JP2023540934A - Ｒａｓタンパク質のターゲットエンゲージメントアッセイ - Google Patents
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Abstract
本明細書では、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤を使用し、ＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び化合物を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳ）の一部位に結合し、同じ部位ならびに他の部位に結合するＲＡＳ結合剤を検出するために使用され得る。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０７１，６９４号、２０２０年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１１７，０８０号、及び２０２１年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１６０，１２０号に対する優先権及びその利益を主張し、それらの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０７１，６９４号、２０２０年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１１７，０８０号、及び２０２１年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１６０，１２０号に対する優先権及びその利益を主張し、それらの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＮＲＡＳ結合化合物を含む、ＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び化合物に関する。特に、本明細書において開示されるＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含み、様々なＲＡＳ結合部位でのターゲットエンゲージメントを調べるために使用し得る。
ＲＡＳタンパク質は、様々な細胞過程に関与する無数のシグナル伝達カスケードを調節する。ＲＡＳ遺伝子は、がん遺伝子であり、変異すると正常な細胞をがん化し得る。ＲＡＳ遺伝子には、それぞれＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＮＲＡＳタンパク質をコードするＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＮＲＡＳが含まれる。これらのタンパク質は、細胞の外側から細胞の核にシグナルを中継し、細胞が成長、分裂、成熟、及び／又は分化するように指示する。ＲＡＳタンパク質は、分子スイッチとして機能するＧＴＰアーゼであり、ＧＴＰからＧＤＰへの変換によってオン・オフする。
ＲＡＳ活性化変異は、ヒトのがんにおける最も頻繁な発癌性変化である。ＲＡＳ活性化変異体は、ＧＴＰからＧＤＰへの循環過程を妨害することにより、ＲＡＳタンパク質を活性なＧＴＰ結合型に固定し、それによって細胞の腫瘍性形質転換を促進する。一般的なＫＲＡＳ活性化変異体の１つは、ＫＲＡＳG12Cであり、これは非小細胞肺がんで特に一般的である。一般的なＨＲＡＳ活性化変異体は、ＨＲＡＳG12S及びＨＲＡＳG12Vである。ＨＲＡＳG12S変異はコステロ症候群に関連している一方、ＨＲＡＳG12Vは膀胱がんに関連している。ＮＲＡＳG12DやＮＲＡＳQ61RなどのＮＲＡＳ変異は、黒色腫などの様々なヒト腫瘍に関連している。
ＲＡＳタンパク質は、歴史的に創薬不可能と考えられてきた。ＲＡＳタンパク質はＧＴＰ基質に対して非常に高い親和性を有しているため、ＲＡＳ阻害剤の開発は困難であった。例えば、ＧＴＰは、非常に高い親和性でＲＡＳタンパク質のスイッチＩ（ＳＩ）部位を占有するため、細胞内での競合阻害はほとんど不可能であると考えられている。最近、ＫＲＡＳの発癌性変異（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ）が、スイッチＩＩ（ＳＩＩ）部位での共有結合阻害によって阻害される可能性があることが発見された。現在は、先進臨床試験で使用された共有結合ＳＩＩ部位阻害剤がある（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０３６００８８３を参照）。最近では、ＳＩ部位とＳＩＩ部位との間に浅い結合ポケットが存在することが発見された。ＳＩ／ＳＩＩ部位と呼ばれるこのポケットは、可逆的阻害（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６：１５８２３－１５８２９（２０１９））の機会を提供し得る。阻害剤であるＢＩ－２８５２は、野生型ＫＲＡＳ及びＫＲＡＳ変異体におけるこのＳＩ／ＩＩ部位に結合し、細胞内の下流のＫＲＡＳシグナル伝達イベントを阻害し得る。
本明細書では、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤を使用し、ＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び化合物を提供する。例えば、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤を使用し、ＫＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び化合物を提供する。ＫＲＡＳ結合部分は、ＫＲＡＳタンパク質の一部位に結合するが、システム及び方法で他のＫＲＡＳ結合部位でのエンゲージメントを首尾よく調べることができるため、広く有用な生細胞ターゲットエンゲージメントアッセイを可能にし、拡散メカニズムを介して結合するＫＲＡＳ結合化合物（ＫＲＡＳ阻害剤など）を同定する。また、本明細書では、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤を使用し、ＨＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び化合物、ならびにＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤を使用し、ＮＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び化合物も記載される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、ＫＲＡＳ結合剤、ＨＲＡＳ結合剤、及び／又はＮＲＡＳ結合剤である（すなわち、結合剤は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＮＲＡＳのうちの１つ又は全てに結合し得る）。
一態様において、本明細書では、ＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＫＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＫＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＫＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、（ｃ）当該機能要素を検出又は定量化するステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、当該ＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、当該ＫＲＡＳ変異体は、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、又はＫＲＡＳG13Dである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、当該試料内で当該ＫＲＡＳタンパク質を発現させることを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＨＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＨＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＨＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、（ｃ）当該機能要素を検出又は定量化するステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、当該ＨＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳ変異体は、ＨＲＡＳG12S又はＨＲＡＳG12Vである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、当該試料内で当該ＨＲＡＳタンパク質を発現させることを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＮＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＮＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＮＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、（ｃ）当該機能要素を検出又は定量化するステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、当該ＮＲＡＳタンパク質は、ＮＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳ変異体は、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、当該試料内で当該ＮＲＡＳタンパク質を発現させることを含む。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、式（Ｉ）の化合物
又はその塩であり、
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ａは、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ1は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ3は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、式
を有し、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、当該機能要素は、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルは、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、沈降粒子、膜、ガラス、チューブ、ウェル、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、及び電子伝導性表面を有する固体担体から選択される固体担体である。いくつかの実施形態において、当該沈降粒子は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素は、フルオロフォアである。
いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳ阻害剤である。いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、当該ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又は当該ＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する。
いくつかの実施形態において、当該試料は、細胞、細胞溶解物、体液、組織、生物学的試料、インビトロ試料、環境試料、無細胞試料、及び精製試料（例えば、精製タンパク質試料）から選択される。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳタンパク質は、生物発光レポーターとの融合体として提供される。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターは、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、当該試料は、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質、及び生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質を含み、第１及び第２のサブユニットは相補的である。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの第１のサブユニットは、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、当該生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの発光スペクトルと当該機能要素の励起スペクトルは重複する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、当該試料を生物発光レポーターの基質と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、当該基質は、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである。
一態様において、本明細書では、
（ａ）標的ＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
（ａ）標的ＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では
（ａ）標的ＫＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＫＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
（ａ）標的ＫＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＫＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
いくつかの実施形態において、当該標的ＫＲＡＳタンパク質はシステム内で発現される。いくつかの実施形態において、当該標的ＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、当該ＫＲＡＳ変異体は、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、及びＫＲＡＳG13Dから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書では
（ａ）標的ＨＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＨＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
（ａ）標的ＨＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＨＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
いくつかの実施形態において、当該標的ＨＲＡＳタンパク質はシステム内で発現される。いくつかの実施形態において、当該ＨＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳ変異体は、ＨＲＡＳG12S又はＨＲＡＳG12Vである。
いくつかの実施形態において、本明細書では
（ａ）標的ＮＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＮＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
（ａ）標的ＮＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＮＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
いくつかの実施形態において、当該標的ＮＲＡＳタンパク質はシステム内で発現される。いくつかの実施形態において、当該ＮＲＡＳタンパク質は、ＮＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳ変異体は、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、式（Ｉ）の化合物
又はその塩であって、
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ａは、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ1は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ3は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、式
を有し、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、当該機能要素は、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルは、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、又はエネルギー移動によって検出可能又は定量可能である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、沈降粒子、膜、ガラス、チューブ、ウェル、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、及び電子伝導性表面を有する固体担体から選択される固体担体である。いくつかの実施形態において、当該沈降粒子は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素は、フルオロフォアである。
いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳ阻害剤である。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合部分は、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、当該ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又は当該ＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する。
いくつかの実施形態において、当該システムは、試料を含み、当該試料は、細胞、細胞溶解物、体液、組織、生物学的試料、インビトロ試料、環境試料、無細胞試料、及び精製試料（例えば、精製タンパク質試料）から選択される。
いくつかの実施形態において、当該標的ＲＡＳタンパク質は、生物発光レポーターとの融合体として存在する。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターは、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、当該標的ＲＡＳタンパク質は、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質、及び生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質を含み、第１及び第２のサブユニットは相補的である。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの第１のサブユニットは、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、当該生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの発光スペクトルと当該機能要素の励起スペクトルは重複する。
いくつかの実施形態において、当該システムは、当該生物発光レポーターの基質を更に含む。いくつかの実施形態において、当該基質は、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである。
一態様において、本明細書では、
（ａ）ＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含む、ＲＡＳ結合剤を提供する。
（ａ）ＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含む、ＲＡＳ結合剤を提供する。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、
（ａ）ＫＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含むＫＲＡＳ結合剤である。
（ａ）ＫＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含むＫＲＡＳ結合剤である。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、
（ａ）ＨＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含むＨＲＡＳ結合剤である。
（ａ）ＨＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含むＨＲＡＳ結合剤である。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、
（ａ）ＮＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含むＮＲＡＳ結合剤である。
（ａ）ＮＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素とを含むＮＲＡＳ結合剤である。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳ結合部分と機能要素とを連結するリンカーを更に含む。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、式（Ｉ）の化合物
又はその塩であって、
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ａは、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ1は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ3は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、式
を有し、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、当該機能要素は、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素は、フルオロフォアである。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルは、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、沈降粒子、膜、ガラス、チューブ、ウェル、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、及び電子伝導性表面を有する固体担体から選択される固体担体である。いくつかの実施形態において、当該沈降粒子は、磁性粒子である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合部分は、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する。
一態様において、本明細書では、本明細書に記載のＲＡＳ結合剤（例えば、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含む、式（Ｉ）の化合物などのＲＡＳ結合剤）を含む組成物を開示する。
いくつかの実施形態において、当該組成物は、ＲＡＳタンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳタンパク質、ＨＲＡＳタンパク質、及びＮＲＡＳタンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳタンパク質は、生物発光レポーターとの融合体として存在する。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターは、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、当該組成物は、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質、及び生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質を含み、第１及び第２のサブユニットは相補的である。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの第１のサブユニットは、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、当該生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの発光スペクトルと当該機能要素の励起スペクトルは重複する。
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該生物発光レポーターの基質を更に含む。いくつかの実施形態において、当該基質は、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである。
いくつかの実施形態において、当該組成物は、候補ＲＡＳ結合化合物を更に含む。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、候補ＫＲＡＳ結合化合物、候補ＨＲＡＳ結合化合物、又は候補ＮＲＡＳ結合化合物である。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳ阻害剤である。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、当該ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又は当該ＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する。
一態様において、本明細書では、ＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
（ａ）（ｉ）ＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＫＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＫＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
（ａ）（ｉ）ＫＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該ＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、当該ＫＲＡＳ変異体は、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、及びＫＲＡＳG13Dから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＨＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＨＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
（ａ）（ｉ）ＨＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該ＨＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、当該ＨＲＡＳ変異体は、ＨＲＡＳG12S又はＨＲＡＳG12Vである。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＮＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＮＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
（ａ）（ｉ）ＮＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）当該機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該ＮＲＡＳタンパク質は、ＮＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、当該ＮＲＡＳ変異体は、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである。
いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、当該ＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳ阻害剤である。いくつかの実施形態において、当該候補ＲＡＳ結合化合物は、当該ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又は当該ＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、式（Ｉ）の化合物
又はその塩であり、
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ａは、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ1は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ3は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、式
を有し、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、当該機能要素は、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルは、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該機能要素は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である。いくつかの実施形態において、当該検出可能要素は、フルオロフォアである。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合部分は、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する。
いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳタンパク質は、生物発光レポーターとの融合体として存在する。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターは、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳタンパク質は、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質、及び生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質を含み、第１及び第２のサブユニットは相補的である。いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの第１のサブユニットは、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、当該生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、当該生物発光レポーターの発光スペクトルと当該機能要素の励起スペクトルは重複する。
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該生物発光レポーターの基質を更に含む。いくつかの実施形態において、当該基質は、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである。
本明細書では、ＲＡＳ阻害剤又はモジュレーターなどのＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び組成物が提供される。ＲＡＳタンパク質は、（アイソフォーム、ＫＲＡＳ４Ａ、及びＫＲＡＳ４Ｂを含んで）ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＫＲＡＳを含む。特に、本明細書では、ＲＡＳ阻害剤又はモジュレーターなどのＲＡＳ結合化合物を同定するシステム、方法、及び組成物が提供される。当該システム及び方法は、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤を含む。当該方法は、ＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、当該試料をＲＡＳ結合剤及び候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることに関与する。いくつかの実施形態において、当該方法は、例えば、機能要素からのシグナルを検出することによって、機能要素を検出又は定量化するステップを更に含む。当該方法、システム、及び化合物を使用し、ＲＡＳ結合剤が結合する部位だけでなく、他のＲＡＳ結合部位でもＲＡＳタンパク質によるターゲットエンゲージメントを測定することができる。例えば、いくつかの実施形態において、当該ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位で結合し、当該システム及び方法を使用し、スイッチＩ／ＩＩ部位だけでなく他の部位、例えばスイッチＩＩ部位でのターゲットエンゲージメントを調べることができる。
Ｉ．定義
本明細書に記載の実施形態の実施又は試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似した又は同等のものを使用することは可能であるが、いくつかの好ましい方法、組成物、装置、及び材料について、本明細書で説明する。ただし、本発明の材料及び方法を記載する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法論、又はプロトコールは、通常の実験及び最適化に応じて変動し得ることから、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の形態又は実施形態のみを説明することを目的としたものであり、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
本明細書に記載の実施形態の実施又は試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似した又は同等のものを使用することは可能であるが、いくつかの好ましい方法、組成物、装置、及び材料について、本明細書で説明する。ただし、本発明の材料及び方法を記載する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法論、又はプロトコールは、通常の実験及び最適化に応じて変動し得ることから、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の形態又は実施形態のみを説明することを目的としたものであり、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
本明細書に特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって通常理解されている意味を有するものとする。例えば、本明細書に説明される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名及び技術は、当該技術分野において周知であり、通常使用されているものである。用語の意味及び範囲は明確でなければならない。しかしながら、潜在的な曖昧さがある場合、本明細書で提供される定義は、辞書又は外部の定義よりも優先される。更に、文脈によって別途必要とされる場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本明細書において、また付属の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうでない旨が明確に示されないかぎり、複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「ペプチド」と言う場合には、１以上のペプチド及び当業者には周知の均等物を指す。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、列挙された項目のいずれかを個別に含む、列挙された項目の任意及び全ての組み合わせを含む。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、及びＡＢＣを包含し、これらの各々が、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」と述べることにより別々に記載されていると見なされるべきである。
