CN116391129A - 针对ras蛋白的靶标接合测定法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于使用RAS结合剂来鉴定RAS结合化合物的系统、方法和化合物，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件。在一些实施方案中，所述RAS结合剂结合至RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS)上的一个位点，并且能用于检测结合至相同的位点以及其他位点的RAS结合剂。

Description

针对RAS蛋白的靶标接合测定法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月28日提交的美国临时专利申请第63/071,694号、2020年11月23日提交的美国临时专利申请第63/117,080号和2021年3月12日提交的美国临时专利申请第63/160,120号的优先权和权益，所述美国临时专利申请中的每件均以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本文提供了用于鉴定RAS结合化合物的系统、方法和化合物，所述RAS结合化合物包括KRAS结合化合物、HRAS结合化合物和NRAS结合化合物。具体而言，本文公开了RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件，并且能用于探测在多个RAS结合位点处的靶标接合。
背景技术
RAS蛋白调节参与多个细胞过程的大量信号传导级联。RAS基因是致癌基因，当该基因发生突变时，可导致正常细胞发生癌变。RAS基因包括KRAS、HRAS和NRAS，它们分别编码KRAS蛋白、HRAS蛋白和NRAS蛋白。这些蛋白质将信号从细胞外部传递到细胞核，以指导细胞生长、分裂、成熟和/或分化。RAS蛋白是充当分子开关的GTP酶，它通过将GTP转化为GDP来打开和关闭。
RAS活化性突变是人类癌症中最常见的致癌性改变。RAS活化性突变通过干扰GTP至GDP的循环过程来使RAS蛋白固定在其活性GTP结合形式，该循环过程继而驱动细胞的赘生性转化。一种常见的KRAS活化性突变是KRASG12C，该突变在非小细胞肺癌中尤为普遍。常见的HRAS活化性突变是HRASG12S和HRASG12V；HRASG12S突变与克斯提洛(Costello)综合征相关，而HRASG12V与膀胱癌相关。NRAS突变(诸如NRASG12D和NRASQ61R)与许多人类肿瘤(诸如黑素瘤)相关。
RAS蛋白历来被认为是难以成药的。开发RAS抑制剂一直是具有挑战性的，部分原因是RAS蛋白对GTP底物具有极高的亲和力。例如，GTP以极高的亲和力占据RAS蛋白的开关I(SI)位点，因此细胞中的竞争性抑制被认为是几乎不可能的。最近发现，KRAS的致癌性变体(KRAS G12C)可以通过开关II(SII)位点处的共价抑制来抑制。目前，在晚期临床试验(参见，例如，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03600883)中存在共价SII位点抑制剂。最近，人们发现，在SI和SII位点之间存在浅结合袋。这个袋称为SI/SII位点，可以为可逆抑制提供可能(Kessler等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 116：158 23-15829(2019))。抑制剂BI-2852与野生型KRAS和KRAS突变体中的这个SI/II位点接合，并且可以抑制细胞中的下游KRAS信号传导事件。
发明内容
本文提供了用于使用RAS结合剂来鉴定RAS结合化合物的系统、方法和化合物，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件。例如，本文提供了用于使用KRAS结合剂来鉴定KRAS结合化合物的系统、方法和化合物，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件。所述KRAS结合部分结合至所述KRAS蛋白上的一个位点，但是所述系统和方法可以成功地查询其他KRAS结合位点处的接合，从而使广泛有用的活细胞靶标接合测定法能够鉴定经由不同机制结合的KRAS结合化合物(诸如KRAS抑制剂)。本文还描述了用于使用HRAS结合剂来鉴定HRAS结合化合物的系统、方法和化合物，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件，以及用于使用NRAS结合剂来鉴定NRAS结合化合物的系统、方法和化合物，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件。在一些实施方案中，RAS结合剂是KRAS结合剂、HRAS结合剂和/或NRAS结合剂(即，所述结合剂可以结合至KRAS、HRAS和NRAS中的一者或全部)。
在一个方面，本文提供了一种鉴定RAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含RAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含RAS结合部分和功能元件的RAS结合剂以及候选RAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定KRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含KRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含KRAS结合部分和功能元件的KRAS结合剂以及候选KRAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。
在一些实施方案中，所述KRAS蛋白是KRAS变体。在一些实施方案中，所述KRAS变体是KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L或KRASG13D。
在一些实施方案中，步骤(a)包括表达样品中的所述KRAS蛋白。
在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定HRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含HRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含HRAS结合部分和功能元件的HRAS结合剂以及候选HRAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。
在一些实施方案中，所述HRAS蛋白是HRAS变体。在一些实施方案中，所述HRAS变体是HRASG12S或HRASG12V。
在一些实施方案中，步骤(a)包括表达样品中的所述HRAS蛋白。
在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定NRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含NRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含NRAS结合部分和功能元件的NRAS结合剂以及候选NRAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。
在一些实施方案中，所述NRAS蛋白是NRAS变体。在一些实施方案中，所述NRAS变体是NRASG12D或NRASQ61R。
在一些实施方案中，步骤(a)包括表达样品中的所述NRAS蛋白。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure BDA0004206448020000051
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
在一些实施方案中，A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000052
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。在一些实施方案中，所述沉积颗粒是磁性颗粒。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。
在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合所述RAS蛋白。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。在一些实施方案中，所述RAS结合剂结合至RAS开关I/II位点。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或所述RAS开关II位点。
在一些实施方案中，所述样品选自细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。
在一些实施方案中，所述RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体提供。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述样品包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQ ID NO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQ ID NO：26具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述样品与所述生物发光报道蛋白的底物接触。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪(furimazine)。
在一个方面，本文提供了一种系统，所述系统包括：
(a)靶标RAS蛋白；
(b)RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选RAS结合化合物。
在一些实施方案中，本文提供了一种系统，所述系统包括：
(a)靶标KRAS蛋白；
(b)KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选KRAS结合化合物。
在一些实施方案中，所述靶标KRAS蛋白在所述系统内表达。在一些实施方案中，所述靶标KRAS蛋白是KRAS变体。在一些实施方案中，所述KRAS变体选自KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L和KRASG13D。
在一些实施方案中，本文提供了一种系统，所述系统包括：
(a)靶标HRAS蛋白；
(b)HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选HRAS结合化合物。
在一些实施方案中，所述靶标HRAS蛋白在所述系统内表达。在一些实施方案中，所述HRAS蛋白是HRAS变体。在一些实施方案中，所述HRAS变体是HRASG12S或HRASG12V。
在一些实施方案中，本文提供了一种系统，所述系统包括：
(a)靶标NRAS蛋白；
(b)NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选NRAS结合化合物。
在一些实施方案中，所述靶标NRAS蛋白在所述系统内表达。在一些实施方案中，所述NRAS蛋白是NRAS变体。在一些实施方案中，所述NRAS变体是NRASG12D或NRASQ61R。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure BDA0004206448020000081
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
在一些实施方案中，A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000082
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号可通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。在一些实施方案中，所述沉积颗粒是磁性颗粒。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。
在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合所述RAS蛋白。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。
在一些实施方案中，所述RAS结合部分结合至所述RAS开关I/II位点。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或所述RAS开关II位点。
在一些实施方案中，所述系统包括选自以下的样品：细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。
在一些实施方案中，所述靶标RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述靶标RAS蛋白包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQ ID NO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQ ID NO：26具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
在一些实施方案中，所述系统还包括所述生物发光报道蛋白的底物。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
在一个方面，本文提供了一种RAS结合剂，所述RAS结合剂包含：
(a)RAS结合部分；以及
(b)功能元件。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含：
(a)KRAS结合部分；以及
(b)功能元件。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含：
(a)HRAS结合部分；以及
(b)功能元件。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含：
(a)NRAS结合部分；以及
(b)功能元件。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂还包含接头，所述接头将所述RAS结合部分与所述功能元件连接。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure BDA0004206448020000111
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
在一些实施方案中，A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000112
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。在一些实施方案中，所述沉积颗粒是磁性颗粒。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。
在一些实施方案中，所述RAS结合部分结合至所述RAS开关I/II位点。
在一个方面，本文公开了一种组合物，所述组合物包含本文所述的RAS结合剂(例如，包含RAS结合部分和功能元件的RAS结合剂，诸如式(I)的化合物)。
在一些实施方案中，所述组合物还包含RAS蛋白。在一些实施方案中，所述RAS蛋白选自KRAS蛋白、HRAS蛋白和NRAS蛋白。在一些实施方案中，所述RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述组合物包含第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQ ID NO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQ ID NO：26具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
在一些实施方案中，所述组合物还包括所述生物发光报道蛋白的底物。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
在一些实施方案中，所述组合物还包含候选RAS结合化合物。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物是候选KRAS结合化合物、候选HRAS结合化合物或候选NRAS结合化合物。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或所述RAS开关II位点。
在一个方面，本文提供了一种用于筛选RAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选RAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)RAS蛋白；和(ii)RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于筛选KRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选KRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)KRAS蛋白；和(ii)KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述KRAS蛋白是KRAS变体。在一些实施方案中，所述KRAS变体选自KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L和KRASG13D。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于筛选HRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选HRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)HRAS蛋白；和(ii)HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述HRAS蛋白是HRAS变体。在一些实施方案中，所述HRAS变体是HRASG12S或HRASG12V。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于筛选NRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选NRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)NRAS蛋白；和(ii)NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述NRAS蛋白是NRAS变体。在一些实施方案中，所述NRAS变体是NRASG12D或NRASQ61R。
在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合所述RAS蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。在一些实施方案中，所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或所述RAS开关II位点。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure BDA0004206448020000151
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
在一些实施方案中，A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000152
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。
在一些实施方案中，所述RAS结合部分结合至所述RAS开关I/II位点。
在一些实施方案中，所述RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述RAS蛋白包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQ ID NO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQ ID NO：26具有至少70％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
在一些实施方案中，所述组合物还包括所述生物发光报道蛋白的底物。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
附图说明
图1显示根据本公开的示例性靶标接合测定法的图示，该测定法使用RAS-NLuc融合体和包含RAS结合部分和能量受体的RAS结合剂。
图2显示来自表达作为与LgBiT和SmBiT的融合体的KRAS或其变体(KRASG12C、KRASG12D或KRASG12V)的细胞中的NanoBiT测定法的数据。数据表明，本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2111)与化合物BI-2852之间存在竞争。
图3显示来自表达作为与LgBiT和SmBiT的融合体的KRAS或其变体(KRASG12C、KRASG12D或KRASG12V)的细胞中的NanoBiT测定法的数据。数据表明，本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2111)与化合物AMG-510之间存在仅针对KRASG12C变体的竞争，但是不存在针对野生型KRAS或另外两个KRAS变体的竞争。
图4显示来自表达作为与NanoLuc的融合体的KRAS或其变体(KRASG12C、KRASG12D或KRASG12V)的细胞的数据。数据表明，本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2025)与化合物BI-2852之间存在针对野生型KRAS和三个KRAS变体的竞争，但是对于化合物AMG-510与ARS-1620仅观察到针对KRASG12C变体的竞争。
图5显示来自表达KRAS-NanoBiT融合蛋白(LgBiT-KRAS2BG12V和SmBiT-KRAS2BG12V)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2192)和化合物BI-2852处理。
图6显示来自表达KRAS-NanoBiT融合蛋白(LgBiT-KRAS2BG12C和SmBiT-KRAS2BG12C)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图7显示来自表达KRAS-NanoBiT融合蛋白(LgBiT-KRAS2BG12C和SmBiT-KRAS2BG12C)的毛地黄皂苷透化的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图8显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12C和HiBiT-KRAS2BG12C)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图9显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12C和HiBiT-KRAS2BG12C)的毛地黄皂苷透化的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图10显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2B和SmBiT-KRAS2B)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2219)和化合物BI-2852处理。
图11显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2B和SmBiT-KRAS2B)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2219)和化合物BI-2852处理。
图12显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12C和SmBiT-KRAS2BG12C)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2219)和化合物BI-2852处理。
图13显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12C和SmBiT-KRAS2BG12C)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图14显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12D和SmBiT-KRAS2BG12D)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2219)和化合物BI-2852处理。
图15显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12D和SmBiT-KRAS2BG12D)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图16显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12V和SmBiT-KRAS2BG12V)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2219)和化合物BI-2852处理。
图17显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BG12V和SmBiT-KRAS2BG12V)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的KRAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图18显示来自表达HRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-HRAS1和SmBiT-HRAS1)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2219)和化合物BI-2852处理。
图19显示来自表达HRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-HRAS1和SmBiT-HRAS1)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2220)和化合物BI-2852处理。
图20显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2220和JRW-2310)和化合物BI-2582处理。
图21显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BQ61R和SmBiT-KRAS2BQ61R)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2310)和化合物BI-2852处理。
图22显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BQ61H和SmBiT-KRAS2BQ61H)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2310)和化合物BI-2852处理。
图23显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BQ61L和SmBiT-KRAS2BQ61L)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2310)和化合物BI-2852处理。
图24显示来自表达KRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-KRAS2BQG13D和SmBiT-KRAS2BG13D)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2310)和化合物BI-2852处理。
图25显示来自表达NRAS-NanoBiT融合体(LgBiT-NRAS和SmBiT-NRAS)的细胞的数据，所述细胞用本文公开的RAS结合剂(化合物JRW-2310)和化合物BI-2852处理。
具体实施方式
本文提供了用于鉴定RAS结合化合物的系统、方法和组合物，所述RAS结合化合物诸如RAS抑制剂或调节剂。RAS蛋白包括NRAS、HRAS和KRAS(包括异型体KRAS4A和KRAS4B)。具体而言，本文提供了用于鉴定RAS结合化合物的系统、方法和组合物，所述RAS结合化合物诸如RAS抑制剂或调节剂。所述系统和方法包括RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件。所述方法涉及提供包含RAS蛋白的样品以及使样品与RAS结合剂和候选RAS结合化合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括检测或定量功能元件的步骤，例如通过检测来自功能元件的信号。所述方法、系统和化合物可以用于测量不仅在RAS结合剂结合的位点处，而且还在其他RAS结合位点处发生的RAS蛋白的靶标接合。例如，在一些实施方案中，RAS结合剂在RAS开关I/II位点处结合，并且所述系统和方法可以用于探测不仅在开关I/II位点处，而且还在其他位点处，诸如在开关II位点处发生的靶标接合。
I.定义
尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本文描述的实施方案的实践或测试中，但本文描述了一些优选的方法、组合物、装置和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，应当理解本发明不限于本文描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可根据常规实验和优化而变化。还应当理解，本说明书中使用的术语是出于仅描述特定型式或实施方案的目的，并非意图限制本文描述的实施方案的范围。
除非本文另外定义，否则与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。例如，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的任何命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。术语的含义和范围应明确；然而，如果存在任何潜在歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求中使用，单数形式“一个/种(a/ana)”和“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提及“肽”是指一个或多个肽以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
如本文所用，术语“和/或”包括所列出的项目的任何和所有组合，包括单独列出的项目中的任一者。例如，“A、B和/或C”涵盖A、B、C、AB、AC、BC和ABC，它们中的每个都应单独考虑为由陈述“A、B和/或C”所描述。
如本文所用，术语“包含”及其语言变型表示存在所列举的特征、要素、方法步骤等，而不排除存在另外的特征、要素、方法步骤等。相反，术语“由......组成”及其语言变型指示存在所列举的特征、要素、方法步骤等，并且排除任何未列举的特征、要素、方法步骤等，通常相关联的杂质除外。短语“基本上由......组成”表示所列举的特征、要素、方法步骤等以及不会对组合物、系统或方法的基本性质产生实质性影响的任何另外的特征、要素、方法步骤等。本文的许多实施方案使用开放性“包含”语言进行描述。此类实施方案涵盖可另选地使用此类语言来要求保护或进行描述的多个封闭性“由......组成”和/或“基本上由......组成”实施方案。
对于本文的数值范围的叙述，明确设想它们之间具有相同精度的每个中间数。例如，对于6至9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于6.0至7.0的范围，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用，术语“亲和元件”是指与相应的“亲和剂”形成稳定的非共价相互作用的分子实体。
如本文所用，术语“捕获元件”是指与相应的“捕获剂”形成共价相互作用的分子实体。
如本文所用，术语“可检测元件”是指附接(例如，直接或经由合适的接头)至本文所述的化合物(或者它们的衍生物或类似物，等)的可检测、反应性、亲和或者生物活性剂或部分。可以用于本文所述的实施方案的其他另外可检测元件包括“定位元件”、“检测元件”等。
