KR20080038183A - 생체분자용 표지색소 및 표지키트와 생체분자의 검출방법 - Google Patents

생체분자용 표지색소 및 표지키트와 생체분자의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 생체분자용 표지색소는, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가진다. 생체분자에 대한 높은 표지율과 고체 상태에서의 높은 형광강도를 얻을 수 있다.
생체분자, 표지색소, 표지키트

Description

생체분자용 표지색소 및 표지키트와 생체분자의 검출방법{LABELING DYE FOR DETECTING BIOMOLECULE, LABELING KIT, AND METHOD FOR DETECTING BIOMOLECULE}
본 발명은 형광색소로 이루어지고, 핵산, 단백질, 펩티드류, 그리고 당류 등의 생체분자의 검출에 사용하는 생체분자용 표지색소(labeling dye) 및 표지키트(labeling kit)와 생체분자의 검출방법에 관한 것이다.
근래, 인간게놈의 전모가 명확해지고, 유전자 치료, 유전자 진단 등을 목적으로 한 포스트게놈 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들어, DNA 해석은, DNA 마이크로어레이 기반 위에 고정된 프로브 DNA와, 형광색소 등으로 표지된 샘플 DNA를 혼성화(hybridization)시켜 이중사슬을 형성하여, 샘플 DNA를 검출하고 있다. 이는 형광색소로 표지한 핵산을 PCR 신장(伸長)시키고, 기반 상에서 혼성화한 후에 측정하는 방법이다. 최근, 보다 많은 아미노기를 가지는 프라이머(primer)를 사용한 방법, DNA에 아미노기를 도입하는 방법이 사용되고 있다.
표지에는 형광색소가 널리 사용되고 있으며, 높은 형광강도를 가지는 것, 건조상태(고체 상태)에서도 발광하는 것, 그리고 수용성을 가지는 것 등이 요구되고 있다. 형광색소로서는 예를 들어, Cy3이나 Cy5가 사용되고 있다(예를 들어, 사이언스 283, 1, January, 1999, 83~87).
하지만, 종래의 표지색소는 표지율이 낮다는 문제가 있다. 예를 들어, 1군데의 반응점을 가지는 DNA에 대하여 200배몰 정도의 형광색소를 이용하고 있는데, 이 조건하에서도 표지율은 50~60% 정도였다. 그 때문에, 표지색소를 대량 사용할 필요가 있어 검출비용이 올라가거나, 미반응 표지색소를 제거하기 위한 처리공정이 필요하게 되어 검출에 긴 시간이 필요하다는 문제가 있었다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자가 예의 노력한 결과, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소를 사용함으로써, DNA에 대한 표지율을 대폭 향상시킬 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명의 생체분자용 표지색소는, 형광측정에 의한 생체분자의 검출에 사용하는 표지색소로서, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 유기EL색소에는, 1종 이상의 헤테로 원자, 셀렌 원자 또는 보론 원자를 포함하는 5원환 화합물과 공액계를 가지는 6원환 화합물로 이루어지는 축합 다환 화합물을 사용할 수 있다.
또한, 상기 축합 다환 화합물에는, 하기 화학식 1의 (1), (2) 또는 (3) 중 어느 1종으로 나타내어지는 아졸 유도체를 사용할 수 있다.
Figure 112008014381492-PCT00001
여기서, 식 중 R1, R2, R3, R4는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기, 헤테로 원자를 환(環)내에 포함하는 방향족기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기 또는 헤테로 원자를 환내에 포함하는 방향족기를 나타내고, X는 치환기를 가지고 있어도 되는 질소 원자 또는 유황 원자 또는 산소 원자 또는 셀렌 원자, 보론 원자를 나타내며, R'는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기 혹은 방향족 탄화수소기, An-는 Cl-, Br-, I- 등의 할로겐화물 이온, CF3SO3 -, BF4 -, PF6 -를 나타낸다.
또한, 상기 R2와 R3에 티오펜 유도체, 푸란 유도체, 피롤 유도체, 이미다졸 유도체, 옥사졸 유도체, 티아졸 유도체, 피라졸 유도체 및 피리딘 유도체로 이루어지는 군에서 선택된 1종을 사용할 수 있다.
또한, 상기 R2와 R3에 술포닐기를 가지는 페닐기를 사용할 수 있다.
또한, 상기 축합 다환 화합물에 하기 화학식 2의 (4), (5), (6), (7) 또는 (8)로 나타내어지는 이미다졸 유도체를 사용할 수도 있다.
Figure 112008014381492-PCT00002
여기서, 식 중 R1, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방 향족 탄화수소기, 복소환기, 헤테로 원자를 환내에 포함하는 방향족기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기 또는 헤테로 원자를 환내에 포함하는 방향족기를 나타내고, R1, R2, R3, R4, R5는 같거나 서로 다른 것이어도 되며, R', R''는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기 혹은 방향족 탄화수소기, An-는 Cl-, Br-, I- 등의 할로겐화물 이온, CF3SO3 -, BF4 -, PF6 -를 나타낸다.
또한, 상기 R2와 R3에 티오펜 유도체, 푸란 유도체, 피롤 유도체, 이미다졸 유도체, 옥사졸 유도체, 티아졸 유도체, 피라졸 유도체 및 피리딘 유도체로 이루어지는 군에서 선택된 1종을 사용할 수 있다.
또한, 상기 R2와 R3에 술포닐기를 가지는 페닐기를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지색소는, 결합부에 카르복시산기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화 알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택된 어느 1종의 반응성기를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지색소는, 스페이서부에 -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -CH2NH-, -CH2NR-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-(R은 알킬기), -(CH2-CH2-O-)n-(n은 1~10의 정수), -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어 지는 군에서 선택되는 관능기를 적어도 1종 포함하는 것을 사용할 수 있다.
여기서, 상기 스페이서부에는 하기 식 (I)로 나타내는 것을 사용할 수 있다.
-(CHR')p-X-(CHR")q- …… (I)
식 중, X는 직접결합 또는 -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 관능기를 나타내고, R'과 R''는 각각 독립적으로 수소 원자, 혹은 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기, 혹은 방향족 탄화수소기로서, 필요에 따라 술포닐기, 히드록실기, 4급 아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종의 하전기(荷電基, charge group)에 의해 치환된 것을 나타내며, Ar은 아릴기를 나타내고, p와 q는 각각 독립적으로 0~20의 정수를 나타내며, p+q≥1이다.
또한, 스페이서부에 아미노산 또는 2~20개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커(peptide linker)를 사용할 수 있다.
또한, 스페이서부에 아미노산을 사용하고, 그 아미노산에 천연 아미노산 또는 합성 아미노산을 사용할 수 있다.
또한, 아미노산에 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산(sulfosulfanylpropanic acid), 2-아미노-3-술폭시프로판산(sulfoxypropanic acid), 티로신(tyrosine), 트레오닐(threonine), 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린 및 세린으로 이루어지는 군에서 선택된 1종을 사용할 수 있다.
또한, 스페이서부에 펩티드 링커를 사용하고, 그 펩티드 링커에 술포닐기, 히드록실기, 4급 아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 하전기를 가지는 것을 사용할 수도 있다.
또한, 펩티드 링커에 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산, 2-아미노-3-술폭시프로판산, 티로신, 트레오닐, 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린 및 세린으로 이루어지는 군에서 선택된 1종의 아미노산을 포함하는 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제1 생체분자용 표지키트는, 형광측정에 따른 생체분자의 검출에 사용하는 생체분자용 표지키트로서, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 제2 생체분자용 표지키트는, 형광측정에 따른 생체분자의 검출에 사용하는 생체분자용 표지키트로서, 적어도 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 이 발색부에 결합하고, -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -CH2NH-, -CH2NR-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-(R은 알킬기), -(CH2-CH2-O-)n-(n은 1~10의 정수), -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택되는 관능기를 적어도 1종 포함하는 스페이서를 포함하는 것을 특징으로 한다.
더구나, 제2 생체분자용 표지키트는, 카르복시산기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화 알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그 리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택된 어느 1종의 반응성기를 표지색소에 도입하기 위한 반응성기 도입시약을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제1 생체분자의 검출방법은, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소를, 생체분자시료와 반응시키고, 이 표지색소에 의해 표지된 생체분자시료의 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 생체분자시료에는, 핵산, 단백질, 펩티드류, 그리고 당류로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종을 사용할 수 있다. 한편, 단백질은 항체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 제2 생체분자의 검출방법은, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지된 프로브와, 생체분자시료를 반응시키고, 이 생체분자시료의 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 생체분자시료에는 핵산을 사용하고, 상기 프로브에는 이 핵산의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 PNA를 사용할 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드에 프라이머 또는 터미네이터를 사용하고, 상기 핵산을 증폭시켜 형광을 측정할 수 있다. 또한, 상기 핵산의 증폭에 앞서 프라이머를 유기EL색소로 표지할 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 PNA에 분자비콘(molecular beacon)을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제3 생체분자의 검출방법은, 생체분자로 이루어지는 피검체 또는 수식물질에 의해 수식된 이 피검체의 검출방법으로서, 피검체에 특이 결합하는 결합물질 또는 수식물질에 특이결합하는 결합물질 중 하나를, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지하고, 표지된 결합물질로부터의 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 피검체 또는 수식물질과 상기 결합물질의 조합에는, 항원-항체, 합텐(hapten)-항합텐 항체, 비오틴-아비딘, Tag-항 Tag항체, 렉틴-당단백질 또는 호르몬-수용체를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제4 생체분자의 검출방법은, 생체분자시료를 전기영동에 의해 크기 분리하는 공정을 포함하고, 이 전기영동에 앞서 혹은 이 전기영동 후에 생체분자시료를 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서를 가지는 표지색소로 표지하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 생체분자시료에 핵산을 사용하고, 전기영동화상에 근거하여 핵산의 염기서열을 결정할 수 있다. 또한, 상기 생체분자시료에 단백질을 사용하고, 전기영동화상에 근거하여 추출한 단백질을 질량분석할 수도 있다.
또한, 본 발명의 조직 또는 세포의 염색방법은, 조직 또는 세포시료 안의 생체분자를 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 생체분자에 핵산 또는 단백질을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 염색색소는, 조직 또는 세포시료의 염색에 사용하는 염색색 소로서, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 조직 또는 세포 안의 생체분자와 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 생체분자용 표지색소는, 발색부에 유기EL색소를 사용하고, 결합부와 발색부 사이에 스페이서부를 마련하도록 하였기 때문에, 대체로 100%에 가까운 표지율을 가지며, 고체 상태에서의 높은 형광강도를 부여하는 표지색소를 제공할 수 있다.
즉, 스페이서부를 설치함으로써, 발색부와 표지대상인 생체분자 사이의 입체장해가 억제되어, 결합부와 생체분자의 표지부위와의 결합이 용이해지고, 그 결과 높은 표지율을 얻을 수 있다고 생각된다. 이에 의해, 본 발명의 표지색소에 따르면, 스페이서부의 길이를 억제함으로써, 생체분자의 표지부위의 깊이에 영향을 받지 않고 높은 표지율을 얻을 수 있게 된다. 이에 의해 사용하는 표지색소의 양을 대폭 줄일 수 있어, 표적분자의 검출비용을 대폭 절감할 수 있게 된다.
더구나, 유기EL색소는 고체 상태(고체 및 반고체를 포함)에서 높은 양자수율을 가지고 있기 때문에, 마이크로 어레이 등의 기반 위 또는 비즈 위의 건조상태에서도 높은 형광강도를 부여한다. 또한, 유기EL색소는 Cy3이나 Cy5에 비하여 저가이기 때문에, 보다 적은 비용으로 생체분자를 검출할 수 있다. 또한, 유기EL색소의 치환기를 바꿈으로써 여기파장 및 발광파장을 바꿀 수 있기 때문에, 형광파장 선택의 자유도가 증가하여, 오렌지, 옐로우, 그린, 블루 등 많은 형광파장을 사용할 수 있다. 이에 의해, 스토크스 시프트(Stokes Shift)가 큰(여기파장과 형광파장의 차 가 큰) 2종 이상의 형광색소를 사용할 수 있게 되어, 하나의 시료안에 포함되는 여러 개의 표적핵산을 동시에 검출할 수도 있게 된다. 또한, Cy3이나 Cy5는 냉동보존해야 하는데 반해, 유기EL색소는 화학적으로 안정적이어서 상온에서의 장기간 보존에 견딜 수 있기 때문에, 취급이 용이하다.
