JP2023132075A - Ｌ－ビオチン測定用試薬、ｌ－ビオチンを含む試料の測定方法、ｌ－ビオチン標識された物質の標識数の決定方法、及び光学異性アビジン類が固定化された固相の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料中のＬ－ビオチンの測定を可能にする手段を提供することを課題とする。【解決手段】光学異性アビジン類と、下記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体とを含む、Ｌ－ビオチン測定用試薬により、上記の課題を解決する。JPEG2023132075000018.jpg42169(式中、R1～R10は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、非置換又は置換基を有するＣ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基、非置換又は置換基を有するＣ１～Ｃ６アルキル基、及び、非置換又は置換基を有するＣ１～Ｃ６アルコキシ基からなる群より選択される基であり、ただし、R1～R5の少なくとも１つは、ヒドロキシ基、又は、非置換もしくは置換基を有するＣ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基であり、且つR6～R10の少なくとも１つは、カルボキシ基である)【選択図】図２
Description
本発明は、Ｌ－ビオチン測定用試薬に関する。本発明は、Ｌ－ビオチンを含む試料の測定方法に関する。本発明は、Ｌ－ビオチン標識された物質の標識数の決定方法に関する。本発明は、光学異性アビジン類が固定化された固相の製造方法に関する。
アビジン及びストレプトアビジンは、Ｄ－ビオチンと非常に高い親和性を有するので、従来、免疫学的測定によく利用される。例えば、Ｄ－ビオチン標識された抗体と、アビジンを固定化した固相とを用いて生体試料中の標的物質を測定する場合、当該抗体により捕捉された標的物質は、Ｄ－ビオチンとアビジンとの結合を介して固相上に固定される。この固相上の標的物質を、例えば化学発光法を利用して検出することにより、標的物質を高感度に測定できる。
Ｄ－ビオチン標識された抗体を用いる免疫学的測定では、１分子の抗体に結合したＤ－ビオチンの数が測定結果に影響する。そのため、抗体に結合したＤ－ビオチンを定量することが必要となる。例えば、非特許文献１には、抗体などタンパク質に結合したＤ－ビオチンや遊離のＤ－ビオチンを測定可能なビオチン定量キットが記載されている。このキットは、4’-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸(以下、「HABA」とも呼ぶ)とアビジンとの混合物を含む試薬を備える。このキットは、HABAとアビジンとが結合して中心波長500 nmの光吸収を有する複合体を形成すること、及び、当該複合体中のHABAがＤ－ビオチンと容易に置換して500 nmの吸収が低下することを利用している。吸収の低下の程度は、試料中のビオチン濃度に依存するので、当該キットを用いるビオチンの測定方法では、ビオチン濃度を500 nmでの吸光度に基づいて測定する。このようなビオチンの測定方法は、HABA法とも呼ばれる。
Pierce(商標) Biotin Quantitation Kit(製品番号：28005)の取扱説明書, Thermo Fisher Scientific社
血液などの生体試料では、ビオチン含有サプリメントの摂取などにより、遊離のＤ－ビオチンが生体試料中に高濃度で含まれることがある。生体試料中の遊離のＤ－ビオチンは、Ｄ－ビオチン標識された抗体と競合して測定結果に影響を及ぼすことがある。そのような問題を解決するため、本発明者らは、Ｄ－ビオチンの光学異性体であるＬ－ビオチンで標識した捕捉体と、Ｄ－ビオチンと実質的に結合せず、Ｌ－ビオチンに結合する光学異性アビジン類を固定化した固相とを用いる免疫学的測定法を開発した。一方、当該測定法においても、１分子の捕捉体に結合するＬ－ビオチンの数を管理する必要がある。しかし、タンパク質などに結合したＬ－ビオチンや遊離のＬ－ビオチンを測定可能な方法や試薬は知られていない。非特許文献１に記載の試薬キットも、Ｄ－ビオチンの測定は可能であるが、Ｌ－ビオチンの測定はできない。よって、本発明は、Ｌ－ビオチンの測定を可能にする手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、光学異性アビジン類とHABAとを含む試薬により、HABA法と同様にして試料中のＬ－ビオチンを測定できることを見出して、本発明を完成した。よって、本発明は、光学異性アビジン類と、下記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体とを含む、Ｌ－ビオチン測定用試薬を提供する。
ただし、R1～R5の少なくとも１つは、ヒドロキシ基、又は、非置換もしくは置換基を有するＣ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基であり、且つR6～R10の少なくとも１つは、カルボキシ基である)
本発明は、Ｌ－ビオチンを含む試料と、上記のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、測定試料の吸光度を測定する工程とを含み、吸光度の測定値が、試料におけるＬ－ビオチンの濃度の指標となる、Ｌ－ビオチンを含む試料の測定方法を提供する。
本発明は、Ｌ－ビオチン標識された物質を含む試料と、上記のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、測定試料の吸光度を測定する工程と、吸光度の測定値に基づいて、試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する工程と、試料におけるＬ－ビオチンの濃度及び物質の濃度に基づいて、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する工程とを含む、Ｌ－ビオチン標識された物質の標識数の決定方法を提供する。