本明細書で使用される場合、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びその言語学的な変化形は、更なる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）などの存在を除外することなく、記載される特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）（複数可）などの存在を示す。これに対して、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」なる用語及びその言語学的な変化形は、記載される特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）などの存在を示し、なおかつあらゆる記載されていない特徴（複数可）、要素（複数可）、方法のステップ（複数可）などは、通常伴う不純物を例外として除外する。「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という表現は、記載される特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）など、及び組成物、システム、又は方法の基本的性質に実質的に影響しない任意のさらなる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを示す。本明細書の多くの実施形態は、開放した「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉を用いて説明される。そのような実施形態は、「からなる」及び／又は「本質的に～からなる」という閉鎖形式の複数の実施形態を包含しており、これらは代替的に、そのような文言を使用して特許請求又は記載され得る。
本明細書における数値範囲の列挙のために、それらの間に同じ程度の精度で介在する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲については、数字７及び８は、６及び９に加えて企図され、６．０～７．０の範囲については、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。
本明細書で使用される場合、「親和性要素」という用語は、対応する「親和性剤」との安定した非共有相互作用を形成する分子実体を指す。
本明細書で使用される場合、「捕捉要素」という用語は、対応する「捕捉剤」と共有結合相互作用を形成する分子実体を指す。
本明細書で使用される場合、「検出可能要素」という用語は、本明細書に記載の化合物（又はその誘導体もしくは類似体など）に結合する（例えば、直接又は好適なリンカーを介して）検出可能な、反応性の、親和性の、もしくは生物活性の薬剤又は部分を指す。本明細書に記載の実施形態で使用されてもよい他の追加の検出可能要素は、「局在化要素」、「検出要素」などを含む。
本明細書で使用される「セレンテラジン」は、天然に存在する（「天然の」）セレンテラジンを指す。本明細書で使用する場合、「セレンテラジン類似体」又は「セレンテラジン誘導体」という用語は、米国特許公開第２００８／０２４８５１１号、米国特許公開第２０１２／０１７４２４２号、米国特許公開第２０１７／０２３３７８９号、及び米国特許公開第２０１８／００３００５９号で開示されるものに加え、フリマジン、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジンを含むセレンテラジンの合成類似体（例えば、誘導体又は変異体）及び天然類似体を指し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、セレンテラジン類似体は、例えば、米国特許公開第２００８／０２４８５１１号、米国特許公開第２０１２／０７０７８４９号、及び米国特許公開第２０１４／００９９６５４号に記載されるものなどのプロ基質が挙げられ、それらの開示は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「エネルギー受容体」という用語は、任意の小分子（例えば、発色団）、巨大分子（例えば、自家蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質、ナノ粒子、界面など）、又はエネルギー吸収（例えば、共鳴エネルギー移動）に応答して容易に検出可能なシグナルを生成する分子複合体を指す。特定の実施形態において、エネルギー受容体は、フルオロフォア又は他の検出可能な発色団である。
本明細書で使用される場合、「ＲＡＳスイッチＩ部位」という用語は、Ｍｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：９３９－９４５（１９９０））及びＫｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６：１５８２３－１５８２９（２０１９））に開示された残基３０～３８にまたがるＲＡＳタンパク質上の部位を指し、「ＲＡＳスイッチＩＩ部位」という用語は、同開示の残基６０～７６にまたがるＲＡＳタンパク質上の部位を指す。それらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位」という用語は、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６：１５８２３－１５８２９（２０１９）に開示されたＲＡＳスイッチＩ部位とＲＡＳスイッチＩＩ部位との間のポケットを指す。
本明細書で使用される「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、特に明記しない限り、ペプチドアミド結合（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）によって主鎖を介して結合された２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語は、通常、短いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個未満のアミノ酸を有する鎖）を指し、一方で「ポリペプチド」という用語は、通常、より長いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個を超えるアミノ酸を有する鎖）を指す。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、その最も広義に使用される。ある意味では、それは、いずれかの供給源から得られた検体又は培養物、ならびに生物学的試料及び環境試料を含むことを意味する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）から得られ、流体、固体、組織、及び気体を含み得る。生物学的試料は、血液生成物（血漿、血清など）などを含む。試料はまた、細胞、細胞溶解物、又は本明細書に記載の酵素、ペプチド、及び／又はポリペプチドの精製形態（例えば、精製タンパク質試料）を指す場合もある。細胞溶解物は、溶解剤で溶解された細胞、又はウサギ網状赤血球又は小麦胚芽溶解物などの溶解物を含み得る。試料はまた、インビトロ試料及び無細胞発現系などの無細胞試料を含み得る。環境試料は、表面物質、土壌、水、及び工業試料などの環境物質を含む。試料はまた、精製されたタンパク質試料などの精製された試料を含み得る。しかしながら、これらの例は、本発明に該当する試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「固体担体」という用語は、基質、変異タンパク質、薬物様分子、及び他の試験成分などの試薬が結合する、又は結合し得る任意の固体又は固定材に関して使用される。固体担体の例としては、顕微鏡スライド、マイクロタイタープレートのウェル、カバースリップ、ビーズ、粒子、樹脂、細胞培養フラスコ、及び他の多くの適切な品目が挙げられる。ビーズ、粒子、又は樹脂は、磁性もしくは常磁性であり得る。
本明細書において、「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持している、ペプチド又はポリペプチドを説明するために使用される。「ＳＮＰ」は、一塩基多型である変異体を指す。「生物学的活性」の代表的な例としては、特異的な抗体によって結合される能力、又は免疫応答を促進する能力が挙げられる。また、変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を説明するために使用される。アミノ酸の保存的置換（すなわち、１つのアミノ酸を、親水性、荷電領域の程度及び分布などの類似の特性を有する別のアミノ酸と置き換えること）は、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸の親水性指標を考慮することによって、特定することができる。アミノ酸の親水性指標は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。類似の親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、タンパク質機能を依然として保持することができるのは、当該技術分野で周知である。一態様において、±２の親水性指標を有するアミノ酸は、置換される。アミノ酸の親水性を利用し、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることも可能である。ペプチドにおいてアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性及び免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な指標を計算することができる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、免疫原性を例とする生物学的活性を保持するペプチドをもたらし得る。置換は、それぞれの±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことが可能である。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、及び他の性質により明らにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
特定の官能基及び化学用語の定義は、以下に、よりに詳細に説明する。本開示の目的のために、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ７５th Ｅｄ．の表紙内側に従って識別され、具体的な官能基は、概して、その中に記載されるように定義される。更に、有機化学の一般原理、ならびに具体的な官能部分及び反応性は、Ｓｏｒｒｅｌｌ， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２nd ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ， Ｓａｕｓａｌｉｔｏ， ２００６、Ｓｍｉｔｈ， Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ７th Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０１３、Ｌａｒｏｃｋ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， ３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０１８、及びＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ， Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， １９８７に記載され、これらの各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～３０個の炭素原子、例えば１～１６個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ16アルキル）、１～１４個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ14アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ12アルキル）、１～１０個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ10アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ8アルキル）、１～６個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ6アルキル）、１～４個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ4アルキル）、６～２０個の炭素原子（Ｃ6～Ｃ20アルキル）、又は８～１４個の炭素原子（Ｃ8～Ｃ14アルキル）を含有する直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルキレン」という用語は、１～１２個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ12アルキレン）、例えば、１～６個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ6アルキレン）を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素から誘導される二価の基を指す。アルキレンの代表例としては、－ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2－、－ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、及び－ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、２～３０個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルケニルの代表例としては、エテニル、２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、３－ブテニル、４－ペンテニル、５－ヘキセニル、２－ヘプテニル、２－メチル－１－ヘプテニル、及び３－デセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」とは、２～３０個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１個の炭素－炭素三重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキニルの代表例としては、エチニル、プロピニル、及びブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、単環（単環式）又は縮合環系を含む複数環（二環式又は三環式）を有し、かつヘテロ原子を含まない芳香族炭素環系を指す。本明細書で使用される場合、アリールは、６～２０個の炭素原子（Ｃ6～Ｃ20アリール）、６～１４個の環炭素原子（Ｃ6～Ｃ14アリール）、６～１２個の環炭素原子（Ｃ6～Ｃ12アリール）、又は６～１０個の環炭素原子（Ｃ6－Ｃ10アリール）を含有する。アリール基の代表例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、及びフェナントレニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アリーレン」という用語は、二価のアリール基を指す。アリーレン基の代表例としては、フェニレン基（例えば、１，２－フェニレン、１，３－フェニレン、及び１，４－フェニレン）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、３～１０個の炭素原子を含有し、かつヘテロ原子を含まない飽和炭素環系を指す。シクロアルキルは、単環式、二環式、架橋、縮合、又はスピロ環式であり得る。シクロアルキルの代表例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、及びビシクロ［５．２．０］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを意味する。
本明細書で使用される場合、「ハロアルキル」という用語は、少なくとも１個の水素原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個の水素原子）がハロゲンで置き換えられている、本明細書で定義する通りのアルキル基を意味する。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、１つ以上の炭素原子（及び任意の関連する水素原子）が、それぞれ独立して、－ＮＲ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－などのヘテロ原子基で置き換えられている、本明細書で定義する通りのアルキル基を意味し、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり、それぞれが任意選択で置換され得る。例として、１個、２個、又は３個の炭素原子が、独立して、同じ又は異なるヘテロ原子基で置き換えられ得る。ヘテロアルキル基の例としては、－ＯＣＨ3、－ＣＨ2ＯＣＨ3、－ＳＣＨ3、－ＣＨ2ＳＣＨ3、－ＮＲＣＨ3、及び－ＣＨ2ＮＲＣＨ3が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、Ｒは水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロアリールであり、これらは、それぞれ任意選択で置換され得る。ヘテロアルキルには、アルキルの炭素原子が酸化されている（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－である）基も含まれる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキレン」という用語は、１つ以上の炭素原子（及び任意の関連する水素原子）が、それぞれ独立して、－ＮＲ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－などのヘテロ原子基で置き換えられている、本明細書で定義する通りのアルキレン基を意味し、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり、それぞれが任意選択で置換され得る。例として、１個、２個、又は３個の炭素原子が、独立して、同じ又は異なるヘテロ原子基で置き換えられ得る。ヘテロアルキレンには、アルキルの炭素原子が酸化されている（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－である）基も含まれる。ヘテロアルキレン基の例としては、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－、－ＣＨ2－Ｓ－ＣＨ2－、－ＣＨ2－ＮＲ－ＣＨ2－、－ＣＨ2－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ2－など、ならびにポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレンオキシド鎖、及びポリエチレンイミン鎖が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立して選択される１つ以上の環ヘテロ原子を有する単環（単環式）又は複数環（二環式もしくは三環式）を有する芳香族基を指す。芳香族単環式環は、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立して選択される１個、２個、３個、又は４個のヘテロ原子）を有する５又は６員環である。５員の芳香族単環式環は２つの二重結合を有し、６員の芳香族単環式環は３つの二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基は、本明細書で定義される単環式アリール基、又は本明細書で定義される単環式ヘテロアリール基に縮合して付加された単環式ヘテロアリール環によって例示される。三環式ヘテロアリール基は、本明細書で定義される単環式アリール基及び本明細書で定義される単環式ヘテロアリール基から独立して選択される２つの環に縮合された単環式ヘテロアリール環によって例示される。単環式ヘテロアリールの代表例としては、ピリジニル（ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル、ピリジン－４－イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ベンゾピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、１，２，４－トリアジニル、及び１，３，５－トリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない二環式ヘテロアリールの代表例としては、ベンゾイミダゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、クロメニル、イミダゾピリジン、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、プリニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、チアゾロピリジニル、チアゾロピリミジニル、チエノピロリル、及びチエノチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリールの代表例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式ヘテロアリールは、環内に含まれる任意の炭素原子又は任意の窒素原子を介して親分子部分に結合している。
本明細書で使用される場合、「複素環」又は「複素環式」という用語は、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立して選択される１つ以上の環ヘテロ原子を有する飽和又は部分的に不飽和の非芳香族環式基を指し、単環式複素環、二環式複素環、又は三環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む３員、４員、５員、６員、７員、又は８員の環である。３員又は４員の環には、０個又は１個の二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１個のヘテロ原子とが含まれる。５員の環には、０個又は１個の二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１個、２個、又は３個のヘテロ原子とが含まれる。６員の環には、０個又は２個の二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１個、２個、又は３個のヘテロ原子とが含まれる。７及び８員の環には、０個、１個、２個、又は３個の二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１個、２個、又は３個のヘテロ原子とが含まれる。単環式複素環の代表例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２－チアジナニル、１，３－チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式複素環は、フェニル基に縮合した単環式複素環、もしくは単環式シクロアルキルに縮合した単環式複素環、もしくは単環式シクロアルケニルに縮合した単環式複素環、もしくは単環式複素環に縮合した単環式複素環、もしくはスピロ複素環基であるか、又は環の２つの隣接しない原子が、１個、２個、３個、もしくは４個の炭素原子有するアルキレン架橋、又は２個、３個、もしくは４個の炭素原子を有するアルケニレン架橋によって連結される架橋単環式複素環系である。二環式複素環の代表例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾチエニル、２，３－ジヒドロイソキノリン、２－アザスピロ［３．３］ヘプタン－２－イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イルを含む）、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式複素環は、フェニル基に縮合した二環式複素環、もしくは単環式シクロアルキルに縮合した二環式複素環、もしくは単環式シクロアルケニルに縮合した二環式複素環、もしくは単環式複素環に縮合した二環式複素環であるか、又は二環式環の２つの隣接しない原子が、１個、２個、３個、もしくは４個の炭素原子有するアルキレン架橋、又は２個、３個、もしくは４個の炭素原子を有するアルケニレン架橋によって連結される二環式複素環である。三環式複素環の例としては、オクタヒドロ－２，５－エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ－２Ｈ－２，５－メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ－アダマンタン（１－アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、及びオキサアダマンタン（２－オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）が挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式複素環は、環内に含まれる任意の炭素原子又は任意の窒素原子を介して親分子部分に結合している。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を意味する。
場合によっては、基（例えば、アルキル、アルコキシ、又はシクロアルキル）中の炭素原子の数は、接頭辞「Ｃx－Ｃy－」で示され、ｘは、基中の最小炭素原子数であり、ｙは、基中の最大炭素原子数である。従って、例えば、「Ｃ1－Ｃ3－アルキル」は、１個～３個の炭素原子（すなわち、１個、２個、又は３個の炭素原子）を含むアルキル基を指す。
本明細書で使用される場合、「置換基」という用語は、示された基の原子上で置換された基を指す。
基又は部分が置換され得る場合、「置換された」という用語は、「置換された」という表現を用いて示される基の、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個、いくつかの実施形態では１個、２個、又は３個、及び他の実施形態では１個又は２個）の水素が、表示原子の通常の原子価が限度を超えない場合、列挙された表示基から選択された基又は当業者に周知の好適な置換基（例えば、以下に列挙した１つ以上の基）で置換できることを示す。置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アシル、アミノ、アミド、アミジノ、アリール、アジド、カルバモイル、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、ヒドラジノ、イミノ、オキソ、ニトロ、リン酸、ホスホン酸、スルホン酸、チオール、チオン、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、化学構造における以下の表示は、
ある部分の、別の部分への結合点を表す（例えば、ＲＡＳ結合部分へのリンカー）。
本明細書に記載の化合物について、基及びその置換基は、許容される原子価及び置換基に従って選択することが可能であり、この選択及び置換により、安定した化合物、例えば、転位、環化、脱離などによるような変換を自発的に起こさない化合物がもたらされるようにする。
置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）が、左から右へ記述する従来の化学式によって特定される場合、それらは、任意選択で、構造を右から左へ記述することによって得られる置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）、例えば、－ＣＨ2Ｏ－は、任意選択でＯＣＨ2－とも記述し、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－は、また任意選択で－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－とも記述するものを包括する。
ＩＩ．ＲＡＳタンパク質
本明細書に開示される方法及びシステムは、標的ＲＡＳタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＡＳタンパク質は標的ＫＲＡＳタンパク質である。ＫＲＡＳ遺伝子は、２つのスプライス変異体又はアイソフォーム（ＫＲＡＳ４Ａ（受入番号：ＮＰ＿００１３５６７１５．１）及びＫＲＡＳ４Ｂ（受入番号：ＮＰ＿００４９７６．２））を有する。ＫＲＡＳ４Ａ及びＫＲＡＳ４Ｂは、それらの最初の１５０アミノ酸残基が同一であり、両方とも、１２位など、いくつかの同様の発癌性変異の対象となり得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＡＳタンパク質は標的ＨＲＡＳタンパク質である。ＨＲＡＳ遺伝子は、２つのスプライス変異体又はアイソフォーム（アイソフォーム１（受入番号：ＮＰ＿００１１２３９１４．１）及びアイソフォーム２（ＮＰ＿７８９７６５．１））も有する。いくつかの実施形態において、標的ＲＡＳタンパク質は標的ＮＲＡＳタンパク質（受入番号：ＮＰ＿００２５１５．１）である。
本明細書に開示される方法及びシステムは、標的ＲＡＳタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＡＳタンパク質は標的ＫＲＡＳタンパク質である。ＫＲＡＳ遺伝子は、２つのスプライス変異体又はアイソフォーム（ＫＲＡＳ４Ａ（受入番号：ＮＰ＿００１３５６７１５．１）及びＫＲＡＳ４Ｂ（受入番号：ＮＰ＿００４９７６．２））を有する。ＫＲＡＳ４Ａ及びＫＲＡＳ４Ｂは、それらの最初の１５０アミノ酸残基が同一であり、両方とも、１２位など、いくつかの同様の発癌性変異の対象となり得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＡＳタンパク質は標的ＨＲＡＳタンパク質である。ＨＲＡＳ遺伝子は、２つのスプライス変異体又はアイソフォーム（アイソフォーム１（受入番号：ＮＰ＿００１１２３９１４．１）及びアイソフォーム２（ＮＰ＿７８９７６５．１））も有する。いくつかの実施形態において、標的ＲＡＳタンパク質は標的ＮＲＡＳタンパク質（受入番号：ＮＰ＿００２５１５．１）である。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、野生型ＫＲＡＳ４Ａタンパク質（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳ４Ａ変異体、例えば、配列番号２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ４Ａ変異体は、配列番号２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する（例えば、構成的に活性な）活性変異体である。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、野生型ＫＲＡＳ４Ｂタンパク質（配列番号４）である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳ４Ｂ変異体、例えば、配列番号４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ４Ｂ変異体は、配列番号４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する（例えば、構成的に活性な）活性変異体である。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳG12C（配列番号５又は配列番号８）、ＫＲＡＳG12D（配列番号６又は配列番号９）、ＫＲＡＳG12V（配列番号７又は配列番号１０）、ＫＲＡＳQ61R（配列番号３７又は配列番号４１）、ＫＲＡＳQ61H（配列番号３８又は配列番号４２）、ＫＲＡＳQ61L（配列番号３９又は配列番号４３）、及びＫＲＡＳG13D（配列番号４０又は配列番号４４）から選択されるＫＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、又は配列番号４４に対して１つ以上の置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、又はそれらの間の範囲）を有するＫＲＡＳ変異体である。
いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳタンパク質は、野生型ＨＲＡＳアイソフォーム１タンパク質（配列番号１２）である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳアイソフォーム１変異体、例えば、配列番号１２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳアイソフォーム１変異体は、配列番号１２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する（例えば、構成的に活性な）活性変異体である。
いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳタンパク質は、野生型ＨＲＡＳアイソフォーム２タンパク質（配列番号１４）である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳアイソフォーム２変異体、例えば、配列番号１４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳアイソフォーム２変異体は、配列番号１４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する（例えば、構成的に活性な）活性変異体である。
いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳG12S（配列番号１５又は配列番号１７）及びＨＲＡＳG12V（配列番号１６又は配列番号１８）から選択されるＨＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳタンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して１つ以上の置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、又はそれらの間の範囲）を有するＨＲＡＳ変異体である。
いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳタンパク質は、野生型ＮＲＡＳタンパク質（配列番号２０）である。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳタンパク質は、ＮＲＡＳ変異体、例えば、配列番号２０と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳ変異体は、配列番号２０と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの間の範囲）の配列同一性を有する（例えば、構成的に活性な）活性変異体である。
いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳタンパク質は、ＮＲＡＳG12D（配列番号２１）及びＮＲＡＳQ61R（配列番号２２）から選択されるＮＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳタンパク質は、配列番号２１又は配列番号２２に対して１つ以上の置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、又はそれらの間の範囲）を有するＮＲＡＳ変異体である。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質）又はその変異体は、融合体として、及び／又は検出、同定などのためのタグと共に発現し、提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質又はその変異体は、生物発光レポーターとの融合体として発現し、提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質又はその変異体は、ルシフェラーゼとの融合体として発現し、提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質又はその変異体は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの活性変異体との融合体として発現し、提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質又はその変異体は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓのルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国特許第８，５５７，９７０号及び米国特許第８，６６９，１０３号を参照、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）（配列番号２３）、ＮａｎｏＢｉＴ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国特許第９，７９７，８８９号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、又はＮａｎｏＴｒｉｐ（米国特許公開第２０２０／０２７０５８６号及び米国特許出願第１７／１０５，９２５号を参照、それらの全体が、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に基つく（例えば、構造的、機能的など）、生物発光ポリペプチド及び／又は生物発光複合体の成分との融合体として提供し、発現される。いくつかの実施形態において、本明細書の方法及びシステムには、市販のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベースの技術（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＢＲＥＴ、ＮａｎｏＢｉＴ、ＮａｎｏＴｒｉｐ、ＮａｎｏＧｌｏなど）が組み込まれるが、他の実施形態では、市販のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベースの技術からの様々な組み合わせ、変形、又は派生物が採用される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳタンパク質）は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３４４９号、米国特許第８，５５７，９７０号、国際特許出願第ＰＣＴ／２０１１／０５９０１８号、及び米国特許第８，６６９，１０３号（それらの全体が、あらゆる目的で、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及び／又は生物発光ポリペプチドを含むがこれらに限定されない生物発光ポリペプチドとの融合体として発現し、提供される。いくつかの実施形態において、そのような生物発光ポリペプチドは、本明細書に記載の方法及びシステムで使用するために、ＲＡＳタンパク質に（例えば、融合、化学的に連結されるなどで）連結される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳタンパク質）は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６３５４号、米国特許第９，７９７，８８９号、米国特許公開第２０２０／０２７０５８６号（ＷＯ２０１９／２４１４３８）、及び米国特許出願第１７／１０５，９２５号（それらの全体が、あらゆる目的で、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）、ＮａｎｏＴｒｉｐ、及び／又は生物発光複合体のペプチド及びポリペプチド成分を含むがこれらに限定されない生物発光複合体の成分との融合体として発現し、提供される。いくつかの実施形態において、そのような生物発光複合体のペプチド及び／又はポリペプチド成分は、本明細書に記載の方法及びシステムで使用するために、ＲＡＳタンパク質に（例えば、融合、化学的に連結されるなどで）連結される。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質は、ＬｇＢｉＴ（配列番号２５）、ＳｍＢｉＴ（配列番号２６）、ＬｇＴｒｉｐ３０９２（配列番号２７）、ＬｇＴｒｉｐ３５４６（配列番号２８）、ＬｇＴｒｉｐ２０９８（配列番号２９）、又はＳｍＴｒｉｐ９（配列番号３０）との融合体として発現し、提供される。