도 1은 본 발명의 검출방법에 있어서, 프로브에 분자 비콘을 사용한 경우의 발광기구를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 검출방법에 있어서, IgG 항체의 Fab' 조각 조제방법의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 검출방법에 있어서, IgG 항체의 Fab' 조각으로의 유기EL색소의 도입방법의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 4a는 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu에 의해 표지된 17mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 4b는 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu-Sp에 의해 표지된 17mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 5a는 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu에 의해 표지된 20mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 5b는 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu-Sp에 의해 표지된 20mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 5c는 본 발명의 실시예 1에서의 Alexa 594에 의해 표지된 20mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 6a는 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu에 의해 표지된 40mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 6b는 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu-Sp에 의해 표지된 40mer DNA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에서의 EL-OSu-Sp의 첨가량과 표지율의 관계를 나타내는 그래프의 일례이다.
도 8a는 본 발명의 실시예 2에서의 EL-OSu에 의해 표지된 BSA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 8b는 본 발명의 실시예 2에서의 EL-OSu-Sp에 의해 표지된 BSA의 HPLC 스펙트럼의 일례이다.
도 9a는 본 발명의 실시예 2에서의 EL-OSu에 의한 표지후 BSA의 TOF MS 스펙트럼의 일례이다.
도 9b는 본 발명의 실시예 2에서의 표지전 BSA의 TOF MS 스펙트럼의 일례이다.
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.
본 발명의 생체분자용 표지색소는, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 표지색소에 사용하는 유기EL색소는, 한쌍의 양극과 음극 사이에 고체 상태로 끼워지며, 양극으로부터 주입된 정공과 음극으로부터 주입된 전자가 재결합할 때의 에너지에 의해 발광할 수 있는 색소라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 테트라페닐부타디엔이나 페릴렌 등의 다환방향족 화합물, 시클로펜타디엔 유도체, 디스티릴피라진 유도체, 아크리돈 유도체, 퀴나크리돈 유도체, 스틸벤 유도체, 페노티아진 유도체, 피라지노피리딘 유도체, 아졸 유도체, 이미다졸 유도체, 카르바졸 유도체, 그리고 테트라페닐티오펜 유도체 등을 사용할 수 있다. 더욱이, 분자내에 카르복시산기를 가지고, 또는 카르복시산기를 도입할 수 있는 색소인 것이 바람직하다. 아래에 기재하는 바와 같이, 생체분자와 결합하기 위한 반응성기의 도입을 용이하게 할 수 있기 때문이다.
본 발명의 표지색소에 사용하는 결합부는 생체분자시료(이하, '표적분자'라고 함)와 결합하는 반응성기를 가지고 있으며, 그 반응성기에는 생체분자와의 사이에 공유결합 또는 이온결합을 형성하는 치환기 혹은 구핵 시약(nucleophilic reagent; 친핵 시약) 또는 구전자 시약(electrophilic reagent; 친전자성 시약)을 사용할 수 있다.
생체분자와의 사이에 공유결합을 형성하는 경우, 반응성기는 표적분자의 아미노기, 이미노기, 티올기 또는 히드록실기와 반응할 수 있는 관능기가 바람직하다. 유기EL색소와 표적분자 사이의 공유결합으로는, 아미드 결합, 이미드 결합, 우레탄 결합, 에스테르 결합 또는 구아니딘 결합을 형성시키는 것이 바람직하다. 그 관능기에는 예를 들어, 이소티오시아네이트기, 이소시아네이트기, 에폭시기, 할로 겐화술포닐기, 염화아실기, 할로겐화 알킬기, 글리옥살기, 알데히드기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 이소티오시아네이트기, 이소시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택한 어느 1종을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 이소시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화 알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택한 어느 1종을 사용하는 것이 바람직하다. 표적분자의 아미노기와 아미드 결합을 형성할 수 있으며, 또한 표적분자 안의 이미노기에 직접 결합할 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 트리아진기, 카르보디이미드기, 또는 활성 에스테르화한 카르보닐기이다. 또한, 이들의 유기EL색소가 카르복시산기를 가지는 경우, 카르보디이미드 유도체, 트리아진 유도체의 존재하에서 표적 분자 안에 존재하는 아미노기 및 이미노기를 직접 수식하는 것도 가능하다. 더욱이, 치환기를 가져도 되는 트리아진기, 치환기를 가져도 되는 카르보디이미드기를 가지는 유기EL색소는, DNA 염기 중의 구아닌, 티민의 이미노기와 직접 반응하기 때문에, PCR(Polymerase Chain Reaction)법에 의한 색소를 도입할 필요가 없어, 미스매치 검출(이중사슬을 형성하지 않는 염기의 검출)이 가능하며, SNP(1염기 다형) 해석의 시약으로서 사용할 수 있다.
또한, 표적분자와의 사이에 이온결합을 형성하는 반응성기에는, 아니온성기 예를 들어, 술포닐기나 카르복시기를 사용할 수 있다. 이 아니온성기는 생체분자의 카티온성기 예를 들어, 아미노기와 이온결합한다.
또한, 반응성기로서, 공유결합을 형성하는 반응성기와 이온결합을 형성하는 반응성기 모두를 사용할 수도 있다. 이에 의해, 표적분자 사이에 더욱 강한 결합을 형성할 수 있다. 공유결합을 형성하는 반응성기와 이온결합을 형성하는 반응성기의 조합은 특별히 한정되지 않으며, 상기 관능기와 상기 술포닐기나 카르복시기 등의 아니온성기의 조합을 들 수 있다.
한편, 표적분자가 DNA인 경우에는 올리고 DNA 말단에 수식된 아미노 잔기와, 단백질인 경우에는 아미노 잔기와, 펩티드류인 경우에는 폴리펩티드의 아미노기와, 예를 들어 폴리리신 유도체의 아미노 잔기와, 그리고 당류인 경우에는 다당류 유도체 골격 안의 아미노기와 반응성기를 결합시킬 수 있다.
본 발명의 표지색소에 사용하는 스페이서부는, 발색부와 반응성기를 연결시키는 구성부분으로, 공유결합 또는 원자사슬을 포함하는 부분이며, -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-(R은 알킬기), -(CH2-CH2-O-)n-(n은 1~10의 정수), -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택되는 관능기를 1종 이상 포함하는 것을 사용할 수 있다.
즉, 스페이서부는 상기 군으로부터 선택된 1종의 관능기만으로 구성하여도 되고, 2종 이상의 관능기를 포함하는 구성으로 할 수도 있다. 또한, 선택한 하나의 관능기를 2개 이상 포함하는 구성으로 할 수도 있다.
예를 들어, 1종의 관능기만으로 구성하는 경우, -CONH-, -COO-, -CH2-O-R-, -CH2NH- 등이 바람직하다. 또한, 2종 이상의 관능기로 구성하는 경우에는 아래의 태양으로 할 수 있다.
(1) 2종의 관능기로 구성하는 경우
-CONH-COO-, -CH2-O-, -CH2-NR- 등이 바람직하다.
(2) 3종 이상의 관능기로 구성하는 경우
(i) 하기 식 (I)로 나타내어지는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
-(CHR1)p-X-(CHR2)q- …… (I)
식 중, X는 직접결합 또는 -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 관능기를 사용할 수 있고, 바람직하게는 -COO-, -CONH-, -O-, -CH=CH-, -C≡C- 또는 -Ar-, 보다 바람직하게는 -COO-, -CONH-, -O-, 또는 -Ar-을 사용할 수 있다. 또한, R1과 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기, 혹은 방향족 탄화수소기로서, 필요에 따라 술포닐기, 히드록실기, 4급 아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종의 하전기에 의해 치환된 것을 사용할 수 있다. 또한, Ar은 아릴기, 바람직하게는 페닐렌기 또는 나프틸렌기이고, 필요에 따라 술포닐기로 치환된 것을 사용할 수 있다. p와 q는 각각 독립적으로 0~20의 정수, 바람직하게는 0~10의 정수, 보다 바람직하게는 0~5의 정수이고, p+q≥1이다.
이 스페이서부의 구체적인 예를 들면, -(CH2)p-CONH-(CH2)q-, -(CH2)p-COO-(CH2)q-, -(CH2)p-CH(-R1-SO3H)-(CH2)q-, -(CH2)p-CH(-R1-N+H3)-(CH2)q-, -(CH2)p-CH(-R1-COOH)-(CH2)q-, -(CH2)p-CH(-R1-OH)-(CH2)q-, -(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-, -(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-, -(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-, -(CH2)p-CONH(-R1-N+H3)-(CH2)q-, -(CH2)p-CONH(-R1-OH)-(CH2)q-, -(CH2)p-CONH(-R1-COOH)-(CH2)q-, -(CH2)p-COO-R1(-SO3H)-(CH2)q-, -(CH2)p-COO-R1(-OH)-(CH2)q-, -(CH2)p-COO-R1(-N+H3)-(CH2)q-, -(CH2)p-COO-R1(-COOH)-(CH2)q-, -(CH2)p-Ar-(CH2)q-, -(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-, -(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-, -(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-, -(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-, -(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-, -(CH2)p-C≡C-(CH2)q-, -(CH2)p-C=C-(CH2)q-, -(CH2)p-NR-(CH2)q-, -(CH2)p-O-(CH2)q-, -(CH2)p-S-(CH2)q-, -(CH2)p-HN-C(=NH)-NH- (CH2)q-, -(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q- 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 -(CH2)p-CONH-(CH2)q-, -(CH2)p-COO-(CH2)q-이다.
(ii) 하기 식 (II)로 나타내어지는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
-Y-(CHR3)r-Z- …… (II)
여기서, Y 및 Z는 각각 독립적으로 -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -CH2NH-, -CH2NR-, -O-, -S-, -NR-, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택된 1종의 관능기이고, 바람직하게는 -CONH-와 -COO-, -COO-와 -COO-, -COO-와 -NR- 등의 조합이다. 또한, R3는 수소 원자, 혹은 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기, 혹은 방향족 탄화수소기로서, 필요에 따라 술포닐기, 히드록실기, 4급 아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종의 하전기에 의해 치환된 것을 사용할 수 있다. 또한, Ar은 아릴기 바람직하게는 페닐렌기 또는 나프틸렌기이고, 필요에 따라 술포닐기로 치환된 것을 사용할 수 있다. r은 0~20의 정수, 바람직하게는 0~10의 정수, 보다 바람직하게는 0~5의 정수이다. 이 스페이서부의 구체적인 예를 들면, -CONH-(CH2)r-COO-, -CONH-CH(-R3-OH)-COO-, -CONH-CH(-R3-COOH)-COO-, -CONH-CH(R3-SO3H)-COO-, -COO-(CH2)r-COO- 등을 들 수 있다.
또한, 스페이서부에 아미노산 또는 2~20의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커를 사용할 수도 있다. 아미노산에는 천연 또는 합성의 아미노산을 사용할 수 있다. 여기서, 천연 아미노산에는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루타민산, 아스파라긴, 글루타민, 리신, 히드록시리신, 아르기닌, 시스테인, 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산, 2-아미노-3-술폭시프로판산, 시스틴, 메티오닌, 페닐알 라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, 프롤린 및 4-히드록시프로판 등이 포함된다.
합성 아미노산에는 상기 천연아미노산의 D체나 분자안에 적어도 아미노기와 카르복시기를 가지는 수식 아미노산이 포함된다.
수식 아미노산은 식 : H-N(R1)-(R2-CO)-OH로 나타낼 수 있다. 여기서, R1과 R2는 각각 독립적으로 에스테르, 에테르, 티오에스테르, 티오에테르, 아미드, 카르바미드 또는 티오카르바미드를 통하여 또는 통하지 않고, 술포닐기, 히드록실기, 4급아민기, 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종의 하전기에 의해 치환된 탄화수소기 또는 방향족기 또는 헤테로 환기를 나타낸다. 또한, 탄화수소기 또는 방향족기 또는 헤테로 환기는 각각 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기 또는 알콕시기 중 적어도 1종으로 치환되어 있어도 된다.
본 발명의 스페이서부에 사용하는 보다 바람직한 아미노산은, 술포닐기를 가지는 아미노산이다. 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산, 2-아미노-3-술폭시프로판산, 그리고 히드록실기를 가지는 티로신, 트레오닐, 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린, 세린으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종이다. 표지색소의 수용성을 향상시킬 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 시스테인산 또는 세린이다.
