JP2016515384A - 標的配列の濃縮 - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (34)
- 核酸の母集団から標的配列について濃縮するための方法であって、
(a)溶液中で、核酸の母集団および標的単離プローブを合わせるステップであって、標的単離プローブは、親和性結合ドメインを含む、ステップ;
(b)標的単離プローブの一本鎖領域を、核酸の母集団中における標的配列の全部または一部とハイブリダイズさせるステップ;
(c)標的単離プローブを捕捉ドメインと結合させ、非結合材料を除去することにより、標的配列を含有する母集団からハイブリダイズされた核酸を選択的に固定化するステップ;および
(d)1種以上の3’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、標的配列の3’末端から非標的配列を除去するステップ
を含む、方法。 - 母集団中の核酸の一部または全部が反復配列を含有し、(a)が、反復配列とハイブリダイズする除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを、核酸の母集団と合わせるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (d)が、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを選択的に分解するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- (b)における標的単離プローブの一本鎖領域が、標的配列の第1の部分とハイブリダイズする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 標的単離プローブの末端が、標的配列の3’末端もしくは5’末端に位置するまたはそれに近接する配列と二重鎖を形成する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- (b)に続いて、第2のプローブの一本鎖領域を、標的配列の第2の部分にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のプローブが、標的単離プローブ付近の、標的単離プローブに近接するまたは標的単離プローブから遠位の標的配列の一部とハイブリダイズする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のプローブの末端が、標的配列の5’末端または3’末端の両方でなくどちらかに位置するまたはそれに近接する配列と二重鎖を形成する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 標的単離プローブおよび第2のプローブのハイブリダイゼーションによって標的配列の両端が定義されるように、標的単離プローブが、標的配列の一方の末端でハイブリダイズし、第2のプローブが、標的配列の反対側の末端とハイブリダイズする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 親和性ドメインが、標的単離プローブの3’末端に位置する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 親和性ドメインが、標的単離プローブの3’末端と5’末端との間に位置する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 4〜10ヌクレオチドのランダム配列を有するオリゴヌクレオチドを、母集団中の核酸とハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項1から3、4、5、10または11のいずれか一項に記載の方法。
- 標的単離プローブまたは標的配列の5’部分に位置する第2のプローブが、ハイブリダイズする一本鎖領域および一本鎖領域の3’末端から伸長するハイブリダイズしない二本鎖領域を有するフラッププローブである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- (e)1種以上の5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、非標的配列を標的配列の5’末端から除去するステップをさらに含む、請求項1から11および13のいずれか一項に記載の方法。
- ハイブリダイズしない二本鎖領域が、ヘアピンを形成するために3’−5’オリゴヌクレオチドまたはそれ自体とハイブリダイズしたプローブの一部を含み、前記方法は、3’−5’オリゴヌクレオチドまたはヘアピンを標的分子の5’末端に連結するステップをさらに含む、請求項1から11、13および14のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターの二本鎖領域の5’末端を、標的配列の3’末端に連結するステップをさらに含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターの二本鎖領域の3’末端を、標的配列の5’末端に連結するステップをさらに含む、請求項1から11および13から15のいずれか一項に記載の方法。
- ヘアピンアダプターの二重鎖領域を、標的配列の3’末端および標的単離プローブの5’末端に連結し、それによって標的単離プローブを標的分子に共有結合させるステップをさらに含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 5’エキソヌクレアーゼ消化後に5’プローブが置換されるように、ポリメラーゼによって標的単離配列の3’末端を伸長させるステップをさらに含む、請求項6または14に記載の方法。
- アダプターを標的配列の各末端に連結し、標的配列を決定するステップを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子または核酸サンプルから標的配列中の突然変異を検出するステップをさらに含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 突然変異が、挿入、欠失またはヌクレオチド多型からなる群から選択することができる、請求項21に記載の方法。
- 標的配列中の突然変異を生物の表現型の変異と相関させるステップを含む、請求項22に記載の方法。
- 標的単離プローブの一本鎖領域が、標的配列の3’末端および5’末端の両方とハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
- 親和性ドメインが、標的単離プローブの3’末端または5’末端の間であるが標的単離プローブの3’末端でも5’末端でもない位置で標的単離プローブと結合される、請求項24に記載の方法。
- (e)1種以上の5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、非標的配列を標的配列の5’末端から除去するステップをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
- 標的単離プローブが、一本鎖領域の3’末端から伸長されるハイブリダイズしない二本鎖領域を有するフラッププローブである、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
- アダプター分子を標的配列の3’末端に連結するステップをさらに含む、請求項21から27のいずれか一項に記載の方法。
- アダプター分子を標的配列の5’末端に連結するステップをさらに含む、請求項21から28のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターが、シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位、ユニークサンプル識別子およびユニーク分子識別子配列のうち少なくとも1つを含む、請求項28または29に記載の方法。
- (a)抽出物から核酸サンプルを得るステップ;
(b)請求項1に記載の標的配列について濃縮するステップ;および
(c)濃縮された標的分子のヌクレオチド配列を得るステップ
を含む、動物または植物の抽出物を分析する方法。 - (c)において得られたヌクレオチド配列が、3’末端において5つ未満の非標的ヌクレオチドを含むまたは(c)において得られたヌクレオチド配列が、標的配列の少なくとも90%を構成する、請求項31に記載の方法。
- (b)が、標的配列の3’末端および5’末端に配置されたアダプター内に位置する配列とハイブリダイズするプライマー配列を用いて、濃縮された標的配列を増幅するステップをさらに含む、請求項31または32に記載の方法。
- 標的配列の特徴を原核生物または真核生物の表現型と相関させるステップをさらに含む、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
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