JP4748685B2 - タンパク質に対する官能基の共有結合的テザリング - Google Patents

タンパク質に対する官能基の共有結合的テザリング Download PDF

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Description

関連出願のクロスリファレンス
本願は、米国特許法３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと２００３年１月３１日に出願された米国特許出願第６０／４４４，０９４号、及び２００３年５月３０日に出願された米国特許出願第６０／４７４，６５９号の出願日の利益を主張するものであり、これらの出願を引用により本明細書に組み入れるものである。
本発明は、生化学的アッセイ及び試薬の分野に関する。更に具体的には、本発明は、１又は複数の官能基に対し共有結合（テザー）した突然変異タンパク質及びそれらの使用方法に関する。
分子の特異的検出は、細胞におけるその分子の役割を理解するのに重要である。標識、例えば注目の分子と共有結合するものは、複合体混合物におけるその分子の迅速な検出を可能にする。標識は、in vitroでの化学合成により加えられるものであっても、in vivoで、例えば組換え技術を介して付着されるものであってもよい。例えば、タンパク質上への蛍光又は他の標識の付着は、伝統的に、タンパク質精製後のin vitroでの化学修飾により達成されている(Hermanson, 1996)。標識のin vivoでの付着の場合、クラゲ（オワンクラゲ(Aequorea victoria)）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、in situで蛍光キメラを生成するために、多くの宿主タンパク質と遺伝子融合されうる(Tsien, 1998; Chalfie et al., 1998)。しかし、ＧＦＰベースの指示薬は現在様々なアッセイ、例えばｐＨ(Kneen et al., 1998 ; Llopis et al. , 1998;Miesenbock et al. , 1998)、Ｃａ2+ (Miyawaki et al. , 1997; Rosomer et al. , 1997)、及び膜電位 (Siegel et al. , 1997)の測定において利用されているが、内因的に標識されたタンパク質、例えばＧＦＰの蛍光は、タンパク質構造の特性、例えば限られた蛍光色の範囲及び比較的低い内因性の明るさ、によって制限されている(Cubitt et al. , 1995;Ormo et al., 1996).。
in situでのＧＦＰ標識の欠点に対処するために、Griffenらは(1998)、分子成分：わずか６個のアミノ酸から構成される小さい受容体ドメイン及び小さい（７００ダルトン未満）の、分光学的プローブ又は架橋に結合しうる合成リガンド、の強固な結合対を合成した。当該受容体ドメインには、αヘリックスのｉ、ｉ＋１、ｉ＋４、及びｉ＋５位にある４つのシステインが含まれており、そして前記リガンドは４’、５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン(dithioarsolan)−２−イル）フルオレセイン（ＦＬＡＳＨ）であった。Griffenらは、当該リガンドがトランスフェクションされなかった哺乳類細胞において比較的少数の結合部位を有し、膜透過性であり、且つ組換えタンパク質のテトラシステインドメインに対し高い親和性及び特異性で結合するまで非蛍光であり、その結果ナノモーラー以下の解離定数で蛍光標識（「ＦＬＡＳＨ」標識）された細胞をもたらすことを開示している。しかしながら、細胞内のバックグラウンドの結合に関しては、Stroffekovaら(2001)は、ＦＬＡＳＨ−ＥＤＴ2が内因性のシステインリッチタンパク質と非特異的に結合することを開示している。更に、ＦＬＡＳＨによるタンパク質の標識は、使用されうるフルオロフォアの範囲により制限される。
受容体媒介型の標的化方法は、実際に任意な細胞部位にフルオロフォアを局在化させるために、遺伝子でコードされた標的配列を使用し、但し、標的化されたタンパク質は適切に折り畳むことが可能である。例えば、Farinasら(1999)は、ｃＤＮＡのトランスフェクションが、一本鎖抗体（ｓＦｖ）を細胞の特定の部位の標的にするために使用されたことを開示している。Farinasらは、ハプテン（４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン、ｐｈＯｘ）及び蛍光プローブ（例えば、ＢＯＤＩＰＹ Ｆｌ、テトラメチルローダミン、及びフルオレセイン）の接合体が、高親和性（約５ｎＭ）で、生きているチャイニーズハムスター卵巣細胞のｓＦｖのための細胞内部位と結合したことを開示しており、これは標的化された抗体が、細胞透過性ハプテン−フルオロフォア接合体の高い親和性受容体として機能したことを示唆している。それにも関わらず、機能的なｓＦｖの発現は、還元性の環境において比較的乏しいことがある。
従って、所望のタンパク質を標識する方法の改善が必要とされる。
本発明の要約
本発明は、例えば共有結合又はその他の安定な結合を介して、１又は複数の官能基を、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質（キメラ）にテザリング（結合）させるための方法、組成物及びキットを提供する。本発明のタンパク質は構造的に野生型（天然）の加水分解酵素と構造的に関連しているが、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、且つ相当の野生型加水分解酵素の基質と結合するが、相当の野生型加水分解酵素と比較して触媒活性が無いか、あるいは低い（この突然変異タンパク質は本明細書では突然変異加水分解酵素と称する）。前述のテザリングは、例えば溶液又は懸濁液中、細胞内、固体支持体上又は溶液／表面の界面において、反応基を含み且つ１又は複数の官能基を含むように修飾されている加水分解酵素の基質を利用することにより生じる。本明細書で使用する場合、「基質」は、反応基、そして任意に１又は複数の官能基を有する基質を含む。１又は複数の官能基を含む基質は通常、本明細書では本発明の基質と称される。本明細書で使用する場合、「官能基」は、検出可能であるか、又は検出することができる分子（例えばクロモフォア、フルオロフォア又はルミノフォア）、あるいは第二の分子に結合又は付着しうる分子（例えば、ビオチン、ハプテン又は架橋基）であり、あるいは１又は複数のアミノ酸、例えばペプチド又はポリペプチド、例えば抗体又は受容体、１又は複数のヌクレオチド、脂質、例えば脂質二重層、固体支持体、例えば沈降粒子を含む。官能基は、複数の特性を有することがあり、例えば、検出可能であること、別の分子と結合すること、である。本明細書で使用する場合、「反応基」は、特定の野生型加水分解酵素又は本発明の突然変異加水分解酵素により特異的に認識される基質の最少数の原子である。基質の反応基と野生型加水分解酵素との相互作用は生成物及び野生型加水分解酵素の再生をもたらす。基質、例えば本発明の基質は更に、任意にリンカー、例えば開裂可能なリンカーを含むことがある。
本発明において有用な基質は、突然変異加水分解酵素が特異的に結合するものであって、好ましくは、当該基質と野生型加水分解酵素との相当のアミノ酸との間で形成した結合よりも安定な、突然変異加水分解酵素のアミノ酸、例えば反応性残基により形成した結合をもたらすものである。突然変異加水分解酵素は、相当の野生型加水分解酵素が特異的に結合しうる基質に特異的に結合するが、相当の野生型加水分解酵素と基質との間の反応により生成物の形成をもたらす条件下で、突然変異加水分解酵素と基質との間の相互作用から全く又は実質的にほとんど生成物を形成せず、例えば２、１０、１００、又は１０００倍少ない。突然変異加水分解酵素による生成物の形成が無いこと、又はその量の低下は、突然変異加水分解酵素における少なくとも１つの置換に起因し、この置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成する結合よりも安定な基質との結合を形成する突然変異加水分解酵素をもたらす。好ましくは、本発明の突然変異加水分解酵素と基質との間で形成される結合は、相当の野生型加水分解酵素による生成物の形成をもたらす条件下で、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合の半減期（すなわち、ｔ1/2）よりも少なくとも２倍、そして更に好ましくは少なくとも４倍、又は場合によって１０倍、そして最大１００倍、１０００倍あるいは１０，０００倍のｔ1/2を有する。好ましくは、突然変異加水分解酵素と基質との間で形成される結合は、少なくとも３０分、そして好ましくは少なくとも４時間、そして最大少なくとも１０時間のｔ1/2を有し、そして洗浄、タンパク質変性、及び／又は高温による破壊に耐性があり、例えば当該結合はＳＤＳ中での煮沸に対し安定である。
１つの態様において、前記基質は、デハロゲナーゼ、例えばハロアルカンデハロゲナーゼ又は脂肪族若しくは芳香族ハロゲン化基質の炭素−ハロゲン結合を開裂するデハロゲナーゼの基質、例えばロドコッカス(Rhodococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、バークホルデリア(Burkholderia)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)又はキサントバクター(Xanthobacter)のデハロゲナーゼの基質、あるいはセリンベータラクタマーゼの基質である。１つの態様において、本発明の基質は、任意に、基質の反応基から１又は複数の官能基を物理的に離すリンカーを含む。例えば、幾つかの突然変異加水分解酵素、すなわち深い触媒ポケットを有するものの場合、本発明の基質は、本発明の基質の１又は複数の官能基が加水分解酵素（野生型又は突然変異体）の３次元構造を妨害しないような十分な長さ及び構造のリンカーを含むことがある。例えば、デハロゲナーゼのための本発明の基質の一例には、反応基、例えば（ＣＨ2）2-3Ｘ（ここで、Ｘはハロゲン化物である）、及び官能基、例えばテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、例えばＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌが含まれる。
１つの態様において、リンカーは好ましくは１２〜３０原子の長さである。リンカーは、本発明の基質に常に存在するわけではないが、態様によっては、反応基が突然変異加水分解酵素の反応性残基と反応して共有結合を形成することができるように、反応基と官能基との間の物理的分離が必要とされることがある。好ましくは、リンカーは、存在している場合、リンカーを有する基質と野生型又は突然変異加水分解酵素との特異性又は反応性を、リンカーを欠いている相当の基質と野生型又は突然変異加水分解酵素との特異性又は反応性と比較して実質的に変化させず、例えば損なわない。更に、リンカーの存在は、好ましくは、官能基の１又は複数の特性、例えば機能を実質的に変化させず、例えば損なわない。
従って、本発明は、式（Ｉ）：Ｒ−リンカーＡ−Ｘ（ここで、Ｒは１又は複数の官能基であり、リンカーはＣ，Ｎ，Ｓ，又はＯを含む多原子の直鎖又は分枝鎖であり、Ａ−Ｘはデハロゲナーゼの基質であり、且つＸはハロゲンである）の化合物を提供する。１つの態様において、アルキルハロゲン化物はリンカーＬに共有結合的に付着し、これは１又は複数の官能基と共有結合的に付着してデハロゲナーゼの基質を形成する１又は複数の基である。本明細書に記載のように、突然変異デハロゲナーゼＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆは、５−（及び６−）カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、例えばＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、ＴＡＭＲＡ、例えばＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、及びビオチン、例えばビオチン−Ｃ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌを含むＤｈａＡの基質と結合し、そしてＦＡＭ又はＴＡＭＲＡの蛍光あるいはストレプトアビジンに対して結合しているビオチンに対するこの結合の消光作用は有意ではなかった。また、本明細書に記載のように、突然変異デハロゲナーゼ、例えばＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ及びＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ並びにＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ：Ｈ２７２Ｆ及びＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ：Ｈ２７２Ｆは、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ及び／又はＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌと結合した。１つの態様において、基質はＲ−（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）6Ｃｌであり、ここで、Ｒは官能基である。そのような基質を調製するために、官能基は、ＮＨ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）6Ｃｌのような分子と反応させられることがある。
１つの態様において、本発明の基質は細胞の原形質膜透過性である。例えば、本明細書に記載のように、原核細胞（Ｅ．コリ）及び真核（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞の原形質膜は、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ及びビオチン−Ｃ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌに対し透過性があり、そしてこれらの基質は、突然変異加水分解酵素の不在下で、迅速且つ効率的に細胞に添加されてウォッシュアウトされた。突然変異加水分解酵素の存在下で、基質の少なくとも一部が細胞からウォッシュアウトされるのが妨げられた。従って、基質の結合部分は、マーカーとして、あるいは突然変異加水分解酵素又はその融合物を捕獲するための手段としての役割を果たすことがある。
本発明は更に、加水分解酵素の基質であって、１又は複数の官能基を含むように修飾されている基質を調製する方法を提供する。本発明の使用のための例示的な官能基には、限定しないが、アミノ酸、タンパク質、例えば酵素、抗体又は他の免疫原性タンパク質、放射性核種、核酸分子、薬物、脂質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、磁気ビーズ、固体支持体、電子不透過性(electron opaque)分子、クロモフォア、ＭＲＩ造影剤、色素、例えばキサンテン色素、カルシウム感受性色素、例えば１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）−フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（Ｆｌｕｏ−３）、ナトリウム感受性色素、例えば１，３−ベンゼンジカルボン酸、４，４’−［１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン−７，１６−ジイルビス（５−メトキシ−６，２−ベンゾフランジイル）］ビス（ＰＢＦＩ）、ＮＯ感受性色素、例えば、４−アミノ−５−メチルアミノ−２’、７’−ジフルオレセイン、又は他のフルオロフォアが含まれる。１つの態様において、官能基は免疫原性の分子であり、すなわち、その分子に特異的な抗体が結合するものである。１つの態様において、官能基は放射性核種ではない。
本発明はまた、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成る突然変異加水分解酵素を含み、この置換は、当該突然変異加水分解酵素が、相当の加水分解酵素の基質、例えば本発明の基質との結合、例えば共有結合であって、相当の野生型加水分解酵素と基質との間に形成される結合よりも安定なものを形成することが出来るようにする。
１つの態様において、本発明の突然変異加水分解酵素は、野生型加水分解酵素において、水分子の活性化と関連している残基、例えば触媒三残基(catalytic triad)の残基又は補助残基における少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、ここで、活性化された水分子は、野生型加水分解酵素の触媒残基と当該加水分解酵素の基質との間に形成した結合を開裂する。本明細書で使用する場合、「補助残基」は、別の残基の活性を変化させる残基であり、これは水分子を活性化させる残基の活性を増強させる。本発明の範囲内の水を活性化させる残基には、限定しないが、酸−塩基触媒に関与するもの、例えばヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。別の態様において、本発明の突然変異加水分解酵素は、野生型加水分解酵素において、当該加水分解酵素の基質の求核攻撃によりエステル中間体を形成する、残基における少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成る。
例えば、野生型デハロゲナーゼＤｈａＡは、ハロゲン化炭化水素（ハロＣ3−ハロＣ10）の炭素−ハロゲン結合を開裂させる。ＤｈａＡの触媒中心は、求核試薬、酸及びヒスチジン残基を含む古典的な触媒三残基である。当該三残基のアミノ酸は、ＤｈａＡの触媒ポケットの内側深くに位置している（約１０Åの長さで且つ断面が約２０Å2）。ＤｈａＡのハロゲン化基質のハロゲン原子、例えば、Ｃｌ−アルカン基質の塩素原子は、ＤｈａＡの触媒中心に近接した位置にある。ＤｈａＡは基質と結合し、おそらくＥＳ複合体を形成し、そしてＤｈａＡのＡｓｐ１０６（この番号はＤｈａＡのタンパク質配列を基にしている）による基質の求核攻撃によりエステル中間体が形成される（図１）。続いて、ＤｈａＡのＨｉｓ２７２が水を活性化し、そして活性化した水が前記中間体を加水分解して触媒中心から生成物を放出させる。本明細書に記載のように、突然変異ＤｈａＡ、例えばＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体（これはおそらく野生型ＤｈａＡ（ＤｈａＡ．ＷＴ）のコンピューターモデリング研究及び基本的な物理化学特性に基づいた３次元構造を保持している）は、野生型酵素の１又は複数の基質を加水分解することができず、例えば、Ｃｌ−アルカンの場合、野生型酵素により放出される相当のアルコールを放出することができなかった。更に本明細書に記載するように、突然変異セリンベータラクタマーゼ、例えばｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ突然変異体、ｂｌａＺ．Ｎ１７０Ｑ突然変異体及びｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ：Ｎ１７０Ｑ突然変異体は、野生型セリンベータラクタマーゼの１又は複数の基質を加水分解することができなかった。
従って、本発明の１つの態様において、突然変異加水分解酵素は、野生型デハロゲナーゼにおいて、水分子を活性化するのに関与している残基、例えば触媒三残基の残基又は補助残基において少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成る突然変異デハロゲナーゼであり、ここで、活性化した水分子は、野生型デハロゲナーゼの触媒残基とデハロゲナーゼの基質との間に形成される結合を開裂する。１つの態様において、少なくとも１つの置換が、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のＤｈａＡの残基２７２に相当する残基にある。「相当の残基」は、参照野生型タンパク質と比較して、ある野生型タンパク質における同一の活性（機能）を有する残基であり、そして任意に、２つのタンパク質の一次配列がアラインされた場合に同一の相対的位置にある。例えば、触媒三残基の一部を形成し、且つ水分子を活性化する、ある酵素の残基は、その酵素の残基２７２であってもよく、ここで、残基２７２は別の酵素の残基７３に相当し、ここで、残基７３は触媒三残基の一部を形成し、且つ水分子を活性化する。従って、１つの態様において、本発明の突然変異デハロゲナーゼは、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のＤｈａＡの残基２７２に相当する位置にフェニルアラニン残基を有する。本発明の別の態様において、突然変異加水分解酵素は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のＤｈａＡの残基１０６に相当する残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成る突然変異デハロゲナーゼである。例えば、本発明の突然変異デハロゲナーゼは、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のＤｈａＡの残基１０６に相当する位置にシステイン又はグルタミン酸残基を有する。追加の態様において、突然変異加水分解酵素は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のＤｈａＡの残基１０６に相当する残基に１つ、そして残基２２７２に相当する残基に１つ、少なくとも２つのアミノ酸置換を含んで成る突然変異デハロゲナーゼである。更に追加の態様において、突然変異加水分解酵素は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ＰＣ１のセリンベータラクタマーゼの残基１６６又は残基１７０に相当する残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成る突然変異ベータラクタマーゼである。
突然変異加水分解酵素は、融合タンパク質、例えば、突然変異加水分解酵素及び注目の少なくとも１つのタンパク質をコードする組換えＤＮＡから発現した融合タンパク質及び化学合成により形成した融合タンパク質であってもよい。例えば、当該融合タンパク質は、突然変異加水分解酵素及び注目の酵素、例えばルシフェラーゼ、ＲＮａｓｉｎ又はＲＮアーゼ、及び／又はチャンネルタンパク質、受容体、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体結合タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質、転写因子、輸送タンパク質及び／又は標的配列、例えばミリスチル化配列、ミトコンドリア局在化配列、あるいは核局在化配列、であって、突然変異加水分解酵素、例えば融合タンパク質を、特定の位置に向かわせるもの、を含んで成ることがある。注目のタンパク質は、突然変異加水分解酵素のＮ末端又はＣ末端に融合されうる。１つの態様において、融合タンパク質は、突然変異加水分解酵素のＮ末端に注目のタンパク質を、そしてＣ末端に別のタンパク質、例えば異なるタンパク質を含んで成る。例えば、注目のタンパク質は、蛍光タンパク質又は抗体であってもよい。任意に、当該融合におけるタンパク質は、接続配列、例えば、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残基を有するもの、例えば１３〜１７個のアミノ酸残基を有するもので離されている。本発明の融合タンパク質における接続配列の存在は、当該融合におけるいずれのタンパク質の機能も、それぞれの個々のタンパク質の機能と比較して実質的に変化させない。従って、突然変異デハロゲナーゼとウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼの融合の場合、接続配列の存在は、突然変異デハロゲナーゼとその基質との間に形成した結合の安定性又はルシフェラーゼの活性を実質的に変化させない。融合におけるタンパク質の任意な特定の組み合わせについては、広範な接続配列が利用されうる。１つの態様において、接続配列は、酵素に認識される配列であり、例えば開裂可能な配列である。例えば、接続配列は、カスパーゼで認識されるものでもよく、例えばＤＥＶＤ（配列番号６１）であり、あるいは光開裂可能な配列である。
１つの態様において、融合タンパク質は、突然変異加水分解酵素のＮ末端に注目のタンパク質を、そして好ましくはＣ末端に注目の異なるタンパク質を含んで成ることがある。本明細書に記載のように、突然変異ＤｈａＡとＧＳＴ（Ｎ末端）、Ｆｌａｇ配列（Ｃ末端）及びウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ（Ｎ末端又はＣ末端）との融合は、突然変異ＤｈａＡと、官能基を含む野生型ＤｈａＡの基質との間の結合形成に対する効果は検出されなかった。更に、Ｆｌａｇ配列とＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆの融合は、ストレプトアビジン−ビオチン−Ｃ18Ｈ32Ｏ4−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ架橋を介して固体支持体に付着されうる（ＳＦｌａｇ−ＥＬＩＳＡ実験）。更に、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ（Ｒ．Ｌｕｃ）とＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆの融合は、官能基を含む野生型ＤｈａＡでコーティングされたＭａｇｎｅｓｉｌ（登録商標）粒子と付着されうる。尚、Ｒ．Ｌｕｃを含んで成る付着した融合は、酵素的に活性であることが示された。
例示的な注目のタンパク質には、限定しないが、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、選択マーカータンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、酵素、例えばＲＮアーゼ、酵素基質、受容体タンパク質、輸送タンパク質、転写因子、チャンネルタンパク質、例えばイオンチャンネルタンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体会合タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、分泌タンパク質、受容体リガンド、血清タンパク質、又は反応性システインを有するタンパク質が含まれる。
本発明はまた、リンカーを含む加水分解酵素の基質、１又は複数の官能基及び任意にリンカーを含む加水分解酵素の基質、１又は複数の官能基を含むリンカー、１又は複数の官能基を欠いており、且つ任意にリンカーを含む加水分解酵素の基質、リンカー、又は突然変異加水分解酵素、あるいはそれらの任意な組み合わせ、を含んで成る組成物及びキットを含む。例えば、本発明は、本発明の基質を含んで成る固体支持体、本発明の基質を含んで成るキット、本発明のデハロゲナーゼをコードするベクターを含んで成るキット、又は本発明のセリンベータラクタマーゼをコードするベクターを含んで成るキット、を含む。
更に提供されるものとして、加水分解酵素をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）がある。１つの態様において、当該単離された核酸分子は、少なくとも１つの選択された宿主において発現について最適化されている核酸配列を含んでなる。最適化された配列には、最適化されているコドン、すなわち、ある生物において、別の生物、例えば遠縁の生物と比較してより頻繁に利用されるコドンの配列、並びにコザック配列及び／又はイントロンを付加又は修飾し、そして／あるいは不所望な配列、例えば潜在的な転写因子結合部位を除去するような修飾、が含まれる。１つの態様において、ポリヌクレオチドには、デハロゲナーゼをコードする核酸配列、であって、選択した宿主細胞での発現のために最適化されている核酸配列が含まれる。１つの態様において、最適化されたポリヌクレオチドはもはや、相当の最適化されなかった配列とハイブリダイズせず、例えば、中程度又は高度にストリンジェントな条件下で最適化されなかった配列とハイブリダイズしない。別の態様において、ポリヌクレオチドは、相当の最適化されなかった配列に対して９０％未満、例えば８０％未満の核酸配列同一性を有し、そして任意に、最適化されなかった配列がコードするポリペプチドと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。単離された核酸分子を含んでなるコンストラクト、例えば発現カセット、及びベクター、並びに単離された核酸、コンストラクト又はベクターを含んで成るキットも提供される。
更に提供されるものとして、本発明の突然変異加水分解酵素を発現する方法がある。当該方法は、突然変異加水分解酵素を発現するように、宿主細胞に対して、本発明の突然変異加水分解酵素をコードする組換え核酸分子を導入することを含んでなる。１つの態様において、突然変異加水分解酵素は、細胞から単離されうる。突然変異加水分解酵素は、一過性に又は安定的に、構成的に又は組織特異的な若しくは薬物制御プロモーターのもとなどで発現されうる。更に提供されるものとして、本発明の突然変異加水分解酵素をコードする組換え核酸分子を含んで成る単離された宿主細胞がある。
１つの態様において、本発明は、突然変異加水分解酵素の存在又は量を検出又は決定する方法を提供する。当該方法は、突然変異加水分解酵素と、１又は複数の官能基を含んで成る加水分解酵素基質との接触を含んで成る。突然変異加水分解酵素は、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、当該少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成する突然変異加水分解酵素をもたらし、そして突然変異加水分解酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、の置換である。官能基の存在又は量が検出又は決定され、それにより突然変異加水分解酵素の存在又は量が検出又は決定される。１つの態様において、突然変異加水分解酵素は細胞内又は細胞表面上にある。別の態様において、突然変異加水分解酵素は細胞可溶化物中にある。
更に提供されるものとして、突然変異加水分解酵素及び１又は複数の官能基を含む相当の加水分解酵素の基質を用いて、例えば分子を単離し、あるいは位置、例えば細胞内(intracellular)、細胞内(subcellular)若しくは細胞外の位置の存在若しくは量、又は細胞中のある分子の移動、を検出又は決定する方法がある。１つの態様において、試料中の注目の分子を単離する方法が提供される。当該方法は、突然変異加水分解酵素と、注目の分子を結合するタンパク質とを含んで成る融合タンパク質を有する試料と、１又は複数の官能基を含んで成る加水分解酵素基質とを接触させることを含む。突然変異加水分解酵素は、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、当該少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成する突然変異加水分解酵素をもたらし、そして突然変異加水分解酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、の置換である。１つの態様において、少なくとも１つの官能基は固体支持体又は固体支持体と結合する分子である。１つの態様において、試料は無処置の細胞を含むが、別の態様において、試料は細胞可溶化物又は細胞内画分である。そして、注目の分子が単離される。
例えば、本発明は、注目のタンパク質を単離する方法を含む。当該方法は、突然変異加水分解酵素及び注目のタンパク質を含んで成る融合タンパク質と、少なくとも１つの官能基を含んで成る加水分解酵素基質とを接触させることを含む。突然変異加水分解酵素は、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、当該少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成する突然変異加水分解酵素をもたらし、そして突然変異加水分解酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、の置換である。１つの態様において、少なくとも１つの官能基は固体支持体又は固体支持体と結合する分子である。そして、注目の分子が単離される。
別の態様において、本発明は、注目のタンパク質と、当該注目のタンパク質と相互作用することが疑われる分子との相互作用を変化させる物質を同定する方法を含む。当該方法は、少なくとも１つの物質を、注目のタンパク質と相互作用することが疑われる分子、突然変異加水分解酵素及び注目のタンパク質を含んで成る融合タンパク質、及び１又は複数の官能基を含んで成る加水分解酵素基質と接触させることを含む。突然変異加水分解酵素は、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、当該少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成する突然変異加水分解酵素をもたらし、そして突然変異加水分解酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間での、基質とエステル中間体を形成する相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基の置換である。１つの態様において、少なくとも１つの官能基は固体支持体又は固体支持体と結合する分子である。続いて、前記物質が、注目のタンパク質と、当該注目のタンパク質と相互作用することが疑われる分子との間の相互作用を変化させるか否かが決定される。
更に、固体支持体に結合した本発明の基質又は固体支持体と結合した突然変異加水分解酵素は、タンパク質アレイ、細胞アレイ、小胞／細胞小器官アレイ及び細胞膜アレイを生成するために使用されうる。
従って、本発明は、細胞におけるタンパク質の発現、位置及び／又は移動（輸送）をモニタリングする方法、並びに細胞内の微小環境の変化をモニタリングする方法、を提供する。１つの態様において、本発明の突然変異加水分解酵素及び基質の使用は、タンパク質の機能、例えばイオンチャンネルの解析を可能にする。別の態様において、突然変異加水分解酵素／基質の２つの対は、多重化(multiplexing)、同時検出、及びＦＲＥＴ−又はＢＲＥＴ−ベースのアッセイを可能にする。例えば、触媒三残基の異なる残基における置換を有する突然変異デハロゲナーゼは、それぞれ優先的に本発明の幾つかの基質に結合するが他のものには結合せず、あるいは突然変異デハロゲナーゼ及び突然変異ベータラクタマーゼはそれらの各基質と一緒に使用されることがあり、その結果多重化を可能にする。他の利用には、解析又は工業目的で（例えば、テザリングした酵素の動力学的パラメーターを研究するため、酵素チェイン／アレイを生成するため、工業成分を代謝させるため、等）、固体支持体上に突然変異加水分解酵素と本発明の相当の基質との接触から生じる安定複合体を捕獲して、タンパク質間相互作用を検出し、注目のタンパク質及び突然変異加水分解酵素を含んで成る融合タンパク質と他の分子との相互作用に対する異なる化合物／薬物の作用を決定し、突然変異加水分解酵素に融合した注目のタンパク質に結合する分子を単離若しくは精製し、あるいは細胞、細胞小器官又はそれらのフラグメントを単離又は精製することが含まれる。例えば、注目のタンパク質は、突然変異加水分解酵素と融合され、続いて、受容器(acceptor group)のリガンドであり、且つ本発明の基質に存在する官能基と、固体支持体上に存在する受容器との特異的な相互作用を介して固体支持体に結合されうる。前記基質は、固体支持体と接触する前に融合タンパク質と接触され、融合タンパク質と接触する前に固体支持体と接触され、あるいは融合タンパク質及び固体支持体と同時に接触されうる。そのような系は、生じた複合体が、注目のタンパク質と結合する分子を検出又は単離するのに利用されることを可能にする。結合分子は、タンパク質、例えば結合タンパク質と官能基、例えばＧＦＰ、ルシフェラーゼ、抗体、との融合物、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はフルオロフォアと複合したもの、であってもよい。
細胞を単離、選別又は精製するために、突然変異加水分解酵素は、細胞表面の外側で発現されることもある（例えば、原形質膜タンパク質との融合を介して）。細胞小器官を単離、精製又は分離するために、突然変異加水分解酵素は、注目の細胞小器官の細胞質側表面上で発現される。別の態様において、異なる細胞を生育するのに最適なプラットホームを作り出すために、突然変異加水分解酵素は、細胞外マトリックス成分又は外膜タンパク質と融合され、三次元細胞培養物又は組織工学のためのプラットホームとテザリングされる。一例として、初代神経又は胚幹細胞はプラットホーム上で生育されて支持細胞層を形成することがある。
他の利用には、細胞の検出又は標識が含まれる。従って、本発明の突然変異加水分解酵素及び相当の基質の使用は、細胞の検出、例えば動物に移植又は注入した後のin vitro又はin vivoでの細胞遊走を検出すること（例えば、血管形成／走化性アッセイ、移植されたニューロン、動物に移植／注入された正常、悪性、又は組換えで修飾された細胞の遊走）、及び生細胞の画像化、その後の免疫細胞化学、を可能にする。別の態様において、本発明は、新規に合成したタンパク質を標識する方法を提供する。例えば、本発明の突然変異加水分解酵素又はその融合物を発現するベクターを含んで成る細胞は、官能基を欠く加水分解酵素の基質と接触される。続いて、細胞は、物質、例えば遺伝子発現の誘導因子、及び１又は複数の官能基を含む加水分解酵素の基質と接触される。突然変異加水分解酵素又はその融合物の存在、量又は位置が続いて検出又は決定される。突然変異加水分解酵素又はその融合物の存在、量又は位置は、新規に合成された突然変異加水分解酵素又はその融合物に起因する。あるいは、本発明の突然変異加水分解酵素又はその融合物を発現するベクターを含んで成る細胞は、官能基、例えばグリーンフルオロフォアを有する加水分解酵素の基質と接触され、続いて、物質及び異なる官能基、例えばレッドフルオロフォアを有する基質と接触される。１つの態様において、突然変異加水分解酵素は、膜局在化シグナルと融合され、そしてその結果膜の中又は膜付近での事象をモニタリングするのに利用されうる。
従って、本発明は、細胞を標識する方法を提供する。当該方法は、突然変異加水分解酵素を含んで成る細胞を、１又は複数の官能基を含んで成る加水分解酵素基質と接触させることを含む。突然変異加水分解酵素は、相当の野生型加水分解酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、当該少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成する突然変異加水分解酵素をもたらし、そして突然変異加水分解酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、相当の野生型加水分解酵素と基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する相当の野生型加水分解酵素におけるアミノ酸残基、の置換である。続いて、官能基の存在又は量が検出又は決定される。
選択マーカータンパク質を発現する細胞、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、又はピューロマイシンに対する耐性をコードするものは、細胞を外来ＤＮＡで安定的に形質転換するために使用される。蛍光標識分子だけでなく選択マーカータンパク質を含む細胞を観察することが望ましいことがある。例えば、選択マーカーを、外から生細胞に添加される蛍光分子で標識することが好ましいことがある。この方法により、選択マーカータンパク質は、フルオロフォアの添加が必要となる場合にのみ視認できるようになり、そしてその蛍光はその後、選択マーカータンパク質が細胞代謝を通じて天然に再生される場合に消失する。従って、１つの態様において、本発明は、選択マーカータンパク質を発現する細胞を標識する方法を提供する。当該方法は、融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる発現カセットを含んで成る細胞を提供する。当該融合タンパク質は、選択マーカータンパク質、例えば少なくとも１つの抗生物質に対する耐性を賦与するもの、及び光学的に検出可能な分子を含む基質又はその一部と安定的に且つ任意に不可逆的に結合することができる第二タンパク質を含んで成る。例えば、当該タンパク質は、アルキル基及び光学的に検出可能な分子を、基質から自分自身に不可逆的に転移させ、それによりアルキルトランスフェラーゼを標識するアルキルトランスフェラーゼ、例えば、Ｏ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼのようなアルキルトランスフェラーゼであってもよい。本発明のこの態様において有用な例示的なタンパク質には、限定しないが、アルキルトランスフェラーゼ、ペプチジルグリシン−アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ、Ｉ型トポイソメラーゼ、加水分解酵素、例えばセリン及びエポキシド加水分解酵素並びに本明細書に記載の突然変異加水分解酵素、アミノトランスフェラーゼ、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ、オキシダーゼ、例えばモノアミンオキシダーゼ、レダクターゼ、例えばリボヌクレオチドレダクターゼ、合成酵素、例えば、環状ＡＤＰリボース合成酵素又はチミジル酸合成酵素、デヒドロゲナーゼ、例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、合成酵素、例えば一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、ラクタマーゼ、シスタチオニンガンマリアーゼ、ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＡ、アロマターゼ、プロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼ、キシラナーゼ、グルコシダーゼ、、マンノシダーゼ、並びにデメチラーゼ及び他のタンパク質、例えば野生型タンパク質、であって、１又は複数の基質と不可逆的な又は他の方法で安定な結合を形成するもの、例えばメカニズムベースの不活性化が可能な酵素、が含まれる。従って、この態様において、安定な結合、すなわち、基質と野生型酵素又は突然変異酵素との間で形成される結合は、少なくとも３０分、好ましくは少なくとも４時間、最大少なくとも１０時間のｔ1/2を有し、且つ洗浄、タンパク質変性、及び／又は高温による破壊に耐性があり、例えば当該結合はＳＤＳ中での煮沸に対し安定である。