펩티드 링커로서는 각각 -C(-R1)-CONH-C(-R2), -C(-R1)-CONH-C(-R2)-CONH-C(-R3)-, -C(-R1)-CONH-C(-R2)-CONH-C(-R3)-CONH-C(-R4)-로 나타내어지는 디펩티드, 트 리펩티드, 테트라펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, R1, R2, R3, R4는 수소 원자, 탄소수 1~6의 알킬기, 알코올기, 인돌기, 히드록시페닐기, 벤질기, 구아니딘기, 티오에테르기, 알킬티올기, 이미다졸기 또는 알킬아민기 등의 치환기를 나타낸다. 이 펩티드들은 호모 또는 헤테로펩티드이어도 된다. 구체적인 예를 들면, Ala-Ser, Glu-Ala, Glu-Ala-Leu, Gly-Pro, Gly-Pro-Asn, Ile-Val, Ile-Val-Met 등을 사용할 수 있다.
또한, 펩티드 링커의 일부를 필요에 따라 술포닐기, 히드록실기, 4급아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 하전기를 가지는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이들 중 어느 1개의 하전기를 가지는 아미노산을 1종 이상 포함하는 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 이에 의해, 표지색소의 수용성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 술포닐기를 가지는 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산, 2-아미노-3-술폭시프로판산, 히드록시기를 가지는 티로신, 트레오닐, 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린, 세린을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 1종의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 사용할 수 있다.
스페이서부의 길이 및 그 구조를 변화시킴으로써, 발색부와 생체분자의 표지부위 사이의 거리를 바꾸어 생체분자와 표지색소 사이의 입체장해를 억제할 수 있다. 즉, 복잡합 구조를 가지는 단백질, 펩티드, DNA 등의 생체분자의 입체구조에 맞추어, 입체장해를 억제하도록 표지색소의 구조를 설계할 수 있기 때문에, 표지율을 향상시킬 수 있게 된다. 혹은, 스페이서부에 강직성을 부여하는 관능기 예를 들 어, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-을 도입함으로써, 특정한 표지부위 예를 들어, 깊은 곳에 있는 표지부위에 대한 입체장해를 크게할 수도 있다. 이에 의해, 입체장해가 적은 표지부위 예를 들어, 얕은 곳만을 선택적으로 표지하는 한편, 입체장해가 적은 별도의 표지색소로 깊은 곳의 표지부위를 표지함으로써, 깊은 곳과 얕은 곳의 표지부위를 식별하는 것도 가능해진다.
본 발명의 표지색소에 반응성기를 도입하는 경우, 예를 들어, 반응식 1로 나타내는 반응을 사용할 수 있다. 반응식 (I)은, 반응성기에 활성 에스테르화한 카르복시기를 사용하고, 반응성기와 결합하는 스페이서부의 관능기에 -COO-를 사용한 예를 나타내고 있다. 활성 에스테르화한 카르보닐기에는 N-히드록시-숙신이미드에스테르나 말레이미드에스테르를 사용할 수 있다. N-히드록시-숙신이미드를 사용하고, 축합제로서 DCC를 사용함으로써, N-히드록시-숙신이미드에스테르체를 경유하여 아미드 결합에 의해 유기EL색소와 표적분자가 결합한다.
또한, 반응식 (II)는, 활성 에스테르화한 카르보닐기에 트리아진 유도체를 사용하고, 반응성기와 결합하는 스페이서부의 관능기에 -COO-를 사용한 예를 나타내고 있다.
또한, 반응식 (III)은, 반응성기에 카르보디이미드기를 사용하고, 반응성기와 결합하는 스페이서부의 관능기에 -COO-를 사용한 예를 나타내고 있다. 카르보디이미드기에는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)나 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 등의 카르보디이미드 시약을 사용할 수 있다. 카르보디이미드체를 경유하여 아미드 결합에 의해 유기EL색소와 표적분자를 결합시킬 수 있 다.
또한, 반응식 (IV)는, 스페이서부에 미리 카르보디이미드기, 트리아진기를 도입한 예 즉, 반응성기와 결합하는 스페이서부의 관능기가 반응성기를 겸하는 예를 나타내고 있다. 이에 의해, 표지색소에 별도로 반응성기를 도입하지 않아도, 표적분자내의 아미노기, 이미드기에 대하여 표지색소를 직접 결합시킬 수 있다.
반응식 1.
Figure 112008014381492-PCT00003
본 발명의 표지색소에 사용하는 바람직한 유기EL색소는, 공액계를 가지는 5원환 화합물을 포함하는 화합물로서, 그 5원환 화합물이 1종 이상의 헤테로 원자, 셀렌 원자 또는 보론 원자를 포함하는 것을 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 공액계를 가지는 5원환 화합물로 이루어지는 단환 화합물과, 그 5원환 화합물과 공액계를 가지는 6원환 화합물로 이루어지는 축합 다환 화합물을 들 수 있다. 고체 상태 에서도 양자 수율이 크고, 강한 형광을 나타내기 때문이다. 5원환 화합물에는 아졸 유도체 또는 이미다졸 유도체가 바람직하다. 더욱이, 아졸 유도체 또는 이미다졸 유도체는 1 이상의 4급 암모늄기를 가지는 것이 바람직하다. 수용성을 향상시킬 수 있기 때문이다.
아래에, 축합 다환 화합물의 구체적인 예에 대하여 설명한다.
(모노아졸 유도체 1)
Figure 112008014381492-PCT00004
여기서, R1, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화 수소기 또는 복소환기를 나타내고, R1, R2, R3, R4, R5는 서로 같아도 달라도 된다. 상기 알킬기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다. 또한, 상기 알케닐기는 바람직하게는 비닐기, 알릴기, 크로틸기, 티그릴기 또는 프레닐기이다. 또한, 상기 알키닐기는 바람직하게는 에티닐기 또는 프로파르길기이다. 또한, 상기 알콕시기는 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기 또는 페녹시이다. 또한, 상기 방향족 탄화수소기는 단환 또는 다환을 포함하며, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기이고, 보다 바람직하게는 페닐기이다. 또한, 상기 복소환기는 바람직하게는 피롤기, 푸란기, 티오펜기, 이미다졸기, 옥사졸기, 티아졸기, 피라졸기, 피리딘기 또는 퀴놀린기이고, 보다 바람직하게는 푸란기, 이미다졸기 또는 티오펜기이다. 또한, 상기 탄화수소기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다.
또한, R'는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기 혹은 방향족 탄화수소기를 나타낸다. 여기서, 알킬기, 알케닐기 방향족 탄화수소기에는 상기와 마찬가지의 것을 사용할 수 있다.
또한, An-는 Cl-, Br-, I- 등의 할로겐화물 이온, CF3SO3 -, BF4 -, PF6 -를 나타낸다. 한편, 하기 화학식에서도 특별히 한정하기 않는한 마찬가지이다.
(모노아졸 유도체 2)
Figure 112008014381492-PCT00005
여기서, 식 중 R8, R9는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기를 나타내고, R8, R9는 서로 같아도 달라도 된다. 또한, 상기 알킬기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다. 또한, 상기 알케닐기는 바람직하게는 비닐기, 알릴기, 크로틸기, 티그릴기 또는 프레닐기이다. 또한, 상기 알키닐기는 바람직하게는 에티닐기 또는 프로파르길기이다. 또한, 상기 알콕시기는 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기 또는 페녹시이다. 또한, 상기 방향족 탄화수소기는 단환 또 는 다환을 포함하며, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기이고, 보다 바람직하게는 페닐기이다. 또한, 상기 복소환기는 바람직하게는 피롤기, 푸란기, 티오펜기, 이미다졸기, 옥사졸기, 티아졸기, 피라졸기, 피리딘기 또는 퀴놀린기이고, 보다 바람직하게는 푸란기, 이미다졸기 또는 티오펜기이다. 또한, 상기 탄화수소기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다.
한편, 이하의 화학식에서도 특별히 단정하지 않는 한 마찬가지이다. 또한, n은 1 이상의 정수, 바람직하게는 1~5이며, 이하의 화학식에서도 마찬가지이다.
(디아졸 유도체 1)
Figure 112008014381492-PCT00006
(디아졸 유도체 2)
Figure 112008014381492-PCT00007
(디아졸 유도체 3)
Figure 112008014381492-PCT00008
여기서, 식 중, R1, R2, R3, R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기를 나타내고, R1, R2, R3, R4, R6, R7은 서로 같아도 달라도 된다. R2, R3은 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기, 바람직하게는 페닐기를 사용할 수 있고, 그 치환기에는 탄소수 1~4의 알킬기나 알콕시기, 또는 브롬 원자를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 알킬기는 메틸기, 알콕시기에는 메톡시기를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, x는 치환기를 가지고 있어도 되는 질소 원자, 유황 원자, 산소 원자, 셀렌 원자 또는 보론 원자이고, 특별히 단정하지 않는 한 이하의 화학식에서도 마찬가지이다.
(디아졸 유도체 4)
Figure 112008014381492-PCT00009
(디아졸 유도체 5)
Figure 112008014381492-PCT00010
여기서, N→O는 질소 원자가 산소 원자에 배위결합하고 있는 상태를 나타낸다.
(디아졸 유도체 6)
Figure 112008014381492-PCT00011
(디아졸 유도체 7)
Figure 112008014381492-PCT00012
(디아졸 유도체 8)
Figure 112008014381492-PCT00013
Figure 112008014381492-PCT00014
여기서, 식 중 R10, R11은 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기를 나타내고, R10, R11은 서로 같아도 달라도 된다. 또한, 상기 알킬기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다. 또한, 상기 알케닐기는 바람직하게는 비닐기, 알릴기, 크로틸기, 티그릴기 또는 프레닐기 이다. 또한, 상기 알키닐기는 바람직하게는 에티닐기 또는 프로파르길기이다. 또한, 상기 알콕시기는 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기 또는 페녹시이다. 또한, 상기 방향족 탄화수소기는 단환 또는 다환을 포함하며, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기이고, 보다 바람직하게는 페닐기이다. 또한, 상기 복소환기는 바람직하게는 피롤기, 푸란기, 티오펜기, 이미다졸기, 옥사졸기, 티아졸기, 피라졸기, 피리딘기 또는 퀴놀린기이고, 보다 바람직하게는 푸란기, 이미다졸기 또는 티오펜기이다. 또한, 상기 탄화수소기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다. 또한, R12는 치환기를 가지고 있어도 되는 올레핀기 또는 파라핀기이고, n은 1~3의 정수, 바람직하게는 1이다. 한편, 이하의 화학식에서도 특별히 단정하지 않는 한 마찬가지이다.
(디아졸 유도체 9)
Figure 112008014381492-PCT00015
Figure 112008014381492-PCT00016
(트리아졸 유도체 1)
Figure 112008014381492-PCT00017
(트리아졸 유도체 2)
Figure 112008014381492-PCT00018
5원환 화합물로서 티오펜기를 포함하는 하기 유도체를 사용할 수도 있다.
(티오펜 유도체 1)
Figure 112008014381492-PCT00019
(티오펜 유도체 2)
Figure 112008014381492-PCT00020
(티오펜 유도체 3)
또한, 티오펜 유도체의 경우, 비축합계 화합물이고, 하기 화학식으로 나타내는 2,3,4,5-테트라페닐티오펜 유도체를 사용할 수도 있다.
Figure 112008014381492-PCT00021
여기서, 식 중, R13, R14, R15는 각각 독립적으로 수소 원자 혹은 직쇄, 분기 또는 고리형상의 탄소수 1~6의 알킬기, 치환 또는 미치환의 아릴기, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기를 나타내고, 혹은 치환 또는 미치환의 아랄킬기, 바람직하게는 벤질기 또는 페네틸기를 나타내며, Ar1 및 Ar2는 치환 또는 미치환의 아릴기, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기를 나타내고, 더욱이 Ar1과 Ar2는 결합하고 있는 질소 원자와 함께 함질소 복소환을 형성하고 있어도 된다. 또한, Y1 및 Y2는 수소 원자, 할로겐 원자, 혹은 직쇄, 분기 또는 고리형상의 탄소수 1~6의 알킬기, 혹은 직쇄, 분기 또는 고리형상의 알콕시기, 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기, 또는 페녹시기, 혹은 치환 또는 미치환의 아릴기, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기, 혹은 치환 또는 미치환의 아랄킬기, 바람직하게는 벤질기 또는 페네틸기, 혹은 치환 또는 미치환의 아미노기를 나타낸다.
(티오펜 유도체 4)
또한, 하기 화학식으로 나타내는 2,3,4,5-테트라페닐티오펜 유도체를 사용할 수도 있다.
Figure 112008014381492-PCT00022
여기서, 식 중 Ar1~Ar6은 각각 독립적으로 치환 또는 미치환의 아릴기, 바람직하게는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기를 나타내고, 또한 Ar1과 Ar2, Ar3과 Ar4, Ar5와 Ar6은 결합하고 있는 질소 원자와 함께 함질소 복소환을 형성하고 있어도 된다.
