JP5539920B2 - 診断薬及びそれを用いた測定方法 - Google Patents
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Description
本発明の診断薬は、抗体を標識する蛍光色素に、有機EL色素から成る発色部と、抗体と結合する結合部とを有する蛍光色素を用いる。
本発明に用いる抗体は特に限定されず、血漿タンパク、リポタンパク、糖タンパク、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類及び核酸から選択される少なくとも1種の標的抗原と特異的に結合する抗体を用いることができる。より好ましくは、血漿タンパク、腫瘍マーカー、ウイルス抗原、タンパク等を抗原とするものである。腫瘍マーカーのための抗体としては、例えば、モノクロナール抗体を挙げることができる。また、ウイルス抗原のための抗体として、例えば、IgG抗体やIgM抗体などを挙げることができる。
蛍光色素に用いる有機EL色素は、一対の陽極と陰極との間に固体状態で挟持され、陽極から注入された正孔と陰極から注入された電子とが再結合する際のエネルギーにより発光可能な色素であれば特に限定されない。例えば、テトラフェニルブタジエンやペリレン等の多環芳香族化合物、シクロペンタジエン誘導体、ジスチリルピラジン誘導体、アクリドン誘導体、キナクドリン誘導体、スチルベン誘導体、フェノチアジン誘導体、ピラジノピリジン誘導体、アゾール誘導体、イミダゾール誘導体、カルバゾール誘導体そしてテトラフェニルチオフェン誘導体等を用いることができる。さらに、分子内にカルボン酸基を有し、又はカルボン酸基を導入可能な色素であることが好ましい。以下に述べるように、抗体と結合するための反応性基の導入を容易に行うことができるからである。
共有結合を形成する場合、反応性基は、抗体のアミノ基、イミノ基、チオール基又はヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。有機EL色素とタンパク質との間の共有結合としては、アミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、又はグアニジン結合を形成させることが好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種を用いることが好ましい。タンパク質のアミノ基とアミド結合を形成することができ、またタンパク質のイミノ基に直接結合する事ができるからである。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基又は活性エステル化したカルボニル基である。また、これらの有機EL色素がカルボン酸基を有する場合、カルボジイミド誘導体、トリアジン誘導体の存在下で、タンパク質に存在するアミノ基およびイミノ基を直接修飾する事も可能である。また、イオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、タンパク質のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-、-CH=CH-、-C≡C-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数であり、p+q≧1である。
スペーサー部の具体例を挙げると、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、
-(CH2)p-CH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-C≡C-(CH2)q-、-(CH2)p-C=C-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q-、-(CH2)p-HN-C(=NH)-NH-(CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等を挙げることができる。
ここで、天然アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、アルギニン、システイン、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、シスチン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン及び4-ヒドロキシプロリン等が含まれる。
修飾アミノ酸は、一般式:H-N(R1)-(R2-CO)-OHで表すことができる。ここで、R1とR2は、それぞれ独立に、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド、カルバミド又はチオカルバミドを介して又は介さずに、スルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基、及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換された炭化水素基又は芳香族基又はヘテロ環基を表す。さらに炭化水素基又は芳香族基又はヘテロ環基は、それぞれ、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基の少なくとも1種で置換されていても良い。
また、反応式(II)は、活性エステル化したカルボニル基にトリアジン誘導体を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。
また、反応式(III)は、反応性基にカルボジイミド基を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。カルボジイミド基には、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)や1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により有機EL色素と抗体とを結合させることができる。
また、反応式(IV)は、スペーサー部に予めカルボジイミド基、トリアジン基を導入した例、すなわち、反応性基と結合するスペーサー部の官能基が反応性基を兼ねる例を示している。これにより、蛍光色素に別途、反応性基を導入しなくても、抗体のアミノ基、イミノ基に対して蛍光色素を直接結合させる事ができる。
以下に、縮合多環化合物の具体例について説明する。
また、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
また、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示す。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。
なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。また、nは1以上の整数、好ましくは1〜5であり、以下の一般式中でも同様である。
(チオフェン誘導体1)
また、チオフェン誘導体の場合、非縮合系の化合物であり、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
また、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
また、以下の一般式で示されるカルバゾール誘導体を用いることもできる。
ここで、上記のR2とR3に、置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基を用いることが好ましい。Cy3に対応する緑色蛍光色素を得ることができる。芳香族炭化水素基としてはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基又はトリル基である。さらに、置換基としてはスルホニウム基が好ましい。水溶性を高めることができるからである。
具体例として、以下の方法を用いることができる。
(1)基盤や溶液中に存在する抗原(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に蛍光標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
(2)基盤や溶液中にハプテンを修飾した抗原(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に、蛍光標識した抗ハプテン抗体を結合させ検出を行う方法。