如本文所用，“腔肠素”是指天然存在的(“天然”)腔肠素。如本文所用，术语“腔肠素类似物”或“腔肠素衍生物”是指除在美国专利公布第2008/0248511号；美国专利公布第2012/0174242号；美国专利公布2017/0233789；和美国专利公布2018/0030059中公开的那些之外，腔肠素的合成(例如，衍生物或变体)和天然类似物，包括呋瑞吗嗪、腔肠素-n、腔肠素-f、腔肠素-h、腔肠素-hcp、腔肠素-cp、腔肠素-c、腔肠素-e、腔肠素-fcp、双脱氧腔肠素(“腔肠素-hh”)、腔肠素-i、腔肠素-icp、腔肠素-v和2-甲基腔肠素；这些专利公布中每个的公开内容均以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，腔肠素类似物包括前底物，例如，美国专利公布第2008/0248511号；美国公布第2012/0707849号；和美国公布第2014/0099654号中描述的那些前底物；这些专利公布中的每个的公开内容均以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，术语“能量受体”是指响应于能量吸收(例如，共振能量转移)而产生易于检测的信号的任何小分子(例如，发色团)、大分子(例如，自发荧光蛋白、藻胆蛋白、纳米颗粒、表面等)或分子复合物。在某些实施方案中，能量受体是荧光团或其他可检测的发色团。
如本文所用，术语“RAS开关I位点”是指RAS蛋白上的跨越残基30-38的位点，术语“RAS开关II位点”是指RAS蛋白上的跨越残基60-76的位点，如Milburn等人(Science 247：939-945(1990))和Kessler等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 116：15823-15829(2019))所公开，这些文献中的每篇均以引用的方式整体并入本文。如本文所用，术语“RAS开关I/II位点”是指RAS开关I位点和RAS开关II位点之间的袋，如Kessler等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 116：15823-15829(2019)所公开。
如本文所用，除非另外指明，否则“肽”和“多肽”是指两个或更多个氨基酸由肽酰胺键(-C(O)NH-)通过主链连接的聚合物化合物。术语“肽”通常是指短氨基酸聚合物(例如，具有少于25个氨基酸的链)，而术语“多肽”通常是指较长的氨基酸聚合物(例如，具有多于25个氨基酸的链)。
如本文所用，术语“样品”以其最广泛的含义来使用。在某种意义上，样品意图包括从任何来源以及生物和环境样品获得的样本或培养物。生物样品可从动物(包括人类)获得并且包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，诸如血浆、血清等。样品还可以指本文所述的细胞、细胞裂解物或者酶、肽和/或多肽的纯化的形式(例如，纯化的蛋白质样品)。细胞裂解物可以包括已经用裂解剂裂解的细胞，或者诸如兔网织红细胞或小麦胚芽裂解物的裂解物。样品还可以包括体外样品和无细胞样品，诸如无细胞表达系统。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品。样品还可以包括纯化的样品，诸如纯化的蛋白质样品。然而，此类实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。
如本文所用，术语“固体支持物”用于指试剂诸如底物、突变蛋白、类药物分子和其他测试组分附接或可以附接至的任何固体或固定材料。固体支持物的实例包括显微镜载玻片、微量滴定板的孔、盖玻片、珠粒、颗粒、树脂、细胞培养瓶以及许多其他合适的物品。珠粒、颗粒或树脂可以是磁性的或顺磁性的。
“变体”在本文中用于描述氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守置换而不同但是保持至少一种生物活性的肽或多肽。“SNP”是指作为单核苷酸多态性的变体。“生物活性”的代表性实例包括被特定抗体结合或促进免疫反应的能力。变体在本文中也用于描述具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保持至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守置换(例如，一种氨基酸被替代为具有相似性质，诸如亲水性、带电荷区域的程度和分布的不同的氨基酸)在本领域中被认为通常涉及微小的变化。如本领域所理解，这些微小的变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来识别。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示可产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的上下文中氨基酸的亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，已报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的测量。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解的。可利用具有在±2内的亲水性值的氨基酸彼此进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值二者均受该氨基酸的特定侧链的影响。与所述观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸取代依赖于氨基酸的相对相似性，特别是所述氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。
下文更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。出于本公开的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版，Handbook of Chemistry and Physics，第75版，内页来识别并且特定官能团通常如其中所述定义。另外，有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性在Sorrell，Organic Chemistry，第2版，University Science Books，Sausalito，2006；Smith，March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanism，and Structure，第7版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，2013；Larock，Comprehensive OrganicTransformations，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，2018；和Carruthers，SomeModern Methods of Organic Synthesis，第3版，Cambridge University Press，Cambridge，1987中有所描述；这些文献中的每个的全部内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“烷基”意指含有1至30个碳原子，例如1至16个碳原子(C1-C16烷基)、1至14个碳原子(C1-C14烷基)、1至12个碳原子(C1-C12烷基)、1至10个碳原子(C1-C10烷基)、1至8个碳原子(C1-C8烷基)、1至6个碳原子(C1-C6烷基)、1至4个碳原子(C1-C4烷基)、6至20个碳原子(C6-C20烷基)或8至14个碳原子(C8-C14烷基)的直链或支链饱和烃链。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。
如本文所用，“亚烷基”是指衍生自具有1至12个碳原子(C1-C12亚烷基)，例如，1至6个碳原子(C1-C6亚烷基)的直链或支链烃的二价基团。亚烷基的代表性实例包括但不限于-CH2-、-CH2CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2CH2-和-CH(CH3)CH2CH2CH2CH2-。
如本文所用，术语“烯基”是指含有2至30个碳原子并且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、2-庚烯基、2-甲基-1-庚烯基和3-癸烯基。
如本文所用，术语“炔基”是指含有2至30个碳原子并且含有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃链。炔基的代表性实例包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。
如本文所用，术语“芳基”是指具有单个环(单环)或多个环(双环或三环)的芳族碳环环系，包括稠环系统和零个杂原子。如本文所用，芳基含有6-20个碳原子(C6-C20芳基)、6至14个环碳原子(C6-C14芳基)、6至12个环碳原子(C6-C12芳基)或6至10个环碳原子(C6-C10芳基)。芳基基团的代表性实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和菲基。
如本文所用，术语“亚芳基”是指二价芳基基团。亚芳基基团的代表性实例包括但不限于亚苯基基团(例如，1，2-亚苯基、1，3-亚苯基和1，4-亚苯基)。
如本文所用，术语“环烷基”是指含有三至十个碳原子和零个杂原子的饱和碳环环系。环烷基可以是单环的、双环的、桥联的、稠合的或螺环的。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、金刚烷基、双环[2.2.1]庚烷基、双环[3.2.1]辛烷基和双环[5.2.0]壬烷基。
如本文所用，术语“卤素”或“卤代”意指F、Cl、Br或I。
如本文所用，术语“卤代烷基”意指这样的如本文所定义的烷基基团，其中至少一个氢原子(例如，一、二、三、四、五、六、七或八个氢原子)被卤素替代。
如本文所用，术语“杂烷基”意指这样的如本文所定义的烷基基团，其中碳原子中的一个或多个(以及任何关联的氢原子)各自独立地被杂原子基团替代，所述杂原子基团诸如-NR-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-等等，其中R是H、烷基、芳基、环烷基、杂烷基、杂芳基或杂环基，它们中的每个可以是任选地取代的。例如，1、2或3个碳原子可以独立地被相同的或不同的杂原子基团替代。杂烷基基团的实例包括但不限于-OCH3、-CH2OCH3、-SCH3、-CH2SCH3、-NRCH3和-CH2NRCH3，其中R是氢、烷基、芳基、芳基烷基、杂烷基或杂芳基，它们中的每个可以是任选地取代的。杂烷基还包括其中烷基的碳原子被氧化(即，是-C(O)-)的基团。
如本文所用，术语“亚杂烷基”意指这样的如本文所定义的亚烷基基团，其中碳原子中的一个或多个(以及任何关联的氢原子)各自独立地被杂原子基团替代，所述杂原子基团诸如-NR-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-等等，其中R是H、烷基、芳基、环烷基、杂烷基、杂芳基或杂环基，它们中的每个可以是任选地取代的。例如，1、2或3个碳原子可以独立地被相同的或不同的杂原子基团替代。亚杂烷基还包括其中烷基的碳原子被氧化(即，是-C(O)-)的基团。亚杂烷基基团的实例包括但不限于-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NR-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-等等，以及聚环氧乙烷链、聚环氧丙烷链和聚乙烯亚胺链。
如本文所用，术语“杂芳基”是指具有单个环(单环)或多个环(双环或三环)、具有一个或多个环杂原子的芳族基团，所述环杂原子独立地选自O、N和S。芳族单环是含有至少一个杂原子的五元环或六元环，所述杂原子独立地选自O、N和S(例如1、2、3或4个杂原子，所述杂原子独立地选自O、N和S)。五元芳族单环具有两个双键，六元芳族单环具有三个双键。双环杂芳基基团的示例是附加稠合至如本文所定义的单环芳基基团或如本文所定义的单环杂芳基基团的单环杂芳基环。三环杂芳基基团的示例是稠合至两个环(独立地选自如本文所定义的单环芳基基团和如本文所定义的单环杂芳基基团)的单环杂芳基环。单环杂芳基的代表性实例包括但不限于吡啶基(包括吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基)、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡咯基、苯并吡唑基、1，2，3-三唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻吩基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、1，2，4-三嗪基和1，3，5-三嗪基。双环杂芳基的代表性实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁二唑基(benzooxadiazolyl)、苯并吡唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并噁二唑基(benzoxadiazolyl)、苯并噁唑基、苯并二氢吡喃基、咪唑并吡啶、咪唑并噻唑基、吲唑基、吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、萘啶基、嘌呤基、吡啶并咪唑基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、噻唑并吡啶基、噻唑并嘧啶基、噻吩并吡咯基和噻吩并噻吩基。三环杂芳基的代表性实例包括但不限于二苯并呋喃基和二苯并噻吩基。单环杂芳基、双环杂芳基和三环杂芳基通过环内含有的任何碳原子或任何氮原子连接至母体分子部分。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环的”是指具有一个或多个独立地选自O、N和S的环杂原子的饱和的或部分不饱和的非芳族环状基团。意指单环杂环、双环杂环或三环杂环。单环杂环是含有至少一个独立地选自O、N和S的杂原子的三元环、四元环、五元环、六元环、七元环或八元环。三元环或四元环含有零个或一个双键，以及一个选自O、N和S的杂原子。五元环含有零个或一个双键以及一个、两个或三个选自O、N和S的杂原子。六元环含有零个、一个或两个双键以及一个、两个或三个选自O、N和S的杂原子。七元环和八元环含有零个、一个、两个或三个双键以及一个、两个或三个选自O、N和S的杂原子。单环杂环的代表性实例包括但不限于氮杂环丁烷基、氮杂环庚烷基、氮丙啶基、二氮杂环庚烷基、1，3-二噁烷基、1，3-二噁戊环基、1，3-二硫戊环基、1，3-二噻烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、异噁唑啉基、异恶唑烷基、吗啉基、噁二唑啉基、噁二唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、氧杂环丁烷基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑啉基、吡唑烷基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢噻吩基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、1，2-噻嗪基、1，3-噻嗪基、噻唑啉基、噻唑烷基、硫代吗啉基、1，1-二氧桥硫代吗啉基(硫代吗啉砜)、噻喃基和三噻烷基。双环杂环是稠合至苯基基团的单环杂环、或稠合至单环环烷基的单环杂环、或稠合至单环环烯基的单环杂环、或稠合至单环杂环的单环杂环、或螺杂环基团、或这样的桥联的单环杂环环系：其中环的两个非邻近原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥或者两个、三个或四个碳原子的亚烯基桥连接。双环杂环的代表性实例包括但不限于苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并二氢吡喃基、2，3-二氢苯并呋喃基、2，3-二氢苯并噻吩基、2，3-二氢异喹啉、2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基、氮杂双环[2.2.1]庚基(包括2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)、2，3-二氢-1H-吲哚基、异吲哚啉基、八氢环戊[c]吡咯基、八氢吡咯并吡啶基和四氢异喹啉基。三环杂环的示例是稠合至苯基基团的双环杂环、或稠合至单环环烷基的双环杂环、或稠合至单环环烯基的双环杂环、或稠合至单环杂环的双环杂环、或这样的双环杂环：其中双环的两个非邻近原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥或者两个、三个或四个碳原子的亚烯基桥连接。三环杂环的实例包括但不限于八氢-2，5-环氧戊二烯、六氢-2H-2，5-甲烷环戊[b]呋喃、六氢-1H-1，4-甲烷环戊[c]呋喃、氮杂-金刚烷(1-氮杂三环[3.3.1.13，7]癸烷)和氧杂-金刚烷(2-氧杂三环[3.3.1.13，7]癸烷)。单环杂环、双环杂环和三环杂环通过环内含有的任何碳原子或任何氮原子连接至母体分子部分。
如本文所用，术语“羟基”意指-OH基团。
在一些情况下，基团(例如，烷基、烷氧基或环烷基)中的碳原子数以前缀“Cx-Cy-”表示，其中x是基团中的碳原子的最小数，y是基团中的碳原子的最大数。因此，例如，“C1-C3-烷基”是指含有1至3个碳原子(即1、2或3个碳原子)的烷基基团。
如本文所用，术语“取代基”是指在指定基团的原子上取代的基团。
当基团或部分可以被取代时，术语“取代的”表示在使用“取代的”的表述中所指示的基团上的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个；在一些实施方案中1、2或3个；以及在其他实施方案中1或2个)氢可以被所选择的列举的指定基团或者被本领域的技术人员已知的合适的取代基基团(例如，下文列举的基团中的一个或多个)替代，前提条件是不超过指定原子的正常化合价。取代基基团包括但不限于烷基、烯基、炔基、烷氧基、酰基、氨基、胺基、脒基、芳基、叠氮基、氨基甲酰基、羧基、羧基酯、氰基、环烷基、环烯基、胍基、卤代基、卤代烷基、卤代烷氧基、杂烷基、杂芳基、杂环基、羟基、肼基、亚氨基、氧代基、硝基、磷酸根基、膦酸根基、磺酸、硫醇、硫酮或它们的组合。
如本文所用，在化学结构中，指示式：
Figure BDA0004206448020000301
表示一个部分与另一个部分的附接点(例如，与RAS结合部分连接的接头)。
对于本文所述的化合物，它们的基团和取代基可以根据原子和取代基的允许化合价来选择，以使得选择和取代产生稳定的化合物，例如不会通过诸如重排、环化、消去等来自发地经历转化的化合物。
当取代基基团以它们的从左到右书写的常规化学式来指定时，它们任选地涵盖由从右到左书写结构所产生的取代基，例如-CH2O-任选地还列举-OCH2-，-OC(O)NH-还任选地列举-NHC(O)O-。
II.RAS蛋白
本文公开的方法和系统涉及靶标RAS蛋白。在一些实施方案中，靶标RAS蛋白是靶标KRAS蛋白。KRAS基因具有两个剪接变体或异型体：KRAS4A(登录号：NP_001356715.1)和KRAS4B(登录号：NP_004976.2)。KRAS4A和KRAS4B在前150个氨基酸残基上是相同的，并且二者都可以发生一些相同的致癌性突变，例如在第12位。在一些实施方案中，靶标RAS蛋白是靶标HRAS蛋白。HRAS基因也具有两个剪接变体或异型体：异型体1(登录号：NP_001123914.1)和异型体2(NP_789765.1)。在一些实施方案中，靶标RAS蛋白是靶标NRAS蛋白(登录号：NP_002515.1)。
在一些实施方案中，KRAS蛋白是野生型KRAS4A蛋白(SEQ ID NO：2)。在一些实施方案中，KRAS蛋白是KRAS4A变体，例如，包含与SEQ ID NO：2具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的变体。在一些实施方案中，KRAS4A变体是包含与SEQ ID NO：2具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的活性变体(例如，组成型活性)。
在一些实施方案中，KRAS蛋白是野生型KRAS4B蛋白(SEQ ID NO：4)。在一些实施方案中，KRAS蛋白是KRAS4B变体，例如，包含与SEQ ID NO：4具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的变体。在一些实施方案中，KRAS4B变体是包含与SEQ ID NO：4具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的活性变体(例如，组成型活性)。
在一些实施方案中，KRAS蛋白是选自以下的KRAS变体：KRASG12C(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8)、KRASG12D(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9)、KRASG12V(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10)、KRASQ61R(SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：41)、KRASQ61H(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：42)、KRASQ61L(SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：43)和KRASG13D(SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：44)。在一些实施方案中，KRAS蛋白是相对于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44而言，具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60个或它们之间的范围)取代的KRAS变体。
在一些实施方案中，HRAS蛋白是野生型HRAS异型体1蛋白(SEQ ID NO：12)。在一些实施方案中，KRAS蛋白是HRAS异型体1变体，例如，包含与SEQ ID NO：12具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的变体。在一些实施方案中，HRAS异型体1变体是包含与SEQ ID NO：12具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的活性变体(例如，组成型活性)。
在一些实施方案中，HRAS蛋白是野生型HRAS异型体2蛋白(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，HRAS蛋白是HRAS异型体2变体，例如，包含与SEQ ID NO：14具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的变体。在一些实施方案中，HRAS异型体2变体是包含与SEQ ID NO：14具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的活性变体(例如，组成型活性)。
在一些实施方案中，HRAS蛋白是选自以下的HRAS变体：HRASG12S(SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17)和HRASG12V(SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18)。在一些实施方案中，HRAS蛋白是相对于SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18而言，具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60个或它们之间的范围)取代的HRAS变体。
在一些实施方案中，NRAS蛋白是野生型NRAS蛋白(SEQ ID NO：20)。在一些实施方案中，NRAS蛋白是NRAS变体，例如，包含与SEQ ID NO：20具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的变体。在一些实施方案中，NRAS变体是包含与SEQ ID NO：20具有至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的范围)的序列同一性的活性变体(例如，组成型活性)。
在一些实施方案中，NRAS蛋白是选自以下的NRAS变体：NRASGl2D(SEQ ID NO：21)和NRASQ61R(SEQ ID NO：22)。在一些实施方案中，NRAS蛋白是相对于SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：22而言，具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60个或它们之间的范围)取代的NRAS变体。
在一些实施方案中，RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白)或其变体被表达/提供为融合体和/或具有用于检测、鉴定等的标签。在一些实施方案中，RAS蛋白或变体其被表达/提供为与生物发光报道蛋白的融合体。在一些实施方案中，RAS蛋白或其变体被表达/提供为与荧光素酶的融合体。在一些实施方案中，RAS蛋白或其变体被表达/提供为与刺虾(Oplophorus)荧光素酶的活性变体的融合体。在一些实施方案中，RAS蛋白或其变体被提供/表达为与生物发光多肽和/或基于(例如，在结构上、在功能上等)以下的生物发光复合物的组分的融合体：细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)的荧光素酶、
Figure BDA0004206448020000332
荧光素酶(Promega Corporation，参见美国专利第8,557,970号和美国专利第8,669,103号，这两个专利以引用的方式整体并入本文)(SEQ ID NO：23)、NanoBiT(PromegaCorporation，参见美国专利第9,797,889号，该专利以引用的方式整体并入本文)或NanoTrip(参见美国专利公布第2020/0270586号和美国专利申请第17/105,925号，这些专利中的每个以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，本文的方法和系统纳入可商购获得的基于
Figure BDA0004206448020000333
的技术(例如，
Figure BDA0004206448020000334
荧光素酶、NanoBRET、NanoBiT、NanoTrip、NanoGlo等)，但是在其他实施方案中，采用来自商购获得的基于
Figure BDA0004206448020000335
的技术的各种组合、变化或衍生物。
在一些实施方案中，RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白)被表达/提供为与生物发光多肽的融合体，所述生物发光多肽包括但不限于
Figure BDA0004206448020000331
和/或PCT申请第PCT/US2010/033449号、美国专利第8,557,970号、PCT申请第PCT/2011/059018号和美国专利第8,669,103号中描述的生物发光多肽(这些专利中的每个均以引用的方式整体并入本文并且用于所有目的)。在一些实施方案中，此类生物发光多肽连接(例如，融合、化学连接等)至用于本文所述的方法和系统的RAS蛋白。
在一些实施方案中，RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白)被表达/提供为与生物发光复合物的组分的融合体，所述生物发光复合物的组分包括但不限于
Figure BDA0004206448020000341
NanoTrip和/或例如PCT申请第PCT/US2014/026354号；美国专利第9,797,889号；美国专利公布第2020/0270586号(WO 2019/241438)；和美国专利申请第17/105,925号中描述的生物发光复合物的肽和多肽组分(这些专利中的每个以引用的方式整体并入本文并且用于所有目的)。在一些实施方案中，生物发光复合物的此类肽和/或多肽组分连接(例如，融合、化学连接等)至用于本文所述的方法和系统的RAS蛋白。例如，在一些实施方案中，RAS蛋白被表达/提供为与LgBiT(SEQ ID NO：25)、SmBiT(SEQ ID NO：26)、LgTrip 3092(SEQ ID NO：27)、LgTrip 3546(SEQ ID NO：28)、LgTrip 2098(SEQ ID NO：29)或SmTrip9(SEQ ID NO：30)的融合体。
如美国专利第10,024,862号和美国专利第9,977,586号(这两个专利中的每个均以引用的方式整体并入本文并且用于所有目的)所公开，连接(例如，融合)至生物发光报道蛋白(例如，荧光素酶、生物发光复合物的组分等)的RAS蛋白可以通过存在于系统或方法中的生物发光报道蛋白和能量受体(例如，荧光团)之间的生物发光共振能量转移(BRET)来检测，并且与蛋白质(例如，激酶)共定位。
在一些实施方案中，基于
Figure BDA0004206448020000342
基于NanoBiT和/或基于NanoTrip中的任一者的肽、多肽、复合物、融合体和缀合物均可用于本文所述的系统和方法的基于BRET的应用。例如，在某些实施方案中，本文提供了融合至生物发光报道蛋白(例如，基于
Figure BDA0004206448020000343
基于NanoBiT和/或基于NanoTrip的多肽、肽或复合物)的RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白)或其变体，以及包含能量受体(例如荧光团(例如，荧光蛋白、小分子荧光团等))的RAS结合剂，其中基于
Figure BDA0004206448020000351
基于NanoBiT和/或基于NanoTrip的多肽、肽或复合物的发射光谱与能量受体(例如，荧光团)的激发光谱重叠。在一些实施方案中，在RAS结合剂与RAS蛋白接合后，并且在存在生物发光报道蛋白的底物(例如，腔肠素、呋瑞吗嗪等)的情况下，检测BRET。在一些实施方案中，在候选RAS结合化合物与RAS蛋白结合后，RAS结合剂发生位移，并且检测到BRET的减少。
III.RAS结合剂和组合物
本文公开了RAS结合剂，以及使用RAS结合剂的系统和方法，所述RAS结合剂包括KRAS结合剂、HRAS结合剂和NRAS结合剂。RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件。在一些实施方案中，RAS结合部分和功能元件通过共价键连接。在一些实施方案中，RAS结合部分和功能元件通过接头连接。
RAS结合部分可以是已知结合至RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白)的任何部分。在一些实施方案中，RAS结合部分是KRAS结合部分。在一些实施方案中，RAS结合部分是HRAS结合部分。在一些实施方案中，RAS结合部分是NRAS结合部分。在一些实施方案中，RAS结合部分是结合至RAS SI/SII位点的部分。在一些实施方案中，KRAS结合部分是结合至KRAS SI/SII位点的部分。在一些实施方案中，HRAS结合部分是结合至HRAS SI/SII位点的部分。在一些实施方案中，NRAS结合部分是结合至NRAS SI/SII位点的部分。
在一些实施方案中，所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure BDA0004206448020000361
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
在一些实施方案中，A是具有1、2或3个独立地选自N、S和O的杂原子的单环芳基或单环杂芳基。在一些实施方案中，A是具有1或2个氮原子的单环芳基或单环杂芳基。在一些实施方案中，A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，A选自苯基、咪唑和吡咯。
在一些实施方案中，A具有下式：
Figure BDA0004206448020000362
在一些实施方案中，A具有下式：
Figure BDA0004206448020000363
在一些实施方案中，A具有下式：
Figure BDA0004206448020000371
在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，R2是氢，并且R3是氢或甲基。在一些实施方案中，R1是基团-接头-B，R2是氢，并且R3是甲基。
在一些实施方案中，R2是基团-接头-B，并且R1和R3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R2是基团-接头-B，R1是氢，并且R3是氢或甲基。在一些实施方案中，R2是基团-接头-B，R1是氢，并且R3是甲基。
在一些实施方案中，R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，R3是基团-接头-B，并且R1和R2都是氢。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0004206448020000372