融合タンパク質を発現する細胞は、当該細胞を標識するように基質と接触される。１つの態様において、細胞は基質と接触する前に固定される。別の態様において、基質と固定剤は、同時に細胞と接触される。更に別の態様において、固定剤は、細胞が基質と接触した後に添加される。１つの態様において、融合タンパク質は、基質とエステル結合を形成する。別の態様において、融合タンパク質は基質とチオエステル結合を形成する。更に提供するものとして、融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及び融合タンパク質を発現する細胞がある。
細胞に対する画像解析を実施する場合、一般に細胞構造の大部分の特徴を維持する防腐剤（固定剤）、例えばパラホルムアルデヒド、アセトン又はメタノールで細胞を固定することが望ましいことがある。そのように固定された細胞は、続いて、細胞内の特定の構造を解明するために、蛍光染色液又は蛍光標識抗体を添加することによりしばしば解析される。細胞を蛍光標識する別の方法は、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰを、固定前に細胞で発現させることである。不幸なことに、これらのタンパク質の効率的な蛍光はタンパク質構造に依存し、これは防腐剤により破壊されることがあり、その結果これらの細胞における画像化の効率が低下する。
従って、本発明は、官能基、例えばフルオロフォアで細胞を標識する方法を提供する。当該方法は、本発明の突然変異加水分解酵素又はその融合物を発現する細胞を準備し、そして少なくとも１つの官能基を含む加水分解酵素基質と当該細胞を接触させることを含む。１つの態様において、細胞は基質と接触する前に固定される。別の態様において、基質と固定剤は、同時に細胞と接触される。更に別の態様において、固定剤は、細胞が基質と接触した後に添加される。続いて、細胞における突然変異加水分解酵素、又はその融合物の存在又は位置が検出又は決定される。１つの態様において、突然変異加水分解酵素は基質とエステル結合を形成するが、別の態様において、突然変異加水分解酵素は基質とチオエステル結合を形成する。
本発明はまた、本発明の化合物、組成物、核酸、タンパク質、又は他の材料を調製するのに有用な、本明細書に開示している方法及び中間体も提供する。
本発明の詳細な説明
定義
「求核試薬」は、電子を供与する分子である。
「選択マーカータンパク質」は、細胞に対し、別の方法で必須栄養素でありうるもの（例えば、酵母細胞のＴＲＰ１遺伝子）を欠いている培地又は抗生物質若しくは他の薬物を含む培地中で生育する能力を付与する酵素活性をコードしており、すなわち、細胞における選択マーカータンパク質をコードする遺伝子の発現は、当該遺伝子を持たない相当の細胞と比較して、前記細胞に対して抗生物質又は薬物に対する耐性を賦与する。宿主細胞が選択培地中で発現するのに選択マーカーを発現しなければならない場合、当該マーカーは、ポジティブな選択マーカーと言われる（例えば、適切な抗生物質の存在下で生育する能力を付与する抗生物質耐性遺伝子）。選択マーカーはまた、特定の遺伝子（発現した場合に、５％スクロース含有培地中で生育している細菌宿主細胞を死滅させるｓａｃＢ遺伝子）を含む宿主細胞を選択するために使用することができ；この様式で使用される選択マーカーは、ネガティブな選択マーカー又は対抗選択マーカー(counter-selectable marker)と称される。一般的な選択マーカー遺伝子配列には、抗生物質、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ピューロマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン（登録商標）等に対して抵抗性のものが含まれる。選択性の栄養要求性遺伝子配列には、例えば、ｈｉｓＤが含まれ、これは、ヒスチジンを含まない培地中でのヒスチジノールの存在下での生育を可能にする。適当な選択マーカー遺伝子には、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子等が含まれる。
「核酸」は、本明細書で使用する場合、あるヌクレオチドのペントースの３’位が次のペントースの５’位に対してホスホジエステル基で連結しており、そしてヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列、ヌクレオチドの線形順序で連結している、ヌクレオチドの共有結合配列である。「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、約１００ヌクレオチド超の長さの配列を含む核酸である。「オリゴヌクレオチド」又は「プライマー」は、ｈで使用する場合、短いポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの一部である。用語「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」は、本明細書で使用する場合、２以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは３超、通常１０超、しかし２５０未満、好ましくは２００未満のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドをから構成される分子として定義される。オリゴヌクレオチドは、あらゆる様式、例えば化学合成、ＤＮＡ複製、増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写（ＲＴ）、又はそれらの組み合わせで生成されうる。「プライマー」は、プライマー伸長が開始される条件下に置かれた場合に核酸合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドである。プライマーは、その３’末端に、標的（鋳型）の特異的配列に対して実質的に相補的な領域を有するよう選択される。プライマーは、標的とハイブリダイズしてプライマー伸長が生じるよう十分に相補的でなければならない。プライマー配列は、標的の正確な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、標的と実質的に相補的なプライマー配列の残部により、プライマーの５’末端に付着しうる。非相補的な塩基又はそれより長い配列がプライマー内に散在してもよく、但し、当該プライマー配列は、ハイブリダイズしてプライマーの伸長産物の合成の複合体を形成するほど標的配列と十分な相補性を有している。遺伝子配列に対するプライマーのマッチング又は相補性は、増幅反応、ＲＴ−ＰＣＲ等において使用されうる。
核酸分子は、「５’末」（５’末端）及び「３’末」（３’末端）を有すると言われており、これは核酸ホスホジエステル連結が置換基のモノヌクレオチドのペントース環の５’炭素及び３’炭素に対して生じるためである。新規な連結が５’炭素に対するものである際のポリヌクレオチドの末端は、その５’末ヌクレオチドである。新規な連結が３’炭素に対するものである際のポリヌクレオチドの末端は、その３’末ヌクレオチドである。末端ヌクレオチドは、本明細書で使用する場合、３’又は５’末の末端の位置にあるヌクレオチドである。
ＤＮＡ分子は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われており、これは、モノヌクレオチドが、あるモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、その付近の３’酸素に対し、一方向でホスホジエステル結合を介して付着するように、反応してオリゴヌクレオチドを生成するためである。従って、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素と連結していない場合には「５’末端」と称され、そしてその３’酸素がその次のペントース環の５’リン酸と連結していない場合には「３’末端」と称される。
本明細書で使用する場合、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの内部にあっても、５’及び３’末端を有すると言われることがある。直鎖又は環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、別個の因子が、「上流」又は「下流」の５’側又は３’因子と称される。この用語法は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進むという事実を反映している。典型的に、連結した遺伝子（例えば、オープンリーディングフレーム又はコード領域）の転写を指示するプロモーター及びエンハンサー因子は、通常コード領域の５’側又は下流に位置する。しかしながら、エンハンサー因子は、プロモーター因子及びコード領域の３’側に位置する場合であっても、それらの作用を発揮しうる。転写終結及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’側又は下流に位置する。
用語「コドン」は、本明細書で使用する場合、基本的な遺伝コード単位であり、これはポリペプチド鎖に組み込まれる特定のアミノ酸、あるいは開始シグナル又は終止シグナルを特定する３つのヌクレオチドの配列から成る。用語「コード領域」は、構造遺伝子に関連して使用する場合、ｍＲＮＡ分子の転写の結果として新生ポリペプチドに見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を意味する。典型的に、コード領域は、５’側に開始メチオニンをコードするヌクレオチドのトリプレット「ＡＴＧ」が、そして３’側に停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）に結合している。場合によっては、コード領域は、ヌクレオチドのトリプレット「ＴＴＧ」により開始することが知られている。
本明細書で使用する場合、用語「単離され、そして／あるいは精製され」は、核酸分子、ポリペプチド、ペプチド又はタンパク質のin vitroでの調製、単離及び／又は精製を意味し、その結果、それはin vivoの物質と会合していない。従って、用語「単離された」は、核酸分子と関連して「単離されたオリゴヌクレオチド」又は「単離されたポリヌクレオチド」として使用する場合、同定されており、且つ通常その供給源において会合している少なくとも１つの混入物から分離されている核酸配列を意味する。単離された核酸は、天然で見られるものと異なる形態又は設定で存在する。対照的に、単離されてない核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それらが天然で存在する状態で見られる。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞染色体上で、近隣遺伝子に近接して見られ；ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中で見られる。従って、「単離された核酸分子」、例えばゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成起源あるいはそれの組み合わせのポリヌクレオチドに関して、「単離された核酸分子」は、（１）「単離された核酸分子」が天然で見られるポリヌクレオチドの全部又は一部と会合しておらず、（２）天然では連結していないポリヌクレオチドと作用可能に連結しており、あるいは（３）天然ではより大きな配列の一部として生じない。単離された核酸分子は、一本鎖又は二本鎖の形態で存在することもある。核酸分子がタンパク質を発現させるために利用される場合、当該核酸は、最低限、センス又はコード鎖を含むが（すなわち、当該核酸は一本鎖であることもある）、センス及びアンチセンス鎖の両方を含むことがある（すなわち、当該核酸は二本鎖であることもある）。
用語「野生型」は、本明細書で使用する場合、天然の供給源から単離された遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子産物を意味する。野生型遺伝子は、個体群で最も頻繁に観察され、その結果当該遺伝子の「野生型」の形態と任意に表されるものである。対照的に、用語「突然変異体」は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に配列及び／又は機能的特性の修飾（すなわち、特徴の変化）を示す遺伝子又は遺伝子産物を意味する。注目すべきは、天然の突然変異体が単離されうることであり；これらは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実により同定される。
用語「組換えＤＮＡ分子」は、通常天然では一緒に見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んで成るハイブリッドＤＮＡ配列を意味する。用語「ベクター」は、ＤＮＡフラグメントが挿入され又はクローニングされることがあり、且つＤＮＡセグメントを細胞内に伝達するために使用することができ、且つ細胞内で複製することができる核酸分子を意味する。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド等に由来することがある。
用語「組換えベクター」、「発現ベクター」又は「コンストラクト」は、本明細書で使用する場合、所望のコード配列及び特定の宿主生物における作用可能に連結した当該コード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列を意味する。原核生物発現ベクターは、プロモーター、リボソーム結合部位、宿主細胞における自己複製のための複製開始点及び可能性のある他の配列、例えば任意のオペレーター配列、任意の制限酵素部位を含む。プロモーターは、ＤＮＡと結合し、そしてＲＮＡ合成を開示するようＲＮＡポリメラーゼを指示するＤＮＡ配列として同定される。真核生物発現ベクターは、プロモーター、任意にポリアデニル化シグナル、そして任意にエンハンサー配列を含む。
「ペプチド、タンパク質又はポリペプチドをコードする」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、遺伝子のコード領域、あるいは相当の完全長ペプチド、タンパク質又はポリペプチドと実質的に同一の活性を有する遺伝子産物をコードするそれらのフラグメント、を含んで成る核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの形態のいずれかで存在しうる。ＤＮＡの形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドは、一本鎖（すなわちセンス鎖）又は二本鎖で存在しうる。適当な調節因子、例えばエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等は、一次ＲＮＡ転写物の適切な転写開始及び／又は正確なプロセシングを可能にすることが必要である場合、遺伝子のコード領域の極めて近くに据えられることがある。あるいは、本発明の発現ベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナル等を含むことがある。追加の態様において、コード領域は内因性と外因性両方の調節因子の組み合わせを含むことがある。
用語「転写制御因子」又は「転写制御配列」は、核酸配列の発現の幾つかの側面を制御する遺伝的因子又は配列を意味する。例えば、プロモーターは、作用可能に連結したコード領域の転写開始を容易にする制御因子である。他の制御因子には、限定しないが、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結因子及びエンハンサー因子が含まれる。
真核生物の転写調節シグナルは、「プロモーター」及び「エンハンサー」因子を含んで成る。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関与する細胞性タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイから成る。プロモーター及びエンハンサー因子は、様々な真核生物の供給源、例えば酵母、昆虫及び哺乳類細胞の遺伝子、から単離されている。プロモーター及びエンハンサー因子はまたウイルスから単離されており、そして類似の調節因子、例えばプロモーターは真核生物でも見られる。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、注目のタンパク質を発現させるのに使用する細胞の型に依存する。真核生物のプロモーター及びエンハンサーは広範な宿主範囲を有しているが、その他のものは限定された細胞型のサブセットにおいて機能的である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類の種に由来する様々な細胞型において非常に活性であり、そして哺乳類細胞におけるタンパク質の発現のために広範に使用されている。広範な哺乳類細胞型において活性なプロモーター／エンハンサーの２つの他の例は、ヒト伸長因子１遺伝子(Uetsuki et al. , 1989; Kim et al., 1990;及びMizushima and Nagata, 1990)及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復(Gorman et al. , 1982)；並びにヒトサイトメガロウイルス(Boshart et al., 1985)由来のものである。
用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター及びエンハンサー両方の機能（すなわち、上述のプロモーター因子及びエンハンサー因子により提供される機能）を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを表す。例えば、レトロウイルスの長い末端反復は、プロモーター及びエンハンサー両方の機能を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」又は「外因性」又は「異種」でありうる。「内因性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノムにおいて所定の遺伝子と天然で連結しているものである。「外因性」又は「異種」のエンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）により、遺伝子の近位に据えられているものであり、その結果当該遺伝子の転写は連結したエンハンサー／プロモーターにより方向付けられる。
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、真核宿主細胞における組換え転写物のより高レベルの発現をしばしばもたらす。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの除去を媒介し、そして、スプライスドナー及びアクセプター部位から構成される(Sambrook et al., 1989)。一般に使用されるスプライスドナー及びアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライス部位である。
真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現は、生じた転写物の効率的な終結及びポリアデニル化を指示するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナルは通常ポリアデニル化シグナルの下流に見られ、そして数百ヌクレオチドの長さである。用語「ポリ（Ａ）部位」又は「ポリ（Ａ）配列」は、本明細書で使用する場合、新生ＲＮＡ転写物の終結及びポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を表す。組換え転写物の効率的なポリアデニル化は、ポリ（Ａ）テイルを欠いている転写物が不安定であり、且つ迅速に分解される場合望ましい。発現ベクターで使用されるポリ（Ａ）シグナルは、「異種」又は「内因性」であってもよい。内因性ポリ（Ａ）シグナルは、ゲノムの所定の遺伝子のコード領域の３’末端で天然に見られるものである。異種ポリ（Ａ）シグナルは、ある遺伝子から単離され、そして別の遺伝子の３’側に位置しているものである。通常使用される異種ポリ（Ａ）シグナルはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルである。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルには、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限フラグメント上に含まれ、そして終結及びポリアデニル化の両方を指示する(Sambrook et al., 1989)。
真核生物発現ベクターはまた、「ウイルスのレプリコン」又は「ウイルスの複製開始点」を含むことがある。ウイルスのレプリコンは、適切な複製因子を発現している宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を可能にするウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０又はポリオーマウイルスのいずれかの複製開始点を含むベクターは、適切なウイルスＴ抗原を発現する細胞において高コピー数（約１０4コピー／細胞）で複製する。対照的に、ウシパピローマウイルス又はエプスタインバーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは、染色体外で、低コピー数（約１００コピー／細胞）で複製する。
用語「in vitro」は、人工的環境及び人工的環境において起こる過程又は反応を意味する。in vitroの環境には、限定しないが、試験管及び細胞可溶化物が含まれる。用語「in situ」は細胞培養物を意味する。用語「in vivo」は、天然環境（例えば動物又は細胞）及び天然環境において生じる過程又は反応を意味する。
用語「発現系」は、注目の遺伝子の発現を決定（例えば、検出）するためのアッセイ又は系を意味する。分子生物学の当業者は、広範の発現系のいずれかが使用されうることを理解するであろう。広範の適当な哺乳類細胞が広範な供給源から利用可能である（例えば、American Type Culture Collection, Rockland, MD）。発現媒体の形質転換又は転写及び選択の方法は、選択した宿主系に依存するであろう。形質転換及び転写の方法は、例えばSambrook et al., 1989に記載されている。発現系には、注目の遺伝子（例えばレポーター遺伝子）が制御配列に連結されており、そして当該遺伝子の発現が当該遺伝子の発現を阻害又は誘導する物質による処理の後にモニタリングされるin vitroでの遺伝子発現アッセイが含まれる。遺伝子発現の検出は、限定しないが、発現したｍＲＮＡ又はタンパク質（例えば、検出可能なレポーター遺伝子産物）の検出を含む任意の適当な手段を介して、あるいは注目の遺伝子を発現する細胞の表現型における検出可能な変化を介してなされうる。発現系はまた、開裂事象又は他の核酸又は細胞性の変化が検出されるアッセイを含んで成ることもある。
用語「遺伝子」は、コード配列を含んで成るＤＮＡ配列、そして任意に、当該ＤＮＡ配列からのポリペプチドの産生に必要な調節配列を含んで成るＤＮＡ配列、を意味する。ポリペプチドは、完全長のコード配列又はコード配列の任意の部分でコードされることがあり、これは、当該部分が完全長のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する遺伝子産物をコードする場合である。
核酸は、異なる型の突然変異を含むことが知られている。「点」突然変異は、野生型配列からの一塩基の位置にあるヌクレオチド配列の変化を意味する。突然変異はまた、核酸配列が参照配列、例えば野生型配列と異なるような１又は複数の塩基の挿入又は欠失も意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイズ」及び「ハイブリダイゼーション」は、標的核酸に対する相補配列のアニーリング、すなわち、相補配列を含む核酸（ポリヌクレオチド）の２つのポリマーが塩基対形成を介してアニーリングする能力、を意味する。用語「アニーリングした」及び「ハイブリダイズした」は、最初から最後まで同義的に使用され、そして相補配列と標的核酸との任意の特異的な且つ再現性のある相互作用、例えばごく部分的な相補性を有する領域の結合、を包含することを意図している。天然の核酸では一般に見られない幾つかの塩基が本発明の核酸に含まれることがあり、そして、例えば、イノシン及び７−デアザグアニンが含まれる。核酸技術の当業者は、多数の変数、例えば相補配列の長さ、塩基粗製及びオリゴヌクレオチド配列、イオン強度及びミスマッチの塩基対の発生を考慮して経験的に二重鎖の安定性を決定することができる。核酸二重鎖の安定性は、誘拐温度、又は「Ｔm」により測定される。特定の条件下での特定の核酸二重鎖のＴmは、平均して半分の塩基対が解離している温度である。
用語「ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションが実施される温度、イオン強度、及び他の化合物の存在の条件に関連して使用される。「高ストリンジェンシー」条件での核酸塩基対形成は、高い頻度で相補的な塩基配列を有する核酸間のみで生じる。従って、「中」又は「低」ストリンジェンシーな条件は、互いに完全には相補的でない核酸がともにハイブリダイズ又はアニーリングすることが望ましい場合にしばしば必要とされる。当業界では、多数の同等の条件が中又は低ストリンジェンシーな条件を含めるために利用されうることは周知である。ハイブリダイゼーション条件の選択は当業者にとって通常自明であり、そしてハイブリダイゼーションの目的、ハイブリダイゼーションの型（ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡ）、及び配列間の所望の関連性のレベルにより通常導かれる（例えば、Sambrook et al. , 1989; Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington D. C. , 1985, for a general discussion of the methods）。
核酸二重鎖の安定性は、ミスマッチの塩基数の増大につれて低下し、そして更にハイブリッド二重鎖におけるミスマッチの相対的な位置に依存して大なり小なり低下することが知られている。従って、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、そのような二重らせんの安定性を最大化又は最小化するために使用されうる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの温度を調節し；ハイブリダイゼーション混合物中のらせん不安定化剤、例えばホルムアミドのパーセンテージを調節し；そして洗浄液の温度及び／又は塩濃度を調節することにより変更されうる。フィルターハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションの最終的なストリンジェンシーはしばしば、ハイブリダイゼーション後の洗浄に使用する塩濃度及び／又は温度により決定される。
「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、５ｘＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／ｌＥＤＴＡ、ＮａＯＨで７．４にｐＨを調節）、０．５％ＳＤＳ、５ｘデンハルト試薬及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る溶液中での４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、続いて、０．１ｘＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含んで成る溶液中での４２℃での洗浄、と同等の条件を含み、これは約５００ヌクレオチドの長さのプローブが利用される場合である。
「中ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、５ｘＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／ｌＥＤＴＡ、ＮａＯＨで７．４にｐＨを調節）、０．５％ＳＤＳ、５ｘデンハルト試薬及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る溶液中での４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、続いて、１．０ｘＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含んで成る溶液中での４２℃での洗浄、と同等の条件を含み、これは約５００ヌクレオチドの長さのプローブが利用される場合である。
「低ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、５ｘＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／ｌＥＤＴＡ、ＮａＯＨで７．４にｐＨを調節）、０．１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト試薬［５０ｘデンハルトは、５００ｍｌ当たり：５ｇのフィコール（４００型、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇＢＳＡ（第Ｖ画分；Ｓｉｇｍａ）を含む］及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る溶液中での４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、続いて、５ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含んで成る溶液中での４２℃での洗浄、と同等の条件を含み、これは約５００ヌクレオチドの長さのプローブが利用される場合である。
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）とは関係なく、アミノ酸の任意の鎖を意味する。特に断らない限り、当該用語は交換可能である。本発明の核酸分子は、天然（野生型）タンパク質の変異体（突然変異体）又は完全長の突然変異タンパク質と実質的に同一の活性を有するそれらのフラグメントをコードする。好ましくは、そのような突然変異タンパク質は、少なくとも８５％、好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％又は９９％、相当の野生型タンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
ポリペプチド分子は、「アミノ末端」（Ｎ末端）及び「カルボキシ末端」（Ｃ末端）を有すると言われ、これはペプチド結合が最初のアミノ酸残基の主鎖のアミノ基と第二のアミノ酸残基の主鎖のカルボキシル基との間で生じるためである。ポリペプチド配列に関連する用語「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、それぞれポリペプチドのＮ末端及びＣ末端領域の一部を含むポリペプチドの領域を意味する。ポリペプチドのＮ末端領域の一部を含む配列は、ポリペプチド鎖のＮ末端側半分に由来するアミノ酸を大部分含むが、そのような配列に限定されない。例えば、Ｎ末端配列は、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端側半分の両方に由来する塩基を含むポリペプチド配列の内側部分を含むことがある。Ｃ末端領域も同様である。Ｎ末端及びＣ末端領域は、必ずしもではないが、それぞれポリペプチドの最終的なＮ末端及びＣ末端を決めるアミノ酸を含む。
用語「単離された」は、ポリペプチドに関連して、「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」として使用する場合、同定され、且つ通常その供給源において会合している少なくとも１つの混入物から分離されているポリペプチドを意味する。従って、単離されたポリペプチドは、（１）天然で見られるタンパク質と会合しておらず、（２）同一の供給源に由来する他のタンパク質を含まず、例えば、ヒトタンパク質を含まず、あるいは（３）異なる種に由来する細胞で発現し、あるいは（４）天然では生じない。対照的に、単離されていないポリペプチド（例えば、タンパク質及び酵素）は、それらが天然で存在する状況で見られる。用語「単離されたポリペプチド」、「単離されたペプチド」又は「単離されたタンパク質」には、合成起源のものを含む、ｃＤＮＡ又は組換えＲＮＡでコードされるポリペプチド、ペプチド又はタンパク質、あるいはそれらの組み合わせを含む。
用語「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ分子から発現したタンパク質分子を意味する。対照的に、用語「天然タンパク質」は、本明細書では、天然（すなわち非組換え）供給源から単離されたタンパク質を示すために使用される。分子生物学的技術は、天然型のタンパク質と比較した場合に同一の特性を有するタンパク質の組換え型を産生するために使用されうる。
用語「融合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、異なるタンパク質、例えば突然変異加水分解酵素と連結した注目のタンパク質を含むキメラタンパク質を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントで実質的にコードされる１又は複数のポリペプチドを有するタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミューの定常領域遺伝子、並びに種々の免疫グロブリンの可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、これらは順に、それぞれ免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。
基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含んで成ることが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、それぞれの対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識にとって主に重要な約１００〜１１０異常のアミノ酸の可変領域を定義する。用語軽鎖可変領域（ＶL）及び重鎖可変領域（ＶH）は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を意味する。
抗体は、無処置な免疫グロブリンとして、又は様々な型の修飾物として存在することがあり、例えばＦａｂＦｃ2、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、（Ｆａｂ’）2、軽鎖及び重鎖の可変領域のみを含むＦｖフラグメント、可変領域及び定常領域の一部を含むＦａｂ又は（Ｆａｂ）’2フラグメント、一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、ＣＤＲ移植抗体等が含まれる。Ｆｖの重鎖及び軽鎖は、同一の抗体又は異なる抗体に由来することがあり、それによりキメラＦｖ領域が産生される。抗体は、動物（特にマウス又はラット）又はヒト起源のものであってもよく、あるいはキメラ又はヒト化抗体であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「抗体」にはこれらの形態が含まれる。
用語「細胞」、「細胞系」、「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、交換可能に使用され、そして全てのそのような表示には、これらの表示の子孫又は潜在的な子孫が含まれる。「形質転換細胞」とは、本発明の核酸分子が導入されている細胞（又はそれらの祖先に本発明の核酸分子が導入されている細胞）を意味する。任意に、本発明の核酸分子は、当該核酸分子がコードするタンパク質又はポリペプチドを産生することができる安定にトランスフェクションされた細胞系を作り出すように適当な細胞系内に導入されうる。そのような細胞系を構築するためのベクター、細胞、及び方法は当業界で周知である。用語「形質転換体」又は「形質転換細胞」には、伝達の回数に関係なく、最初に形質転換された細胞由来の初代形質転換細胞を含む。全ての子孫は、計画的な又は故意ではない突然変異によりＤＮＡの内容が正確には同一でないことがある。それにも関わらず、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能を有する突然変異の子孫は、形質転換体の定義に含まれる。
用語「相同性」は、相補性の程度を意味する。部分的な相同性又は完全な相補性（すなわち同一性）が存在しうる。相同性はしばしば配列解析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group. University of Wisconsin Biotechnology Center. 1710 University Avenue. Madison,WI 53705）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、挿入、及び他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることにより類似の配列に適合させる。保存的置換は、典型的に以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンの中での置換を含む。
用語「精製した」又は「精製」は、注目の成分、例えばタンパク質又は核酸から混入物の幾つかを除去する任意な方法の結果を意味する。精製した成分のパーセントは、その結果試料中で増大する。
用語「作用可能に連結」は、本明細書で使用する場合、所定の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質の合成を指示することができる核酸が産生するような様式での核酸配列の連結を意味する。当該用語はまた、機能的な（例えば、酵素的に活性であること、結合パートナーと結合することができること、阻害することができること、等）タンパク質又はポリペプチド、あるいはそれらの前駆体、例えば当該タンパク質又はポリペプチドのプレ−又はプレプロ−型が産生されるような様式でのアミノ酸をコードしている配列の連結を意味する。
本明細書で同定される全てのアミノ酸残基は、天然のＬ配置のものである。標準的なポリペプチドの命名法に準じたアミノ酸残基の略語は、以下の対応表に示すとおりである。
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本明細書で使用する場合、「ポリヒスチジントラクト(tract)」又は（ヒスタグ）は、２〜１０個のヒスチジン残基を含んで成る分子を意味し、例えば５〜１０個の残基のポリヒスチジントラクトである。ポリヒスチジントラクトは、固定化された金属、例えばニッケル、亜鉛、コバルト又は銅、キレートカラム上に、又は別の分子（例えばヒスタグと反応性のある抗体）との相互作用を介して共有結合した分子の親和性精製を可能にする。
本明細書で使用する場合、「純粋」は、対象種が存在している中で支配的な種であり（すなわち、モルベースで、組成物中他のどの個別の種よりも豊富であること）、そして好ましくは実質的に精製された画分が、対照種が少なくとも存在している全ての高分子種のうちの少なくとも約５０％（モルベース）を含んで成る組成物であること、を意味する。通常、「実質的に純粋」な組成物は、当該組成物中に存在する全ての高分子種のうちの約８０％超、更に好ましくは約８５％、約９０％、約９５％、そして約９９％を含んで成る。最も好ましくは、対象種は、本質的に均一になるまで精製され（混入種が常用の検出方法では検出されえない）、ここで、組成物は本質的に単一の高分子種から成る。
Ｉ．突然変異加水分解酵素及びそれらの融合物