(3)基盤や溶液中にビオチンを修飾した抗原(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に、蛍光標識したアビジンを結合させ検出を行う方法。
(4)基盤や溶液中に存在する抗原(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に抗体を結合させ、さらにその抗体と特異的に結合する蛍光色素を標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
(5)基盤や溶液中に存在する抗原(タンパク質、多糖類、核酸)にハプテンを修飾した抗体を結合させ、さらにそのハプテンと特異的に結合する蛍光色素を標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
(6)基盤や溶液中に存在する抗原(タンパク質、多糖類、核酸)にビオチンを修飾した抗体を結合させ、さらにそのビオチンと特異的に結合する蛍光色素を標識したアビジンを結合させ検出を行う方法。
(7)基盤や溶液中に存在する抗原(タンパク質、多糖類、核酸)にTag(ヒスチジンなど)を導入し、蛍光色素で標識した抗Tag抗体で検出を行う方法。
(8)蛍光色素で標識したタンパク質に抗体を結合させ、基盤や溶液中に存在する抗原(タンパク質、多糖類、核酸)と結合させて検出を行う方法。
これらの標識物は、免疫染色、ELISA、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等の各種の測定手法に使用することができる。
さらに、具体例を説明すると、例えば、図1に示すように、IgG抗体をペプシンで処理するとF(ab’)2と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとFab’と呼ばれるフラグメントが得られる。Fab’フラグメントは1つもしくは2つのチオール基(-SH)を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、図2に示すように、マレイミド基を導入した蛍光色素をフラグメントのチオール基と反応させることにより、蛍光色素で抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性(抗原捕捉能)を失うことがない。また、アルブミン(BSA)等のタンパク質に蛍光色素と抗体を結合させる方法では、タンパク質に2分子以上の蛍光色素を導入することができるので、抗原と結合させると、より高感度で検出することが可能となる。
合成例1.
有機EL色素として、1, 2, 5,-オキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジン誘導体を用いた。
以下に、スペーサー部を導入したオキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジンの活性エステル体の反応例(スキーム2と3)を示す。なお、スペーサー部を有しない活性エステル体をEL-OSu、スペーサー部を導入した活性エステル体をEL-OSu-Spと略す。
(合成手順)
(1)ジケトン誘導体(2)の合成
500mL三口フラスコに4-メトキシアセトフェノン(1)37.5 g (0.25 mol)、亜硝酸ナトリウム0.15 gを酢酸100 mLに溶解した。水浴中、HNO3 100 mLを酢酸100 mLに溶解したものを2時間かけて滴下した。その後、室温で2日間撹拌した。反応混合物を500mLの水にゆっくりと入れ、沈殿を生成させた。沈殿物は濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を飽和重曹水で洗浄し、10% NaCl 水溶液で2回洗浄した。MgSO4で脱水した後、減圧下、クロロホルムを留去し、オキサジアゾール-N-オキサイド(2)を34.5 g (収率78%)で得た。
500mL三口フラスコにオキサジアゾール-N-オキサイド(2)17.7 g (0.05 mol)をアセトニトリル400 mLに溶解した。それにZn 12.0 g、AcOH 7 mL、Ac2O 20mLを添加した。水浴中で反応温度が30℃を超えないように冷却した。12時間撹拌して反応終点とした。反応混合物を濾過し、不溶分を除去した。アセトニトリルを減圧下留去して残渣を得た。残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾール-N-オキサイド(3)を10.2 g (収率60%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾール-N-オキサイド(3)15.6 g (0.046 mol)をブタノール300 mLに溶解した。そこへグリシンエチルエステル塩酸塩 32.0 g (0.23 mol)を添加した。24時間加熱還流を行った。ブタノールを減圧下留去し、残渣を得た。残渣を200mLのクロロホルムに溶解し、10% HCl、飽和NaHCO3、10%NaClで洗浄した。MgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)を13.0 g (収率 70%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)3.0 g (0.007 mol)を200 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.62 g (0.01 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を200 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水-エタノール (1:1)で再結晶し、2.1 g (収率 81%)のオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)を得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)1.0 g (0.0026 mol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.30 g (0.0026 mol)をDMF 20mLに溶解した。これにN, N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.54 g (0.0026 mol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)を0.76 g (収率62%)得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とアラニン18.8 mg (0.21 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(7)を83 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(7)70 mg (0.16 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド18.0 mg (0.16 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド 32.2 mg (0.16 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(8)を75.8 mg (収率89%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にシステイン酸を用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をシステイン酸と反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(9)を合成した。