Figure BDA0004206448020000381
(例如，
Figure BDA0004206448020000382
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0004206448020000383
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有以下结构：
Figure BDA0004206448020000391
式(I)的化合物包括作为基团-接头-B的一部分的接头。在一些实施方案中，接头在功能元件B和化合物的其余部分之间提供足够的距离，以允许功能元件B和化合物的其余部分中的每个的功能发挥不受与另一个的连接的干扰(或使干扰最小)。例如，在一些实施方案中，诸如当基团B是可检测元件(如本文所进一步描述)时，接头提供足够的距离以允许式(I)的化合物结合至RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS)，并且还允许可检测部分成为可检测的(例如，无干扰或干扰最小)。在一些实施方案中，接头使功能元件(例如，可检测元件、固体表面等)与式(I)的化合物的其余部分在长度上分开
Figure BDA0004206448020000393
至
Figure BDA0004206448020000394
包括端值在内。在一些实施方案中，接头使功能元件与式(I)的化合物的其余部分分开
Figure BDA0004206448020000395
Figure BDA0004206448020000396
或它们之间的任何合适的范围(例如，
Figure BDA0004206448020000397
等)。在一些实施方案中，接头使功能元件与式(I)的化合物的其余部分分开1-200个原子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200个原子或它们之间的任何合适的范围(例如，2-20、10-50个原子等))。
接头可以包括一个或多个独立地选自以下的基团：亚甲基(-CH2-)、醚(-O-)、胺(-NH-)、烷基胺(-NR-，其中R是任选地取代的C1-C6烷基基团)、硫醚(-S-)、二硫化物(-S-S-)、酰胺(-C(O)NH-)、酯(-C(O)O-)、氨基甲酸酯(-OC(O)NH-)、磺酰胺(-S(O)2NH-)、亚苯基(-C6H4-)和亚哌嗪基
Figure BDA0004206448020000392
以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，接头包含一个或多个-(CH2CH2O)-(氧亚乙基)基团，例如，1-20个-(CH2CH2O)-基团(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个-(CH2CH2O)-基团或它们之间的任何范围)。在一些实施方案中，接头包含-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2O)2-、-(CH2CH2O)3-、-(CH2CH2O)4-、-(CH2CH2O)5-、-(CH2CH2O)6-、-(CH2CH2O)7-、-(CH2CH2O)8-、-(CH2CH2O)9-或-(CH2CH2O)10-基团。在一些实施方案中，接头包含-(CH2CH2O)4-基团。
在一些实施方案中，接头包含一个或多个亚烷基基团(例如，-(CH2)n-，其中n为1-12，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或它们之间的任何合适的范围)。在一些实施方案中，接头包含一个或多个支链亚烷基基团。
在一些实施方案中，接头包含至少一个酰胺基团(-C(O)NH-)。在一些实施方案中，接头包含两个酰胺基团。
在一些实施方案中，接头包含至少一个亚哌嗪基基团。
在一些实施方案中，接头包含可切割的(例如，可酶促切割的、可化学切割的等)部分。
在一些实施方案中，接头包含一个或多个取代基、侧基、侧链等，包括任何合适的有机官能团(例如，-OH、-NH2、-SH、-CN、＝O、＝S、卤素(例如，-F、-Cl、-Br、-I)、-COOH、-CONH2、-CH3等)。
在一些实施方案中，接头包含多于一个线性连接的C、S、N和/或O原子。在一些实施方案中，接头包含1-200个线性连接的原子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200个或它们之间的任何合适的范围(例如，2-20、10-50、6-18个))。在一些实施方案中，接头包含1-200个线性连接的原子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200个或它们中的任何合适的范围(例如，2-20、10-50、6-18个))。
在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000411
其中m和n独立地为0、1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，m和n独立地为0、1、2或3。在一些实施方案中，m和n独立地为1、2或3。
在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000412
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，m、n和p独立地为0、1、2、3或4。在一些实施方案中，m和n独立地为1、2或3，并且p为1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000413
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，m、n和p独立地为0、1、2、3或4。在一些实施方案中，m和n独立地为1、2、3或4，并且p为1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000421
其中m为0、1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，m为1、2或3。在一些实施方案中，m为1或2。
在一些实施方案中，接头具有下式：
Figure BDA0004206448020000422
其中p为1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，接头选自：
Figure BDA0004206448020000423
在一些实施方案中，接头L选自：
Figure BDA0004206448020000424
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
式(I)的化合物包含作为基团-接头-B的一部分的功能元件(其中B是功能元件)。在某些实施方案中，功能元件具有允许进行RAS结合剂的检测的可检测性质。可检测元件包括具有特征性电磁光谱性质(诸如发射或吸收、磁性、电子自旋共振、电容、介电常数或电导率)以及铁磁性、顺磁性、抗磁性、发光、电化学发光、荧光、磷光、有色、抗原性官能团或具有独特质量的那些。可检测元件包括但不限于核酸分子(例如，DNA或RNA(例如，寡核苷酸或核苷酸))、蛋白质(例如，发光蛋白)、肽、放射性核素、亲和标签(例如，生物素或链霉亲和素)、半抗原、氨基酸、脂质、脂质双层、固体支持物、荧光团、发色团、报告分子、电子不透明分子、MRI造影剂(例如，锰、钆(III)或氧化铁颗粒)或它们的配位体、SPECT造影剂等等。检测特定可检测元件或分离包含特定可检测元件与其所结合的任何物质的组合物的方法是已知的，并且包括诸如以下的方法：荧光、质谱、放射性核素检测、光学成像、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和能量转移。
在一些实施方案中，功能元件是或包括固体支持物。合适的固体支持物包括沉积颗粒，诸如磁性颗粒、琼脂糖凝胶或纤维素珠粒；膜；玻璃，例如，载玻片；纤维素、藻酸盐、塑料或其他合成制备的聚合物(例如，Eppendorf管或多孔板的孔)；自组装单层；表面等离子共振芯片；具有电子传导表面的固体支持物；等。
示例性功能元件包括半抗原(例如，用于增强免疫原性的分子，诸如钥孔帽贝血蓝蛋白)、可切割的标记(例如，可光切割的生物素)和荧光标记(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的香豆素以及琥珀酰亚胺或磺酰基琥珀酰亚胺修饰的BODIPY(它可以通过紫外和/或可见激发荧光检测法进行检测)、罗丹明(R110、对甲氨基酚、CRG6、德克萨斯甲基红(TAMRA)、Rox5、FAM或荧光素)、香豆素衍生物(例如，7氨基香豆素和7-羟基香豆素)、2-氨基-4-甲氧基萘、1-羟基芘、试卤灵、葩酮或苯并次联苯甲酮(美国专利第4,812,409号))、吖啶酮(美国专利第4,810,636号)、蒽以及α-萘酚和β-萘酚的衍生物、氟化呫吨衍生物(包括氟化荧光素和对甲氨基酚)(例如，美国专利第6,162,931号)以及生物发光分子(例如，荧光素酶(例如，刺虾源性荧光素酶(参见，例如，美国专利公布第2010/0281552号和美国专利公布第2012/0174242号，这两个专利公布以引用的方式整体并入本文)或者GFP或GFP衍生物))。
另一类可检测元件包括可使用电磁辐射检测的分子，并且包括但不限于呫吨荧光团、丹磺酰基荧光团、香豆素和香豆素衍生物、荧光吖啶部分、基于苯并芘的荧光团以及7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑和3-N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)-2，3-二氨基-丙酸。优选地，荧光分子在不同于天然氨基酸的波长下具有高荧光量子收率，并且更优选地具有可以在光谱的可见光部分或者紫外和可见光部分中被激发的高荧光量子收率。在预选的波长下激发后，可以目测或使用常规荧光检测方法来检测低浓度的分子。电化学发光分子，诸如钌螯合物以及它们的衍生物或者硝基氧氨基酸以及它们的衍生物，可在飞摩尔范围及以下检测。
在一些实施方案中，可检测元件是能量受体，诸如荧光团。合适的荧光团包括但不限于：呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红、德克萨斯红等)、花青衍生物(例如，花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青、部花青等)、萘衍生物(例如，丹磺酰基和普罗丹(prodan)衍生物)、噁二唑衍生物(例如，吡啶噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑等)、芘衍生物(例如，级联蓝)、噁嗪衍生物(例如，尼罗河红、尼罗河蓝、甲酚紫、噁嗪170等)、吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙、吖啶黄等)、吖啶次甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿等)、四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素等)、CF染料(Biotium)、BODIPY(Invitrogen)、ALEXA FLuoR(Invitrogen)、DYLIGHT FLUOR(Thermo Scientific，Pierce)、ATTO和TRACY(Sigma Aldrich)、FluoProbes(Interchim)、DY和MEGASTOKES(Dyomics)、SULFO CY染料(CYANDYE，LLC)、SETAU和SQUARE染料(SETA BioMedicals)、QUASAR和CALFLUOR染料(Biosearch Technologies)、SURELIGHT染料(APC、RPE、PerCP、藻胆体)(Columbia Biosciences)、APC、APCXL、RPE、BPE(Phyco-Biotech)、自发荧光蛋白(例如，YFP、RFP、mCherry、mKate)、量子点纳米晶体等。在一些实施方案中，荧光团是罗丹明类似物(例如，羧基罗丹明类似物)，诸如美国专利公布第2013/0317207号中描述的那些，该专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，荧光团是BODIPY染料。在一些实施方案中，荧光团是DY-605(Dyomics)。
在一些实施方案中，可检测元件是具有下式的能量受体(荧光团)：
Figure BDA0004206448020000451
在一些实施方案中，可检测元件是具有下式的能量受体(荧光团)：
Figure BDA0004206448020000452
或者其盐或互变异构体。
除荧光分子之外，具有基于分子对电磁场和辐射的相互作用和响应的物理性质的多种分子可用于本文公开的RAS结合剂中的可检测部分。这些性质包括电磁波谱的紫外、可见和红外区域中的吸收、拉曼活性发色团的存在，并且可以通过共振拉曼光谱、电子自旋共振活性以及核磁共振和分子质量，例如，经由质谱仪来进一步增强。
在一些实施方案中，功能元件是捕获元件。在一些实施方案中，捕获元件是蛋白质(例如，酶)的底物，并且捕获剂是该蛋白质。在一些实施方案中，捕获元件是“共价底物”或者与蛋白质或酶形成共价键的捕获元件(该捕获元件与蛋白质或酶发生反应)。底物可以包含在与酶相互作用时与酶形成共价键的反应性基团(例如，经修饰的底物)，或者酶可以是不能使共价结合的中间体与底物适应的突变形式。在一些实施方案中，底物由与其形成共价键的突变蛋白(例如，突变脱卤素酶)识别。在这些实施方案中，虽然底物与蛋白质(例如，脱卤素酶)的野生形式的相互作用生成产物并且使野生型蛋白质再生，但是底物(例如，卤代烷烃)与蛋白质(例如，脱卤素酶)的突变形式的相互作用使蛋白质与底物之间形成稳定的键(例如，共价键形成)。底物可以是任何突变蛋白质的任何合适的底物，所述突变蛋白质已经被改变为与其底物形成超稳定键或共价键，所述底物通常只会与蛋白质短暂结合。在一些实施方案中，蛋白质是突变水解酶或脱卤素酶。在一些实施方案中，蛋白质是突变脱卤素酶，并且底物是卤代烷烃。在一些实施方案中，卤代烷烃包括被末端卤素(例如，Cl、Br、F、I等)加帽的烷烃(例如，C2-C20)。在一些实施方案中，卤代烷具有式A-X，其中X是卤素(例如，Cl、Br、F、I等)，并且其中A是包含2-20个碳的烷烃。在某些实施方案中，A包含2-12个碳的直链区段。在某些实施方案中，A是2-12个碳的直链区段。在一些实施方案中，卤代烷烃可以包含不干扰与突变脱卤素酶的相互作用的任何另外的侧基或取代基。
在一些实施方案中，捕获剂是SNAP-Tag，并且捕获元素是苄基鸟嘌呤(参见，例如，Crivat G，Taraska JW(2012年1月)Trends in Biotechnology 30(1)：8-16，该文献以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，捕获剂是CLIP-Tag，并且捕获元件是苄基胞嘧啶(参见，例如，Gautier等人Chem Biol.2008，15(2)：128-36，该文献以引用的方式整体并入本文)。
包含共价结合底物(例如，卤代烷烃底物)的突变蛋白(例如，突变水解酶(例如，突变脱卤素酶))的系统例如在美国专利第7,238,842号；美国专利第7,425,436号；美国专利第7,429,472号；美国专利第7,867,726号中有所描述；这些专利中的每个均以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，功能元件是亲和元件(例如，结合至亲和剂的亲和元件)。这些配对的实例包括：作为亲和剂的抗体和作为亲和元件的抗原；作为亲和元件的His标签和作为亲和剂的镍色谱柱；分别作为亲和剂和亲和元件的具有高亲和力的蛋白质和小分子(例如，链霉亲和素和生物素)等。亲和分子的实例包括诸如以下的分子：免疫原性分子(例如，蛋白质、肽、碳水化合物或脂质的表位(例如，可用于制备对该分子具有特异性的抗体的任何分子))；生物素、亲和素、链霉亲和素以及它们的衍生物；金属结合分子；以及这些分子的片段和组合。示例性亲和分子包括5xHis(HHHHH)(SEQ ID NO：31)、6xHis(HHHHHH)(SEQ IDNO：32)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO：33)、FLAG(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：34)、Strep-Tag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：35)、HA标签(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：36)、硫氧还蛋白、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、S-肽、T7肽、钙调蛋白结合肽、C-末端RNA标签、金属结合结构域、金属结合反应性基团、氨基酸反应性基团、内含肽、生物素、链霉亲和素和麦芽糖结合蛋白。亲和分子的另一个实例是丹磺酰赖氨酸。与丹磺酰基环相互作用的抗体是可商购获得的(Sigma Chemical；St.Louis，Mo.)或者可以使用诸如Antibodies：A Laboratory Manual(Harlow和Lane，1988)中描述的已知的方案来制备。
在一些实施方案中，功能元件是诱导蛋白质降解的部分。例如，功能元件可以是在活细胞内募集蛋白质降解途径的部分。诱导蛋白质降解的合适的功能元件包括Lai等人，Nature Reviews Drug Discovery，2017，16，101-114中公开的那些，该文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，功能元件是疏水性基团，诸如金刚烷或Arg-Boc3，所述疏水性基团通过疏水性标签标记(HyT)来诱导蛋白质降解。在一些实施方案中，Z是来自核蛋白(nutlin)-3a、苯丁抑制素(bestatin)、VHL配体、泊马度胺和Lai等人公开的其他小分子的部分，它们通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标签标记来诱导蛋白质降解。
在一些实施方案中，RAS结合剂是生物相容的(例如，细胞相容的)和/或可透过细胞的。因此，在一些实施方案中，合适的功能元件(例如，可检测元件、亲和元件、固体支持物、捕获元件)是在此类化合物的背景内细胞相容的和/或可透过细胞的功能元件。在一些实施方案中，RAS结合剂能够跨过细胞膜进入细胞(例如，经由扩散、内吞、主动转运、被动转运等)。在一些实施方案中，除特定功能之外，还基于细胞相容性和/或细胞透过性来选择合适的功能元件和接头。
在一些实施方案中，RAS结合剂是选自以下的化合物：
Figure BDA0004206448020000481
Figure BDA0004206448020000491
Figure BDA0004206448020000501
Figure BDA0004206448020000511
Figure BDA0004206448020000521
Figure BDA0004206448020000531
Figure BDA0004206448020000541
或者其互变异构体或盐。
RAS结合剂，诸如式(I)的化合物，可以是盐的形式。中性形式可以通过使盐与碱或酸接触并且以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理性质(诸如在极性溶剂中的溶解度)方面不同于各种盐形式，但是出于本公开的目的，盐等同于化合物的母体形式。
具体而言，如果RAS结合剂(例如，式(I)的化合物)是阴离子或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则可以与一种或多种合适的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属阳离子，诸如Li+、Na+和K+，碱土金属阳离子，诸如Ca2+和Mg2+，以及其他阳离子。钠盐可以是特别合适的。合适的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即，NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R1 +、NH2R2 +、NHR3 +和NR4 +)。一些合适的取代铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和三羟甲基氨基甲烷，以及诸如赖氨酸和精氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，化合物是钠盐。
如果RAS结合剂(例如，式(I)的化合物)是阳离子或具有可以是阳离子的官能团(例如，-NH2可以是-NH3 +)，则可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。合适的有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟乙酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、四氟硼酸、甲苯磺酸、三氟甲磺酸和戊酸。在一些实施方案中，化合物是卤化物盐，诸如氯盐、溴盐或碘盐。在一些实施方案中，化合物是四氟硼酸盐或三氟甲磺酸盐。
RAS结合剂(例如，式(I)的化合物)可以通过多种方法来制备，包括实施例中所示的那些。本文的化合物和中间体可以通过有机合成领域的技术人员熟知的方法来分离和纯化。用于分离和纯化化合物的常规方法的实例可以包括但不限于在固体支持物(诸如硅胶、氧化铝或烷基硅烷基团衍生化的二氧化硅)上的色谱法，通过在高温或低温下重结晶并任选地用活性炭预处理，薄层色谱法，在不同的压力下蒸馏，真空升华以及研碎，如例如“Vogel′s Textbook of Practical Organic Chemistry”第5版(1989)，Furniss，Hannaford，Smith和Tatchell编，pub.Longman Scientific&Technical，Essex CM20 2JE，England中所述。
每个单独步骤的反应条件和反应时间可以根据所用的特定反应物和所用反应物中存在的取代基而变化。具体程序提供于实施例部分中。反应可以以常规方式进行后处理，例如通过从残余物中除去溶剂并且根据本领域通常已知的方法进一步纯化，所述方法诸如但不限于结晶、蒸馏、萃取、研碎和色谱法。除非另外指明，否则起始物料和试剂是商购获得的，或者可以由本领域的技术人员使用化学文献中描述的方法从商购获得的材料制备。起始物料，如果不是商购获得的，则可以通过程序来制备，所述程序选自标准有机化学技术、类似于已知的结构上相似的化合物的合成的技术、或者类似于上文所述的方案或合成实施例部分中描述的程序的技术。
常规实验，包括对反应条件、试剂和合成路线顺序的适当操纵，对与反应条件不相容的任何化学官能团的保护，以及在方法的反应顺序中适当的点进行的脱保护都被包括在本发明的范围中。合适的保护基团以及用于使用此类合适的保护基团对不同的取代基进行保护和脱保护的方法是本领域的技术人员熟知的；它们的实例可见于PGM Wuts标题为“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”(第5版)，John Wiley&Sons，Inc.(2014)的专题论文中，该文献以引用的方式整体并入本文。本发明的化合物的合成可以通过类似于上文所述的合成方案和具体实施例中描述的那些的方法来完成。
当需要所公开的化合物的光学活性形式时，可以通过以下方式来获得：使用光学活性起始物料进行本文所述的程序之一(例如通过合适反应步骤的不对称诱导来制备)，或者通过使用标准程序(诸如色谱分离、重结晶或酶促拆分)来拆分化合物或中间体的立体异构体的混合物。
类似地，当需要化合物的纯几何异构体时，可以通过以下方式来获得：使用纯几何异构体作为起始原料进行上述过程之一，或者通过使用标准程序诸如色谱分离来拆分化合物或中间体的几何异构体的混合物。
所描述的合成方案和具体实施例是示例性的，并且不应解读为限制权利要求中定义的本发明的范围。合成方法和具体实施例的所有替代方式、修改和等同物均包括在权利要求的范围内。
本文还提供了包含RAS结合剂的组合物。组合物可以另外包含RAS蛋白，诸如本文所述的RAS蛋白(例如，KRAS蛋白、HRAS蛋白、NRAS蛋白或它们的任何变体)。在一些实施方案中，诸如其中RAS蛋白是与生物发光报道蛋白的融合体的那些，组合物还包含生物发光报道蛋白的底物(例如，腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪)。在一些实施方案中，组合物还包含候选RAS结合化合物(例如，KRAS结合化合物、HRAS结合化合物、NRAS结合化合物)，诸如RAS抑制剂(例如，KRAS抑制剂、HRAS抑制剂或NRAS抑制剂)。
IV.系统和方法
在一些实施方案中，本文提供了鉴定RAS结合化合物(即评估候选RAS结合化合物与RAS蛋白的靶标接合)的系统和方法。所述系统和方法使用上述RAS蛋白和RAS结合剂来鉴定RAS结合化合物(例如，RAS抑制剂)。
在一个方面，本文提供了一种鉴定RAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含RAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含RAS结合部分和功能元件的RAS结合剂以及候选RAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法是鉴定KRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含KRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含KRAS结合部分和功能元件的KRAS结合剂以及候选KRAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法是鉴定HRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含HRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含HRAS结合部分和功能元件的HRAS结合剂以及候选HRAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法是鉴定NRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含NRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含NRAS结合部分和功能元件的NRAS结合剂以及候选NRAS结合化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。可以用于检测或定量功能元件的方法将取决于RAS结合剂(例如，KRAS结合剂、HRAS结合剂或NRAS结合剂)中存在的功能元件。例如，在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。因此，在一些实施方案中，可检测元件或由此产生的信号通过荧光、光学成像、放射性核素检测、质谱、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或能量转移来检测或定量。
在另一个方面，本文提供了一种系统，所述系统包括：
(a)靶标RAS蛋白；
(b)RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选RAS结合化合物。
在一些实施方案中，所述系统包括：
(a)靶标KRAS蛋白；
(b)KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选KRAS结合化合物。
在一些实施方案中，所述系统包括：
(a)靶标HRAS蛋白；
(b)HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选HRAS结合化合物。
在一些实施方案中，所述系统包括：
(a)靶标NRAS蛋白；
(b)NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选NRAS结合化合物。
在另一个方面，本文提供了一种用于筛选RAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选RAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)RAS蛋白；和(ii)RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。在一些实施方案中，所述RAS结合化合物结合所述RAS蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述方法是用于筛选KRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选KRNS结合化合物接触，所述样品包括：(i)KRAS蛋白；和(ii)KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。在一些实施方案中，所述KRAS结合化合物结合所述KRAS蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述方法是用于筛选HRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选HRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)HRAS蛋白；和(ii)HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。在一些实施方案中，所述HRAS结合化合物结合所述HRAS蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的信号。
在一些实施方案中，所述方法是用于筛选NRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选NRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)NRAS蛋白；和(ii)NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。在一些实施方案中，所述NRAS结合化合物结合所述NRAS蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的信号。
在所公开的系统和方法中，RAS结合剂是本文公开的RAS结合剂(例如，包含KRAS结合部分和功能元件的KRAS结合剂、包含HRAS结合部分和功能元件的HRAS结合剂或者包含NRAS结合部分和功能元件的NRAS结合剂)。示例性RAS结合剂包括式(I)的化合物。
在一些实施方案中，如本文所讨论，系统或方法中的RAS蛋白是RAS变体。在一些实施方案中，系统或方法中的KRAS蛋白是KRAS变体，诸如选自以下的变体：KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L和KRASG13D。在一些实施方案中，系统或方法中的KRAS蛋白是KRASG12C。在一些实施方案中，系统或方法中的HRAS蛋白是HRAS变体，诸如选自以下的变体：HRASG12S和HRASG12V。在一些实施方案中，系统或方法中的NRAS蛋白是NRASG12D或NRASQ61R。
在一些实施方案中，如上文所讨论，RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白或者它们的变体)在系统或样品内表达。在一些实施方案中，RAS蛋白(或其变体)提供于无细胞系统或样品，例如，体外样品或纯化的蛋白质样品中。在一些实施方案中，RAS蛋白(或其变体)提供于无细胞样品中，用于探头位移测定法(例如，基于荧光共振能量转移(FRET)、生物发光能量转移(BRET)的探头位移测定法、荧光偏振(FP)、放射性配体结合等等)。
在一些实施方案中，RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白或者它们的变体)在本文公开的系统和方法中被提供/表达为与生物发光报道蛋白(诸如荧光素酶(例如，刺虾荧光素酶))的融合体。在特定实施方案中，RAS蛋白或其变体被提供/表达为与生物发光多肽和/或基于
Figure BDA0004206448020000611
荧光素酶(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)、NanoBiT或NanoTrip的生物发光复合物的组分的融合体。在其他特定实施方案中，RAS蛋白被表达/提供为与生物发光复合物的组分的融合体，所述生物发光复合物的组分包括但不限于
Figure BDA0004206448020000612
NanoTrip和/或本文所述的生物发光复合物的肽和多肽组分。在一些实施方案中，生物发光复合物的此类肽和/或多肽组分连接(例如，融合、化学连接等)至用于本文所述的方法和系统的RAS蛋白。例如，在一些实施方案中，RAS蛋白被表达/提供为与LgBiT(SEQ ID NO：25)、SmBiT(SEQ ID NO：26)、LgTrip 3092(SEQ ID NO：27)、LgTrip 3546(SEQ ID NO：28)、LgTrip 2098(SEQ ID NO：29)或SmTrip9(SEQ ID NO：30)的融合体。在使用RAS与生物发光报道蛋白的融合体的实施方案中，所述方法可以另外包括使样品与生物发光报道蛋白的底物接触的步骤。在一些实施方案中，生物发光报道蛋白的底物选自腔肠素、腔肠素衍生物(例如，腔肠素-n、腔肠素-f、腔肠素-h、腔肠素-hcp、腔肠素-cp、腔肠素-c、腔肠素-e、腔肠素-fcp、双脱氧腔肠素(“腔肠素-hh”)、腔肠素-i、腔肠素-icp、腔肠素-v和2-甲基腔肠素)以及呋瑞吗嗪。在一些实施方案中，生物发光报道蛋白的底物是呋瑞吗嗪。
当RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白或者它们的变体)和生物发光报道蛋白的融合蛋白用于本文所述的系统和方法中时，以及当RAS结合剂包含作为功能元件的能量受体(例如，荧光团)时，如果生物发光报道蛋白的发射光谱与能量受体的激发光谱重叠，则所述方法还可以包括检测从生物发光报道蛋白至能量受体的能量转移的步骤。这种步骤可以鉴定RAS结合化合物，例如，通过检测样品与候选RAS结合化合物接触时能量转移的变化来鉴定RAS结合化合物。示例性测定法描绘于图1中，其中RAS蛋白被表达为与
Figure BDA0004206448020000621
荧光素酶的融合体，并且RAS结合剂包含RAS结合部分和能量受体。当RAS结合剂结合至RAS蛋白，并且样品与
Figure BDA0004206448020000622
荧光素酶的底物(例如，腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪)接触时，可以检测到从
Figure BDA0004206448020000623
荧光素酶至能量受体的能量转移。如果候选RAS结合化合物结合至RAS蛋白，则BRET信号将降低。如本文的实施例所示，即使当候选RAS结合化合物结合至RAS蛋白上与RAS结合剂不同的位点时，也可以检测到BRET信号的丢失。例如，在一些实施方案中，RAS结合剂结合至RAS开关I/II位点，而候选RAS结合化合物结合至开关I/II位点或开关II位点。在其他实施方案中，RAS结合剂结合至RAS开关II位点，而候选RAS结合化合物结合至开关I/II位点或开关II位点。在一些实施方案中，已经确定结合RAS蛋白(或其变体)的候选RAS结合化合物可以用作RAS结合剂(例如，连接至功能元件)，并且针对其他候选RAS结合化合物进行筛选。
因此，在一些实施方案中，本文提供了系统和方法，所述系统和方法包括融合至生物发光报道蛋白(例如，基于
Figure BDA0004206448020000631
的报道蛋白)的RAS蛋白和包含作为可检测元件的能量受体(例如，荧光团)的RAS结合剂，其中生物发光报道蛋白的发射光谱和荧光团的激发光谱重叠，以使得RAS结合剂与RAS蛋白的接合(例如，结合)可以通过生物发光报道蛋白与能量受体(例如，荧光团)之间的BRET的增加(例如，存在)来检测。在一些实施方案中，RAS结合化合物与RAS蛋白的接合(例如，结合)可以随后通过生物发光报道蛋白与能量受体(例如，荧光团)之间BRET的减少(例如，丢失)来检测。
在一些实施方案中，生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的任何范围)的荧光素酶。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。当RAS多聚体种类在细胞中形成(例如，二聚体)时，两个互补的生物发光报道蛋白亚基非常接近以形成功能性荧光素酶，所述荧光素酶在与底物(例如，腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪)反应后产生发光信号。因此，在一些实施方案中，生物发光报道蛋白的第一亚基与SEQ ID NO：25具有至少70％的序列同一性(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的任何范围)，并且生物发光报道蛋白的第二亚基与SEQ ID NO：26具有至少90％的序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或它们之间的任何范围)。
本文公开的方法可以用于多种样品。例如，在一些实施方案中，所述样品选自细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。在一些实施方案中，样品包含细胞，诸如表达RAS蛋白或其变体(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白或者它们的变体)的细胞，所述RAS蛋白或其变体诸如融合至生物发光报道蛋白的RAS蛋白或其变体(例如，KRAS、HRAS或NRAS蛋白或者它们的变体)。
在本文公开的系统和方法的一些实施方案中，RAS结合剂是可透过细胞的。在一些实施方案中，诸如使用生物发光报道蛋白的那些，系统和方法还包括不可透过细胞的生物发光报道蛋白的抑制剂，以确保任何BRET信号来自活的、未受损的细胞。
V.实施例
实施例1
RAS结合剂的合成
3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)丙烯酰胺(JRW-2024)
Figure BDA0004206448020000641
步骤1.3-(2-硝基乙烯基)-1H-吲哚-6-甲腈(JRW-1991)
Figure BDA0004206448020000651
向3-甲酰基-1H-吲哚-6-甲腈(0.39g，2.3mmol)在硝基甲烷的悬浮液(10mL)中添加乙酸铵(400mg)。将混合物加热至85℃并保持18小时。使反应冷却，产生黄色沉淀。将固体过滤并用甲醇/水(1∶1)洗涤，得到粗产物(290mg)，为黄色固体。ESI MS m/z 214[M+1]+。
步骤2. 3-(2-硝基乙基)-1H-吲哚-6-甲腈(JRW-1992)
Figure BDA0004206448020000652
向3-(2-硝基乙烯基)-1H-吲哚-6-甲腈(290mg，1.4mmol)在四氢呋喃/甲醇(1∶1，10mL)中的溶液中添加硼氢化钠(62mg，1.6mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。混合物用水稀释并且用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(220mg，两步44％)，为淡黄色固体。ESI MS m/z 214[M-1]+。
步骤3.(2-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2016)
Figure BDA0004206448020000653
向3-(2-硝基乙基)-1H-吲哚-6-甲腈(220mg，1.0mmol)在冰浴冷却的乙腈(20mL)中的溶液中添加二异丙基乙胺(660mg，5.1mmol)和三氯硅烷(484mg，3.6mmol)。将反应在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌3小时。将反应用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)中和，然后将脱碳酸二叔丁酯(436mg，2.0mmol)添加至氨基中间体。将混合物在室温下搅拌18小时。反应用乙腈稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(160mg，56％)，为白色泡沫状物。ESI MS m/z 286[M+1]+。
步骤4.(2-(6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2017)
Figure BDA0004206448020000661
向(2-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(160mg，0.56mmol)在冰浴冷却的四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加氢化钠(45mg，1.1mmol，60％)、1-(氯甲基)-1H-咪唑(98mg，0.84mmol)和四丁基碘化铵(20mg，0.056mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(120mg，56％)，为橙色油状物。ESI MS m/z 380[M+1]+。
步骤5.(2-(6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2019)
Figure BDA0004206448020000662
向(2-(6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(120mg，0.32mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌5小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。将滤液浓缩并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(75mg，62％)，为无色油状物。ESI MS m/z 384[M+1]+。
步骤6.(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2021)
Figure BDA0004206448020000671
向(2-(6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(65mg，0.17mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(50mg，0.17mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(102mg，0.85mmol)。将悬浮液在100℃下加热18小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(20mg，0.52mmol)。将还原加热至室温并搅拌1小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(42mg，37％)，为橙色固体。ESI MS m/z 660[M+1]+。
步骤7. 3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2022)
Figure BDA0004206448020000681
向(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(42mg，0.064mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，得到棕色油状粗产物。ESI MS m/z 560[M+1]+。
步骤8. 3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)丙烯酰胺(JRW-2024)
Figure BDA0004206448020000682
向3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(10mg，0.018mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(7mg，0.018mmol)和二异丙基乙胺(18mg，0.14mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(13mg，86％)，为紫色固体。ESI MS m/z 871[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2025)
Figure BDA0004206448020000691
向3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(10mg，0.018mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(12mg，0.018mmol)和二异丙基乙胺(18mg，0.14mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(13mg，65％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1118[M+1]+。
3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(2-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)丙烯酰胺(JRW-2029)
Figure BDA0004206448020000701
步骤1.(2-(4-((6-氰基-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-1987)
Figure BDA0004206448020000702
向3-甲酰基-1H-吲哚-6-甲腈(477mg，2.8mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加(2-(哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(771mg，3.4mmol)和氰基硼氢化钠(1.5g，7.0mmol)。将反应在40℃下搅拌18小时。混合物用水稀释并且用氯仿/异丙醇(3∶1)萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(910mg，85％)，为无色油状物。ESI MS m/z 384[M+1]+。
步骤2.(2-(4-((6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2011)
Figure BDA0004206448020000703
向(2-(4-((6-氰基-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.52mmol)在冰浴冷却的四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加氢化钠(42mg，1.0mmol，60％)、1-(氯甲基)-1H-咪唑(74mg，0.57mmol)和四丁基碘化铵(20mg，0.052mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌6小时。混合物用水(pH 10)稀释并且用氯仿/异丙醇(3：1)萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(187mg，75％)，为无色油状物。ESI MS m/z 478[M+1]+。
步骤3.(2-(4-((6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2013)
Figure BDA0004206448020000711
向(2-(4-((6-氰基-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(187mg，0.39mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌5小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到所期望的产物(170mg，粗产物)，为无色蜡状物。ESI MS m/z 482[M+1]+。
步骤4.(2-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2023)
Figure BDA0004206448020000712
向(2-(4-((6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(65mg，0.14mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(40mg，0.14mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(82mg，0.68mmol)。将悬浮液在100℃下加热18小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(16mg，0.41mmol)。将还原加热至室温并搅拌1小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(35mg，34％)，为棕色固体。ESI MS m/z 758[M+1]+。
步骤5. 3-(2-((((3-((4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2026)
Figure BDA0004206448020000721
向(2-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(25mg，0.046mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌4小时。浓缩混合物，得到棕色油状粗产物。ESI MS m/z 658[M+1]+。
步骤6. 3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(2-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)丙烯酰胺(JRW-2029)
Figure BDA0004206448020000731
向3-(2-((((3-((4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(10mg，0.015mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(6mg，0.015mmol)和二异丙基乙胺(16mg，0.12mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(13mg，86％)，为紫色固体。ESI MS m/z 969[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)哌嗪-1-基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2030)
Figure BDA0004206448020000732
向3-(2-((((3-((4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(10mg，0.015mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(10mg，0.015mmol)和二异丙基乙胺(16mg，0.12mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(13mg，72％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1216[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酰胺基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2038)
Figure BDA0004206448020000741
步骤1. 3-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1995)
Figure BDA0004206448020000742
将3-甲酰基-1H-吲哚-6-甲腈(200mg，1.2mmol)在乙腈(10mL)中的溶液加热至80℃。分批添加2-(三苯基-15-亚膦酰基)乙酸叔丁酯(1.1g，2.9mmol)。将反应在80℃下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(125mg，40％)，为白色固体。ESI MS m/z 269[M+1]+。
步骤2. 3-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(JRW-1997)
Figure BDA0004206448020000751
向3-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)丙烯酸叔丁酯(120mg，0.45mmol)在甲醇/乙酸乙酯(1∶1，10mL)中的溶液中添加钯碳(10mg)。在氢气球下，将反应在室温下搅拌2小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液并进行色谱分离，得到所期望的产物(105mg，87％)，为淡红色固体。ESI MS m/z 271[M+1]+。
步骤3. 3-(6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(JRW-2020)
Figure BDA0004206448020000752
向3-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(105mg，0.39mmol)在冰浴冷却的四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加氢化钠(23mg，0.58mmol，60％)、1-(氯甲基)-1H-咪唑(68mg，0.58mmol)和四丁基碘化铵(14mg，0.039mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在60℃下搅拌3小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到无色油状的期望产物。ESI MS m/z 365[M+1]+。
步骤4. 3-(6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(JRW-2027)
Figure BDA0004206448020000761
向3-(6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(0.39mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌4小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。将滤液浓缩并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(90mg，两步63％)，为无色油状物。ESI MS m/z 369[M+1]+。
步骤5. 3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(JRW-2031)
Figure BDA0004206448020000762
向3-(6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(90mg，0.25mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(75mg，0.25mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(200mg)。将悬浮液在100℃下加热6小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(29mg，0.77mmol)。将还原加热至室温并搅拌1小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(85mg，52％)，为棕色固体。ESI MS m/z 645[M+1]+。
步骤6. 3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(JRW-2034)
Figure BDA0004206448020000771
向3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸叔丁酯(85mg，0.13mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，得到棕色油状粗产物。ESI MS m/z 589[M+1]+。
步骤7.(2-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2035)
Figure BDA0004206448020000772
向3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(0.13mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)四氟硼酸脲(45mg，0.16mmol)、二异丙基乙胺(51mg，0.39mmol)和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(42mg，0.26mmol)。将反应在室温下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(20mg，两步21％)，为浅棕色固体。ESI MS m/z 731[M+1]+。
步骤8.N-(2-氨基乙基)-3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙烯酰胺(JRW-2036)
Figure BDA0004206448020000781
向(2-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙烯酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(20mg，0.027mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，得到棕色油状粗产物。ESI MS m/z 631[M+1]+。
步骤9. 1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酰胺基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2038)
Figure BDA0004206448020000782
向N-(2-氨基乙基)-3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙烯酰胺(0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(9mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(10mg，64％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1189[M+1]+。
4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)丁酰胺(JRW-2093)
Figure BDA0004206448020000791
步骤1. 3-溴-6-氰基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(JRW-2072)
Figure BDA0004206448020000792
向3-溴-1H-吲哚-6-甲腈(1.0g，4.5mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中添加脱碳酸二叔丁酯(1.2g，5.4mmol)、二异丙基乙胺(1.8g，13.6mmol)和N，N-二甲基吡啶-4-胺(0.055g，0.45mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。混合物用二氯甲烷稀释，倒入含HCl的水中，分层。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(1.3g，89％)，为白色固体。ESI MS m/z 322[M+1]+。
步骤2. 3-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙-1-炔-1-基)-6-氰基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(JRW-2074)
Figure BDA0004206448020000801
向3-溴-6-氰基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(1.3g，4.0mmol)在四氢呋喃(30mL)中的溶液中添加丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(1.6g，10.2mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(0.28g，0.40mmol)、碘化亚铜(0.077g，0.40mmol)和三苯基膦(0.42g，1.6mmol)。使溶液脱气并用氮气吹扫。添加二乙胺(4.4g，60.7mmol)，并将反应在60℃下搅拌5小时。反应用乙酸乙酯稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.80g，50％)，为浅棕色泡沫状物。ESI MS m/z 396[M+1]+。
步骤3.(3-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2076)
Figure BDA0004206448020000802
向3-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙-1-炔-1-基)-6-氰基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(300mg，0.76mmol)在甲醇/四氢呋喃(1∶1，20mL)中的溶液中添加碳酸铯(494mg，1.5mol)。将反应在室温下搅拌30分钟。蒸发溶剂得到黄色固体状粗产物。ESI MS m/z 296[M+1]+。
步骤4.(3-(6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2077)
Figure BDA0004206448020000811
向(3-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(0.76mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(45mg，1.1mmol，60％)、1-(氯甲基)-1H-咪唑(148mg，1.1mmol)和四丁基碘化铵(28mg，0.076mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌6小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(130mg，44％)，为橙色油状物。ESI MS m/z390[M+1]+。
步骤5.(3-(6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2080)
Figure BDA0004206448020000812
向(3-(6-氰基-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(130mg，0.33mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到所期望的产物(120mg，粗产物)，为浅棕色固体。ESI MS m/z 394[M+1]+。
步骤6.(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2083)
Figure BDA0004206448020000821
向(3-(6-(氨基甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(120mg，0.30mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(75mg，0.25mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(200mg)。将悬浮液在100℃下加热18小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(29mg，0.77mmol)。将还原加热至室温并搅拌2小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(40mg，23％)，为浅棕色固体。ESI MS m/z 674[M+1]+。
步骤7. 3-(2-((((3-(3-氨基丙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2090)
Figure BDA0004206448020000831
向(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(40mg，0.060mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，得到棕色油状粗产物。ESI MS m/z 574[M+1]+。
步骤8. 4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑_4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)丁酰胺(JRW-2093)
Figure BDA0004206448020000832
