiana）Bal31の培養培地由来のBal31ヌクレアーゼを使用す
る。さらに、好ましくはヘテロ二本鎖の非対合セグメントは、大腸菌由来のエキ
ソヌクレアーゼVIIによってエキソヌクレアーゼ作用で分解される。
引き続き一本鎖ニックにて開始する、5'-3'方向および3'-5'方向の両方における
、段階(c)に従ったエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解が行われる。こ
の場合、前述の酵素を使用できる。好ましくは、アルテロモナス・エスペジアナ
（Alteromonas espejiana）Bal31の培養培地由来のBal31ヌクレアーゼを使用す
る。さらに、好ましくはヘテロ二本鎖の非対合セグメントは、大腸菌由来のエキ
ソヌクレアーゼVIIによってエキソヌクレアーゼ作用で分解される。
【００６０】
本発明の方法のその他の好ましい態様においては、特に一本鎖ニックの挿入後
、本発明の方法の段階(c)に従った5'-エキソヌクレアーゼ作用による分解のため
、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもつポリメラーゼが使用される。
、本発明の方法の段階(c)に従った5'-エキソヌクレアーゼ作用による分解のため
、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもつポリメラーゼが使用される。
【００６１】
最後に、ポリメラーゼ、および鋳型としてヘテロ二本鎖の相補的な鎖の対応す
る5'-セグメントまたは3'-セグメントを用いて、部分的に分解された一本鎖の3'
末端または5'末端の新たな伸長により、本発明の方法の段階(d)に従ったポリヌ
クレオチドの半保存的合成を実行する。「半保存的一本鎖合成」という用語は、対
応する鋳型鎖の情報によって既存の一本鎖を伸長することによる、ポリヌクレオ
チドの合成を意味する。
る5'-セグメントまたは3'-セグメントを用いて、部分的に分解された一本鎖の3'
末端または5'末端の新たな伸長により、本発明の方法の段階(d)に従ったポリヌ
クレオチドの半保存的合成を実行する。「半保存的一本鎖合成」という用語は、対
応する鋳型鎖の情報によって既存の一本鎖を伸長することによる、ポリヌクレオ
チドの合成を意味する。
【００６２】
態様に応じて、2つの鎖のうち1つのみ（例えばコード鎖または非コード鎖）が
伸長される（態様A）か、または両方の鎖が5'末端もしくは3'末端をもつ鋳型と
して使用される。同時に、それらは3'末端または5'末端において新たに合成され
る（態様B）。態様Bにおいては、ポリヌクレオチドの半保存的合成に引き続き、
相補的なポリヌクレオチドの単独合成を行うことができる。それによって、分解
されなかった保存的配列セグメントの効率のよい新たな組合わせが達成される（
図4を参照のこと）。当業者は鋳型に沿った合成の実施に精通しており、それは
例えば、サムブルック（Sambrook）（「分子クローニング（Molecular Cloning
）」、コールドスプリングハーバー研究所出版、(1989))またはオースベル（Aus
ubel）（同書）にて説明されている。
伸長される（態様A）か、または両方の鎖が5'末端もしくは3'末端をもつ鋳型と
して使用される。同時に、それらは3'末端または5'末端において新たに合成され
る（態様B）。態様Bにおいては、ポリヌクレオチドの半保存的合成に引き続き、
相補的なポリヌクレオチドの単独合成を行うことができる。それによって、分解
されなかった保存的配列セグメントの効率のよい新たな組合わせが達成される（
図4を参照のこと）。当業者は鋳型に沿った合成の実施に精通しており、それは
例えば、サムブルック（Sambrook）（「分子クローニング（Molecular Cloning
）」、コールドスプリングハーバー研究所出版、(1989))またはオースベル（Aus
ubel）（同書）にて説明されている。
【００６３】
ポリメラーゼ反応については、3'末端または5'末端から開始してポリヌクレオ
チド鎖を重合できる、鋳型に沿ったポリヌクレオチド重合活性をもつ任意の酵素
を使用できる。著しく多様な生物由来の、および異なる機能をもつ多数のポリメ
ラーゼが、既に単離され報告されている。鋳型の種類および合成されるポリヌク
レオチドに関して、DNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆
転写酵素）、DNA依存性RNAポリメラーゼ、およびRNA依存性RNAポリメラーゼ（レ
プリカーゼ）の間に差異が生じる。温度安定性に関して、非熱安定性ポリメラー
ゼ（37℃）と熱安定性ポリメラーゼ（75〜95℃）とでは異なってくる。加えて、
ポリメラーゼは5'-3'-エキソヌクレアーゼ作用活性および3'-5'-エキソヌクレア
ーゼ作用活性の存在に関して異なる。DNA依存性DNAポリメラーゼは最も重要なポ
リメラーゼである。
チド鎖を重合できる、鋳型に沿ったポリヌクレオチド重合活性をもつ任意の酵素
を使用できる。著しく多様な生物由来の、および異なる機能をもつ多数のポリメ
ラーゼが、既に単離され報告されている。鋳型の種類および合成されるポリヌク
レオチドに関して、DNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆
転写酵素）、DNA依存性RNAポリメラーゼ、およびRNA依存性RNAポリメラーゼ（レ
プリカーゼ）の間に差異が生じる。温度安定性に関して、非熱安定性ポリメラー
ゼ（37℃）と熱安定性ポリメラーゼ（75〜95℃）とでは異なってくる。加えて、
ポリメラーゼは5'-3'-エキソヌクレアーゼ作用活性および3'-5'-エキソヌクレア
ーゼ作用活性の存在に関して異なる。DNA依存性DNAポリメラーゼは最も重要なポ
リメラーゼである。
【００６４】
特に、最適温度が厳密に37℃または約37℃であるDNAポリメラーゼを使用でき
る。これらは、例えば大腸菌由来のDNAポリメラーゼI、バクテリオファージT7由
来のT7 DNAポリメラーゼ、およびバクテリオファージT4由来のT4 DNAポリメラー
ゼを含み、これらは各々、例えばUSB、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカル
社（Roche Molecular Biochemicals）、ストラタジーン社（Stratagen）、NEBま
たはカンタムバイオテクノロジー社（Quantum Biotechnologies）のような、多
数の製造業者によって販売されている。大腸菌由来のDNAポリメラーゼI（ホロ酵
素）は5'-3'ポリメラーゼ活性、3'-5'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ
活性および5'-3' エキソヌクレアーゼ活性をもつ。酵素はニックトランスレーシ
ョン法によってDNAのインビトロの標識に使用される（Rigbyら(J.Mol.Biol. 113
(1977)、237〜251)）。ホロ酵素と対照的に、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIの
クレノウ断片もまた、5'-エキソヌクレアーゼ活性をもたず、これはT7 DNAポリ
メラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼと全く同様である。ゆえに、これらの酵素は
いわゆるフィルイン反応、または長い鎖の合成に使用される（Youngら(Biochemi
stry 31(1992)、8675〜8690)、Lehman(Methods Enzymol. 29(1974)、46〜53)）
。結局、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片の3'-5'-exo(-)変異体も
、3'-エキソヌクレアーゼ活性をもたない。この酵素はサンガー（Sanger）（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)、5463〜5467)）によるDNA配列決定にしばしば使
用される。これらの酵素に加えて、本発明の方法にて使用できる、異なる特性を
もった、複数の他の37℃ DNAポリメラーゼが存在する。
る。これらは、例えば大腸菌由来のDNAポリメラーゼI、バクテリオファージT7由
来のT7 DNAポリメラーゼ、およびバクテリオファージT4由来のT4 DNAポリメラー
ゼを含み、これらは各々、例えばUSB、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカル
社（Roche Molecular Biochemicals）、ストラタジーン社（Stratagen）、NEBま
たはカンタムバイオテクノロジー社（Quantum Biotechnologies）のような、多
数の製造業者によって販売されている。大腸菌由来のDNAポリメラーゼI（ホロ酵
素）は5'-3'ポリメラーゼ活性、3'-5'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ
活性および5'-3' エキソヌクレアーゼ活性をもつ。酵素はニックトランスレーシ
ョン法によってDNAのインビトロの標識に使用される（Rigbyら(J.Mol.Biol. 113
(1977)、237〜251)）。ホロ酵素と対照的に、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIの
クレノウ断片もまた、5'-エキソヌクレアーゼ活性をもたず、これはT7 DNAポリ
メラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼと全く同様である。ゆえに、これらの酵素は
いわゆるフィルイン反応、または長い鎖の合成に使用される（Youngら(Biochemi
stry 31(1992)、8675〜8690)、Lehman(Methods Enzymol. 29(1974)、46〜53)）
。結局、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片の3'-5'-exo(-)変異体も
、3'-エキソヌクレアーゼ活性をもたない。この酵素はサンガー（Sanger）（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)、5463〜5467)）によるDNA配列決定にしばしば使
用される。これらの酵素に加えて、本発明の方法にて使用できる、異なる特性を
もった、複数の他の37℃ DNAポリメラーゼが存在する。
【００６５】
75℃が最適温度であり且つ95℃においても十分安定である最も普及している熱
安定性DNAポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由
来のTaq DNAポリメラーゼであり、市販されている。Taq DNAポリメラーゼは、3'
-5' エキソヌクレアーゼ活性をもたない、高度にプロセッシブな5'-3' DNAポリ
メラーゼである。それはしばしば標準PCR法、配列決定反応、および変異誘発PCR
法に用いられる（CadwellおよびJoyce(PCR Methods Appl. 3(1994)、136〜140)
、ArigoniおよびKaminski(Methods Mol.Biol. 23(1993)、109〜114)）。サーマ
ス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8由来のTth DNAポリメラーゼお
よびサーマス・フラバス（Thermus flavus）由来のTfl DNAポリメラーゼは同様
の特性をもつ。Tth DNAポリメラーゼはさらに、マンガンイオンの存在下におい
て固有の逆転写酵素（RT）活性をもつ（Cusiら(Biotechniques 17(1994)、1034
〜1036)）。5'-エキソヌクレアーゼ活性をもたないが3'-エキソヌクレアーゼ活
性をもつ熱安定性DNAポリメラーゼのうち、多くのものが市販されている：ピロ
コッカス・ウォセイ（Pyrococcus woesei）由来のPwo DNAポリメラーゼ、サーモ
コッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のTli、VentまたはDeepV
ent DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来
のPfxまたはPfu DNAポリメラーゼ、サーマス・ユビキトス（Thermus ubiquitous
）由来のTub DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima
）由来のTmaまたはUlTma DNAポリメラーゼ（NewtonおよびGraham、PCR, Spektru
m Akad. Verlag Heidelberg(1994)、1）。3'-プルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ活性をもたないポリメラーゼは、可能な限り欠損のないPCR産物の増幅
に使用される。結局、Taq DNAポリメラーゼのStoffel断片を用い、Vent-(exo-)
DNAポリメラーゼおよびTsp DNAポリメラーゼを用いて、5'-エキソヌクレアーゼ
活性をもたない、および3'-エキソヌクレアーゼ活性をもたない、熱安定性DNAポ
リメラーゼが得られる。
安定性DNAポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由
来のTaq DNAポリメラーゼであり、市販されている。Taq DNAポリメラーゼは、3'
-5' エキソヌクレアーゼ活性をもたない、高度にプロセッシブな5'-3' DNAポリ
メラーゼである。それはしばしば標準PCR法、配列決定反応、および変異誘発PCR
法に用いられる（CadwellおよびJoyce(PCR Methods Appl. 3(1994)、136〜140)
、ArigoniおよびKaminski(Methods Mol.Biol. 23(1993)、109〜114)）。サーマ
ス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8由来のTth DNAポリメラーゼお
よびサーマス・フラバス（Thermus flavus）由来のTfl DNAポリメラーゼは同様
の特性をもつ。Tth DNAポリメラーゼはさらに、マンガンイオンの存在下におい
て固有の逆転写酵素（RT）活性をもつ（Cusiら(Biotechniques 17(1994)、1034
〜1036)）。5'-エキソヌクレアーゼ活性をもたないが3'-エキソヌクレアーゼ活
性をもつ熱安定性DNAポリメラーゼのうち、多くのものが市販されている：ピロ
コッカス・ウォセイ（Pyrococcus woesei）由来のPwo DNAポリメラーゼ、サーモ
コッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のTli、VentまたはDeepV
ent DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来
のPfxまたはPfu DNAポリメラーゼ、サーマス・ユビキトス（Thermus ubiquitous
）由来のTub DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima
）由来のTmaまたはUlTma DNAポリメラーゼ（NewtonおよびGraham、PCR, Spektru
m Akad. Verlag Heidelberg(1994)、1）。3'-プルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ活性をもたないポリメラーゼは、可能な限り欠損のないPCR産物の増幅
に使用される。結局、Taq DNAポリメラーゼのStoffel断片を用い、Vent-(exo-)
DNAポリメラーゼおよびTsp DNAポリメラーゼを用いて、5'-エキソヌクレアーゼ
活性をもたない、および3'-エキソヌクレアーゼ活性をもたない、熱安定性DNAポ
リメラーゼが得られる。
【００６６】
RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）のうち、鳥類骨髄芽球症ウイルス由
来のAMV逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のM-MuLV逆転写酵素、
およびヒト免疫不全ウイルス由来のHIV逆転写酵素が最も一般的な酵素であり、
それらはまたNEB、ライフテクノロジー社（Life Technologies）、カンタムバイ
オテクノロジー社（Quantum Biotechnologies）のような様々な製造業者により
販売されている。HIV逆転写酵素のように、AMV逆転写酵素は関連したリボヌクレ
アーゼH活性をもつ。この活性はM-MuLV逆転写酵素においては著しく低減される
。M-MuLV逆転写酵素およびAMV逆転写酵素のいずれも、3'-5'-エキソヌクレアー
ゼ活性をもたない。
来のAMV逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のM-MuLV逆転写酵素、
およびヒト免疫不全ウイルス由来のHIV逆転写酵素が最も一般的な酵素であり、
それらはまたNEB、ライフテクノロジー社（Life Technologies）、カンタムバイ
オテクノロジー社（Quantum Biotechnologies）のような様々な製造業者により
販売されている。HIV逆転写酵素のように、AMV逆転写酵素は関連したリボヌクレ
アーゼH活性をもつ。この活性はM-MuLV逆転写酵素においては著しく低減される
。M-MuLV逆転写酵素およびAMV逆転写酵素のいずれも、3'-5'-エキソヌクレアー
ゼ活性をもたない。
【００６７】
DNA依存性RNAポリメラーゼのうち最も一般的な酵素には、大腸菌由来のRNAポ
リメラーゼ、バクテリオファージSP6に感染させたネズミチフス菌（Salmonella