本発明の範囲内の突然変異加水分解酵素は、限定しないが、組換え技術、例えば部位指定突然変異誘発又は繰り返し(recursive)突然変異誘発を介して調製されたものを含み、そして、突然変異加水分解酵素が相当の突然変異体でない（野生型）加水分解酵素の基質、例えば１又は複数の官能基を含むように修飾された基質と、安定な結合、例えば共有結合を形成することができるようにする１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る。本発明の範囲内の加水分解酵素は、限定しないが、ペプチダーゼ、エステラーゼ（例えば、コレステロールエステラーゼ）、グリコシダーゼ（例えば、グルコサミラーゼ(glucosamylase)）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）等を含む。例えば、加水分解酵素は、限定しないが、エステル結合に対して作用する酵素、例えば、カルボン酸エステル加水分解酵素、チオエステル加水分解酵素、リン酸モノエステル加水分解酵素、リン酸ジエステル加水分解酵素、三リン酸モノエステル加水分解酵素、硫酸エステル加水分解酵素、二リン酸モノエステル加水分解酵素、リン酸トリエステル加水分解酵素、５’−ホスホモノエステル産生エキソリボヌクレアーゼ、３’−ホスホモノエステル産生エキソリボヌクレアーゼ、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のいずれかに活性なエキソヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル産生エンドでオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル以外を産生するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、変化した塩基に特異的な部位特異的エンドデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル産生エンドリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステル以外を産生するエンドリボヌクレアーゼ、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のいずれかに活性なエンドリボヌクレアーゼ、リボ核酸又はデオキシリボ核酸グリコシダーゼのいずれかに活性なエンドリボヌクレアーゼ；グリコシダーゼ、例えばＯ−及びＳ−グリコシルを加水分解する酵素、及びＮ−グリコシル化合物を加水分解する酵素；エーテル結合に作用する酵素、例えばトリアルキルスルホニウム加水分解酵素又はエーテル加水分解酵素；ペプチド結合に作用する酵素（ペプチド加水分解酵素）、例えばアミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、オメガ(omega)ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸ペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スレオニンエンドペプチダーゼ、及び未知の触媒機構のエンドペプチダーゼ；ペプチド結合以外の炭素−窒素結合、例えば直鎖アミド、環状アミド、直鎖アミジン、環状アミジン、ニトリル、又は他の化合物に存在するものに作用する酵素；酸無水物、例えばリン含有無水物の形態及びスルホニル含有無水物の形態のものに作用する酵素；酸無水物に作用するもの（膜貫通の移動を触媒する）；酸無水物に作用し又は細胞及び細胞内移動に関与する酵素；炭素間結合（例えば、ケトン性物質中のもの）に作用する酵素；ハロゲン化物の結合（例えば、Ｃ−ハロゲン化物化合物中のもの）に作用する酵素、リン−窒素結合に作用する酵素；硫黄−窒素結合に作用する酵素；炭素−リン結合に作用する酵素；炭素−リン結合に作用する酵素；及び硫黄間結合に作用する酵素、を含む。ハロゲン化物の結合に作用する例示的な加水分解酵素は、限定しないが、アルキルハリダーゼ(alikylhalidase)、２−ハロ酸デハロゲナーゼ、ハロ酢酸デハロゲナーゼ、チロキシンデヨードナーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼ、４−クロロ安息香酸デハロゲナーゼ、４−クロロベンゾイル−ＣｏＡデハロゲナーゼ、及びアトラジンクロロヒドロラーゼを含む。環状アミド中の炭素−窒素結合に作用する例示的な加水分解酵素は、限定しないが、バルビツラーゼ(barbiturase)、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロオロターゼ、カルボキシメチルヒダントイナーゼ、アラントイナーゼ、β−ラクタマーゼ、イミダゾロネプロピオナーゼ(imidazolonepropionase)、５−オキソプロリナーゼ（ＡＴＰ加水分解性）、クレアチニナーゼ、Ｌ−リジン−ラクタマーゼ、６−アミノヘキサノン酸環状二量体加水分解酵素、２，５−ジオキソピペラジン加水分解酵素、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＡＴＰ加水分解性）、シアヌル酸アミドヒドロラーゼ、マレイミド加水分解酵素を含む。「ベータ−ラクタマーゼ」は、本明細書で使用する場合、クラスＡ、クラスＣ及びクラスＤのベータ−ラクタマーゼ並びにＤ−アラニンカルボキシペプチダーゼ／トランスペプチダーゼ、エステラーゼＥｓｔＢ、ペニシリン結合タンパク質２Ｘ、ペニシリン結合タンパク質５、及びＤ−アミノペプチダーゼを含む。好ましくは、ベータ−ラクタマーゼは、セリンベータ−ラクタマーゼ、例えば、Ｓ．アウレウス(S. aureus)ＰＣ１のセリンベータ−ラクタマーゼの残基７０に相当する位置に触媒性のセリン残基、及びＳ．アウレウス(S. aureus)ＰＣ１のセリンベータ−ラクタマーゼの残基１６６に相当する位置にグルタミン酸残基を有し、任意に、Ｓ．アウレウス(S. aureus)ＰＣ１のセリンベータ−ラクタマーゼの残基７３に相当する位置にリジン残基を有し、そしてまた任意にＳ．アウレウス(S. aureus)ＰＣ１のセリンベータ−ラクタマーゼの残基２３４に相当する位置にリジン残基を有するもの、である。
１つの態様において、突然変異加水分解酵素は、ハロアルカンデハロゲナーゼ、例えば、グラム陰性(Keuning et al., 1985)及びグラム陽性ハロアルカン利用細菌(Keuning et al., 1985 Yokota et al., 1987; Scholtz et al., 1987; Sallis et al., 1990)である。ハロアルカンデハロゲナーゼ、例えばキサントバクター・アウトトロフィカス(Xanthobacter autotrophicus)ＧＪ１０(Janssen et al., 1988, 1989)由来のＤｈｌＡ及びロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のＤｈａＡ、は、相当の炭化水素の加水分解による脱ハロゲン化を触媒する酵素である。変換にかけられるハロゲン化脂肪族炭化水素は、１又は複数のハロゲン基が付着しているＣ2−Ｃ10飽和脂肪族炭化水素を含み、ここで、前記ハロゲンのうちの少なくとも２つが隣接している炭素原子上にある。そのような脂肪族炭化水素は、揮発性塩素化脂肪族（ＶＣＡ）炭化水素を含む。ＶＣＡは、例えば、脂肪族炭化水素、例えば、ジクロロエタン、１，２−ジクロロ−プロパン、１，２−ジクロロブタン及び１，２，３−トリクロロプロパンを含む。用語「ハロゲン化炭化水素」は、本明細書で使用する場合、ハロゲン化脂肪族炭化水素を意味する。本明細書で使用する場合、「ハロゲン」は、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、アスタチン等を含む。好ましいハロゲンは塩素である。
本明細書で説明するように、本発明は、突然変異加水分解酵素と、注目のタンパク質のアミノ酸配列、例えばマーカータンパク質若しくは親和性タグの配列、例えばルシフェラーゼ、ＧＦＰ、若しくはポリヒスチジン配列、核酸結合タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、分泌タンパク質、受容体リガンド、血清タンパク質、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、反応性システインを有するタンパク質、受容体タンパク質、例えばＮＭＤＡ受容体、チャンネルタンパク質、例えば、ナトリウム−、カリウム−又はカルシウム感受性チャンネルタンパク質、例えばＨＥＲＧチャンネルタンパク質、又は輸送タンパク質、例えばＥＡＡＴ１−４グルタミン酸輸送体、並びにターゲティングシグナル、例えば色素体ターゲティングシグナル、核局在化シグナル又はミリスチル化配列、とを含んで成る融合タンパク質を含む。
ＩＩ．最適化された加水分解酵素配列、並びに当該加水分解酵素をコードするベクター及び宿主細胞
加水分解酵素又はそれらの融合物をコードする核酸を含んで成る核酸分子は、任意に、特定の宿主細胞における発現のために最適化されており、そして更に、転写制御配列、例えば、１又は複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列又はそれらの組み合わせと作用可能に連結して発現カセットを形成する。
１つの態様において、加水分解酵素又はその融合物をコードする核酸配列は、野生型又は突然変異加水分解酵素配列のコドンを、特定の（選択された）細胞において優先的に利用されるコドンで置換することにより最適化される。好ましいコドンは、選択された細胞で相対的に高いコドン使用頻度を有しており、そして好ましくはそれらの導入は、選択した宿主細胞に存在する転写因子のために比較的少数の転写因子結合部位、及び比較的少数の他の不所望な構造的特性の導入をもたらす。従って、最適化された核酸産物は、コドン使用頻度の改善による発現レベルの向上、及び不所望な転写制御配列数の減少による不適切な転写の挙動のリスクの低下、を有する。
本発明の単離され、そして最適化された核酸分子は、３０％、３５％、４０％以上、又は４５％以上、例えば、５０％、５５％、６０％以上のコドンにおいて相当する野生型核酸配列のものと異なるコドン組成を有することがある。本発明における使用にとって好ましいコドンは、特定の生物において同一のアミノ酸のための少なくとも１つの他のコドンよりも頻繁に利用されるものであり、そして更に好ましくは、更に、その生物において低使用頻度でないコドンであり、且つ更に、核酸分子をクローニングし、又は核酸分子の発現についてスクリーニングするために使用する生物において低使用頻度でないコドンである。更に、幾つかのアミノ酸（すなわち、３以上のコドンを有するアミノ酸）にとって好ましいコドンは、他の（好ましくない）コドンよりも頻繁に利用される２以上のコドンを含むことがある。ある生物において、別の生物においてよりも頻繁に利用される核酸分子の存在は、それらのコドンをより頻繁に利用する生物の細胞に導入された場合に、野生型又は親の核酸配列の、それらの細胞における発現よりも高いレベルで、それらの細胞において発現する核酸分子をもたらす。
本発明の１つの態様において、異なるコドンは、哺乳類においてより頻繁に利用されるものでありあるが、別の態様において、異なるコドンは、植物においてより頻繁に利用されるものである。異なる生物にとって好ましいコドンは当業界で知られており、例えば、www.kazusa.or.Jp./codon/を参照のこと。特定の哺乳類の型、例えばヒトは、哺乳類の別の型よりも好ましいコドンの異なるセットを有することがある。同様に、特定の植物の型は、別の植物の型よりも好ましいコドンの異なるセットを有することがある。本発明の１つの態様において、異なるコドンの大部分は、所望の宿主細胞において好ましいコドンであるものである。哺乳類（例えばヒト）及び植物を含む生物にとって好ましいコドンは当業界で知られている（例えば、Wada et al. , 1990; Ausubel et al. , 1997）。例えば、好ましいヒトの子度は、限定しないが、CGC (Arg), CTG (Leu), TCT (Ser), AGC (Ser), ACC (Thr), CCA (Pro), CCT (Pro), GCC (Ala), GGC (Gly), GTG (Val), ATC(Ile), ATT(Ile), AAG (Lys), AAC (Asn), CAG(Gln), CAC (His), GAG (Glu), GAC (Asp), TAC (Tyr), TGC (Cys)及びTTC (Phe) (Wada et al., 1990)を含む。従って、１つの態様において、本発明の合成核酸分子は、好ましいヒトのコドン、例えばCGC, CTG, TCT, AGC, ACC, CCA, CCT, GCC, GGC, GTG, ATC, ATT, AAG, AAC, CAG, CAC, GAG, GAC, TAC, TGC, TTC、又はそれらの組み合わせの数を増大させることにより野生型核酸配列と異なるコドン組成を有する。例えば、本発明の核酸分子は、CTG又はTTGロイシンコードコドン、GTG又はGTCバリンコードコドン、GGC又はGGTグリシンコードコドン、ATC又はATTイソロイシンコードコドン、CCA又はCCTプロリンコードコドン、CGC又はCGTアルギニンコードコドン、AGC又はTCTセリンコードコドン、ACC又はACTスレオニンコードコドン、GCC又はGCTアラニンコードコドン、又はそららの組み合わせの数が、野生型核酸配列と比較して増大していることがある。別の態様において、Ｃ．エレガンス(C. elegans)のコドンは、限定しないが、UUC (Phe), UUU (Phe), CUU (Leu), UUG (Leu), AUU(Ile), GUU (Val), GUG(Val), UCA(Ser), UCU(Ser), CCA (Pro), ACA (Thr), ACU (Thr), GCU (Ala), GCA (Ala), UAU (Tyr), CAU (His), CAA(Gln), AAU (Asn),AAA (Lys), GAU (Asp), GAA (Glu), UGU (Cys), AGA (Arg), CGA (Arg), CGU (Arg), GGA (Gly)又はそれらの組み合わせを含む。更に別の態様において、好ましいショウジョウバエ(Drosophilia)のコドンは、限定しないが、UUC (Phe), CUG (Leu), CUC (Leu), AUC (Ile), AUU (Ile), GUG (Val), GUC (Val), AGC (Ser), UCC (Ser), CCC (Pro), CCG (Pro), ACC (Thr), ACG (Thr), GCC (Ala), GCU (Ala), UAC (Tyr), CAC (His), CAG (Gln), AAC (Asn), AAG (Lys), GAU (Asp), GAG (Glu), UGC (Cys), CGC (Arg), GGC (Gly), GGA (gly)又はそれらの組み合わせを含む。好ましい酵母のコドンは、限定しないが、UUU (Phe), UUG (Leu), UUA (Leu), CCU (Leu), AUU (Ile), GUU (Val), UCU (Ser), UCA (Ser), CCA (Pro), CCU (Pro), ACU (Thr), ACA(Thr), GCU (Ala), GCA (Ala), UAU (Tyr), UAC (Tyr), CAU (His), CAA (Gln), AAU (Asn), AAC (Asn), AAA (Lys), AAG (Lys), GAU (Asp), GAA (Glu), GAG (Glu), UGU (Cys), CGU (Trp), AGA (Arg), CGU (Arg), GGU (Gly), GGA (Gly)又はそれらの組み合わせを含む。同様に、植物においてより頻繁に利用されるコドンの数が増大している核酸分子は、限定しないが、CGC (Arg), CTT (Leu), TCT (Ser), TCC (Ser), ACC (Thr), CCA (Pro), CCT (Pro), GCT (Ser), GGA (Gly), GTG (Val), ATC(Ile), ATT (nue), AAG (Lys), AAC (Asn), CAA (Gln), CAC (His), GAG (Glu), GAC (Asp), TAC (Tyr), TGC (Cys), TTC (Phe)又はそれらの組み合わせを含む植物のコドンの数を増大させることにより野生型又は親の核酸配列と異なるコドン組成を有する(Murray et al. , 1989)。好ましいコドンは、異なる植物の型につき相違することがある(Wada et al., 1990)。
１つの態様において、加水分解酵素又はそれらの融合物をコードする最適化された核酸配列は、相当の加水分解酵素又はそれらの融合物をコードする最適化されていない核酸配列に対して、１００％未満、例えば９０％未満又は８０％未満の核酸配列同一性を有する。例えば、ＤｈａＡをコードする最適化された核酸配列は、相当のＤｈａＡをコードする最適化されてない（野生型）の核酸配列に対し、約８０％未満の核酸配列同一性を有し、そして最適化された核酸配列によりコードされるＤｈａＡは、相当の野生型ＤｈａＡに対し、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する。１つの態様において、最適化された核酸配列がコードするＤｈａＡの活性は、最適化されてない配列がコードするＤｈａＡの活性の少なくとも１０％、例えば５０％以上であり、例えば、最適化された核酸配列がコードする突然変異ＤｈａＡは、最適化されてない拡散配列が同一の基質と結合するのと実質的に同一の効率、すなわち、少なくとも５０％、８０％、１００％以上で基質と結合する。
核酸分子又は発現カセットは、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターであって、任意に選択マーカーを含むものに導入されることがあり、そして、当該ベクターは、注目の細胞、例えば、原核細胞、例えばＥ．コリ(E. coli)、ストレプトマイセス種(Streptomiyces spp.)、バチルス種(Bacillus spp.)、スタフィロコッカス(Staphylococcus spp.)等、並びに、真核生物細胞、例えば植物（双子葉植物又は単子葉植物）、真菌、酵母、例えば、ピキア(Pichia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)又はシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)、あるいは哺乳類細胞に導入される。個のまし哺乳類細胞には、ウシ、ヤギ(caprine)、ヤギ(ovine)、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、例えば、サル、及びヒトの細胞が含まれる。好ましい哺乳類細胞系には、限定しないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、Ｈｅｌｅ、ＣＶ−１、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫細胞）、ＨＥＫ２９３、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が含まれる。
コードされた突然変異加水分解酵素の発現は、原核細胞又は真核細胞において発現可能な任意のプロモーターにより制御されうる。好ましい原核生物プロモーターは、限定しないが、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ又はマルトースプロモーターを含む。好ましい真核生物プロモーターは、限定しないが、構成的プロモーター、例えばウイルスプロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０及びＲＳＶプロモーター、並びに制御可能なプロモーター、誘導可能又は抑制可能なプロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター及びＣＲＥにより制御される合成プロモーターを含む。細菌の発現にとって好ましいベクターは、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３を含み、そして真核生物の発現の場合、ｐＣＩｎｅｏ−ＣＭＶを含む。
本発明の核酸分子、発現カセット及び／又はベクターは、任意な方法、例えば、限定しないが、カルシウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、微粒子銃等により細胞に導入されうる。
ＩＩＩ．官能基
本発明の基質及び方法において有用な官能基は、検出可能又は検出することができる分子である。本発明の範囲内の官能基は、二官能性リンカー又は加水分解酵素の基質のある反応性置換基と共有結合することができ、そして、本発明の基質の一部として、天然で見られる基質と結合せず、且つ突然変異加水分解酵素と安定な複合体を形成することができる官能基と実質的に同一の活性を有する。従って、官能基は、官能基を有する基質と、突然変異加水分解酵素との間の安定な複合体の検出、そして任意に単離、を容易にする１又は複数の特性を有する。例えば、官能基は、特徴的な電磁スペクトル特性、例えば発光又は吸光、磁性、電子スピン共鳴、静電容量、比誘電率又は電気伝導率を有するもの、並びに強磁性、常磁性、反磁性、発光、電気化学発光、蛍光、リン光、有色、抗原性の官能基、又は独特の塊(mass)を有する置換基を含む。官能基は、限定しないが、核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド、タンパク質、例えば発光タンパク質、ペプチド、例えばリガンド、例えば、ビオチン又はストレプトアビジンに認識されるエピトープ、ハプテン、アミノ酸、脂質、脂質二重層、固体支持体、フルオロフォア、クロモフォア、レポーター分子、放射性核種、電子不透過性(electron opaque)分子、ＭＲＩ造影剤、例えば、マンガン、ガドリニウム（ＩＩＩ）又は酸化鉄粒子等を含む。特定の官能基を検出する方法は当業界で知られている。例えば、核酸分子は、ハイブリダイゼーション、増幅、核酸と当該核酸分子に特異的な結合タンパク質との結合、酵素アッセイ（例えば、核酸分子がリボザイムである場合）により検出することができ、又は核酸分子自体が検出可能な又は検出することができる分子、例えば放射性標識又はビオチンを含んで成る場合、その分子に適したアッセイにより検出することができる。
例示的な官能基には、ハプテン、例えば免疫原性を増強するのに有用な分子、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、開裂可能な標識、例えば、光で開裂可能なビオチン、及び蛍光標識、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）修飾クマリン及びスクシンイミド又はスルホノスクシンイミド(sulfonosuccinimide)修飾ＢＯＤＩＰＹ（ＵＶ及び／又は可視励起蛍光検出により掲出されうるもの）、ローダミン、例えばＲ１１０、ロドール(rhodol)、ＣＲＧ６、テキサスメチルレッド（ＴＡＭＲＡ）、Ｒｏｘ５、ＦＡＭ、フルオレセイン、クマリン誘導体、例えば、７アミノクマリン、及び７−ヒドロキシクマリン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、１−ヒドロキシピレン、レゾルフィン、フェナレノン又はベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号）、アクリジノン（米国特許第４，８１０，６３６号）、アントラセン、並びにα−及びβ−ナフトール誘導体、フッ素化フルオレセインとロドールを含むフッ素化キサンテン誘導体（米国特許第６，１６２，９３１号）、及び生物発光分子、例えばルシフェラーゼ又はＧＦＰが含まれる。相当の野生型加水分解酵素の基質と結合することにより突然変異加水分解酵素と連結した蛍光（又は生物発光）官能基は、系における変化、例えばリン酸化をリアルタイムで感知するために使用されうる。更に、蛍光分子、例えば金属イオンの化学感覚器、例えばＣｕ2+の９−カルボニルアントラセン修飾グリシル−ヒスチジル−リジン（ＧＨＫ）は、本発明の基質おいて、当該基質と結合するタンパク質を標識するために利用されうる。生物発光又は蛍光官能基、例えばＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン、ＧＦＰ、又は赤外色素も、官能基としての用途が見出されており、そして、例えば、相互作用の研究において、例えばＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、ＬＲＥＴ又は電気泳動を用いて利用されうる。
別の官能基のクラスは、受容器を含む分子（「親和性」分子）と選択的に相互作用する分子である。従って、親和性分子を含む加水分解酵素の基質は、そのような基質と突然変異加水分解酵素を有する複合体の分離を容易にすることができ、これは、当該親和性分子と、本来生物学的又は非生物学的でありうる別の分子、例えばアクセプター分子との選択的相互作用のためである。例えば、親和性分子が相互作用する特異的分子（アクセプター分子と称する）は、小有機分子、化学基、例えばスルフヒドリル基（−ＳＨ）又は大きな生体分子、例えば親和性分子の抗体又は他の天然のリガンドでありうる。結合は通常天然において化学的であり、そして共有結合又は非共有結合又は相互作用、例えばイオン結合又は水素結合を包含することがある。アクセプター分子は、溶液中で遊離していることがあり、あるいはそれ自体が固体若しくは半固体表面、ポリマーマトリックス、又は、固体若しくは半固体基板上の残基、と結合していることがある。相互作用はまた外的因子、例えば光、温度、圧力又は触媒として作用する化学的若しくは生物学的分子の添加、により引き起こされうる。反応混合物からの前記複合体の検出及び／又は分離が起こるのは、親和性分子とアクセプター分子との間の相互作用のためであり、通常結合の型である。
親和性分子の例には、免疫原性分子、例えばタンパク質のエピトープ、ペプチド、炭水化物又は脂質のような分子、すなわち、その分子に特異的な抗体を調製するのに有用な任意の分子；ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びそれらの誘導体；金属結合分子；並びにこれらの分子のフラグメント及び組み合わせ、が含まれる。例示的な親和性分子には、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ）（配列番号１７）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１８）、Ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１９）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２０）、ＳｔｅｐｔＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号２１）、ＨＡタグ（ＹＰＧＤＶＰＤＹＡ）（配列番号２２）、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド、Ｃ末端ＲＮＡタグ、金属結合ドメイン、金属結合反応基、アミノ酸反応基、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、及びマルトース結合タンパク質が含まれる。例えば、ビオチンを含む加水分解酵素の基質は、突然変異加水分解酵素と接触させられる。突然変異加水分解酵素と基質との複合体におけるビオチンの存在は、表面、例えばビーズ、マイクロウェル、ニトロセルロース等の上にコーティングされたストレプトアビジン分子に対する選択的結合を可能にする。適当な表面には、クロマトグラフィーによる分離のための樹脂、プラスチック、例えば組織培養表面又は結合プレート、マイクロタイターディッシュ及びビーズ、セラミック及びガラス、磁気粒子を含む粒子、ポリマー及び他のマトリックスが含まれる。処理された表面は、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、ビオチンを欠いている分子が除去され、そしてビオチンを含む複合体が単離される。場合によっては、これらの材料は生体分子検出装置、例えば光ファイバー、Ｃｈｅｍｆｅｔ、及びプラズモン検出器の一部であってもよい。
親和性分子の別の例はダンシルリジンである。ダンシル環と相互作用する抗体は市販されている(Sigma Chemical; St. Louis, MO)であり、あるいは既知のプロトコール、例えばAntibodies: A Laboratory Manual (Harlow and Lane,1988)に記載のものを用いて調製することができる。例えば、抗ダンシル抗体は、クロマトグラフィーカラムの充填材料上に固定される。このアフィニティーカラムクロマトグラフィー法は、突然変異加水分解酵素と本発明の基質との複合体を、固定化された抗体とのその相互作用により保持して、一方、他の分子はカラムを通過させることにより分離を達成する。前記複合体は、続いて、抗体−抗原相互作用を破壊することにより放出されうる。特定のクロマトグラフィー材料、例えばイオン交換又は親和性セファロース、セファクリル、セファデックス及び他のクロマトグラフィー樹脂は市販されている(Sigma Chemical; St. Louis, MO;Pharmacia Biotech; Piscataway, N. J.)。ダンシル樹脂は簡便に検出することができ、これはその蛍光特性のためである。
抗体をアクセプター分子として利用する場合、分離はまた他の生化学的分離法、例えば免疫沈降及びフィルター又は他の表面、例えばビーズ、プレート又は樹脂上への抗体の固定化を介して実施することができる。例えば、本発明の突然変異加水分解酵素と基質の複合体は、磁気ビーズを親和性分子特異的又は加水分解酵素特異的抗体でコーティングすることにより単離されうる。ビーズは、しばしば磁界を用いて混合物から分離される。
別の官能基のクラスは電磁放射を用いて検出可能な分子を含み、そして、限定しないが、キサンテンフルオロフォア、ダンシルフルオロフォア、クマリン及びクマリン誘導体、蛍光アクリジニウム部分、ベンゾピレンベースのフルオロフォア、並びに７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、及び３−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−２，３−ジアミノ−プロピオン酸を含む。好ましくは、蛍光分子は、天然アミノ酸と異なる波長の高量子収率の蛍光を有し、そして更に好ましくは可視、又はＵＶと可視の両方のスペクトル部分で励起しうる高量子収率の蛍光を有する。予め選択した波長での励起の際、前記分子は、低濃度で、可視的に、又は常用の蛍光検出法を用いて、そのいずれかで検出可能である。電気化学発光分子、例えばルテニウムキレート及びその誘導体又は窒素酸化物アミノ酸並びにそれらの誘導体は、フェムトモーラー範囲以下で検出可能である。
蛍光分子に加えて、電磁場及び放射線との分子の相互作用及びそれらに対する応答に基づいた物理学的特性を有する様々な分子が、本発明の突然変異加水分解酵素と基質との複合体を検出するために使用されうる。これらの特性には、電磁スペクトルのＵＶ、可視及び赤外領域における吸収、ラマン活性なクロモフォアの存在、を含み、そして更に共鳴ラマン分光法、電子スピン鏡面活性及び核磁気共鳴及び分子量により、例えば質量分析を介して増強されうる。
親和性分子を有する複合体を検出し、そして／あるいは単離するための方法は、クロマトグラフィー技術、例えばゲル濾過、高速圧力又は高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。他のタンパク質分離法も、本発明の突然変異加水分解酵素と基質との複合体の検出、その後の単離にとって有用であり、例えば電気泳動、等電点電気泳動及び質量分析である。
ＩＶ．リンカー
記号「Ｌ」によっても識別される用語「リンカー」は、反応基を含む基質又は反応基に対し１又は複数の官能基を共有結合させる１又は複数の基を意味する。リンカーは、本明細書で使用する場合、単一の共有結合ではない。リンカーの構造は重要ではなく、但し、それはその標的酵素と結合しうる基質をもたらす。１つの態様において、リンカーは、官能基（Ｒ）と反応基とを、全て含めて約５オングストローム〜約１０００オングストロームの長さで分離する二価の基であってもよい。他の適当なリンカーには、官能基（Ｒ）と反応基とを約５オングストローム〜約１００オングストローム分離するリンカー、並びにＲと基質とを約５オングストローム〜約５０オングストローム、約５オングストローム〜約２５オングストローム、約５オングストローム〜約５００オングストローム、又は約３０オングストローム〜約１００オングストローム分離するリンカーを含む。
１つの態様において、リンカーはアミノ酸である。
別の態様において、リンカーはペプチドである。
別の態様において、リンカーは、約２〜約３０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝の炭素鎖であって、任意に１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の二重又は三重結合を含み、そして任意に１又は複数（例えば２，３，又は４）のヒドロキシ又はオキソ（＝Ｏ）基で置換されており、鎖の中の１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の炭素原子が任意に非過酸化物−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−で置換されているもの、である。
別の態様において、リンカーは、式−Ｗ−Ｆ−Ｗ−の二価の基であり、ここでＦは（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、（Ｃ2−Ｃ30）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ30）アルキニル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、又は（Ｃ6−Ｃ10）アリールであり、ここで、Ｗは−Ｎ（Ｑ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、又は直接的な結合であり；ここで、それぞれのＱは独立してＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）アルキルである。
別の態様において、リンカーは、約２〜約３０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝炭素鎖であって、任意に１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の二重又は三重結合を含み、そして任意に１又は複数（例えば２，３，又は４）のヒドロキシ又はオキソ（＝Ｏ）基で置換されているものである。
別の態様において、リンカーは、約２〜約３０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝炭素鎖であって、任意に１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の二重又は三重結合を含むものである。
別の態様において、リンカーは、約２〜約３０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝炭素鎖である。
別の態様において、リンカーは、約２〜約２０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝炭素鎖であって、任意に１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の二重又は三重結合を含み、そして任意に１又は複数（例えば２，３，又は４）のヒドロキシ又はオキソ（＝Ｏ）基で置換されているものである。
別の態様において、リンカーは、約２〜約２０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝炭素鎖であって、任意に１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の二重又は三重結合を含むものである。
別の態様において、リンカーは、約２〜約２０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝炭素鎖である。
別の態様において、リンカーは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−1-10である。
別の態様において、リンカーは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ(ＣＨ2)3−；−Ｃ（＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ2)5Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ(ＣＨ2)−；−ＣＨ2ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ(ＣＨ2)−；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ(ＣＨ2)2Ｏ(ＣＨ2)2Ｏ(ＣＨ2)3−；−ＣＨ2ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）3−；−（ＣＨ2)4Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）2Ｏ（ＣＨ2)2Ｏ（ＣＨ2)3−である。
具体的には、（Ｃ1−Ｃ30）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、又はデシルであってもよく；（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルであってもよく；（Ｃ2−Ｃ30）アルケニルは、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、又はデシニルであってもよく；そして（Ｃ6−Ｃ10）アリールはフェニル、インデニル、又はナフチルであってもよい。
用語「アミノ酸」は、リンカーに関して使用する場合、天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ）残基をＤ又はＬ型で、並びに非天然アミノ酸（例えば、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４、−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔ−ブチルグリシン）残基を含んで成る。当該用語はまた、常用のアミノ保護基（例えばアセチル又はベンジルオキシカルボニル）を有する天然及び非天然アミノ酸、並びにカルボキシ末端が（例えば、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、フェニル又はベンジルとして）保護されている天然及び非天然アミノ酸を含む。他の適当なアミノ及びカルボキシ保護基は当業者に知られている（例えば、Greene, Protecting Groups In Organic Synthesis ; Wiley: New York,1981、及びその中で引用されている参考文献を参照のこと）。アミノ酸は、カルボキシ末端、アミノ末端を通じて、あるいは結合の任意な他の都合のよい部分を通じて、例えばシステインの硫黄を通じて、別の分子と結合されうる。
用語「ペプチド」は、リンカーに関連して使用する場合、２〜２５アミノ酸（例えば上文で定義した通り）又はペプチジル残基の配列を説明する。例えば、環状ペプチドは、配列中の２つのシステイン残基間のジスルフィド架橋の形成から調製することができ、又はそれから生じることがある。ペプチドは、カルボキシ末端、アミノ末端を通じて、あるいは結合の任意な他の都合のよい部分を通じて、例えばシステインの硫黄を通じて、別の分子と結合されうる。好ましくは、ペプチドは、３〜２５、又は５〜２１アミノ酸を含んで成る。ペプチド誘導体は、米国特許第４，６１２，３０２号；第４，８５３，３７１号；及び第４，６８４，６２０号に開示されているように調製することができる。本明細書で具体的に列挙しているペプチド配列は、左側をアミノ末端、右側をカルボキシ末端で記載されている。
１つの態様において、リンカーを有するデハロゲナーゼのための本発明の基質は、式（Ｉ）：
Ｒ−リンカー−Ａ−Ｘ （Ｉ）
（ここで、Ｒは１又は複数の官能基（例えば、フルオロフォア、ビオチン、ルミノフォア、又は蛍光発生的若しくは発光発生的分子であり、あるいは固体支持体、例えばミクロスフィア、膜、ガラスビーズ等）であり、ここで、リンカーはＣ，Ｎ，Ｓ，又はＯを含む多原子の直鎖又は分枝鎖であり、Ａ−Ｘはデハロゲナーゼの基質であり、且つＸはハロゲンである）を有する。１つの態様において、リンカーは、約２〜約３０の炭素原子を含んで成る二価の分枝又は非分枝の炭素鎖であって、任意に１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の二重又は三重結合を含み、そして任意に１又は複数（例えば２，３，又は４）のヒドロキシ又はオキソ（＝Ｏ）基で置換されており、鎖の中の１又は複数（例えば１，２，３，又は４）の炭素原子が任意に比過酸化物−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−で置換されているもの、である。１つの態様において、ＡはＣＨ2ＣＨ2又はＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2である。１つの態様において、デハロゲナーゼ、例えばロドコッカス(Rhodococcus)のデハロゲナーゼの基質中のリンカーは、Ｃ，Ｎ，Ｓ，又はＯを含む多原子の直鎖又は分枝鎖であり、そして好ましくは、官能基Ｒが芳香環系を含むか、あるいは固体支持体である場合、１１〜３０原子である。
別の態様において、リンカーを有するデハロゲナーゼのための本発明の基質は、式（ＩＩ）：
Ｒ−リンカー−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｘ （ＩＩ）
（ここで、Ｘは、ハロゲン、好ましくは塩素である）を有する。１つの態様において、Ｒは１又は複数の官能基、例えば、フルオロフォア、ビオチン、ルミノフォア、又は蛍光発生的若しくは発光発生的分子であり、あるいは固体支持体、例えばミクロスフィア、膜、ガラスビーズ等である。Ｒが放射性標識、又は小さい検出可能な分子、例えば分光学的に活性な同位体である場合、リンカーは０〜３０原子でありうる。
Ｖ．例示的な基質の合成
［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エチル］−カルバミン酸アントラセン−９−イルメチルエステル。２００ｍｌ中のＣＨ2Ｃｌ2中の９−アントラセンメタノール（１０ｇ、４８ミリモル）及び４−ニトロフェニルクロロギ酸塩（１３．６ｇ、６７．５ミリモル）の攪拌スラリーに対し、トリエチルアミン（６．７ｍｌ、０．１９モル）を添加した。生じた金色の溶液を１６時間室温で攪拌しておいた。この時点で、２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１４．４ｍｌ、０．１４４モル）を添加して攪拌を更に２４時間続けた。続いて、ｐ−ニトロフェノールが有機層中で観察されなくなるまで、ＣＨ2Ｃｌ2反応混合物を２％水酸化ナトリウム（ｗ／ｗ）溶液で洗浄した。ジクロロメタンを硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、そして減圧下で蒸発させた。
粗製産物は、シリカゲル６０上でのカラムクロマトグラフィーにより、１％〜３％メタノール／ジクロロメタンで徐々に溶出して更に精製した。７．６％（５８％収率）の黄色い固体が単離された；1H NMR(CDCl3) δ8.38 (s, H- 10), 8.28 (d,H-1, 8), 7.94 (d, H-4,5), 7.44 (m, H-2,3, 6,7), 6.06 (s, CH2-anth), 5.47 (t, 交換可能, NH), 3.53 (bs, CH2-OH) 3.33 (m, ３つの-CH-). 質量スペクトル m/e C20H22NO4 +の理論値: 340.15. 実測値: 340.23. C20H21NNaO4 +の理論値: 340.15. 実測値: 340.23.