本発明は、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを含む液体から分取された試料と、上記のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、測定試料の吸光度を測定する工程と、吸光度の測定値に基づいて、測定試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する工程と、Ｌ－ビオチンの濃度及びポリペプチドの濃度に基づいて、試料におけるＬ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する工程と、Ｌ－ビオチン基の数が所定の範囲内であったとき、液体と、ポリペプチドと結合可能な固相とを接触して、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを固相上に固定化する工程と、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが固定化された固相と、光学異性アビジン類とを接触して、光学異性アビジン類を固相上に固定化する工程とを含む、光学異性アビジン類が固定化された固相の製造方法を提供する。
本発明によれば、試料中のＬ－ビオチンを測定可能な手段が提供される。
本実施形態のＬ－ビオチン測定用試薬(以下、「本実施形態の試薬」ともいう)は、光学異性アビジン類と、上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体とを含む。本実施形態の試薬は、HABA法と同様の原理により、Ｌ－ビオチンの測定を可能とする。また、本実施形態の試薬に含まれる光学異性アビジン類は、Ｌ－ビオチンと結合するが、Ｄ－ビオチンとは実質的に結合しない。そのため、試料にＤ－ビオチンが混入していても、Ｌ－ビオチンの測定結果への影響は抑えられる。
本明細書において「アビジン類」は、アビジン及びその類縁体を包含する。アビジン及びその類縁体は、ビオチン類と高い親和性を有するポリペプチドである。本明細書において「ポリペプチド」は、タンパク質及びその断片を包含する。アビジン類は、脱グリコシル化されたポリペプチドであってもよい。脱グリコシル化アビジン類としては、例えばニュートラアビジンが挙げられる。ニュートラアビジンは、脱グリコシル化されたアビジンである。
本明細書において「ビオチン類」は、ビオチンとその類縁体及びそれらの光学異性体を包含する。ビオチンの類縁体としては、例えばデスチオビオチン、ビオシチンなどが挙げられる。ビオチン及びその類縁体には、それぞれ光学異性体が存在する。例えばビオチンは、理論上８種類の光学異性体が存在する。本明細書において「Ｌ－ビオチン」は、遊離の3aR,4R,6aS-L-ビオチン、及び任意の物質に付加された3aR,4R,6aS-L-ビオチン基を包含する。また、「Ｄ－ビオチン」は、遊離の3aS,4S,6aR-D-ビオチン、及び任意の物質に付加された3aS,4S,6aR-D-ビオチン基を包含する。「ビオチン基」は、ビオチン類の化学構造のうち、少なくともイミダゾリジン環を含む複素環部分をいう。
アビジンの類縁体としては、例えばストレプトアビジン、タモギタケ由来アビジン様タンパク質、ブラダビジン、リザビジンなどが挙げられる。本明細書において、アビジンの類縁体は、アビジン類のキメラ体及び改変体を包含する。キメラ体は、複数種類のアビジン類のそれぞれを構成するポリペプチドの全部又は一部を融合した改変ポリペプチドをいう。改変体は、所定のアビジン類のアミノ酸配列に少なくとも１アミノ酸残基の置換、欠失又は付加がされたアミノ酸配列で表される改変ポリペプチドをいう。改変体のアミノ酸配列は、元のアビジン類のアミノ酸配列と比較して、90％以上、好ましくは95％、より好ましくは99％の配列同一性を有するポリペプチドである。
本明細書において、アビジンの類縁体は、光学異性アビジン類を包含する。一般に、天然に見られるアビジン類はＬ型アビジン類である。本明細書において「Ｌ型アビジン類」とは、アビジン類のうち、グリシン以外のアミノ酸残基がＬ－アミノ酸残基からなり、Ｄ－ビオチンと結合し、Ｌ－ビオチンとは実質的に結合しないポリペプチドをいう。本明細書において「光学異性アビジン類」とは、Ｌ型アビジン類の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であり、Ｌ－ビオチンと結合し、Ｄ－ビオチンと実質的に結合しないポリペプチドをいう。すなわち、光学異性アビジン類は、Ｌ型アビジン類と同じアミノ酸配列を含むが、そのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを構成するアミノ酸残基の90％以上はＤ－アミノ酸残基である。以下、所定のＬ型アビジン類に対応する光学異性アビジン類を「Ｄ型ポリペプチド」とも呼ぶ。本明細書において、アミノ酸残基の「Ｄ－」及び「Ｌ－」との表記は、DL表示法に基づく。
光学異性アビジン類は、Ｌ型アビジン類のアミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90%以上、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は全てがＤ－アミノ酸残基であり得る。好ましい実施形態では、光学異性アビジン類は、Ｌ型アビジン類のアミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基からなる。
アビジン類は、ビオチン類との結合部位を有する。アビジン類におけるビオチン類との結合部位を構成するポリペプチドのアミノ酸配列を、以下、「コア配列」とも呼ぶ。好ましい実施形態では、光学異性アビジン類は、少なくともＬ型アビジン類のコア配列を有し、そのコア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基である。すなわち、光学異性アビジン類におけるＬ－ビオチンとの結合部位は、Ｌ型アビジン類のコア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドから構成される。コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であることにより、光学異性アビジン類におけるＬ－ビオチンとの結合部位の立体構造は、Ｌ型アビジン類におけるＤ－ビオチンとの結合部位に対して鏡像異性の状態であると考えられる。そのため、光学異性アビジン類は、Ｄ－ビオチンと実質的に結合せず、Ｌ－ビオチンに高い親和性を有すると考えられる。
