JP6441893B2 - 標的配列の濃縮 - Google Patents
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Description
Claims (35)
- 標的核酸及び非標的核酸を含有する母集団から標的ヌクレオチドを濃縮し、かつ標的ヌクレオチドにアダプターを連結するための方法であって、ここで標的核酸は標的ヌクレオレオチド及び非標的ヌクレオチドを含み、非標的核酸は標的ヌクレオチドを含まず、
(a)溶液中で、前記母集団および標的単離プローブを合わせるステップであって、標的単離プローブは、親和性結合ドメインを含む、ステップ;
(b)標的単離プローブの一本鎖領域を、前記母集団中における、標的ヌクレオチドの全部または一部のみとハイブリダイズさせるステップ;
(c)標的単離プローブを捕捉ドメインと結合させることによって、前記母集団から、ステップ(b)でハイブリダイズされた標的ヌクレオチドを選択的に固定化し、そして非結合材料を除去することにより、標的ヌクレオチドを濃縮するステップ;
(d)前記ハイブリダイズされた標的ヌクレオチドが選択的に固定化された後、1種以上の3’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、標的ヌクレオチドの3’末端から非標的ヌクレオチドを除去して、標的ヌクレオチドの特定された読み取り開始点で平滑末端を形成するステップ、及び
(e)アダプターの5’末端を、前記標的ヌクレオチドの3’末端に連結するステップ
を含む、方法。 - 母集団中の標的核酸及び非標的核酸の一部または全部が反復配列を含む領域を含有し、(a)が、反復配列とハイブリダイズする除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを、前記母集団と合わせるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (d)が、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを選択的に分解するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- (b)における標的単離プローブの一本鎖領域が、標的ヌクレオチドの第1の部分とハイブリダイズする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 標的単離プローブの末端が、標的ヌクレオチドの3’末端部もしくは5’末端部、またはそれに近接する部分と二重鎖を形成する、請求項4に記載の方法。
- (b)に続いて、第2のプローブの一本鎖領域を、標的ヌクレオチドの第2の部分にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項4又は5に記載の方法。
- 第2のプローブが、標的単離プローブ付近の、標的単離プローブに近接するまたは標的単離プローブから遠位の標的ヌクレオチドの一部とハイブリダイズする、請求項6に記載の方法。
- 第2のプローブの末端が、標的ヌクレオチドの5’末端または3’末端の両方でなくどちらかに位置するまたはそれに近接する、前記標的ヌクレオチドの第1又は第2の部分と二重鎖を形成する、請求項6又は7に記載の方法。
- 標的単離プローブおよび第2のプローブのハイブリダイゼーションが標的ヌクレオチドの3’末端および5’末端で起こるように、標的単離プローブが、標的ヌクレオチドの一方の末端でハイブリダイズし、第2のプローブが、標的ヌクレオチドの反対側の末端とハイブリダイズする、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
- 親和性結合ドメインが、標的単離プローブの3’末端に位置する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 親和性結合ドメインが、標的単離プローブの3’末端と5’末端との間に位置する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 4〜10ヌクレオチドのランダム配列を有するオリゴヌクレオチドを、母集団中の核酸とハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項1から3、4、5、10または11のいずれか一項に記載の方法。
- 標的単離プローブまたは標的ヌクレオチドの5’部分に位置する第2のプローブがフラッププローブであり、ここで前記フラッププローブは一本鎖領域と二本鎖領域を有し、前記フラッププローブの一本鎖領域のみが標的ヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
- (f)1種以上の5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、非標的ヌクレオチドを標的ヌクレオチドの5’末端から除去するステップをさらに含む、請求項1から11および13のいずれか一項に記載の方法。
- フラッププローブの二本鎖領域は、オリゴヌクレオチドを含むか、又は前記フラッププローブの一部が前記フラッププローブ自体とハイブリダイズしてヘアピンを形成しており、
前記方法は、前記オリゴヌクレオチドまたはヘアピンを標的ヌクレオチドの5’末端に連結するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。 - 1種以上の3’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、3’エキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼTからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターの二本鎖領域の3’末端を、標的ヌクレオチドの5’末端に連結するステップをさらに含む、請求項1から11および13から15のいずれか一項に記載の方法。
- ヘアピンアダプターの二重鎖領域を、標的ヌクレオチドの3’末端および標的単離プローブの5’末端に連結し、それによって標的単離プローブを標的ヌクレオチドに共有結合させるステップをさらに含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 5’エキソヌクレアーゼ消化後に第2のプローブが置換されるように、ポリメラーゼによって標的単離プローブの3’末端を伸長させるステップをさらに含み、ここで、前記第2のプローブは、標的核酸中の標的ヌクレオチドの5’末端領域に位置する、請求項6に記載の方法。
- アダプターを、標的核酸中の標的ヌクレオチドの各末端に連結し、標的配列を決定するステップを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド中の突然変異を検出するステップをさらに含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 突然変異が、挿入、欠失またはヌクレオチド多型からなる群から選択することができる、請求項21に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド中の突然変異を生物の表現型の変異と相関させるステップを含む、請求項22に記載の方法。
- 標的単離プローブの一本鎖領域が、標的ヌクレオチドの3’末端および5’末端の両方とハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
- 親和性結合ドメインが、標的単離プローブの3’末端または5’末端の間であるが標的単離プローブの3’末端でも5’末端でもない位置で標的単離プローブと結合される、請求項24に記載の方法。
- (f)1種以上の5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、非標的ヌクレオチドを標的ヌクレオチドの5’末端から除去するステップをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
- 標的単離プローブがフラッププローブであり、前記フラッププローブは、一本鎖領域の3’末端から伸長される二本鎖領域を有するフラッププローブである、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
- アダプター分子を標的ヌクレオチドの3’末端に連結するステップをさらに含む、請求項21から27のいずれか一項に記載の方法。
- アダプター分子を標的ヌクレオチドの5’末端に連結するステップをさらに含む、請求項21から28のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターが、シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位、ユニークサンプル識別子およびユニーク分子識別子のうち少なくとも1つを含む、請求項28または29に記載の方法。
- (a)抽出物から核酸サンプルを得るステップ;
(b)請求項1の方法によって、標的ヌクレオチドを濃縮し、そして前記標的ヌクレオチドをアダプターに連結するステップ;および
(c)濃縮された標的ヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、動物または植物の抽出物を分析する方法。 - (c)において決定されたヌクレオチド配列が、3’末端において5つ未満の非標的ヌクレオチドを含むか、または(c)において決定されたヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチドの少なくとも90%を構成する、請求項31に記載の方法。
- (b)が、標的ヌクレオチドの3’末端および5’末端に配置された1つ以上のアダプターとハイブリダイズするプライマーを用いて、濃縮された標的ヌクレオチドを増幅するステップをさらに含む、請求項31または32に記載の方法。
- 標的ヌクレオチドの特徴を原核生物または真核生物の表現型と相関させるステップをさらに含む、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
- 標的単離プローブはフラッププローブであり、ここで前記フラッププローブは一本鎖領域と二本鎖領域を有し、前記フラッププローブの一本鎖領域のみが標的ヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
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