向3-(2-((((3-(3-氨基丙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.026mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(13mg，0.026mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(9mg，36％)，为紫色固体。ESI MS m/z 970[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(3-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)丙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2094)
Figure BDA0004206448020000841
向3-(2-((((3-(3-氨基丙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.026mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(9mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(13mg，0.10mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(5mg，35％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1132[M+1]+。
N-(2-(1-苄基-6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2095)
Figure BDA0004206448020000851
步骤1.(2-(1-苄基-6-氰基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2079)
Figure BDA0004206448020000852
向(2-(6-氰基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(550mg，1.9mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(154mg，3.8mmol，60％)、苄基氯(366mg，2.9mmol)和四丁基碘化铵(71mg，0.19mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌8小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(445mg，61％)，为浅棕色泡沫状物。ESI MS m/z 376[M+1]+。
步骤2.(2-(6-(氨基甲基)-1-苄基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2084)
Figure BDA0004206448020000853
向(2-(1-苄基-6-氰基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(445mg，1.2mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到所期望的产物(430mg，粗产物)，为黄色泡沫状物。ESI MS m/z 380[M+1]+。
步骤3.(2-(1-苄基-6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2085)
Figure BDA0004206448020000861
向(2-(6-(氨基甲基)-1-苄基-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(116mg，0.31mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(75mg，0.25mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(200mg)。将悬浮液在100℃下加热18小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(29mg，0.77mmol)。将还原加热至室温并搅拌2小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(78mg，46％)，为棕色玻璃状物。ESI MS m/z 656[M+1]+。
步骤4. 3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-苄基-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2091)
Figure BDA0004206448020000871
向(2-(1-苄基-6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(78mg，0.12mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，得到棕色固体状粗产物。ESI MS m/z 556[M+1]+。
步骤5.N-(2-(1-苄基-6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2095)
Figure BDA0004206448020000872
向3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-苄基-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(9mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(14mg，0.11mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(3mg，20％)，为紫色固体。ESI MS m/z1132[M+1]+。
N-(2-(1-苄基-6-(((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙烯酰胺(JRW-2096)
Figure BDA0004206448020000881
向3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-苄基-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(11mg，0.027mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(10mg，43％)，为紫色固体。ESI MS m/z 867[M+1]+。
N-(2-(1-苄基-6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-IH-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)丁酰胺(JRW-2097)
Figure BDA0004206448020000891
向3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-苄基-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(13mg，0.027mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(6mg，24％)，为紫色固体。ESI MS m/z 952[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2111)
Figure BDA0004206448020000892
步骤1.(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2105)
Figure BDA0004206448020000901
向1H-吲哚-6-甲腈(500mg，3.5mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(211mg，5.3mmol，60％)、(4-(氯甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(1.1g，4.2mmol)和四丁基碘化铵(130mg，0.35mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌1小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(1.2g，94％)，为白色固体。ESI MS m/z 362[M+1]+。
步骤2.(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2106)
Figure BDA0004206448020000902
向(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(500mg，1.4mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到黄色固体状粗产物。ESI MS m/z 366[M+1]+。
步骤3.(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2109)
Figure BDA0004206448020000911
向(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(275mg，0-75mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(110mg，0.37mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(200mg)。将悬浮液在100℃下加热18小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(43mg，1.1mmol)。将还原加热至室温并搅拌30分钟。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(45mg，18％)，为白色固体。ESI MS m/z 642[M+1]+。
步骤4. 3-(2-((((1-(4-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2110)
Figure BDA0004206448020000912
向(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.074mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌30分钟。浓缩混合物，得到浅棕色固体状粗产物。ESI MS m/z 542[M+1]+。
步骤5. 1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2111)
Figure BDA0004206448020000921
向3-(2-((((1-(4-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(9mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(5mg，16％)，为紫色固体。ESI MS m/z1100[M+1]+。
4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)丁酰胺(JRW-2113)
Figure BDA0004206448020000922
向3-(2-((((1-(4-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(7mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(8mg，30％)，为紫色固体。ESI MS m/z 938[M+1]+。
3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)丙烯酰胺(JRW-2114)
Figure BDA0004206448020000931
向3-(2-((((1-(4-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(6mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(6mg，26％)，为紫色固体。ESI MS m/z 853[M+1]+。
(S-1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2143)
Figure BDA0004206448020000941
步骤1.(S)-3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2141)
Figure BDA0004206448020000942
向(S)-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(14mg，0.021mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌4小时。浓缩混合物，得到浅棕色油状粗产物。ESI MS m/z 560[M+1]+。
步骤2.(S)-1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2143)
Figure BDA0004206448020000951
向(S)-3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(10mg，0.017mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(12mg，0.017mmol)和二异丙基乙胺(18mg，0.14mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(11mg，55％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1118[M+1]+。
(R)-1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-眯唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2144)
Figure BDA0004206448020000952
步骤1.(R)-3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2142)
Figure BDA0004206448020000961
向(R)-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(10mg，0.015mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌4小时。浓缩混合物，得到浅棕色油状粗产物。ESI MS m/z 560[M+1]+。
步骤2.(R)-1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(2-(6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2144)
Figure BDA0004206448020000962
向(R)-3-(2-((((3-(2-氨基乙基)-1-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(10mg，0.017mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(12mg，0.017mmol)和二异丙基乙胺(18mg，0.14mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(10mg，50％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1118[M+1]+。
3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(3-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)丙烯酰胺(JRW-2191)
Figure BDA0004206448020000971
步骤1.(3-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2181)
Figure BDA0004206448020000972
向1H-吲哚-6-甲腈(450mg，3.2mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(190mg，4.8mmol，60％)、(4-(氯甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(0.81g，3.2mmol)和四丁基碘化铵(117mg，0.32mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌2小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.90g，78％)，为油状物。ESI MS m/z 362[M+1]+。
步骤2.(3-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2182)
Figure BDA0004206448020000981
向(3-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(0.90g，2.5mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中添加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。将滤液浓缩并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.59g，64％)，为泡沫状物。ESI MS m/z 366[M+1]+。
步骤3.(3-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2186)
Figure BDA0004206448020000982
向(3-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(150mg，0.41mmol)和3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(120mg，0.41mmol)在甲苯的悬浮液(10mL)中添加硫酸镁(200mg)。将悬浮液在100℃下加热18小时。使反应冷却、浓缩并重悬于甲醇(10mL)中。将混合物冷却至0℃，并添加硼氢化钠(46mg，1.2mmol)。将还原加热至室温并搅拌30分钟。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(27mg，10％)，为白色固体。ESI MS m/z 642[M+1]+。
步骤4. 3-(2-((((1-(3-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2190)
Figure BDA0004206448020000991
向(3-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(27mg，0.042mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌30分钟。浓缩混合物，得到浅棕色固体状粗产物。ESI MS m/z 542[M+1]+。
步骤5. 3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(3-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)丙烯酰胺(JRW-2191)
Figure BDA0004206448020000992
向3-(2-((((1-(3-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(11mg，0.027mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(5mg，21％)，为紫色固体。ESI MS m/z 853[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(3-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)苄基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2192)
Figure BDA0004206448020001001
向3-(2-((((1-(3-(氨基甲基)苄基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(如上文所述制备)(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(9mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(6mg，20％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1100[M+1]+。
3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-眯唑-1-基)丙基)丙烯酰胺(JRW-2218)
Figure BDA0004206448020001002
步骤1. 1-((1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-甲腈(JRW-2189)
Figure BDA0004206448020001011
向1H-吲哚-6-甲腈(600mg，4.2mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(253mg，6.3mmol，60％)、4-(氯甲基)-1H-咪唑-1-甲酸叔丁酯(0.91g，4.2mmol)和四丁基碘化铵(155mg，0.42mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌18小时。反应用水稀释，用氢氧化钠将pH调节至12，并且用氯仿/异丙醇(3∶1)萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(130mg，9％)，为浅黄色固体。ESI MS m/z 223[M+1]+。
步骤2.(3-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2211)
Figure BDA0004206448020001012
向1-((1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-甲腈(110mg，0.49mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(30mg，0.74mmol，60％)和(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯(177mg，0.74mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌2小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(112mg，59％)，为橙色油状物。ESI MS m/z 380[M+1]+。
步骤3.(3-(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2213)
Figure BDA0004206448020001021
向(3-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(100mg，0.26mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到半固体状粗产物(110mg)。ESI MS m/z 384[M+1]+。
步骤4.(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2214)
Figure BDA0004206448020001022
向(3-(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(98mg，0.26mmol)在THF的悬浮液(10mL)中添加3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(75mg，0.26mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(272mg，1.3mmol)并在室温下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(125mg，73％)，为橙色油状物。ESI MS m/z 660[M+1]+。
步骤5. 3-(2-((((1-((1-(3-氨基丙基)-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2216)
Figure BDA0004206448020001031
向(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(125mg，0.19mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌6小时。浓缩混合物，得到棕色固体状粗产物。ESI MS m/z 560[M+1]+。
步骤6. 3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-N-(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)丙基)丙烯酰胺(JRW-2218)
Figure BDA0004206448020001032
向3-(2-((((1-((1-(3-氨基丙基)-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(如上文所述制备)(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(11mg，0.027mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(24mg，定量)，为紫色固体。ESI MS m/z 871[M+1]+。
4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基-N-(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-眯唑-1-基)丙基)丁酰胺(JRW-2219)
Figure BDA0004206448020001041
向3-(2-((((1-((1-(3-氨基丙基)-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(如上文所述制备)(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加4-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙烯酰胺基)丁酸2，5-一氧代吡咯烷-1-酯(13mg，0.027mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(12mg，48％)，为紫色固体。ESI MS m/z 956[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基-N-(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-眯唑-1-基)丙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2220)
Figure BDA0004206448020001042
向3-(2-((((1-((1-(3-氨基丙基)-1H-咪唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(如上文所述制备)(15mg，0.027mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-3-氧代-7，10，13，16-四氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(9mg，0.013mmol)和二异丙基乙胺(28mg，0.22mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(19mg，63％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1118[M+1]+。
N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-5-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-眯唑-1-基)戊酰胺(JRW-2310)
Figure BDA0004206448020001051
步骤1. 5-(2-(羟甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(JRW-2271)
Figure BDA0004206448020001052
向5-(2-甲酰基-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(0.92g，4.4mmol)在冰浴冷却的甲醇/四氢呋喃(1∶1，50mL)中的溶液中添加硼氢化钠(200mg，5.3mmol)，并且将混合物搅拌30分钟。将反应用HCl(3mL，2M)淬灭，然后将pH调节至8。将混合物用硅藻土浓缩并通过硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.53g，57％)，为无色油状物。ESI MS m/z 213[M+1]+。
步骤2. 5-(2-(氯甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(JRW-2279)
Figure BDA0004206448020001061
向5-(2-(羟甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(0.53g，2.5mmol)在氯仿中的溶液中添加氯化亚砜(3.0g，25mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时并加热至75℃并保持1小时。浓缩反应，并将残余物悬浮于醚中。过滤得到白色固体状粗产物(0.64g)。ESI MS m/z 231[M+1]+。
步骤3. 5-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(JRW-2281)
Figure BDA0004206448020001062
向1H-吲哚-6-甲腈(200mg，1.4mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(84mg，2.1mmol，60％)、5-(2-(氯甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(0.38g，1.4mmol)和四丁基碘化铵(52mg，0.14mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌2小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(370mg，78％)，为橙色油状物。ESI MS m/z 337[M+1]+。
步骤4. 5-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸(JRW-2284)
Figure BDA0004206448020001063
向5-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(0.37g，1.1mmol)在二噁烷(10mL)中的溶液中添加氢氧化锂(0.13g，5.5mmol)和水(1mL)。将反应加热至40℃并保持2小时。用水稀释混合物，用HCl将pH调节至3，并用CHCl3/IPA 3∶1萃取。浓缩有机层，得到白色固体状粗产物(0.30g)。ESI MS m/z 323[M+1]+。
步骤5.(17-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2286)
Figure BDA0004206448020001071