Figure 0004748685
｛２−［２−（６−クロロ−ヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミン酸アントラセン−９−イルメチルエステル。１００ｍｌの丸底フラスコに［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エチル］−カルバミン酸アントラセン−９−イルメチルエステル（１．１２ｇ、３ミリモル）及び鉱油中に６０％分散している新しい水素化ナトリウム（３６０ｍｇ、９ミリモル）を不活性雰囲気のもと充填した。２０ｍｌの無水ＴＨＦを添加し、そして反応液を３０分間攪拌させた。フラスコを続いて氷／ＮａＣｌの槽を用いて−１０〜−２０℃に冷却した。その温度に達したときに、１−クロロ−６−ヨードヘキサン（１ｍｌ、６ミリモル）をシリンジから添加する。反応液を氷／ＮａＣｌの温度で２時間維持し、続いてゆっくりと一晩室温に加温する。この時点で、シリカゲル６０は、減圧下で溶媒を失い、反応混合物上に一緒に吸収されている。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、最初に溶出液としてヘプタンを用い、続いて１０％、２０％、及び２５％の酢酸エチルを用いて行う。合計０．５７ｇ（４１％の収率）の産物を適切な画分から単離する：1H NMR(CDCl3) δ8.48 (s, H-10), 8. 38 (d, H-1, 8), 8.01 (d, H-4,5), 7.52 (dt, H-2,3, 6,7), 6.13 (s,CH2-anth), 5.29 (bs, 交換可能, NH), 3.74 (m, 4H), 3.55-3. 15 (m, 8H), 1.84 (m, 4H), 1.61 (m, 1H), 1.43 (m, 1H), 1.25 (m, 2H). 質量スペクトル, m/e C26H32ClNO4H20の理論値 : 475.21(100%), 476.22 (29.6%). 実測値: 475.21, 476.52
Figure 0004748685
２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル−アンモニウムトリフルオロ酢酸。４ｍｌのジクロロメタンに溶解した｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミン酸アントラセン−９−イルメチルエステル（０．５６ｇ、１．２ミリモル）に２滴のアニソールを添加した。反応混合物を氷／ＮａＣｌの槽を用いて冷却する。１０分後、トリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を添加する。反応混合物は添加により暗褐色になり、そして３０分間攪拌される。全ての揮発物が減圧の雰囲気のもと除去される。残渣をＣＨ2Ｃｌ2中で再び溶解し、そして水で２回洗浄する。水性の画分を凍結し、そして一晩凍結乾燥させる。油性の残渣が残り、そして次の反応のストック溶液として使用するために無水ＤＭＦ中で溶解される。質量スペクトル, m/e Cl0H23ClNO2 +の理論値 : 224.14(100%), 226.14 (32%). 実測値：224.2, 226.2.
Figure 0004748685
［２−（６−クロロ−ヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチルアミンに対するレポーター基の接合のための一般的方法。１等量のレポーター基のスクシニミジルエステル／ＤＭＦに対し、３等量の［２−（６−クロロ−ヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル−アンモニウムトリフルオロ酢酸ストック溶液、続いてジイソプロピルエチルアミンを添加する。反応液を８〜１６時間室温で攪拌する。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣ又はシリカゲルクロマトグラフィーで行う。
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−フルオレセイン−５−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。質量スペクトル, m/e C31H31ClNO8 -の理論値：580.17 (100%), 581.18, 581.31.
Figure 0004748685
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−ビオチン−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、シリカゲルクロマトグラフィー（２％〜５％メタノール／ジクロロメタン）。質量スペクトル, m/e C20H37ClN3O4S+の理論値：450.22(100%), 452.22(32%). 実測値：449.95, 451.89.
Figure 0004748685
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−テトラメチルローダミン−５−（及び６−）−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。構造異性体の分離を実現した。質量スペクトル, m/e C35H43ClN3O6 +の理論値：636.28 (100%), 637.29 (39.8%), 638.28 (32.4%), 実測値：636.14, 637.15, 638.14.
Figure 0004748685
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−ローダミンＲ１１０−５−（及び６−）−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。構造異性体の分離を実現した。質量スペクトル, m/e C31H35ClN3O6 +理論値：580.2 (100%), 581.2 (35.6%), 582.2 (32.4%). 実測値：580.4, 581.4, 582.2.
Figure 0004748685
６−（｛４−［４，４ジフルオロ−５−（チオフェン−２−イル）−４−ボラ−３ａ−４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル］フェノキシ｝アセチルアミノ）−ヘキサン酸｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、シリカゲルクロマトグラフィー（３％〜５％メタノール／ジクロロメタン）を用いて行った。質量スペクトル, m/e C37H47BClF2N4O5S+の理論値：743.3 (100%). 実測値743.4.
Figure 0004748685
６−（｛４−［４，４ジフルオロ−５−（チオフェン−２−イル）−４−ボラ−３ａ−４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル］スチリルオキシ｝アセチルアミノ）−ヘキサン酸｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、シリカゲルクロマトグラフィー（３％メタノール／ジクロロメタン）を用いて行った。質量スペクトル, m/e C39H48BClF2N4NaO5S+の理論値：791.3 (100%). 実測値：7.91. 3.
Figure 0004748685
トリエチルアンモニウム３−［５−［２−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジエチルアミノ−クロメン−２−イリデン）−エチリデン］−３−（５−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−ペンチル）−２，４，６−トリオキソ−テトラヒドロ−ピリミジン−１−イル］−プロパン−１−スルホン酸陰イオン。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。質量スペクトル, m/e C42H62ClN4O10S-の理論値849.4 (100%), 850.4 (48.8%), 851.4 (36.4%). 実測値：849.6, 850.5, 851.5.
Figure 0004748685
２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−｛３−［１−（５−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−ペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−イリデン］−プロペニル｝−７−ジエチルアミノ−クロメニリウムクロリド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。質量スペクトル, m/e C46H67ClN3O7S-の理論値：840.4 (100%), 841.4 (54.4%). 実測値：840.5, 841.5.
Figure 0004748685
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−３−｛４−［５−（４−ジメチルアミノ−フェニル）−オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニルアミノ｝−プロピオンアミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。質量スペクトル, m/e C30H40ClN4O6S-の理論値：619.2 (100%), 620.2 (35%). 実測値：619.5, 620.7.
Figure 0004748685
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−９’−クロロセミナフトフルオレセイン−５−（及び６−）−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。構造異性体の分離を実現した。質量スペクトル, m/e C35H34Cl2NO8 +の理論値：666.17 (100%), 668. 16 (64%), 667.17 (39.8%). 実測値：666.46, 668. 44,667. 51.
Figure 0004748685
Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−セミナフトジメチルローダミン−５−（及び６−）−アミド。表題の化合物は、上記方法論を用いて調製した。精製は、調製用の規模のＨＰＬＣを用いて行った。質量スペクトル, m/e C37H38ClN2O7 -の理論値：657.24 (100%), 658.24 (42%), 659.23 (32%). 実測値：657.46, 658.47, 659.45.
Figure 0004748685
６−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−５−（及び−６−）−カルボキサミド）ヘキサン酸｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−アミド。６−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−５−（及び−６−）−カルボキサミド）ヘキサン酸スクシニミジルエステル（０．１９５ｇ、０．２６ミリモル）を含む１００ｍｌの丸底フラスコに対し、２５ｍｌのエタノール中の２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチルアミン（〜０．４４ミリモル）を添加し、続いて２ｍｌのピリジンを添加した。反応混合物を一晩攪拌させた。減圧下での蒸発後、残渣は、溶出液として２％〜５％メタノール／ジクロロメタンを徐々に用いてシリカゲル６０カラムクロマトグラフィーにかけた。適切な画分を回収し、そして真空下乾燥させた（０．１８６ｇ、０．２１６ミリモル、及び８４％の収率）。質量スペクトル, m/e C47H60ClN2O11 +の理論値：863.39 (100%), 864.39 (54.4%), 865.39 (34.6%). 実測値：862.94, 864.07, 864.94.
Figure 0004748685
６−（フルオレセイン−５−（及び−６−）−カルボキサミド）ヘキサン酸｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−アミド。６−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−５−（及び−６−）−カルボキサミド）ヘキサン酸｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−アミド（０．１８６ｇ、０．２１６ミリモル）を５ｍｌのメタノール中で溶解し、そして０．５ｍｌの２Ｍ炭酸ナトリウム（ａｑ）を添加した。反応混合物を１６時間攪拌し、続いて濾過した。精製は調製用の規模のＨＰＬＣを用いて達成した。構造異性体の分離を実現した。質量スペクトル, m/e C37H44ClN2O9 +の理論値：695.27 (100.0%), 696.28 (42.2%), 697.27 (32.3%). 実測値：
Figure 0004748685
｛２−［２−（４−クロロブトキシ）−エトキシ］−エチル｝カルバミン酸アントラセン−９−イルメチルエステル。５０ｍｌの丸底フラスコに［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］−エチルカルバミン酸アントラセン−９−イルメチルエステル（０．２５ｇ、０．７４ミリモル）及び鉱油中６０％分散している新しい水素化ナトリウム（０．２５ｇ、３．７５ミリモル）を不活性雰囲気のもと充填した。１０ｍｌの無水ＴＨＦを添加し、そして反応液を５分間攪拌させた。この時点の後、１−クロロ−４−ヨードブタン（１８０μｌ、１．５ミリモル）をシリンジから添加する。反応液を室温で２４時間攪拌する。シリカゲル６０は、減圧下で溶媒を失い、反応混合物上に一緒に吸収されている。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、最初に溶出液としてヘプタンを用い、続いて１０％、２０％、及び３０％の酢酸エチルを用いて行う。合計０．１ｇ（３２％の収率）の産物を適切な画分から単離する：1H NMR(CDCl3) δ8.50 (s, H-10), 8.40 (d, H-1, 8), 8.03 (d, H-4,5), 7.53 (dt, H-2,3, 6, 7), 6.15 (s,CH-anth), 5.19 (m, 交換可能, ,NH), 3.93-3.32 (m, 12H) 1.69-1.25 (m,4H). 質量スペクトルC24H28ClNO4H2Oの理論値：447. 18 (100.0%), 448.18 (27.1%). 実測値：447.17, 448.41.
Figure 0004748685
２−（２−｛２−［２−（２−クロロエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル）−イソインドール−１，３−ジオン。２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル）−イソインドール−１，３−ジオン（０．５ｇ、１．５５ミリモル）をNielsen, J. and Janda, K. D. (Methods: A Companion to Methods in Enzymology 6,361-371 (1994))の方法で調製した。この試薬に対し、ポリスチレン担持トリフェニルホスフィン約３ミリモルＰ／ｇ（０．６７ｇ、２ミリモル）及び６ｍｌの四塩化炭素を、還流冷却器付きの２５ｍｌの丸底フラスコ中で添加した。反応のセットアップにアルゴンを散布し、続いて２時間加熱して還流させた。冷却の際、更にポリスチレン担持トリフェニルホスフィン（０．１ｇ、０．３ミリモル）を添加し、そして反応液を更に１時間還流した。冷却した溶液を濾過し、そして樹脂を追加の四塩化炭素で洗浄した。溶媒の蒸発は、０．４ｇ（７５．５％の収率）の純粋な表題の化合物を生成させた：1H NMR(CDCl3) δ7. 82 (dd, 2 H), 7.69 (dd, 2H), 3. 88 (t, 2H), 3.71 (q, 4 H), 3.63-3. 56 (m, 12H). 質量スペクトル, m/e C16H21ClNO5 +の理論値：342.11 (100.0%), 344.11 (32.0%). 実測値：341.65, 343.64.
Figure 0004748685
２−［２−（２−｛２−［２−（２−クロロエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エチル］−イソインドール−１，３−ジオン。表題の化合物は、以前の実施例に従い、８９％の収率で調製した：1H NMR(CDCl3) δ7.77 (dd, 2H), 8 7.64 (dd, 2H), 3.83 (t, 2H), 3.67 (m,4 H), 3.60-3.52(m, 14H). 質量スペクトル, m/e C18H25CINO6 +の理論値：386.14 (100.0%), 388.13 (32.0%). 実測値：385.88, 387.83.
Figure 0004748685
２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−クロロエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−イソインドール−１，３−ジオン。表題の化合物は、２−（２−｛２−［２−（２−クロロエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル）−イソインドール−１，３−ジオンの合成に従い、９２％の収率で調製した：質量スペクトル, m/e C20H29ClNO7 +の理論値：430.16 (100.0%). 実測値429.85.
Figure 0004748685
ＶＩ．例示的な使用方法
本発明は、細胞における分子の発現、位置及び／又は輸送をモニタリングし、そして細胞内の微小環境の変化をモニタリングする方法を提供する。１つの態様において、突然変異加水分解酵素及び官能基を含む相当の基質は、細胞、生物又は細胞培養物中の細胞、又は細胞性成分を標識するのに利用される。例えば、細胞は、突然変異加水分解酵素をコードするベクター、例えば、突然変異加水分解酵素と核局在化シグナルの融合物をコードするものと接触させられる。細胞における当該ベクターの発現は、一過性又は安定でありうる。続いて、当該細胞は、突然変異加水分解酵素により認識される本発明の基質と接触される。あるいは、細胞は、ベクター及び基質と一緒に接触される。続いて、細胞、その可溶化液、又はその細胞成分画分、における基質の存在又は位置が検出又は決定される。
本発明の基質は、水性又はほとんど水性の溶液、例えば、水及び約６以上のｐＨを有する水溶液中で好ましくは可溶性である。本発明の基質のストック溶液は、しかしながら、水溶液又は緩衝液中で希釈する前に有機溶媒中で溶解されることがある。好ましい有機溶媒は、非プロトン性極性溶媒、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン及び他のヒドロキシル化しておらず、完全に水混和性の溶媒である。通常、利用される本発明の基質の量は、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料中の官能基の存在を、妥当な時間内に、最小のバックグラウンド又は不所望の標識で検出するのに必要とされる最小量である。使用する本発明の基質及び相当の突然変異加水分解酵素の正確な濃度は、実験条件及び所望の結果に依存する。本発明の基質の濃度は、典型的にナノモーラーからマイクロモーラーに及ぶ。本発明の基質と相当の突然変異加水分解酵素に必要な濃度は、満足の行く標識が達成されるまで、基質の体系的変化により決定される。出発時の範囲は、当業界で知られている方法から容易に決定される。
１つの態様において、光学特性を有する官能基を含む基質は、試料を標識するために突然変異加水分解酵素と一緒に利用される。そのような基質は、突然変異加水分解酵素が基質と結合するのに十分な期間、突然変異加水分解酵素を含んで成る注目の試料と一緒にされ、この後、当該試料は官能基の光学的応答を誘発するために選択した波長で照射される。任意に、当該試料は、残りの過剰な又は結合していない基質を除去するために洗浄される。１つの態様において、標識は、光学的応答と、標準的な又は予想される応答と更に比較することにより前記試料の特定の特徴を決定するために使用される。例えば、突然変異加水分解酵素が結合した基質は、試料中のそれらの空間的分布及び時間的分布に関して試料の特定の成分をモニタリングするために使用される。あるいは、突然変異加水分解酵素が結合した基質は、ある分子の存在又は量を決定又は検出するのに利用される。別の態様において、突然変異加水分解酵素が結合した基質は、官能基と特異的に応答する分子の存在について試料を解析するのに使用される。
検出可能な光学的応答は、直接観察又は機器のいずれかで知覚することができる試験系におけるパラメーターの変化、又は発生を意味する。そのような検出可能な応答には、色、蛍光、反射、化学発光、偏光、光散乱、又はＸ線散乱の変化又は出現が含まれる。典型的に、検出可能な応答は、蛍光の変化、例えば蛍光の強度、励起波長又は発光波長、蛍光寿命、蛍光偏光、又はそれらの組み合わせ、の変化である。検出可能な光学的応答は、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料を通じて、あるいは突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料の局所中で生じることがある。光学的応答の程度と標準的な又は予想される応答との比較は、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料が所定の特性を保持するか否か、そして突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料がどの程度所定の特性を保持するかを決定するために使用されうる。
別の態様において、官能基は、アクセプター分子のリガンドである。典型的には、基質が特定の結合対（リガンド）のメンバーである官能基を含んで成る場合、相補的なメンバー（アクセプター）は、固体又は半固体、例えばポリマー、ポリマー性の膜又はポリマー粒子（例えば、ポリマービーズ）上に固定される。代表的な特異的結合対には、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン若しくは抗ビオチン）、ＩｇＧとプロテインＡ若しくはプロテインＧ、薬物と薬物受容体、毒素と毒素受容体、炭水化物とレクチン若しくは炭水化物受容体、ペプチドとペプチド受容体、タンパク質とタンパク質受容体、酵素基質と酵素、センスＤＮＡ若しくはＲＮＡとアンチセンス（相補）ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ホルモンとホルモン受容体、そしてイオンとキレート剤、が含まれる。天然の受容体が存在しているリガンドには、天然タンパク質及び合成タンパク質、例えばアビジン及びストレプトアビジン、抗体、酵素、及びホルモン；ヌクレオチド及び天然又は合成のオリゴヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ並びに一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡのプライマー；脂質；多糖及び炭水化物；並びに種々の薬物、例えば治療薬並びに不正薬物及び殺虫剤が含まれる。官能基が、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、又は別の生物学的に重要な金属イオンのキレート剤である場合、そのような官能基を含んで成る基質は、イオンの指示薬として機能する。あるいは、そのような基質は、ｐＨ指示薬として機能しうる。好ましくは、イオンの指示薬の検出可能な光学的応答は、蛍光の変化である。
突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料は、典型的には、受動的な手段、すなわち、基質とのインキュベーションにより標識される。しかしながら、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料中に基質を導入する任意の方法、例えば細胞又は細胞小器官への基質のマイクロインジェクションは、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料に基質を導入するために使用されうる。本発明の基質は、概して、使用の濃度内で生細胞及び他の生物学的成分にとって非毒性である。
突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料は、本発明の基質との接触直後に観察することができる。突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料は、標識の間に他の溶液、例えば洗浄溶液、透過溶液及び／又は固定溶液、並びに追加の検出試薬を含む他の溶液、と任意に組み合わされる。基質との接触後の洗浄は、概して、洗浄後の非特異的バックグラウンドの低下に起因して、光学的応答の検出を改善する。満足の行く可視化が、より低い標識濃度を用いることにより洗浄することなく可能である。多数の固定剤及び固定条件が当業界で知られており、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、グルタルアルデヒド、冷却したメタノール及び３：１メタノール：酢酸である。固定は、典型的には細胞の形態を保存し、そして病原性試料とともに働く場合にバイオハザードを軽減するために使用される。基質の選択される態様は、細胞中でよく保持される。固定には、任意に、本発明の嵩高い基質が細胞膜を通過するように、当業界で一般的に知られている方法に従い、例えばアセトン、エタノール、ＤＭＳＯ若しくは種々の界面活性剤による透過処理が続き、あるいはそれを伴う。任意に、基質の使用は、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料中の特定の細胞成分、細胞内物質の存在、又は細胞の条件に起因して検出可能な応答を生成する追加の検出試薬の使用と組み合わされることがある。追加の検出試薬が基質のものと異なるスペクトル特性を有する場合、多色の利用が可能である。
光学的特性を有する官能基を含んで成る基質と接触した後又はその間の任意な時間に、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料は、検出可能な光学的応答をもたらす光の波長で照射され、そして当該光学的応答を検出するための手段で観察される。基質によっては比色分析により、周辺光を用いて検出可能であるが、他の基質は、親のフルオロフォアの蛍光特性で検出される。照射、例えば紫外又は可視の波長の輝線ランプ、アークランプ、レーザー、あるいは日光又は通常の室内照明による照射は、基質、例えば相補的な特異的結合対のメンバーと結合した基質は、強力な可視吸収並びに蛍光放射を示す。本発明の基質を照射するのに有用な選択される装置には、限定しないが、手持ちの紫外ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、アルゴンレーザー、レーザーダイオード、及びＹＡＧレーザー、が含まれる。これらの照射源は、任意にレーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的又は小さい蛍光光度計、又はクロマトグラフィー検出器に組み込まれる。この比色分析の吸光又は蛍光放射は、目視検査により、又は以下の装置：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、光ダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光マイクロプレートリーダー、のいずれかの使用により。あるいは光電子倍増管のようなシグナルを増幅するための手段により任意に検出される。突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料がフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡又は蛍光光度計を用いて試験される場合、これらの装置は、フルオロフォアである官能基を含んで成る基質と、検出可能な異なる光学的特性を有する第二のフルオロフォアと識別し、そして区別するために任意に使用され、典型的に、これは基質の蛍光応答を、第二のフルオロフォアのものと区別することによる。突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料がフローサイトメトリーを用いて試験される場合、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料の試験には、選別装置を用いることによる、基質の蛍光応答に基づいた、突然変異加水分解酵素又はその融合物を含んで成る試料内の粒子の単離が含まれる。
１つの態様において、細胞内移動は、本発明の突然変異加水分解酵素の融合を用いてモニタリングされうる。例えば、ベータ−アレスチンは、Ｇタンパク質共役受容体の制御因子であり、これは、それが活性化した場合、細胞質から細胞膜に移動する。本発明の突然変異加水分解酵素及びベータ−アレスチンと基質との融合物を含む細胞は、活性化したＧタンパク質共役受容体と会合するように、細胞質から細胞膜へのベータ−アレスチンの移動の検出を可能にする。
別の態様において、ＦＲＥＴが突然変異加水分解酵素と蛍光タンパク質、例えばＧＦＰの融合物、又は蛍光分子、例えばＯ−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）(Keppler et al., 2003)に結合するタンパク質との融合物と一緒に利用されうる。あるいは、突然変異加水分解酵素と注目のタンパク質の融合物及び蛍光タンパク質と前記注目のタンパク質と相互作用すると疑われる分子との第二の融合物は、前記注目のタンパク質と前記分子との相互作用を研究するために利用されることがあり、これは例えばＦＲＥＴを用いる。ある細胞が突然変異加水分解酵素と注目のタンパク質の融合物を含むことがあり、一方、別の細胞が、蛍光タンパク質と、前記注目のタンパク質と相互作用すると疑われる分子との第二の融合物を含むことがある。これらの２つの細胞を有する集団は、基質及び物質、例えば薬物と接触されることがあり、この後、細胞は２つの集団に対する物質の投与の効果を検出するためにモニタリングされる。
更に別の態様において、突然変異加水分解酵素は、蛍光タンパク質と融合される。融合タンパク質は、その結果、当該蛍光タンパク質を検出することにより、又は細胞を本発明の基質と接触させ、そして基質中の官能基を検出することにより検出されうる。蛍光タンパク質の検出は、官能基の検出前に実施されうる。あるいは、官能基の検出は、蛍光タンパク質の検出前に実施されうる。更に、これらの細胞は、追加の基質、例えば異なる官能基を有するものと接触されることがあり、そして当該細胞中の異なる官能基が検出され、この官能基は、第一の基質がこれまで結合したことがない突然変異加水分解酵素と共有結合する。
更に別の態様において、突然変異加水分解酵素と転写因子との融合物は、転写活性化経路の活性化をモニタリングするために利用されうる。例えば、不活性型で細胞質中に存在するが、活性化により核に転移する転写因子（例えばＮＦκβ）に対する突然変異加水分解酵素の融合は、転写活性化経路をモニタリングすることができる。
別の態様において、ビオチンは、基質中の官能基として利用され、そして融合物は、別の分子、例えばタンパク質と細胞中で相互作用すると疑われる注目のタンパク質と融合した突然変異加水分解酵素を含む。そのような試薬の使用は、突然変異加水分解酵素と融合したタンパク質と細胞において相互作用するほかの分子の捕獲を可能にし、それにより相互作用分子を同定し、そして／あるいは捕獲（単離）する。
１つの態様において、突然変異加水分解酵素は、分泌タンパク質と融合される。その融合物と本発明の基質を用いて、分泌タンパク質は検出され、そして／あるいはモニタリングされうる。同様に、突然変異加水分解酵素が異なる小胞区画間を輸送される膜タンパク質と融合される場合、基質の存在下、これらの区画内でのタンパク質のプロセシングが検出されうる。更に別の態様において、突然変異加水分解酵素が、イオンチャンネル又は輸送タンパク質、あるいは当該チャンネル又は輸送タンパク質と密接に会合するタンパク質と融合される場合、細胞又はオルガネラ膜を通過してのイオンの移動は、イオン感受性フルオロフォアを含む本発明の基質の存在下でモニタリングされうる。同様に、突然変異加水分解酵素が小胞又は細胞骨格と会合するタンパク質と融合される場合、基質の存在下で、細胞骨格構造に沿ったタンパク質又は小胞の輸送が容易に検出されうる。
別の態様において、官能基は薬物又は毒素である。そのような官能基を有する基質と、突然変異加水分解酵素と標的分子、例えば抗体、例えば特定の腫瘍細胞と会合する抗原に結合するものの融合物とを組み合わせることにより、薬物又は毒素が細胞内又は動物内で標的化されうる。あるいは、官能基は、基質中に存在し、且つ突然変異加水分解酵素と標的分子、例えば一本鎖抗体との融合物と組み合わされる場合、当該標的分子が標識されるフルオロフォアであってもよく、例えばin vitroでの用途、例えばＥＬＩＳＡのために標識された抗体である。
更に別の態様において、細胞表面上で発現したタンパク質と融合した場合、細胞表面上の突然変異加水分解酵素は、本発明の基質、例えばフルオロフォアを含むものと組み合わされる場合、in vivo又はin vitroでの細胞遊走（例えば、ガン細胞遊走）をモニタリングするために利用されうる。１つの態様において、本発明の基質は、細胞膜に対してほとんど又は全く透過性を有さないものである。あるいは、そのような系は、異なる細胞のプールに対する異なる物質、例えば薬物の作用をモニタリングするために使用されうる。更に別の態様において、突然変異加水分解酵素は、ＨＥＲＧチャンネルと融合される。Ｋ＋感受性フルオロフォアを含む本発明の基質の存在下で、そのような融合物を発現する細胞は、ＨＥＲＧチャンネルの活性をモニタリングするために、例えば薬物毒性をモニタリングするために利用されうる。
別の態様において、本発明の基質は、細胞又は生物における、疎水性領域のモニタリングに有用な官能基、例えばナイルレッドを含む。
従って、本発明の突然変異加水分解酵素と基質は、広範なアッセイ、例えばファージディスプレー、パニング、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＭＡＴ(fluorometric microvolume assay technology)並びに細胞及び細胞成分染色に有用である。
本発明は以下の非限定的な実施例により更に説明される。
実施例Ｉ
一般的方法論
特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術的且つ科学的用語は、分子生物学並びに細胞シグナル伝達及びモデリングの分野の通常の技術を有するものにより一般的に理解されるのと同一の意味を有する。通常、本明細書で使用する命名法並びに分光学、創薬、細胞培養、分子遺伝学、プラスチック製造、高分子化学、診断学、アミノ酸及び核酸化学、並びに以下説明するアルカン化学における研究室の手順は周知なものであり、そして当業界で一般的に利用されれている。標準的な技術は、プラスチックの調製、シグナル検出、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、並びに微生物培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に典型的に使用される。
前記技術及び手順は、当業界の常用の方法及び種々の一般的参考文献（概して、蛍光技術についてはSambrook et. al. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 及びLakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983)を参照のこと。これは引用により本明細書に組み入れられる）であって、本明細書を通じて提供されるものに従い通常実施される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、及び生物学的アッセイに使用される。
材料
全てのオリゴヌクレオチドが、Promega Corporation (Madison, WI)又はthe University of Iowa DNA Facility (Iowa City, Iowa)により合成され、精製され、そして配列決定された。制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素は、Promega Corporation (Madison, WI), New England Biolabs, Inc.(Beverly, MA)又はStratagene Cloning Systems (La Jolla, CA)から入手し、そして製造業者のプロトコールに従い使用した。コンピテントＥ．コリＪＭ１０９は、Promega Corporationにより供給され、又はStratagene Cloning Systemsから購入した。小規模のプラスミドＤＮＡ単離はQiagenプラスミドミニキット(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)を用いて行った。ＤＮＡライゲーションは、Stratagene Cloning Systemsから購入した、予備試験した試薬を用いて実施した。ＤＮＡフラグメントは、Qiagen Incから購入したQIAクイックゲル抽出キット又はQIAクイックＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