米国特許第１０，０２４，８６２号及び米国特許第９，９７７，５８６号（それらの全体が、あらゆる目的で、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、生物発光レポーター（例えば、ルシフェラーゼ、生物発光複合体の成分など）に連結（例えば、融合）されたＲＡＳタンパク質は、当該システム又は方法に存在し、タンパク質（例えば、キナーゼ）と共局在している生物発光レポーター及びエネルギー受容体（例えば、フルオロフォア）間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）によって検出され得る。
いくつかの実施形態において、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベース、ＮａｎｏＢｉＴベース、及び／又はＮａｎｏＴｒｉｐベースのペプチド、ポリペプチド、複合体、融合体、及び結合体のいずれも、本明細書に記載のシステム及び方法を用いたＢＲＥＴベースの用途に使用されてもよい。例えば、特定の実施形態において、本明細書では、生物発光レポーター（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベース、ＮａｎｏＢｉＴベース、及び／又はＮａｎｏＴｒｉｐベースのポリペプチド、ペプチド、又は複合体）に融合されたＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質）又はその変異体、及びエネルギー受容体（例えば、フルオロフォア（例えば、蛍光タンパク質、小分子フルオロフォアなど））を含むＲＡＳ結合剤が提供され、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベース、ＮａｎｏＢｉＴベース、及び／又はＮａｎｏＴｒｉｐベースのポリペプチド、ペプチド、又は複合体の発光スペクトルは、エネルギー受容体（例えば、フルオロフォア）の励起スペクトルと重複する。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤とＲＡＳタンパク質とのエンゲージメントにより、生物発光レポーターの基質（例えば、セレンテラジン、フリマジンなど）の存在下で、ＢＲＥＴが検出される。いくつかの実施形態において、候補ＲＡＳ結合化合物とＲＡＳタンパク質との結合により、ＲＡＳ結合剤が置き換えられ、ＢＲＥＴの減少が検出される。
ＩＩＩ．ＲＡＳ結合剤及び組成物
本明細書では、ＫＲＡＳ結合剤、ＨＲＡＳ結合剤、及びＮＲＡＳ結合剤を含むＲＡＳ結合剤、ならびにＲＡＳ結合剤を使用するシステム及び方法を開示する。ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分及び機能要素は、共有結合によって結合される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分及び機能要素は、リンカーによって結合される。
本明細書では、ＫＲＡＳ結合剤、ＨＲＡＳ結合剤、及びＮＲＡＳ結合剤を含むＲＡＳ結合剤、ならびにＲＡＳ結合剤を使用するシステム及び方法を開示する。ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分及び機能要素は、共有結合によって結合される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分及び機能要素は、リンカーによって結合される。
ＲＡＳ結合部分は、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳタンパク質）に結合すると知られている任意の部分であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分はＫＲＡＳ結合部分である。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分はＨＲＡＳ結合部分である。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分はＮＲＡＳ結合部分である。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合部分は、ＲＡＳ ＳＩ／ＳＩＩ部位に結合する部分である。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ結合部分は、ＫＲＡＳ ＳＩ／ＳＩＩ部位に結合する部分である。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳ結合部分は、ＨＲＡＳ ＳＩ／ＳＩＩ部位に結合する部分である。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳ結合部分は、ＮＲＡＳ ＳＩ／ＳＩＩ部位に結合する部分である。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、式（Ｉ）の化合物
又はその塩であり、
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ａは、Ｎ、Ｓ、及びＯから独立して選択される１個、２個、又は３個のヘテロ原子を有する単環式アリール又は単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、１個又は２個の窒素原子を有する単環式アリール又は単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される。いくつかの実施形態において、Ａは、フェニル、イミダゾール、及びピロールから選択される。
いくつかの実施形態において、Ａは、
から選択される式を有する。
いくつかの実施形態において、Ａは、
から選択される式を有する。
いくつかの実施形態において、Ａは、式
を有する。
いくつかの実施形態において、Ｒ1は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ1は基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2は水素であり、Ｒ3は水素又はメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ1は基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2は水素であり、Ｒ3はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ2は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ3は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ2は基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1は水素であり、Ｒ3は水素又はメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ2は基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1は水素であり、Ｒ3はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ3は、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素及びメチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ3は基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2の両方は、水素である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下から選択される構造を有する。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下から選択される構造を有する。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、構造
を有する。
式（Ｉ）の化合物は、基－リンカー－Ｂの一部としてリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、機能要素Ｂと化合物の残りの部分との間に十分な距離を提供し、他方への結合によって邪魔されずに（又は出来るだけ邪魔されずに）それぞれが機能できるようにする。例えば、いくつかの実施形態において、基Ｂが、（本明細書で更に説明するように）検出可能要素である場合、リンカーは、十分な距離を提供することで、式（Ｉ）の化合物がＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳ）に結合されるようにし、（例えば、干渉せず、又は最小限の干渉で）検出可能な部分が検出されるようにする。いくつかの実施形態において、リンカーは、機能要素（例えば、検出可能要素、固体表面など）を式（Ｉ）の化合物の残りから、５Å～１０００Åの両方を含んでの長さだけ分離する。いくつかの実施形態において、リンカーは、機能要素を式（Ｉ）の化合物の残りから、５Å、１０Å、２０Å、５０Å、１００Å、１５０Å、２００Å、３００Å、４００Å、５００Å、６００Å、７００Å、８００Å、９００Å、１０００Å、又はそれらの間の任意の好適な範囲（例えば、５～１００Å、５０～５００Å、１５０～７００Åなど）だけ分離する。いくつかの実施形態において、リンカーは、機能要素を式（Ｉ）の化合物の残りから、１個～２００個の原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２０個、１４０個、１６０個、１８０個、２００個、又はそれらの間の任意の好適な範囲（例えば、２～２０個、１０～５０個など））だけ分離する。
リンカーは、メチレン（－ＣＨ2－）、エーテル（－Ｏ－）、アミン（－ＮＨ－）、アルキルアミン（－ＮＲ－、ここでＲは任意選択で置換されたＣ1～Ｃ6アルキル基である）、チオエーテル（－Ｓ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エステル（－Ｃ（Ｏ）Ｏ－）、カルバミン酸（－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－）、スルホンアミド（－Ｓ（Ｏ）2ＮＨ－）、フェニレン（－Ｃ6Ｈ4－）、及びピペラジニレン（
）、及びそれらの任意の組み合わせから独立して選択される１つ以上の基を含み得る。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上の－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）－（オキシエチレン）基、例えば、１個～２０個の－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）－基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、もしくは２０個の－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）－基、又はその間の任意の範囲）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）4－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）5－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）7－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8－、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）9－、又は（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）10－基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）4－基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のアルキレン基（例えば、－（ＣＨ2）n－、ここでｎは１～１２、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２、又はそれらの間の任意の好適な範囲）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上の分岐状アルキレン基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのアミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、２つのアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのピペラジニレン基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能（例えば、酵素切断可能、化学切断可能など）部分を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、任意の好適な有機官能基（例えば、－ＯＨ、－ＮＨ2、－ＳＨ、－ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、ハロゲン（例えば、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ）、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ2、－ＣＨ3など）を含む、１つ以上の置換基、ペンダント、及び側鎖を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、２つ以上の直鎖状に結合されたＣ、Ｓ、Ｎ、及び／又はＯ原子を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１個～２００個の直鎖状に結合された原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２０個、１４０個、１６０個、１８０個、２００個、又はそれらの間の任意の好適な範囲（例えば、２個～２０個、１０個～５０個、６個～１８個））を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１個～２００個の直鎖状に結合された原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２０個、１４０個、１６０個、１８０個、２００個、又はそれらのうちの任意の好適な範囲（例えば、２個～２０個、１０個～５０個、６個～１８個））を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、以下の式を有する。
式中、ｍ及びｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態において、ｍ及びｎは、独立して、０、１、２、又は３である。いくつかの実施形態において、ｍ及びｎは、独立して、１、２、又は３である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、以下の式を有する。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、又は４である。いくつかの実施形態において、ｍ及びｎは、独立して、１、２、又は３であり、ｐは、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、以下の式を有する。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、又は４である。いくつかの実施形態において、ｍ及びｎは、独立して、１、２、３、又は４であり、ｐは、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、以下の式を有する。
式中、ｍは０、１、２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態において、ｍは１、２、又は３である。いくつかの実施形態において、ｍは１又は２である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、以下の式を有する。
式中、ｐは、１、２、３、４、５、又は６である。
いくつかの実施形態において、リンカーは以下から選択される。
いくつかの実施形態において、リンカーは以下から選択される。
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である。
式（Ｉ）の化合物は、基－リンカー－Ｂ（Ｂは機能要素）の一部としての機能要素を含む。特定の実施形態において、機能要素は、ＲＡＳ結合剤の検出を可能にする検出可能な特性を有する。検出可能要素は、発光又は吸光度、磁性、電子スピン共鳴、電気容量、誘電率、又は電気伝導度などの特徴的な電磁スペクトル特性を有する要素、ならびに強磁性、常磁性、反磁性、発光性、電気化学発光性、蛍光性、燐光性、有色性、抗原性であるか、又は特徴的な質量を有する官能基を有する要素を含む。検出可能要素は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド）、タンパク質（例えば、発光タンパク質）、ペプチド、放射性核種、親和性タグ（例えば、ビオチン又はストレプトアビジン）、ハプテン、アミノ酸、脂質、脂質二重層、固体担体、フルオロフォア、発色団、レポーター分子、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤（例えば、マンガン、ガドリニウム（ＩＩＩ）、もしくは酸化鉄粒子）又はその配位子、ＳＰＥＣＴ造影剤などを含むが、これらに限定されない。特定の検出可能要素を検出する方法、又は特定の検出可能要素とそれに結合するものを含む組成物を単離する方法は理解されており、蛍光、質量分析、放射性核種の検出、光学イメージング、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、及びエネルギー移動などの方法を含む。
いくつかの実施形態において、機能要素は、固体担体であるか、又はそれを含む。好適な固体担体としては、磁性粒子、セファロース、又はセルロースビーズなどの沈降粒子、膜、ガラス（例えばガラススライド）、セルロース、アルギン酸、プラスチック、もしくは他の合成調製されたポリマー（例えば、エッペンドルフチューブ又はマルチウェルプレートのウェル）、自己組織化単層、表面プラズモン共鳴チップ、電子伝導性表面を有する固体担体などが含まれる。
例示的な機能要素としては、ハプテン（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンなどの免疫原性を高めるのに有用な分子）、切断可能な標識（例えば、光切断可能なビオチン）、及び蛍光標識（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で修飾されたクマリン及びスクシンイミド又はスルホノスクシンイミドで修飾されたＢＯＤＩＰＹ（ＵＶ及び／又は可視励起蛍光検出で検出可能）、ローダミン（Ｒ１１０、ロドール、ＣＲＧ６、テキサスメチルレッド（ＴＡＭＲＡ）、Ｒｏｘ５、ＦＡＭ、又はフルオレセイン）、クマリン誘導体（例えば、７アミノクマリン、及び７－ヒドロキシクマリン、２－アミノ－４－メトキシナフタレン、１－ヒドロキシピレン、レゾルフィン、フェナレノン又はベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号））、アクリジノン（米国特許第４，８１０，６３６号）、アントラセン、ならびにアルファ及びベータ－ナフトールの誘導体、フッ素化フルオレセイン及びロドールを含むフッ化キサンテン誘導体（例えば、米国特許第６，１６２，９３１号）、及び生物発光分子（例えば、ルシフェラーゼ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ誘導体ルシフェラーゼ（例えば、米国特許公開第２０１０／０２８１５５２号及び米国特許公開第２０１２／０１７４２４２、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）又はＧＦＰもしくはＧＦＰ誘導体）が挙げられる。
別のクラスの検出可能な要素としては、電磁放射線を用いて検出可能な分子が挙げられ、キサンテンフルオロフォア、ダンシルフルオロフォア、クマリン及びクマリン誘導体、蛍光アクリジニウム部分、ベンゾピレン系フルオロフォア、ならびに７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール、及び３－Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）－２，３－ジアミノプロピオン酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、蛍光分子は、天然アミノ酸とは異なる波長で高い量子収率の蛍光を有し、より好ましくは、スペクトルの可視部分、又はＵＶ及び可視部分の両方で励起され得る高い量子収率の蛍光を有する。予め選択された波長で励起されると、分子は視覚的、又は従来の蛍光検出方法を使用して低濃度で検出可能である。ルテニウムキレート及びその誘導体、又はニトロキシドアミノ酸及びその誘導体などの電気化学発光分子は、フェムトモル範囲以下で検出可能である。
いくつかの実施形態において、検出可能要素は、フルオロフォアなどのエネルギー受容体である。好適なフルオロフォアとしては、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッドなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びプロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ ＦＬｕｏＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ ＣＹ色素（ＣＹＡＮＤＹＥ，ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ ＡＮＤ ＳＱＵＡＲＥ ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ ＦＬＵＯＲ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ ＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓ）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自己蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅなど）、量子ドットナノ結晶などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、米国特許公開第２０１３／０３１７２０７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたもののようなローダミン類似体（例えば、カルボキシローダミン類似体）である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアはＢＯＤＩＰＹ色素である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアはＤＹ－６０５（Ｄｙｏｍｉｃｓ）である。
いくつかの実施形態において、検出可能要素は、式
を有するエネルギー受容体（フルオロフォア）である。
いくつかの実施形態において、検出可能要素は、式
もしくはその塩、又はその互変異性体を有するエネルギー受容体（フルオロフォア）である。
蛍光分子に加え、電磁場及び放射線に対する分子の相互作用及び応答に基づく物理的特性を有する様々な分子が、本明細書に開示されるＲＡＳ結合剤における検出可能な部分として使用される。これらの特性としては、電磁スペクトルの紫外、可視、及び赤外領域での吸収、ラマン活性があり、かつ共鳴ラマン分光法によって更に強化できる発色団の存在、電子スピン共鳴活性、ならびに核磁気共鳴及び例えば、質量分析計を介した分子量が挙げられる。
いくつかの実施形態において、機能要素は捕捉要素である。いくつかの実施形態において、捕捉要素はタンパク質（例えば、酵素）の基質であり、捕捉剤はそのタンパク質である。いくつかの実施形態において、捕捉要素は、「共有結合性基質」、又はそれが反応するタンパク質もしくは酵素と共有結合を形成するものである。基質は、酵素との相互作用の際に酵素と共有結合を形成する反応性基（例えば、修飾基質）を含んでもよく、又は酵素は、共有結合した中間体を基質と調和させることができない変異型バージョンであってもよい。いくつかの実施形態において、基質は、それに対して共有結合を形成する変異型タンパク質（例えば、変異型デハロゲナーゼ）によって認識される。そのような実施形態において、基質とタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）の野生型バージョンとの相互作用は、野生型タンパク質の生成物及び再生をもたらす。一方で、基質（例えば、ハロアルカン）とタンパク質（例えば、デハロゲナーゼ）の変異型バージョンとの相互作用は、タンパク質と基質との間に安定した結合形成（例えば、共有結合形成）をもたらす。基質は、通常はタンパク質によって一時的にのみ結合される基質と超安定な結合又は共有結合を形成するように改変されている任意の変異型タンパク質に好適な任意の基質であり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は変異型の加水分解酵素又はデハロゲナーゼである。いくつかの実施形態において、タンパク質は変異型デハロゲナーゼであり、基質はハロアルカンである。いくつかの実施形態において、ハロアルカンは、末端ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉなど）によってキャップされたアルカン（例えば、Ｃ2～Ｃ20）を含む。いくつかの実施形態において、ハロアルカンは式Ａ－Ｘのものであり、式中、Ｘはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉなど）であり、Ａは２個～２０個の炭素を含むアルカンである。特定の実施形態において、Ａは２個～１２個の炭素の直鎖セグメントを含む。特定の実施形態において、Ａは２個～１２個の炭素の直鎖セグメントである。いくつかの実施形態において、ハロアルカンは、変異型デハロゲナーゼとの相互作用を妨害しない任意の追加のペンダント又は置換を含み得る。
いくつかの実施形態において、捕捉剤はＳＮＡＰタグであり、捕捉要素はベンジルグアニンである（例えば、Ｃｒｉｖａｔ Ｇ，Ｔａｒａｓｋａ ＪＷ，（Ｊａｎｕａｒｙ，２０１２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３０（１）：８－１６を参照、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ＣＬＩＰタグであり、捕捉要素はベンジルシトシンである（例えば、Ｇａｕｔｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；１５（２）：１２８－３６、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
それらの基質（例えば、ハロアルカン基質）に共有結合する変異型タンパク質（例えば、変異型加水分解酵素（例えば、変異型デハロゲナーゼ））を含むシステムは、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、及び米国特許第７，米国特許第７，８６７，７２６号に記載され、これらはその全体が、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、機能要素は、親和性要素（例えば、親和性剤に結合するもの）である。そのような対の例としては、親和性剤としての抗体と親和性要素としての抗原、親和性要素としてのＨｉｓタグと親和性剤としてのニッケルカラム、親和性剤及び親和性要素として高い親和性をそれぞれ有するタンパク質及び小分子（例えば、ストレプトアビジン及びビオチン）などが挙げられる。親和性分子の例としては、免疫原性分子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、又は脂質のエピトープ（例えば、その分子に特異的な抗体を調製するのに有用な任意の分子））、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びそれらの誘導体、金属結合分子、ならびにこれらの分子の断片及び組み合わせなどの分子が挙げられる。例示的な親和性分子としては、５ｘＨｉｓ（ＨＨＨＨＨ）（配列番号３１）、６ｘＨｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号３２）、Ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号３３）、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３４）、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号３５）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号３６）、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、Ｓ－ペプチド、Ｔ７ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド、Ｃ－末端ＲＮＡタグ、金属結合ドメイン、金属結合反応性基、アミノ酸反応性基、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。親和性分子の別の例は、ダンシルリジンである。ダンシル環と相互作用する抗体は市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、又はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８）に記載された既知のプロトコールを用いて調製することができる。
いくつかの実施形態において、機能要素は、タンパク質分解を誘導する部分である。例えば、機能要素は、生細胞内でタンパク質分解経路を動員する部分であり得る。タンパク質分解を誘導することに好適な機能要素としては、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１７，１６，１０１－１１４に開示されたものが含まれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、機能要素は、アダマンタン又はＡｒｇ－Ｂｏｃ3などの疎水性基であり、これは疎水性タグ付け（ＨｙＴ）によってタンパク質分解を誘導する。いくつかの実施形態において、Ｚは、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ベスタチン、ＶＨＬリガンド、ポマリドマイド、及びＬａｉ ｅｔ ａｌ．に開示された他の小分子からの部分であり、これらは、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、生体適合性（例えば、細胞適合性）及び／又は細胞透過性である。従って、いくつかの実施形態において、好適な機能要素（例えば、検出可能要素、親和性要素、固体担体、捕捉要素）は、そのような化合物の脈絡内で細胞適合性及び／又は細胞透過性のものである。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、細胞膜を通過して細胞に入ることが可能（例えば、拡散、エンドサイトーシス、能動輸送、受動輸送などを介して）である。いくつかの実施形態において、好適な機能要素及びリンカーは、それらの特定の機能に加え、細胞適合性及び／又は細胞透過性に基づいて選択される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、
から選択される化合物、又は互変異性体もしくはその塩である。
式（Ｉ）の化合物などのＲＡＳ結合剤は、塩の形態であり得る。中性形態は、塩を塩基又は酸と接触させ、親化合物を従来の様式で単離することによって再生され得る。化合物の親形態は、極性溶媒中での溶解度などのある特定の物理的特性において、種々の塩形態とは異なるが、さもなければ塩は、本開示の目的に関して、化合物の親形態と同じである。
特に、ＲＡＳ結合剤（例えば、式（Ｉ）の化合物）がアニオン性であるか、又はアニオン性であり得る官能基（例えば、－ＣＯＯＨは－ＣＯＯ-であり得る）を有する場合、塩は１つ以上の好適なカチオンで形成され得る。好適な無機カチオンの例としては、Ｌｉ+、Ｎａ+、及びＫ+などのアルカリ金属カチオン、Ｃａ2+及びＭｇ2+などのアルカリ土類カチオン、及び他のカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。ナトリウム塩が特に好適であり得る。好適な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ4
+）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ3Ｒ1
+、ＮＨ2Ｒ2
+、ＮＨＲ3
+、及びＮＲ4
+）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例としては、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミンから由来するもの、ならびにリジン及びアルギニンなどのアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、化合物はナトリウム塩である。
ＲＡＳ結合剤（例えば、式（Ｉ）の化合物）がカチオン性であるか、又はカチオン性であり得る官能基（例えば、－ＮＨ2が－ＮＨ3
+であり得る）を有する場合、塩は、好適なアニオンで形成し得る。好適な無機アニオンの例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸の無機酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。好適な有機アニオンの例としては、２－アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、テトラフルオロホウ酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、吉草酸の有機酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、化合物は、クロロ、ブロモ、又はヨード塩などのハライド塩である。いくつかの実施形態において、化合物は、テトラフルオロホウ酸塩又はトリフルオロメタンスルホン酸塩である。
ＲＡＳ結合剤（例えば、式（Ｉ）の化合物）は、実施例に示されるものを含む様々な方法によって調製することができる。本明細書の化合物及び中間体は、当業者に周知の有機合成の方法によって単離及び精製し得る。化合物の単離及び精製の従来方法の例としては、例えば、「Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）， ｂｙ Ｆｕｒｎｉｓｓ， Ｈａｎｎａｆｏｒｄ， Ｓｍｉｔｈ， ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ， ｐｕｂ．Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ， Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ， Ｅｎｇｌａｎｄに記載の、活性炭で任意選択で前処理を行う高温及び低温での再結晶よるシリカゲル、アルミナ、又はアルキルシラン基で誘導体化したシリカなどの固体担体でのクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、各種圧力での蒸留、減圧下での昇華及び粉砕などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