또한, 5원환 화합물에 이미다졸을 사용하고, 하기 화학식으로 나타내는 이미다졸 유도체를 사용할 수도 있다. 여기서, 이미다졸 유도체를 구성하는 이미다졸기는 4급 암모늄기를 가지는 것이 바람직하다. 수용성을 향상시킬 수 있기 때문이다. 또한, 피리딘기(pyridino group)를 포함하는 경우, 보다 수용성을 향상시키기 위하여, 피리딘기도 4급 암모늄기를 가지고 있어도 된다. 한편, 하기 화학식 중 R"는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기 혹은 방향족 탄화수소기를 나타낸다.
(이미다졸 유도체 1)
Figure 112008014381492-PCT00023
(이미다졸 유도체 2)
Figure 112008014381492-PCT00024
(이미다졸 유도체 3)
Figure 112008014381492-PCT00025
(이미다졸 유도체 4)
Figure 112008014381492-PCT00026
Figure 112008014381492-PCT00027
여기서, 이미다졸 골격은 중앙의 벤젠환 R8, R9, R10, R11의 임의의 위치에 복수개의 유니트가 결합되어 있어도 된다. 또한, R12는 치환기를 가지고 있어도 되는 올레핀기 또는 파라핀기이고, n은 1~3의 정수, 바람직하게는 1이다.
(카르바졸 유도체)
또한, 하기 화학식으로 나타내어지는 카르바졸 유도체를 사용할 수도 있다.
Figure 112008014381492-PCT00028
또한, 공액계를 가지는 5원환 화합물로서, 1종 이상의 헤테로 원자, 셀렌 원자 또는 보론 원자를 포함하는 단환 화합물을 사용할 수도 있다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 하기 화학식으로 나타내어지는 아졸 유도체를 사용할 수 있다.
Figure 112008014381492-PCT00029
여기서, 식 중 R1, R4, R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기를 나타내고, R1, R4, R5는 서로 같아도 달라도 된다. 또한, 상기 알킬기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다. 또한, 상기 알케닐기는 바람직하게는 비닐기, 알릴기, 크로틸기, 티그릴기 또는 프레닐기이다. 또한, 상기 알키닐기는 바람직하게는 에티닐기 또는 프로파르길기이다. 또한, 상기 알콕시기는 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기 또는 페녹시이다. 또한, 상기 방향족 탄화수소기 는 단환 또는 다환을 포함하며, 바람직하게는 비페닐기, 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기이고, 보다 바람직하게는 비페닐기, 페닐기이다. 또한, 상기 복소환기는 바람직하게는 피롤기, 푸란기, 티오펜기, 이미다졸기, 옥사졸기, 티아졸기, 피라졸기, 피리딘기 또는 퀴놀린기이고, 보다 바람직하게는 푸란기, 이미다졸기 또는 티오펜기이다. 또한, 상기 탄화수소기는 바람직하게는 탄소수 1~6의 직쇄형상 또는 분기형상의 알킬기이다.
본 발명의 표지색소를 사용하는 유기EL색소에는, 이상 설명한 축합 다환 화합물 및 단환 화합물이면 특별히 한정되지 않지만, 하기 화학식으로 나타내는 디아졸 유도체 또는 이미다졸 유도체를 바람직하게 사용할 수 있다.
Figure 112008014381492-PCT00030
Figure 112008014381492-PCT00031
또한, 상기 디아졸 유도체 및 이미다졸 유도체 중에서, 디아졸로피리딘 유도체 또는 이미다졸로피리딘 유도체를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 표지색소는, 상기 디아졸로피리딘 유도체 또는 이미다졸로피리딘 유도체를 발색부에 포함하는 것으로, 하기 화학식으로 나타낼 수 있다.
Figure 112008014381492-PCT00032
Figure 112008014381492-PCT00033
-(CHR')p-X-(CHR")q-는 상술한 스페이서부를 나타낸다. 또한, Z는 상술한 반응성기를 나타낸다.
여기서, 상기 R2와 R3에 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기를 사용하는 것이 바람직하다. Cy3에 대응하는 녹색 형광색소를 얻을 수 있다. 방향족 탄화수소기로서는 페닐기, 톨릴기, 크실릴기 또는 나프틸기, 보다 바람직하게는 페닐기 또는 톨릴기이다. 또한, 치환기로는 술포늄기가 바람직하다. 수용성을 높일 수 있기 때문이다.
혹은, 상기 R2와 R3에 치환기를 가지고 있어도 되는 티오펜기, 푸란기, 피롤기, 이미다졸기, 옥사졸기, 티아졸기, 피라졸기 및 피리딘기로 이루어지는 군에서 선택된 1종, 보다 바람직하게는 티오펜기, 이미다졸기 또는 푸란기를 사용할 수도 있다. Cy5에 대응하는 적색 형광색소를 얻을 수 있다.
표지색소는 반응성기와 스페이서부의 조합에 의해 여러가지 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 반응성기에 활성 에스테르화한 카르보닐기를 사용하는 경우, 미리 디아졸로피리딘 유도체 또는 이미다졸로피리딘 유도체의 활성 에스테르체를 합성하여 두고, 이 활성 에스테르체에 스페이서용 화합물(예를 들어, 글리신, 알라닌, 4-아미노부탄산, 시스테인산, 세린 등의 아미노산)을 반응시켜 카르복시산체를 얻고, 이 카르복시산체를 N-히드록시-숙신이미드와 반응시킴으로써, 스페이서를 도입한 활성 에스테르체를 얻을 수 있다. 예를 들어, 스페이서용 화합물에 글리신을 사용한 경우, -CONH-와 -(CH2)-를 가지는 스페이서부를 얻을 수 있다. 또한, β-알라닌을 사용한 경우, -CONH-와 -(CH2)2- 를 가지는 스페이서부를 얻을 수 있다. 또한, 4-아미노부탄산을 사용한 경우, -CONH-와 -(CH2)3- 을 가지는 스페이서부를 얻을 수 있다. 또한, 시스테인산을 사용한 경우, -CONH-와 -SO3 - 을 가지는 스페이서부를 얻을 수 있다. 또한, 세린을 사용한 경우, -CONH-와 -OH를 가지는 스페이서부를 얻을 수 있다. 시스테인산과 세린을 사용함으로써, 스페이서부에 각각 술포늄기와 수산기를 도입할 수 있으며, 표지색소의 수용성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 표지색소는, 표지된 고체 혹은 반고체 상태의 생체분자의 형광을 측정하는 검출방법이면, 모든 생체분자의 검출방법에 사용할 수 있다. 종래의 형광색소 대신 유기EL색소를 사용함으로써, 고감도로 화학적으로 안정적이고 조작성이 뛰어나며, 또한 저가인 검출방법을 제공할 수 있다. 본 발명에서는 상술한 바와 같 이 생체분자시료에 유기EL색소를 직접 반응시켜, 생체분자시료를 유기EL색소로 표지하여도 되고, 혹은 생체분자시료와, 유기EL색소로 표지된 프로브를 반응시켜 생체분자시료를 유기EL색소로 표지하는 방법을 이용할 수도 있다. 또한, 특이결합을 사용한 생체분자의 검출방법을 이용할 수도 있다. 더욱이, 유기EL색소로 표지한 생체분자시료를 전기영동에 의해 크기 분리하는 방법을 이용할 수도 있다.
예를 들어, 핵산을 검출대상으로 하는 DNA 마이크로 어레이법에서는 아래의 순서로 할 수 있다.
(DNA 마이크로어레이법)
본 검출방법은, 검출해야 할 표적핵산에 유기EL색소를 반응시켜 유기EL색소로 표지하는 한편, 표적핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬으로 변성시킨 표적핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화하여, 표적핵산의 형광을 측정한다. 본 검출방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다. 또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다. 한편, 단 일사슬으로 변성시킨 표적핵산과 유기EL색소를 혼합하여 반응시킴으로써, 유기EL색소에 의해 표지된 표적핵산을 조제한다. 반응온도는 실온~60℃, 반응시간은 2~48시간으로 하는 것이 바람직하다.
이어서, 표지된 표적핵산을 기판 위에 점적하고, 혼성화한다. 혼성화는 실온~70℃, 그리고 2~48시간의 범위에서 하는 것이 바람직하다. 혼성화에 의해 프로브 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 표적핵산이 선택적으로 프로브 핵산과 결합한다. 그 후, 기판을 세정하고 실온에서 건조한다. 이어서, 건조한 기판 표면의 형광강도를 형광 레이저 스캐너법에 의해 측정한다. 형광강도에 의해 유전자 발현의 레벨을 모니터링할 수 있다. 한편, 상기 혼성화는 프로브 핵산을 기판에 고정하는 방법에 대해서 설명하였지만, 미리 유기EL색소로 표지한 표적핵산을 기판에 고정하고, 프로브 핵산을 기판 위에 점적하는 방법을 이용할 수도 있다.
또한, 마찬가지로 핵산을 검출대상으로 하고, 프라이머나 터미네이터를 사용하는 PCR법에서는 아래의 순서로 행할 수 있다.
(PCR법)
본 검출방법은, 검출해야 할 표적핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 유기EL색소로 표지하고, 표적핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적핵산과 프로브를 반응시켜, 표적핵산의 형광을 측정한다. 구체적으로는 표적핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소(polymerase), RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 이 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전 자 영역만을 증폭시킨다. 효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다. 이 때 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 예를 들어, 도 27에 나타내는 바와 같은 색소를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 색소가 도입된 핵산을 합성할 수 있다. 또는 PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 유기EL색소를 결합하여, 유기EL색소가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
Figure 112008014381492-PCT00034
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다. 이 뉴클레오티드, ddNTP(dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다. 통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성반응하면, 일정한 확율로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다. 이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 유기EL색소로 표지해두면, 합성반응의 종 점(3'단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 유기EL색소를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다. 또한, 터미네이터 대신에 미리 유기EL색소로 표지한 프라이머를 사용하여 표적핵산과 혼성화할 수도 있다.
또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이 때문에, 특정한 핵산 검출을 위한 프로브로서 효과적이다. 그 때문에, ISH(in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
검출에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 유기EL색소로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다. 이에 대하여 형광색소의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정 할 수도 있다. 이것에는 예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 검출방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
예를 들어, 분자비콘법의 발광기구에 대하여, 도 1을 사용하여, 기판위에 분자비콘을 고정시키고, 목적유전자와의 혼성화를 하는 예에 대하여 설명한다. 특정한 DNA 서열을 가지는 DNA(프로브)의 한쪽 끝에 유기EL색소(F), 다른쪽 끝에 퀀처(quencher)(Q)를 표지한다. 퀀처(Q)는 기판에 고정되어 있으며, 목적유전자의 도입전에는, 퀀처(Q)와 유기EL색소(F)가 근접하여 있고 형광색소는 소광된다. 여기에, 표지한 DNA와 상보적인 서열을 가지는 목적유전자를 도입하면, 표지한 DNA와 목적유전자는 혼성화를 하는데, 이에 의해 유기EL색소(F)와 퀀처(Q)의 거리가 떨어지고, 유기EL색소(F)의 형광을 관찰할 수 있다. 이에 의해 DNA 혼성화의 관찰과 혼성화의 양을 측정할 수 있게 된다.
또한, 단백질을 검출대상으로 하는 경우, 전기영동 후의 단백질의 검출에는 염색색소가 사용되고 있다. 통상, 영동후의 겔 안에 염색색소 예를 들어, CBB(Coomassie Brilliant Blue)를 침투시켜 단백질을 염색하고, UV를 조사하여 발광시키는 방법이 사용된다. 하지만, 종래의 염색색소를 사용하는 방법은 간단하지만, 감도가 100ng 정도로 낮아, 미량의 단백질 검출에는 적합하지 않다. 또한, 겔을 통하여 염색색소를 침투시키기 때문에, 염색에 많은 시간을 요한다는 문제도 있다.
이에 대하여, 본 발명에서는 단백질을 전기영동에 의해 크기 분리한 후, 분 리한 단백질에 유기EL색소를 결합시킴으로써 단백질을 표지한다. 본 발명의 유기EL색소는 반응성기를 가지고 있으며, 단백질과 빠르게 정량적으로 반응하고, 더욱이 고감도이어서, 미량의 단백질 검출에 적합하다. 더욱이, 크기 분리한 단백질을 질량 분석하여 동정(同定)할 수도 있다.