ＤｈａＡ突然変異体及びそれらの融合物を生成するために使用するベクターは以下の通りである：pET21 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pRL-null (Promega, Madison,WI)、pGEX-5x-3 (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)、並びにEGFP及びDsRED2（共にCLONTECH, Palo Alto, CA由来）。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル並びに関連の緩衝液及び染色液、並びにエレクトロブロットトランスファーバッファーは、BioWhittaker Molecular Applications (Rockland, ME)から入手した。タンパク質分子量マーカーのスタンダードは、Invitrogenから購入した。
Sigma-Aldrichは抗Ｆｌａｇ（登録商標）モノクローナル抗体抗体（抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２モノクローナル抗体（マウス）（Ｆ３１６５））、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２ ＨＲＰコンジュゲート及び抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２ ＦＩＴＣコンジュゲート（それぞれＡ８５９２及びＦ４０４９）の供給源である。Chemicon (Temecula, CA)はモノクローナル抗ウミシイタケルシフェラーゼ抗体（ＭＡＢ４４１０）の供給源である。Promega Corp.はＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ及びＨＲＰ−複合ストレプトアビジン（それぞれＷ４０２１及びＧ７１４）の供給源である。
１−Ｃｌ−ブタン、１−Ｃｌ−ヘキサン、１−Ｃｌ−オクタン、１−Ｃｌ−デカン、１−Ｃｌ−ブタノール、１−Ｃｌ−ヘキサノール、１−Ｃｌ−オクタノール、及び１−Ｃｌ−デカノールはAldrich又はFluka (USA)から入手した。全ての塩、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、イミダゾール、ＨＥＰＥＳ、ナトリウムＥＤＴＡ、硫酸アンモニウム、及びＴｒｉｓ遊離塩基はFisher (Biotech Grade)由来のものである。
グルタチオンセファロース４ＦＦ、グルタチオン、モノＱ及びセファデックスＧ−２５を予め充填したカラムは、Amersham Biosciences.由来のものである。
Ｌ培地（「ＬＢ」）は、Promega Corporation提供のものである。
方法
ＰＣＲ反応。ＤＮＡ増幅は、Promega Corp供給の標準的なポリメラーゼ連鎖反応緩衝液を用いて実施した。典型的に、５０μｌの反応液は、１ｘ濃度の製造業者供給の緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１２５μＭのｄＡＴＰ、１２５μＭのｄＣＴＰ、１２５μＭのｄＧＴＰ、１２５μＭのｄＴＴＰ、０．１０〜１．０μＭのフォワード及びリバースプライマー、５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ及び１ｎｇ未満の標的ＤＮＡを含む。特に指示の無い限り、ＤＮＡの増幅のための温度プロフィールは、９４℃で０．５分；５５℃で１分；そして７２℃で１分の３５サイクルであった。
ＤＮＡ配列決定。全てのクローンは、ジデオキシサーマルサイクル配列決定法(Sanger et al. , 1977)及びPerkin-Elmer Model 310 DNAシークエンサー(Foster City, CA).を用いたＤＮＡ配列決定により確認した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。タンパク質は、サンプルバッファー（１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、及び１．０ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８；Promega Corporation）中で溶解し、５分間煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％グラジエントゲル；BioWhittaker Molecular Applications）で分離した。ゲルはウェスタンブロット解析のためにクーマシーブルー（Promega Corp.）で染色し、又は蛍光撮像装置(Hitachi, Japan)上で、評価する各フルオロフォアについて適切なＥex／Ｅemで解析した。
ウェスタンブロット。ニトロセルロース膜（０．２μｍ、Scheicher & Schuell, Germany）に対する電気泳動によるタンパク質のトランスファーは、Xcell IIブロットモジュール(Invitrogen)内で、２５ｍＭのトリス塩基／１８８ｍＭグリシン（ｐＨ８．３）、２０％（ｖ／ｖ）メタノール中で２．０時間８０ｍＭの定電流で（４℃で）実施した。膜をＴＢＳＴバッファー（１０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．６、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有）ですすぎ、そしてブロッキング溶液（３％粉ミルク又は１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴバッファー）中で３０分間室温で又は一晩４℃でインキュベートした。続いて、膜を５０ｍｌのＴＢＳＴバッファーで洗浄し、そして抗ＦＬＡＧ（登録商標）モノクローナル抗体Ｍ２（１；５０００希釈）、抗ウミシイタケルシフェラーゼモノクローナル抗体（１：５，０００希釈）、又はＨＲＰ複合ストレプトアビジン（１：１０，０００希釈）で４５分間室温でインキュベートした。続いて、膜をＴＢＳＴバッファー（５０ｍｌ、５分、３回）で洗浄した。抗体でプローブされた膜は、続いて、ＨＲＰ複合ロバ抗マウスＩｇＧでインキュベートされ（３０分、室温）、そして次に、洗浄手順を繰り返された。タンパク質は、増強化学発光（ＥＣＬ）系(Pharmacia- Amersham)により、製造業者の指示に従い視覚化した。タンパク質のレベルは、コンピューター支援デンシトメトリーを用いて定量した。
タンパク質濃度。タンパク質は、Pierce BCAタンパク質アッセイのマイクロタイタープロトコール(Pierce, Rockford, IL)により、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて測定した。
統計解析。データは、４回１組で実施した、類似の結果を有する少なくとも３つの独立した実験を代表する実験由来の平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ値として表した。統計的有意差は、スチューデントｔ検定により評価し、そしてｐ＜０．０５の場合に有意とみなした。
細菌細胞。ｐＥＴ−３ａとロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)（ＤｈａＡ）を含むＤｈ５αの初期のストックは、Clifford J. Unkefer博士(Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) (Schindler et al., 1999; Newman et al. , 1999)のご好意により提供された。細菌は、Promega Corpにより提供されたプレミックス試薬を用いてＬＢ中で培養した。Ｅ．コリＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＥＴ３ａ（１０％グリセロール中で−８０℃で保存）のフリーザーストックを使用して、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）(Sambrook et al. , 1989)を添加したＬＢアガープレートに接種した。１つのコロニーを選択し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２つの１０ｍｌのＬＢ培養液に接種した。細胞は８時間３７℃で振とうしながら（２２０ｒｐｍ）培養し、この後、２ｍｌ用いて５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２つの５０ｍｌＬＢ培地のそれぞれに接種し、これを３７℃で振とうしながら一晩生育させた。１０ｍｌのこの培養液を使用して、アンピシリンを含む０．５ＬのＬＢ培地のそれぞれに接種した。培養液のＡ600が０．６に達したとき、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ０ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭの終濃度にまで添加し、そして培養液を更に４時間３０℃で振とうしながら維持した。細胞を続いて遠心で回収し、そして１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で洗浄した。細胞のペレットを細胞の可溶化の前に−７０℃で保存した。
哺乳類細胞。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ６１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＨａｍ’ｓＦ１２栄養素とダルベッコ改変最少必須培地の１：１混合物中で、９５％空気と５％ＣＯ2の雰囲気で３７℃で培養した。
ラット海馬（Ｅ１８）一次神経を後述するように単離した。要約すると、Brewer博士(Southern Illinois University)から入手したHibernate（登録商標）Ｅ培地(GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA)中の胚性（Ｅ１８）ラット海馬のフラグメントを解離し、そしてポリ−Ｄ−リジンでコーティングした（０．２８ｍｇ／ｃｍ2；Sigma）ガラス／プラスチック陶器上にプレーティングし、そしてＢ２７サプリメントを含む無血清Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地(NB 27, GIBCO)中で培養した。全ての培地を２〜３日毎に交換した。
トランスフェクション。異なるタンパク質の一過性発現を研究するために、細胞を３５ｍｍの培養皿又は２４穴プレートにプレーティングした。約８０〜９０％コンフルエントで、細胞を製造業者（ＧＩＢＣＯ）の指示に従いリポフェクタミン／ＤＮＡ／抗生物質を含まない培地の混合物に暴露した。次の日、培地を新鮮な培地に交換し、そして細胞を様々な期間生育させた。
蛍光。９６穴プレート内の細胞の蛍光は、蛍光プレートリーダーCytoFluorII (Beckman)上で特定のフルオロフォアにとって適切なＥex／Ｅem（例えば、ＴＡＭＲＡのＥex／Ｅemは５４０／５７５ｎｍである）で測定した。
実施例ＩＩ
ＤｈａＡベースのテザリング系
Ａ．野生型及び突然変異のＤｈａＡタンパク質及びその融合物
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のハロ−アルカンデヒドロゲナーゼはＤｈａＡ遺伝子産物である（ＭＷ約３３ｋＤａ）。この酵素は、脂肪族及び芳香族ハロゲン化化合物の、例えばハロＣ3−ハロＣ10の炭素−ハロゲン結合を開裂する。ＤｈａＡの触媒中心は典型的な「触媒三残基(catalytic triad)」であり、求核試薬、酸及びヒスチジン残基を含んで成る。基質はＤｈａＡに結合してＥ−Ｓ複合体を形成し、この後Ａｓｐ１０６による求核攻撃がエステル中間体を形成し、Ｈｉｓ２７２が続いて当該中間体を加水分解するＨ2０を活性化して触媒中心から生成物を放出するようである。触媒的なＨｉｓ２７２残基の点突然変異が酵素の酵素活性を損ない、その結果このタンパク質に対する官能基（ＦＧ）の共有結合的テザリングが可能となるか否かを決定するために、突然変異Ｄｈａが調製された。
材料と方法
突然変異ＤｈａＡベクターを調製するために、４プライマー重複伸長法(four primer overlap-extension method)に基づくPromegaのin vitro突然変異誘発キットが利用され(Ho et al., 1989)、ＤｈａＡ．Ｈ２７２のＦ，Ａ，Ｇ，又はＨ突然変異を生成した。外部プライマーはオリゴヌクレオチド
Figure 0004748685
 であり、そして内部の突然変異誘発プライマーは以下の通りである：
Figure 0004748685
 （突然変異したコドンには下線が引かれている）。突然変異したデハロゲナーゼ遺伝子は、ｐＥＴ−３ａベクターにサブクローニングされた。突然変異デハロゲナーゼの過剰発現のために、ｐＥＴ−３ａベクターでコンピテントＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。クローンのＤｈａＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認した。
ＧＳＴ−ＤｈａＡ（ＷＴ又はＨ２７２Ｆ／Ａ／Ｇ／Ｈ突然変異体）融合カセットは、適切なＤｈａＡコード領域をｐＧＥＸ５ｘ３ベクターのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングすることで構築した。２つのプライマー
Figure 0004748685
 を設計して、ＤｈａＡの５’コード領域に対してＳａｌＩ部位及びＫｏｚａｋ共通配列を加え、ＤｈａＡの３’コード領域に対してＮｏｔＩ、ＥｃｏＲ４７ＩＩＩ、及びＡｇｅＩ制限部位並びに停止コドンを加え、そしてＤｈａＡ（ＷＴ又は突然変異体）鋳型から８９７ｂｐのフラグメントを増幅した。生じたフラグメントを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子、第Ｘａ因子開裂部位をコードする配列、及びマルチクローニング部位（ＭＣＳ）、続いて、停止コドンを含むベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−３のＳａｌＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入した。
Ｆｌａｇコード配列を続いてｐＧＥＸ５Ｘ−３ベクターのＡｇｅＩ／ＥｃｏＲ４７ＩＩＩ制限部位に挿入した。６つのヌクレオチドとのインフレームで、ＡｇｅＩ部位は１１アミノ酸ペプチドの配列であり、この最後のオクタペプチドがＦｌａｇペプチドに相当する(Kodak Imaging Systems, Rochester,NY)。Ｆｌａｇペプチド(Kodak Imaging Systems, Rochester,NY)をコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチド
Figure 0004748685
 をアニーリングした。アニーリングしたＤＮＡは５’末端にＡｇｅＩ部位を、そして３’末端にＥｃｏＲ４７ＩＩＩを有していた。アニーリングしたＤＮＡをＡｇｅＩ及びＥｃｏＲ４７ＩＩＩで消化し、そして次にＧＳＴ−ＤｈａＡ．ＷＴ又はＧＳＴ−Ｄｈａ．Ｈ２７２Ｆ突然変異コンストラクト内に、ＡｇｅＩ及びＥｃｏＲ４７ＩＩＩ部位でサブクローニングした。全ての遺伝子融合コンストラクトをＤＮＡ配列決定で確認した。
ＧＳＴ−ＤｈａＡ融合タンパク質を生成させるために、酵素発現は、培養液が６００ｎｍで０．６の光学密度に達した場合に、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＭの終濃度）の添加により誘導した。細胞をバッファーＡ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ4、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、及び１０％グリセロール、ｐＨ７．５）中に回収し、そしてVibra Cell（登録商標）ソニケーター(Sonics & Materials, Danbury, CT, USA)を用いた超音波処理により破壊した。細胞片を１９，８００ｘｇで１時間の遠心により除去した。粗製抽出物をＧＳＳ−セファロース４ファストフローカラム(Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)上で、製造業者の指示に従い更に精製した。ＧＳＴ−ＤｈａＡ融合タンパク質を含む溶出画分をプールし、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ4バッファー（２０ｍＭＮａ2ＳＯ4及び１ｍＭＥＤＴＡ−Ｎａ2を含む）に対し一晩４℃で透析し、そして使用するまで−２０℃で保存した。ＤｈａＡ（ＷＴ又は突然変異体）を生成させるために、ＧＳＴは、第Ｘａ因子との融合タンパク質から開裂し、そして生成物をＧＳＳ−セファロース４(Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)上で、製造業者の指示に従い精製した。当該タンパク質の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。実験によっては、無細胞抽出物が、Newmanら(1999)により説明されているように４５〜７０％飽和硫酸アンモニウムを用いて分画された。
結果
図３は、ＧＳＴ−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（レーン１）及びＧＳＴ−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（レーン２）融合タンパク質の強いＩＰＴＧ誘導性産生を示す。更に、当該タンパク質は可溶性であり、且つＧＳＳ−セファロース４ＦＦ上で効率的に精製されうる（レーン５〜１０、奇数番号レーンはＧＳＴ−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇに相当し、そして偶数番号レーンはＧＳＴ−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇに相当する）。第Ｘａ因子による融合タンパク質の処理は、２つのタンパク質ＧＳＴ及びＤｈａＡ（ＷＴ又は突然変異体、それぞれレーン１１及び１２）の形成をもたらし、そしてＧＳＴはＧＳＳ−セファロース４ＦＦ上で効率的に除去された（ＷＴ又は突然変異体、それぞれレーン１３及び１４）。尚、全てのタンパク質が推定の分子量を有していた。
Ｂ．Ｈ２７２の突然変異はＣｌ−アルカンを加水分解するＤｈａＡの能力を損なう。
酵素が周囲の媒体中に酵素反応産物を放出不能ということは、テザリング系にとって必須である。この不能は、酵素の加水分解活性の有意な低下により検出することができる。
Ｃｌ−アルカンのＤｈａＡ（ＷＴ又は突然変異体）加水分解の能力に対する点突然変異の効果を研究するために、Hollowayら(1998)によって説明されているようなｐＨ指示染料系が利用された。
材料と方法
ｐＨ指示染料系の反応緩衝液は、１ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＳＯ4（ｐＨ８．２）、２０ｍＭのＮａ2ＳＯ4、及び１ｍＭのＥＤＴＡから成る。フェノールレッドは終濃度２５μｇ／ｍｌになるよう添加された。ハロゲン化化合物は、基質の溶解画分が脱ハロゲン化反応の最大速度にとって十分であることを保証しうる見かけの濃度になるよう添加された。基質−緩衝溶液は、ボルテックスをかけることで激しく３０秒間混合し、基質の有意な蒸発を防ぐために蓋がされ、そして１〜２時間以内に使用した。それぞれの動力学的な決定の前に、フェノールレッドをＨＣｌの標準化溶液で滴定して見かけの吸光係数を準備した。ＤｈａＡの定常状態の速度定数は、Beckman Du640分光光度計(Beckman Coulter, Fullerton, CA)上で、室温で５５８ｎｍで決定した。速度定数は、コンピュータープログラムSigmaPlotを用いて初速度から算出した。１ユニットの酵素活性は、特定の条件下で１分当たり１．０ｍＭの基質を脱ハロゲン化するのに必要な量として定義される。
結果
図４に示す通り、０．１ｍｌ／ｍｌの酵素及び１０ｍＭの基質をｐＨ７．０〜８．２で用いると、触媒活性は４つの変異体のいずれでも見られなかった。これらの条件下、野生型酵素は、タンパク質１ｍｇ当たり５ユニットの１−Ｃｌ−ブタンの活性を有していた。このように、突然変異体の活性は少なくとも７００倍低下した。
ＤｈａＡ（ＷＴ又は突然変異体のうちの１つ）を発現しているＥ．コリから得られた上清のアリコートは、（ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度を増大させて処理した。タンパク質は、それぞれの（ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度に２時間（４℃）曝露し、遠心でペレット化し、一晩バッファーＡに対し透析し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
図５に示す通り、ＤｈａＡ．ＷＴ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体の主要画分は、４５〜７０％の（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈殿した。これらのタンパク質の沈殿は、低い（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度では観察されなかった。対照的に、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｑ、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｇ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ａ突然変異体は、１０％（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈殿しうる。これは、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｑ、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｇ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ａ突然変異体の物理化学的特性の有意な変化を強力に示唆するものである。同時に、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体は、これらのパラメーターに対して有意な効果は有さなかった。これらのデータは、ＤｈａＡの三次元構造に対する突然変異の効果のコンピューターモデリングの結果と十分一致しており、これは、試験した全ての変異体の中でも、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体のみが推定の三次元モデル（図２を参照のこと）上で有意な作用を有さなかったことを示している。これらの結果に基づき、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆが更なる実験のために選択された。
共有結合付加物を形成するために、Ｃｌ−アルカンの塩素原子は、おそらくＤｈａＡ（ＷＴ又は突然変異体）の触媒的なアミノ酸の極めて近くに位置する（図２）。ＤｈａＡの結晶構造(Newman et al., 1999)は、これらのアミノ酸がＤｈａＡの触媒ポケットの内側深くに位置していることを示唆している（約１０Åの長さで且つ２０Å2の断面）。官能基を含むＤｈａＡの基質の反応基がＤｈａＡの触媒ポケット内に進入することを可能にするために、リンカーを設計して、官能基が触媒ポケットの外側に位置するように、すなわち、ＤｈａＡの三次元構造を妨害／破壊しないように、官能基を有するＣｌ含有基質と接続された。
ＤｈａＡが長い疎水性炭素鎖を有するＣｌ−アルカンを加水分解することが出来るか否かを決定するために、Ｄｈａ．ＷＴが種々のＣｌ−アルカンアルコールと接触された。図６に示すように、Ｄｈａ．ＷＴは４〜１０個の炭素原子を有する１−Ｃｌ−アルカンアルコールを加水分解することができる。更に、Ｃｌ−アルカンの加水分解の初速度（ＩＲＨ）は、炭素鎖の長さに対して逆相関であるが、水性緩衝液中での長鎖Ｃｌ−アルカンの難溶性は、酵素−基質相互作用の有効性に影響を及ぼすことがある。事実、図６に示すように、１−Ｃｌ−アルカン−１０−デカノールのＩＲＨは、１−Ｃｌ−デカンのＩＲＨよりも遥かに高い。更に重要なことに、これらのデータは、ＤｈａＡが相対的に極性の基（例えば、ＨＯ基）を含むＣｌ−アルカンを加水分解することができることを示唆している。
異なる長さ及び／又は疎水性のリンカーを有するＦＡＭ修飾Ｃｌアルカンを調製した（図７）。ＤｈａＡ．ＷＴは、前記リンカーが１２以上の原子長である場合、相対的に嵩高い官能基（ＦＡＭ）を有するＣｌ−アルカンを効率的に加水分解した。ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ／Ａ／Ｇ／Ｑ突然変異体の活性は試験したＣｌ−アルカンのいずれでも検出されなかった（データは示さない）。更に、Ｃｌ原子に隣接している（ＣＨ2）6領域の修飾は、ＤｈａＡ．ＷＴによる１４原子のリンカーのＩＲＨの有意な低下をもたらした。それにも関わらず、リンカーの長さ及び構造が加水分解酵素の触媒部位と適合する場合、本発明の基質におけるリンカーの存在は、当該反応に対し実質的に効果を有さない。
試料のうちの幾つかは、自動ＨＰＬＣ(Hewlett- Packard Model 1050)系上で解析された。ＤＡＤ検出器は、２００〜６００ｎｍの範囲にわたるＵＶ−可視スペクトルを記録するために設定された。蛍光は、ＦＡＭ−修飾基質及びＴＡＭＲＡ−修飾基質についてそれぞれ４８０／５２０ｎｍ及び５４０／５７５ｎｍに匹敵するＥex／Ｅemで検出された。Ｃｌ−アルカンのエタノール抽出物又はＣｌ−アルカン加水分解産物は、分析用の逆相Ｃ18カラム(Adsorbosphere HS, 5μ, 150 x 4.6 mm; Hewlett-Packard, Clifton, NJ)を用いて、１．０ｍｌ／分で３０分適用される２５：７５〜１：９９（ｖ／ｖ）のリニアなグラジエントの１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）：ＡＣＮ（アセトニトリル）で解析した。分離した化合物の定量は、回収したピークの積分した表面を基にした。
図８Ａは、基質と反応産物の完全な分離を示す。図８Ｂは、野生型ＤｈａＡがＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌを非常に効率的に加水分解したことを示唆する。同様の結果が、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ又はＲＯＸ．５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌが基質として使用された場合に得られた（データは示さない）。総合すると、これらのデータは、ｐＨ指示染料ベースのアッセイの結果が、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異によるＤｈａＡの完全な不活性化を示すことを裏付けるものである。
Ｃ．ＤｈａＡ突然変異体に対するin vitroでの官能基の共有結合的テザリング
材料と方法
タンパク質のＭＡＬＤＩ解析が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計Bruker Biflex III (Bruker, USA.)を用いてウィスコンシンバイオテクノロジーセンターで実施された。試料を調製するために、２００μｌの緩衝液（１ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＳＯ4（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＮａ2ＳＯ4、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）中１００μｇの精製ＤｈａＡ（ＷＴ又はＨ２７２Ｆ突然変異体）又はＧＳＴ−ＤｈａＡ（ＷＴ又はＨ２７２Ｆ突然変異体）融合タンパク質（約９０％の均質性にまで精製）を基質（ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、終濃度１．０ｍＭ）と共に、又は基質無しで、室温で１５分間インキュベートされた。続いて、反応混合物を２０ｍＭのＣＨ3ＣＯＯＮＨ4（ｐＨ７．０）に対し、一晩４℃で透析し、そしてタンパク質及びタンパク質−基質複合体のＭ／Ｚ値が決定された。
ＤｈａＡ．Ｄ１０６突然変異体を調製するために利用したオリゴヌクレオチドは、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃの場合：
Figure 0004748685
 を含み；
ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｑの場合：
Figure 0004748685
 を含み；
ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅの場合：
Figure 0004748685
 を含み；
ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｙの場合：
Figure 0004748685
 を含む。アニーリングしたオリゴヌクレオチドは、５’末端にＳｔｙＩ部位を、そして３’末端にＢｌｐＩ部位を含んだ。アニーリングしたオリゴヌクレオチドは、ＳｔｙＩ及びＢｌｐＩで消化され、そしてＧＳＴ−ＤｈａＡ．ＷＴ又はＧＳＴ−ＤｈａＡ．Ｈ２７２ＦのＳｔｙＩ及びＢｌｐＩ部位にサブクローニングされた。全ての変異体をＤＮＡ配列決定で確認した。
結果
ＤｈａＡ．Ｈ２７２突然変異体が官能基を有するＣｌ−アルカンと結合することができることを確認するために、これらの突然変異体又はそれらのＧＳＴ−融合物、並びに相当の野生型タンパク質又は融合物は、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、ＲＯＸ．５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、又はビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌと１５分間室温で接触させられた。続いて、当該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。タンパク質を含むゲルをＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ、又はＲＯＸ．５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌとインキュベートし、そして蛍光撮像装置(Hitachi, Japan)により、各フルオロフォアに適切なＥex／Ｅemで解析した。ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌとインキュベートしたタンパク質を含むゲルをニトロセルロース膜にトランスファーし、そしてＨＲＰ複合ストレプトアビジンでプローブした。
図９に示すように、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン１及び２）、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン３及び４）、及びＲＯＸ．５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン５及び６）はＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆと結合したが（パネルＡのレーン２，４、及び６）、ＤｈａＡ．ＷＴとは結合しなかった（パネルＡのレーン１，３，及び５）。ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−ＣｌはＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆと結合したが（パネルＢのレーン９〜１４）、ＤｈａＡ．ＷＴとは結合しなかった（パネルＢのレーン１〜８）。更に、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−ＣｌとＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆとの結合（パネルＢのレーン１〜８）は用量依存的であり、そして０．２μＭで検出されうる。更に、基質とＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆとの結合は非常に強く、これはＳＤＳとの煮沸が結合を破壊しなかったためである。
全ての試験したＤｈａＡ．Ｈ２７２突然変異体、すなわちＨ２７２Ｆ／Ｇ／Ａ／ＱがＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌと結合した（図１０）。更に、ＤｈａＡ．Ｈ２７２突然変異体は、高度に特異的な様式で基質と結合し、これは、ある基質（ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ）による突然変異体の前処理が完全に別の基質（ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ）の結合を完全に防いだためである（図１０）。
Ｃｌ−アルカンとＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体（又はＧＳＴ−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体融合タンパク質）との結合の性質を決定するために、これらのタンパク質は、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌと一緒に、又はそれ無しでインキュベートされ、そしてＭＡＬＤＩで解析された。図１１に示す通り、突然変異ＤｈａＡ．Ｈ２７２ＦとＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌとの結合は強力である。更にＥ*Ｓ複合体の解析は、基質（例えば、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ）とＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆとの間の結合の共有結合の性質を示唆した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析も、基質／タンパク質付加物が１：１の関係で形成されることを裏付けている。
触媒三残基における別の残基、残基１０６のＤｈａＡ突然変異体が調製された。野生型ＤｈａＡの１０６位にある残基はＤであり、これは既知の求核アミノ酸残基のうちの１つである。ＤｈａＡの１０６位にあるＤは、Ｄ以外の求核アミノ酸残基、例えばＣ、Ｙ及びＥで置換され、これらは野生型ＤｈａＡと基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成しうる。特に、システインはシステインベースの酵素における既知の求核試薬であり、そしてこれらの酵素は水を活性化することが知られていない。
コントロールの突然変異体ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｑ、単一の突然変異体ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｙ、及びＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ、並びに二重の突然変異体ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ：Ｈ２７２Ｆ、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ：Ｈ２７２Ｆ、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｑ：Ｈ２７２Ｆ、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｙ：Ｈ２７２Ｆが、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌに対する結合について解析された（図１２）。図１２に示す通り、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌは、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ：Ｈ２７２Ｆ、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ、及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆと結合した。このように、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌと、突然変異体ＤｈａＡの残基１０６のシステイン又はグルタミン酸との間で形成される結合は、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌと野生型ＤｈａＡとの間で形成される結合と比較して安定である。１０６位での単独又はＤｈａＡの他の残基と組み合わせた他の置換は、同様の結果をもたらしうる。更に、１０６位での単独での又はＤｈａＡの他の残基と組み合わせた幾つかの置換は、わずかに幾つかの基質との結合を形成する突然変異体ＤｈａＡをもたらしうる。