向5-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸(0.30g，0.93mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.33g，1.1mmol)、羟基苯并三唑(0.28g，1.9mmol)、1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.36g，1.9mmol)和二异丙胺(0.36g，2.8mmol)。将反应加热至60℃并保持1小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(525mg，94％)，为浅棕色的。ESI MS m/z 597[M+1]+。
步骤6.(17-(2-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2296)
Figure BDA0004206448020001072
向(17-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.52g，0.88mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到半固体状粗产物(0.49g)。ESI MS m/z601[M+1]+。
步骤7.(17-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2300)
Figure BDA0004206448020001081
向(17-(2-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.45g，0.75mmol)在THF的悬浮液(10mL)中添加3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(0.22g，0.75mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.48g，2.3mmol)并在室温下搅拌3小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.53g，80％)，为棕色泡沫状物。ESI MS m/z 878[M+1]+。
步骤8.N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(JRW-2309)
Figure BDA0004206448020001082
向(17-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.030g，0.034mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌1.5小时。浓缩混合物，得到无色油状粗产物。ESI MS m/z 777[M+1]+。
步骤9.N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-5-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(JRW-2310)
Figure BDA0004206448020001091
向N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(26mg，0.033mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5λ4，6λ4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(14mg，0.033mmol)和二异丙基乙胺(34mg，0.27mmol、)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(38mg，定量)，为紫色固体。ESI MS m/z 1088[M+1]+。
N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-5-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-眯唑-1-基)戊酰胺(JRW-2308)
Figure BDA0004206448020001101
步骤1. 5-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(JRW-2241)
Figure BDA0004206448020001102
向1H-吲哚-6-甲腈(150mg，1.1mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(63mg，1.6mmol，60％)、5-(4-(氯甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯盐酸盐(282mg，1.1mmol)和四丁基碘化铵(39mg，0.11mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌2小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(330mg，93％)。ESI MS m/z 337[M+1]+。
步骤2. 5-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸(JRW-2243)
Figure BDA0004206448020001103
向5-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸甲酯(0.33g，0.98mmol)在二噁烷(10mL)中的溶液中添加氢氧化锂(0.12g，4.9mmol)和水(1mL)。将反应加热至40℃并保持18小时。混合物用水稀释，用HCl将pH调节至3，并用CHCl3/IPA 3∶1萃取。浓缩有机层，得到粗产物(0.36g)，为无色油状物。ESI MS m/z 323[M+1]+。
步骤3.(17-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2245)
Figure BDA0004206448020001111
向5-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酸(0.30g，0.93mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.27g，0.93mmol)、羟基苯并三唑(0.28g，1.9mmol)、1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.36g，1.9mmol)和二异丙胺(0.36g，2.8mmol)。将反应加热至60℃并保持2小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.30g，54％)，为浅黄色油状物。ESI MS m/z 597[M+1]+。
步骤4.(17-(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2248)
Figure BDA0004206448020001112
向(17-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.30g，0.50mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到无色半固体状粗产物(0.31g)。ESI MSm/z 601[M+1]+。
步骤5.(17-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2252)
Figure BDA0004206448020001121
向(17-(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.31g，0.50mmol)在THF的悬浮液(10mL)中添加3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(0.16g，0.55mmol)。将反应在室温下搅拌3小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.58g，2.7mmol)并在室温下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.33g，68％)，为棕色泡沫状物。ESI MS m/z 878[M+1]+。
步骤6.N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基))-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(JRW-2305)
Figure BDA0004206448020001122
向(17-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.030g，0.034mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌1.5小时。浓缩混合物，得到无色油状粗产物。ESI MS m/z 777[M+1]+。
步骤7.N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-514，614-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-5-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(JRW-2308)
Figure BDA0004206448020001131
向N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(26mg，0.033mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(14mg，0.033mmol)和二异丙基乙胺(34mg，0.27mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(40mg，定量)，为紫色固体。ESI MS m/z 1088[M+1]+。
1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2316)
Figure BDA0004206448020001141
步骤1.(3-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2293)
Figure BDA0004206448020001142
向1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲哚-6-甲腈(0.18g，0.97mmol)在叔丁醇(10mL)、(3-叠氮丙基)氨基甲酸叔丁酯(0.19g，0.97mmol)的悬浮液中添加硫酸铜(31mg，0.19mmol)和抗坏血酸钠(38mg，0.19mmol)。添加水(5mL)，并将混合物在室温下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.28g，74％)，为棕色胶状物。ESI MS m/z 381[M+1]+。
步骤2.(3-(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2304)
Figure BDA0004206448020001143
向(3-(4-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(0.28g，0.72mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到无色半固体状粗产物(0.30g)。ESI MS m/z 385[M+1]+。
步骤3.(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2307)
Figure BDA0004206448020001151
向(3-(4-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(0.27g，0.69mmol)在THF的悬浮液(10mL)中添加3-(6-羟基一3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(0.20g，0.68mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.58g，2.7mmol)并在室温下搅拌2小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.29g，64％)，为棕色泡沫状物。ESI MS m/z 660[M+1]+。
步骤4. 3-(2-((((1-((1-(3-氨基丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(JRW-2314)
Figure BDA0004206448020001152
向(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(0.030g，0.045mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，得到无色油状粗产物。ESI MS m/z 561[M+1]+。
步骤5. 1-(3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酰胺基)-N-(3-(4-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(JRW-2316)
Figure BDA0004206448020001161
向3-(2-((((1-((1-(3-氨基丙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-5-羟基异吲哚啉-1-酮(22mg，0.039mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(13mg，0.019mmol)和二异丙基乙胺(40mg，0.31mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(12mg，66％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1119[M+1]+。
N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酰胺(JRW-2317)
Figure BDA0004206448020001162
步骤1. 2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酸甲酯(JRW-2294)
Figure BDA0004206448020001171
向1H-吲哚-6-甲腈(0.55g，3.9mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(0.23g，5.8mmol，60％)、2-(氯甲基)异烟酸甲酯盐酸盐(0.86g，3.9mmol)和四丁基碘化铵(142mg，0.39mmol)。将混合物在0℃下搅拌1小时并且在室温下搅拌3小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.55g，48％)，为白色固体。ESI MS m/z 292[M+1]+。
步骤2. 2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酸(JRW-2295)
Figure BDA0004206448020001172
向2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酸甲酯(0.55g，1.9mmol)在二噁烷(20mL)中的溶液中添加氢氧化锂(0.09g，3.8mmol)和水(1mL)。将反应加热至40℃并保持4小时。混合物用水稀释，用HCl将pH调节至3，并用CHCl3/IPA 3∶1萃取。浓缩有机层，得到白色固体状粗产物(0.49g)。ESI MS m/z 278[M+1]+。
步骤3.(1-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶-4-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2298)
Figure BDA0004206448020001181
向2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酸(0.49g，1.8mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.62g，2.1mmol)、羟基苯并三唑(0.54g，3.5mmol)、1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.68g，3.5mmol)和二异丙胺(0.68g，5.3mmol)。将反应加热至60℃并保持1小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.89g，91％)，为白色泡沫状物。ESI MS m/z 552[M+1]+。
步骤4.(1-(2-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶-4-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2306)
Figure BDA0004206448020001182
向(1-(2-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶-4-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(0.89g，1.6mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到粗产物(0.85g)，为无色油状物。ESI MS m/z 556[M+1]+。
步骤5.(1-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶-4-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2311)
Figure BDA0004206448020001191
(1-(2-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶-4-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(0.71g，1.3mmol)在THF的悬浮液(10mL)中添加3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(0.25g，0.86mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.54g，2.6mmol)并在室温下搅拌18小时。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.38g，53％)，为棕色泡沫状物。ESI MS m/z 832[M+1]+。
步骤6.N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酰胺(JRW-2315)
Figure BDA0004206448020001192
向(1-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶-4-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(0.030g，0.036mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，得到橙色油状粗产物。ESI MS m/z 732[M+1]+。
步骤7.N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-514，614-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酰胺(JRW-2317)
Figure BDA0004206448020001201
向N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)异烟酰胺(25mg，0.034mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(14mg，0.034mmol)和二异丙基乙胺(35mg，0.27mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(37mg，定量)，为紫色固体。ESIMS m/z 1043[M+1]+。
N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-5-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺(JRW-2313)
Figure BDA0004206448020001202
步骤1. 5-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酸甲酯(JRW-2283)
Figure BDA0004206448020001211
向1H-吲哚-6-甲腈(0.70g，4.9mmol)在冰浴冷却的DMF(20mL)中的溶液中添加氢化钠(0.29g，7.4mmol，60％)、5-(氯甲基)噻吩-2-甲酸甲酯(0.94g，4.9mmol)和四丁基碘化铵(0.18g，0.49mmol)。将混合物在0℃下搅拌1小时并且在室温下搅拌1小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.36g，26％)。ESI MS m/z 297[M+1]+。
步骤2. 5-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酸(JRW-2285)
Figure BDA0004206448020001212
向5-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酸酯(0.36g，1.2mmol)在二噁烷(20mL)中的溶液中添加氢氧化锂(0.14g，6.1mmol)和水(1mL)。将反应加热至40℃并保持1.5小时。混合物用水稀释，用HCl将pH调节至3，并用CHCl3/IPA 3∶1萃取。浓缩有机层，得到浅色固体状粗产物(0.37g)。ESI MS m/z 283[M+1]+。
步骤3.(1-(5-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2287)
Figure BDA0004206448020001213
向5-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酸(0.34g，1.2mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.42g，1.4mmol)、羟基苯并三唑(0.37g，2.4mmol)、1-乙基-3-(3′-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.46g，2.4mmol)和二异丙胺(0.47g，3.6mmol)。将反应加热至60℃并保持1小时。反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.46g，73％)，为浅黄色胶状物。ESI MS m/z 557[M+1]+。
步骤4.(1-(5-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2301)
Figure BDA0004206448020001221
向(1-(5-((6-氰基-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13一基)氨基甲酸叔丁酯(0.46g，0.82mmol)在溶于甲醇的氨(7N，20mL)中的溶液中加一勺悬浮于水中的雷尼镍。向反应中装填氢(60psi)并在室温下搅拌18小时。在用氮气脱气后，将混合物用硅藻土过滤。浓缩滤液，得到粗产物(0.53g)，为浅绿色泡沫状物。ESIMS m/z 561[M+1]+。
步骤5.(1-(5-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(JRW-2303)
Figure BDA0004206448020001222
向(1-(5-((6-(氨基甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(0.42g，0.75mmol)在THF的悬浮液(10mL)中添加3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-甲醛(0.22g，0.75mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.48g，2.2mmol)并在室温下搅拌3天。反应用甲醇稀释，添加硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法纯化，得到所期望的产物(0.28g，44％)，为棕色泡沫状物。ESI MS m/z 838[M+1]+。
步骤6.N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺(JRW-2312)
Figure BDA0004206448020001231
向(1-(5-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-基)-1-氧代-5，8，11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(0.030g，0.036mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将反应在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，得到橙色油状粗产物。ESI MS m/z 737[M+1]+。
步骤7.N-(15-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-5l4，6l4-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)-13-氧代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)-5-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺(JRW-2313)
Figure BDA0004206448020001232
向N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺(25mg，0.034mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加3-(5，5-二氟-7-(1H-吡咯-2-基)-5H-514，614-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(14mg，0.034mmol)和二异丙基乙胺(35mg，0.27mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(25mg，71％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1048[M+1]+。
(6-(2-((22-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-眯唑-1-基)-4，18-二氧代-8，11，14-三氧杂-5，17-二氮杂二十二烷基)(甲基)氨甲酰基)苯基)-2，2，10，10-四甲基-1，11-双(3-氨磺酰丙基)-1，2，10，11-四氢-13λ3-吡喃并[3，2-g：5，6-g′]二喹啉-4，8-二基)二甲磺酸(JRW-2395)
Figure BDA0004206448020001241
向N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(2-((6-((((3-(6-羟基-3-氧代异吲哚啉-1-基)-1H-吲哚-2-基)甲基)氨基)甲基)-1H-吲哚-1-基)甲基)-1H-咪唑-1-基)戊酰胺(15mg，0.019mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加(6-(2-((4-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-4-氧代丁基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)-2，2，10，10-四甲基-1，11-双(3-氨磺酰丙基)-8-(磺甲基)-1，2，10，11-四氢-13λ3-吡喃并[3，2-g：5，6-g′]二喹啉-4-基)甲磺酸钠(10mg，0.009mmol)和二异丙基乙胺(20mg，0.15mmol)。将反应在室温下搅拌30分钟。混合物用甲醇稀释并通过反相制备型HPLC纯化，得到所期望的产物(7mg，43％)，为紫色固体。ESI MS m/z 1751[M+1]+。
实施例2
测量细胞中的KRAS靶标接合
发光由KRAS的NanoLuc(Nluc)标记作为BRET供体产生，或通过KRAS的NanoBiT标记产生，其中BRET供体信号来源于细胞中的KRAS多聚体种类。在96孔板中，每孔20,000个HEK293细胞用从pFN31K和pFN32K质粒表达的KRAS-Nluc融合体或KRAS-NanoBiT融合体转染。使用3：1的FuGENE HD：质粒比率进行转染。在转染后24小时，用化合物JRW-2111或JRW-2025和不同浓度的测试化合物来处理细胞。测试化合物包括BI-2852(开关I/II位点抑制剂)、AMG-510(共价修饰KRASG12C的Cys-12残基的开关II位点抑制剂)和ARS-1620(共价修饰KRASG12C的Cys-12残基的开关II位点抑制剂)。在温育后，将NanoBRET-TE底物溶液添加至终浓度为1X，并在Glomax Discover读板器上测量BRET。
数据显示于图2-4中。具体而言，图2显示来自表达作为与LgBiT和SmBiT的融合体的KRAS或其突变体(KRASG12C、KRASG12D或KRASG12V)的细胞中的NanoBiT测定法的数据。使用作为KRAS结合剂的化合物JRW-2111，以及作为候选KRAS结合化合物的化合物BI-2852，观察到野生型KRAS和全部三个突变体的靶标接合。
图3显示来自表达作为与LgBiT和SmBiT的融合体的KRAS或其突变体(KRASG12C、KRASG12D或KRASG12V)的细胞中的NanoBiT测定法的数据。使用化合物JRW-2111(作为KRAS结合剂)和化合物AMG-510，仅观察到KRASG12C变体的靶标接合。
图4显示来自表达作为与NanoLuc的融合体的KRAS或其突变体(例如，KRASG12C、KRASG12D或KRASG12V)的细胞的数据。使用作为KRAS结合剂的化合物JRW-2025，观察到BI-2852针对野生型KRAS和三个KRAS变体的竞争，但是对于化合物AMG-510与ARS-1620仅观察到针对KRASG12C突变体的竞争。
总之，在致癌性变体KRASG12C处，可以观察到两种抑制剂机制的靶标接合，这两种机制均涉及BI-2852(开关I/II位点抑制剂)以及AMG-510和ARS1620(与残基12处的半胱氨酸共价反应的开关II位点抑制剂)。这表明，开关I/II结构域和开关II结构域的接合是相互排斥的。这些结果支持广泛有用的靶标接合测定法，以查询活细胞中KRAS的多种接合机制。
实施例3
使用具有SmBiT标签的酶互补-NanoBiT寡聚体构型来测量细胞中的KRAS(G12V)同源多聚体复合物处的靶标接合
据推测，KRAS可以作为多聚体复合物预先存在于细胞中，这表明，可以使用经由酶互补形成的BRET供体以KRAS的寡聚体形式查询靶标接合。为了研究这一概念，使用NanoBiTTM技术通过KRAS的NanoBiT标记来观察KRAS多聚体(例如，二聚体)复合物，其中BRET供体信号来源于寡聚体KRAS。在组织培养瓶中，每孔HEK293细胞用KRAS-NanoBiT融合体，即从pNB3K或pNB4K质粒表达的LgBiT-KRAS2B(G12V)和SmBiT-KRAS2B(G12V)以及pGEM-3Z载体DNA(1∶1∶8质量比)转染。使用3∶1的FuGENE HD∶质粒比率进行转染。在转染后24小时，用化合物JRW-2192和BI-2852来处理细胞。
在活细胞中温育后，将NanoBRET-TE底物溶液添加至终浓度为1X，并在GlomaxDiscover读板器上测量BRET。数据显示于图5中。具体而言，图5显示来自竞争测定法的数据。使用作为KRAS结合剂的示踪剂JRW-2192，示踪剂浓度的增加表明BRET信号呈剂量依赖性增加。BI-2852显示出通过功能竞争产生的对示踪剂诱导的BRET信号的剂量依赖性抑制。
实施例4
使用具有SmBiT标签的酶互补-NanoBiT寡聚体构型来测量细胞中的KRAS(G12C)同源多聚体复合物处的靶标接合