여기서, 단백질에는 알부민, 글로불린, 글루테린, 히스톤, 프로타민, 그리고 콜라겐 등의 단순 단백질, 핵단백질, 당단백질, 리보단백질, 인단백질, 금속단백질 등의 복합 단백질 중 어느 것이든 검출대상으로 할 수 있다. 예를 들어, 인단백질, 당단백질, 총단백질의 염색색소에 대응시켜 3종의 유기EL색소를 사용하고, 2차원 전기영동으로 분리한 단백질 시료에 있어서, 인단백질, 당단백질 및 총단백질을 염색할 수 있다. 또한, TOF-Mass 등의 질량분석을 함으로써 단백질을 동정할 수 있기 때문에, 특수한 단백질을 생성시키는 암이나 바이러스에 의한 감염증 등의 질병의 진단이나 치료에 응용할 수 있다. 또한, 콜라겐은 동물의 결합조직을 구성하는 단백질이며, 독특한 섬유형상 구조를 가진다. 즉, 3중 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 그 펩티드 사슬이 모여 3중 사슬을 형성한다. 콜라겐은 일반적으로 매우 면역원성이 낮은 단백질로서, 식품, 화장품, 의약품 등의 분야에서 널리 사용되고 있다. 하지만, 콜라겐의 펩티드 사슬에 형광색소를 도입하여도, 종래의 형광색소에서는 그 안정성이 충분하다고는 할 수 없으며, 보다 안전한 형광색소가 필요하였다. 그래서, 콜라겐을 표지하는 형광색소에 유기EL색소를 사용함으로써, 안전하고 고감도의 검출을 할 수 있게 된다.
또한, 프로브에 압타머(aptamer)를 사용할 수도 있다. 압타머는 올리고 핵산 으로 이루어지며, 염기서열에 의존하여 여러가지 특징있는 입체구조를 가질 수 있기 때문에, 그 입체구조를 통하여 단백질을 포함하는 모든 생체분자에 결합할 수 있다. 이 성질을 이용하여, 유기EL색소로 표지한 압타머를 특정 단백질에 결합시켜, 피검체와의 결합에 의한 단백질의 구조변화에 따른 형광변화로부터 간접적으로 피검체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광색소로 표지한 압타머를 사용하고, 에너지 트랜스퍼를 이용한 코카인 검출용 바이오센서가 제안되고 있다(J.Am.Chem.Soc. 2001,123,4928-4931). 이 형광색소 대신 유기EL색소를 사용함으로써, 고감도로 취급이 용이한 바이오센서를 제공할 수 있게 된다.
또한, 본 발명의 표지색소를 특이결합을 사용한 생체분자의 검출방법에도 사용할 수 있다. 즉, 생체분자로 이루어지는 피검체 또는 수식물질에 의해 수식된 이 피검체의 검출에 있어, 피검체에 특이 결합하는 결합물질 또는 수식물질에 특이결합하는 결합물질 중 하나를, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지하고, 표지된 결합물질로부터의 형광을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 피검체 또는 수식물질과 상기 결합물질의 조합에는, 항원-항체, 합텐-항합텐 항체, 비오틴-아비딘, Tag-항 Tag항체, 렉틴-당단백질 또는 호르몬-수용체를 사용할 수 있다.
구체적으로는 기판상, 용액안, 비즈위, 항체위에 존재하는 항원 또는 합텐에 대하여, 유기EL색소로 표지한 항체 등의 결합물질을 작용시키고, 그 항체의 항원 또는 합텐 특이적 결합능을 이용하여, 특정 항원 또는 합텐을 검출한다. 항원으로 는 단백질, 다당류, 핵산, 펩티드 등을 들 수 있으며, 합텐으로는 FITC나 디니트로페닐기 등의 저분자량 분자를 들 수 있다. 항원 또는 합텐과 항체의 조합으로는 GFP와 항 GFP항체, FITC와 항FITC 항체 등을 들 수 있다.
구체적인 예로는 아래의 방법을 이용할 수 있다.
(1) 기판이나 용액 안에 존재하는 생체분자(항원: 단백질, 다당류, 핵산, 펩티드)에 형광표지한 항체를 결합시켜 검출하는 방법.
(2) 기판이나 용액 안에 합텐을 수식한 생체분자(단백질, 다당류, 핵산, 펩티드)에 형광표지한 항합텐 항체를 결합시켜 검출하는 방법.
(3) 기판이나 용액 안에 비오틴을 수식한 생체분자(단백질, 다당류, 핵산, 펩티드)에 형광표지한 아비딘을 결합시켜 검출하는 방법.
(4) 기판이나 용액 안에 존재하는 생체분자(단백질, 다당류, 핵산, 펩티드)에 항체를 결합시키고, 또한 그 항체와 특이적으로 결합하는 형광색소를 표지한 항체를 결합시켜 검출하는 방법.
(5) 기판이나 용액 안에 존재하는 생체분자(단백질, 다당류, 핵산)에 합텐을 수식한 항체를 결합시키고, 또한 그 합텐과 특이적으로 결합하는 형광색소를 표지한 항체를 결합시켜 검출하는 방법.
(6) 기판이나 용액 안에 존재하는 생체분자(단백질, 다당류, 핵산)에 비오틴을 수식한 항체를 결합시키고, 또한 그 비오텐과 특이적으로 결합하는 형광색소를 표지한 아비딘을 결합시켜 검출하는 방법.
(7) 기판이나 용액 안에 존재하는 생체분자(단백질, 다당류, 핵산)에 Tag(히 스티딘 등)을 도입하고, 형광색소로 표지한 항Tag 항체로 검출하는 방법.
이 표지물들은, 면역염색, ELISA, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 플로우 사이토미트리(Flow cytometry) 등의 각종 측정방법에 사용할 수 있다.
더욱 구체적인 예를 설명하면, 예를 들어 도 2에 나타내는 바와 같이, IgG 항체를 펩신으로 처리하면, F(ab')2라고 불리는 조각이 얻어진다. 이 조각을 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등으로 환원하면, Fab'라고 불리는 조각이 얻어진다. Fab' 조각은 1개 혹은 2개의 티올기(-SH)를 가지고 있다. 이 티올기에 대하여 말레이미드기를 작용시켜 특이적인 반응을 할 수 있다. 즉, 도 3에 나타내는 바와 같이, 말레이미드기를 도입한 유기EL색소를 조각의 티올기와 반응시킴으로써, 유기EL색소로 항체를 표지할 수 있다. 이 경우, 항체의 생리활성(항원보충기능)을 잃지 않는다.
또한, 본 발명의 표지색소를 이용하여 금속 이온을 검출할 수도 있다. 체내의 DNA나 단백질 등의 안정성이나 고차(高次) 구조의 유지, 기능발현, 그리고 생체 내의 모든 화학반응을 담당하는 효소의 활성화 등, 생체내에서 일어나는 모든 생명현상에 금속 이온이 관여하고 있다. 이 때문에, 생체 내에서의 금속 이온의 움직임을 실시간으로 관찰할 수 있는 금속 이온센서는, 의료분야를 비롯하여 그 중요성이 주장되고 있다. 종래, 생체분자에 형광색소를 도입한 금속 이온센서가 알려져 있다. 예를 들어, K+ 이온 존재하에서, K+ 이온을 가지고 특수한 구조를 띠는 서열을 가지는 핵산을 사용하는 금속 이온센서가 제안되고 있다(J.Am.Chem.Soc. 2002,124,14286-14287). 에너지 트랜스퍼를 일으키는 형광색소를 핵산의 양끝에 도입한다. 통상은 색소간 거리가 있기 때문에 에너지 트랜스퍼는 일어나지 않는다. 하지만, K+ 이온 존재하에서는 핵산이 특수한 형태를 띠기 때문에, 그 결과 형광색소가 에너지 트랜스퍼를 일으키는 거리에 근접함으로써 형광을 관찰할 수 있다. 또한, 펩티드에 형광색소를 도입한 아연 이온센서도 제안되고 있다(J.Am.Chem.Soc. 1996,118,3053-3054). 이 종래의 형광물질들 대신에 본 발명의 유기EL색소로 이루어지는 표지색소를 사용함으로써, 종래에 비하여 고감도이고 취급이 용이한 금속 이온센서를 제공할 수 있게 된다. 한편, 생체내에 존재하는 금속 이온이면, 모든 금속 이온을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지색소를 이용하여, 세포 안의 시그널을 관찰할 수도 있다. 내부 시그널이나 환경정보에 대한 세포의 응답에는, 이온으로부터 효소로 많은 분자가 관여하고 있다. 시그널 전달과정에서는 특수한 프로테인 키나아제가 활성화하여, 특수한 세포 단백질의 인산화를 유도함으로써 여러가지 세포응답의 초기응답을 담당하고 있는 것이 알려져 있다. 뉴클레오티드의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체를 사용함으로써 시그널 전달거동을 빠르게 관찰할 수 있다. 예를 들어, 프로테인 키나아제C(PKC)는 세포막에서의 시그널 전달에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 이 Ca2+ 의존 세린/트레오닌 프로테인 키나아제는 디아실 글리세롤이나 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine)과 같은 막 구성 지질상에서 활성화되어, 이온 채널이나 세포골격 단백질에 존재하 는 세린이나 트레오닌(threonine)을 인산화함으로써 막표면 전하를 바꾸어 시그널 전달을 하고 있다. 이것들을 살아있는 세포에서 동적으로 관찰함으로써, 세포의 시그널 전달을 관찰할 수 있다.
여기서, 뉴클레오티드 유도체는 효소의 기질이나 저해제로서 공급되며, 고립성 단백질의 구조와 역학의 탐사, 막결합 단백효소의 재구성, 미토콘드리아와 같은 세포기관(organelle), 제막(除膜) 근섬유와 같은 조직의 뉴클레오티드 결합 단백질 부분에 결합하여 그것들의 조절을 하고 있다. 또한, 최근에는 G-단백질의 저해제나 활성체와 같은 시그널 전달에 영향을 주는 화합물의 존재도 알려지고 있다. 이 뉴클레오티드 유도체는 본 발명의 유기EL색소로 이루어지는 표지색소를 도입함으로써, 이 세포들 안 시그널 전달의 동적 관찰을 고감도로 할 수 있으며, 또한 취급이 용이하게 할 수 있게 된다.
또한, 본 발명의 표지색소를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현상황의 관찰에 이용할 수도 있다. RNAi는 RNA를 세포에 도입했을 때, 그것과 같은 서열을 가진 유전자의 발현이 넉다운되는 현상이다. RNAi는 이중사슬 RNA(dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제한다. 이 프로세스에서는 처음에 장쇄의 dsRNA(double stranded RNA)가 리보뉴클리아제 활성을 가지는 다이서(dicer)에 의해 21~23mer의 짧은 siRNA로 절단된다. 생성된 siRNA는 중간복합체(RISC: RNA-induced silencing complex)에 의해 혼입되어, 이 복합체는 혼입된 siRNA의 안티센스 사슬과 상보적인 서열을 가지는 mRNA를 절단하는 것이 알려져 있다. 이 분야에서도 유전자 발현 상황 등을 관찰하기 위하여 형광색소가 사용되고 있다. 표지할 형광색소에 유기EL색소를 사용함으로써, 안정적이고 고감도로 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 표지색소는 조직 또는 세포 시료 안의 표적핵산이나 표적 단백질의 발현 레벨의 검토에 사용하는 조직 또는 세포의 염색색소로서도 사용할 수 있다. 조직 또는 세포의 염색은 상술한 바와 같이, 반응성기를 통하여 표적핵산 또는 표적 단백질에 유기EL색소를 결합시킴으로써 할 수 있다.
즉, 본 발명의 염색색소는 예를 들어, 유기EL색소를 진핵 세포의 염색에 사용하면 건조상태에서도 형광을 발하기 때문에, 표지후의 보존 등의 면에서 종래의 색소보다 뛰어난 성능을 나타낸다. 또한, 진핵 세포 뿐만 아니라, 세포골격용 색소로서도 충분히 사용할 수 있다. 그 밖에, 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 리소좀, 지질 이중막 등의 표지에 사용할 수 있다. 이들, 표지된 세포 등은 습윤 및 건조 등 모든 조건하에서 관측이 가능하기 때문에, 범용성이 크다. 관측에 있어서는 형광현미경 등을 사용할 수 있다.
또한, 임상단계에서 인체로부터 채취된 조직은, 마이크로톰 등의 기기를 사용하여 박막으로 슬라이스한 후, 염색되어 있다. 여기서는, Cy 색소 및 Alexa 색소가 사용되고 있다. 하지만, 기존의 색소는 안정성이 매우 나빠, 재진단시에는 다시 샘플을 제작해야 한다. 또한, 제작된 샘플은 표본으로서 보존하는 것이 불가능하다. 하지만, 상기 종래의 색소에 비하여 유기EL색소는 매우 안정적인 색소이기 때문에, 염색한 조직을 표본으로서 보전하는 것이 가능하다.