光学異性アビジン類は、少なくともＬ型アビジン類のコア配列を有し、そのコア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％がＤ－アミノ酸残基であり得るか、又はコア配列のグリシン以外のアミノ酸残基の全てがＤ－アミノ酸残基であり得る。好ましい実施形態では、光学異性アビジン類は、少なくともＬ型アビジン類のコア配列を有し、そのコア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基からなる。
光学異性アビジン類としては、Ｄ型ポリペプチドであって、例えばストレプトアビジン、アビジン、タモギタケ由来アビジン様タンパク質、ブラダビジン、ザビジンなどのＬ型アビジン類、並びにこれらのキメラ体及び改変体に対応するＤ型ポリペプチドが挙げられる。「対応するＤ型ポリペプチド」とは、前述のＬ型アビジン類並びにそのキメラ体及び改変体の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であり、Ｌ－ビオチンと結合し、Ｄ－ビオチンと実質的に結合しないＤ型ポリペプチドをいう。ストレプトアビジンに対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性ストレプトアビジン」と呼ぶ)は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも19番目～133番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。配列番号１のアミノ酸配列は、ストレプトアビジンのアミノ酸配列である。好ましくは、光学異性ストレプトアビジンは、配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも13番目～133番目からなる部分配列を含み、当該部分配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。より好ましくは、光学異性ストレプトアビジンは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
アビジンに対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性アビジン」と呼ぶ)は、配列番号２のアミノ酸配列のうち、少なくとも２番目～128番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。配列番号２のアミノ酸配列は、アビジンのアミノ酸配列である。好ましくは、光学異性アビジンは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
タモギタケ由来アビジン様タンパク質として、例えばタマビジン(登録商標)が挙げられる。タマビジン(登録商標)は、タモギタケから発見されたＬ型アビジン類であり、ビオチンに対する高い親和性、及びアビジンよりも優れた熱安定性を有する(国際公開第2002/072817号参照)。タマビジン(登録商標)に対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性タマビジン」と呼ぶ)は、配列番号３のアミノ酸配列のうち、少なくとも４番目～129番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。配列番号３のアミノ酸配列は、タマビジン(登録商標)１のアミノ酸配列である。好ましくは、光学異性アビジンは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
あるいは、光学異性タマビジンは、配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも４番目～127番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドでもよい。配列番号４のアミノ酸配列は、タマビジン(登録商標)２のアミノ酸配列である。好ましくは、光学異性アビジンは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
ストレプトアビジン改変体の一例として、Qureshi MH.ら, J.Biol.Chem., vol.276, No.49, pp.46422-46428, 2001に記載の改変体(以下、「ストレプトアビジン改変体１」という)が挙げられる。ストレプトアビジン改変体１のアミノ酸配列(配列番号５)は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、S45A、T90A及びD128Aの置換を有する。ストレプトアビジン改変体１に対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性ストレプトアビジン改変体１」と呼ぶ)は、配列番号５のアミノ酸配列のうち、少なくとも19番目～133番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体１は、配列番号５のアミノ酸配列のうち、少なくとも13番目～133番目からなる部分配列を含み、当該部分配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。より好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体１は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
ストレプトアビジン改変体の他の例として、Wu SC.及びWong SL., J.Biol.Chem., vol.280, No.24, pp.23225-23231, 2005に記載の改変体(以下、「ストレプトアビジン改変体２」という)が挙げられる。ストレプトアビジン改変体２のアミノ酸配列(配列番号６)は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、V55T、T76R、L109T及びV125Rの置換を有する。ストレプトアビジン改変体２に対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性ストレプトアビジン改変体２」と呼ぶ)は、配列番号６のアミノ酸配列のうち、少なくとも19番目～133番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体２は、配列番号６のアミノ酸配列のうち、少なくとも13番目～133番目からなる部分配列を含み、当該部分配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。より好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