個別のステップごとの反応条件及び反応時間は、採用する特定の反応物及び使用する反応物に存在する置換基に応じて変化し得る。具体的な手順は、実施例の節で提供する。反応は、例えば、残基から溶媒を除去し、これに限るものではないが、結晶化、蒸留、抽出、粉砕、及びクロマトグラフィーなどの、当業者に一般的に知られている方法論に従って更に精製することによって、従来の方法で後処理することができる。特に明記しない限り、出発物質及び試薬は、市販品で入手するか、又は化学文献に記載の方法を使用して当業者が商業的に利用可能な材料から調製することが可能である。市販されていない場合、出発物質は、標準的な有機化学技法、既知の構造的に類似した化合物の合成に類似する技法、もしくは上述のスキームに類似する技法から選択される手順、又は合成実施例節に記載される手順によって調製され得る。
反応条件、試薬、及び合成経路の順序の適切な操作、反応条件と適合し得ない任意の化学的官能性の保護、ならびに方法の反応順序における好適な時点での脱保護を含む日常的な実験は、本発明の範囲に含まれる。好適な保護基ならびにそのような好適な保護基を使用して異なる置換基を保護及び脱保護するための方法は、当業者に周知であり、それらの例は、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（５ｔｈ ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０１４）と題されたＰＧＭ Ｗｕｔｓによる専門書において見出すことができ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の化合物の合成は、上記の合成スキーム及び特定の実施例に記載されるものに類似の方法によって達成され得る。
開示された化合物の光学活性体が必要な場合、光学活性出発物質（例えば、好適な反応ステップの不斉誘導によって調製されるもの）を使用し、本明細書に記載の手順の１つを実行することによって、又は、化合物もしくは中間体の立体異性体の混合物を、標準的な手順（クロマトグラフィー分離、再結晶、酵素分割など）を使用して分割することによって得ることができる。
同様に、化合物の純粋な幾何異性体が必要な場合、出発物質として純粋な幾何異性体を使用し、上記の手順のいずれかを実行することによって、又は、化合物もしくは中間体の幾何異性体の混合物を、クロマトグラフィー分離などの標準的な手順を使用して分割することによって得ることができる。
記載された合成スキーム及び具体的な実施例は、説明のためのものであり、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。合成方法及び具体的な実施例における全ての代替方法、変更、及び等価物は、特許請求の範囲内に含まれる。
ＲＡＳ結合剤を含む組成物も本明細書で提供される。組成物は、本明細書に記載のＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳタンパク質、ＨＲＡＳタンパク質、ＮＲＡＳタンパク質、又はそれらのいずれかの変異体）などのＲＡＳタンパク質を更に含んでもよい。ＲＡＳタンパク質が生物発光レポーターとの融合体であるいくつかの実施形態において、組成物は、生物発光レポーターの基質（例えば、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジン）を更に含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＡＳ阻害剤（例えば、ＫＲＡＳ阻害剤、ＨＲＡＳ阻害剤、又はＮＲＡＳ阻害剤）などの候補ＲＡＳ結合化合物（例えば、ＫＲＡＳ結合化合物、ＨＲＡＳ結合化合物、ＮＲＡＳ結合化合物）を更に含む。
ＩＶ．システム及び方法
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＲＡＳ結合化合物を同定する（すなわち、候補ＲＡＳ結合化合物によるＲＡＳタンパク質とのターゲットエンゲージメントを評価する）ためのシステム及び方法を提供する。システム及び方法では、上述のＲＡＳタンパク質及びＲＡＳ結合剤を使用し、ＲＡＳ結合化合物（例えば、ＲＡＳ阻害剤）を同定する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＲＡＳ結合化合物を同定する（すなわち、候補ＲＡＳ結合化合物によるＲＡＳタンパク質とのターゲットエンゲージメントを評価する）ためのシステム及び方法を提供する。システム及び方法では、上述のＲＡＳタンパク質及びＲＡＳ結合剤を使用し、ＲＡＳ結合化合物（例えば、ＲＡＳ阻害剤）を同定する。
一態様において、本明細書では、ＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む、当該方法を提供する。
（ａ）ＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む、当該方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、ＫＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＫＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＫＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、ＨＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＨＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＨＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、ＮＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＮＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
（ａ）ＮＲＡＳタンパク質を含む試料を提供することと、
（ｂ）当該試料を、ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、（ｃ）当該機能要素を検出又は定量化するステップを更に含む。機能要素を検出又は定量化するために使用できる方法は、ＲＡＳ結合剤（例えば、ＫＲＡＳ結合剤、ＨＲＡＳ結合剤、又はＮＲＡＳ結合剤）に存在する機能要素に依存する。例えば、いくつかの実施形態において、当該機能要素は、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である。従って、いくつかの実施形態において、当該検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルは、蛍光、光学イメージング、放射性核種検出、質量分析、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される。
一態様において、本明細書では、
（ａ）標的ＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
（ａ）標的ＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＲＡＳ結合化合物とを含む、システムを提供する。
いくつかの実施形態において、当該システムは、
（ａ）標的ＫＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＫＲＡＳ結合化合物とを含む。
（ａ）標的ＫＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＫＲＡＳ結合化合物とを含む。
いくつかの実施形態において、当該システムは、
（ａ）標的ＨＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＨＲＡＳ結合化合物とを含む。
（ａ）標的ＨＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＨＲＡＳ結合化合物とを含む。
いくつかの実施形態において、当該システムは、
（ａ）標的ＮＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＮＲＡＳ結合化合物とを含む。
（ａ）標的ＮＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＮＲＡＳ結合化合物とを含む。
別の態様において、本明細書では、ＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
（ａ）（ｉ）ＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、ＫＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＫＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ結合化合物は、ＫＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
（ａ）（ｉ）ＫＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ結合化合物は、ＫＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、ＨＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＨＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳ結合化合物は、ＨＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
（ａ）（ｉ）ＨＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＲＡＳ結合化合物は、ＨＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、ＮＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＮＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳ結合化合物は、ＮＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
（ａ）（ｉ）ＮＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ＮＲＡＳ結合化合物は、ＮＲＡＳタンパク質に結合し、機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる。
開示されるシステム及び方法において、ＲＡＳ結合剤は、本明細書に開示されるＲＡＳ結合剤（例えば、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤、又はＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤）である。例示的なＲＡＳ結合剤は、式（Ｉ）の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で論じるように、システム又は方法におけるＲＡＳタンパク質はＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、システム又は方法におけるＫＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、及びＫＲＡＳG13Dから選択される変異体などのＫＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、システム又は方法におけるＫＲＡＳタンパク質はＫＲＡＳG12Cである。いくつかの実施形態において、システム又は方法におけるＨＲＡＳタンパク質は、ＨＲＡＳG12S及びＨＲＡＳG12Vから選択される変異体などのＨＲＡＳ変異体である。いくつかの実施形態において、システム又は方法におけるＮＲＡＳタンパク質は、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである。
いくつかの実施形態において、上述のように、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質、又はそれらの変異体）は、システム又は試料内で発現される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（又はその変異体）は、無細胞系又は試料、例えば、インビトロ試料又は精製タンパク質試料で提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（又はその変異体）は、プローブ置換アッセイ（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、放射性リガンド結合などに基づくプローブ置換アッセイ）用の無細胞試料で提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質、又はそれらの変異体）は、ルシフェラーゼ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）などの生物発光レポーターとの融合体として、本明細書に開示されるシステムおよび方法で提供し、発現される。特定の実施形態において、ＲＡＳタンパク質又はその変異体は、生物発光ポリペプチド及び／又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（配列番号２３及び配列番号２４）、ＮａｎｏＢｉＴ、又はＮａｎｏＴｒｉｐに基づく生物発光複合体の成分との融合体として提供し、発現される。別の特定の実施形態において、ＲＡＳタンパク質は、本明細書に記載のＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）、ＮａｎｏＴｒｉｐ、及び／又は生物発光複合体のペプチド及びポリペプチド成分を含むがこれらに限定されない生物発光複合体の成分との融合体として発現し、提供される。いくつかの実施形態において、そのような生物発光複合体のペプチド及び／又はポリペプチド成分は、本明細書に記載の方法及びシステムで使用するために、ＲＡＳタンパク質に（例えば、融合、化学的に連結されるなどで）連結される。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質は、ＬｇＢｉＴ（配列番号２５）、ＳｍＢｉＴ（配列番号２６）、ＬｇＴｒｉｐ３０９２（配列番号２７）、ＬｇＴｒｉｐ３５４６（配列番号２８）、ＬｇＴｒｉｐ２０９８（配列番号２９）、又はＳｍＴｒｉｐ９（配列番号３０）との融合体として発現し、提供される。生物発光レポーターとのＲＡＳ融合体を使用する実施形態において、方法は、試料を生物発光レポーターの基質と接触させるステップを更に含み得る。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターの基質は、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体（例えば、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジン）、及びフリマジンから選択される。いくつかの実施形態において、生物発光レポーターの基質は、フリマジンである。
ＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質、又はその変異体）と生物発光レポーターとの融合タンパク質が、本明細書に記載のシステム及び方法で使用される場合、及びＲＡＳ結合剤が、機能要素としてエネルギー受容体（例えば、フルオロフォア）を含む場合、方法は、生物発光レポーターの発光スペクトルとエネルギー受容体の励起スペクトルが重複すると、生物発光レポーターからエネルギー受容体へのエネルギー移動を検出するステップを更に含み得る。このようなステップでは、例えば、試料と候補ＲＡＳ結合化合物との接触によるエネルギー移動の変化を検出することによって、ＲＡＳ結合化合物を同定することが可能である。例示的なアッセイを図１に示す。ＲＡＳタンパク質は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼとの融合体として発現し、ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳ結合部分及びエネルギー受容体を含む。ＲＡＳ結合剤がＲＡＳタンパク質に結合し、試料がＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼの基質（例えば、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジン）と接触すると、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼからエネルギー受容体へのエネルギー移動が検出され得る。候補ＲＡＳ結合化合物がＲＡＳタンパク質に結合すると、ＢＲＥＴシグナルが減少する。本明細書の実施例に示すように、候補ＲＡＳ結合化合物がＲＡＳタンパク質上のＲＡＳ結合剤とは異なる部位に結合する場合でも、ＢＲＥＴシグナルの喪失を検出することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する一方、候補ＲＡＳ結合化合物は、スイッチＩ／ＩＩ部位又はスイッチＩＩ部位に結合する。別の実施形態において、ＲＡＳ結合剤は、ＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する一方、候補ＲＡＳ結合化合物は、スイッチＩ／ＩＩ部位又はスイッチＩＩ部位に結合する。いくつかの実施形態において、ＲＡＳタンパク質（又はその変異体）に結合することが決定された候補ＲＡＳ結合化合物は、ＲＡＳ結合剤として（例えば、機能要素に結合して）使用することができ、他の候補ＲＡＳ結合化合物に対してスクリーニングすることができる。
従って、いくつかの実施形態において、本明細書では、生物発光レポーター（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベースのレポーター）に融合されたＲＡＳタンパク質と、検出可能要素としてエネルギー受容体（例えば、フルオロフォア）を含むＲＡＳ結合剤とを含むシステム及び方法を提供し、生物発光レポーターの発光スペクトル及びフルオロフォアの励起スペクトルが重複し、生物発光レポーターとエネルギー受容体（例えば、フルオロフォア）との間のＢＲＥＴ増加（例えば、出現）によって、ＲＡＳタンパク質へのＲＡＳ結合剤のエンゲージメント（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）（例えば、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））を検出することができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合化合物のＲＡＳタンパク質へのエンゲージメント（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）（例えば、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ））は、その後、生物発光レポーターとエネルギー受容体（例えば、フルオロフォア）との間のＢＲＥＴの減少（例えば、喪失）によって検出することができる。
いくつかの実施形態において、生物発光レポーターは、配列番号２４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はその間の任意の範囲）の配列同一性を有するルシフェラーゼである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステム及び方法は、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質、及び生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質を含み、第１及び第２のサブユニットは相補的である。ＲＡＳ多量体種が細胞内で形成されると（例えば、二量体）、２つの相補的な生物発光レポーター・サブユニットが近接し、基質（例えば、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジン）との反応で発光シグナルを生成する機能的ルシフェラーゼを形成する。従って、いくつかの実施形態において、生物発光レポーターの第１のサブユニットは、配列番号２５と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はその間の任意の範囲）の配列同一性を有し、生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はその間の任意の範囲）の配列同一性を有する。
本明細書に開示される方法は、多種多様な試料を用いて使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、試料は、細胞、細胞溶解物、体液、組織、生物学的試料、インビトロ試料、環境試料、無細胞試料、及び精製試料（例えば、精製タンパク質試料）から選択される。いくつかの実施形態において、試料は、生物発光レポーターに融合したＲＡＳタンパク質又はその変異体（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質、又はその変異体）などの、ＲＡＳタンパク質又はその変異体（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳタンパク質、又はその変異体）を発現する細胞などの細胞を含む。
本明細書に開示されるシステム及び方法に係るいくつかの実施形態において、ＲＡＳ結合剤は細胞透過性である。生物発光レポーターを使用するものなどのいくつかの実施形態において、システム及び方法は、ＢＲＥＴシグナルが、損なわれていない生きた細胞に由来することを確実にする生物発光レポーターの細胞不透過性阻害剤を更に含む。
Ｖ．実施例
実施例１
ＲＡＳ結合剤の合成
３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０２４）
ステップ１．３－（２－ニトロビニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（ＪＲＷ－１９９１）
ニトロメタン（１０ｍＬ）中の３－ホルミル－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（０．３９ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、酢酸アンモニウム（４００ｍｇ）を添加した。この混合物を８５℃に１８時間加熱した。反応物を冷却し、黄色の沈殿を得た。固体をろ過し、メタノール／水（１：１）で洗浄し、黄色固体として粗生成物（２９０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２１４［Ｍ＋１］＋。
実施例１
ＲＡＳ結合剤の合成
３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０２４）
ステップ２．３－（２－ニトロエチル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（ＪＲＷ－１９９２）
テトラヒドロフラン／メタノール（１：１、１０ｍＬ）中の３－（２－ニトロビニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（２９０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（６２ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２２０ｍｇ、２つのステップにわたり４４％）を淡黄色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２１４［Ｍ－１］＋。
ステップ３．（２－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０１６）
氷浴で冷やしたアセトニトリル（２０ｍＬ）中の３－（２－ニトロエチル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（２２０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（６６０ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ）及びトリクロロシラン（４８４ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を０℃で３０分間、室温で３時間撹拌した。反応物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（１０ｍＬ）で中和し、次いでジ－ｔｅｒｔ－ブチルデカーボネート（４３６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をアミノ中間体に添加した。混合物を室温で１８時間撹拌した。反応物をアセトニトリルで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１６０ｍｇ、５６％）を白色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２８６［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（２－（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０１７）
氷浴で冷やしたテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の（２－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１６０ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（４５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、６０％）、１－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール（９８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（２０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、室温で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１２０ｍｇ、５６％）を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８０［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．（２－（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０１９）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（２－（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１２０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で５時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（７５ｍｇ、６２％）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８４［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０２１）
トルエン（１０ｍＬ）中の（２－（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（６５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（１０２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を１００℃で１８時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、１時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４２ｍｇ、３７％）を橙色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２０２２）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４２ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ８．３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０２４）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（７ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１３ｍｇ、８６％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８７１［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル））－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０２５）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（１２ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１３ｍｇ、６５％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１１８［Ｍ＋１］＋。
３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（２－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０２９）
ステップ１．（２－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－１９８７）
テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の３－ホルミル－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（４７７ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）の溶液に、（２－（ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（７７１ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．５ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を４０℃で１８時間撹拌した。混合物を水で希釈し、クロロホルム／イソプロパノール（３：１）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（９１０ｍｇ、８５％）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８４［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（２－（４－（（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０１１）
氷浴で冷やしたテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の（２－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（４２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、６０％）、１－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール（７４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（２０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、室温で６時間撹拌した。混合物を水（ｐＨ１０）で希釈し、クロロホルム／イソプロパノール（３：１）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１８７ｍｇ、７５％）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ４７８［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（２－（４－（（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０１３）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（２－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１８７ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で５時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、所望の生成物（１７０ｍｇ、粗）を無色ワックスとして得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ４８２［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（２－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０２３）
トルエン（１０ｍＬ）中の（２－（４－（（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（６５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（４０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（８２ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を１００℃で１８時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（１６ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、１時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３５ｍｇ、３４％）を茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７５８［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．３－（２－（（（（３－（（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２０２６）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（２－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２５ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で４時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６５８［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（２－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０２９）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１３ｍｇ、８６％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９６９［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（４－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０３０）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１３ｍｇ、７２％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １２１６［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパンアミド）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０３８）
ステップ１．３－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－１９９５）
アセトニトリル（１０ｍＬ）中の３－ホルミル－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（２００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃に加熱した。２－（トリフェニル－１５－ホスホラニリデン）酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．１ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加した。反応物を８０℃で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１２５ｍｇ、４０％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２６９［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．３－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－１９９７）