実施例ＩＩＩ
本発明の突然変異体ＤｈａＡと基質を介する固体支持体に対するルシフェラーゼのテザリング
材料と方法
phRLuc-リンカー-DhaA. WT-Flag及びphRLuc-リンカー-DhaA. H272F-Flagの融合カセットは、phRLucのコード領域を、ミリスチン酸付着ペプチドコード配列（ＭＡＳ）を含むpCIneoベクターのNheI/SalI部位にクローニングすることで構築した。２つのプライマー
Figure 0004748685
 が、NheI及びSalI部位を、それぞれphRLucの５’及び３’コード領域に付加し、そしてphRLuc鋳型(pGL3ベクター、Promega）から９００ｂｐのフラグメントを増幅するように設計された。続いて、ミリスチン酸付着ペプチドコード配列をNheI及びSalI制限酵素で切り出し、そしてphRLucを含む増幅したフラグメントをpCIneo.DhaA.(WT又はH272F)-FlagベクターのNheI/SalI制限部位に挿入した。各コンストラクトの配列はＤＮＡ配列決定で確認した。PromegaのTNT（登録商標）T7Quickシステムを続いて融合タンパク質をin vitroで生成するために使用した。
結果
ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｃｌ−アルカン架橋を介した固体支持体に対するタンパク質のテザリングを証明するために、ウミシイタケルシフェラーゼ（hRLuc、融合物のＮ末端）、タンパク質コネクター（１７アミノ酸、表Ｉを参照のこと）、及びＤｈａＡ（ＷＴ又はＨ２７２Ｆ突然変異体）の融合タンパク質をコードするベクターを調製した。Ｆｌａｇエピトープを続いてＤｈａＡのＣ末端に融合させた。
Figure 0004748685
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のウェスタンブロット解析は、前記タンパク質がそれらの推定の分子量を有しており、そして抗R.Luc及び抗Flag（登録商標）Ｍ２抗体で認識されたことを証明した。更に、全ての融合タンパク質が、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を有していた（Promegaのウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系によりｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中で決定された）。
ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｃｌ−アルカン架橋を介した固体支持体に対するタンパク質のテザリングは、基質としてビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌを、そして固体支持体としてストレプトアビジン（ＳＡ）コーティング９６穴プレート(Pierce, USA)を用いることにより証明された。翻訳されたタンパク質は、２５μＭ（終濃度）のビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ基質と６０分間室温で接触された。未結合のビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌは、セファデックスＧ−２５充填カラム(Amersham Biosicences)上でのゲル濾過で除去した。R.Luc-コネクター-DhaA融合物の回収画分は、ＳＡコーティング９６穴プレート内に１時間室温で据えられ、未結合タンパク質は洗い落とされ、そしてルシフェラーゼ活性が測定された。
図１３Ａは、プレート上で捕獲されたウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す。これらのデータの解析は、突然変異体ＤｈａＡを含む融合物のみが捕獲されたことを示唆した。捕獲の効率は非常に高かった（プレートに添加された５０％超のウミシイタケルシフェラーゼ活性が捕獲された）。対照的に、野生型ＤｈａＡ及びウミシイタケルシフェラーゼを含む融合物の捕獲の効率は、無視できるほど小さかった（＜０．１％）。ビオチン化していない基質（ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ）によるR.Luc-コネクター-DhaA.H272Fの前処理は、捕獲効率を約８０％に低下させた。更に、R.Luc-コネクター-DhaA.WT又はウミシイタケルシフェラーゼの捕獲に対するビオチン化されていない基質による前処理の効果はなかった。
総合すると、これらのデータは、活性酵素（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）が、本発明の基質の一部を形成する固体支持体にテザリングすることができ（Ｃｌ−アルカン−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ架橋）、そして酵素活性を保持することを証明している。
実施例ＩＶ
in vivoでの突然変異ＤｈａＡと基質の系
Ａ．ＤｈａＡ突然変異体に対するin vivo：原核生物及び真核生物における官能基の共有結合的テザリング
材料と方法
原核生物において発現した突然変異加水分解酵素に対する本発明の基質の結合を研究するために、Ｅ．コリ細胞ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓ６５をpGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag又はpGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flagで形質転換し、脂質培養液中で生育させ、そしてＩＰＴＧとともにインキュベートした。ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ又はビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌのいずれかを誘導した細胞に添加した（終濃度、２５μＭ）。１時間後、細胞を収穫し、冷たいＰＢＳ（ｐＨ７．３）で洗浄し、超音波で破壊し、そして１９，８００ｘｇでの１時間の遠心により分画した。可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した細胞から単離したタンパク質を有するゲルを蛍光撮像装置上で解析し、一方、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理した細胞由来のタンパク質はニトロセルロース膜にトランスファーし、そしてＨＲＰ複合ストレプトアビジンでプローブした。
哺乳類細胞におけるＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの結合を研究するために、DhaA.WT-Flag又はDhaA.H272F-Flagのコード領域をそれぞれpGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag又はpGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flagから切り出し、ゲル精製し、そしてpCIneo.CMVベクター(Promega)のSalI/NotI制限部位内に挿入した。コンストラクトは、ＤＮＡ配列決定で確認した。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２４穴プレート(LAbsystems)内に据え、そしてこれにpCIneo.CMV.DhaA.WT-Flag又はpCIneo.CMV.DhaA.H272F-Flagベクターをトランスフェクションした。２４時間後、培地は、２５μＭのＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌを含む新鮮な培地と交換され、そして細胞はＣＯ2インキュベーター内に６０分間据えられた。このインキュベーションの後、培地を除去し、細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄し、そして細胞をサンプルバッファー（１％ＳＤＳ、１０％グリセロール等；２５０μｌ／穴）中で溶解した。タンパク質（１０μｌ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％のグラジエントゲル）上で分離し、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの結合を、蛍光撮像装置(Hitachi, Japan)により５４０／５７５ｎｍに匹敵するＥex／Ｅemで検出した。
結果
図１４Ａ及びＢは、in vivoでのＥ．コリタンパク質に対するビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（Ａ）及びＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（Ｂ）の結合を示す。図１４Ａ上の低分子バンドはＨＲＰ−ＳＡで認識可能なＥ．コリタンパク質であり、一方、パネルＢの下の部分で検出される蛍光は、遊離ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの蛍光であった。図１５は、in vivoでの真核細胞タンパク質に対するＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの結合を示す。
図１４及び図１５の解析は、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ突然変異体がＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ又はビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌに結合するが、ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇは結合しないことを示した。更に、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇと基質との結合は非常に強力であり（おそらく共有結合）、これは、ＳＤＳとの煮沸、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥが、突然変異体酵素と基質との間の結合を破壊しなかったためである。
Ｂ．本発明の基質に対する細胞膜の透過性
材料と方法
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ６１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＨａｍ’ｓＦ１２栄養素とダルベッコ改変最少必須培地の１：１混合物中で、９５％空気と５％ＣＯ2の雰囲気で３７℃で培養した。
異なる基質の取り込みを研究するために、細胞をＬＴ−ＩＩチャンバー(Nunc)又は９６穴プレート(Labsystems)中に３０，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングした。次の日、培地を異なる濃度の基質を含む培地と交換し、そして細胞をＣＯ2インキュベーター内に２，５又は１５分間戻した。インキュベーションの終了時に、基質を含む培地を除去し、そして細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄した。新鮮な培地を続いて細胞に添加し、そして細胞を３７℃のＣＯ2インキュベーターに戻した。９６穴プレート内の細胞の蛍光レベルを、蛍光プレートリーダーCytoFluorII (Beckman)上で、ＦＡＭ−修飾基質及びＴＡＭＲＡ−修飾基質についてそれぞれ４８０／５２０ｎｍ及び５４０／５７５ｎｍに匹敵するＥex／Ｅemで測定した。細胞の蛍光画像は、ＦＩＴＣ又はＴＡＭＲＡの検出に適したフィルターセットを有する倒立落射蛍光顕微鏡Axiovert-100 (Carl Zeiss)上で撮影された。
結果
図１６に示す通り、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理したＣＨＯ−Ｋ１細胞（２５μＭ、５分、３７℃）は、迅速且つ効率的にＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌを充填しうる。画像解析は、蛍光色素が細胞膜を通過したことを示唆した。図１６はまた、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌが効率的に細胞から洗い出されうることを示す。総合すると、これらのデータは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の原形質膜がＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ透過性であることを示唆する。
対照的に、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌは、細胞を高濃度（すなわち１００μＭ）のＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで、且つかなり長期間（６０分間）前処理した場合であっても、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の原形質膜を通過しなかった（データは示さない）。したがって、本発明の種々の基質、例えばＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ及びＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌについての細胞の原形質膜の異なる透過性は、細胞表面上で発現したタンパク質及び細胞の内側で発現したタンパク質を異なるフルオロフォアで標識する独特の機会を提供し、それによりバイプレキシング(biplexing)が可能となる。
実施例Ｖ
in vivoでの細胞画像化のためのＤｈａＡベースのテザリング
Ａ．生きている哺乳類細胞のＧＦＰ及びＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの共局在化
材料と方法
ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ融合カセットは、ＧＦＰ−ＤＥＶＤ−Ｒｌｕｃ（ｈ）をコードするPackardのベクター（Packard #6310066)のウミシイタケルシフェラーゼのコード領域を、ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇのコード領域で置換することにより構築された。２つのプライマー
Figure 0004748685
 が、
がＤｈａＡの５’及び３’領域にそれぞれＡｐａＩ及びＢａｍＨＩ部位（下線）と付加し、そしてpGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag又はpGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag鋳型から９８０ｂｐのフラグメントを増幅するために設計された。Ｒ．Ｌｕｃのコード領域をＡｐａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切り出した。続いて、ＤｈａＡを含む９８０ｂｐのフラグメントをＧＦＰ−ＤＥＶＤ−Ｒｌｕｃ（ｈ）コードベクターのＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。遺伝子融合コンストラクトの配列は、ＤＮＡ配列決定で確認した。
ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ融合タンパク質を一過的に発現する細胞をＬＴ−ＩＩチャンバー(Nunc)において３０，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングした。次の日、培地は、２５μＭのＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌを含む新鮮な培地と交換し、そして細胞をＣＯ2インキュベーター内に６０分間戻した。インキュベーションの終了時に、基質を含む培地を除去し、細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄し、そして新鮮な培地を続いて細胞に添加した。細胞をＣＯ2インキュベーター内に戻し、そして６０分後に細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄した。細胞の蛍光画像は、ＧＦＰ及びＴＡＭＲＡの検出に適したフィルターセットを有する倒立落射蛍光顕微鏡Axiovert-100 (Carl Zeiss)上で撮影された。
結果
図１７に示す通り、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞は、ＧＦＰの発光特性によりタンパク質の強力な発現を示した。ＴＡＭＲＡフィルターセットで撮影した同一の細胞の画像解析は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇを発現する細胞が暗く、そしてこの融合タンパク質発現しない細胞から識別されえないことを示した。対照的に、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇを発現する細胞は非常に明るく、そして間違えずに認識可能であった。
ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−ＦｌａｇベクターでトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞から単離したタンパク質のウェスタンブロット解析は、これらの細胞が抗Ｆｌａｇ抗体で認識され、且つ融合タンパク質について推定される分子量を有するタンパク質を発現したことを示した（データは示さない）。これらのタンパク質を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのフルオロスキャンは、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇに対する強力な共有結合及びＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇに対する結合無しを示した（図１８）。
Ｂ．ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−ＦｌａｇにおけるＤｈａＡの融合パートナーは機能的である。
２つのタンパク質の融合が一方又は両方のタンパク質の活性の損失をもたらすか否かを決定するために、融合物のＣ−又はＮ−末端にＤｈａＡを、そして２つのタンパク質間にコネクター配列、例えば１３〜１７アミノ酸のものを有する複数のＤｈａＡベースの融合タンパク質（表ＩＩを参照のこと）を調製した。データは、融合物における両タンパク質の機能活性が保存されたことを示した。
Figure 0004748685
Ｃ．Ｃｌ−アルカンの毒性
材料と方法
Ｃｌ−アルカンの毒性を研究するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を９６穴プレート中に、穴当たり５，０００細胞の密度でプレーティングした。次の日、培地は、０〜１００μＭの濃度のＣｌ−アルカンを含む新鮮な培地と交換し、そして細胞をＣＯ2インキュベーター内に異なる期間戻した。細胞の生存度は、CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存度アッセイ(Promega)を用い、製造業者のプロトコールに従い測定した。通常、１００μｌのCellTiter-Glo（登録商標）試薬を直接細胞に添加し、そして発光はDYNEX MLXマイクロタイタープレートルミノメーターを用いて１０分目に記録した。実験によっては、蛍光／発光の干渉を防ぐために、蛍光Ｃｌ−アルカンを含む培地を除去し、しすてCellTiter-Glo（登録商標）試薬の添加前に細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄した。対照実験は、この手順がCellTiter-Glo（登録商標）アッセイの感度又は精度に影響しなかったことを示唆した。
結果
図１９に示す通り、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌは、１００μＭの濃度（試験した最高の濃度）での４時間の処理後であっても、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する毒性を示さなかった。２４時間の処理後、毒性は６．２５μＭの濃度（「最大非毒性濃度」）で検出されなかった。６．２５μＭ超の濃度で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における相対的な発光は、約１００μＭのＩＣ50で用量依存的に低下した。ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌの毒性は、１００μＭでの２４時間の処理後であっても観察されなかった。対照的に、ＲＯＸ５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＲＬＵの低下が１時間の処理後に検出されうるので、顕著な毒性作用を有していた。この作用のＩＣ50値は、２５μＭの濃度での明らかなＡＴＰ低下無しに、約７５μＭであった。ＲＯＸ５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−ＣｌのＩＣ50値及びＲＯＸ５−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの「最大非毒性濃度」は、時間依存的に低下し、それぞれ１２．５μＭ及び６．２５μＭに達した。
ＴＡＭＲＡ−又はＤｉＡｃ−ＦＡＭ含有基質及び固定剤と接触したＣＨＯ細胞におけるＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃの検出
ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ、４回継代）を、８穴チャンバースライド(German coverglass system)内の、抗生物質を含まず、１０％ＦＢＳ及び１ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地(Gibco)中に低密度で播種した。２日後、細胞は倒立型顕微鏡を用いて検査した。２つの視覚的基準がトランスフェクション試薬を適用する前に確認された：１）チャンバー当たりの細胞のコンフルエントのレベルが約６０〜８０％であったこと、そして２）９０％超の細胞が接着性であり、そして平らな形態を示したこと。培地は、１５０μｌの新鮮な予め暖められた増殖培地と交換され、そして細胞は約１時間インキュベートされた。
細胞は、TransIT TKOシステム(Miris)を用いてトランスフェクションした。TKO脂質は、１００μｌの無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地当たり７μｌの脂質を添加することで希釈し、そして次に１．２μｇのトランスフェクション用ＤｈａＡ．Ｄ１０６ＣのＤＮＡを１００μｌの脂質含有培地当たり添加した。混合物を室温で１５分間インキュベートし、そして次に２５μｌのアリコートを個々の培養液のチャンバー（０．３μｇのＤＮＡ）に移した。細胞をインキュベーターに５〜６時間戻し、増殖培地で２回洗浄し、３００μｌの新鮮な増殖培地を添加し、そして次に細胞を更に２４時間インキュベートした。
トランスフェクションした又はトランスフェクションしなかったコントロールの細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中の１２．５μＭのＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ又は１２．５μＭのＤｉＡｃ−ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌとともに３０分間、３７℃及び５％ＣＯ2でインキュベートした。細胞を暖かい増殖培地で３回洗浄し、３００μｌの新鮮な増殖培地を添加し、そして次に細胞を１時間インキュベートした。
増殖培地を暖かいＰＢＳと交換し、そして生細胞は、ローダミンフィルターセット（励起フィルター＝５４０、放射フィルター＝５６０ＬＰ）及びフルオレセインフィルターセット（励起フィルター＝４９０、放射フィルター＝５２０）を備えたZeiss Axiovert 100倒立顕微鏡、及びスポットＣＣＤカメラを用いて視覚化した。画像は、４又は１６のゲイン設定で、０．１５〜０．６０秒の曝露時間で捕獲した。
別個で且つ特異的に標識され、トランスフェクションされた細胞は、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ及びＤｉＡｃ−ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ標識細胞の両方で明らかであった。細胞の多くはトランスフェクションされてない細胞であり、そしてそれらは標識を保持していなかった。
ＰＢＳは除去され、そして細胞は３．７％パラホルムアルデヒド／０．１％トリトン／ＰＢＳで１５分間固定された。固定剤は除去され、ＰＢＳが添加され、そして第二組の画像がＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ及びＤｉＡｃ−ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ標識細胞の両方で捕えられた。
ＰＢＳは５０％メタノール／ＰＢＳと交換され、そして細胞は１５分間インキュベートされ、続いて１５分間９５％メタノール中でインキュベーションされた。第三組の画像を捕え、そして次に等量のメタノールとアセトンの混合物を細胞に適用し、そして１５分間インキュベートした。培地をＰＢＳと交換し、そして第四組の画像を集めた。
結果は、ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃに対する基質の結合が、パラホルムアルデヒドでの固定、及びその後のメタノール及びアセトン中での固定化された細胞試料の処理の後に安定であったことを示唆した。更に、ＴＡＭＲＡ又はＦＡＭの蛍光の明るさは、これらの条件下で変化しなかった。
実施例ＶＩ
突然変異ベータラクタマーゼ（ｂｌａＺ）ベースのテザリング
細菌に対し、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を賦与する酵素セリン−β−ラクタマーゼは、恐らくセリン残基（Ambler et al. (1991)のクラスＡの共通の番号付けのスキームにおいてＳｅｒ７０）のヒドロキシル基を使用して、広範なβ−ラクタム化合物を分解する。反応は、共有結合前のエンカウンターコンプレックス(precovalent encounter complex)の形成から開始し（図２０Ａ）、そして高エネルギーのアシル化４面体中間体に進み（図２０Ｂ）、一過的に安定なアシル−酵素中間体を形成し、触媒的な残基であるＳｅｒ７０を通じてエステルを形成する（図２０Ｃ）。続いて、アシル−酵素は、加水分解性の水から攻撃を受け（図２０Ｄ）、高エネルギーの脱アシル化中間体を形成し（図２０Ｅ）(Minnasov et al., 2002)、これは崩壊して加水分解産物を形成する（図２０Ｆ）。当該産物は続いて追い出され、遊離酵素を再生する。セリンプロテアーゼで見られるように、この機構は、基質のアミド結合を攻撃するセリン求核試薬を活性化するのに触媒塩基を必要とし、そして、付加物のエステル中心に対する攻撃のための加水分解性の水を活性化するために、アシル酵素中間体のその後の形成を必要とする。
Ａ．突然変異体β−ラクタマーゼ及びその融合物
材料と方法
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ＰＣ１のｂｌａＺ遺伝子を宿しているプラスミドＰＴＳ３２(Zawadzke et al. , 1995)は、O. Herzberg博士(University of Maryland Biotechnology Institute)の好意により提供された。ｂｌａＺ遺伝子は以下の配列を有する：
Figure 0004748685
ＧＳＴ−ｂｌａＺ（ＷＴ及びＥ１６６Ｄ、Ｎ１７０Ｑ、又はＥ１６６Ｄ：Ｎ１７０Ｑ突然変異体）融合カセットは、ｂｌａＺ遺伝子内に点突然変異を導入し、そしてｂｌａＺコード領域をpGEX5x3ベクターのSalI/AgeI部位にクローニングすることにより構築した。内部の突然変異誘発プライマーは以下の通りである：
Figure 0004748685
 ２つの外部プライマー
Figure 0004748685
 は、ｂｌａＺの５’コード領域に対してＮ末端のＳａｌＩ部位及びＫｏｚａｋ共通配列を加え、ｂｌａＺの３’コード領域に対してＡｇｅＩ制限部位を加え、そしてｂｌａＺ．ＷＴ鋳型から８０６ｂｐのフラグメントを増幅するために設計した。生じたフラグメントを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子、第Ｘａ因子開裂部位をコードする配列、及びマルチクローニング部位（ＭＣＳ）、続いて、Ｆｌａｇ及び停止コドンをコードする配列、を含むｐＧＥＸ−５Ｘ−３のＳａｌＩ／ＡｇｅＩ部位に挿入した。これらの遺伝子融合コンストラクトは、ＤＮＡ配列決定で確認した。
ＧＳＴ−ｂｌａＺ（ＷＴ又は突然変異体）の融合タンパク質は、コンピテントＥ．コリＢＬ２１（λＤＥ３）細胞において過剰発現し、そしてＤｈａＡ及びＧＳＴ−ＤｈａＡ融合タンパク質について本質的に記載されているように精製した（リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）がバッファーＡの代わりに使用されたことを除く）。タンパク質の均質性はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
発色性の基質である６−β−［（フリルアクリロイル）アミド］ペニシラン酸トリエチルアミン塩（ＦＡＰ）をCalbiochem (La Jolla, CA)から購入した。ＦＡＰの加水分解を、Beckman Du640分光光度計(Beckman Coulter, Fullerton, CA).上での３４４ｎｍの吸光度の損失によりモニタリングされた。全てのアッセイが、２５℃で、ｐＨ６．８の０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液中で実施された。
ＣＣＦ２において、セファロスポリンのコアは、７−ヒドロキシクマリンをフルオレセインに結合させる。未処理の分子において、クマリンの励起（Ｅex−４０９ｎｍ）は、フルオレセインに対するＦＲＥＴをもたらし、これは緑色の光を発光する（Ｅem−５２０ｎｍ）。β−ラクタマーゼによるＣＣＦ２の開裂は、２つの色素の空間的分離をもたらし、クマリンの現在の励起が青色の蛍光（Ｅex−４４７ｎｍ）を生じさせるようにＦＲＥＴを崩壊させる。ＣＣＦ２は、Aurora Biosciences Corporation (San Diego, CA)から購入した。ＦＲＥＴシグナルの低下及び青色の蛍光の増大は、Fluorescence Multi-well Plate Reader CytoFluorII(PerSeptive Biosystems, Framingham,, USA)上で測定した。
結果
全てのβ−ラクタマーゼ、例えばスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ＰＣ１由来のβ−ラクタマーゼは、異なる化学構造のβ−ラクタムを加水分解する。加水分解の効率は酵素の型及び基質の化学構造に依存する。ペニシリンはスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ＰＣ１由来のβ−ラクタマーゼにとって好ましい基質と考えられる。
ペニシリンを加水分解するβ−ラクタマーゼの能力に対する点突然変異の効果は、Zawadzke et al. (1995)に記載の通り研究した。図２０に示す通り、ＧＳＴ−β−ラクタマーゼＰＣ１融合タンパク質は、ＦＡＰを効率的に加水分解した。blaZ.E166D, blaZ. N170Q又はblaZ. E166D :N170Q blaZ突然変異体による加水分解は、６０分の同時インキュベーションの後であっても検出されえない。従って、これらの突然変異体は、blaZの有意な不活性化を引き起こした。
blaZ.E166D, blaZ. N170Q又はblaZ. E166D :N170Q blaZ突然変異体がβ−ラクタマーゼと結合し、それ故に異なる官能基がβ−ラクタムを介してこれらのタンパク質にテザリングしうることを証明するために、これらの突然変異体のＧＳＴ融合物が、蛍光ペニシリンであるBOCELLINT（登録商標）FL (Molecular Probes Inc. , Eugene, OR).と一緒にインキュベートされた。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、そして蛍光撮像装置(Hitachi, Japan)により、特定のフルオロフォアに適切なＥex／Ｅemで解析した。図２２のデータは、全てのｂｌａＺがボセリンと結合することを示している。更に、ｂｌａＺ突然変異体と蛍光基質との間の結合は非常に強力であり、そして恐らく共有結合であり、これはＳＤＳとの煮沸、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥが結合を破壊しなかったためである。また、二重突然変異体blaZ. E166D:N170Qの結合効率（タンパク質結合フルオロフォアの蛍光シグナルの強度により判断される）は、単一突然変異体のいずれかの結合効率よりも遥かに高く、そしてblaZ. N170Qの結合効率はblaZ. E166Dの結合効率よりも高かった。これらのデータは、ベータ−ラクタムの加水分解における個々のアミノ酸の役割の現時点の理解と組み合わせて、追加の突然変異（例えば、補助的なアミノ酸の突然変異）は、突然変異タンパク質に対する官能基のテザリングの効率を向上することができることを示す。
セファロスポリンを加水分解するβ−ラクタマーゼの能力に対する点突然変異の効果はまた、Zlokarnik et al. (1998)により説明されているＦＲＥＴベースの基質であるＣＣＦ２を用いて研究された。図２３に示すように、ＧＳＴ−β−ラクタマーゼＰＣ１融合タンパク質がＣＣＦ２を効率的に加水分解した（レーン２）。単一の点突然変異（すなわちＥ１６６Ｄ又はＮ１７０Ｑ）は、ＣＣＦ２を加水分解する融合タンパク質の能力を低下させた（レーン３及び４）。２つのアミノ酸の置換（blaZ. E166D:N170Q突然変異体、レーン５）は、ＣＣＦ２の加水分解に対してより更に顕著な効果を有していた。しかしながら、全てのblaZ突然変異体がＣＣＦ２を加水分解することができた。
従って、１６６又は１７０位のアミノ酸置換、例えばＧｌｕ１６６Ａｓｐ又はＡｓｎ１７０Ｇｌｙは、突然変異β−ラクタマーゼが、基質を捕獲するのを可能にし、そしてそれ故に当該基質の官能基を、安定な結合、例えば共有結合を介して突然変異ベータ−ラクタマーゼにテザリングさせる。更に、Ｈ2Ｏの活性化に対して補助的な作用を有するアミノ酸の突然変異がテザリングの効率を増大させた。
実施例ＶＩＩ
生細胞の核及び細胞質に対するＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆのターゲティング
材料と方法
ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−ＮＬＳ３融合カセットは、ＮＬＳ３（シミアンウイルスラージＴ抗原由来の核局在化配列（ＮＬＳ）の３つのタンデム反復）をコードする配列をpCIneo. GFP-コネクター-DhaA. H272F-FlagベクターのAgeI/BamHI部位に挿入することで構築した。ＮＬＳ３ペプチドをコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチド
Figure 0004748685
 をアニーリングさせた。アニーリングしたＤＮＡは５’末端にＡｇｅＩ部位を、そして３’末端にＢａｍＨＩ部位を有していた。アニーリングしたＤＮＡをＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩ部位でＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇコンストラクトにサブクローニングした。遺伝子融合コンストラクトの配列をＤＮＡ配列決定で確認した。
ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−β−アレスチン２融合カセットは、ＧＦＰ2−β−アレスチン２(Packard #6310176-1F1)をコードするPackardのベクター内のｐＧＦＰ2コード領域をＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇのコード領域で置換することで構築した。２つのプライマー
Figure 0004748685
 は、ＤｈａＡの３’コード領域にＫｐｎＩ部位を追加し、そしてpGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag鋳型から９３０ｂｐのフラグメントを増幅するように設計された。ｐＧＦＰ2コード領域は、ＮｈｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で切り出し、続いてDhaA.H272Fをコードする９３０ｂｐのフラグメントをＧＦＰ2−β−アレスチン２コードベクターのＮｈｅＩ及びＫｐｎＩ部位に挿入した。融合コンストラクトの配列は、ＤＮＡ配列決定で確認した。
ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−ＮＬＳ３、ＧＦＰ2−β−アレスチン２又はＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−β−アレスチン２融合タンパク質を一過的に発現するＣＨＯ−Ｋ１又は３Ｔ３細胞は、ＬＴ−ＩＩチャンバー(Nunc)において３０，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングした。次の日、培地は、２５μＭのＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌを含む新鮮な培地と交換し、そして細胞をＣＯ2インキュベーター内に６０分間戻した。インキュベーションの終了時に、基質培地を除去し、細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄し、そして新しい培地を続いて細胞に添加した。細胞をＣＯ2インキュベーター内に戻し、そして６０分後に細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄した。細胞の蛍光画像は、ＧＦＰ及びＴＡＭＲＡの検出に適したフィルターセットを有する共焦点顕微鏡Pascal-5 (Carl Zeiss)上で撮影した。
結果
図２４の画像が示すように、ＧＦＰ及びＴＡＭＲＡは、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−ＮＬＳ３の細胞発現の細胞核に共局在化され、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌと接触された。
図２５の画像が示すように、ＧＦＰ−β−アレスチン２発現細胞は、典型的なβ−アレスチン２細胞質局在化を有する。ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−β−アレスチン２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのフルオロスキャンは、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−β−アレスチン２を発現している細胞に対する、ＴＡＭＲＡ含有ＤｈａＡ基質の強力な結合を示した。
実施例ＶＩＩＩ
ＤｈａＡ触媒残基１３０の部位指定突然変異誘発
ハロアルカンデハロゲナーゼは、炭素−ハロゲン結合の開裂に三段階の機構を使用する。この反応は、求核試薬、塩基及び酸から構成されるアミノ酸三残基により触媒され、これは、キサントバクター・アウトトロフィカス(Xanthobacter autotrophicus)由来のハロアルカンデハロゲナーゼの場合、それぞれ残基Ａｓｐ１２４、Ｈｉｓ２８９及びＡｓｐ２６０であり(Franken et al., 1991)、そしてロドコッカス(Rhodococcus)のデハロゲナーゼ酵素（ＤｈａＡ）においては、Ａｓｐ１０６、Ｈｉｓ２７２及びＧｌｕ１３０である(Newman et al., 1999)。
ハロアルカンデハロゲナーゼの求核試薬及び塩基性残基と異なり、触媒三残基の第三のメンバーの役割はまだ完全に理解されていない。触媒性の酸は、Ｈｉｓ残基と水素結合しており、そしてイミダゾール環の窒素の塩基性度を増大させることによりＨｉｓ残基をその機能において補助しうる。Krooshofらは(1997)、ＤｈｌＡの触媒性の酸Ａｓｐ２６０の役割を研究するために部位指定突然変異誘発を用いて、Ｄ２６０Ｎ突然変異体が触媒的に不活性であったことを証明した。更に、この残基は、一見、重要な構造的役割を有しているようであり、これは、突然変異タンパク質が主に封入体に蓄積していたためである。スフィノゴモナス・パウシモビリス(Sphinogomonas pauciynobilis)由来のハロアルカンデハロゲナーゼ（ＬｉｎＢ）は、γ−ヘキサクロロシクロヘキサンの分解に関与する酵素である(Nagata et al. , 1997)。Hynkovaらは(1999)、ＬｉｎＢの推定の触媒残基（Ｇｌｕ−１３２）をグルタミン（Ｑ）残基で置換した。しかしながら、Ｅ１３２Ｑ突然変異体の活性は、非常に高い基質濃度であっても観察されなかった。
タンパク質産生における、そして突然変異タンパク質が共有結合のアルキル−酵素中間体を蛍光標識ハロアルカン基質と形成する能力に対する、ＤｈａＡ触媒三残基のＧｌｕ１３０の役割を試験するために、部位指定突然変異誘発を利用して１３０位のＤｈａＡのグルタミン酸（Ｅ）残基をグルタミン、ロイシン及びアラニンで置換した。
材料と方法
菌株及びプラスミド。ウルトラコンピテントＥ．コリＸＬ１０ゴールド(Stratagene; Tetr Δ(mcrA) 183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relA1 lac Hte [F' proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr])を部位指定突然変異誘発反応の形質転換における宿主として使用した。Ｅ．コリ菌株JM109 (e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK-mK+) supE44 relA1Δ(lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZΔM15])を遺伝子発現及び細胞全体の酵素標識研究のための宿主として使用した。プラスミドpGEX5X3にクローニングしたGST-DhaA-FLAG遺伝子融合物は、pGEX5X3DhaAWT.FLAGと表し、Ｅ１３０突然変異誘発のための出発時の鋳型として使用した。ＤｈａＡにおいてＨ２７２Ｆの突然変異を含む突然変異プラスミドは、pGEX5X3DhaAH272F-FLAGと表し、標識研究におけるポジティブコントロールとして使用し、そしてクローニングベクターpGEX5X3はネガティブコントロールとして使用した。
ＤｈａＡのＥ１３０残基の部位指定突然変異誘発。突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドを以下に示す。下線を引いたヌクレオチドは、変化したコドンの位置を示す。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)により、１００ナノモルの規模で合成され、そして５’末端のリン酸化により修飾された。
Figure 0004748685
部位指定突然変異誘発は、QuikChange Multiキットを用い、製造業者の指示に従い実施した(Stratagene, La Jolla, CA)。突然変異誘発反応液をコンピテントＥ．コリＸＬ１０ゴールド細胞に導入し、そして形質転換体が、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢアガープレート上で選択された。個々の形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡは、グルタミン酸のコドンの置換（ＧＡＡｔｔｃ）に起因するＥｃｏＲＩの部位の消失について最初にスクリーニングされた。各反応に由来する所望のコドンの変化を含むと疑われるクローンが選択され、そしてＤＮＡ配列解析にかけられた(SeqWright, Houston, TX)。pGEX5X3ベクターにおける突然変異体の配列を確認するために使用したプライマーは以下の通りである：5'GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3'（配列番号４１）。
ＤｈａＡ突然変異体解析。３つのＤｈａＡ Ｅ１３０置換突然変異体は、以下のコンストラクトと比較された：野生型ＤｈａＡ、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ、及びＤｈａＡネガティブコントロール（pGEX5X3ベクターのみ）。各クローンの一晩培養物を、アンピシリン（１００μｇ／Ｌ）を含む２ｍＬのＬＢ中で振とうして３０℃で生育させた。当該一晩培養物は、５０ｍＬの新鮮なＬＢ培地及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む滅菌フラスコ中で１：５０に希釈した。当該培養物は、不溶性タンパク質種の産生を最小化するために、振とうしながら２５℃でインキュベートした。当該培養物が中期の対数期に達した場合（ＯＤ600＝０．６）、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を添加し、そして培養物を振とうしながら２５℃で更に２２時間インキュベートした。テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）ハロアルカン複合基質で細胞全体を標識するために、各培養物の細胞密度は、基質を１５μＭの濃度にまで添加する前に、ＯＤ600＝１に調節された。細胞は、穏やかに攪拌しながら４℃で約１８時間インキュベートした。インキュベーション後、各標識反応由来の２０μｌの細胞を６μｌの４ｘＳＤＳローディング色素に添加し、そしてこの試料は、４〜２０％アクリルアミドゲル（トリスグリシン）上に載せる前に、約３分間煮沸された。in vitroでの標識研究のために、ＩＰＴＧ誘導培養物の粗製可溶化液は、３ｍＬの細胞（ＯＤ600＝１）を回収し、そして生じたペレットを７５μＬのＰＢＳ中で再懸濁することで調製した。凍結／融解段階の後、１．２５ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む２２５μＬの１ＸCell Culture Lysis Reagent (Promega Corp. , Madison, WI)を添加して、細胞の可溶化を容易にした。各可溶化液の２０μＬの試料を２５μＬの１ＸＰＢＳと混合した。ＴＡＭＲＡ標識ハロアルカン基質を２５μＭの終濃度で添加した。標識反応液を室温で２時間インキュベートした。各標識反応液の２５μＬ試料を６μの４ＸＳＤＳローディング色素に添加され、そしてこの試料は４〜２０％アクリルアミドゲル（トリスグリシン）上に載せる前に、約３分間煮沸された。当該ゲルは、５７０ｎｍでの発光を検出するために設定されたFluorhnager SI装置(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いて画像化された。
細胞を含まない可溶化液は、粗製の可溶化液を１５分間１４，０００ＲＰＭで遠心することで生成させた。タンパク質の産生は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析でモニタリングした。ＰＶＤＦ膜にトランスファーしたタンパク質は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と複合した抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体(Sigma, St. Louis, MO)と一緒にインキュベートした。ブロットは、アルカリホスファターゼのためのウェスタンブルー安定化基質(Promega Corp. , Madison,WI)で展開した。
結果
アルキル−酵素中間体の加水分解におけるＤｈａＡの触媒性の酸の役割は、部位指定突然変異誘発で調査された。ＤｈａＡのコドンＥ１３０は、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）のコドンの置換が、酵素の構造に対し恐らく少なくとも破壊的であろうことからこれらで置換された。突然変異誘発の後、制限エンドヌクレアーゼスクリーニング及びＤＮＡ配列解析を使用して所望のコドンの変化を証明した。配列を確認したＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ及びＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａクローンは、それぞれＣ１、Ａ５及びＡ１２と表され、次の解析のために選択された。Ｅ１３０突然変異体は、タンパク質発現及びＴＡＭＲＡ標識ハロアルカン基質との共有結合アルキル−酵素中間体を形成するのそれらの能力について解析された。３つのＥ１３０遺伝子変異体は、ＩＰＴＧによる誘導の後、Ｅ．コリＪＭ１０９細胞において過剰発現した。粗製細胞可溶化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、野生型及び突然変異ｄｈａＡ遺伝子を発現する培養物がタンパク質をほぼ同レベルにまで蓄積したことを示した（図２６；レーン２，４，６，８，１０及び１２）。更に、野生型及びＨ２７２Ｆコンストラクトにより産生したＤｈａＡタンパク質は、大部分が可溶性であり、これはタンパク質の量が遠心後に感知できるほど変化しなかったためである（図２６；レーン３及び５）。ベクターのみのレーン（図２６；レーン６及び７）に存在する豊富な２２ｋＤａのタンパク質バンドは、ＧＳＴタンパク質を表している。しかしながら、これらの結果は、主に不溶性ＤｈａＡタンパク質を蓄積したようであるＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ及びＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ突然変異体と全く対照的である。この結論は、遠心後、細胞を含まない可溶化液に存在するＤｈａＡタンパク質量の有意な減少があった観察を基にしている（図２６；レーン９，１１，及び１３）。それにも関わらず、ＤｈａＡと一緒に移動するタンパク質バンドは、遠心後（＋ｓ）に各ＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体のレーンにおいてはっきりと観察され、これは可溶性酵素の存在を示唆している。ウェスタン解析は、それ故に、遠心後にＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体において観察されたタンパク質バンドが可溶性ＤｈａＡ材料を意味するのか否かを決定するために使用された。図２７に示すイムノブロットは、ＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体の細胞を含まない可溶化液のそれぞれにおける可溶性ＤｈａＡタンパク質の存在を確認した（レーン９，１１，及び１３）。
ＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体はまた、アルキル−酵素共有結合中間体を生成するそれらの能力についても試験された。種々のコンストラクトのＩＰＴＧ誘導培養物から調製した粗製可溶化液は、ＴＡＭＲＡ標識基質の存在下でインキュベートされた。図２８は、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体（レーン３）がこの中間体を生成するのに非常に効率的であったことを示した。そのような生成物はＷＴ ＤｈａＡ又はネガティブコントロールの可溶化液のいずれでも検出されえなかった。最初の試験で、ＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体は、検出可能なレベルの共有結合生成物を生成しないようであった。しかしながら、蛍光画像の精密検査の結果として、微量の共有結合中間体を潜在的に表し得る極度に弱いバンドが観察された（図２８；レーン５〜７）。これらの結果に基づき、細胞全体が共有結合の蛍光アルキル−酵素中間体を生成する能力が研究された。
図２９は、ＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体のそれぞれをポジティブコントロール（ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体）及びネガティブコントロール（ＤｈａＡ−）と比較したin vivoの標識実験結果を示す。予想されるように、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体は、ＧＳＴ−ＤｈａＡ−Ｆｌａｇ融合物の推定分子量付近の単一の蛍光バンド（図２９、レーン３）により証明されるように、共有結合アルキル−酵素中間体を生成することができた。in vitroでの標識の結果で既に観察されたように、前記生成物は野生型又はネガティブコントロールの培養物のいずれでも検出されなかったが（図２９、レーン２及び３）、正確な位置に移動している非常に弱い蛍光バンドが、３つ全てのＤｈａＡ．Ｅ１３０置換突然変異体で再び検出された（図２９、レーン５〜７）。これらの結果は、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ，Ｌ及びＡ突然変異体が共有結合アルキル−酵素中間体を捕捉する能力を有するという可能性を示している。しかしながら、この反応の効率は、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体酵素と比較して劇的に低下した速度で進むようである。
この突然変異誘発研究の結果は、ＤｈａＡの触媒性の酸性残基ＤｈａＡ．Ｅ１３０が、酵素の正確な折りたたみにおける重要な構造的役割を果たすことを示唆している。ＤｈａＡタンパク質は、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ及びＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ粗製可溶化液中の高度に不溶性のタンパク質複合体の存在が証明するように、このアミノ酸位の置換に対して明らかに感受性であった。それにも関わらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット解析に基づくと、有意な量の可溶性ＤｈａＡタンパク質が、３つ全てのＤｈａＡ．Ｅ１３０突然変異体の細胞を含まない可溶化液中で検出された。
実施例ＩＸ
生きている哺乳類細胞において発現したＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇウミシイタケルシフェラーゼ融合タンパク質の捕獲
材料と方法
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、２４穴プレート(Labsystems)において３０，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングされ、そしてpCIneo.DhaA.WT-Flag又はpCIneo.hRLuc-コネクター-DhaA.H272F-Flagベクターをトランスフェクションされた。２４時間後、培地は、２５μＭのビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ及び０．１％ＤＭＳＯ、又は０．１％ＤＭＳＯ単独を含む新鮮な培地と交換され、そして細胞をＣＯ2インキュベーター内に６０分間戻した。インキュベーションの終了時に、培地を除去し、細胞を素早くＰＢＳ（ｐＨ７．４；４回連続洗浄：１．０ｍｌ／ｃｍ2；各５秒）で洗浄し、そして新しい培地を続いて細胞に添加した。実験によっては、培地は交換しなかった。細胞をＣＯ2インキュベーター内に戻した。
６０分後、培地を除去し、そして細胞は、プロテアーゼ阻害剤(Sigma #P8340)を含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、２００μｌ／穴、ＲＴ）中に回収した。細胞は、針(IM1 23GTW)を通じて粉砕(trituriation)することで溶解した。続いて、細胞可溶化液をMagnaBindストレプトアビジンコーティングビーズ(Pierce #21344)と一緒に、製造業者のプロトコールに従いインキュベートした。要約すると、細胞可溶化液は、回転円盤を用いて、６０分間室温（ＲＴ）でビーズとインキュベートされた。未結合の材料を回収し；ビーズをＰＢＳで洗浄し（３ｘ５００μｌ、ｐＨ＝７．４、ＲＴ）、そしてＳＤＳ−サンプルバッファー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析用）又はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、Ｒ．Ｌｕｃ活性の決定用）中で再懸濁された。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロース膜にトランスファーされ、抗Ｆｌａｇ−Ａｂ又は抗Ｒ．Ｌｕｃ−Ａｂで解析され、そして結合した抗体が増強化学発光（ＥＣＬ）系(Pharmacia- Amersham)により検出された。ビーズに結合したｈＲ．Ｌｕｃの活性は、Promegaの「ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系」を用い、製造業者のプロトコールに従い決定された。
結果
生細胞において発現したタンパク質の捕獲は、様々な解析方法／技術によるこれらのタンパク質の解析を可能にする。多数の捕獲ツールが利用可能であるが、これらのツールの大部分が高度に特異的な抗体又は特異的なタグペプチド／タンパク質と遺伝子融合している注目のタンパク質の生成を必要とする(Jarvik and Telmer, 1998; Ragaut et al., 1999)。しかしながら、これらのタグは、生細胞の画像化にのみ用途が限定されている。ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆと融合した機能的タンパク質を捕獲するために、ＳＡ−コーティングビーズが使用された(Savage et al. , 1992)。
ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌは、野生型ＤｈａＡにより効率的に加水分解され、そして、in vitro及びin vivoで、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ融合タンパク質と共有結合した。更に、結合は、Ｅ．コリ及び哺乳類細胞の両方で観察された。対照実験は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現した約８０％のＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇタンパク質が６０分の処理後に標識されたことを示した。
ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇを一過的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理した。ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理した細胞は可溶化され、そして細胞可溶化液は、ＳＡ−コーティングビーズと一緒にインキュベートされた。ビーズに対するＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆの結合は、抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体を用いたウェスタンブロットにより解析された。図３０Ｄに示すように、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇの捕獲は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ処理無しでは検出されなかった。同時に、細胞で発現した５０％超のＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇが、細胞をビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理した場合にＳＡ−コーティングビーズ上で捕獲された。
ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇと融合した機能的に活性なタンパク質の捕獲を証明するために、hRLuc-コネクター-DhaA.H272F-Flagをコードするベクターを細胞にトランスフェクションし、そしてビーズ上で捕獲されたルシフェラーゼ活性を測定した。図３０Ｃに示すように、有意なルシフェラーゼ活性が、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ処理細胞の可溶化液と一緒にインキュベートされたビーズ上で検出された。同時に、ルシフェラーゼ活性は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理しなかった細胞由来の可溶化液と一緒にインキュベートされたビーズ上で検出されなかった。更に、hR.Luc活性は、遊離ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌが洗い落とされなかった場合、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理しなかった細胞由来の可溶化液と一緒にインキュベートされたビーズ上で検出されなかった。
総合すると、これらのデータは、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆと融合した機能的に活性なタンパク質(hR.Luc)が、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ及びＳＡ−コーティングビーズを用いて効率的に捕獲されえないことを示している。捕獲はビオチン依存的であり、そして過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌにより拮抗を失わせること(competed-off)ができる。hR.Luc活性に対するビーズの有意な阻害作用が観察された場合（データは示さない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗R.Luc抗体を用いたウェスタンブロット解析を使用して、hRLuc-コネクター-DhaA.H272F-Flag融合タンパク質の捕獲効率を推定した。図３０Ｄに示す通り、５０％超のhRLuc-コネクター-DhaA.H272F-Flag融合タンパク質がビオチン依存的に捕獲されうる。これは、DhaA.H272F-Flagの捕獲効率と十分一致している（図３０Ａを参照のこと）。
実施例Ｘ
最適化されたＤｈａＡ遺伝子
ＤｈａＡの通常配列の設計
ヒトコドンバイアス、低ＧＣ含量、選択された制限酵素認識部位及び低下した数の転写制御部位を有する合成ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ遺伝子が調製された。シグナル配列を欠いている野生型ＤｈａＡ遺伝子（配列番号４８）によりコードされるアミノ酸配列、及び／又はＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆと比較して、コドン最適化ＤｈａＡ遺伝子及び隣接配列のアミノ酸配列は、１）改良Ｋｏｚａｋ配列(GCCACCATGG;配列番号４２)及びBamHI部位の導入により２位に挿入されたＧｌｙ（従って、Ｇｌｙを挿入されたＤｈａＡ突然変異体におけるＨ２７２Ｆ活性部位突然変異は２７３位でされている）；２）Ｇｌｙを挿入されたＤｈａＡ突然変異体において、２９３位でなされているSmaI/Xmal/AvaI部位の導入に起因するＡ２９２Ｇ置換；３）NaeI (NgoMIV)部位の導入に起因する、Ｃ末端へのＡｌａ−Ｇｌｙの付加；４）５’隣接配列におけるNheI, PvuII, EcoRV及びNcoI部位の付加；５）最終的にサーチアルゴリズムエラーを排除し、そしてＯＲＦ１（すなわち、NNN-NGC-TAG-CCA-GCT-GGC-GAT-ATC-GCC-ACC-ATG- GGA；配列番号４３）を維持するための、５’隣接配列におけるＮＮＮＮの付加；６）３’末端のNotI部位、最終的にサーチアルゴリズムエラーを排除するためのＮＮＮＮの付加、ＯＲＦ Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓを有するPacI部位、及び少なくとも一方がＴＡＡである２つの停止コドン（すなわち、TAATAGTTAATTAAGTAAGCGGCCGCNNNN；配列番号４４）、を有していた。
配列番号４８は以下の配列を有する：
コドン選択
コドン使用頻度データは、Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)から入手し、これは、２００２年８月１５日のGenBank Release131.0 (Nakamura et al. , 2000を参照のこと)。コドン使用頻度の表は、HS: ホモサピエンス[gbpri] 50,031 CDS (21,930,294コドン); MM :マウス(Mus musculus)[gbrod] 23,113CDS (10,345,401コドン); EC:エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli) [gbbct]11,985 CDS (3,688,954コドン);及びEC K12: エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli) K12 [gbbct] 4,291 CDS (1,363,716コドン)についてダウンロードした。HSとMMを比較し、そして密接に類似していることが明らかとなったため、EC K12の表が利用された。
コドンを選択するための全体的なストラテジーは、コドン使用頻度を哺乳類細胞における最適な発現に適合させ、同時に、低使用頻度のＥ．コリのコドンを回避することであった。１つの「最高」のコドンが各アミノ酸について選択され、そして所望のタンパク質配列をバックトランスレーションして出発時の遺伝子配列を生成させるために使用された。別の選択基準は、ＣＧのメチル化が転写性の遺伝子制御に関与しており、そして安定な細胞系における遺伝子発現のダウンレギュレートを引き起こしうるので、ＣＧジヌクレオチドを含む高使用頻度のHSコドンを回避することであった。従って、ＣＧを含む全てのコドン（８個のヒトのコドン）及びＴＡ（４個のヒトのコドン、Ｔｙｒコドンを除く）が排除された。Ｃで終わるコドンも、それらが下流のコドンとＣＧを形成しうるので回避された。若干低い使用頻度を有するコドンがＥ．コリにおいて実質的に高い使用頻度を有していない限り、残りのコドンの中でも、HSにおいて最高の使用頻度を有するものが選択された。
ＤｈａＡ遺伝子配列
出発時のＤｈａＡ配列を生成させるために、Vector NTI 8.0(Informax)におけるコドン使用頻度表が利用された。ＤｈａＡ．ｖ２．１タンパク質配列（配列番号４５）をバックトランスレーションし、出発時の遺伝子配列hDhaA. v2.1-0を作り出し、そして隣接領域が続いて上述のように付加され、hDhaA. v2.1-0F（配列番号４６）が作り出された。
Figure 0004748685
更なる最適化
配列モチーフの同定及び除去に使用したプログラム及びデータベースは、Genomatix Software GmbH (Munich, Germany, http://www.genomatix.de) : GEMS Launcher Release 3.5. 1 (April 2003),MatInspector professional Release 6.1 (２００３年１月), Matrix Family Library Ver 3.1. 1 (２００３年４月、１２８のファミリーにおいて３１８の脊椎動物のマトリックスを含む)、ModelInspector professional Release 4.8 (２００２年１０月)、Model Library Ver 3.1 (２００３年３月、２２６のモジュール)、SequenceShaper tool、及びUser Defined Matricesのものである。優先順位に従って出発時の遺伝子配列から除去される配列モチーフは、以下に列記する制限酵素認識配列；デフォルトスコア超のプロモーターモジュールを含む転写因子結合配列（すなわち、規定の配向を有する２つの転写因子結合部位）、及び最小スコア＝０．７５／マトリックス＝最適化済みの脊椎動物の転写因子結合配列；真核生物の転写制御部位、例えばＫｏｚａｋ配列、スプライスドナー／アクセプター配列、ポリＡ付加配列；並びに原核生物転写制御配列、例えばＥ．コリプロモーター及び、Ｍｅｔコドンから２０ｂｐ未満上流の場合、Ｅ．コリＲＢＳ、であった。
ユーザー定義マトリックス
サブセットＤｈａＡ
フォーマット：マトリックス名（コアの類似性の閾値／マトリックスの類似性の閾値）：U$AatII (0.75/1.00), U$BamHI (0.75/1.00), U$Bg1I (0.75/1.00), U$Bg1II (0.75/1.00), U$BsaI (0.75/1. 00), U$BsmAI (0.75/1.00), U$BsmBI (0.75/1.00), U$BstEII (0.75/1.00),U$BstXI (0.75/1.00), U$Csp45I (0.75/1.00), U$CspI (0.75/1.00), U$DraI (0.75/1.00), U$EC-P-10 (1.00/最適化済み), U$EC- P-35 (1.00/最適化済み), U$EC-Prom (1.00/最適化済み), U$EC-RBS (0.75/1.00), U$EcoRI (0.75/1. 00), U$EcoRV (0.75/1.00), U$HindIII (0.75/1. 00), U$Kozak (0.75/最適化済み), U$KpnI (0.75/1.00), U$M1uI (0.75/1.00), U$NaeI (0.75/1.00), U$NcoI (0.75/1. 00), U$NdeI (0.75/1.00), U$NheI (0.75/1.00), U$NotI (0.75/1.00), U$NsiI (0.75/1.00), U$PacI (0.75/1.00), U$PflMI (0.75/1.00), U$PmeI (0.75/1.00), U$PolyAsig (0.75/1.00), U$PstI (0.75/1.00), U$PvuII (0.75/1.00), U$SacI (0.75/1.00), U$SacII (0.75/1. 00), U$Sa1I (0.75/1. 00), U$SfiI (0.75/1.00), U$SgfI (0.75/1.00), U$SmaI (0.75/1.00), U$SnaBI (0.75/1.00), U$SpeI (0.75/1.00), U$Splice-A (0.75/最適化済み), U$Splice-D (0.75/最適化済み), U$XbaI (0.75/1.00), U$XcmI (0.75/1.00), U$XhoI (0.75/1.00), 及び全ての脊椎動物のlib.
サブセットＤｈａＡ−ＥＣ
Ｅ．コリ特異的な配列無し：U$AatII (0.75/1.00), U$BamHI (0.75/1.00),U$BglI (0.75/1.00),U$BglII (0.75/1.00), U$BsaI (0.75/1.00), U$BsmAI (0.75/1.00), U$BsmBI (0.75/1.00), U$BstEII (0.75/1.00), U$BstXI (0.75/1.00), U$Csp45I (0.75/1.00), U$CspI (0.75/1.00), U$DraI (0.75/1.00), U$EcoRI (0.75/1.00), U$EcoRV (0.75/1.00), U$HindIII (0.75/1.00), U$Kozak (0.75/最適化済み), U$KpnI (0.75/1.00), U$MluI (0.75/1.00), U$NaeI (0.75/1.00), U$NcoI (0.75/1.00), U$NdeI (0.75/1.00), U$NheI (0.75/1.00), U$NotI (0.75/1.00), U$NsiI (0.75/1.00), U$PacI (0.75/1.00), U$PflMI (0.75/1.00), U$PmeI (0.75/1.00), U$PolyAsig (0.75/1.00), U$PstI (0.75/1.00), U$PvuII (0.75/1.00), U$SacI (0.75/1.00),U$SacII (0.75/1.00), U$Sa1I (0.75/1.00), U$SfiI (0.75/1.00), U$SgfI (0.75/1.00), U$SmaI (0.75/1.00), U$SnaBI (0.75/1.00), U$SpeI (0.75/1.00), U$Splice-A (0.75/最適化済み), U$Splice-D (0.75/最適化済み), U$XbaI (0.75/1.00), U$XcmI (0.75/1.00), U$XhoI (0.75/1.00), 及び全ての脊椎動物のlib.