typhimurium）LT2由来のSP6-RNAポリメラーゼ、バクテリオファージT3由来のT3-
RNAポリメラーゼ、およびバクテリオファージT7由来のT７-RNAポリメラーゼT7が
含まれる。
リメラーゼ、バクテリオファージSP6に感染させたネズミチフス菌（Salmonella
typhimurium）LT2由来のSP6-RNAポリメラーゼ、バクテリオファージT3由来のT3-
RNAポリメラーゼ、およびバクテリオファージT7由来のT７-RNAポリメラーゼT7が
含まれる。
【００６８】
本発明の方法の好ましい態様において、本方法の段階(d)における鋳型鎖はDNA
分子であり、DNA依存性DNAポリメラーゼが鋳型に沿った一本鎖合成に使用される
。
分子であり、DNA依存性DNAポリメラーゼが鋳型に沿った一本鎖合成に使用される
。
【００６９】
特に好ましい態様においては、非熱安定性のDNAポリメラーゼが用いられ、大
腸菌由来のポリメラーゼIのような、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性および3'-
エキソヌクレアーゼ作用活性をもつポリメラーゼが特に好ましい。
腸菌由来のポリメラーゼIのような、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性および3'-
エキソヌクレアーゼ作用活性をもつポリメラーゼが特に好ましい。
【００７０】
または、例えば大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、バクテリオフ
ァージT7由来のT7-DNAポリメラーゼ、またはバクテリオファージT4由来のT4-DNA
ポリメラーゼのような、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもたないが、3'-エキ
ソヌクレアーゼ作用活性をもつ非熱安定性DNAポリメラーゼも使用できる。
ァージT7由来のT7-DNAポリメラーゼ、またはバクテリオファージT4由来のT4-DNA
ポリメラーゼのような、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもたないが、3'-エキ
ソヌクレアーゼ作用活性をもつ非熱安定性DNAポリメラーゼも使用できる。
【００７１】
さらに、例えば大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片の3'-5'-exo(-)
変異体のような、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性および3'-エキソヌクレアーゼ
作用活性のいずれももたない、非熱安定性DNAポリメラーゼを使用できる。
変異体のような、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性および3'-エキソヌクレアーゼ
作用活性のいずれももたない、非熱安定性DNAポリメラーゼを使用できる。
【００７２】
その他の特に好ましい態様においては、熱安定性ポリメラーゼが使用される（
例えばTaq-Pol、Pwo-Pol等）。このポリメラーゼはやはり、例えばサーマス・ア
クアティカス（Thermus aquaticus）由来のTaq DNAポリメラーゼ、サーマス・サ
ーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8由来のTth DNAポリメラーゼ、または
サーマス・フラバス（Thermus flavus）由来のTfl-DNAポリメラーゼのように、5
'-および3'-エキソヌクレアーゼ作用活性を有するか、または5'-エキソヌクレア
ーゼ作用活性を有するが、3'-エキソヌクレアーゼ作用活性はもたないものであ
ってもよい。
例えばTaq-Pol、Pwo-Pol等）。このポリメラーゼはやはり、例えばサーマス・ア
クアティカス（Thermus aquaticus）由来のTaq DNAポリメラーゼ、サーマス・サ
ーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8由来のTth DNAポリメラーゼ、または
サーマス・フラバス（Thermus flavus）由来のTfl-DNAポリメラーゼのように、5
'-および3'-エキソヌクレアーゼ作用活性を有するか、または5'-エキソヌクレア
ーゼ作用活性を有するが、3'-エキソヌクレアーゼ作用活性はもたないものであ
ってもよい。
【００７３】
または、熱安定性DNAポリメラーゼは、ピロコッカス・ウォセイ（Pyrococcus
woesei）由来のPwo-DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococ
cus litoralis）由来のVentR-DNAポリメラーゼ、DeepVentR-DNAポリメラーゼ、
もしくはTli-DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furios
us）由来のPfu-DNAポリメラーゼもしくはPfx-DNAポリメラーゼ、またはサーモト
ガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のTma-DNAポリメラーゼもしくはUl
Tma-DNAポリメラーゼのように、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもたないが、
3'-エキソヌクレアーゼ作用活性はもつものであってもよい。
woesei）由来のPwo-DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococ
cus litoralis）由来のVentR-DNAポリメラーゼ、DeepVentR-DNAポリメラーゼ、
もしくはTli-DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furios
us）由来のPfu-DNAポリメラーゼもしくはPfx-DNAポリメラーゼ、またはサーモト
ガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のTma-DNAポリメラーゼもしくはUl
Tma-DNAポリメラーゼのように、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもたないが、
3'-エキソヌクレアーゼ作用活性はもつものであってもよい。
【００７４】
加えて、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のTaq-DNAポリ
メラーゼのStoffel断片、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litorali
s）由来のTsp-DNAポリメラーゼ、またはVentR-DNAポリメラーゼもしくはDeepVen
tR-DNAポリメラーゼのexo(-)変異体のような、3'-エキソヌクレアーゼ作用活性
および5'-エキソヌクレアーゼ作用活性のいずれももたない熱安定性ポリメラー
ゼを用いることができる。
メラーゼのStoffel断片、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litorali
s）由来のTsp-DNAポリメラーゼ、またはVentR-DNAポリメラーゼもしくはDeepVen
tR-DNAポリメラーゼのexo(-)変異体のような、3'-エキソヌクレアーゼ作用活性
および5'-エキソヌクレアーゼ作用活性のいずれももたない熱安定性ポリメラー
ゼを用いることができる。
【００７５】
熱安定性ポリメラーゼを使用する場合、ポリメラーゼ反応は、例えば温度を上
昇させることによりエキソヌクレアーゼ作用による分解を停止した直後に続いて
行うことが好ましい。間に試料の精製またはさらなる処理は行わない。さらに、
幾つかのサイクルを行う場合、好ましくは精製の各手順後に新たにポリメラーゼ
を添加することは避ける。≦72℃の温度までに加熱されると変性するが、約90℃
における鎖の熱融解およびアニーリング温度より低い温度への冷却後には再生す
る、あるエキソヌクレアーゼを使用する場合、間に物質または試料の操作を加え
ずに、数サイクルに渡るワンポット反応として働くある態様が可能である。その
他の好ましい態様においては、ポリメラーゼ（PolI等）のプロセッシビティがエ
キソヌクレアーゼ作用による分解のものよりも有意に高い場合は、エキソヌクレ
アーゼをポリメラーゼに比較して過剰に加える。
昇させることによりエキソヌクレアーゼ作用による分解を停止した直後に続いて
行うことが好ましい。間に試料の精製またはさらなる処理は行わない。さらに、
幾つかのサイクルを行う場合、好ましくは精製の各手順後に新たにポリメラーゼ
を添加することは避ける。≦72℃の温度までに加熱されると変性するが、約90℃
における鎖の熱融解およびアニーリング温度より低い温度への冷却後には再生す
る、あるエキソヌクレアーゼを使用する場合、間に物質または試料の操作を加え