メタノール／酢酸エチル（１：１、１０ｍＬ）中の３－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（１２０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウム炭素（１０ｍｇ）を添加した。水素バルーン下、反応物を室温で２時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、クロマトグラフィーに付し、所望の生成物（１０５ｍｇ、８７％）を淡赤色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２７１［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．３－（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０２０）
氷浴で冷やしたテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の３－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１０５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（２３ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、６０％）、１－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール（６８ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（１４ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、６０℃で３時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３６５［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．３－（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０２７）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の３－（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で４時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（９０ｍｇ、２つのステップにわたり６３％）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３６９［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０３１）
トルエン（１０ｍＬ）中の３－（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（９０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（２００ｍｇ）を添加した。懸濁液を１００℃で６時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（２９ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、１時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（８５ｍｇ、５２％）を茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６４５［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（ＪＲＷ－２０３４）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸ｔｅｒｔ－ブチル（８５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５８９［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．（２－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパンアミド）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０３５）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（４５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（５１ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及び（２－アミノエチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、２つのステップにわたり２１％）を薄茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７３１［Ｍ＋１］＋。
ステップ８．Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０３６）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（２－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパンアミド）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６３１［Ｍ＋１］＋。
ステップ９．１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２）－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパンアミド）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０３８）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＮ－（２－アミノエチル）－３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロペンアミド（０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１０ｍｇ、６４％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１８９［Ｍ＋１］＋。
４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）ブタンアミド（ＪＲＷ－２０９３）
ステップ１．３－ブロモ－６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０７２）
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の３－ブロモ－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（１．０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルデカーボネート（１．２ｇ、５．４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ））、及びＮ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．０５５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物をジクロロメタンで希釈し、ＨＣｌと共に水に注ぎ、層を分離した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１．３ｇ、８９％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３２２［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．３－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパ－１－イン－１－イル）－６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０７４）
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の３－ブロモ－６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．３ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパ－２－イン－１－イルカルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．６ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（０．２８ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（０．０７７ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（０．４２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を脱気し、窒素でパージした。ジエチルアミン（４．４ｇ、６０．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を６０℃で５時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．８０ｇ、５０％）を薄茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３９６［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（３－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパ－２－イン－１－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０７６）
メタノール／テトラヒドロフラン（１：１、２０ｍＬ）中の３－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパ－１－イン－１－イル）－６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（３００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（４９４ｍｇ、１．５ｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物を黄色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２９６［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（３－（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパ－２－イン－１－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０７７）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（３－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパ－２－イン－１－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（４５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、６０％）、１－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール（１４８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（２８ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、室温で６時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１３０ｍｇ、４４％）を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３９０［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．（３－（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０８０）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（３－（６－シアノ－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパ－２－イン－１－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１３０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、所望の生成物（１２０ｍｇ、粗）を薄茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３９４［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０８３）
トルエン（１０ｍＬ）中の３－（６－（アミノメチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（２００ｍｇ）を添加した。懸濁液を１００℃で１８時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（２９ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、２時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４０ｍｇ、２３％）を薄茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６７４［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．３－（２－（（（（３－（３－アミノプロピル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２０９０）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５７４［Ｍ＋１］＋。
ステップ８．４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）ブタンアミド（ＪＲＷ－２０９３）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（３－アミノプロピル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）ブタン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１３ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（９ｍｇ、３６％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９７０［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０９４）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（３－アミノプロピル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（５ｍｇ、３５％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１３２［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（２－（１－ベンジル－６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０９５）
ステップ１．（２－（１－ベンジル－６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０７９）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（２－（６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（５５０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（１５４ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ、６０％）、塩化ベンジル（３６６ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（７１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、室温で８時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４４５ｍｇ、６１％）を薄茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３７６［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（２－（６－（アミノメチル）－１－ベンジル－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０８４）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（２－（１－ベンジル－６－シアノ－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４４５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、所望の生成物（４３０ｍｇ、粗）を黄色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８０［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（２－（１－ベンジル－６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２０８５）
トルエン（１０ｍＬ）中の（２－（６－（アミノメチル）－１－ベンジル－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１１６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（２００ｍｇ）を添加した。懸濁液を１００℃で１８時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（２９ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、２時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（７８ｍｇ、４６％）を茶色ガラスとして得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６５６［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－ベンジル－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２０９１）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（２－（１－ベンジル－６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（７８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５５６［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．Ｎ－（２－（１－ベンジル－６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２０９５）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－ベンジル－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（３ｍｇ、２０％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１３２［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（２－（１－ベンジル－６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２０９６）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－ベンジル－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１０ｍｇ、４３％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８６７［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（２－（１－ベンジル－６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）ブタンアミド（ＪＲＷ－２０９７）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－ベンジル－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）ブタン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（６ｍｇ、２４％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９５２［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１１１）
ステップ１．（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２１０５）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（５００ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（２１１ｍｇ、５．３ｍｍｏｌ、６０％）、（４－（クロロメチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．１ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（１３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、室温で１時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１．２ｇ、９４％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３６２［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２１０６）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、粗生成物を黄色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３６６［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２１０９）
トルエン（１０ｍＬ）中の（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２７５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（１１０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（２００ｍｇ）を添加した。懸濁液を１００℃で１８時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（４３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、３０分間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４５ｍｇ、１８％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６４２［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．３－（２－（（（（１－（４－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２１１０）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４５ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を薄茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５４２［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１１１）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（４－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（５ｍｇ、１６％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１００［Ｍ＋１］＋。
４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル））アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）ブタンアミド（ＪＲＷ－２１１３）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（４－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）ブタン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（８ｍｇ、３０％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９３８［Ｍ＋１］＋。
３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２１１４）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（４－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（６ｍｇ、２６％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８５３［Ｍ＋１］＋。
（Ｓ）－１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１４３）
ステップ１．（Ｓ）－３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２１４１）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（Ｓ）－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１４ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で４時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を薄茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（Ｓ）－１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１４３）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の（Ｓ）－３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１１ｍｇ、５５％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１１８［Ｍ＋１］＋。
（Ｒ）－１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１４４）
ステップ１．（Ｒ）－３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２１４２）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（Ｒ）－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で４時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を薄茶色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（Ｒ）－１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（２－（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１４４）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の（Ｒ）－３－（２－（（（（３－（２－アミノエチル）－１－（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１０ｍｇ、５０％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１１８［Ｍ＋１］＋。
３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（３－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２１９１）
ステップ１．（３－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２１８１）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（４５０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（１９０ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ、６０％）、（４－（クロロメチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．８１ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（１１７ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１５分間、室温で２時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．９０ｇ、７８％）を油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３６２［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（３－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２１８２）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（３－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．９０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．５９ｇ、６４％）を泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３６６［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（３－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２１８６）
トルエン（１０ｍＬ）中の（３－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１５０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）及び３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（１２０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、硫酸マグネシウム（２００ｍｇ）を添加した。懸濁液を１００℃で１８時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、メタノール（１０ｍＬ）に再懸濁した。混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（４６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。還元物を室温に温め、３０分間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２７ｍｇ、１０％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６４２［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．３－（２－（（（（１－（３－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２１９０）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（３－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２７ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を薄茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５４２［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（３－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２１９１）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（３－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（５ｍｇ、２１％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８５３［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ベンジル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２１９２）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（３－（アミノメチル）ベンジル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（上述のように調製）（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（６ｍｇ、２０％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１００［Ｍ＋１］＋。
３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２２１８）