ストレプトアビジン改変体の他の例として、Lim KH.ら, Biotech.Bioeng., vol.110, No.1, pp.57-67, 2013に記載の改変体(以下、「ストレプトアビジン改変体３」という)が挙げられる。ストレプトアビジン改変体３に対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性ストレプトアビジン改変体３」と呼ぶ)は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。配列番号７のアミノ酸配列は、ストレプトアビジン改変体３のアミノ酸配列である。
ストレプトアビジン改変体の他の例として、Sano T.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.94, pp.6153-6158, 1997に記載の改変体(以下、「ストレプトアビジン改変体４」という)が挙げられる。ストレプトアビジン改変体４のアミノ酸配列(配列番号８)は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、H127Dの置換及びG113からW120までの欠失を有する。ストレプトアビジン改変体４に対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性ストレプトアビジン改変体４」と呼ぶ)は、配列番号８のアミノ酸配列のうち、少なくとも19番目～125番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体４は、配列番号８のアミノ酸配列のうち、少なくとも13番目～125番目、少なくとも19～131番目又は少なくとも13番目～131番目からなる部分配列を含み、当該部分配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。より好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体２は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
ストレプトアビジン改変体の他の例として、国際公開第2006/058226号に記載の改変体(以下、「ストレプトアビジン改変体５」という)が挙げられる。ストレプトアビジン改変体５に対応するＤ型ポリペプチド(以下、「光学異性ストレプトアビジン改変体５」と呼ぶ)は、配列番号９のアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目～20番目、35番目～196番目及び213番目～261番目からなるコア配列を含み、当該コア配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。配列番号９のアミノ酸配列は、ストレプトアビジン改変体５のアミノ酸配列である。好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体５は、配列番号９のアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目～24番目、29～202番目及び207番目～261番目からなる部分配列を含み、当該部分配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。より好ましくは、光学異性ストレプトアビジン改変体５は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であるポリペプチドである。
光学異性アビジン類を含め、アビジン類は一般に、複数のサブユニットから構成される多量体の形態で存在する。多量体は、例えば二量体、四量体又は八量体であり得る。多量体は、所定のアビジン類の複数分子のポリペプチドが会合することにより形成される。例えば、本実施形態の試薬が光学異性アビジン又は光学異性ストレプトアビジンを含む場合、当該試薬中には、四量体の光学異性アビジン又は光学異性ストレプトアビジンが存在し得る。四量体の光学異性アビジン又は光学異性ストレプトアビジンは、４つのＬ－ビオチンと結合できる。
光学異性アビジン類は、公知のポリペプチドの合成方法により製造できる。ペプチドの合成方法は、特に限定されないが、例えば液相合成、固相合成、人工tRNAを用いた無細胞系による合成などが挙げられる。また生産物のポリペプチドのアミノ酸残基数が一定数以上(一般に30残基以上)の場合、２以上のペプチド断片を合成した後に公知のライゲーション反応を用いて、ポリペプチドを連結することで製造できる。
光学異性アビジン類は、例えば、以下の固相合成法によって合成できる。
(1) 保護基を用いて、アミノ基の窒素原子を保護した１残基目のアミノ酸のカルボキシ基を樹脂に結合させる。
(2) 上記(1)の結合反応により得られた反応物の保護基を、脱保護剤を用いて脱離した後、溶媒にて洗浄し遊離アミノ酸を形成させる。
(3) 上記(2)で得られた遊離アミノ酸と、保護基によりアミノ基を保護した任意のアミノ酸とを、縮合剤を用いて縮合させる。
(4) 上記(3)の生成物の保護基を、脱保護剤を用いて脱離して、遊離アミノ酸を形成させる。
(5) 上記(2)から(4)の工程を繰り返すことにより、Ｃ末端に樹脂が結合した任意のアミノ酸が連結したポリペプチドを得ることができる。
(6) 上記(5)の工程後の任意の時点、及び所望のポリペプチドが結合した樹脂を製造した時点で溶媒を用いて洗浄する。
(7) 上記(6)で洗浄した前記樹脂が結合したポリペプチドを保護基によって、Ｎ末端アミノ基を保護した後、酸を用いて樹脂を切断することで、保護基が結合した任意のポリペプチドを得ることができる。
(1) 保護基を用いて、アミノ基の窒素原子を保護した１残基目のアミノ酸のカルボキシ基を樹脂に結合させる。
(2) 上記(1)の結合反応により得られた反応物の保護基を、脱保護剤を用いて脱離した後、溶媒にて洗浄し遊離アミノ酸を形成させる。
(3) 上記(2)で得られた遊離アミノ酸と、保護基によりアミノ基を保護した任意のアミノ酸とを、縮合剤を用いて縮合させる。
(4) 上記(3)の生成物の保護基を、脱保護剤を用いて脱離して、遊離アミノ酸を形成させる。