配列モチーフの除去のストラテジー
上文で特定した不所望の配列モチーフは、特定のタンパク質及び隣接配列の保持を可能にした代替コドンを選択することにより出発時の遺伝子配列から除去された。代替コドンは、出来る限り全体的なコドン選択ストラテジーに適合するように選択された。
Ａ．一般的なステップ
−MatInspectorを用い、マトリックスファミリーサブセット「DhaA」又は「DhaA-EC」を使用し、そしてModellnspectorを用い、デフォルト設定を使用して、不所望な配列一致を同定すること。
−可能性のある置換コドンを同定してSequenceShaperを用いて不所望な配列一致を除去すること（ＯＲＦを維持する）。
−全ての変化を合成遺伝子配列の新しいバージョンに組み込み、そしてMatInspector及びModellnspectorで再解析すること。
Ｂ．特定のステップ
−サブセット「DhaA-EC」及びSequenceShaperのデフォルトの残りの閾値（０．７０／Ｏｐｔ−０．２０）を用いて不所望な配列一致を除去すること。
−このアプローチで除去されえない配列一致のために、より低いSequenceShaperの残りの閾値（例えば、０．７０／Ｏｐｔ−０．０５）を使用すること。
−尚も除去されえない配列一致のために、人の手で選択された置換コドンの異なる組み合わせを試すこと（特に、３塩基超の変化が必要とされうる場合）それが新規な配列一致を導入する場合、上記ステップを用いてそれらを除去するよう試すこと（出発時の配列が異なると、時に、異なる除去の解決法が可能となる）。
−サブセット「DhaA」を使用して、問題のあるＥ．コリ配列モチーフが導入されたか否かを調べ、そしてもしそうであるならば、非Ｅ．コリ配列について上文で記載したものと同様のアプローチを用いてそれらを除去するよう試すこと。
隣接（非オープンリーディングフレーム）配列についても同様のストラテジーを使用する。
Ｃ．推定のＣｐＧ島の同定及び除去
使用したソフトウェア：EMBOSS CpGPlot / CpGReport
http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html) (Gardiner-Garden et al., 1987を参照のこと)。
パラメーター：デフォルト（変更済み）：ウィンドウ：１００；ステップ：１；Ｏｂｓ／Ｅｘｐ：０．６；ＭｉｎＰＣ：５０；長さ：１００；リバース：無し；相補体(Complement)：無し。不所望な配列モチーフの除去の後、遺伝子配列は、上述のソフトウェアを用いて、少なくとも１００塩基の推定のＣｐＧ島について調べられた。ＣｐＧ島が同定された場合、それらは、ＣＧジヌクレオチドの幾つかの位置にある、特定のタンパク質及び隣接配列の保持を可能にしたが、新規の不所望な配列モチーフを導入しなかった代替コドンを選択することにより除去された。
Ｄ，制限部位
独特のMunI/MfeI(C'AATTG)部位が導入され、Ｃ末端付近の推定のミリスチル化部位（ＧＳＥＩＡＲ）を含むＣ末端３４アミノ酸の除去が可能となった。別の独特の部位、NruI部位が導入され、Ｃ末端の８０〜１００アミノ酸の除去が可能となった。
hDhaA. v2.1-6F（最終。隣接配列を有する）
Figure 0004748685
異なるＤｈａＡ遺伝子（隣接配列無し）の核酸配列同一性の比較を表ＩＩＩに示す。
Figure 0004748685
 a２位にＧｌｙが付加されている。Ｈ２７２Ｆ。Ａ２９２Ｇ。Ｃ末端にＡｌａ−Ｇｌｙが付加されている。
bコドンが最適化されている。
異なるＤｈａＡ遺伝子（隣接領域無し）のＧＣ含量を表ＩＶに提示する。
Figure 0004748685
異なるＤｈａＡ遺伝子で見られる脊椎動物の転写因子結合配列ファミリー（コアの類似性：０．７５／マトリックスの類似性：ｏｐｔ）及びプロモーターモジュール（デフォルトパラメーター：最適化された閾値又は最大のスコアの８０％）を表Ｖに示す。
Figure 0004748685
注記：３’隣接領域における５’結合配列の一致を除去するためにhDhaA. v2.1-OF及びhDhaA. v2.1-6FのEcoRVの前に３ｂｐ挿入がある。
hDhaA. v2.1-6Fにおける残りの転写因子結合配列の一致は、５’隣接領域において：ファミリー：V$NEUR (NeuroD, Beta2, HLHドメイン)、最高の一致：NEUROD1のＤＮＡ結合部位(BETA-2/E47 dimer) (MEDLINE 9108015)；オープンリーディングフレームにおいて：ファミリー：V$GATA (GATA結合因子)、最高の一致：GATA結合因子１(MEDLINE 94085373)、ファミリー：V$PCAT (プロモーターCCAAT結合因子)、最高の一致：細胞性及びウイルスのCCAATボックス、(MEDLINE 90230299)、ファミリー：VSRXRF(RXR ヘテロ二量体結合部位)、最高の一致：ファルネソイドＸ受容体(RXR/FXR二量体) (MEDLINE 11792716)；そして３’隣接領域において：ファミリー：V$HNF1 （肝細胞核因子１）、最高の一致：肝細胞核因子１ (MEDLINE 95194383)、ファミリー：V$BRNF(Brn POUドメイン因子)、最高の一致：POU転写因子Brn-3 (MEDLINE 9111308)、ファミリー：V$RBIT（Ｂ細胞のＩｇＨ転写制御因子）、最高の一致：ＩｇＨ転写の明るい(Bright)Ｂ細胞制御因子 (MEDLINE96127903)、ファミリー：V$CREB (Camp-応答因子結合タンパク質)、最高の一致：E4BP4, bZIPドメイン、転写抑制因子 (MEDLINE92318924)、ファミリー：V$HOMS（ホモドメインサブファミリーＳ８）、最高の一致：Ｓ８型のホモドメインの結合部位 (MEDLINE94051593)、ファミリー：V$NKXH (NKX/DLX-ホモドメイン部位)、最高の一致：DLX-1, -2, 及び-5 結合部位 (MEDLINE 11798166)、ファミリー：V$TBPF (Tata- 結合タンパク質因子)、最高の一致：トリＣ型LTR TATAボックス(MEDLINE 6322120)、及びファミリー：V$NKXH (NKX/DLX-ホモドメイン部位)、最高の一致：前立腺特異的ホモドメインタンパク質NKX3.1 (MEDLINE10871372)を含んだ。
オープンリーディングフレームのhDhaA. v2.1-6Fに残っている他の配列モチーフは、Ｅ．コリの場合、タンパク質配列（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ：ＡＡ（Ａ／Ｇ）−ＧＧＮ）の保持により除去されなかったＭｅｔコドンの１１塩基上流のＲＢＳ（ＡＡＧＧ）、及び転写因子結合部位配列の導入により除去されなかったＢｓｍＡＩ制限部位（ＧＴＣＴＣ）、であった。
ＤｈａＡ遺伝子のそれぞれのコード配列における推定のＣｐＧ島は、EMBOSS CpGPlot/CpGReportのように、デフォルトパラメーターで解析され、そして結果を表ＶＩに示す。
Figure 0004748685
Figure 0004748685
Figure 0004748685
Figure 0004748685
全ての刊行物、特許及び特許出願書類が引用により本明細書に組み入れられる。先の明細書において、本発明はそれらの幾つかの好ましい態様に関して記載され、そして多くの詳細な事柄を例示目的で記載したが、当業者にとっては、本発明が更なる態様を受け入れる余地があり、そして本明細書に記載した詳細な事柄の幾つかが、本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変更されうることは自明であろう。
図１は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)デハロゲナーゼの触媒三残基における、アルキルハロゲン化物基質との反応図である。 図２は、野生型ＤｈａＡロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)デハロゲナーゼ及び４つの突然変異ＤｈａＡ（Ｈ２８３Ｑ、Ｇ、Ａ又はＦ）の三次元モデルを示す。シアンのリボンは、このタンパク質の結晶構造を基にしたＤｈａＡ．ＷＴの三次元モデルである (Newman et al., 1999)（パネルＡ）。パープルのリボンはＨ２７２Ｑ、Ｈ２７２Ｇ及びＨ２７２Ａ突然変異体の三次元モデル（パネルＡ）、又はＨ２７２Ｆ突然変異体の三次元モデル（パネルＢ）である。３つの三次元モデルは、分子確率密度関数の算出、続く、制限付きの焼き鈍し(Stimulated Annealing)分子動力学（ＭＤ）スキームを含む複数の最適化段階、により生成された。三次元モデリングは、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓのコンピューターステーション上でＩｎｓｉｇｈｔＩＩのソフトウェア（米国）を用いて実施した。 図２は、野生型ＤｈａＡロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)デハロゲナーゼ及び４つの突然変異ＤｈａＡ（Ｈ２８３Ｑ、Ｇ、Ａ又はＦ）の三次元モデルを示す。シアンのリボンは、このタンパク質の結晶構造を基にしたＤｈａＡ．ＷＴの三次元モデルである (Newman et al., 1999)（パネルＡ）。パープルのリボンはＨ２７２Ｑ、Ｈ２７２Ｇ及びＨ２７２Ａ突然変異体の三次元モデル（パネルＡ）、又はＨ２７２Ｆ突然変異体の三次元モデル（パネルＢ）である。３つの三次元モデルは、分子確率密度関数の算出、続く、制限付きの焼き鈍し(Stimulated Annealing)分子動力学（ＭＤ）スキームを含む複数の最適化段階、により生成された。三次元モデリングは、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓのコンピューターステーション上でＩｎｓｉｇｈｔＩＩのソフトウェア（米国）を用いて実施した。 図３は、野生型及び突然変異ＤｈａＡタンパク質の精製を示す。ＧＳＴ−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（奇数レーン）及びＧＳＴ−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（偶数レーン）の融合タンパク質は、可溶性であり、且つＧＳＳ−セファロース４ＦＦ上で効率的に精製されていることが明らかとなった（レーン３及び４−粗製Ｅ．コリ上清；レーン５及び６−洗浄液；レーン７〜１０−精製タンパク質）。第Ｘａ因子による融合タンパク質の処理は、２つのタンパク質ＧＳＴ及びＤｈａＡの形成をもたらした（ＷＴ又は突然変異体；それぞれレーン１１、１２）。更に、ＧＳＴはＧＳＳ−セファロース４ＦＦ上で効率的に除去された（ＷＴ又は突然変異体；それぞれレーン１３、１４）。全てのタンパク質が推定の分子量を有していた。 図４は、野生型ＤｈａＡ及び突然変異ＤｈａＡによる１−Ｃｌ−ブタンの加水分解を例示する。 図５は、種々の濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4によるＤｈａＡ．ＷＴ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ／Ａ／Ｇ／Ｑ突然変異体の沈殿を示す。レーン１，５及び９、０％（ＮＨ4）2ＳＯ4；レーン２，６及び１０、１０％（ＮＨ4）2ＳＯ4；レーン３，７及び１１、１０〜４５％（ＮＨ4）2ＳＯ4；レーン４，８及び１２、４５〜７０％（ＮＨ4）2ＳＯ4。パネル：レーン１〜４、ＤｈａＡ．ＷＴ；レーン５〜８、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｇ；及びレーン９〜１２、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｑ。パネルＢ：レーン１〜４、ＤｈａＡ．ＷＴ；レーン５〜８、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ；及びレーン９〜１２、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ａ。 図５は、種々の濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4によるＤｈａＡ．ＷＴ及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ／Ａ／Ｇ／Ｑ突然変異体の沈殿を示す。レーン１，５及び９、０％（ＮＨ4）2ＳＯ4；レーン２，６及び１０、１０％（ＮＨ4）2ＳＯ4；レーン３，７及び１１、１０〜４５％（ＮＨ4）2ＳＯ4；レーン４，８及び１２、４５〜７０％（ＮＨ4）2ＳＯ4。パネル：レーン１〜４、ＤｈａＡ．ＷＴ；レーン５〜８、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｇ；及びレーン９〜１２、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｑ。パネルＢ：レーン１〜４、ＤｈａＡ．ＷＴ；レーン５〜８、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ；及びレーン９〜１２、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ａ。 図６は、野生型ＤｈａＡの基質特異性を表す。フェノールレッドベースのアッセイ（Ｅ558）を用いて、反応初速度は、酵素添加後最初の６０秒間で、４回の１５秒の読み取りにより決定した。 図７は、官能基（例えば、５−（及び６−）−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、Ａｎｔｈ（アントラセン）又はビオチン）及びリンカーを含むＤｈａＡの基質を示す。 図８Ａは、野生型ＤｈａＡによるＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ加水分解産物のＨＰＬＣ分離を示す。 図８Ｂは、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの野生型ＤｈａＡ加水分解により時間とともに生成した産物のＨＰＬＣ解析（基質のパーセンテージとして）を示す。 図９は、野生型ＤｈａＡ（パネルＡのレーン１，３及び５並びにパネルＢのレーン１〜８）及び突然変異ＤｈａＡ（ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ）；（パネルＡのレーン２，４及び６並びにパネルＢのレーン９〜１４）と、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン１及び２）；ＲＯＸ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン３及び４）；ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン５及び６）；又はビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（パネルＢ）との結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。パネルＢのビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌの濃度：０μＭ（レーン１及び８）、１２５μＭ（レーン２及び９）、２５μＭ（レーン３及び１０）、５μＭ（レーン４及び１１）、１μＭ（レーン５〜１２）、０．２μＭ（レーン６及び１３）、及び０．０４μＭ（レーン７及び１４）。 図９は、野生型ＤｈａＡ（パネルＡのレーン１，３及び５並びにパネルＢのレーン１〜８）及び突然変異ＤｈａＡ（ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ）；（パネルＡのレーン２，４及び６並びにパネルＢのレーン９〜１４）と、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン１及び２）；ＲＯＸ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン３及び４）；ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡのレーン５及び６）；又はビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（パネルＢ）との結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。パネルＢのビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌの濃度：０μＭ（レーン１及び８）、１２５μＭ（レーン２及び９）、２５μＭ（レーン３及び１０）、５μＭ（レーン４及び１１）、１μＭ（レーン５〜１２）、０．２μＭ（レーン６及び１３）、及び０．０４μＭ（レーン７及び１４）。 図１０は、基質であるビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌによる突然変異ＤｈａＡの前処理が、別の基質の結合を防ぐことを示す。ＤｈａＡ．ＷＴ−レーン１及び２；ＤｈａＡ．Ｈ２７２突然変異体：Ｆ、レーン３及び４；Ｇ、レーン５及び６；Ａ、レーン７及び８；並びにＱ、レーン９及び１０．試料２，４，６，８，及び１０はビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで前処理した。 図１１は、酵素基質複合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を示す、ＦＡＭ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−ＣｌとインキュベートしたＧＳＴ−ＤｈａＡ．ＷＴ又はＧＳＴ−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆの質量スペクトルを示す。 図１２は、残基１０６に置換を有するＤｈａＡ突然変異体、残基１０６及び残基２７２に置換を有するＤｈａＡ突然変異体の、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌに対する結合特性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を例示する。３２μｌ中２μｇのタンパク質及び２５μＭのＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌを室温で１時間インキュベートした。１０μｌの各反応液をレーンごとに添加した。レーン１−ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ；レーン２−ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｃ：Ｈ２７２Ｆ；レーン３−ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ；レーン４−ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｅ：Ｈ２７２Ｆ；レーン５−ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｑ；レーン６−ＤｈａＡ．Ｄ１０６Ｑ：Ｈ２７２Ｆ；レーン７−ＤｈａＡ．ＷＴ；及びレーン２−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ。ゲルは５７０ｎｍフィルターで撮像した。 図１３は、固体支持体（ストレプトアビジンでコーティングしたプレート）にテザリングしたルシフェラーゼと突然変異ＤｈａＡの融合物を有する試料中のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性を表す。融合物の捕獲は、ＤｈａＡの基質（すなわち、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ）を用いて達成した。ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼと野生型ＤｈａＡの融合物を有する画分には活性は見られなかった。 図１４は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡ）又はＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＢ）を用いてin vivoで処理した、野生型ＤｈａＡ（ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ、各パネルのレーン１〜４）又は突然変異ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ（ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ、各パネルのレーン５〜７）のいずれかを発現するＥ．コリ(E. coli)の２倍連続希釈液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。矢印は、ＤｈａＡ−ＦｌａｇのＭrに相当するＭrを有するタンパク質を示す。 図１４は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（パネルＡ）又はＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（パネルＢ）を用いてin vivoで処理した、野生型ＤｈａＡ（ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ、各パネルのレーン１〜４）又は突然変異ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ（ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ、各パネルのレーン５〜７）のいずれかを発現するＥ．コリ(E. coli)の２倍連続希釈液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。矢印は、ＤｈａＡ−ＦｌａｇのＭrに相当するＭrを有するタンパク質を示す。 図１５は、真核細胞タンパク質に対するin vivoでのＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの結合を示す。ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（レーン１〜４）又はＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（レーン５〜８）のいずえｒかを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞由来のタンパク質の２倍連続希釈液をＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。矢印は、ＤｈａＡ−ＦｌａｇのＭrに相当するＭrを有するタンパク質を示す。 図１６は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの透過性を例示する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａ、明視野像）をＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、５分間、３７℃）で処理し、そしてＰＢＳで迅速に処理した（パネルＢ）。パネルＣは、洗浄手順後の細胞を示す。 図１６は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの透過性を例示する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａ、明視野像）をＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、５分間、３７℃）で処理し、そしてＰＢＳで迅速に処理した（パネルＢ）。パネルＣは、洗浄手順後の細胞を示す。 図１６は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌの透過性を例示する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａ、明視野像）をＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、５分間、３７℃）で処理し、そしてＰＢＳで迅速に処理した（パネルＢ）。パネルＣは、洗浄手順後の細胞を示す。 図１７は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞の画像を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（パネルＡ〜Ｃ）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（パネルＤ〜Ｆ）をコードするＤＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。パネルＡ、Ｄ−明視野；パネルＢ、Ｅ−ＧＦＰフィルターセット；及びパネルＣ、Ｆ−ＴＡＭＲＡフィルターセット。 図１７は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞の画像を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（パネルＡ〜Ｃ）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（パネルＤ〜Ｆ）をコードするＤＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。パネルＡ、Ｄ−明視野；パネルＢ、Ｅ−ＧＦＰフィルターセット；及びパネルＣ、Ｆ−ＴＡＭＲＡフィルターセット。 図１７は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞の画像を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（パネルＡ〜Ｃ）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（パネルＤ〜Ｆ）をコードするＤＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。パネルＡ、Ｄ−明視野；パネルＢ、Ｅ−ＧＦＰフィルターセット；及びパネルＣ、Ｆ−ＴＡＭＲＡフィルターセット。 図１７は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞の画像を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（パネルＡ〜Ｃ）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（パネルＤ〜Ｆ）をコードするＤＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。パネルＡ、Ｄ−明視野；パネルＢ、Ｅ−ＧＦＰフィルターセット；及びパネルＣ、Ｆ−ＴＡＭＲＡフィルターセット。 図１７は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞の画像を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（パネルＡ〜Ｃ）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（パネルＤ〜Ｆ）をコードするＤＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。パネルＡ、Ｄ−明視野；パネルＢ、Ｅ−ＧＦＰフィルターセット；及びパネルＣ、Ｆ−ＴＡＭＲＡフィルターセット。 図１７は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇをトランスフェクションした細胞の画像を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（パネルＡ〜Ｃ）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（パネルＤ〜Ｆ）をコードするＤＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで処理した。パネルＡ、Ｄ−明視野；パネルＢ、Ｅ−ＧＦＰフィルターセット；及びパネルＣ、Ｆ−ＴＡＭＲＡフィルターセット。 図１８は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ（レーン１〜４）又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ（レーン５〜８）でトランスフェクションした細胞由来のタンパク質のウェスタンブロットを示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ又はＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇで処理され、続いて、ＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ）で０，５，１５又は６０分間処理し、ＰＢＳ（４ｘ１０ｍｌ）で洗浄し、そしてＳＤＳ−サンプルバッファー中に回収した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして蛍光撮像装置上で解析した。レーン１〜４、０，５，１５又は６０分間それぞれ処理したＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．ＷＴ−Ｆｌａｇ。レーン５〜８、０，５，１５又は６０分間それぞれ処理したＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇ。矢印は、ＤｈａＡ−ＦｌａｇのＭrに相当するＭrを有するタンパク質を示す。 図１９は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞について選択した基質（パネルＡ、ＴＡＭＲＡ及びパネルＢ、ＲＯＸ）の毒性を例示する。 図１９は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞について選択した基質（パネルＡ、ＴＡＭＲＡ及びパネルＢ、ＲＯＸ）の毒性を例示する。 図２０は、セリンベータラクタマーゼの反応スキームを例示する。当該反応は、共有結合前のエンカウンターコンプレックス(precovalent encounter complex) の形成から開始し（図２０Ａ）、そして高エネルギーのアシル化４面体中間体に進み（図２０Ｂ）、一過的に安定なアシル−酵素中間体を形成し、触媒的な残基であるＳｅｒ７０を通じてエステルを形成する（図２０Ｃ）。続いて、アシル−酵素は、加水分解性の水から攻撃を受け（図２０Ｄ）、高エネルギーの脱アシル化中間体を形成し（図２０Ｅ）(Minnasov et al., 2002)、これは崩壊して加水分解産物を形成する（図２０Ｆ）。当該産物は続いて追い出され、遊離酵素を再生する。 図２１は、ＧＳＴ−ｂｌａＺによる経時的なＦＡＰの加水分解を示す。 図２２は、ＧＳＴとｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ、ｂｌａＺ．Ｎ１７０Ｑ又はｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ：Ｎ１７０Ｑの融合物に対するボセリン(bocellin)の結合を示す。レーン１−色素／ｂｌａＺなし；レーン２−ｂｌａＺ．ＷＴ；レーン３−ｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ；レーン４−ｂｌａＺ．Ｎ１７０Ｑ；及びレーン５−ｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ：Ｎ１７７Ｑ。 図２３は、ＧＳＴとｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ、ｂｌａＺ．Ｎ１７０Ｑ又はｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ：Ｎ１７０Ｑの融合物に対するＣＣＦ２の結合を示す。レーン１−色素／ｂｌａＺなし；レーン２−ＧＳＴ−ｂｌａＺ．ＷＴ；レーン３−ＧＳＴ−ｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ；レーン４−ＧＳＴ−ｂｌａＺ．Ｎ１７０Ｑ；及びレーン５−ＧＳＴ−ｂｌａＺ．Ｅ１６６Ｄ：Ｎ１７７Ｑ。 図２４は、ＧＦＰ−コネクター−ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−ＮＬＳ３をコードするコンストラクトでトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌで染色したＣＨＯ−Ｋ１生細胞の蛍光及びＤＩＣイメージを提供する。ＴＡＭＲＡフィルター−左上；ＧＦＰフィルター−右上；「Ａ」及び「Ｂ」のオーバーレイ−左下；オーバーレイ画像「Ｃ」及び細胞のＤＩＣ画像−右下。ＮＬＳ３＝ＳＶ４０のＴ抗原由来の核局在化配列のタンデム反復。 図２５は、ＧＦＰ−β−アレスチン２をコードするコンストラクト（左）及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−β−アレスチン２をコードするコンストラクトをトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（右）で染色した生きているＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光画像を示す。 図２５は、ＧＦＰ−β−アレスチン２をコードするコンストラクト（左）及びＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−β−アレスチン２をコードするコンストラクトをトランスフェクションし、そしてＴＡＭＲＡ−Ｃ14Ｈ24Ｏ4−Ｃｌ（右）で染色した生きているＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光画像を示す。 図２６は、Ｅ．コリにおけるＤｈａＡ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン：１、分子量スタンダード；２、野生型ＤｈａＡ粗製可溶化液；３、野生型ＤｈａＡ無細胞可溶化液；４、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ粗製可溶化液；５、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ無細胞可溶化液；６、ベクターコントロール粗製可溶化液；７、ベクターコントロール無細胞可溶化液；８、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ Ｃ１突然変異体粗製可溶化液；９、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ Ｃ１突然変異体無細胞可溶化液；１０、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ Ａ５突然変異体粗製可溶化液；１１、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ Ａ５突然変異体無細胞可溶化液；１２、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ Ａ１２突然変異体粗製可溶化液；１３、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ Ａ１２突然変異体無細胞可溶化液；１４、分子量スタンダード。矢印は、ＤｈａＡタンパク質の位置を示す。−ｓ、遠心前の可溶化液；＋ｓ、遠心後の可溶化液。 図２７は、ＤｈａＡ含有可溶化液のイムノブロット解析を示す。レーン：１、野生型ＤｈａＡ粗製可溶化液；２、野生型ＤｈａＡ無細胞可溶化液；３、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ粗製可溶化液；４、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ無細胞可溶化液；５、ベクターコントロール粗製可溶化液；６、ベクターコントロール無細胞可溶化液；７、分子量スタンダード；８、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ Ｃ１突然変異体粗製可溶化液；９、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ Ｃ１突然変異体無細胞可溶化液；１０、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ Ａ５突然変異体粗製可溶化液；１１、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ Ａ５突然変異体無細胞可溶化液；１２、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ Ａ１２突然変異体粗製可溶化液；１３、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ Ａ１２突然変異体無細胞可溶化液；１４、分子量スタンダード。矢印は、ＤｈａＡタンパク質の位置を示す。 図２８は、in vitroでの共有結合のアルキル−酵素形成の蛍光画像解析を提供する。レーン：１、蛍光分子量スタンダード；２、ＤｈａＡ野生型；３、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体；４、ＤｈａＡ−（ベクターのみのコントロール）；５、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ突然変異体；６、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ突然変異体；７、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ突然変異体。矢印は、蛍光酵素−アルキル共有結合中間体の位置を示す。 図２９は、細胞全体における共有結合のアルキル−酵素形成の蛍光画像解析を提供する。レーン：１、蛍光分子量スタンダード；２、ＤｈａＡ野生型；３、ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ突然変異体；４、ＤｈａＡ−（ベクターのみのコントロール）；５、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｑ突然変異体；６、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ｌ突然変異体；７、ＤｈａＡ．Ｅ１３０Ａ突然変異体；８、蛍光分子量スタンダード。矢印は、蛍光酵素−アルキル共有結合中間体の位置を示す。 図３０Ａ−Ｂは、ストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングビーズ上で捕獲されたＤｈａＡ−Ｆｌａｇのウェスタンブロット解析を示す。ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇを一過的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、０．１％ＤＭＳＯ、６０分、３７℃）で処理され（Ａ）、又は処理されなかった（Ｂ）。過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌは洗い落とされ、細胞は可溶化され、そして１０μｌの細胞可溶化液は、ＳＡ−コーティングビーズ(Pierce)と一緒に６０分間室温（ＲＴ）でインキュベートされた。細胞可溶化液（レーン１）、ビーズに結合しなかったタンパク質（レーン２）、及びビーズに結合したタンパク質（レーン３）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロース膜にトランスファーされ、そして抗Ｆｌａｇ抗体(Sigma)でプローブされた。 図３０Ａ−Ｂは、ストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングビーズ上で捕獲されたＤｈａＡ−Ｆｌａｇのウェスタンブロット解析を示す。ＤｈａＡ．Ｈ２７２Ｆ−Ｆｌａｇを一過的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、０．１％ＤＭＳＯ、６０分、３７℃）で処理され（Ａ）、又は処理されなかった（Ｂ）。過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌは洗い落とされ、細胞は可溶化され、そして１０μｌの細胞可溶化液は、ＳＡ−コーティングビーズ(Pierce)と一緒に６０分間室温（ＲＴ）でインキュベートされた。細胞可溶化液（レーン１）、ビーズに結合しなかったタンパク質（レーン２）、及びビーズに結合したタンパク質（レーン３）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロース膜にトランスファーされ、そして抗Ｆｌａｇ抗体(Sigma)でプローブされた。 図３０Ｃ−Ｄは、ＳＡコーティングビーズ上で捕獲されたhR.Luc-DhaAの解析を例示する。hR.Luc-コネクター-DhaA.H272F-Flagを一過的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、０．１％ＤＭＳＯ、６０分、３７℃）で処理され、又は処理されなかった。細胞は可溶化され、そして１０μｌの細胞可溶化液は、ＳＡ−コーティングビーズ(Pierce)と一緒に６０分間室温（ＲＴ）でインキュベートされた。未結合材料は洗い落とされ、そしてhR.Luc活性は、Promegaの「ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系」を用いて決定され（Ｃ）、又は捕獲されたhR.Lucはウェスタンブロットで解析された（Ｄ）。Ｃ）カラム１、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理され、そして過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌが洗い落とされた細胞；カラム２、未処理細胞；及びカラム３、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理し、過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌを洗い落とさなかった細胞。Ｄ）細胞可溶化液（レーン１）、ビーズに結合しなかったタンパク質（レーン２）、及びビーズに結合したタンパク質（レーン３）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロース膜にトランスファーされ、そして抗R.Luc抗体(Chemicon)でプローブされた。 図３０Ｃ−Ｄは、ＳＡコーティングビーズ上で捕獲されたhR.Luc-DhaAの解析を例示する。hR.Luc-コネクター-DhaA.H272F-Flagを一過的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌ（２５μＭ、０．１％ＤＭＳＯ、６０分、３７℃）で処理され、又は処理されなかった。細胞は可溶化され、そして１０μｌの細胞可溶化液は、ＳＡ−コーティングビーズ(Pierce)と一緒に６０分間室温（ＲＴ）でインキュベートされた。未結合材料は洗い落とされ、そしてhR.Luc活性は、Promegaの「ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系」を用いて決定され（Ｃ）、又は捕獲されたhR.Lucはウェスタンブロットで解析された（Ｄ）。Ｃ）カラム１、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理され、そして過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌが洗い落とされた細胞；カラム２、未処理細胞；及びカラム３、ビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌで処理し、過剰なビオチンＣ18Ｈ32Ｏ4−Ｃｌを洗い落とさなかった細胞。Ｄ）細胞可溶化液（レーン１）、ビーズに結合しなかったタンパク質（レーン２）、及びビーズに結合したタンパク質（レーン３）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロース膜にトランスファーされ、そして抗R.Luc抗体(Chemicon)でプローブされた。

Claims (17)

  1. 式（Ｉ）：Ｒ−リンカー−Ａ−Ｘ（ここで、Ｒは、フルオロフォア、クロモフォア、ルミノフォア、ビオチン、ハプテン、ペプチド、ポリペプチド、抗体、受容体、ヌクレオチド、脂質及び固体支持体から成る群から選択される１又は複数の官能基であり、リンカーは、２〜３０個の炭素原子を含んで成る分枝又は非分枝炭素鎖であって、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y（ｙ＝２）を含んで成る鎖であり、Ａは（ＣＨ２）ｎであり、ｎは６であり、Ａ−Ｘはデハロゲナーゼの基質であり、且つＸはハロゲンである）の化合物。
  2. ロドコッカス(Rhodococcus)デハロゲナーゼの基質である、請求項１に記載の化合物。
  3. ＸがＣｌ又はＢｒである、請求項１に記載の化合物。
  4. Figure 0004748685
    である、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｎ−｛２−［２−（６−クロロヘキシルオキシ）−エトキシ］−エチル｝−ビオチン−アミドである、請求項１に記載の化合物。
  6. 少なくとも１つの官能基が光学的に検出可能な分子である、請求項１に記載の化合物。
  7. 少なくとも１つの官能基がフルオロフォアである、請求項６に記載の化合物。
  8. 突然変異デハロゲナーゼの存在又は量を検出又は決定する方法であって：
    ａ）突然変異デハロゲナーゼとデハロゲナーゼ基質とを接触させ、ここで、当該突然変異デハロゲナーゼは、配列番号４８によってコードされる野生型デハロゲナーゼと比較して、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、前記突然変異デハロゲナーゼは、前記野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成し、ここで、当該突然変異デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、配列番号４８によってコードされるデハロゲナーゼの残基２７２に相当するアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する、配列番号４８によってコードされるデハロゲナーゼの残基１０６に相当するアミノ酸残基、での置換であり；そして
    ｂ）前記基質の存在又は量を検出又は決定し、それにより突然変異デハロゲナーゼの存在又は量を検出又は決定すること、
    を含んで成る方法。
  9. 試料中の注目の分子、細胞又は細胞小器官を単離する方法であって：
    ａ）試料と、突然変異デハロゲナーゼ及びデハロゲナーゼ基質とを接触させ、ここで、当該突然変異デハロゲナーゼが、配列番号４８によってコードされる野生型デハロゲナーゼと比較して、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、前記突然変異デハロゲナーゼが、前記野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成し、ここで、当該突然変異デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、配列番号４８によってコードされるデハロゲナーゼの残基２７２に相当するアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する、配列番号４８によってコードされるデハロゲナーゼの残基１０６に相当するアミノ酸残基、での置換であり、前記融合タンパク質が、注目の分子、細胞又は細胞小器官と結合するタンパク質を含んで成り；そして
    ｂ）注目の分子、細胞又は細胞小器官を単離すること、
    を含んで成る方法。
  10. 前記基質が、固体支持体又は固体支持体と結合する分子を含んで成る、請求項９に記載の方法。
  11. 注目の分子がタンパク質である、請求項９に記載の方法。
  12. 細胞を標識する方法であって：
    ａ）突然変異デハロゲナーゼを含んで成る細胞と１又は複数の官能基を含んで成るデハロゲナーゼ基質とを接触させること、を含んでなり、ここで、当該突然変異デハロゲナーゼが、配列番号４８によってコードされる野生型デハロゲナーゼと比較して、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、当該突然変異デハロゲナーゼが前記野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合よりも安定な基質との結合を形成し、ここで、当該突然変異デハロゲナーゼにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化と関連する、配列番号４８によってコードされるデハロゲナーゼの残基２７２に相当するアミノ酸残基、あるいは基質とエステル中間体を形成する、配列番号４８によってコードされるデハロゲナーゼの残基１０６に相当するアミノ酸残基、での置換である、方法。
  13. 前記基質が、Ｒ−リンカー−Ａ−Ｘ（ここで、Ｒは１又は複数の官能基であり、リンカーは２〜３０個の炭素原子を含んで成る分枝又は非分枝炭素鎖であって、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ 2 ＣＨ 2 Ｏ） y （ｙ＝２）を含んで成る鎖であり、Ａは（ＣＨ ２ ） ｎ であり、ｎは６であり、Ａ−Ｘはデハロゲナーゼの基質であり、且つＸはハロゲンである）を含んで成る、請求項８、９又は１２に記載の方法。
  14. 少なくとも１つの官能基が光学的に検出可能な分子である、請求項８、９又は１２に記載の方法。
  15. 突然変異加水分解酵素が更に注目のタンパク質を含んで成り、その結果融合タンパク質を生成する、請求項８、９又は１２に記載の方法。
  16. 式Ｒ−リンカー−Ａ−Ｘの化合物を調製する方法であって、式Ｒ−Ｙの化合物と、式Ｚ−リンカー−Ａ−Ｘの化合物とをカップリングさせることを含んで成り、ここで、Ｙ及びＺが、Ｒ−を−リンカー−Ａ−Ｘと連結させるよう反応することができる基であり、当該リンカーは、２〜３０個の炭素原子を含んで成る分枝又は非分枝炭素鎖であって、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y（ｙ＝２）を含んで成る鎖であり、Ａは（ＣＨ２）ｎであり、ｎは６であり、Ａ−Ｘがデハロゲナーゼの基質であり、且つＸがハロゲンであり、そしてＲ−Ｙが式Ｒの化合物の活性化エステルであり、且つＺが当該活性化エステルと反応してアミド結合を形成するのに適したアミンである、方法。
  17. 請求項１６に記載の方法により調製される化合物。
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