据推测，KRAS可以作为多聚体复合物预先存在于细胞中，这表明，可以使用经由酶互补形成的BRET供体以KRAS的寡聚体形式查询靶标接合。为了研究这一概念，使用NanoBiTTM技术通过KRAS的NanoBiT标记来观察KRAS多聚体(例如，二聚体)复合物，其中BRET供体信号来源于寡聚体KRAS。在组织培养瓶中，每孔HEK293细胞用KRAS-NanoBiT融合体，即从pNB3K或pNB4K质粒表达的LgBiT-KRAS2B(G12C)和SmBiT-KRAS2B(G12C)以及pGEM-3Z载体DNA(1∶1∶8质量比)转染。转染使用3∶1的FuGENE HD∶质粒比率进行。在转染后24小时，用化合物JRW-2220和BI-2852来处理细胞。
在活细胞中温育后，将NanoBRET-TE底物溶液添加至终浓度为1X，并在GlomaxDiscover读板器上测量BRET。数据显示于图6中。具体而言，图6显示来自竞争测定法的数据。使用作为KRAS结合剂的示踪剂JRW-2220，示踪剂浓度的增加表明BRET信号呈剂量依赖性增加。BI-2852显示出通过功能竞争产生的对示踪剂诱导的BRET信号的剂量依赖性抑制。
该测定法还在毛地黄皂苷透化的细胞中进行。透化导致整体发光下降，但是仍然允许测量靶标接合。数据显示于图7中。具体而言，图7显示来自竞争测定法的数据。使用作为KRAS结合剂的示踪剂JRW-2220，示踪剂浓度的增加表明BRET信号呈剂量依赖性增加。BI-2852显示出在透化的细胞中通过功能竞争产生的对示踪剂诱导的BRET信号的剂量依赖性抑制。
实施例5
使用具有HiBiT标签的酶互补-NanoBiT寡聚体构型来测量细胞中的KRAS(G12C)同源多聚体复合物
据推测，KRAS可以作为多聚体复合物预先存在于细胞中，这表明，可以使用经由酶互补形成的BRET供体以KRAS的寡聚体形式查询靶标接合。为了研究这一概念，使用NanoBiTTM技术通过KRAS的NanoBiT标记来形成KRAS多聚体(例如，二聚体)复合物，其中BRET供体信号来源于寡聚体KRAS。在组织培养瓶中，每孔HEK293细胞用KRAS-NanoBiT融合体，即从pNB3K或pFN38A质粒表达的LgBiT-KRAS2B(G12C)和HiBiT-KRAS2B(G12C)以及pGEM-3Z载体DNA(1∶1∶8质量比)转染。转染使用3∶1的FuGENE HD∶质粒比率进行。在转染后24小时，用化合物JRW-2220和BI-2852来处理细胞。
在活细胞中温育后，将NanoBRET-TE底物溶液添加至终浓度为1X，并在GlomaxDiscover读板器上测量BRET。数据显示于图8中。具体而言，图8显示来自竞争测定法的数据。使用作为KRAS结合剂的示踪剂JRW-2220，示踪剂浓度的增加表明BRET信号呈剂量依赖性增加。BI-2852显示出通过功能竞争产生的对示踪剂诱导的BRET信号的剂量依赖性抑制。
该测定法还在毛地黄皂苷透化的细胞中进行。即使在透化后，由于HiBiT标签的使用，供体信号水平仍然很明显，这有助于测量靶标接合。数据显示于图9中。具体而言，图9显示来自竞争测定法的数据。使用作为KRAS结合剂的示踪剂JRW-2220，示踪剂浓度的增加表明BRET信号呈剂量依赖性增加。BI-2852显示出在透化的细胞中通过功能竞争产生的对示踪剂诱导的BRET信号的剂量依赖性抑制。
实施例6
测量细胞中的KRAS2B、HRAS或NRAS靶标接合
据推测，很多RAS变体可以作为多聚体复合物预先存在于细胞中，这表明，可以使用经由酶互补形成的BRET供体以RAS的寡聚体形式查询靶标接合。为了研究这一概念，使用NanoBiTTM技术通过RAS的NanoBiT标记来形成RAS多聚体(例如，二聚体)复合物，其中BRET供体信号来源于寡聚体RAS。在组织培养瓶中，每孔HEK293细胞用RAS-NanoBiT融合体，即从pNB3K或pNB4K质粒表达的LgBiT-RAS和SmBiT-RAS以及pGEM-3Z载体DNA(1∶1∶8质量比)转染。转染使用3∶1的FuGENE HD∶质粒比率进行。在转染后24小时，用化合物JRW-2219、JRW-2220或JRW-2310以及BI-2852来处理细胞。
数据显示于图10-24中。数据表明，在对以下细胞进行的NanoBiT测定法中观察到靶标接合：表达KRAS2B或其突变体(KRAS2B(G12C)、KRAS2B(G12D)、KRAS2B(G12V)、KRAS2B(Q61R)、KRAS2B(Q61H)、KRAS2B(Q61L)、KRAS2B(G13D))，或者作为与LgBiT和SmBiT的融合体的HRAS1，使用作为RAS结合剂的化合物JRW-2219、JRW-2220或JRW-2310以及作为候选RAS结合化合物的化合物BI-2852。
对于NRAS，使用3∶1的Fugene HD脂质∶DNA比率，将LgBiT-NRAS和SmBiT-NRAS质粒以1∶1的质量比转染至HEK293细胞。在转染后24小时，收获细胞，以80,000个细胞/孔接种于Coming 3600板中，随后添加示踪剂JRW-2310以达到2μM的终浓度，并且添加连续稀释的RAS结合化合物BI-2852。BRET在与示踪剂和未标记的竞争剂一起温育2小时后进行测量。数据显示于图25中。
VI.序列
SEQ ID NO：1-KRAS4A(异型体a的核苷酸序列)
Figure BDA0004206448020001291
Figure BDA0004206448020001301
SEQ ID NO：2-KRAS4A(异型体a的蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001302
SEQ ID NO：3-KRAS4B(异型体b的核苷酸序列)
Figure BDA0004206448020001303
SEQ ID NO：4-KRAS4B(异型体b的蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001304
SEQ ID NO：5-KRAS4AG12C(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001311
SEQ ID NO：6-KRAS4AG12D(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001312
SEQ ID NO：7-KRAS4AG12V(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001313
SEQ ID NO：8-KRAS4BG12C(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001314
SEQ ID NO：9-KRAS4BG12D(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001321
SEQ ID NO：10-KRAS4BG12V(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001322
SEQ ID NO：11-HRAS1(异型体1的核苷酸序列)
Figure BDA0004206448020001323
SEQ ID NO：12-HRAS1(异型体1的蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001324
Figure BDA0004206448020001331
SEQ ID NO：13-HRAS2(异型体2的核苷酸序列)
Figure BDA0004206448020001332
SEQ ID NO：14-HRAS2(异型体2的蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001333
SEQ ID NO：15-HRAS1G12S(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001334
SEQ ID NO：16-HRAS1G12V(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001335
Figure BDA0004206448020001341
SEQ ID NO：17-HRAS2G12S(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001342
SEQ ID NO：18-HRAS2G12V(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001343
SEQ ID NO：19-NRAS(核苷酸序列)
Figure BDA0004206448020001344
SEQ ID NO：20-NRAS(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001345
Figure BDA0004206448020001351
SEQ ID NO：21-NRASG12D(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001352
SEQ ID NO：22-NRASQ61R(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001353
SEQ ID NO：23-NanoLuc(核苷酸序列)
Figure BDA0004206448020001354
SEQ ID NO：24-NanoLuc(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001361
SEQ ID NO：25-LgBiT(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001362
SEQ ID NO：26-SmBiT(蛋白质序列)
VTGYRLFEEIL
SEQ ID NO：27-LgTrip 3092
Figure BDA0004206448020001363
SEQ ID NO：28-LgTrip 3546
Figure BDA0004206448020001364
SEQ ID NO：29-LgTrip 2098
Figure BDA0004206448020001365
Figure BDA0004206448020001371
SEQ ID NO：30-SmTrip9
GSMLFRVTINS
SEQ ID NO：31-5x His标签
HHHHH
SEQ ID NO：32-6x His标签
HHHHHH
SEQ ID NO：33-C-myc标签
EQKLISEEDL
SEQ ID NO：34-FLAG标签
DYKDDDDK
SEQ ID NO：35-Strep标签
WSHPQFEK
SEQ ID NO：36-HA标签
YPYDVPDYA
SEQ ID NO：37-KRAS4AQ61R(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001372
Figure BDA0004206448020001381
SEQ ID NO：38-KRAS4AQ61H(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001382
SEQ ID NO：39-KRAS4AQ61L(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001383
SEQ ID NO：40-KRAS4AG13D(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001384
SEQ ID NO：41-KRAS4BQ61R(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001385
Figure BDA0004206448020001391
SEQ ID NO：42-KRAS4BQ61H(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001392
SEQ ID NO：43-KRAS4BQ61L(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001393
SEQ ID NO：44-KRAS4BG13D(蛋白质序列)
Figure BDA0004206448020001394
序列表
<110> 普洛麦格公司(Promega Corporation)
<120> 针对RAS蛋白的靶标接合测定法
<130> PRMG-38695.204 & PRMG-38695.601
<150> 63/160,120
<151> 2021-03-12
<150> 63/117,080
<151> 2020-11-23
<150> 63/071,694
<151> 2020-08-28
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 核苷酸
<400> 1
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60
atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120
aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180
caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240
gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300
aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360
ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420
tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480
agagagatcc gacaatacag attgaaaaaa atcagcaaag aagaaaagac tcctggctgt 540
gtgaaaatta aaaaatgcat tataatg 567
<210> 2
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 2
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 3
<211> 517
<212> DNA
<213> 核苷酸
<400> 3
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag caacaataga 60
ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga 120
cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg 180
ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag 240
agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa 300
atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta 360
tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta 420
tacattagtt cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa 480
gaaaaagaag tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 517
<210> 4
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 4
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 5
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 5
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 6
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 6
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 7
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 7
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
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Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 8
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 8
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 9
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 9
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 10
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 10
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 11
<211> 570
<212> DNA
<213> 核苷酸
<400> 11
atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccggcggtg tgggcaagag tgcgctgacc 60
atccagctga tccagaacca ttttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac 120
cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc 180
caggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt 240
gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc 300
aaacgggtga aggactcgga tgacgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg 360
gctgcacgca ctgtggaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc 420
tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg 480
cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc 540
tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga 570
<210> 12
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 12
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 13
<211> 513
<212> DNA
<213> 核苷酸
<400> 13
atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccggcggtg tgggcaagag tgcgctgacc 60
atccagctga tccagaacca ttttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac 120
cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc 180
caggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt 240
gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc 300
aaacgggtga aggactcgga tgacgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg 360
gctgcacgca ctgtggaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc 420
tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggcagccgct ctggctctag ctccagctcc 480
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<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 14
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
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130 135 140
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Gly Thr Leu Trp Asp Pro Pro Gly Pro Met
165 170
<210> 15
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 15
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 16
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 16
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
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50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185
<210> 17
<211> 170
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 17
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Ser Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Gly Thr Leu Trp Asp Pro Pro Gly Pro Met
165 170
<210> 18
<211> 170
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 18
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Ser Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Gly Thr Leu Trp Asp Pro Pro Gly Pro Met
165 170
<210> 19
<211> 570
<212> DNA
<213> 核苷酸
<400> 19
atgactgagt acaaactggt ggtggttgga gcaggtggtg ttgggaaaag cgcactgaca 60
atccagctaa tccagaacca ctttgtagat gaatatgatc ccaccataga ggattcttac 120
agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc tgtttgttgg acatactgga tacagctgga 180
caagaagagt acagtgccat gagagaccaa tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt 240
gtatttgcca tcaataatag caagtcattt gcggatatta acctctacag ggagcagatt 300
aagcgagtaa aagactcgga tgatgtacct atggtgctag tgggaaacaa gtgtgatttg 360
ccaacaagga cagttgatac aaaacaagcc cacgaactgg ccaagagtta cgggattcca 420
ttcattgaaa cctcagccaa gaccagacag ggtgttgaag atgcttttta cacactggta 480
agagaaatac gccagtaccg aatgaaaaaa ctcaacagca gtgatgatgg gactcagggt 540
tgtatgggat tgccatgtgt ggtgatgtaa 570
<210> 20
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 20
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 21
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 21
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 22
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 22
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 23
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 23
atgaaacatc accatcacca tcatgcgatc gccatggtct tcacactcga agatttcgtt 60
ggggactggc gacagacagc cggctacaac ctggaccaag tccttgaaca gggaggtgtg 120
tccagtttgt ttcagaatct cggggtgtcc gtaactccga tccaaaggat tgtcctgagc 180
ggtgaaaatg ggctgaagat cgacatccat gtcatcatcc cgtatgaagg tctgagcggc 240
gaccaaatgg gccagatcga aaaaattttt aaggtggtgt accctgtgga tgatcatcac 300
tttaaggtga tcctgcacta tggcacactg gtaatcgacg gggttacgcc gaacatgatc 360
gactatttcg gacggccgta tgaaggcatc gccgtgttcg acggcaaaaa gatcactgta 420
acagggaccc tgtggaacgg caacaaaatt atcgacgagc gcctgatcaa ccccgacggc 480
tccctgctgt tccgagtaac catcaacgga gtgaccggct ggcggctgtg cgaacgcatt 540
ctggcggtt 549
<210> 24
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 24
Met Lys His His His His His His Ala Ile Ala Met Val Phe Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp
20 25 30
Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly
35 40 45
Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly
50 55 60
Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Gly
65 70 75 80
Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val
85 90 95
Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile
100 105 110
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115 120 125
Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu
130 135 140
Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly
145 150 155 160
Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu
165 170 175
Cys Glu Arg Ile Leu Ala Val
180
<210> 25
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 25
Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala
1 5 10 15
Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu
20 25 30
Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Arg
35 40 45
Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr
50 55 60
Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 26
Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 27
Met Val Phe Thr Leu Asp Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala
1 5 10 15
Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu
20 25 30
Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Met Arg Ile Val Arg
35 40 45
Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ile Thr Pro Asp
145
<210> 28
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 28
Met Lys His His His His His His Val Phe Thr Leu Asp Asp Phe Val
1 5 10 15
Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp
145 150 155
<210> 29
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 29
Met Lys His His His His His His Val Phe Thr Leu Asp Asp Phe Val
1 5 10 15
Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala
65 70 75 80
Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Thr Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn
130 135 140
Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp
145 150 155
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 30
Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 31
His His His His His
1 5
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 32
His His His His His His
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 33
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 34
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 35
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 36
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 37
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 37
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 38