ずに、数サイクルに渡るワンポット反応として働くある態様が可能である。その
他の好ましい態様においては、ポリメラーゼ（PolI等）のプロセッシビティがエ
キソヌクレアーゼ作用による分解のものよりも有意に高い場合は、エキソヌクレ
アーゼをポリメラーゼに比較して過剰に加える。
【００７６】
別の好ましい態様においては、新たに合成されたセグメントの3'末端は、エキ
ソヌクレアーゼ作用による分解およびそれに続く鋳型に沿った一本鎖合成より前
に一本鎖ニックが挿入された場合、共有結合される。好ましくは、該結合はリガ
ーゼ、特に好ましくはバクテリオファージT4由来のT4-DNAリガーゼによって実行
される。
ソヌクレアーゼ作用による分解およびそれに続く鋳型に沿った一本鎖合成より前
に一本鎖ニックが挿入された場合、共有結合される。好ましくは、該結合はリガ
ーゼ、特に好ましくはバクテリオファージT4由来のT4-DNAリガーゼによって実行
される。
【００７７】
本発明の方法のその他の好ましい態様においては、鋳型に沿った一本鎖合成が
行われる本発明の方法の段階(d)における鋳型鎖は、RNA分子である。この場合、
RNA依存性DNAポリメラーゼ、好ましくは鳥類骨髄芽球症ウイルス由来のAMV逆転
写酵素、ヒト免疫不全ウイルス由来のHIV逆転写酵素、またはモロニーマウス白
血病ウイルス由来のM-MuLV逆転写酵素が鋳型に沿った一本鎖合成に使用される。
さらに、熱安定性逆転写酵素が使用されることが好ましく、固有の逆転写酵素活
性をもつサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のTth-DNAポ
リメラーゼが特に好ましい。
行われる本発明の方法の段階(d)における鋳型鎖は、RNA分子である。この場合、
RNA依存性DNAポリメラーゼ、好ましくは鳥類骨髄芽球症ウイルス由来のAMV逆転
写酵素、ヒト免疫不全ウイルス由来のHIV逆転写酵素、またはモロニーマウス白
血病ウイルス由来のM-MuLV逆転写酵素が鋳型に沿った一本鎖合成に使用される。
さらに、熱安定性逆転写酵素が使用されることが好ましく、固有の逆転写酵素活
性をもつサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のTth-DNAポ
リメラーゼが特に好ましい。
【００７８】
別の好ましい態様において、段階(c)に従ってエキソヌクレアーゼ作用による
一本鎖の分解を受け、段階(d)に従って一本鎖合成を受けるポリヌクレオチド鎖
は、RNAからなる。
一本鎖の分解を受け、段階(d)に従って一本鎖合成を受けるポリヌクレオチド鎖
は、RNAからなる。
【００７９】
ゆえに、新たに合成された半保存的一本鎖ポリヌクレオチドは、エキソヌクレ
アーゼ作用によって分解された5'末端から3'末端への、または場合によっては、
3'末端から5'末端への元の情報、ならびに新たな合成の5'末端から3'末端への、
または3'末端から5'末端への反対の鎖の情報を含む。図2および図3は、サイクル
の適用における可能な態様AおよびBの典型例を示す（3'-エキソヌクレアーゼ作
用による分解による変異体）。エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分解の長さ
を調節することにより（例えばエキソヌクレアーゼ作用活性の時間により調節し
た反応）、各サイクルにおいて新しい組合わせを、位置選択的な様式で、即ち、
好ましくはポリヌクレオチド配列の特定の部分において、生み出すことができる
。該方法のサイクルの適用によって、第一サイクルに従って生じた半保存的一本
鎖分子のヘテロ二本鎖DNAの別の作製から開始して、新たな組合わせを繰り返し
作製することができる。この場合、態様Aのサイクル適用（図2を参照のこと）に
より、ポリヌクレオチドの規定の組換え頻度をもつ異なる非相同配列セグメント
の、位置選択的および遍在する組合わせの両方が提供される。態様Bのサイクル
適用（図3を参照のこと）により、少数のみのサイクルの後であっても、準種の
非相同配列セグメントの全く新しい組合わせの可能性が提供される。この場合、
最初のポリヌクレオチド鎖の集団は、新規に合成されるポリヌクレオチドの鋳型
としての役割を担っておらず、半保存的機構に従って互いに新たに組合わせられ
ることが強調されるべきである。
アーゼ作用によって分解された5'末端から3'末端への、または場合によっては、
3'末端から5'末端への元の情報、ならびに新たな合成の5'末端から3'末端への、
または3'末端から5'末端への反対の鎖の情報を含む。図2および図3は、サイクル
の適用における可能な態様AおよびBの典型例を示す（3'-エキソヌクレアーゼ作
用による分解による変異体）。エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分解の長さ
を調節することにより（例えばエキソヌクレアーゼ作用活性の時間により調節し
た反応）、各サイクルにおいて新しい組合わせを、位置選択的な様式で、即ち、
好ましくはポリヌクレオチド配列の特定の部分において、生み出すことができる
。該方法のサイクルの適用によって、第一サイクルに従って生じた半保存的一本
鎖分子のヘテロ二本鎖DNAの別の作製から開始して、新たな組合わせを繰り返し
作製することができる。この場合、態様Aのサイクル適用（図2を参照のこと）に
より、ポリヌクレオチドの規定の組換え頻度をもつ異なる非相同配列セグメント
の、位置選択的および遍在する組合わせの両方が提供される。態様Bのサイクル
適用（図3を参照のこと）により、少数のみのサイクルの後であっても、準種の
非相同配列セグメントの全く新しい組合わせの可能性が提供される。この場合、
最初のポリヌクレオチド鎖の集団は、新規に合成されるポリヌクレオチドの鋳型
としての役割を担っておらず、半保存的機構に従って互いに新たに組合わせられ
ることが強調されるべきである。
【００８０】
ゆえに、本発明に係る方法の適用により、2つの異なる一本鎖ポリヌクレオチ
ド上に位置する2つまたはそれ以上の異なる非相同配列セグメントを結合させ、
新たな半保存的一本鎖ポリヌクレオチドを形成させることが可能となる。該方法
の使用により、エキソヌクレアーゼ作用による分解の調節された実行に応じて、
保存的配列セグメントおよび新規の配列セグメントを同一および異なる比率の両
方でもつ、半保存的一本鎖ポリヌクレオチドを作製できる。
ド上に位置する2つまたはそれ以上の異なる非相同配列セグメントを結合させ、
新たな半保存的一本鎖ポリヌクレオチドを形成させることが可能となる。該方法
の使用により、エキソヌクレアーゼ作用による分解の調節された実行に応じて、
保存的配列セグメントおよび新規の配列セグメントを同一および異なる比率の両
方でもつ、半保存的一本鎖ポリヌクレオチドを作製できる。
【００８１】
加えて、本発明は本発明の方法を実施するための使用説明書を含むキットに関
する。好ましい態様において、該キットは以下の構成要素の少なくとも1つも含
む： (i)二重鎖ポリヌクレオチドの作製のための緩衝液； (ii)二重鎖ポリヌクレオチド分子を部分的なエキソヌクレアーゼ作用により分解
させる試薬； (iii)部分的なエキソヌクレアーゼ作用による分解を実行するための緩衝液； (iv)分解された末端から開始するポリヌクレオチド鎖の鋳型に沿った重合を行わ
せる試薬；および (v)(iv)の重合反応を実行するための緩衝液。
する。好ましい態様において、該キットは以下の構成要素の少なくとも1つも含
む： (i)二重鎖ポリヌクレオチドの作製のための緩衝液； (ii)二重鎖ポリヌクレオチド分子を部分的なエキソヌクレアーゼ作用により分解
させる試薬； (iii)部分的なエキソヌクレアーゼ作用による分解を実行するための緩衝液； (iv)分解された末端から開始するポリヌクレオチド鎖の鋳型に沿った重合を行わ
せる試薬；および (v)(iv)の重合反応を実行するための緩衝液。
【００８２】
これらおよびその他の態様は開示され、当業者には明らかであり、本発明の説
明および実施例により包含される。本発明の意図の範囲内で使用できる、上述の
方法、手段、および適用の1つに関するさらなる文献は、最先端の技術、例えば
電気的手段の使用により、例えば公共のライブラリから得られる。この目的は特
に、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.というアドレス
の、インターネットを介して利用可能な「メドライン（medline）」のような、公
共のデータベースによって果たされる。当業者には他のデータベースおよびアド
レスが公知であり、インターネットから、例えばhttp://www.lycos.com.という
アドレスにおいて得られる。バイオテクノロジーにおける特許および特許出願に
関する供給源および情報の概観は、バークス（Berks）（TIBTECH 12(1994)、352
〜364）に含まれる。
明および実施例により包含される。本発明の意図の範囲内で使用できる、上述の
方法、手段、および適用の1つに関するさらなる文献は、最先端の技術、例えば
電気的手段の使用により、例えば公共のライブラリから得られる。この目的は特