その後、カルボン酸体(9)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(10)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(9)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とシステイン酸 39 mg (0.23 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(9)を98 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(9) 80 mg (0.15 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(10)を73 mg (収率 78%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にセリンを用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(11)を合成した。その後、カルボン酸体(11)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(12)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(11)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とセリン26 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(12)を 79 mg (収率 81%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(11) 70 mg (0.15mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(12)を 61 mg (収率 72%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にペプチドリンカーとしてアラニルセリン(Ala-Ser)を用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をアラニルセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(13)を合成した。その後、カルボン酸体(13)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(14)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(13)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とアラニルセリン 45 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=6:4)で単離精製し、カルボン酸体(13)を72 mg (収率64%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(13) 60 mg (0.11 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 14 mg (0.12 mmol)をDMF 15mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド 25 mg (0.12 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で15時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=8:2)で単離精製し、活性エステル体(14)を60 mg (収率 86%)得た。
(標識手順)
6.5 mg/ml のGFP 抗体(SIGMA #G6539)溶液300 μl を、マイクロコンYM-50 を用いて0.2 M sodium bicarbonate(pH 9.0)にバッファー交換した。オキサジアゾロピリジン活性エステル体EL-Osu 6 を10 mg/ml のDMSO 溶液として調製し、これを25μl 加えて室温で2時間撹拌した。NAP-10 カラムをPBS (pH 7.4)で平衡化した後、反応溶液を添加し、活性エステル体EL-Osu 6 で標識した抗体を含むフラクションをエッペンドルフチューブに集めた(約1ml)。
His-Tag 付きEGFP(大腸菌より発現させた緑色蛍光蛋白質)溶液(in PBS pH 7.4)をニッケルタイタープレート(96 穴)に各ウェルに100μl ずつ分注し、室温で2時間静置した後、各ウェルをPBST buffer(PBSに0.05%のTween-20を添加したバッファー) 100 μl で3回洗浄(プレートウォッシャー使用)してEGFP をプレートに固定化した。その後、オキサジアゾロピリジンの活性エステル体EL-Osu 6 で修飾したGFP抗体溶液(20 μg/ml, 2 μg/ml, 200 ng/ml, 20 ng/ml)を各ウェルに100 μl ずつ分注し、37 ℃で2 時間静置した後、各ウェルをPBST buffer 100 μl で3 回洗浄(プレートウォッシャー使用)した。最後にプレートリーダーによりプレートの蛍光測定を行った。蛍光測定は、励起波長400 nm、蛍光波長530 nmで行い、フィルターは515 nmを用いた。
活性試験の結果を図3に示す。EL-Osuで標識したGFP抗体はその濃度が2ng/100μLであっても、EGFPを検出することができた。
蛍光色素に、Cy3色素を用いた以外は、実施例1と同様の方法により、修飾抗体の活性評価を行った。EGPTを検出するには、蛍光標識したGFP抗体の濃度が 2 ng/100μL 程度が必要であった。
(標識手順1:蛍光色素による標識)
BSA(Bovine Serium Albumin)のリシン残基のアミノ基とスペーサー部を含むオキサジアゾロピリジンの活性エステル体EL-OSu-Sp 8を反応させてアミド結合を形成させて、BSAへの色素標識を行った。具体的には、BSA 1.0 mg (15.05 nmol)を含む炭酸buffer(pH9.0) 100 μlに、活性エステル体35.82 μg(75.25 nmol)を含むDMSO溶液400μl加えて室温で24時間振盪した。その後全量が1 mlになるように0.1 M TEAA buffer(pH7.0)を加え、NAP-10カラム(GE healthcare Sephadex G-25)を用いてBSAに由来する成分を1.5 ml分取した。得られた溶液100μlを逆相HPLCにより分析した。
HPLC装置には、日本分光(株)製の LC-2000plus シリーズを用いた。
カラム:GL Science Inertsil ODS-3 Column 5μm、4.6 mm×250 mm
DNAグラジエント条件
Eluting solvent A: 0.1M TFA水溶液(pH7.0)
Eluting solvent B: 90% CH3CN/0.1M TFA水溶液 (pH7.0)
Gradient (B%) 0 min(5%)→20 min(50%)→60 min(70%)→70 min(100%)→80 min(100%)→90 min(5%)
流速 0 min→20 min, 60 min→90 min :1 mL/min、20 min→60 min :0.5 mL/min
温度 40℃
スペーサー部を有しないEL-OSuとスペーサー部を有するEL-OSu-Spを用いて標識したBSAのHPLCの結果を、それぞれ図5Aと5Bに示す。標識率を表1に示す。
上記の標識手順1で調製した蛍光色素導入BSAを、実施例1と同様の方法によりGFP 抗体に結合させて標識抗体を調製した。
実施例1と同様の方法を用いて行った。
実施例1の場合と同様に、EL-Osuで標識したGFP抗体はその濃度が2ng/100μLであっても、EGFPを検出することができた。
有機EL色素に合成例2で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体EL-Osu-Sp 10を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例2と同様の方法により蛍光色素をBSAへ導入した。抗体との結合及び標識抗体の活性評価は、実施例1と同様の方法により行った。
蛍光色素の標識率については実施例2の場合と同様の高い標識率で得られた。さらに、標識抗体の活性についても、実施例1の場合と同様に、EL-Osu-Sp 10で標識したGFP抗体はその濃度が2ng/100μLであっても、EGFPを検出することができた。なお、実施例2では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。
