JP2020501554A - 短いdna断片を連結することによる一分子シーケンスのスループットを増加する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a.少なくとも1つの二本鎖領域を有する第1のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ;
b.試料をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ;
c.標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも2つの標的分子を接合させ、二本鎖アダプター領域を形成するステップ、および標的分子の鎖を共有結合させ、それにより連結した標的分子を生成するステップ;ならびに
d.1つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位、およびシーケンスプライミング部位を含む第2のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を提供する。
a.少なくとも1つの二本鎖領域を有する第1のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ;
b.アダプター含有二本鎖標的分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ;
c.標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも2つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ;
d.1つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第2のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を使用して作製された連結した標的核酸分子のライブラリーを提供する。
a.レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも1つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ;
b.アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ;
c.部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも2つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合させ、それにより連結標的分子を生成するステップ
を含む方法を提供する。
a.レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも1つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ;
b.プライマーをアダプターライゲート標的分子の各鎖にハイブリダイズさせるステップであって、プライマーがレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むステップ;
c.プライマーを伸長して、アダプターライゲート標的分子の各鎖から、各末端でレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する新しい分子を形成するステップ;
d.新しい分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ;
e.部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも2つのエンドヌクレアーゼ消化した新しい分子を接合し、それにより連結標的分子を生成するステップ
を含む方法を提供する。
a.レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも1つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ;
b.アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ;
c.部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも2つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合し、それにより連結した標的分子を生成するステップ
を含む方法を使用して作製した連結した標的核酸分子のライブラリーを提供する。
以下の定義は本開示の理解を助ける。
用語「試料」は、標的核酸を含有するまたは含有すると推定される任意の組成物を指す。これは個体から単離された組織または体液の試料、例えば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、臓器および腫瘍、ならびに個々の患者またはモデル生物から採取した細胞から確立されたin vitro培養の試料を含み、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)およびそこから単離された核酸を含む。試料は、無細胞材料、例えば無細胞DNA(cfDNA)または循環腫瘍DNA(ctDNA)を含有する無細胞血液分画も含み得る。
DNA、オリゴヌクレオチド、試薬およびキット。この実施例では、市販のKRAS変異ヒト細胞系由来のゲノムDNAをHorizon Discovery(HD701)およびPromega(G1471)から購入した。低分子量DNAラダーはNew England BioLabs(N3233)から購入した。オリゴヌクレオチドおよびNuclease−Free Duplex BufferはIntegrated DNA Technologiesから購入した。1つのオリゴヌクレオチドは、シトシンにおけるアミノ基の組込みによって内部で改変した。NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixおよびPhusion High−Fidelity DNAポリメラーゼはNew England BioLabs(E2621)から購入した。エキソヌクレアーゼIII(M0379)およびエキソヌクレアーゼVII(M0206)はNew England BioLabsから購入した。Buffer IIおよびMgCl2とAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(N8080241)、Nuclease−Free Water(AM9937)およびQubit dsDNAアッセイの試薬(Q32850およびQ32851)はThermo Fisher Scientificから購入した。KAPA Hyper Prep Kit(KK8503)およびKAPA Pure Beads(KK8002)はKAPA BioSystemsから購入した。Agilent 2100 BioanalyzerシステムのAgilent DNA 7500 kits(5067−1504)は、Agilent Technologiesから購入した。