본 발명의 표지키트는, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합 하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소를 포함하는데, 필요에 따라 색소를 대상으로 하는 생체분자와 반응시키기 위한 시약, 효소, 용매 등을 포함할 수 있다. 대상으로 하는 생체분자는 핵산, 단백질, 펩티드류 또는 당류이다.
또한, 본 발명의 다른 표지키트는, 적어도 유기EL색소로 이루어지는 발색부와 이 발색부에 결합하고 상술한 반응식 (I)로 나타내어지는 스페이서부를 가지는 표지색소 전구체를 포함하며, 필요에 따라 카르복시산기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화 알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택된 어느 1종의 반응성기를 표지색소에 도입하기 위한 반응성기 도입시약을 포함하는 것이다.
(실시예)
이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 아래의 실시예에 의해 한정되지 않는다.
합성예 1
유기EL색소로서 1,2,5-옥사디아졸로-[3,4-c]피리딘 유도체를 사용하였다.
이하, 스페이서부로서 -COO-를 도입한 옥사디아졸로-[3,4-c]피리딘의 활성 에스테르체의 반응예(반응식 2, 3)를 나타낸다. 한편, 스페이서부를 가지지 않는 활성 에스테르체를 EL-OSu, 스페이서부를 도입한 활성 에스테르체를 EL-OSu-Sp라고 기재한다.
반응식 2.
Figure 112008014381492-PCT00035
이어서, 옥사디아졸로 피리딘 활성 에스테르체(6)을 DMF 중, 알라닌과 반응시켜, 스페이서부를 도입한 카르복시산체(7)을 합성하였다. 그 후, 카르복시산체(7)을 디옥산 중, N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, 스페이서부를 도입한 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(8)을 합성하였다. 이하, 반응예를 나타낸다.
반응식 3.
Figure 112008014381492-PCT00036
각 스텝 모두 반응은 차분히 진행되며, 카르복시산체(7)을 경유하여 목적으로 하는 활성 에스테르체(8)을 높은 수율로 얻었다.
(합성순서)
(1) 디케톤 유도체(2)의 합성
500ml의 입구가 3개인 플라스크에서 4-메톡시아세토페논(1) 37.5g(0.25mol), 아질산나트륨 0.15g을 초산 100ml에 용해하였다. 물중탕 안에, HNO3 100ml를 초산 100ml에 용해한 것을 2시간에 걸쳐 떨어뜨렸다. 그 후, 실온에서 2일간 교반하였다. 반응혼합물을 500ml의 물에 천천히 넣고, 침전을 생성시켰다. 침전물은 여과하여, 클로로포름에 용해하였다. 클로로포름상(相)을 포화 중탄산나트륨수로 세정하고, 10% NaCl 수용액으로 2회 세정하였다. MgSO4로 탈수한 후, 감압하 클로로포름을 증류제거하고, 옥사디아졸-N-옥사이드(2)를 34.5g(수율 78%) 얻었다.
(2) 디케톤 유도체(3)의 합성
500ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸-N-옥사이드(2) 17.7g(0.05mol)을 아세토니트릴 400ml에 용해하였다. 그것에 Zn 12.0g, AcOH 7ml, Ac2O 20ml를 첨가하였다. 물중탕 안에서 반응온도가 30℃가 넘지않도록 냉각하였다. 12시간 교반하여 반응을 종료하였다. 반응혼합물을 여과하여, 불용분을 제거하였다. 아세토니트릴을 감압하 증류제거하여 잔재를 얻었다. 잔재를 클로로포름으로 재결정하고, 옥사디아졸-N-옥사이드(3)을 10.2g(수율 60%) 얻었다.
(3) 옥사디아졸로피리딘 에틸에스테르(4)의 합성
500ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸-N-옥사이드(3) 15.6g (0.046mol)을 부탄올 300ml에 용해하였다. 그것에 글리신에틸에스테르 염산염 32.0g(0.23mol)을 첨가하고, 24시간 가열환류하였다. 부탄올을 감압하 증류제거하고, 잔재를 얻었다. 잔재를 200mol의 클로로포름에 용해하고, 10% HCl, 포화 NaHCO3, 10% NaCl로 세정하였다. MgSO4로 건조하고, 용매를 증류제거하였다. 얻어진 잔재를 클로로포름으로 재결정하고, 옥사디아졸로피리딘 에틸에스테르(4)를 13.0g(수율 70%) 얻었다.
(4) 옥사디아졸로피리딘 에틸에스테르(4)의 가수분해
500ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 에틸에스테르(4) 3.0g(0.007mol)을 200ml의 에탄올에 용해하였다. 그것에 KOH 0.62g(0.01mol)을 첨가하였다. 5시간 가열환류한 후, 반응혼합물을 200ml의 물에 첨가하였다. 이 수용액에 진한 염산을 떨어뜨려 pH 1로 조정하였더니 침전이 발생하였다. 침전물을 여 과하고, 클로로포름에 용해하였다. 클로로포름상을 10% NaHCO3 수용액, 물로 세정하였다. 클로로포름을 증류제거하여 잔재를 얻었다. 잔재를 물-에탄올(1:1)로 재결정하여, 2.1g(수율 81%)의 옥사디아졸로피리딘 카르복시산(5)를 얻었다.
(5) 활성 에스테르체(6)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산(5) 1.0g(0.0026mol)과 N-히드록시숙신이미드 0.30g(0.0026mol)을 DMF 20ml에 용해하였다. 이것에 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 0.54g(0.0026mol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 30시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름)로 단리 정제하고, 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6)을 0.76g(수율 62%) 얻었다.
(6) 카르복시산체(7)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6) 100g(0.21mmol)과 알라닌 18.8mg(0.21mmol)을 DMF 20mL에 용해하였다. 그 후, 실온에서 12시간 교반하였다. 반응종료후, 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=7:3)로 단리 정제하고, 카르복시산체(7)을 83mg(수율 88%) 얻었다.
(7) 활성 에스테르체(8)의 합성
이어서, 50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산체(7) 70g(0.16mmol)과 N-히드록시숙신이미드 18.0g(0.16mmol)을 DMF 20ml에 용해 하였다. 이것에 DMF 5ml에 용해한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 32.2mg(0.16mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 30시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(8)을 75.8mg(수율 89%) 얻었다.
합성예 2
유기EL색소로서 이미다졸로피리딘 에틸에스테르 유도체를 사용하였다. 이하, 스페이서부로서 -COO-를 도입한 이미다졸로피리딘 에틸에스테르의 활성 에스테르체의 반응예(반응식 4, 5)를 나타낸다.
반응식 4.
Figure 112008014381492-PCT00037
이어서, 합성예 1의 경우와 마찬가지로, 이미다졸로피리딘 활성 에스테르체(3)을 알라닌과 반응시켜, 스페이서부를 도입한 카르복시산체(4)를 합성하고, 그 카르복시산체(4)를 디옥산 중, N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, 스페이서부를 도입한 이미다졸로피리딘 활성 에스테르체(5)를 합성하였다. 이하, 반응예를 나타낸 다.
반응식 5.
Figure 112008014381492-PCT00038
(1) 이미다졸로피리딘 에틸에스테르(1)의 가수분해
500ml의 입구가 3개인 플라스크에서 에스테르체(1) 0.5g(1.5mmol)을 50ml의 에탄올에 용해하였다. 그것에 KOH 0.12g(2.1mol)을 첨가하였다. 5시간 가열환류한 후, 반응혼합물을 50ml의 물에 첨가하였다. 이 수용액에 진한 염산을 떨어뜨려 pH 1로 조정하였더니 침전이 발생하였다. 침전물을 여과하고, 클로로포름에 용해하였다. 클로로포름상을 10% NaHCO3 수용액, 물로 세정하였다. 클로로포름을 증류제거하여 잔재를 얻었다. 잔재를 물로 재결정하여, 0.3g(수율 63%)의 카르복시산체(2)를 얻었다.
(2) 활성 에스테르체(3)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 카르복시산 유도체(2) 0.2g(0.6mmol)과 N-히드록시숙신이미드 0.07g(0.6mmol)을 DMF 10ml에 용해하였다. 이것에 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 0.12g(0.6mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 30시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(3)을 0.14g(수율 55%) 얻었다.
(3) 카르복시산체(4)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 이미다졸로피리딘 활성 에스테르체(3) 80mg(0.19mmol)과 알라닌 17.3mg(0.19mmol)을 DMF 20mL에 용해하였다. 그 후, 실온에서 10시간 교반하였다. 반응종료후, 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=7:3)로 단리 정제하고, 카르복시산체(4)를 58mg(수율 78%) 얻었다.
(4) 활성 에스테르체(5)의 합성
이어서, 50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 이미다졸로피리딘 카르복시산체(4) 54mg(0.14mmol)과 N-히드록시숙신이미드 16.1mg(0.14mmol)을 DMF 20ml에 용해하였다. 이것에 DMF 5ml에 용해한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 28.8mg(0.14mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 30시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(5)를 62.2mg(수율 92%) 얻었다.
합성예 3
유기EL색소로서 합성예 1에서 사용한 옥사디아졸로피리딘 유도체를 사용하 고, 스페이서부에 시스테인산을 사용하며, 반응성기에는 활성 에스테르화한 카르보닐기와 아니온성기인 술포늄기 모두를 도입하였다. 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6)을 시스테인산과 반응시키고, 스페이서부를 도입한 카르복시산체(9)를 합성하였다. 그 후, 카르복시산체(9)를 디옥산 중, N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, 스페이서부를 도입한 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(10)을 합성하였다. 이하, 반응예를 나타낸다.
반응식 6.
Figure 112008014381492-PCT00039
이하, 반응예 1과 다른 부분의 합성순서만 나타낸다.
(1) 카르복시산체(9)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6) 100mg(0.21mmol)과 시스테인산 39mg(0.23mmol)을 DMF 20mL에 용해하였다. 그 후, 실온에서 12시간 교반하였다. 반응종료후, 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=7:3)로 단리 정제하고, 카르복시 산체(9)를 98mg(수율 88%) 얻었다.
(2) 활성 에스테르체(10)의 합성
이어서, 50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산체(9) 80mg(0.15mmol)과 N-히드록시숙신이미드 19mg(0.17mmol)을 DMF 20ml에 용해하였다. 이것에 DMF 5ml에 용해한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 35mg(0.17mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 30시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=10:1)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(10)을 73mg(수율 78%) 얻었다.
합성예 4
유기EL색소로서 합성예 1에서 사용한 옥사디아졸로피리딘 유도체를 사용하고, 스페이서부에 세린을 사용하였다. 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6)을 세린과 반응시켜, 스페이서부를 도입한 카르복시산체(11)을 합성하였다. 그 후, 카르복시산체(11)을 디옥산 중, N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, 스페이서부를 도입한 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(12)를 합성하였다. 이하, 반응예를 나타낸다.
반응식 7.
Figure 112008014381492-PCT00040
이하, 반응예 1과 다른 부분의 합성순서만 나타낸다.
(1) 카르복시산체(11)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6) 100mg(0.21mmol)과 세린 26mg(0.25mmol)을 DMF 20mL에 용해하였다. 그 후, 실온에서 12시간 교반하였다. 반응종료후, 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=7:3)로 단리 정제하고, 카르복시산체(11)을 79mg(수율 81%) 얻었다.
(2) 활성 에스테르체(12)의 합성
이어서, 50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산체(11) 70mg(0.15mmol)과 N-히드록시숙신이미드 19mg(0.17mmol)을 DMF 20ml에 용해하였다. 이것에 DMF 5ml에 용해한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 35mg(0.17mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 30시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로 포름-메탄올=10:1)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(12)를 61mg(수율 72%) 얻었다.
합성예 5
유기EL색소로서 합성예 1에서 사용한 옥사디아졸로피리딘 유도체를 사용하고, 스페이서부에 펩티드 링커로서 알라닌세린(Ala-Ser)을 사용하였다. 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6)을 알라닌세린과 반응시켜, 스페이서부를 도입한 카르복시산체(13)을 합성하였다. 그 후, 카르복시산체(13)을 디옥산 중, N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, 스페이서부를 도입한 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(14)를 합성하였다. 이하, 반응예를 나타낸다.
반응식 8.
Figure 112008014381492-PCT00041
이하, 반응예 1과 다른 부분의 합성순서만 나타낸다.