(5) 上記(2)から(4)の工程を繰り返すことにより、Ｃ末端に樹脂が結合した任意のアミノ酸が連結したポリペプチドを得ることができる。
(6) 上記(5)の工程後の任意の時点、及び所望のポリペプチドが結合した樹脂を製造した時点で溶媒を用いて洗浄する。
(7) 上記(6)で洗浄した前記樹脂が結合したポリペプチドを保護基によって、Ｎ末端アミノ基を保護した後、酸を用いて樹脂を切断することで、保護基が結合した任意のポリペプチドを得ることができる。
上記(1)において使用する樹脂としては、固相合成法で使用される公知の樹脂であればよい。Ｃ末端をアミド基として供給する樹脂としては、例えば、アミノ基で官能化されたRink-Amide-レジン(Merck KGaA製)、Rink-Amide-PEGA-レジン(Merck KGaA製)及び、Fmoc-NH-SAL-レジン(渡辺化学工業製)を用いることが好ましい。また、アミノ基で官能化されたAMINO-PEGA-レジン(Merck KGaA製)などにFmoc-NH-SAL-レジン-リンカー(渡辺化学工業製)などを結合させてもよい。
また、Ｃ末端をカルボン酸にする場合の樹脂としては、例えば、塩素で官能化された２－クロロトリチルクロリド樹脂(Merck KGaA製)や、アミノ基で官能化されたAMINO-PEGA-レジン(Merck KGaA製)、ヒドロキシ基を有するNovaSyn TGTアルコール樹脂(Merck KGaA製)、Wang-レジン(Merck KGaA製)、HMPA-PEGA-レジン(Merck KGaA製)などを用いることができる。また、AMINO-PEGA-レジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸(HMPA)、4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)-ブチル酢酸(HMPB)などが挙げられる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したH-Cys(Trt)-TritylNovaPEG樹脂(Merck KGaA製)などを用いることができる
ヒドロキシ基を有する樹脂又は塩素で官能化された樹脂を使用する場合、樹脂とアミノ基の窒素原子が保護基により保護されたアミノ酸との結合はアミノ酸のカルボキシル基を樹脂へとエステル結合により結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合、該アミノ酸のカルボキシル基を樹脂へとアミド結合により結合させる。
保護基としては公知の保護基であればよく、例えば、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)基、ベンジル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基などの、カーボネート系又はアミド系の保護基を用いることができる。アミノ酸に保護基を導入する場合、例えばFmoc基を導入する際には、9-フルオレニルメトキシカルボニル-N-スクシニミジルカーボネートと炭酸ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入することができる。反応温度は０～50℃、好ましくは室温であり、反応時間は１～５時間、好ましくは３時間である。
保護基を用いてアミノ基の窒素原子を保護したアミノ酸としては、市販のアミノ酸を用いてもよい。例えば、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-AIa-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-SeMet-OH、Fmoc-3-(メチルセレノ)-Ala-OHが挙げられる。
また、保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したアミノ酸を用いてもよい。例えば、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Sec(Trt)-OH、Fmoc-Sec(pMeOBzl)-OH、Fmoc-Sec(pMeBzl)-OH、Fmoc-HomoSec(pMeBzl)-OH、Fmoc-HomoSec(Mob)-OHを挙げられる。
ヒドロキシ基を有する樹脂を用いる場合、例えば、HMPB樹脂であれば、エステル化触媒として用いることができる。その際、脱水縮合剤は、1-メシチレンスルホニル-3-ニトロ-1，2，4-トリアゾール(MSNT)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)などの公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、アミノ酸１当量に対して、脱水縮合剤が、通常１～10当量、好ましくは１～５当量である。
エステル化反応は、例えば、固相カラムに樹脂を供し、溶媒で洗浄し、アミノ酸溶液を加えることにより行うことが好ましい。洗浄用溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、2-プロパノール、ジクロロメタン(DCM)などが挙げられる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)、DMF、DCMなどが挙げられる。エステル化反応の反応温度は０～50℃、好ましくは室温である。反応時間は10分間～30時間、好ましくは15分間～24時間である。このとき、固相上の未反応の官能基を、無水酢酸などを用いてアセチル化してキャッピングすることが好ましい。
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基での処理により行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリンなどが挙げられる。塩基での処理は、溶媒の存在下で行うことが好ましい。溶媒としては、例えばDMF、DMSO、メタノールなどが挙げられる。
遊離アミノ基と、保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤、塩基及び溶媒の存在下で行うことが好ましい。