PacBioシーケンス。Binding Calculator(バージョン2.3.1)を使用して、MagBead one−cell per well(OCPW)プロトコールを使用してPacBioシーケンスのライブラリーを調製し、結合キットP6v2をプレート上濃度0.05nMで使用した。プライマー調節およびアニーリング、ならびにポリメラーゼの鋳型への結合、および磁気ビーズへの複合体の結合は、正確に、Binding Calculatorのプロトコールに示される通りに行った。鋳型複合体は、SMRT細胞にロードする前に4℃で2時間MagBeadとインキュベートした。4時間の動画を記録し、PacBio RSII装置で1次シーケンス分析を実施した。
アダプターを付加する代替の方法。図4aは、SeqCap法(Roche Sequencing Solutions、Madison、Wisc.)への適用を示し、ワークフローの変更が2つだけある。1つ目は、プロトコールの最初にDNA断片にライゲートするY−アダプターが、ConcatSeqアダプターによって置き換えられる(図4a、アダプターライゲーションステップ)。2つ目は、連結が起こるように1時間、捕捉およびPCR増幅された標的分子を酵素マスターミックスとインキュベートする新しいステップが導入される。
二次および三次データ分析。インサートのリードは、SMRT Portalのデフォルト設定を使用して決定した:1より多くの全パスでのリードおよび最小予測精度90%のみがCCSリード生成に含まれた。環状コンセンサス配列リードはアダプタースキャン手法を使用して連結解除し、これを、本発明者らはRで実行した。簡潔に言うと、30bpのウィンドウ(ConcatSeqアダプターの長さに相当する)は各リードに沿ってスライドし、agrep関数を使用してConcatSeqアダプター配列(フォワードおよびリバース相補鎖方向)におよそのマッチングを実施し、4つまでのミスマッチ、挿入、および/または欠失を許容する。この方法で特定したアダプターは、連結解除断片を後に残してリードから除去する。この方法によって特定された全てのアダプターおよび断片を列挙する新しいfastqファイルを作成する。断片の参照へのアライメントの前に、1bp長の全ての断片を除去した。スペーサー配列(図1a〜c、図3a〜dに記載の実験において第1のPCR増幅中に導入された)は連結解除後に各断片の一部を残し、bwa memを使用するアライメントの前に特異的に除去されなかった。各断片に隣接するスペーサー配列は、アライメントの間にソフトクリップされた。0または16のいずれかのsamフラグを有するアライメントのみが、それぞれフォワードまたはリバース相補鎖方向での正確なアライメントを示し、さらなる分析のために維持された。図3a〜dでは、本発明者らはsamtoolsでmpileup関数を使用してアラインした断片のパイルアップを生成した。本発明者らは、Perlスクリプトを使用して、パイルアップを分割表に変換し、位置ごとの各ベースコールの頻度を報告した。関連のある位置でのアリール頻度(すなわち、公知のHD701の一塩基変異体)をこれらの表から抽出し、その位置でアラインしたリードの総数の画分としてプロットした。
ConcatSeqシーケンス評価。本発明者らの連結手法が成功したことを確認するため、本発明者らは詳細な検査のためにZMW93から1719bpからなるリードを(無作為に)選択する。その長さに基づき、本発明者らは、それが8量体であると考えた。このリードで3つの循環的な特徴が特定された:30bp ConcatSeqアダプター、標的配列、およびスペーサー(図2a)。(簡潔さのために、本発明者らは、これ以降、標的と隣接するスペーサー配列を「標的」または「断片」と呼ぶ。)本発明者らの手法で使用された設計から予測されるように、アダプターはリードに沿ってフォワードおよびリバース相補鎖方向間で交替する。標的の方向は無作為であるが、両方向はほぼ同じ頻度で存在する(すなわち、フォワード方向に5、リバース相補鎖方向に3)。
UIDおよび所望の方向のSceIの制限部位の両方を持つ二本鎖アダプターを、DNA断片の両末端にライゲートする(図1)。ライゲーション産物は、SceIによって消化し、DNAリガーゼによって接合する。
フォワードおよびリバースプライマーは、所望の方向でSceIの制限部位およびUIDを持つように設計する(図2)。これらのプライマーを使用して、PCRを介して試料内の目的の領域を選択する。PCR増幅に続いて、増幅産物をSceIによって消化し、DNAリガーゼによって接合する。
UIDおよび所望の方向のSceIの制限部位の両方を持つ二本鎖アダプターを、DNA断片の両末端にライゲートする(図3)。(+)または(−)鎖に対して設計され、鎖特異的ID(SID)および所望の方向のSceI制限部位の両方を持つ伸長プライマーは、標的分子の各鎖に別々にハイブリダイズする。PCR後、所望のインサート方向のアダプター付加(adapted)断片分子を生成する。代わりに、両鎖の伸長プライマーは、標的分子に同時にハイブリダイズする。PCR後、無作為なインサート方向を有するアダプター付加断片分子を生成する。両反応から精製したPCR産物は、次いで上記のように処理され得る。
標的DNA断片はビオチン化プライマーによってPCR増幅し、ビオチン化アンプリコンを作製する。これらは、制限酵素SceIによる消化に供され、連結のため非パリンドロームオーバーハングを暴露する。全てのビオチン化種は、ストレプトアビジン結合固体支持体とのインキュベーションによって除去し、完全に消化した産物のみを残す。(図10a)カルボキシル化SeraMag Speedbeads(GE Healthcare Bio−Sciences、Pittsburgh、Penn.)および増量のPEG−8000の存在下でT4 DNAリガーゼを使用する標準的なライゲーション反応を実施する。30分後、ビーズを磁化し、上清を除去し、ビーズを70%エタノールで洗浄する。コンカテマーは次いで、TE緩衝液で溶出する。結果は図10bに示す:レーン1〜5は、漸増濃度のPEG8000(6%〜14% w/v)とのライゲーション混合物の電気泳動を示す。レーン6は、沈殿無しの対照である。
Claims (15)
- 試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、
a.少なくとも1つの二本鎖領域を有する第1のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ;
b.試料をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ;
c.標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも2つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ;ならびに、