(1) 카르복시산체(13)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6) 100mg(0.21mmol)과 알라닌세린 45mg(0.25mmol)을 DMF 20mL에 용해하였다. 그 후, 실온에서 10시간 교반하였다. 반응종료후, 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=6:4)로 단리 정제하고, 카르복시산체(13)을 72mg(수율 64%) 얻었다.
(2) 활성 에스테르체(14)의 합성
이어서, 50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산체(13) 60mg(0.11mmol)과 N-히드록시숙신이미드 14mg(0.12mmol)을 DMF 15ml에 용해하였다. 이것에 DMF 5ml에 용해한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 25mg(0.12mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 15시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=8:2)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(14)를 60mg(수율 86%) 얻었다.
합성예 6
유기EL색소로서 합성예 1에서 사용한 옥사디아졸로피리딘 유도체를 사용하고, 스페이서부에는 에틸렌글리콜산을 사용하였다. 이하, 반응식을 나타낸다.
반응식 9.
Figure 112008014381492-PCT00042
(1) 산클로라이드체(15)의 합성
50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산체(5) 100mg(0.27mmol)을 SOCl2 20ml에 혼합하고, 2시간 가열환류하였다. 실온까지 냉각하고 SOCl2을 증류제거하여, 산클로라이드체(15)를 94mg(Y. 90%) 얻었다.
(2) 카르복시산체(16)의 합성
100ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘산 클로라이드체(15) 90mg(0.22mmol)을 THF 40mL에 혼합하였다. 거기에 5ml의 THF에 용해한 에틸렌글리콜산 20mg(0.22mmol)을 투입하고, 1시간 교반하였다. 그 후, THF를 증류제거하였다. 잔재를 메탄올로 재결정하여, 카르복시산체(16)을 61mg(Y. 62%) 얻었다.
(3) 활성 에스테르체(17)의 합성
이어서, 50ml의 입구가 3개인 플라스크에서 옥사디아졸로피리딘 카르복시산체(16) 100mg(0.22mmol)과 N-히드록시숙신이미드 29mg(0.24mmol)을 DMF 25ml에 용해하였다. 이것에 DMF 10ml에 용해한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 50mg(0.24mmol)을 30분에 걸쳐 떨어뜨렸다. 떨어뜨린 후, 실온에서 15시간 교반하였다. 감압하 DMF를 증류제거하였다. 잔재를 실리카겔컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=7:3)로 단리 정제하고, 활성 에스테르체(17)을 107mg(수율 89%) 얻었다.
합성예 7
유기EL색소로서 합성예 1에서 사용한 옥사디아졸로피리딘 유도체를 사용하고, 스페이서부에 타우린을 사용하여, 합성예 3의 옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(10)을 합성하였다.
옥사디아졸로피리딘 활성 에스테르체(6) 0.48g [1.08mmol]과 DCC 등의 불순물 0.52g, 타우린(M.W.: 125.15) 0.43g [3.44 mmol]을 100ml의 나스 플라스크(recovery flask)에 넣고, 또한 무수 DMF 50ml를 첨가하였다. 이어서, 트리에틸아민(TEA, M.W.:101.19, 1L≒0.73kg) 715㎕ [514 mmol]를 더하고, 4시간 교반하였다. 이 때, TLC [CHCl3:MeOH=6:4, 원료 Rf=0.89, 목적물 Rf=0.69], TLC[CHCl3:MeOH=7:3, 원료 Rf=0.89, 목적물 Rf=0.49]로 확인하였더니, 반응은 2시간에서 거의 종료하였다.
DMF를 감압 증류제거한 후, 실리카겔컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH=3:1)로 정제하고 목적물을 분취하였더니, 분취한 용액에 결정이 발생하였기 때문에 그것을 여과하였다. 얻어진 결정을 HPLC(Figure 3), TLC로 확인하였더니 목적물이었다. 수량은 283mg(수율 58%)이었다.
실시예 1
<올리고 DNA의 색소표지 및 검출(1)>
(올리고 DNA)
사용한 올리고 DNA는 아래와 같다.
17mer DNA H2N-(C6)-5'-ACT CCA GTG GTA ATC TA-3'
20mer DNA H2N-(C6)-5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3'
40mer DNA H2N-(C6)-5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TGG GAC GGA ACA GCT TTG AGG T-3'
(표지순서)
표지색소에는, 합성예 1에서 합성한 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체(8)(EL-OSu-Sp)을 사용하였다. 올리고 DNA에 20mer DNA를 사용한 예에 대하여 설명한다.
H2N-(C6)-5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3' (10 nmol)을 포함하는 붕산 버퍼(pH 8.5) 20㎕에, 활성 에스테르체(EL-OSu-Sp) 12nmol(5.7㎍)(1.2당량)을 포함하는 DMSO 용액 80㎕을 더하여 실온에서 6시간 흔들었다. 그 후, 전체 양이 1ml가 되도록 0.1M TEAA(triethylamine-acetate) 버퍼(pH 7.0)를 더하여, NAP-10컬럼(GE healthcare Sephadex G-25)을 사용하여 올리고뉴클레오티드에 유래하는 성분을 분취하였다. 그 때, NAP-10 컬럼은 미리 0.1M TEAA 버퍼 15ml로 평형화시킨 후 사용하였다. 전체 양이 1ml가 되도록 조정된 시료를 컬럼에 충전하고, 1ml의 용액이 용 출한 후, 0.1M TEAA 버퍼를 1.5ml 채웠다. 그 직후부터의 용출액 1.5ml를 분취하였다. 이 얻어진 용액 100㎕을 역상(逆相) HPLC에 의해 분석하였다.
한편, 비교를 위해, 스페이서부를 포함하지 않는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체(EL-OSu)를 이용하여 올리고 DNA를 표지하였다. 또한, 몰레큘러 프로브(Mole㎛cular Probe)사 제품인 Alexa 594의 활성 에스테르체도 일부 비교에 사용하였다.
(HPLC 측정조건)
HPLC 장치로는 니혼분코사 제품인 LC-2000플러스 시리즈를 사용하였다.
컬럼: GL Science Inertsil ODS-3 컬럼 5㎛, 4.6mm×250mm
DNA 변화(gradient) 조건:
- 용리액 A: 0.1M TEAA 수용액 (pH 7.0)
- 용리액 B: 90% CH3CN/0.1M TEAA 수용액 (pH 7.0)
- 변화(B%) 0min(10%) -> 30min(45%) -> 40min(100%) -> 50min(100%) -> 60min(10%)
- 속도: 1 ml/min
- 온도: 40℃
(결과)
EL-OSu 또는 EL-OSu-Sp를 이용하여 표지한 올리고 DNA의 HPLC의 결과를, 17mer DNA, 20mer DNA, 40mer DNA에 대하여 도 4a~도 4b, 도 5a~도 5c, 도 6a~도 6b에 나타낸다. 또한, 표지율의 값을 표 1 내지 표 3에 나타낸다.
17mer
활성 에스테르체 몰비 EL-OSu 1:1.2 EL-OSu-Sp 1:1.2
표지율(%) 6.1 99.1
20mer
활성 에스테르체 몰비 EL-OSu 1:1.2 EL-OSu 1:10 EL-OSu-Sp 1:1.2 Alexa594-NHS 1:1.2 Alexa594-NHS 1:10
표지율(%) 11.8 54.0 99.6 극소 5.8
40mer
활성 에스테르체 몰비 EL-OSu 1:1.2 EL-OSu 1:10 EL-OSu-Sp 1:1.2
표지율(%) 극소 10.0 78.0
이어서, 17mer DNA를 이용하여, EL-OSu-Sp와의 비율을 아래의 범위에서 변화시킨 경우의 표지율 변화를 조사하였다. 결과를 도 7에 나타낸다.
스페이서부를 도입한 표지색소 EL-OSu-Sp를 이용함으로써, 스페이서부를 가지지 않는 EL-OSu나 Alexa 594와 비교하여 표지율을 향상시킬 수 있었다. 특히, 20mer 정도 길이의 올리고 DNA이면, 1.2배몰의 첨가량으로 EL-Osu의 약 12%, Alexa의 극소량(1% 이하)에 대하여, 대체로 100%의 표지율을 얻을 수 있었다. 또한, 17mer이나 40mer DNA는 Alexa에서는 표지가 어려웠으나, 이 올리고 DNA들에 대해서도 비약적으로 표지율을 향상시킬 수 있었다. 몰비 1.2 정도에서도 대체로 100%의 표지율이 얻어지기 때문에, 스페이서부를 도입한 표지색소 EL-OSu-Sp는 올리고 DNA에 대하여 정량적인 표지가 가능하다. Alexa 등의 종래의 표지색소를 이용하는 경우, 200배몰 정도 첨가하여도 50% 전후의 표지율밖에 얻어지지 않는 것을 고려하면, 20mer 정도 길이의 올리고 DNA이면, 스페이서부를 도입한 표지색소 EL-OSu-Sp는 약 1/200의 첨가량으로 100%의 표지율을 얻을 수 있다는 현저한 효과를 가진다.
실시예 2
<올리고 DNA의 색소표지 및 검출(2)>
유기EL색소에 스페이서부를 가지는 이미다졸로피리딘의 활성 에스테르체5(im-EL-OSu-Sp)를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지 방법에 의해 20mer DNA에 색소표지를 하였다.
(결과)
옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체(EL-OSu-Sp)를 이용한 경우와 마찬가지로, 몰비 1.2정도에서도 대체로 100%의 표지율이 얻어졌다.
실시예 3
<올리고 DNA의 색소표지 및 검출(3)>
유기EL색소에 합성예 3에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체10을 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지 방법에 의해 20mer DNA에 색소표지를 하였다.
(결과)
옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체(8)을 이용한 경우와 마찬가지로, 몰비 1.2정도에서도 대체로 100%의 표지율이 얻어졌다. 한편, 실시예 1에서는 유기EL색소를 용해시키기 위하여 DMSO를 시료액 전체의 80vol%로 하였는데, 본 실시예에서는 10vol%에서도 유기EL색소가 용해하여, 뛰어난 수용성을 나타내었다.
실시예 4
<올리고 DNA의 색소표지 및 검출(4)>
유기EL색소에 합성예 4에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체12를 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지 방법에 의해 20mer DNA에 색소표지를 하였다.
(결과)
옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체(8)을 이용한 경우와 마찬가지로, 몰비 1.2정도에서도 대체로 100%의 표지율이 얻어졌다. 한편, 실시예 3의 경우와 마찬가지로, 뛰어난 수용성을 나타내었다.
실시예 5
<올리고 DNA의 색소표지 및 검출(5)>
유기EL색소에 합성예 5에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체14를 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지 방법에 의해 20mer DNA에 색소표지를 하였다.
(결과)
옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체(8)을 이용한 경우와 마찬가지로, 몰비 1.2 정도에서도 대체로 100%의 표지율이 얻어졌다. 한편, 실시예 1에서는 유기EL색소를 용해시키기 위하여 DMSO를 시료액 전체의 80vol%로 하였는데, 본 실시예에서는 10vol%에서도 유기EL색소가 용해하여, 뛰어난 수용성을 나타내었다.
실시예 6
<단백질의 색소표지 및 검출(1)>
(표지순서)
BSA(Bovine Serium Albumin)의 리신 잔기의 아미노기와 스페이서부를 포함하는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체8(EL-OSu-Sp)을 반응시켜 아미드 결합을 형성하고, BSA를 색소표지하였다. 구체적으로는, BSA 1.0mg(15.05nmol)을 포함하는 탄산 버퍼(pH 9.0) 100㎕에, 활성 에스테르체 35.82㎍(75.25nmol)을 포함하는 DMSO 용액을 400㎕ 더하여 실온에서 24시간 흔들었다. 그 후, 전체 양이 1ml이 되도록 0.1M TEAA 버퍼(pH 7.0)를 더하여, NAP-10컬럼(GE healthcare Sephadex G-25)을 사용하여 BSA에 유래하는 성분을 1.5ml 분취하였다. 얻어진 용액 100㎕를 역상 HPLC에 의해 분석하였다.
한편, MALDI TOF MS에 의해 EL-OSu로 표지한 BSA를 동정하였다. 표지한 BSA(도 9a)는 원료(도 9b)에 비하여 분자량이 2200정도 증가하고 있으며, 유기EL색소가 약 5분자 결합하고 있는 것을 알 수 있었다.
(HPLC 측정조건)
HPLC 장치로는 니혼분코사 제품인 LC-2000플러스 시리즈를 사용하였다.