に、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.というアドレス
の、インターネットを介して利用可能な「メドライン（medline）」のような、公
共のデータベースによって果たされる。当業者には他のデータベースおよびアド
レスが公知であり、インターネットから、例えばhttp://www.lycos.com.という
アドレスにおいて得られる。バイオテクノロジーにおける特許および特許出願に
関する供給源および情報の概観は、バークス（Berks）（TIBTECH 12(1994)、352
〜364）に含まれる。
【００８３】
上記に引用した特許、刊行物、およびデータベース・エントリのすべての開示
は、そのような各個別の特許、刊行物、またはエントリが特定的および各々参照
として組み入れられると示されたのと同様に、それらの全体が参照として特定的
に本明細書に組み入れられる。
は、そのような各個別の特許、刊行物、またはエントリが特定的および各々参照
として組み入れられると示されたのと同様に、それらの全体が参照として特定的
に本明細書に組み入れられる。
【００８４】
以下の実施例は本発明を例証するためのものである。
【００８５】
以下に記載する実験的な実施例においては、例えば、その全容が参照として特
定的に本明細書に組み入れられる、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クロー
ニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」、コー
ルドスプリングハーバー研究所(1989)、またはオースベル（Ausubel）ら、「分
子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology
、1987〜1988）」；Wiley Interscience(1987)のように、様々な刊行物において
説明された、組換えDNA技術の標準法を使用した。別途記載のない限り、制限酵
素、ポリメラーゼ、および他の酵素は、製造者の仕様書に従って使用した。折り
後ヌクレオチドは、パーキンエルマーエクスペディットDNAシンセサイザー（Per
kin Elmer Expedite DNA synthesizer）において合成した。
定的に本明細書に組み入れられる、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クロー
ニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」、コー
ルドスプリングハーバー研究所(1989)、またはオースベル（Ausubel）ら、「分
子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology
、1987〜1988）」；Wiley Interscience(1987)のように、様々な刊行物において
説明された、組換えDNA技術の標準法を使用した。別途記載のない限り、制限酵
素、ポリメラーゼ、および他の酵素は、製造者の仕様書に従って使用した。折り
後ヌクレオチドは、パーキンエルマーエクスペディットDNAシンセサイザー（Per
kin Elmer Expedite DNA synthesizer）において合成した。
【００８６】
実施例1
枯草菌（Bacillus subtilis）スブチリシンE変異体のインビトロにおける組換え
本実施例は、本発明の態様Bに従った方法の単一サイクルにおける、枯草菌ス
ブチリシンEの変異体の組換えによる、遺伝子当たりにおける組換え事象の数の
制御可能性を示す。
ブチリシンEの変異体の組換えによる、遺伝子当たりにおける組換え事象の数の
制御可能性を示す。
【００８７】A.ベクターの構築
ベクターp3は、pMK3のマルチクローニング部位におけるHindIII部位を唯一のN
heI部位によって置換し、引き続き2つのEcoRI部位間の908 bp配列を、枯草菌p43
プロモーターおよび唯一のKpnI部位を含む472 bp挿入断片によって置換すること
による、pMK3（ATCC 37314）に由来する、6.8 kbの大腸菌-枯草菌シャトルプラ
スミドである。p3における方向付けは、修飾マルチクローニング部位（EcoRI Sm
aI BamHI SalI PstI NheI）がプロモーターの下流に位置するようになっている
。オリゴヌクレオチドP01およびP02をプライマーとして用いて、apre遺伝子（ス
ブチリシンE）をターミネーター配列と共に含む1.7 kbのDNA配列を、枯草菌ゲノ
ムからPCR増幅した： P01（長さ：67 nt、KpnI部位(下線)を含む）： P02（長さ：54 nt、PstI部位(下線)を含む）：
heI部位によって置換し、引き続き2つのEcoRI部位間の908 bp配列を、枯草菌p43
プロモーターおよび唯一のKpnI部位を含む472 bp挿入断片によって置換すること
による、pMK3（ATCC 37314）に由来する、6.8 kbの大腸菌-枯草菌シャトルプラ
スミドである。p3における方向付けは、修飾マルチクローニング部位（EcoRI Sm
aI BamHI SalI PstI NheI）がプロモーターの下流に位置するようになっている
。オリゴヌクレオチドP01およびP02をプライマーとして用いて、apre遺伝子（ス
ブチリシンE）をターミネーター配列と共に含む1.7 kbのDNA配列を、枯草菌ゲノ
ムからPCR増幅した： P01（長さ：67 nt、KpnI部位(下線)を含む）： P02（長さ：54 nt、PstI部位(下線)を含む）：
【００８８】
QIAクイックPCR精製キットを供給元の使用説明書に従って使用し、結果的に生
じたPCR産物を精製した。PstIおよびKpnIを用いた分解およびアガロースゲル精
製の後、PCR産物を、PstIおよびKpnIによって分解し、ゲル精製および脱リン酸
化されたベクターp3に連結し、その結果プラスミドp3-ApreTを得た（図5を参照
のこと）。apre遺伝子を欠く枯草菌株を形質転換することにより、スブチリシン
Eを構成的に発現させた。活性は、形質転換体を1％のスキムミルクを含むLB寒天
培地にプレーティングし、その結果、各コロニーの周辺に澄んだハロができるこ
とによって確認した。
じたPCR産物を精製した。PstIおよびKpnIを用いた分解およびアガロースゲル精
製の後、PCR産物を、PstIおよびKpnIによって分解し、ゲル精製および脱リン酸
化されたベクターp3に連結し、その結果プラスミドp3-ApreTを得た（図5を参照
のこと）。apre遺伝子を欠く枯草菌株を形質転換することにより、スブチリシン
Eを構成的に発現させた。活性は、形質転換体を1％のスキムミルクを含むLB寒天
培地にプレーティングし、その結果、各コロニーの周辺に澄んだハロができるこ
とによって確認した。
【００８９】B.突然変異体の作製
遺伝子の内部のHindIII部位からC末端までのapre配列を含む0.86 kbのDNA配列
を、オリゴヌクレオチドP03およびP04をプライマーとして用い、変異誘発PCRに
よってp3-ApreTから増幅した： P03（長さ：23 nt）： P04（長さ：23 nt）：
を、オリゴヌクレオチドP03およびP04をプライマーとして用い、変異誘発PCRに
よってp3-ApreTから増幅した： P03（長さ：23 nt）： P04（長さ：23 nt）：
【００９０】
10 mM Tris HCl pH 7.6、50 mM KCl、7 mM MgCl2、0.5 mM MnCl2、0.01％ゼラ
チン溶液中、30 pmolの各プライマー、20 nmolのdGTPおよびdATP、100 nmolのdC
TPおよびdTTP、20 fmolの鋳型、および5 UのTaq DNAポリメラーゼを用いて、94
℃にて1分間、65℃にて1分間、および72℃にて1分間を20サイクルにて、変異誘
発PCRを行った。その結果生じたライブラリを、QIAクイックPCR精製キットを供
給元の使用説明書に従って用い、精製した。HindIIIおよびPstIを用いたPCR産物
の分解、およびアガロースゲル精製後、同様にHindIIIおよびPstIによって分解
、および元のapre挿入断片からゲル精製し、脱リン酸化したp3-ApreTにそれらを
連結した。枯草菌形質転換体を1％のスキムミルクを含むLB寒天培地上にプレー
ティングすることによって、結果的に生じたクローンをスブチリシンE活性につ
いて分析した。活性を全く示さない7つのクローンのプラスミド（p3-ApreT-MUT0
2、04、10、18、24、25、26）を単離し、配列決定した。野生型由来のこれらの
不活性なスブチリシンE突然変異体の配列偏向を図6に示す。突然変異クローンの
各々は少なくとも1つの突然変異を有し、2回形成される突然変異はなかった。概
して、7つのクローンは、HindIII部位とPstI部位との間の配列全体にわたって無
作為に分布した、マーカーとなり得るような26の突然変異をもつ（図7を参照の
こと）。