ステップ１．１－（（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（ＪＲＷ－２１８９）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（６００ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（２５３ｍｇ、６．３ｍｍｏｌ、６０％）、４－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．９１ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（１５５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１５分間、室温で１８時間撹拌した。反応物を水で希釈し、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し、クロロホルム／イソプロパノール（３：１）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１３０ｍｇ、９％）を淡黄色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２２３［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（３－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２１１）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１－（（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（１１０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、６０％）及び（３－ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１７７ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１５分間、室温で２時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１１２ｍｇ、５９％）を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８０［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（３－（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２１３）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（３－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、粗生成物（１１０ｍｇ）を半固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８４［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２１４）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（３－（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（９８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（７５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２７２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１２５ｍｇ、７３％）を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．３－（２－（（（（１－（（１－（３－アミノプロピル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２２１６）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１２５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で６時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を茶色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－Ｎ－（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）プロペンアミド（ＪＲＷ－２２１８）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（（１－（３－アミノプロピル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（上述のように調製）（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（２４ｍｇ、定量的収率）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８７１［Ｍ＋１］＋。
４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）ブタンアミド（ＪＲＷ－２２１９）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（（１－（３－アミノプロピル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（上述のように調製）（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、４－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）ブタン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１２ｍｇ、４８％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９５６［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２２２０）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（（１－（３－アミノプロピル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（上述のように調製）（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－３－オキソ－７，１０，１３，１６－テトラオキサ－４－アザノナデカン－１９－オエート（９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１９ｍｇ、６３％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１１８［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－５－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（ＪＲＷ－２３１０）
ステップ１．５－（２－（ヒドロキシメチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（ＪＲＷ－２２７１）
氷浴で冷やしたメタノール／テトラヒドロフラン（１：１、５０ｍＬ）中の５－（２－ホルミル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（０．９２ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（２００ｍｇ、５．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。反応物をＨＣｌ（３ｍＬ、２Ｍ）でクエンチし、次いでｐＨを８に調整した。混合物をセライトで濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．５３ｇ、５７％）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２１３［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．５－（２－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（ＪＲＷ－２２７９）
クロロホルム中の５－（２－（ヒドロキシメチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（０．５３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル（３．０ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、７５℃に１時間加熱した。反応物を濃縮し、残渣をエーテルに懸濁した。ろ過により粗生成物（０．６４ｇ）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２３１［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．５－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（ＪＲＷ－２２８１）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（２００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（８４ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、６０％）、５－（２－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（０．３８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（５２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１５分間、室温で２時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３７０ｍｇ、７８％）を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３３７［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．５－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸（ＪＲＷ－２２８４）
ジオキサン（１０ｍＬ）中の５－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（０．３７ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（０．１３ｇ、５．５ｍｍｏｌ）及び水（１ｍＬ）を添加した。この反応物を４０℃に２時間加熱した。混合物を水で希釈し、ＨＣｌでｐＨを３に調整し、ＣＨＣｌ3／ＩＰＡ３：１で抽出した。有機層を濃縮し、粗生成物（０．３０ｇ）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３２３［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．（１７－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２８６）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の５－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸（０．３０ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の溶液に、（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．３３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．２８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＣｌ（０．３６ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルアミン（０．３６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃に１時間加熱した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５２５ｍｇ、９４％）を薄茶色のものとして得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５９７［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．（１７－（２－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２９６）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（１７－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．５２ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、粗生成物（０．４９ｇ）を半固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６０１［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．（１７－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３００）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（１７－（２－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．４５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（０．２２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．４８ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．５３ｇ、８０％）を茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８７８［Ｍ＋１］＋。
ステップ８．Ｎ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（ＪＲＷ－２３０９）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（１７－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．０３０ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１．５時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７７７［Ｍ＋１］＋。
ステップ９．Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－５－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（ＪＲＷ－２３１０）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（２６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５λ4，６λ4－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（３８ｍｇ、定量的収率）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０８８［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－５－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン）－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（ＪＲＷ－２３０８）
ステップ１．５－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（ＪＲＷ－２２４１）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（１５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（６３ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、６０％）、５－（４－（クロロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル塩酸塩（２８２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（３９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間、室温で２時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３３０ｍｇ、９３％）を得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３３７［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．５－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸（ＪＲＷ－２２４３）
ジオキサン（１０ｍＬ）中の５－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸メチル（０．３３ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（０．１２ｇ、４．９ｍｍｏｌ）及び水（１ｍＬ）を添加した。この反応物を４０℃に１８時間加熱した。混合物を水で希釈し、ＨＣｌでｐＨを３に調整し、ＣＨＣｌ3／ＩＰＡ３：１で抽出した。有機層を濃縮し、粗生成物（０．３６ｇ）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３２３［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（１７－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２４５）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の５－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタン酸（０．３０ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の溶液に、（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．２７ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．２８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＣｌ（０．３６ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルアミン（０．３６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃に２時間加熱した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．３０ｇ、５４％）を淡黄色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５９７［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（１７－（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２４８）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（１７－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．３０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、粗生成物（０．３１ｇ）を無色半固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６０１［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．（１７－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２５２）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（１７－（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．３１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（０．１６ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３時間撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．５８ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．３３ｇ、６８％）を茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８７８［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．Ｎ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（ＪＲＷ－２３０５）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（１７－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．０３０ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１．５時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７７７［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－５－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン）－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（ＪＲＷ－２３０８）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（４ －（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（２６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（４０ｍｇ、定量的収率）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０８８［Ｍ＋１］＋。
１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２３１６）
ステップ１．（３－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２９３）
ｔｅｒｔ－ブタノール（１０ｍＬ）中の１－（プロパ－２－イン－１－イル）－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（０．１８ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、（３－アジドプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．１９ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、硫酸銅（３１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、及びアスコルビン酸ナトリウム（３８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加した。水（５ｍＬ）を加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．２８ｇ、７４％）を茶色ガムとして得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８１［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．（３－（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３０４）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（３－（４－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．２８ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、粗生成物（０．３０ｇ）を無色半固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３８５［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３０７）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（３－（４－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．２７ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（０．２０ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．５８ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．２９ｇ、６４％）を茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６６０［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．３－（２－（（（（１－（（１－（３－アミノプロピル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（ＪＲＷ－２３１４）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．０３０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６１［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．１－（３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（４－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（ＪＲＷ－２３１６）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の３－（２－（（（（１－（（１－（３－アミノプロピル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）－１Ｈ－インドール－６－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－５－ヒドロキシイソインドリン－１－オン（２２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１３ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（４０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（１２ｍｇ、６６％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１１９［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチンアミド（ＪＲＷ－２３１７）
ステップ１．２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチン酸メチル（ＪＲＷ－２２９４）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（０．５５ｇ、３．９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（０．２３ｇ、５．８ｍｍｏｌ、６０％）、２－（クロロメチル）イソニコチン酸メチル塩酸塩（０．８６ｇ、３．９ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（１４２ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１時間、室温で３時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．５５ｇ、４８％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２９２［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチン酸（ＪＲＷ－２２９５）
ジオキサン（２０ｍＬ）中の２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチン酸メチル（０．５５ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（０．０９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）及び水（１ｍＬ）を添加した。この反応物を４０℃に４時間加熱した。混合物を水で希釈し、ＨＣｌでｐＨを３に調整し、ＣＨＣｌ3／ＩＰＡ３：１で抽出した。有機層を濃縮し、粗生成物（０．４９ｇ）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２７８［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（１－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ピリジン－４－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２９８）
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチン酸（０．４９ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．６２ｇ、２．１ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．５４ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＣｌ（０．６８ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルアミン（０．６８ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃に１時間加熱した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．８９ｇ、９１％）を白色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５５２［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（１－（２－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ピリジン－４－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３０６）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（１－（２－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ピリジン－４－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．８９ｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮して、粗生成物（０．８５ｇ）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５５６［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．（１－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ピリジン－４－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３１１）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（１－（２－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ピリジン－４－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．７１ｇ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（０．２５ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．５４ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１８時間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．３８ｇ、５３％）を茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８３２［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．Ｎ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ）－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチンアミド（ＪＲＷ－２３１５）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（１－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）ピリジン－４－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．０３０ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７３２［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチンアミド（ＪＲＷ－２３１７）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ）－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）イソニコチンアミド（２５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１４ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（３７ｍｇ、定量的収率）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０４３［Ｍ＋１］＋。
Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－５－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボキサミド（ＪＲＷ－２３１３）
ステップ１．５－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボン酸メチル（ＪＲＷ－２２８３）
氷浴で冷やしたＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル（０．７０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（０．２９ｇ、７．４ｍｍｏｌ、６０％）、５－（クロロメチル）チオフェン－２－カルボン酸メチル（０．９４ｇ、４．９ｍｍｏｌ）、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．１８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１時間、室温で１時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．３６ｇ、２６％）を得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２９７［Ｍ＋１］＋。
ステップ２．５－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボン酸（ＪＲＷ－２２８５）
ジオキサン（２０ｍＬ）中の５－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボン酸メチル（０．３６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（０．１４ｇ、６．１ｍｍｏｌ）及び水（１ｍＬ）を添加した。この反応物を４０℃に１．５時間加熱した。混合物を水で希釈し、ＨＣｌでｐＨを３に調整し、ＣＨＣｌ３／ＩＰＡ３：１で抽出した。有機層を濃縮し、粗生成物（０．３７ｇ）を白色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ２８３［Ｍ＋１］＋。
ステップ３．（１－（５－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２２８７）
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の５－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボン酸（０．３４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．４２ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．３７ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＣｌ（０．４６ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルアミン（０．４７ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃に１時間加熱した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．４６ｇ、７３％）を淡黄色ガムとして得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５５７［Ｍ＋１］＋。
ステップ４．（１－（５－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３０１）