活性化剤としては、例えばDIC、DCC、１-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(WSC・HCl)、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)、カルボニルジイミダゾール(CDI)、ジエチルシアノホスホネート(DEPC)、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、ヒドロキシスクシンイミド(HOSu)、ジメチルアミノピリジン(DMAP)、１－ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)、ヒドロキシフタルイミド(HOPht)、ペンタフルオロフェノール(Pfp-OH)、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1，1，3，3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート(HATU)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1，1，3，3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(DHBT)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド(DMT-MM)などが挙げられる。
活性化剤の使用量は、保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～20当量、好ましくは１～10当量、より好ましくは１～５当量である。
塩基としては、アルキル化反応と共存させることができる塩基が好ましい。例えば、N-エチルジイソプロピルアミン(DIPEA)、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU)、DMAP,1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(DABCO)、2,6-ジメチルピリジン、トリエチルアミン(TEA)、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン(DBN)などが挙げることができるが、特に限定されない。
溶媒としては、例えばDMF、DMSO、DCMなどが挙げられる。反応温度は０～50℃、好ましくは室温である。反応時間は10分～30時間、好ましくは15分～24時間である。保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。樹脂からペプチド鎖を切断するには、酸で処理することが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸(TFA)が挙げられる。
２以上のペプチド断片を連結させる公知のライゲーション反応としては、ネイティブ・ケミカル・ライゲーション(NCL法)(Dawson PE.ら, Science, vol.266, pp.776-779, 1994)を利用できる。NCL法はＣ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにした第１のペプチドとＮ末端にシステイン残基を有する第２のペプチドとの化学選択反応であり、システインの側鎖のチオール基(SH基又はスルフヒドリル基ともいう)がチオエステル基のカルボニル炭素に選択的に反応し、チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成する。この中間体は、自発的に分子内転位して、連結部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。
NCL法において、Ｎ末端にシステイン残基を有する第２のペプチドのシステイン結合部位はライゲーション反応後に脱硫反応(Yan LZ.及びDawson PE., J.Am.Chem.Soc., vol.123, pp.526-533, 2001)により、アラニンに置換することもできる。すなわち本来アラニンである部位をシステインに置換して合成を行い、ライゲーション反応の結合部位とすることができる。
ペプチドの合成反応又はライゲーション反応の前後の工程に分離及び/又は精製工程を含んでいてもよい。精製方法は公知の方法を用いればよく、カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。分離精製を所望する対象物に応じて、溶媒、カラムの充填剤、分離対象物及び精製対象物の検出方法、温度条件、圧力条件などは適宜選択できる。
ペプチドの合成反応、ライゲーション反応又は分離及び／又は精製工程の前後に適宜、公知の洗浄、乾燥、希釈、及び濃縮工程などを含んでいてもよい。
ポリペプチドが正しくフォールディングされない場合、リフォールディングすることが好ましい。リフォールディングは、例えば希釈リフォールディング法、透析リフォールディング法、固相リフォールディング法、サイズ排除クロマトグラフィーリフォールディング法、界面活性剤リフォールディング法などにより行うことができる(Arakawa T.及びEjima D., Antibodies, vol.3, pp.232-241, 2014)。
上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体は、光学異性アビジン類のＬ－ビオチンとの結合部位に結合可能な色素である。本実施形態の試薬において光学異性アビジン類が多量体の形態で存在する場合、複数分子のアゾベンゼン誘導体が、光学異性アビジン類の多量体が有するＬ－ビオチンとの結合部位に結合する。アゾベンゼン誘導体と光学異性アビジン類の多量体に結合することにより、本実施形態の試薬中にアゾベンゼン誘導体と光学異性アビジン類との複合体が形成すると考えられる。当該複合体は、上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体の存在により、中性付近のpH(pH6.5～7.5)において波長約400 nm～約600 nmの光吸収を有する。