컬럼: GL Science Inertsil ODS-3 컬럼 5㎛, 4.6mm×250mm
DNA 변화 조건:
- 용리액 A: 0.1M TFA 수용액 (pH 7.0)
- 용리액 B: 90% CH3CN/0.1M TFA 수용액 (pH 7.0)
- 변화(B%) 0min(5%) -> 20min(50%) -> 60min(70%) -> 70min(100%) -> 80min(100%) -> 900min(5%)
- 속도: 0min -> 20min, 60min -> 90min: 1ml/min, 20min -> 60min: 0.5ml/min
- 온도: 40℃
(결과)
스페이서부를 가지지 않는 EL-OSu와 스페이서부를 가지는 EL-OSu-Sp를 사용하여 표지한 BSA의 HPLC의 결과를 각각 도 8a와 도 8b에 나타낸다. 표지율을 표 4에 나타낸다.
BSA
활성 에스테르체 몰비 EL-OSu 1:5 EL-OSu-Sp 1:5
표지율(%) 12.5 90.9
BSA를 대상으로 한 경우에도, 스페이서부를 가지는 EL-OSu-Sp를 사용함으로써, 스페이서부를 가지지 않는 EL-OSu를 사용한 경우보다 비약적으로 표지율을 향상시킬 수 있었다. 반응성기인 활성 에스테르와 색소분자 사이에 스페이서부를 도입함으로써, BSA의 표지부위와 색소분자의 입체장해가 보다 적어지기 때문에 표지율이 향상되었다고 생각된다. 또한, TOF-MASS의 측정결과로부터, EL-OSu에서 표지한 BSA에는 5분자의 유기EL색소가 도입되고 있는 것을 확인하였다. EL-OSu-Sp의 경우, 5분자를 도입하기 위하여 5배몰 사용하였더니, 거의 정량적으로 표지할 수 있었다.
실시예 7
<단백질의 색소표지 및 검출(2)>
유기EL색소에 합성예 3에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체10을 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 5와 마찬가지 방법에 의해 BSA에 색소표지를 하였다.
(결과)
실시예 5의 경우와 마찬가지의 표지율로 얻어졌다. 한편, 실시예 5에서는 유기EL색소를 용해시키기 위하여 DMSO를 시료액 전체의 80vol%로 하였는데, 본 실시예에서는 10vol%에서도 유기EL색소가 용해하여, 뛰어난 수용성을 나타내었다.
실시예 8
<단백질의 색소표지 및 검출(4)>
유기EL색소에 합성예 4에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체12를 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 5와 마찬가지 방법에 의해 BSA에 색소표지를 하였다.
(결과)
실시예 5의 경우와 마찬가지의 표지율이 얻어졌다. 또한, 실시예 5의 경우와 마찬가지로, 뛰어난 수용성을 나타내었다.
실시예 9
<단백질의 색소표지 및 검출(5)>
유기EL색소에 합성예 5에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체14를 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 5와 마찬가지 방법에 의해 BSA에 색소표지를 하였다.
(결과)
실시예 5의 경우와 마찬가지의 표지율이 얻어졌다. 한편, 실시예 5에서는 유기EL색소를 용해시키기 위하여 DMSO를 시료액 전체의 80vol%로 하였는데, 본 실시예에서는 10vol%에서도 유기EL색소가 용해하여, 뛰어난 수용성을 나타내었다.
실시예 10
<단백질의 색소표지 및 검출(6)>
유기EL색소에 합성예 6에서 합성한 스페이서부를 가지는 옥사디아졸로피리딘의 활성 에스테르체17을 이용하고, DMSO를 10㎕로 하여 시료액 전체의 10vol%로 한 것 이외에는, 실시예 5와 마찬가지 방법에 의해 BSA에 색소표지를 하였다.
(결과)
실시예 5의 경우와 마찬가지의 표지율이 얻어졌다. 또한, 본 실시예에서도 뛰어난 수용성을 나타내었다.
이상, 설명한 바와 같이, 본 발명의 표지색소에 따르면, 고체 상태에서도 높은 형광강도를 가질 뿐만 아니라, 표적분자에 대하여 사용하는 색소량을 대폭 줄일 수 있다. 예를 들어, 종래의 표지색소의 경우, 200배몰 정도가 상식으로 되어 있지만, 이를 1/200 정도까지 줄일 수 있게 된다. 이에 의해, 사용하는 표지색소의 양을 대폭 줄일 수 있기 때문에, 표적분자의 검출비용을 대폭 줄일 수 있게 된다. 또 한, 표지 반응후, 미반응의 다량의 색소를 제거하는 공정이 필요없게 할 수도 있어, 검출방법을 보다 단시간에 실행할 수 있다.

Claims (34)

  1. 형광측정에 의한 생체분자의 검출에 사용하는 표지색소로서, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서를 가지는 생체분자용 표지색소.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유기EL색소가, 1종 이상의 헤테로 원자, 셀렌 원자 또는 보론 원자를 포함하는 5원환 화합물과 공액계를 가지는 6원환 화합물로 이루어지는 축합 다환 화합물인 생체분자용 표지색소.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 축합 다환 화합물이 하기 화학식 1의 (1), (2) 또는 (3) 중 어느 1종으로 나타내어지는 아졸 유도체인 생체분자용 표지색소:
    [화학식 1]
    Figure 112008014381492-PCT00043
    (식 중, R1, R2, R3, R4는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기를 나타내고, X는 치환기를 가지고 있어도 되는 질소 원자 또는 유황 원자 또는 산소 원자 또는 셀렌 원자, 보론 원자를 나타내며, R'는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기 혹은 방향족 탄화수소기, An-는 Cl-, Br-, I- 등의 할로겐화물 이온, CF3SO3 -, BF4 -, PF6 -를 나타낸다).
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 R2와 R3이, 각각 독립적으로 티오펜 유도체, 푸란 유도체, 피롤 유도체, 이미다졸 유도체, 옥사졸 유도체, 티아졸 유도체, 피라졸 유도체 및 피리딘 유도체로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 생체분자용 표지색소.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 R2와 R3이 술포닐기를 가지는 아릴기인 생체분자용 표지색소.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 축합 다환 화합물이 하기 화학식 2의 (4), (5), (6), (7) 또는 (8)로 나타내어지는 이미다졸 유도체인 생체분자용 표지색소:
    [화학식 2]
    Figure 112008014381492-PCT00044
    (식 중, R1, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 히드록실기, 시아노기, 술포닐기, 방향족 탄화수소기, 복소환기 등의 치환기를 가지고 있어도 되는 방향족 탄화수소기 또는 탄화수소기 또는 복소환기를 나타내고, R1, R2, R3, R4, R5는 같거나 서로 다른 것이어도 되며, R', R''는 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기 혹은 방향족 탄화수소기, An-는 Cl-, Br-, I- 등의 할로겐화물 이온, CF3SO3 -, BF4 -, PF6 -를 나타낸다).
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 R2와 R3이 각각 독립적으로 티오펜 유도체, 푸란 유도체, 피롤 유도체, 이미다졸 유도체, 옥사졸 유도체, 티아졸 유도체, 피라졸 유도체 및 피리딘 유도체로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 생체분자용 표지색소.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 R2와 R3이 술포닐기를 가지는 아릴기인 생체분자용 표지색소.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합부가 카르복시산기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화 알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택된 어느 1종의 반응성기를 가지는 생체분자용 표지색소.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서부가 -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -CH2NH-, -CH2NR-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-(R은 알킬기), -(CH2-CH2-O-)n-(n은 1~10의 정수), -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택되는 관능기를 적어도 1종 포함하는 생체분자용 표지색소.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 스페이서부가 하기 식 (I)로 나타내어지는 생체분자용 표지색소:
    -(CHR')p-X-(CHR")q- …… (I)
    (식 중, X는 직접결합 또는 -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-, -CH≡CH-, -C=C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 관능기를 나타내고, R'과 R''는 각각 독립적으로 수소 원자, 혹은 방향고리를 포함하여도 되는 알킬기 또는 알케닐기 등의 지방족 탄화수소기, 혹은 방향족 탄화수소기로서, 필요에 따라 술포닐기, 히드록실기, 4급 아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종의 하전기에 의해 치환된 것을 나타내며, Ar은 아릴기를 나타내고, p와 q는 각각 독립적으로 0~20의 정수를 나타내며, p+q≥1이다).
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 스페이서부가 아미노산 또는 2~20개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커인 생체분자용 표지색소.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 스페이서부가 아미노산으로서, 이 아미노산에 천연 아미노산 또는 합성 아미노산인 생체분자용 표지색소.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 아미노산이 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산, 2-아미노-3-술폭시프로판산, 티로신, 트레오닐, 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린 및 세린으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 생체분자용 표지색소.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 스페이서부가 펩티드 링커로서, 이 펩티드 링커가 술포닐기, 히드록실기, 4급 아민기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 하전기를 가지는 생체분자용 표지색소.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 펩티드 링커가 시스테인산, 2-아미노-3-술포설파닐프로판산, 2-아미노-3-술폭시프로판산, 티로신, 트레오닐, 4-아미노-2-히드록시부탄산, 호모세린 및 세린으로 이루어지는 군에서 선택된 1종의 아미노산을 포함하는 생체분자용 표지색소.
  17. 형광측정에 따른 생체분자의 검출에 사용하는 생체분자용 표지키트로서, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부 를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소를 포함하는 생체분자용 표지키트.
  18. 형광측정에 따른 생체분자의 검출에 사용하는 생체분자용 표지키트로서, 적어도 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 이 발색부에 결합하는 스페이서부로서, -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -CH2NH-, -CH2NR-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -O-, -S-, -NR-(R은 알킬기), -(CH2-CH2-O-)n-(n은 1~10의 정수), -CH=CH-, -C≡C-, -Ar- 및 -CO-Ar-NR-로 이루어지는 군에서 선택되는 관능기를 적어도 1종 포함하는 스페이서부를 가지는 표지색소 전구체를 포함하는 생체분자용 표지키트.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    카르복시산기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 할로겐화 알킬기, 트리아진기, 카르보디이미드기, 그리고 활성 에스테르화한 카르보닐기로부터 선택된 어느 1종의 반응성기를 표지색소에 도입하기 위한 반응성기 도입시약을 더 포함하는 생체분자용 표지키트.
  20. 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소를, 생체분자시료와 반응시키고, 이 표지색소에 의해 표지된 생체분자시료의 형광을 측정하는 생체분자의 검출방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 생체분자시료에 핵산, 단백질, 펩티드류, 그리고 당류로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종을 사용하는 검출방법.
  22. 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지된 프로브와, 생체분자시료를 반응시키고, 이 생체분자시료의 형광을 측정하는 검출방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 생체분자시료가 핵산이고, 상기 프로브에는 이 핵산의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 PNA를 사용하는 검출방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드가 프라이머 또는 터미네이터이고, 상기 핵산을 증폭시켜 형광을 측정하는 검출방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 핵산의 증폭에 앞서 프라이머를 유기EL색소로 표지하는 검출방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 또는 PNA가 분자비콘인 검출방법.
  27. 생체분자로 이루어지는 피검체 또는 수식물질에 의해 수식된 이 피검체의 검출방법으로서, 피검체에 특이결합하는 결합물질 또는 수식물질에 특이결합하는 결합물질 중 하나를, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지하고, 표지된 결합물질로부터의 형광을 측정하는 생체분자의 검출방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 피검체 또는 수식물질과 상기 결합물질의 조합이, 항원-항체, 합텐-항합텐 항체, 비오틴-아비딘, Tag-항 Tag항체, 렉틴-당단백질 또는 호르몬-수용체인 검출방법.
  29. 생체분자시료를 전기영동에 의해 크기 분리하는 공정을 포함하고, 이 전기영동에 앞서 혹은 이 전기영동 후에 생체분자시료를, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서를 가지는 표지색소로 표지하는 생체분자의 검출방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 생체분자시료가 핵산이고, 전기영동화상에 근거하여 이 핵산의 염기서열을 결정하는 검출방법.
  31. 제 29 항에 있어서,
    상기 생체분자시료가 단백질이고, 전기영동화상에 근거하여 추출한 단백질을 질량분석하는 검출방법.
  32. 조직 또는 세포시료 안의 생체분자를, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 생체분자를 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 표지하는 조직 또는 세포의 염색방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 생체분자가 핵산 또는 단백질인 염색방법.
  34. 조직 또는 세포시료의 염색에 사용하는 염색색소로서, 유기EL색소로 이루어지는 발색부와, 조직 또는 세포 안의 생체분자와 결합하는 결합부와, 발색부와 결합부를 연결하는 스페이서부를 가지는 표지색소로 이루어지는 염색색소.
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