d.1つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第2のアダプターを連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ;
を含む、前記方法。 - 第1のアダプターが、アダプター配列が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって付加される、または第1のアダプターが、標的核酸分子の末端へのライゲーションによって付加される、請求項1に記載の方法。
- 第1のアダプターが、両末端がライゲーションできるアダプターおよび1つの末端のみがライゲーションできるアダプターの混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1のアダプターが、5’末端から少なくとも約15塩基の位置にエキソヌクレアーゼ耐性領域を含む、請求項1に記載の方法。
- a.少なくとも1つの二本鎖領域を有する第1のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ;
b.アダプター含有二本鎖標的分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ;
c.標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも2つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ;ならびに、
d.1つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第2のアダプターを連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ;
を含む方法を使用して作製された、連結した標的核酸分子のライブラリー。 - 少なくとも1つの二本鎖領域を有する第1のアダプター、1つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第2のアダプター、エキソヌクレアーゼ、核酸ポリメラーゼ、および核酸リガーゼを含み、任意選択により、第1のアダプター配列に相補的な増幅プライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも4つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物をさらに含む、連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキット。
- 試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、
a.レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも1つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ;
b.アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ;ならびに、
c.部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも2つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合させ、それにより連結した標的分子を生成するステップ;
を含む、前記方法。 - アダプターが、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって付加される、請求項7に記載の方法。
- プライマーが、標的特異的配列および分子バーコードをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 第2のアダプターを、連結した分子の少なくとも1つの末端に付加するステップをさらに含み、アダプターが少なくとも1つのシーケンスプライマー結合部位を含む、請求項7に記載の方法。
- 試料から、連結した標的核酸分子を作製する方法であって、
a.レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも1つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ;
b.プライマーをアダプターライゲート標的分子の各鎖にハイブリダイズさせるステップであって、プライマーがレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むステップ;
c.プライマーを伸長して、アダプターライゲート標的分子の各鎖から、各末端でレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する新しい分子を形成するステップ;
d.新しい分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ;ならびに、
e.部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも2つのエンドヌクレアーゼ消化した新しい分子を接合し、それにより連結した標的分子を生成するステップ;
を含む、前記方法。 - プライマーが、標的特異的配列を含み、および任意選択により分子バーコードをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 第2のアダプターを、連結した分子の少なくとも1つの末端に付加するステップをさらに含み、アダプターが少なくとも1つのシーケンスプライマー結合部位を含む、請求項11に記載の方法。
- a.レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも1つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ;
b.アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ;ならびに、
c.部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも2つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合し、それにより連結した標的分子を生成するステップ;
を含む方法を使用して作製した、連結した標的核酸分子のライブラリー。 - レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位および分子バーコードを含むアダプター、ユニバーサルプライミング部位を含む第2のアダプター、レアカット制限エンドヌクレアーゼおよび核酸リガーゼを含む、連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキット。
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