アンモニアメタノール（７Ｎ、２０ｍＬ）中の（１－（５－（（６－シアノ－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．４６ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の溶液に、水に１スクープのラネーニッケルを懸濁したものを添加した。反応物に水素（６０ｐｓｉ）を充填し、室温で１８時間撹拌した。窒素で脱気した後、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、薄緑色の泡として粗生成物（０．５３ｇ）を得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６１［Ｍ＋１］＋。
ステップ５．（１－（５－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＪＲＷ－２３０３）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（１－（５－（（６－（アミノメチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．４２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－カルバルデヒド（０．２２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．４８ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３日間撹拌した。反応物をメタノールで希釈し、セライトを添加し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．２８ｇ、４４％）を茶色泡状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８３８［Ｍ＋１］＋。
ステップ６．Ｎ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ）－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボキサミド（ＪＲＷ－２３１２）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（１－（５－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－イル）－１－オキソ－５，８，１１－トリオキサ－２－アザトリデカン－１３－イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．０３０ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を橙色油状物として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７３７［Ｍ＋１］＋。
ステップ７．Ｎ－（１５－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル）－５－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボキサミド（ＪＲＷ－２３１３）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ）－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）チオフェン－２－カルボキサミド（２５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、３－（５，５－ジフルオロ－７－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－５Ｈ－５ｌ４，６ｌ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１４ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（２５ｍｇ、７１％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０４８［Ｍ＋１］＋。
（６－（２－（（２２－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－４，１８－ジオキソ－８，１１，１４－トリオキサ－５，１７－ジアザドコシル）（メチル）カルバモイル）フェニル）－２，２，１０，１０－テトラメチル－１，１１－ビス（３－スルファモイルプロピル）－１，２，１０，１１－テトラヒドロ－１３λ3－ピラノ［３，２－ｇ：５，６－ｇ’］ジキノリン－４，８－ジイル）ジメタンスルホン酸（ＪＲＷ－２３９５）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－５－（２－（（６－（（（（３－（６－ヒドロキシ－３－オキソイソインドリン－１－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－インドール－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ペンタンアミド（１５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）の溶液に、（６－（２－（（４－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－４－オキソブチル）（メチル）カルバモイル）フェニル）－２，２，１０，１０－テトラメチル－１，１１－ビス（３－スルファモイルプロピル）－８－（スルホメチル）－１，２，１０，１１－テトラヒドロ－１３λ3－ピラノ［３，２－ｇ：５，６－ｇ’］ジキノリン－４－イル）メタンスルホン酸ナトリウム（１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。混合物をメタノールで希釈し、逆相分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（７ｍｇ、４３％）を紫色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １７５１［Ｍ＋１］＋。
実施例２
細胞内ＫＲＡＳターゲットエンゲージメントの測定
ＢＲＥＴドナーとしてのＫＲＡＳのＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）タグ付け、又はＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けのいずれかから発光が引き起こされる。ＢＲＥＴドナーシグナルは細胞内のＫＲＡＳ多量体種に由来する。９６ウェルプレート中、各ウェル当たり２０，０００個のＨＥＫ２９３細胞に、ｐＦＮ３１Ｋ及びｐＦＮ３２Ｋプラスミドから発現されたＫＲＡＳ－Ｎｌｕｃ融合体又はＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体をトランスフェクトした。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２１１１又はＪＲＷ－２０２５及び各種濃度の試験化合物で処理した。試験化合物には、ＢＩ－２８５２（スイッチＩ／ＩＩ部位阻害剤）、ＡＭＧ－５１０（ＫＲＡＳG12CのＣｙｓ－１２残基を共有結合で修飾するスイッチＩＩ部位阻害剤）、及びＡＲＳ－１６２０（ＫＲＡＳG12CのＣｙｓ－１２残基を共有結合で修飾するスイッチＩＩ部位阻害剤）が含まれていた。インキュベーションの後、ＮａｎｏＢＲＥＴ－ＴＥ基質溶液を１Ｘの最終濃度まで添加し、ＢＲＥＴをＧｌｏｍａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒプレートリーダーで測定した。
細胞内ＫＲＡＳターゲットエンゲージメントの測定
ＢＲＥＴドナーとしてのＫＲＡＳのＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）タグ付け、又はＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けのいずれかから発光が引き起こされる。ＢＲＥＴドナーシグナルは細胞内のＫＲＡＳ多量体種に由来する。９６ウェルプレート中、各ウェル当たり２０，０００個のＨＥＫ２９３細胞に、ｐＦＮ３１Ｋ及びｐＦＮ３２Ｋプラスミドから発現されたＫＲＡＳ－Ｎｌｕｃ融合体又はＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体をトランスフェクトした。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２１１１又はＪＲＷ－２０２５及び各種濃度の試験化合物で処理した。試験化合物には、ＢＩ－２８５２（スイッチＩ／ＩＩ部位阻害剤）、ＡＭＧ－５１０（ＫＲＡＳG12CのＣｙｓ－１２残基を共有結合で修飾するスイッチＩＩ部位阻害剤）、及びＡＲＳ－１６２０（ＫＲＡＳG12CのＣｙｓ－１２残基を共有結合で修飾するスイッチＩＩ部位阻害剤）が含まれていた。インキュベーションの後、ＮａｎｏＢＲＥＴ－ＴＥ基質溶液を１Ｘの最終濃度まで添加し、ＢＲＥＴをＧｌｏｍａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒプレートリーダーで測定した。
データを図２～４に示す。具体的には、図２に、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの融合体として、ＫＲＡＳ又はその変異体（ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、又はＫＲＡＳG12V）を発現する細胞におけるＮａｎｏＢｉＴアッセイからのデータを示す。化合物ＪＲＷ－２１１１をＫＲＡＳ結合剤として使用し、化合物ＢＩ－２８５２を候補ＫＲＡＳ結合化合物として使用すると、野生型ＫＲＡＳ及び３つの全ての変異体でターゲットエンゲージメントが観察された。
図３には、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの融合体として、ＫＲＡＳ又はその変異体（ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、又はＫＲＡＳG12V）を発現する細胞におけるＮａｎｏＢｉＴアッセイからのデータを示す。化合物ＪＲＷ－２１１１をＫＲＡＳ結合剤として使用し、化合物ＡＭＧ－５１０を使用すると、ＫＲＡＳG12C変異体でのみターゲットエンゲージメントが観察された。
図４には、ＮａｎｏＬｕｃとの融合体として、ＫＲＡＳ又はその変異体（ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、又はＫＲＡＳG12V）を発現する細胞から得たデータを示す。化合物ＪＲＷ－２０２５をＫＲＡＳ結合剤として使用すると、野生型ＫＲＡＳ及び３つのＫＲＡＳ変異体に対するＢＩ－２８５２との競合が観察されたが、化合物ＡＭＧ－５１０及びＡＭＧ－１６２０との競合は、ＫＲＡＳG12Cに対してのみ観察された。
要約すると、発癌性変異体ＫＲＡＳG12Cでは、ＢＩ－２８５２（スイッチＩ／ＩＩ部位阻害剤）とＡＭＧ－５１０及びＡＲＳ１６２０（残基１２でのシステインと共有結合して反応するスイッチＩＩ部位阻害剤）との両方で２つの阻害剤メカニズムのターゲットエンゲージメントが観察され得た。これは、スイッチＩ／ＩＩドメイン及びスイッチＩＩドメインのエンゲージメントが相互に排他的であることを示す。これらの結果は、ターゲットエンゲージメントアッセイの広い有用性を裏付け、生細胞のＫＲＡＳでの複数のエンゲージメントメカニズムに関する問いを投げるようにする。
実験例３
ＳｍＢｉＴタグを用いる酵素相補性ＮａｎｏＢｉＴオリゴマー構成を使用した細胞内のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）ホモ多量体複合体のターゲットエンゲージメント測定
ＫＲＡＳは、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＫＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＫＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を観察した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＫＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＮＢ３Ｋ又はｐＮＢ４Ｋプラスミドから、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共に発現するＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｖ）及びＳｍＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｖ）をトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２１９２及びＢＩ－２８５２で処理した。
ＳｍＢｉＴタグを用いる酵素相補性ＮａｎｏＢｉＴオリゴマー構成を使用した細胞内のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）ホモ多量体複合体のターゲットエンゲージメント測定
ＫＲＡＳは、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＫＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＫＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を観察した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＫＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＮＢ３Ｋ又はｐＮＢ４Ｋプラスミドから、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共に発現するＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｖ）及びＳｍＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｖ）をトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２１９２及びＢＩ－２８５２で処理した。
生細胞でのインキュベーションの後、ＮａｎｏＢＲＥＴ－ＴＥ基質溶液を１Ｘの最終濃度まで添加し、ＢＲＥＴをＧｌｏｍａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒプレートリーダーで測定した。データを図５に示す。具体的には、図５に、競合アッセイからのデータを示す。トレーサーＪＲＷ－２１９２をＫＲＡＳ結合剤として使用すると、トレーサーの濃度が増加し、ＢＲＥＴシグナルの用量依存的増加が実証される。ＢＩ－２８５２は、機能的競合を介し、トレーサーによって誘導されるＢＲＥＴシグナルの用量依存的阻害を示す。
実施例４
ＳｍＢｉＴタグを用いる酵素相補性ＮａｎｏＢｉＴオリゴマー構成を使用した細胞内のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）ホモ多量体複合体のターゲットエンゲージメント測定
ＫＲＡＳは、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＫＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＫＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を観察した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＫＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共にｐＮＢ３Ｋ又はｐＮＢ４Ｋプラスミドから発現するＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）及びＳｍＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）をトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２２２０及びＢＩ－２８５２で処理した。
ＳｍＢｉＴタグを用いる酵素相補性ＮａｎｏＢｉＴオリゴマー構成を使用した細胞内のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）ホモ多量体複合体のターゲットエンゲージメント測定
ＫＲＡＳは、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＫＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＫＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を観察した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＫＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共にｐＮＢ３Ｋ又はｐＮＢ４Ｋプラスミドから発現するＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）及びＳｍＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）をトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２２２０及びＢＩ－２８５２で処理した。
生細胞でのインキュベーションの後、ＮａｎｏＢＲＥＴ－ＴＥ基質溶液を１Ｘの最終濃度まで添加し、ＢＲＥＴをＧｌｏｍａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒプレートリーダーで測定した。データを図６に示す。具体的には、図６に、競合アッセイからのデータを示す。トレーサーＪＲＷ－２２２０をＫＲＡＳ結合剤として使用すると、トレーサーの濃度が増加し、ＢＲＥＴシグナルの用量依存的増加が実証される。ＢＩ－２８５２は、機能的競合を介し、トレーサーによって誘導されるＢＲＥＴシグナルの用量依存的阻害を示す。
アッセイは、ジギトニン透過処理細胞でも実施された。透過処理により、全体的な発光が低下したが、ターゲットエンゲージメントの測定が可能であった。データを図７に示す。具体的には、図７に、競合アッセイからのデータを示す。トレーサーＪＲＷ－２２２０をＫＲＡＳ結合剤として使用すると、トレーサーの濃度が増加し、ＢＲＥＴシグナルの用量依存的増加が実証される。ＢＩ－２８５２は、透過処理細胞内の機能的競合を介し、トレーサーによって誘導されるＢＲＥＴシグナルの用量依存的阻害を示す。
実施例５
ＨｉＢｉＴタグを用いる酵素相補性ＮａｎｏＢｉＴオリゴマー構成を使用した細胞内のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）ホモ多量体複合体の測定
ＫＲＡＳは、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＫＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＫＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を形成した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＫＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共にｐＮＢ３Ｋ又はｐＦＮ３８Ａプラスミドから発現するＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）及びＨｉＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）をトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２２２０及びＢＩ－２８５２で処理した。
ＨｉＢｉＴタグを用いる酵素相補性ＮａｎｏＢｉＴオリゴマー構成を使用した細胞内のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）ホモ多量体複合体の測定
ＫＲＡＳは、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＫＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＫＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＫＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を形成した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＫＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共にｐＮＢ３Ｋ又はｐＦＮ３８Ａプラスミドから発現するＫＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）及びＨｉＢｉＴ－ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）をトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２２２０及びＢＩ－２８５２で処理した。
生細胞でのインキュベーションの後、ＮａｎｏＢＲＥＴ－ＴＥ基質溶液を１Ｘの最終濃度まで添加し、ＢＲＥＴをＧｌｏｍａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒプレートリーダーで測定した。データを図８に示す。具体的には、図８に、競合アッセイからのデータを示す。トレーサーＪＲＷ－２２２０をＫＲＡＳ結合剤として使用すると、トレーサーの濃度が増加し、ＢＲＥＴシグナルの用量依存的増加が実証される。ＢＩ－２８５２は、機能的競合を介し、トレーサーによって誘導されるＢＲＥＴシグナルの用量依存的阻害を示す。
アッセイは、ジギトニン透過処理細胞でも実施された。透過処理後でも、ＨｉＢｉＴタグの使用によりドナーシグナルレベルは有意なままであり、ターゲットエンゲージメントの測定が容易になった。データを図９に示す。具体的には、図９に、競合アッセイからのデータを示す。トレーサーＪＲＷ－２２２０をＫＲＡＳ結合剤として使用すると、トレーサーの濃度が増加し、ＢＲＥＴシグナルの用量依存的増加が実証される。ＢＩ－２８５２は、透過処理細胞内の機能的競合を介し、トレーサーによって誘導されるＢＲＥＴシグナルの用量依存的阻害を示す。
実施例６
細胞内ＫＲＡＳ２Ｂ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳのターゲットエンゲージメントの測定
多くのＲＡＳ変異体は、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を形成した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共にｐＮＢ３Ｋ又はｐＮＢ４Ｋプラスミドから発現するＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＲＡＳ及びＳｍＢｉＴ－ＲＡＳをトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２２１９、ＪＲＷ－２２２０、又はＪＲＷ－２３１０、及びＢＩ－２８５２で処理した。
細胞内ＫＲＡＳ２Ｂ、ＨＲＡＳ、又はＮＲＡＳのターゲットエンゲージメントの測定
多くのＲＡＳ変異体は、多量体複合体として細胞内に前から存在し得ると想定されており、これは、酵素相補性によって形成されたＢＲＥＴドナーを使用するＲＡＳのオリゴマー形態でのターゲットエンゲージメントに対する疑いを示唆する。この概念を探求するために、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、ＲＡＳのＮａｎｏＢｉＴタグ付けによりＲＡＳ多量体（二量体など）複合体を形成した。ＢＲＥＴドナーシグナルはオリゴマーＲＡＳに由来する。組織培養フラスコ中、１ウェルあたりのＨＥＫ２９３細胞に、ｐＧＥＭ－３Ｚ担体ＤＮＡと共にｐＮＢ３Ｋ又はｐＮＢ４Ｋプラスミドから発現するＲＡＳ－ＮａｎｏＢｉＴ融合体、ＬｇＢｉＴ－ＲＡＳ及びＳｍＢｉＴ－ＲＡＳをトランスフェクトした（１：１：８質量比）。トランスフェクションは、３：１のＦｕＧＥＮＥ ＨＤ：プラスミド比を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を化合物ＪＲＷ－２２１９、ＪＲＷ－２２２０、又はＪＲＷ－２３１０、及びＢＩ－２８５２で処理した。
データを図１０～２４に示す。このデータは、ＲＡＳ結合剤としての化合物ＪＲＷ－２２１９、ＪＲＷ－２２２０、ＪＲＷ－２３１０、及び候補ＲＡＳ結合化合物としての化合物ＢＩ－２８５２を使用し、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴとの融合体としてのＫＲＡＳ２Ｂ又はその変異体（ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｃ）、ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｄ）、ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１２Ｖ）、ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｑ６１Ｒ）、ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｑ６１Ｈ）、ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｑ６１Ｌ）、ＫＲＡＳ２Ｂ（Ｇ１３Ｄ））、又はＨＲＡＳ１を発現する細胞にＮａｎｏＢｉＴアッセイを行うと、ターゲットエンゲージメントが観察されたことを実証する。
ＮＲＡＳの場合、ＬｇＢｉＴ－ＮＲＡＳ及びＳｍＢｉＴ－ＮＲＡＳプラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを３：１の脂質：ＤＮＡ比で使用して、ＨＥＫ２９３細胞に１：１の質量比でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を回収し、８０，０００細胞／ウェルでコーニング３６００プレートに播種した。その後、トレーサーＪＲＷ－２３１０を最終濃度２μＭになるように添加し、ＲＡＳ結合化合物であるＢＩ－２８５２を希釈系列として添加した。ＢＲＥＴは、２時間インキュベーションの後、トレーサー及び非標識の競合物で測定された。データは、図２５に示す。
ＶＩ．配列
配列番号１－ＫＲＡＳ４Ａ（アイソフォームａのヌクレオチド配列）
ａｔｇａｃｔｇａａｔａｔａａａｃｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇｃｇｔａｇｇｃａａｇａｇｔｇｃｃｔｔｇａｃｇａｔａｃａｇｃｔａａｔｔｃａｇａａｔｃａｔｔｔｔｇｔｇｇａｃｇａａｔａｔｇａｔｃｃａａｃａａｔａｇａｇｇａｔｔｃｃｔａｃａｇｇａａｇｃａａｇｔａｇｔａａｔｔｇａｔｇｇａｇａａａｃｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇａｔａｔｔｃｔｃｇａｃａｃａｇｃａｇｇｔｃａａｇａｇｇａｇｔａｃａｇｔｇｃａａｔｇａｇｇｇａｃｃａｇｔａｃａｔｇａｇｇａｃｔｇｇｇｇａｇｇｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇｔｇｔａｔｔｔｇｃｃａｔａａａｔａａｔａｃｔａａａｔｃａｔｔｔｇａａｇａｔａｔｔｃａｃｃａｔｔａｔａｇａｇａａｃａａａｔｔａａａａｇａｇｔｔａａｇｇａｃｔｃｔｇａａｇａｔｇｔａｃｃｔａｔｇｇｔｃｃｔａｇｔａｇｇａａａｔａａａｔｇｔｇａｔｔｔｇｃｃｔｔｃｔａｇａａｃａｇｔａｇａｃａｃａａａａｃａｇｇｃｔｃａｇｇａｃｔｔａｇｃａａｇａａｇｔｔａｔｇｇａａｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｔｇａａａｃａｔｃａｇｃａａａｇａｃａａｇａｃａｇａｇａｇｔｇｇａｇｇａｔｇｃｔｔｔｔｔａｔａｃａｔｔｇｇｔｇａｇａｇａｇａｔｃｃｇａｃａａｔａｃａｇａｔｔｇａａａａａａａｔｃａｇｃａａａｇａａｇａａａａｇａｃｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｔｇａａａａｔｔａａａａａａｔｇｃａｔｔａｔａａｔｇ
配列番号２－ＫＲＡＳ４Ａ（アイソフォームａのタンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号３－ＫＲＡＳ４Ｂ（アイソフォームｂのヌクレオチド配列）
ａｔｇａｃｔｇａａｔａｔａａａｃｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇｃｇｔａｇｇｃａａｇａｇｃａａｃａａｔａｇａｇｇａｔｔｃｃｔａｃａｇｇａａｇｃａａｇｔａｇｔａａｔｔｇａｔｇｇａｇａａａｃｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇａｔａｔｔｃｔｃｇａｃａｃａｇｃａｇｇｔｃａａｇａｇｇａｇｔａｃａｇｔｇｃａａｔｇａｇｇｇａｃｃａｇｔａｃａｔｇａｇｇａｃｔｇｇｇｇａｇｇｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇｔｇｔａｔｔｔｇｃｃａｔａａａｔａａｔａｃｔａａａｔｃａｔｔｔｇａａｇａｔａｔｔｃａｃｃａｔｔａｔａｇａｇａａｃａａａｔｔａａａａｇａｇｔｔａａｇｇａｃｔｃｔｇａａｇａｔｇｔａｃｃｔａｔｇｇｔｃｃｔａｇｔａｇｇａａａｔａａａｔｇｔｇａｔｔｔｇｃｃｔｔｃｔａｇａａｃａｇｔａｇａｃａｃａａａａｃａｇｇｃｔｃａｇｇａｃｔｔａｇｃａａｇａａｇｔｔａｔｇｇａａｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｔｇａａａｃａｔｃａｇｃａａａｇａｃａａｇａｃａｇｇｇｔｇｔｔｇａｔｇａｔｇｃｃｔｔｃｔａｔａｃａｔｔａｇｔｔｃｇａｇａａａｔｔｃｇａａａａｃａｔａａａｇａａａａｇａｔｇａｇｃａａａｇａｔｇｇｔａａａａａｇａａｇａａａａａｇａａｇｔｃａａａｇａｃａａａｇｔｇｔｇｔａａｔｔａｔｇｔａａ
配列番号４－ＫＲＡＳ４Ｂ（アイソフォームｂのタンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号５－ＫＲＡＳ４ＡG12C（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号６－ＫＲＡＳ４ＡG12D（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号７－ＫＲＡＳ４ＡG12V（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号８－ＫＲＡＳ４ＢG12C（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号９－ＫＲＡＳ４ＢG12D（タンパク質配列）
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配列番号１０－ＫＲＡＳ４ＢG12V（タンパク質配列）
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配列番号１１－ＨＲＡＳ１（アイソフォーム１のヌクレオチド配列）
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配列番号１２－ＨＲＡＳ１（アイソフォーム１のタンパク質配列）
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配列番号１３－ＨＲＡＳ２（アイソフォーム２のヌクレオチド配列）
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配列番号１４－ＨＲＡＳ２（アイソフォーム２のタンパク質配列）
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配列番号１５－ＨＲＡＳ１G12S（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＳＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＱＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＡＡＲＴＶＥＳＲＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＹＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ
配列番号１６－ＨＲＡＳ１G12V（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＱＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＡＡＲＴＶＥＳＲＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＹＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ
配列番号１７－ＨＲＡＳ２G12S（タンパク質配列）
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配列番号１８－ＨＲＡＳ２G12V（タンパク質配列）
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配列番号１９－ＮＲＡＳ（ヌクレオチド配列）
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配列番号２０－ＮＲＡＳ（タンパク質配列）
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配列番号２１－ＮＲＡＳG12D（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＳＫＳＦＡＤＩＮＬＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＴＲＴＶＤＴＫＱＡＨＥＬＡＫＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＭＫＫＬＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ
配列番号２２－ＮＲＡＳQ61R（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＳＫＳＦＡＤＩＮＬＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＴＲＴＶＤＴＫＱＡＨＥＬＡＫＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＭＫＫＬＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ
配列番号２３－ＮａｎｏＬｕｃ（ヌクレオチド配列）
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配列番号２４－ＮａｎｏＬｕｃ（タンパク質配列）
ＭＫＨＨＨＨＨＨＡＩＡＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＶ
配列番号２５－ＬｇＢｉＴ（タンパク質配列）
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号２６－ＳｍＢｉＴ（タンパク質配列）
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配列番号２７－ＬｇＴｒｉｐ３０９２
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配列番号２８－ＬｇＴｒｉｐ３５４６
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配列番号２９－ＬｇＴｒｉｐ２０９８
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ
配列番号３０－ＳｍＴｒｉｐ９
ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ
配列番号３１－５ｘＨＩＳタグ
ＨＨＨＨＨ
配列番号３２－６ｘＨＩＳタグ
ＨＨＨＨＨＨ
配列番号３３－Ｃ－ｍｙｃタグ
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
配列番号３４－ＦＬＡＧタグ
ＤＹＫＤＤＤＤＫ
配列番号３５－Ｓｔｒｅｐタグ
ＷＳＨＰＱＦＥＫ
配列番号３６－ＨＡタグ
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
配列番号３７－ＫＲＡＳ４ＡQ61R（タンパク質配列）
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配列番号３８－ＫＲＡＳ４ＡQ61H（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号３９－ＫＲＡＳ４ＡQ61L（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号４０－ＫＲＡＳ４ＡG13D（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＤＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号４１－ＫＲＡＳ４ＢQ61R（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号４２－ＫＲＡＳ４ＢQ61H（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号４３－ＫＲＡＳ４ＢQ61L（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号４４－ＫＲＡＳ４ＢG13D（タンパク質配列）