チン溶液中、30 pmolの各プライマー、20 nmolのdGTPおよびdATP、100 nmolのdC
TPおよびdTTP、20 fmolの鋳型、および5 UのTaq DNAポリメラーゼを用いて、94
℃にて1分間、65℃にて1分間、および72℃にて1分間を20サイクルにて、変異誘
発PCRを行った。その結果生じたライブラリを、QIAクイックPCR精製キットを供
給元の使用説明書に従って用い、精製した。HindIIIおよびPstIを用いたPCR産物
の分解、およびアガロースゲル精製後、同様にHindIIIおよびPstIによって分解
、および元のapre挿入断片からゲル精製し、脱リン酸化したp3-ApreTにそれらを
連結した。枯草菌形質転換体を1％のスキムミルクを含むLB寒天培地上にプレー
ティングすることによって、結果的に生じたクローンをスブチリシンE活性につ
いて分析した。活性を全く示さない7つのクローンのプラスミド（p3-ApreT-MUT0
2、04、10、18、24、25、26）を単離し、配列決定した。野生型由来のこれらの
不活性なスブチリシンE突然変異体の配列偏向を図6に示す。突然変異クローンの
各々は少なくとも1つの突然変異を有し、2回形成される突然変異はなかった。概
して、7つのクローンは、HindIII部位とPstI部位との間の配列全体にわたって無
作為に分布した、マーカーとなり得るような26の突然変異をもつ（図7を参照の
こと）。
【００９１】C.インビトロにおける組換え
KpnI およびPstIのクローニング部位およびapre遺伝子全体を含む1.4 kbのDNA
配列を、p3-ApreT-MUTクローンの各々から、ストラタジーン（Stratagen）社のP
fuポリメラーゼを供給元の使用説明書に従って用い、オリゴヌクレオチドP05お
よびP06をプライマーとして使用して、PCR増幅した： P05（長さ：20 nt）： P06（長さ：23 nt）：
配列を、p3-ApreT-MUTクローンの各々から、ストラタジーン（Stratagen）社のP
fuポリメラーゼを供給元の使用説明書に従って用い、オリゴヌクレオチドP05お
よびP06をプライマーとして使用して、PCR増幅した： P05（長さ：20 nt）： P06（長さ：23 nt）：
【００９２】
QIAクイックPCR精製キットを供給元の使用説明書に従って用いて、PCR産物を
精製し、アガロースゲル電気泳動によって正確なサイズについて調べ、等モル量
に混合した。150 mM Tris HCl pH 7.6、6.6 mM MgCl2中に溶解したこのPCR混合
物80μgを94℃にて5分間加熱し、鎖を再アニールすることによりヘテロ二本鎖を
確率的な様式で作製するために、引き続き37℃まで0.05℃/秒で冷却した。その
後、μgDNA当たり2.5 U エキソヌクレアーゼIIIを加え、異なる長さのものをヘ
テロ二本鎖の双方の3'末端から分解するため、37℃にて20分、40分、または60分
間インキュベートした。供給元の使用説明書に従い、0.17 mMのdNTPおよびPfuポ
リメラーゼ緩衝液において72℃にて15分間インキュベートすることにより、部分
的に分解されたPCR産物をμgDNA当たり0.6 UのPfuポリメラーゼによって再充填
した（半保存的合成）。プライマーP05およびP06を使用した単回のPCRサイクル
を実施し、得られたDNAを、QIAクイックPCR精製キットを供給元の使用説明書に
従って使用して精製し、KpnIおよびPstIを用いて分解し、KpnIおよびPstIにより
直鎖状化したp3に連結し、大腸菌XL1-blueに形質転換した。プラスミド小規模調
製およびゲル電気泳動により、挿入断片を有するかどうかについて形質転換体を
調べた。正確なサイズを示すクローンから、25個のクローンを無作為に選択し、
単離し、配列決定により分析した。
精製し、アガロースゲル電気泳動によって正確なサイズについて調べ、等モル量
に混合した。150 mM Tris HCl pH 7.6、6.6 mM MgCl2中に溶解したこのPCR混合
物80μgを94℃にて5分間加熱し、鎖を再アニールすることによりヘテロ二本鎖を
確率的な様式で作製するために、引き続き37℃まで0.05℃/秒で冷却した。その
後、μgDNA当たり2.5 U エキソヌクレアーゼIIIを加え、異なる長さのものをヘ
テロ二本鎖の双方の3'末端から分解するため、37℃にて20分、40分、または60分
間インキュベートした。供給元の使用説明書に従い、0.17 mMのdNTPおよびPfuポ
リメラーゼ緩衝液において72℃にて15分間インキュベートすることにより、部分
的に分解されたPCR産物をμgDNA当たり0.6 UのPfuポリメラーゼによって再充填
した（半保存的合成）。プライマーP05およびP06を使用した単回のPCRサイクル
を実施し、得られたDNAを、QIAクイックPCR精製キットを供給元の使用説明書に
従って使用して精製し、KpnIおよびPstIを用いて分解し、KpnIおよびPstIにより
直鎖状化したp3に連結し、大腸菌XL1-blueに形質転換した。プラスミド小規模調
製およびゲル電気泳動により、挿入断片を有するかどうかについて形質転換体を
調べた。正確なサイズを示すクローンから、25個のクローンを無作為に選択し、
単離し、配列決定により分析した。
【００９３】D.結果
25個の無作為に選択したクローンのうち、12個は組換え体であり、13個は使用
した突然変異体に同一であり、その分布はかなり確率的であった。2つの突然変
異体は4回（MUT04、MUT26）、1つの突然変異体は2回（MUT10）、3つの突然変異
体は1回（MUT18、MUT24、MUT25）認められ、また1つの突然変異体は認められな
かった（MUT02）。12個の組換え体の各々は1回のみ認められ、明らかに1つの組
換え事象に起因した（下記の表を参照のこと）。異なるエキソヌクレアーゼIII
のインキュベーション時間（20分、40分、および60分）から得た試料を分離せず
に、組換え部位は図7に示されるように配列全体に分布することが認められた。
総計48％の組換え体が見出された。しかし、この数値は、組換え体の分画の下限
のみを表す。認められた幾つかのまたは全ての明らかな非組換え突然変異体は、
主にマーカーが遺伝子のC末端側半分にのみ導入されたという事実により、配列
を変化させなかった組換え事象から生じた可能性がある（図5を参照のこと）。
した突然変異体に同一であり、その分布はかなり確率的であった。2つの突然変
異体は4回（MUT04、MUT26）、1つの突然変異体は2回（MUT10）、3つの突然変異
体は1回（MUT18、MUT24、MUT25）認められ、また1つの突然変異体は認められな
かった（MUT02）。12個の組換え体の各々は1回のみ認められ、明らかに1つの組
換え事象に起因した（下記の表を参照のこと）。異なるエキソヌクレアーゼIII
のインキュベーション時間（20分、40分、および60分）から得た試料を分離せず
に、組換え部位は図7に示されるように配列全体に分布することが認められた。
総計48％の組換え体が見出された。しかし、この数値は、組換え体の分画の下限
のみを表す。認められた幾つかのまたは全ての明らかな非組換え突然変異体は、
主にマーカーが遺伝子のC末端側半分にのみ導入されたという事実により、配列
を変化させなかった組換え事象から生じた可能性がある（図5を参照のこと）。
【００９４】
【表】
1)「wt」は元の配列が野生型と等しい、即ち、特定の領域においてマーカーをもた
ないことを意味する。
ないことを意味する。
【００９５】
実施例2
エキソヌクレアーゼIII分解
請求項9に従ったエキソヌクレアーゼIIIによるDNAの分解は、文献から既知で
ある。しかし、インキュベーション時間と分解されたDNA鎖の長さとの関連の正
確性については、ほとんどの場合比較的長いDNA分子、即ち直鎖状プラスミドを
用いて分析されてきた。より短いDNA分子もある長さにまで分解できることを証
明するために、典型的に短い読み取り枠を示す0.8 kbのPCR産物を、エキソヌク
レアーゼIIIを用いて分解した。その結果生じたDNA分子は部分的に二重鎖、部分
的に一本鎖である。しかし、アガロースゲル上でサイズを分析するためには、分
子は純粋に二重鎖でなければならない。ゆえに、分析のためだけに、一本鎖セグ
メントをS1ヌクレアーゼによって分解し、その結果生じる分解されない二重鎖DN
A分子の分布をゲル電気泳動により分析した。双方の3'末端から同時に分解が行
われた場合、これは2つの重なる長さの分布を生じさせる。
ある。しかし、インキュベーション時間と分解されたDNA鎖の長さとの関連の正
確性については、ほとんどの場合比較的長いDNA分子、即ち直鎖状プラスミドを
用いて分析されてきた。より短いDNA分子もある長さにまで分解できることを証
明するために、典型的に短い読み取り枠を示す0.8 kbのPCR産物を、エキソヌク
レアーゼIIIを用いて分解した。その結果生じたDNA分子は部分的に二重鎖、部分
的に一本鎖である。しかし、アガロースゲル上でサイズを分析するためには、分
子は純粋に二重鎖でなければならない。ゆえに、分析のためだけに、一本鎖セグ