本明細書において「Ｃ１～Ｃ６アルキル基」は、炭素数が１～６の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素鎖である１価の基をいう。Ｃ１～Ｃ６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、1-プロピル、2-プロピル、1-ブチル、2-メチル-1-プロピル、2-ブチル、2-メチル-2-プロピル(t-ブチル)、1-ペンチル、2-ペンチル、3-ペンチル、2-メチル-2-ブチル、3-メチル-2-ブチル、3-メチル-1-ブチル、2-メチル-1-ブチル、1-ヘキシル、2-ヘキシル、3-ヘキシル、2-メチル-2-ペンチル、3-メチル-2-ペンチル、4-メチル-2-ペンチル、3-メチル-3-ペンチル、2-メチル-3-ペンチル、2,3-ジメチル-2-ブチル、3,3-ジメチル-2-ブチル及びヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基」は、上記のＣ１～Ｃ６アルキルがオキシ基に結合した基である。Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、n-へキシルオキシ基などが挙げられる。
本明細書において「Ｃ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基」は、２つの上記のＣ１～Ｃ６アルキルが、アミノ基の２つの水素原子と置き換わった基を意味する。２つのＣ１～Ｃ６アルキル基は、同一でも異なっていてもよい。Ｃ１～Ｃ６ジアルキルアミノとしては、例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、N,N-ジイソプロピルアミノ、N-メチル-N-エチルアミノ、N-イソプロピル-N-エチルアミノなどが挙げられる。好ましくは、Ｃ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基は、ジメチルアミノ又はジエチルアミノである。
Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基及びＣ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基の置換基はいずれも独立して、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、カルバモイル基、アミノ基及びヒドロキシ基から選択される。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。
好ましい実施形態では、上記の式(I)において、R1～R5のいずれか１つが、ヒドロキシ基、又は、非置換のジメチルアミノ基もしくはジエチルアミノ基であり、且つR6～R10のいずれか１つがカルボキシ基である。
上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体としては、例えばHABA、4’-ヒドロキシアゾベンゼン-4-カルボン酸、4’-ジメチルアミノアゾベンゼン-2-カルボン酸などが挙げられる。これらのアゾベンゼン誘導体をそれぞれ下記の式(II)～(IV)に示す。これらの中でも、HABAが特に好ましい。
上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体は、例えばジアゾカップリング反応など用いる公知の合成方法により得ることができる。あるいは、市販のアゾベンゼン誘導体を用いてもよい。例えば、下記の反応式に示すように、アントラニル酸と亜硝酸ナトリウムとを冷却下で反応させてジアゾニウム塩を生成し、当該ジアゾニウム塩とフェノールとを反応させることにより、HABAを得ることができる。
上記の反応式において、アントラニル酸に代えてp-アミノ安息香酸を用いた場合、4’-ヒドロキシアゾベンゼン-4-カルボン酸を得ることができる。また、上記の反応式において、フェノールに代えてジメチルアニリンを用いた場合、4’-ジメチルアミノアゾベンゼン-2-カルボン酸を得ることができる。
本実施形態の試薬は、光学異性アビジン類と上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体とを適切な溶媒に溶解することにより調製できる。あるいは、本実施形態の試薬は、光学異性アビジン類の溶液と、上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体の溶液とを混合することにより調製できる。溶媒は、中性付近のpH(pH6.5～7.5)を有する水性溶媒が好ましく、例えば水、生理食塩水、中性付近のpHで緩衝作用を有する緩衝液などが挙げられる。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、BES緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液、TES緩衝液などが挙げられる
本実施形態の試薬のpHは、通常6.5以上7.5以下、好ましくは７以上7.5以下である。本実施形態の試薬における光学異性アビジン類の濃度は特に限定されないが、例えば50μg/mL以上2000μg/mL以下、好ましくは100μg/mL以上1000μg/mL以下、より好ましくは200μg/mL以上500μg/mL以下である。本実施形態の試薬における上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体の濃度は特に限定されないが、例えば５μg/mL以上200μg/mL以下、好ましくは10μg/mL以上100μg/mL以下、より好ましくは20μg/mL以上50μg/mL以下である。
本実施形態の試薬は、光学異性アビジン類及び上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体の両方を１つの試薬中に含む一試薬の形態であってもよい。あるいは、本実施形態の試薬は、光学異性アビジン類を含む第１試薬と、上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体を含む第２試薬とを含む二試薬の形態であってもよい。
本実施形態の試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。箱には、試薬の使用方法などを記載した添付文書を同梱していてもよい。図１Ａ及び図１Ｂに、本実施形態の試薬の例を示す。図１Ａを参照して、１０は、一試薬の形態の試薬を示し、１１は、試薬を収容した第１容器を示し、１２は、梱包箱を示し、１３は、添付文書を示す。図１Ｂを参照して、２０は、二試薬の形態の試薬を示し、２１は、第１試薬を収容した第１容器を示し、２２は、第２試薬を収容した第２容器を示し、２３は、梱包箱を示し、２４は、添付文書を示す。