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配列番号１－ＫＲＡＳ４Ａ（アイソフォームａのヌクレオチド配列）
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配列番号２－ＫＲＡＳ４Ａ（アイソフォームａのタンパク質配列）
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配列番号３－ＫＲＡＳ４Ｂ（アイソフォームｂのヌクレオチド配列）
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配列番号４－ＫＲＡＳ４Ｂ（アイソフォームｂのタンパク質配列）
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配列番号５－ＫＲＡＳ４ＡG12C（タンパク質配列）
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配列番号６－ＫＲＡＳ４ＡG12D（タンパク質配列）
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配列番号７－ＫＲＡＳ４ＡG12V（タンパク質配列）
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配列番号８－ＫＲＡＳ４ＢG12C（タンパク質配列）
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配列番号９－ＫＲＡＳ４ＢG12D（タンパク質配列）
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配列番号１０－ＫＲＡＳ４ＢG12V（タンパク質配列）
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配列番号１１－ＨＲＡＳ１（アイソフォーム１のヌクレオチド配列）
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配列番号１２－ＨＲＡＳ１（アイソフォーム１のタンパク質配列）
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配列番号１３－ＨＲＡＳ２（アイソフォーム２のヌクレオチド配列）
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配列番号１４－ＨＲＡＳ２（アイソフォーム２のタンパク質配列）
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配列番号１５－ＨＲＡＳ１G12S（タンパク質配列）
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配列番号１６－ＨＲＡＳ１G12V（タンパク質配列）
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配列番号１７－ＨＲＡＳ２G12S（タンパク質配列）
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配列番号１８－ＨＲＡＳ２G12V（タンパク質配列）
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配列番号１９－ＮＲＡＳ（ヌクレオチド配列）
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配列番号２０－ＮＲＡＳ（タンパク質配列）
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配列番号２１－ＮＲＡＳG12D（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＳＫＳＦＡＤＩＮＬＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＴＲＴＶＤＴＫＱＡＨＥＬＡＫＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＭＫＫＬＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ
配列番号２２－ＮＲＡＳQ61R（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＳＫＳＦＡＤＩＮＬＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＴＲＴＶＤＴＫＱＡＨＥＬＡＫＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＭＫＫＬＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ
配列番号２３－ＮａｎｏＬｕｃ（ヌクレオチド配列）
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配列番号２４－ＮａｎｏＬｕｃ（タンパク質配列）
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配列番号２５－ＬｇＢｉＴ（タンパク質配列）
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号２６－ＳｍＢｉＴ（タンパク質配列）
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配列番号２７－ＬｇＴｒｉｐ３０９２
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配列番号２８－ＬｇＴｒｉｐ３５４６
ＭＫＨＨＨＨＨＨＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ
配列番号２９－ＬｇＴｒｉｐ２０９８
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ
配列番号３０－ＳｍＴｒｉｐ９
ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ
配列番号３１－５ｘＨＩＳタグ
ＨＨＨＨＨ
配列番号３２－６ｘＨＩＳタグ
ＨＨＨＨＨＨ
配列番号３３－Ｃ－ｍｙｃタグ
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
配列番号３４－ＦＬＡＧタグ
ＤＹＫＤＤＤＤＫ
配列番号３５－Ｓｔｒｅｐタグ
ＷＳＨＰＱＦＥＫ
配列番号３６－ＨＡタグ
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
配列番号３７－ＫＲＡＳ４ＡQ61R（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号３８－ＫＲＡＳ４ＡQ61H（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号３９－ＫＲＡＳ４ＡQ61L（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号４０－ＫＲＡＳ４ＡG13D（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＤＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
配列番号４１－ＫＲＡＳ４ＢQ61R（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号４２－ＫＲＡＳ４ＢQ61H（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号４３－ＫＲＡＳ４ＢQ61L（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号４４－ＫＲＡＳ４ＢG13D（タンパク質配列）
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＤＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
Claims (144)
- ＲＡＳ結合化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＲＡＳタンパク質を含む試料を提供する工程、
（ｂ）前記試料を、ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記方法が、ＫＲＡＳ結合化合物を同定する方法であり、
（ａ）ＫＲＡＳタンパク質を含む試料を提供する工程、
（ｂ）前記試料を、ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 - （ｃ）前記機能要素を検出又は定量化する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
- 前記ＫＲＡＳタンパク質が、ＫＲＡＳ変異体である、請求項２又は請求項３に記載の方法。
- 前記ＫＲＡＳ変異体が、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、又はＫＲＡＳG13Dである、請求項４に記載の方法。
- 工程（ａ）が、前記試料内に前記ＫＲＡＳタンパク質を発現させることを含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、ＨＲＡＳ結合化合物を同定する方法であり、
（ａ）ＨＲＡＳタンパク質を含む試料を提供する工程、
（ｂ）前記試料を、ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 - （ｃ）前記機能要素を検出又は定量化する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
- 前記ＨＲＡＳタンパク質が、ＨＲＡＳ変異体である、請求項７又は請求項８に記載の方法。
- 前記ＨＲＡＳ変異体が、ＨＲＡＳG12S又はＨＲＡＳG12Vである、請求項９に記載の方法。
- 工程（ａ）が、前記試料内に前記ＨＲＡＳタンパク質を発現させることを含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、ＮＲＡＳ結合化合物を同定する方法であり、
（ａ）ＮＲＡＳタンパク質を含む試料を提供する工程と、
（ｂ）前記試料を、ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤、ならびに候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。 - （ｃ）前記機能要素を検出又は定量化する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記ＮＲＡＳタンパク質が、ＮＲＡＳ変異体である、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
- 前記ＮＲＡＳ変異体が、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである、請求項１４に記載の方法。
- 工程（ａ）が、前記試料内に前記ＮＲＡＳタンパク質を発現させることを含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＡＳ結合剤が、次式（Ｉ）の化合物
式中、Ａは、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つは、基－リンカー－Ｂであり、Ｂは、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つは、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。 - Ａが、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される、請求項１７に記載の方法。
- Ｒ1が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
- Ｒ3が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
- リンカーは、次式、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。 - 前記機能要素が、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記機能要素が、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である、請求項２２に記載の方法。
- 前記検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルが、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される、請求項２３に記載の方法。
- 前記機能要素が、沈降粒子、膜、ガラス、チューブ、ウェル、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、及び電子伝導性表面を有する固体担体から選択される固体担体である、請求項２２に記載の方法。
- 前記沈降粒子が、磁性粒子である、請求項２５に記載の方法。
- 前記検出可能要素が、フルオロフォアである、請求項２３に記載の方法。
- 前記機能要素が、タンパク質分解を誘導する部分である、請求項２２に記載の方法。
- 前記機能要素が、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である、請求項２８に記載の方法。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、前記ＲＡＳタンパク質に結合する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、ＲＡＳ阻害剤である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＡＳ結合剤が、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、前記ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又はＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、細胞、細胞溶解物、体液、組織、生物学的試料、インビトロ試料、環境試料、無細胞試料、及び精製試料（例えば、精製タンパク質試料）から選択される、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＡＳタンパク質が、生物発光レポーターとの融合体として提供される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生物発光レポーターが、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである、請求項３５に記載の方法。
- 前記試料が、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質と、生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質とを含み、前記第１及び第２のサブユニットは相補的である、請求項３５に記載の方法。
- 前記生物発光レポーターの第１のサブユニットが、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、前記生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３７に記載の方法。
- 前記生物発光レポーターの発光スペクトルと前記機能要素の励起スペクトルが、重複する、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料を前記生物発光レポーターの基質と接触させることを更に含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである、請求項４０に記載の方法。
- （ａ）標的ＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＲＡＳ結合化合物と、
を含むことを特徴とするシステム。 - （ａ）標的ＫＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＫＲＡＳ結合化合物と、
を含む、請求項４２に記載のシステム。 - 前記標的ＫＲＡＳタンパク質が、前記システム内で発現される、請求項４３に記載のシステム。
- 前記標的ＫＲＡＳタンパク質が、ＫＲＡＳ変異体である、請求項４３又は請求項４４に記載のシステム。
- 前記ＫＲＡＳ変異体が、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、及びＫＲＡＳG13Dから選択される、請求項４５に記載のシステム。
- （ａ）標的ＨＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＨＲＡＳ結合化合物と、
を含む、請求項４２に記載のシステム。 - 前記標的ＨＲＡＳタンパク質が、前記システム内で発現される、請求項４１に記載のシステム。
- 前記標的ＨＲＡＳタンパク質が、ＨＲＡＳ変異体である、請求項４７又は請求項４８に記載のシステム。
- 前記ＨＲＡＳ変異体が、ＨＲＡＳG12S又はＨＲＡＳG12Vである、請求項４９に記載のシステム。
- （ａ）標的ＮＲＡＳタンパク質と、
（ｂ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤と、
（ｃ）候補ＮＲＡＳ結合化合物と、
を含む、請求項４２に記載のシステム。 - 前記標的ＮＲＡＳタンパク質が、前記システム内で発現される、請求項５１に記載のシステム。
- 前記標的ＮＲＡＳタンパク質が、ＮＲＡＳ変異体である、請求項５１又は請求項５２に記載のシステム。
- 前記ＮＲＡＳ変異体が、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである、請求項５３に記載のシステム。
- 前記ＲＡＳ結合剤が、次式（Ｉ）の化合物
式中、Ａが、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つが、基－リンカー－Ｂであり、Ｂが、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つが、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載のシステム。 - Ａが、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される、請求項４５に記載のシステム。
- Ｒ1が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項４５又は請求項４６に記載のシステム。
- Ｒ3が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項４５又は請求項４６に記載のシステム。
- リンカーは、次式、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である、請求項５５～５８のいずれか１項に記載のシステム。 - 前記機能要素が、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である、請求項４２～５９のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記機能要素が、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である、請求項６０に記載のシステム。
- 前記検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルが、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、又はエネルギー移動によって検出可能又は定量化可能である、請求項６１に記載のシステム。
- 前記機能要素が、沈降粒子、膜、ガラス、チューブ、ウェル、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、及び電子伝導性表面を有する固体担体から選択される固体担体である、請求項６０に記載のシステム。
- 前記沈降粒子が、磁性粒子である、請求項６３に記載のシステム。
- 前記検出可能要素が、フルオロフォアである、請求項６１に記載のシステム。
- 前記機能要素が、タンパク質分解を誘導する部分である、請求項６０に記載のシステム。
- 前記機能要素が、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である、請求項６６に記載のシステム。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、前記ＲＡＳタンパク質に結合する、請求項４２～６７のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、ＲＡＳ阻害剤である、請求項４２～６８のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記ＲＡＳ結合部分が、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する、請求項４２～６９のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、前記ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又はＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する、請求項４２～７０のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記システムが、細胞、細胞溶解物、体液、組織、生物学的試料、インビトロ試料、環境試料、無細胞試料、及び精製試料（例えば、精製タンパク質試料）から選択される試料を含む、請求項４２～７１のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記標的ＲＡＳタンパク質が、生物発光レポーターとの融合体として存在する、請求項４２～７２のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記生物発光レポーターが、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである、請求項７３に記載のシステム。
- 前記標的ＲＡＳタンパク質が、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質と、生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質とを含み、前記第１及び第２のサブユニットは相補的である、請求項７３に記載のシステム。
- 前記生物発光レポーターの第１のサブユニットが、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、前記生物発光レポーターの第２のサブユニットが、配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７５に記載のシステム。
- 前記生物発光レポーターの発光スペクトルと前記機能要素の励起スペクトルが、重複する、請求項７３～７６のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記生物発光レポーターの基質を更に含む、請求項７３～７７のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである、請求項７８に記載のシステム。
- （ａ）ＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素と、
を含むことを特徴とするＲＡＳ結合剤。 - 前記ＲＡＳ結合剤が、
（ａ）ＫＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素と、
を含むＫＲＡＳ結合剤である、請求項８０に記載のＲＡＳ結合剤。 - 前記ＲＡＳ結合剤が、
（ａ）ＨＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素と、
を含むＨＲＡＳ結合剤である、請求項８０に記載のＲＡＳ結合剤。 - 前記ＲＡＳ結合剤が、
（ａ）ＮＲＡＳ結合部分と、
（ｂ）機能要素と、
を含むＮＲＡＳ結合剤である、請求項８０に記載のＲＡＳ結合剤。 - 前記ＲＡＳ結合部分と前記機能要素とを連結するリンカーを更に含む、請求項８０～８３のいずれか１項に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記ＲＡＳ結合剤が、次式（Ｉ）の化合物
式中、Ａが、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つが、基－リンカー－Ｂであり、Ｂが、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つが、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項８０～８４のいずれか１項に記載のＲＡＳ結合剤。 - Ａが、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される、請求項８５に記載のＲＡＳ結合剤。
- Ｒ1が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項８５又は請求項８６に記載のＲＡＳ結合剤。
- Ｒ3が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項８５又は請求項８６に記載のＲＡＳ結合剤。
- リンカーが、次式、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である、請求項８５～８８のいずれか１項に記載のＲＡＳ結合剤。 - 前記機能要素が、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である、請求項８０～８９のいずれか１項に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記機能要素が、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である、請求項９０に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記検出可能要素が、フルオロフォアである、請求項９１に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルが、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される、請求項９０に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記機能要素が、沈降粒子、膜、ガラス、チューブ、ウェル、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、及び電子伝導性表面を有する固体担体から選択される固体担体である、請求項９０に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記沈降粒子が、磁性粒子である、請求項９４に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記機能要素が、タンパク質分解を誘導する部分である、請求項９０に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記機能要素が、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である、請求項９６に記載のＲＡＳ結合剤。
- 前記ＲＡＳ結合部分が、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する、請求項８０～９７のいずれか１項に記載のＲＡＳ結合剤。
- 請求項８０～９８のいずれか一項に記載のＲＡＳ結合剤を含む組成物。
- ＲＡＳタンパク質を更に含む、請求項９９に記載の組成物。
- 前記ＲＡＳタンパク質が、ＫＲＡＳタンパク質、ＨＲＡＳタンパク質、及びＮＲＡＳタンパク質から選択される、請求項１００に記載の組成物。
- 前記ＲＡＳタンパク質が、生物発光レポーターとの融合体として存在する、請求項９９又は請求項１０１に記載の組成物。
- 前記生物発光レポーターが、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである、請求項１０２に記載の組成物。
- 前記組成物は、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質と、生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質とを含み、前記第１及び第２のサブユニットは相補的である、請求項１０２に記載の組成物。
- 前記生物発光レポーターの第１のサブユニットは、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、前記生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１０４に記載の組成物。
- 前記生物発光レポーターの発光スペクトルと前記機能要素の励起スペクトルが、重複する、請求項１０２～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記生物発光レポーターの基質を更に含む、請求項１０２～１０６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである、請求項１０７に記載の組成物。
- 候補ＲＡＳ結合化合物を更に含む、請求項９９～１０８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、候補ＫＲＡＳ結合化合物、候補ＨＲＡＳ結合化合物、又は候補ＮＲＡＳ結合化合物である、請求項１０９に記載の組成物。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、ＲＡＳ阻害剤である、請求項１０９又は請求項１１０に記載の組成物。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又はＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する、請求項１０９～１１１のいずれか１項に記載の組成物。
- ＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
（ｂ）前記機能要素からのシグナルを検出又は定量化する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記方法が、ＫＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であり、
（ａ）（ｉ）ＫＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＫＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＫＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＫＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
（ｂ）前記機能要素からのシグナルを検出又は定量化する工程、
を含む、請求項１１３に記載の方法。 - 前記ＫＲＡＳタンパク質が、ＫＲＡＳ変異体である、請求項１１４に記載の方法。
- 前記ＫＲＡＳ変異体が、ＫＲＡＳG12C、ＫＲＡＳG12D、ＫＲＡＳG12V、ＫＲＡＳQ61R、ＫＲＡＳQ61H、ＫＲＡＳQ61L、及びＫＲＡＳG13Dから選択される、請求項１１５に記載の方法。
- 前記方法が、ＨＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であり、
（ａ）（ｉ）ＨＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＨＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＨＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＨＲＡＳ結合化合物と接触させることと、
（ｂ）前記機能要素からのシグナルを検出又は定量化することを含む、請求項１１３に記載の方法。 - 前記ＨＲＡＳタンパク質が、ＨＲＡＳ変異体である、請求項１１７に記載の方法。
- 前記ＨＲＡＳ変異体が、ＨＲＡＳG12S又はＨＲＡＳG12Vである、請求項１１８に記載の方法。
- 前記方法が、ＮＲＡＳ結合化合物をスクリーニングする方法であり、
（ａ）（ｉ）ＮＲＡＳタンパク質と、（ｉｉ）ＮＲＡＳ結合部分及び機能要素を含むＮＲＡＳ結合剤とを含む試料を、候補ＮＲＡＳ結合化合物と接触させる工程、
（ｂ）前記機能要素からのシグナルを検出又は定量化する工程、
を含む、請求項１１３に記載の方法。 - 前記ＮＲＡＳタンパク質が、ＮＲＡＳ変異体である、請求項１２０に記載の方法。
- 前記ＮＲＡＳ変異体が、ＮＲＡＳG12D又はＮＲＡＳQ61Rである、請求項１２１に記載の方法。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、前記ＲＡＳタンパク質に結合し、前記機能要素からのシグナルを検出可能に改変させる、請求項１１３～１２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合物が、ＲＡＳ阻害剤である、請求項１１３～１２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記候補ＲＡＳ結合化合が、ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位又はＲＡＳスイッチＩＩ部位に結合する、請求項１１３～１２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＡＳ結合剤が、次式（Ｉ）の化合物
式中、Ａが、単環式アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の１つが、基－リンカー－Ｂであり、Ｂが、機能要素であり、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の他の２つが、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項１１３～１２５のいずれか１項に記載の方法。 - Ａが、フェニル、イミダゾール、ピロール、ピリジル、チオフェン、及びトリアゾールから選択される、請求項１２６に記載の方法。
- Ｒ1が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ2及びＲ3が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項１２６又は請求項１２７に記載の方法。
- Ｒ3が、基－リンカー－Ｂであり、Ｒ1及びＲ2が、独立して、水素及びメチルから選択される、請求項１２６又は請求項１２７に記載の方法。
- リンカーは、次式、
式中、ｍ、ｎ、及びｐは、独立して、０、１、２、３、４、５、又は６である、請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の方法。 - 前記機能要素が、検出可能要素、親和性要素、捕捉要素、固体担体、又はタンパク質分解を誘導する部分である、請求項１１３～１３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記機能要素が、フルオロフォア、発色団、放射性核種、電子不透明分子、ＭＲＩ造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、及び質量タグから選択される検出可能要素である、請求項１３１に記載の方法。
- 前記検出可能要素又はそれによって生成されるシグナルが、蛍光、質量分析、光学イメージング、放射性核種検出、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、又はエネルギー移動によって検出又は定量化される、請求項１３２に記載の方法。
- 前記検出可能要素が、フルオロフォアである、請求項１３２に記載の方法。
- 前記機能要素が、タンパク質分解を誘導する部分である、請求項１３１に記載の方法。
- 前記機能要素が、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けによってタンパク質分解を誘導する部分である、請求項１３５に記載の方法。
- 前記ＲＡＳ結合部分が、前記ＲＡＳスイッチＩ／ＩＩ部位に結合する、請求項１１３～１３６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＡＳタンパク質が、生物発光レポーターとの融合体として存在する、請求項１１３～１３７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生物発光レポーターが、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有するルシフェラーゼである、請求項１３８に記載の方法。
- 前記試料が、生物発光レポーターの第１のサブユニットと融合した第１のＲＡＳタンパク質と、生物発光レポーターの第２のサブユニットと融合した第２のＲＡＳタンパク質とを含み、前記第１及び第２のサブユニットは相補的である、請求項１３８に記載の方法。
- 前記生物発光レポーターの第１のサブユニットが、配列番号２５と少なくとも７０％の配列同一性を有し、前記生物発光レポーターの第２のサブユニットは、配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１４０に記載の方法。
- 前記生物発光レポーターの発光スペクトルと前記機能要素の励起スペクトルが、重複する、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組成物が、前記生物発光レポーターの基質を更に含む、請求項１３８～１４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、又はフリマジンである、請求項１４３に記載の方法。
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