メントをS1ヌクレアーゼによって分解し、その結果生じる分解されない二重鎖DN
A分子の分布をゲル電気泳動により分析した。双方の3'末端から同時に分解が行
われた場合、これは2つの重なる長さの分布を生じさせる。
【００９６】A.方法
790 bpのPCR産物0.75μgを、66 mM Tris-HCl、pH8.0、0.66 mMのMgCl2、75 mM
のNaClを含む20μlの緩衝液中において、200ユニットのエキソヌクレアーゼIII
と共に25℃にてインキュベートした。0分、1分、2分、3分、4分、および5分後に
、2μlの試料を混合物から採取し、7.5μlのS1ヌクレアーゼ分解反応液（40.5 m
Mの酢酸ナトリウム、pH4.6、338 mMのNaCl、1.4 mMのZnSO4、6.8％のグリセロー
ル、1.88 UのS1ヌクレアーゼ）と即時に混合し、氷上に置いた。全ての試料を採
取後、室温にて30分間チューブをインキュベートした。1μlの停止溶液（300 mM Tris；50 mM EDTA、pH 8.0）を加え、試料を70℃にて10分間インキュベートす
ることにより、S1ヌクレアーゼを不活性化した。臭化エチジウムによって染色し
た2％アガロースゲル上において試料をアッセイし、UV照射下にて分析した。
のNaClを含む20μlの緩衝液中において、200ユニットのエキソヌクレアーゼIII
と共に25℃にてインキュベートした。0分、1分、2分、3分、4分、および5分後に
、2μlの試料を混合物から採取し、7.5μlのS1ヌクレアーゼ分解反応液（40.5 m
Mの酢酸ナトリウム、pH4.6、338 mMのNaCl、1.4 mMのZnSO4、6.8％のグリセロー
ル、1.88 UのS1ヌクレアーゼ）と即時に混合し、氷上に置いた。全ての試料を採
取後、室温にて30分間チューブをインキュベートした。1μlの停止溶液（300 mM Tris；50 mM EDTA、pH 8.0）を加え、試料を70℃にて10分間インキュベートす
ることにより、S1ヌクレアーゼを不活性化した。臭化エチジウムによって染色し
た2％アガロースゲル上において試料をアッセイし、UV照射下にて分析した。
【００９７】B.結果
分解の結果を図8に示す。数値はインキュベーション時間（分）に対応する。
これらの反応条件下において、分解は１分当たり約25ヌクレオチドの速度でほと
んど直線的に進行する。あるインキュベーション時間に対応する長さは、正確に
定義されてはいないが、約50ヌクレオチドの標準偏差をもつガウス様の分布を示
し、一方では組換えられる配列におけるある領域に組換え部位を集中させること
、他方では例えば異なるインキュベーション時間で得られた試料を混合すること
により、全配列中に渡って位置非特異的な組換えを行わせることの両方を可能に
する。
これらの反応条件下において、分解は１分当たり約25ヌクレオチドの速度でほと
んど直線的に進行する。あるインキュベーション時間に対応する長さは、正確に
定義されてはいないが、約50ヌクレオチドの標準偏差をもつガウス様の分布を示
し、一方では組換えられる配列におけるある領域に組換え部位を集中させること
、他方では例えば異なるインキュベーション時間で得られた試料を混合すること
により、全配列中に渡って位置非特異的な組換えを行わせることの両方を可能に
する。
【配列表】
【図１】 本発明の方法の概略図である。
【図２】 エキソヌクレアーゼ作用による分解から保護された鋳型ポリヌク
レオチドを用いた、本発明に係る方法の態様Aのサイクル方法の原理を示す。段
階の表記は本文中に定義される通りである。理解しやすくするため3サイクルの
みを示している。
レオチドを用いた、本発明に係る方法の態様Aのサイクル方法の原理を示す。段
階の表記は本文中に定義される通りである。理解しやすくするため3サイクルの
みを示している。
【図３】 二重鎖ポリヌクレオチドの各鎖が鋳型としての役割を担い、かつ
分解される、本発明に係る方法の態様Bのサイクル方法の原理を示す。段階の表
記は本文中に定義される通りである。理解しやすくするため2サイクルのみを示
している。
分解される、本発明に係る方法の態様Bのサイクル方法の原理を示す。段階の表
記は本文中に定義される通りである。理解しやすくするため2サイクルのみを示
している。
【図４】 エキソヌクレアーゼ作用による分解以前に一本鎖ニックが挿入さ
れる、本発明に係る方法の態様Cのサイクル方法の原理を示す。段階の表記は本
文中に定義される通りである。理解しやすくするため3サイクルのみを示してい
る。エキソヌクレアーゼ作用による分解は5'から3'方向に進行する。
れる、本発明に係る方法の態様Cのサイクル方法の原理を示す。段階の表記は本
文中に定義される通りである。理解しやすくするため3サイクルのみを示してい
る。エキソヌクレアーゼ作用による分解は5'から3'方向に進行する。
【図５】 実施例1に従った手順の概要を示す。しかし、実施例1における組
換え事象の数の制御可能性を示すために、サイクルは1回のみ実施している（n=0
）。説明については本文を参照のこと。recは組換え体を意味する。
換え事象の数の制御可能性を示すために、サイクルは1回のみ実施している（n=0
）。説明については本文を参照のこと。recは組換え体を意味する。
【図６】 使用された突然変異体、および実施例1に従ってマーカーとして
用いた結果的に生じた突然変異をもつ組換え体を示す。
用いた結果的に生じた突然変異をもつ組換え体を示す。
【図７】 実施例1に従った各突然変異体（MUT）についての、および各組換
え体（TMA）についての、配列に渡るマーカーの分布を示す。KpnI部位はおよそ-
450 bpに、HindIII部位は0 bpに、およびPstI部位はおよそ900 bpに位置してい
る。
え体（TMA）についての、配列に渡るマーカーの分布を示す。KpnI部位はおよそ-
450 bpに、HindIII部位は0 bpに、およびPstI部位はおよそ900 bpに位置してい
る。
【図８】 実施例2に従い、異なるインキュベーション時間（0=0分、1=1分
、3=3分、4=4分、5=5分）で、エキソヌクレアーゼ作用により分解されたDNAのア
ガロースゲル電気泳動像を示す。
、3=3分、4=4分、5=5分）で、エキソヌクレアーゼ作用により分解されたDNAのア
ガロースゲル電気泳動像を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月１６日（２００２．１．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ケットリング ウルリッヒ
ドイツ連邦共和国 ゲッティンゲン スタ
ンプフェ エイチェ ２
(72)発明者 エイゲン マンフレッド
ドイツ連邦共和国 ゲッティンゲン ポス
トボックス 2841 マックス−プランク−
インスティテュート ファー バイオフィ
シカリスク ケミー
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA04
CA11 GA25 HA20
Claims (32)
- 【請求項１】 以下の段階を含む少なくとも1回のサイクルを完了する、改
変特性を有するポリヌクレオチド分子の作製方法であって、段階(c)および(d)が
連続してまたは同時に実行されうる方法： (a) 一本鎖ポリヌクレオチド分子の集団を提供する段階であって、該集団の
個々のポリヌクレオチドが相同な配列セグメントおよび非相同な配列セグメント
の両方を有し、且つ集団中に、これらの一本鎖に各々完全にまたは部分的に相補
的であるような鎖も含まれる段階； (b) 異なる非相同な配列セグメントを有する二重鎖を含む、段階(a)に従って
提供される一本鎖ポリヌクレオチド分子集団の二重鎖ポリヌクレオチド分子を形
成する段階； (c) 段階(b)に従って作製された二重鎖ポリヌクレオチド分子を、部分的に、
エキソヌクレアーゼ作用により一本鎖分解する段階；および (d) 段階(c)に従って作製された、部分的に分解された二重鎖の分解された末
端から開始する、鋳型に沿って一本鎖合成する段階。 - 【請求項２】 段階(a)〜(d)を含むサイクルを1回以上完了する、請求項1記
載の方法。 - 【請求項３】 本発明の方法の段階(c)に記載のエキソヌクレアーゼ作用に
よる分解の分解長が、サイクル数が増加するに従い定常的に減少する、請求項2
記載の方法。 - 【請求項４】 部分的に分解された鎖と新しく合成された鎖との組合せの位
置選択性が、段階(c)に記載の部分的な、エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖
の分解の調節により制御される、請求項1から3のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項５】 1サイクル、数サイクル、または全サイクルの後に選択段階
が実行され、且つ該選択段階がポリヌクレオチドの遺伝子型もしくは表現型のい
ずれかに、または遺伝子型および表現型の両方に関連する、請求項2から4のいず
れか一項記載の方法。 - 【請求項６】 段階(a)に従って提供される一本鎖ポリヌクレオチド分子の