有機EL色素に合成例3で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体EL-Osu-Sp 12を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例2と同様の方法により蛍光色素をBSAへ導入した。抗体との結合及び標識抗体の活性評価は、実施例1と同様の方法により行った。
蛍光色素の標識率については実施例2の場合と同様の高い標識率で得られた。さらに、標識抗体の活性についても、実施例1の場合と同様に、EL-Osu-Sp 12で標識したGFP抗体はその濃度が2ng/100μLであっても、EGFPを検出することができた。なお、実施例2の場合と同様に、本実施例の蛍光色素も優れた水溶性を示した。
有機EL色素に合成例4で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体EL-Osu-Sp 14を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例2と同様の方法により蛍光色素をBSAへ導入した。
蛍光色素の標識率については実施例2の場合と同様の高い標識率で得られた。さらに、標識抗体の活性についても、実施例1の場合と同様に、EL-Osu-Sp 14で標識したGFP抗体はその濃度が2ng/100μLであっても、EGFPを検出することができた。なお、実施例2の場合と同様に、本実施例の蛍光色素も優れた水溶性を示した。
Claims (6)
- 少なくとも、抗体と、該抗体を標識する蛍光色素とを含む診断薬であって、
該蛍光色素が、有機EL色素から成る発色部と、上記抗体と結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有し、
該有機EL色素が、以下の一般式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)又は(8)のいずれか1種で示される縮合多環化合物であり、
該スペーサー部が、-(CH 2 )p-CONH-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-COO-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CH(-R'-SO 3 H)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CH(-R'-N + H 3 )-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CH(-R'-COOH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CH(-R'-OH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-(O-CH-)n-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CONH(-R'-SO 3 H)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CONH(-R'-SO 3 H)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CONH(-R'-N + H 3 )-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CONH(-R'-OH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-CONH(-R'-COOH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-COO-R'(-SO 3 H)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-COO-R'(-OH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-COO-R'(-N + H 3 )-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-COO-R'(-COOH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-Ar-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-(Ar-COO)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-(Ar-SO 3 H)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-(Ar-N + H 3 )-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-(Ar-OH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-(Ar-COOH)-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-C≡C-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-C=C-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-NR-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-O-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-S-(CH 2 )q-、-(CH 2 )p-HN-C(=NH)-NH-(CH 2 )q-、または-(CH 2 )p-CO-Ar-NR-(CH 2 )q-であり、R'は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基またはアルケニル基、あるいは芳香族炭化水素基であり、Arはスルホニル基で置換されてもよいフェニレン基またはナフチル基であり、pとqはそれぞれ独立に0から5の整数であり、p+q≧1である、診断薬。
(一般式(4)、(5)、(6)、(7)又は(8)の式中、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1はスペーサー部と直接結合を示し、R2、R3、R4、R5は同じでも異なっていても良く、R'、R''は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-、CF3SO3 -、BF4 -又はPF6 -を示す。) - 上記のR2とR3が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された1種である請求項1記載の診断薬。
- 上記のR2とR3が、スルホニル基を有するアリール基である請求項2記載の診断薬。
- 上記結合部が、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種の反応性基を有する請求項1から3のいずれか一つに記載の診断薬。
- 少なくとも、抗体と、該抗体を標識する蛍光色素とを含み、該蛍光色素が、有機EL色素から成る発色部と、上記抗体と結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する請求項1記載の診断薬を用いて被検体中の抗原を検出する測定方法であって、蛍光色素で標識された抗体を抗原と反応させ、該蛍光色素からの蛍光を測定する測定方法。
- 少なくとも、抗体と、該抗体を標識する蛍光色素とを含み、該蛍光色素が、有機EL色素から成る発色部と、上記抗体と結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する請求項1記載の診断薬の製造方法であって、蛍光色素と抗体との間に、アミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合及びグアニジン結合からなる群から選択された少なくとも1種の結合を形成させる工程を含む診断薬の製造方法。
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