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 38
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 39
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 39
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 40
<211> 189
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 40
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 41
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 41
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 42
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 42
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 43
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 43
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 44
<211> 188
<212> PRT
<213> 蛋白质
<400> 44
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185

Claims (144)

1.一种鉴定RAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含RAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含RAS结合部分和功能元件的RAS结合剂以及候选RAS结合化合物接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是鉴定KRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含KRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含KRAS结合部分和功能元件的KRAS结合剂以及候选KRAS结合化合物接触。
3.如权利要求2所述的方法，还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。
4.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述KRAS蛋白是KRAS变体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述KRAS变体是KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L或KRASG13D。
6.如权利要求2至权利要求5中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括表达所述样品中的所述KRAS蛋白。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是鉴定HRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含HRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含HRAS结合部分和功能元件的HRAS结合剂以及候选HRAS结合化合物接触。
8.如权利要求7所述的方法，还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。
9.如权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述HRAS蛋白是HRAS变体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述HRAS变体是HRASG12S或HRASG12V。
11.如权利要求7至权利要求10中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括表达所述样品中的所述HRAS蛋白。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是鉴定NRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含NRAS蛋白的样品；以及
(b)使所述样品与包含NRAS结合部分和功能元件的NRAS结合剂以及候选NRAS结合化合物接触。
13.如权利要求12所述的方法，还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述NRAS蛋白是NRAS变体。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述NRAS变体是NRASG12D或NRASQ61R。
16.如权利要求12至权利要求15中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括表达所述样品中的所述NRAS蛋白。
17.如权利要求1至权利要求16中任一项所述的方法，其中所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure FDA0004206448010000031
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
18.如权利要求17所述的方法，其中A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。
20.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。
21.如权利要求17至权利要求20中任一项所述的方法，其中接头具有下式：
Figure FDA0004206448010000032
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
22.如权利要求1至权利要求21中任一项所述的方法，其中所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)或能量转移来检测或定量。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述沉积颗粒是磁性颗粒。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述可检测元件是荧光团。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。
30.如权利要求1至权利要求29中任一项所述的方法，其中所述候选RAS结合化合物结合所述RAS蛋白。
31.如权利要求1至权利要求30中任一项所述的方法，其中所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。
32.如权利要求1至权利要求31中任一项所述的方法，其中所述RAS结合剂结合至RAS开关I/II位点。
33.如权利要求1至权利要求32中任一项所述的方法，其中所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或RAS开关II位点。
34.如权利要求1至权利要求33中任一项所述的方法，其中所述样品选自细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。
35.如权利要求1至权利要求34中任一项所述的方法，其中所述RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体提供。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述样品包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQ IDNO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQ IDNO：26具有至少90％的序列同一性。
39.如权利要求35至权利要求38中任一项所述的方法，其中所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
40.如权利要求35至权利要求38中任一项所述的方法，还包括使所述样品与所述生物发光报道蛋白的底物接触。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
42.一种系统，所述系统包括：
(a)靶标RAS蛋白；
(b)RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选RAS结合化合物。
43.如权利要求42所述的系统，包括：
(a)靶标KRAS蛋白；
(b)KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选KRAS结合化合物。
44.如权利要求43所述的系统，其中所述靶标KRAS蛋白在所述系统内表达。
45.如权利要求43或权利要求44所述的系统，其中所述靶标KRAS蛋白是KRAS变体。
46.如权利要求45所述的系统，其中所述KRAS变体选自KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L和KRASG13D。
47.如权利要求42所述的系统，包括：
(a)靶标HRAS蛋白；
(b)HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选HRAS结合化合物。
48.如权利要求41所述的系统，其中所述靶标HRAS蛋白在所述系统内表达。
49.如权利要求47或权利要求48所述的系统，其中所述靶标HRAS蛋白是HRAS变体。
50.如权利要求49所述的系统，其中所述HRAS变体是HRASG12S或HRASG12V。
51.如权利要求42所述的系统，包括：
(a)靶标NRAS蛋白；
(b)NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件；以及
(c)候选NRAS结合化合物。
52.如权利要求51所述的系统，其中所述靶标NRAS蛋白在所述系统内表达。
53.如权利要求51或权利要求52所述的系统，其中所述靶标NRAS蛋白是NRAS变体。
54.如权利要求53所述的系统，其中所述NRAS变体是NRASG12D或NRASQ61R。
55.如权利要求42至权利要求44中任一项所述的系统，其中所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure FDA0004206448010000081
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
56.如权利要求45所述的系统，其中A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。
57.如权利要求45或权利要求46所述的系统，其中R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。
58.如权利要求45或权利要求46所述的系统，其中R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。
59.如权利要求55至权利要求58中任一项所述的系统，其中接头具有下式：
Figure FDA0004206448010000082
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
60.如权利要求42至权利要求59中任一项所述的系统，其中所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。
61.如权利要求60所述的系统，其中所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。
62.如权利要求61所述的系统，其中所述可检测元件或由此产生的信号可通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)或能量转移来检测或定量。
63.如权利要求60所述的系统，其中所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。
64.如权利要求63所述的系统，其中所述沉积颗粒是磁性颗粒。
65.如权利要求61所述的系统，其中所述可检测元件是荧光团。
66.如权利要求60所述的系统，其中所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。
67.如权利要求66所述的系统，其中所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。
68.如权利要求42至权利要求67中任一项所述的系统，其中所述候选RAS结合化合物结合所述RAS蛋白。
69.如权利要求42至权利要求68中任一项所述的系统，其中所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。
70.如权利要求42至权利要求69中任一项所述的系统，其中所述RAS结合部分结合至RAS开关I/II位点。
71.如权利要求42至权利要求70中任一项所述的系统，其中所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或RAS开关II位点。
72.如权利要求42至权利要求71中任一项所述的系统，其中所述系统包括选自以下的样品：细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、和环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。
73.如权利要求42至权利要求72中任一项所述的系统，其中所述靶标RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。
74.如权利要求73所述的系统，其中所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。
75.如权利要求73所述的系统，其中所述靶标RAS蛋白包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。
76.如权利要求75所述的系统，其中所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQ IDNO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQ IDNO：26具有至少90％的序列同一性。
77.如权利要求73至权利要求76中任一项所述的系统，其中所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
78.如权利要求73至权利要求77中任一项所述的系统，还包括所述生物发光报道蛋白的底物。
79.如权利要求78所述的系统，其中所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
80.一种RAS结合剂，所述RAS结合剂包含：
(a)RAS结合部分；以及
(b)功能元件。
81.如权利要求80所述的RAS结合剂，其中所述RAS结合剂是KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含：
(a)KRAS结合部分；以及
(b)功能元件。
82.如权利要求80所述的RAS结合剂，其中所述RAS结合剂是HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含：
(a)HRAS结合部分；以及
(b)功能元件。
83.如权利要求80所述的RAS结合剂，其中所述RAS结合剂是NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含：
(a)NRAS结合部分；以及
(b)功能元件。
84.如权利要求80至权利要求73中任一项所述的RAS结合剂，还包含接头，所述接头将所述RAS结合部分与所述功能元件连接。
85.如权利要求80至权利要求84中任一项所述的RAS结合剂，其中所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure FDA0004206448010000111
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
86.如权利要求85所述的RAS结合剂，其中A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。
87.如权利要求85或权利要求86所述的RAS结合剂，其中R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。
88.如权利要求85或权利要求86所述的RAS结合剂，其中R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。
89.如权利要求85至权利要求88中任一项所述的RAS结合剂，其中接头具有下式：
Figure FDA0004206448010000121
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
90.如权利要求80至权利要求89中任一项所述的RAS结合剂，其中所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。
91.如权利要求90所述的RAS结合剂，其中所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。
92.如权利要求91所述的RAS结合剂，其中所述可检测元件是荧光团。
93.如权利要求90所述的RAS结合剂，其中所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)或能量转移来检测或定量。
94.如权利要求90所述的RAS结合剂，其中所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。
95.如权利要求94所述的RAS结合剂，其中所述沉积颗粒是磁性颗粒。
96.如权利要求90所述的RAS结合剂，其中所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。
97.如权利要求96所述的RAS结合剂，其中所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。
98.如权利要求80至权利要求97中任一项所述的RAS结合剂，其中所述RAS结合部分结合至RAS开关I/II位点。
99.一种组合物，所述组合物包含如权利要求80至权利要求98中任一项所述的RAS结合剂。
100.如权利要求99所述的组合物，还包含RAS蛋白。
101.如权利要求100所述的组合物，其中所述RAS蛋白选自KRAS蛋白、HRAS蛋白和NRAS蛋白。
102.如权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。
103.如权利要求102所述的组合物，其中所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。
104.如权利要求102所述的组合物，其中所述组合物包含第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。
105.如权利要求104所述的组合物，其中所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQID NO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQID NO：26具有至少90％的序列同一性。
106.如权利要求102至权利要求105中任一项所述的组合物，其中所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
107.如权利要求102至权利要求106中任一项所述的组合物，还包含所述生物发光报道蛋白的底物。
108.如权利要求107所述的组合物，其中所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
109.如权利要求99至权利要求108中任一项所述的组合物，还包含候选RAS结合化合物。
110.如权利要求109所述的组合物，其中所述候选RAS结合化合物是候选KRAS结合化合物、候选HRAS结合化合物或候选NRAS结合化合物。
111.如权利要求109或权利要求110所述的组合物，其中所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。
112.如权利要求109至权利要求111中任一项所述的组合物，其中所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或RAS开关II位点。
113.一种用于筛选RAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选RAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)RAS蛋白；和(ii)RAS结合剂，所述RAS结合剂包含RAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述方法是用于筛选KRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选KRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)KRAS蛋白；和(ii)KRAS结合剂，所述KRAS结合剂包含KRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述KRAS蛋白是KRAS变体。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述KRAS变体选自KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61R、KRASQ61H、KRASQ61L和KRASG13D。
117.如权利要求113所述的方法，其中所述方法是用于筛选HRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选NRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)HRAS蛋白；和(ii)HRAS结合剂，所述HRAS结合剂包含HRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述HRAS蛋白是HRAS变体。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述HRAS变体是HRASG12S或HRASG12V。
120.如权利要求113所述的方法，其中所述方法是用于筛选NRAS结合化合物的方法，所述方法包括：
(a)使样品与候选NRAS结合化合物接触，所述样品包括：(i)NRAS蛋白；和(ii)NRAS结合剂，所述NRAS结合剂包含NRAS结合部分和功能元件；以及
(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述NRAS蛋白是NRAS变体。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述NRAS变体是NRASG12D或NRASQ61R。
123.如权利要求113至权利要求122中任一项所述的方法，其中所述候选RAS结合化合物结合所述RAS蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的所述信号。
124.如权利要求113至权利要求123中任一项所述的方法，其中所述候选RAS结合化合物是RAS抑制剂。
125.如权利要求113至权利要求124中任一项所述的方法，其中所述候选RAS结合化合物结合至所述RAS开关I/II位点或RAS开关II位点。
126.如权利要求113至权利要求125中任一项所述的方法，其中所述RAS结合剂是式(I)的化合物：
Figure FDA0004206448010000171
或其盐，其中：
A是单环芳基或杂芳基；
R1、R2和R3中的一者是基团-接头-B，其中B是功能元件；并且
R1、R2和R3中的另外两者独立地选自氢和甲基。
127.如权利要求126所述的方法，其中A选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。
128.如权利要求126或权利要求127所述的方法，其中R1是基团-接头-B，并且R2和R3独立地选自氢和甲基。
129.如权利要求126或权利要求127所述的方法，其中R3是基团-接头-B，并且R1和R2独立地选自氢和甲基。
130.如权利要求126至权利要求129中任一项所述的方法，其中接头具有下式：
Figure FDA0004206448010000172
其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。
131.如权利要求113至权利要求130中任一项所述的方法，其中所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、MRI造影剂、SPECT造影剂和质量标签。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(MRI)或能量转移来检测或定量。
134.如权利要求132所述的方法，其中所述可检测元件是荧光团。
135.如权利要求131所述的方法，其中所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)标记来诱导蛋白质降解的部分。
137.如权利要求113至权利要求136中任一项所述的方法，其中所述RAS结合部分结合至所述RAS开关I/II位点。
138.如权利要求113至权利要求137中任一项所述的方法，其中所述RAS蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述生物发光报道蛋白是与SEQ ID NO：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。
140.如权利要求138所述的方法，其中所述样品包括第一RAS蛋白和第二RAS蛋白，所述第一RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二RAS蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与SEQID NO：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与SEQID NO：26具有至少90％的序列同一性。
142.如权利要求138至权利要求141中任一项所述的方法，其中所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。
143.如权利要求138至权利要求142中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含所述生物发光报道蛋白的底物。
144.如权利要求143所述的方法，其中所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。
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Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4812409A (en) 1986-01-31 1989-03-14 Eastman Kodak Company Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same
US4810636A (en) 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
US6162931A (en) 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
WO2004072232A2 (en) 2003-01-31 2004-08-26 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins
US7429472B2 (en) 2003-01-31 2008-09-30 Promega Corporation Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule
US7425436B2 (en) 2004-07-30 2008-09-16 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor
WO2008118445A1 (en) 2007-03-26 2008-10-02 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
GB0905840D0 (en) 2009-04-06 2009-05-20 Sagentia Ltd Apparatus and methods
PL3409764T3 (pl) 2009-05-01 2020-07-13 Promega Corporation Syntetyczne lucyferazy z krewetki oplορηorus emitującej bardziej intensywne światło
JP5677041B2 (ja) 2009-11-11 2015-02-25 株式会社ニデック 眼科装置
CA2817102C (en) 2010-11-02 2020-07-28 Promega Corporation Oplophorus-derived luciferases, novel coelenterazine substrates, and methods of use
GB201103631D0 (en) * 2011-03-03 2011-04-13 Univ Leeds Identification of candidate therapeutics
JP5751030B2 (ja) 2011-06-03 2015-07-22 ソニー株式会社 表示制御装置、表示制御方法、及びプログラム
JP6522339B2 (ja) 2011-11-21 2019-05-29 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ カルボキシｘローダミン類似体
JP2015530114A (ja) 2012-09-26 2015-10-15 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ リアルタイムモニタリング
KR102150479B1 (ko) 2012-12-12 2020-09-01 프로메가 코포레이션 세포내 생물발광 공명 에너지 전이를 이용하여 생물활성제에 의한 세포 표적 결합의 인식
US10067149B2 (en) * 2012-12-12 2018-09-04 Promega Corporation Recognition of cellular target binding by a bioactive agent using intracellular bioluminescence resonance energy transfer
BR112015023394B8 (pt) 2013-03-15 2023-09-26 Promega Corp Sistema e complexo bioluminescente
EP3364977A4 (en) * 2015-10-19 2019-09-04 Araxes Pharma LLC PROCESS FOR SCREENING INHIBITORS OF RAS
US9924073B2 (en) 2016-02-15 2018-03-20 Promega Corporation Substituted imidazo[1,2-a]pyrazines as luciferase substrates and preparation method thereof
JP7212612B2 (ja) 2016-07-28 2023-01-25 プロメガ コーポレイション セレンテラジン類縁体
WO2019173683A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Stc. Unm Discovery of novel molecules and repurposed drugs for ras family gtpases
WO2019241438A2 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Promega Corporation Multipartite luciferase

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