集団が準種の突然変異体分布からのポリヌクレオチド分子である、請求項1から5
のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項７】 エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖の分解および一本鎖合
成を受けたポリヌクレオチド鎖がDNAからなる、請求項1から6のいずれか一項記
載の方法。 - 【請求項８】 段階(c)に記載の二重鎖ポリヌクレオチドのエキソヌクレア
ーゼ作用による一本鎖の分解が3'-5'方向に行われる、請求項1から7のいずれか
一項記載の方法。 - 【請求項９】 段階(c)において大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIIIが、3'
-エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分解に使用される、請求項8記載の方法。 - 【請求項１０】 段階(c)において大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIが、ヘ
テロ二本鎖の非対合セグメントの3'-エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分解
に使用される、請求項8または9記載の方法。 - 【請求項１１】 段階(c)に記載の二重鎖ポリヌクレオチドのエキソヌクレ
アーゼ作用による一本鎖分解が5'-3'方向に行われる、請求項1から7のいずれか
一項記載の方法。 - 【請求項１２】 段階(c)においてバクテリオファージT7由来のT7-エキソヌ
クレアーゼGene 6が、二重鎖ポリヌクレオチドの5'-エキソヌクレアーゼ作用に
よる一本鎖分解に使用される、請求項11記載の方法。 - 【請求項１３】 段階(c)において大腸菌由来のエキソヌクレアーゼVIIが、
ヘテロ二本鎖の非対合セグメントの5'-エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分
解に使用される、請求項11または12記載の方法。 - 【請求項１４】 ポリヌクレオチド二重鎖の2つの末端のうち1つが、段階(c
)に記載の3'-または5'-エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分解から保護され
るような方法で修飾される、請求項1から13のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１５】 チオエステルの選択的挿入により、3'-突出部を生じさせ
る制限酵素を用いた切断により、2つの鎖のうち1つを環状一本鎖として最初に提
供することにより、または適合性の環状ポリヌクレオチド分子との共有結合によ
り、修飾が行われる、請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】 段階(c)に記載のエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分
解の前に、一本鎖ニックが二重鎖ポリヌクレオチド分子に導入される、請求項1
から15のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１７】 二重鎖ポリヌクレオチド分子当たりに平均で1つまたはそ
れ未満の一本鎖ニックが導入される、請求項16記載の方法。 - 【請求項１８】 配列特異的なニッキング酵素によって一本鎖ニックが二重
鎖ポリヌクレオチド分子に導入される、請求項16または17記載の方法。 - 【請求項１９】 配列非特異的なニッキング酵素によって、一本鎖ニックが
二重鎖ポリヌクレオチド分子に導入される、請求項16または17記載の方法。 - 【請求項２０】 段階(c)に記載のエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分
解が5'-3'方向および3'-5'方向の両方において行われる、請求項16から19のいず
れか一項記載の方法。 - 【請求項２１】 アルテロモナス・エスペジアナ（Alteromonas espejiana
）Bal31の培養培地からのBal31ヌクレアーゼが、段階(c)における5'-および3'-
エキソヌクレアーゼ作用による同時の一本鎖分解に使用される、請求項20記載の
方法。 - 【請求項２２】 段階(c)に記載のエキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分
解が、5'-エキソヌクレアーゼ作用活性をもつポリメラーゼによって行われる、
請求項16から19のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２３】 段階(d)における鋳型鎖がDNA分子であり、且つ1つまたは
複数のDNA依存性DNAポリメラーゼが鋳型に沿った一本鎖合成に使用される、請求
項7から22のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２４】 大腸菌由来のポリメラーゼIが使用される、請求項23記載
の方法。 - 【請求項２５】 1つまたは数個の熱安定DNAポリメラーゼが使用される、請
求項23記載の方法。 - 【請求項２６】 サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のT
aq DNAポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8
由来のTth DNAポリメラーゼ、またはサーマス・フラバス（Thermus flavus）由
来のTfl DNAポリメラーゼが使用される、請求項25記載の方法。 - 【請求項２７】 新しく合成されたセグメントの3'末端が、エキソヌクレア
ーゼの作用様式において部分的に分解されたセグメントの5'末端と共有結合され
る、請求項16から26のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２８】 バクテリオファージT4由来のT4 DNAリガーゼによって共有
結合が行われる、請求項27記載の方法。 - 【請求項２９】 段階(d)における鋳型鎖がRNA分子であり、且つ1つまたは
複数のRNA依存性DNAポリメラーゼが鋳型に沿った一本鎖合成に使用される、請求
項7から22のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項３０】 鳥類骨髄芽球症ウイルス由来のAMV逆転写酵素、ヒト免疫
不全ウイルス由来のHIV逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のM-MuL
V逆転写酵素、または固有の逆転写酵素活性を有するサーマス・サーモフィラス
（Thermus thermophilus）由来のTth DNAポリメラーゼが使用される、請求項29
記載の方法。 - 【請求項３１】 エキソヌクレアーゼ作用による一本鎖分解および一本鎖合
成を受けるポリヌクレオチド鎖がRNAからなる、請求項1から6のいずれか一項記
載の方法。 - 【請求項３２】 請求項1から31のいずれか一項記載の方法を実行するため
の構成要素および使用説明書を含むキット。
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|---|---|---|---|
| DE19953854A DE19953854C2 (de) | 1999-11-09 | 1999-11-09 | Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften |
| DE19953854.9 | 1999-11-09 | ||
| PCT/EP2000/011049 WO2001034835A2 (en) | 1999-11-09 | 2000-11-08 | Method for the production of biopolymers with modified properties |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003513652A true JP2003513652A (ja) | 2003-04-15 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001536760A Pending JP2003513652A (ja) | 1999-11-09 | 2000-11-08 | 改変特性を有するバイオポリマーの作製方法 |
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| WO (1) | WO2001034835A2 (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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