本実施形態の試薬は、光学異性アビジン類及び上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体を固体(粉末、粒子、凍結乾燥品など)の状態で含んでもよい。あるいは、本実施形態の試薬は、光学異性アビジン類及び上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体を溶液の状態で含んでもよい。試薬が二試薬の形態である場合は、光学異性アビジン類及び上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体のいずれか一方が固体の状態であり、残りの一方が溶液の状態であってもよい。好ましくは、光学異性アビジン類及び上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体の両方が溶液の状態である。
本実施形態の試薬は、キャリブレータをさらに含んでもよい。キャリブレータは、所定の濃度でＬ－ビオチンを含む溶液であり、検量線を作成するために用いられる。キャリブレータは、それぞれＬ－ビオチン濃度が異なる複数の溶液からなることが好ましい。また、キャリブレータは、Ｌ－ビオチン濃度が０である溶液、例えばＬ－ビオチンを含まない緩衝液を含むことが好ましい。
本発明の別の実施形態は、Ｌ－ビオチンを含む試料の測定方法である。以下、この方法を「本実施形態の測定方法」ともいう。本実施形態の測定方法では、まず、Ｌ－ビオチンを含む試料と、本実施形態の試薬とを混合して測定試料を調製する。Ｌ－ビオチンを含む試料は、遊離のＬ－ビオチン及び／又は少なくとも１つのＬ－ビオチン基を有する物質を含むかぎり、特に限定されない。本実施形態の測定方法において、Ｌ－ビオチンを含む試料を「被検試料」とも呼ぶ。
少なくとも１つのＬ－ビオチン基を有する物質は、例えばＬ－ビオチン標識された物質であり得る。Ｌ－ビオチン標識された物質においては、Ｌ－ビオチンと物質とが共有結合していることが好ましい。物質は特に限定されず、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖鎖などが挙げられる。好ましいＬ－ビオチン標識された物質は、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドである。ポリペプチドの種類は特に限定されないが、例えば抗体、アルブミン、アルカリホスファターゼなどの酵素などが挙げられる。
本明細書において「抗体」は、抗体断片も包含する。抗体断片としては、例えばFab、Fab'、F(ab')2などが挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよい。抗体の由来は特に限定されず、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ヒトなどのいずれの哺乳動物に由来する抗体であり得る。抗体のアイソタイプはIgG、IgM、IgE、IgAなどのいずれでもよいが、好ましくはIgGである。
Ｌ－ビオチン標識は、例えば、物質とＬ－ビオチン標識試薬とを反応させることにより行うことができる。Ｌ－ビオチン標識試薬は、Ｌ－ビオチンのバレリアン酸側鎖を公知の方法により誘導化して、標識官能基を導入することにより得ることができる。標識官能基は特に限定されないが、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、マレイミド基などが挙げられる。
本実施形態の測定方法は溶液中で行われることが好ましいので、被検試料が液状ではない場合、あらかじめ液状としておくことが好ましい。ここで、「液状」の試料とは、溶質が完全に溶媒に溶解した溶液に限られず、微細な固形物が懸濁した懸濁液、ゾルなども含む。例えば、被検試料が、固体のＬ－ビオチン標識された物質を含む場合、適切な溶媒により当該物質を溶解して液状の試料とすることができる。溶媒は、本実施形態の試薬について述べたことと同様である。
Ｌ－ビオチンを含む試料と本実施形態の試薬との混合量及び試薬の終濃度は、特に限定されず、適宜決定できる。例えば、後述の測定試料の吸光度の測定において、吸光度の値が所定の値より低い場合は、被検試料中のＬ－ビオチン濃度が高いと考えられる。この場合、被検試料を希釈して、希釈した被検試料から測定試料を再び調製することが好ましい。上記の所定の値は適宜決定できるが、例えば、キュベットを用いて吸光度を測定する場合、所定の値は0.3であり得る。また、マイクロプレートを用いて吸光度を測定する場合、所定の値は0.15であり得る。
Ｌ－ビオチンを含む試料と本実施形態の試薬との混合における温度及び時間の条件は、特に限定されない。例えば、混合物を４℃～40℃、好ましくは室温(約20℃)～37℃にて、１分間～60分間、好ましくは５分間～30分間インキュベーションする。インキュベーションの間、混合物は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。
本実施形態の測定方法では、調製した測定試料の吸光度を測定する。具体的には、上記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体を測定可能な波長(例えば極大吸収波長)の吸光度を測定する。そのような波長は、約400 nm～約600 nmの範囲から適宜決定できる。例えば、アゾベンゼン誘導体としてHABAを用いる場合、波長500 nmの吸光度を測定してもよい。また、4’-ヒドロキシアゾベンゼン-4-カルボン酸を用いる場合、波長470 nmの吸光度を測定してもよい。また、4’-ジメチルアミノアゾベンゼン-2-カルボン酸を用いる場合、波長548 nm又は577 nmの吸光度を測定してもよい。
図２を参照して、本実施形態の測定方法の原理を説明する。図２に示される例では、本実施形態の試薬は光学異性アビジン類及びHABAを含み、被検試料はＬ－ビオチン標識されたポリペプチドを含むが、本発明はこの例に限定されない。この試薬においては、光学異性アビジン類の四量体３１とHABA３２との複合体３０が形成されている。複合体３０は、HABA３２の存在により波長500 nmの吸収を有する。本実施形態の試薬と、Ｌ－ビオチン標識されたポリペプチド３３を含む試料とを混合すると、複合体３０とポリペプチド３３とが接触する。この接触により、複合体３０中のHABA３２が、ポリペプチド３３のＬ－ビオチン基と置換して、HABA３２が遊離する。これは、Ｌ－ビオチンの方が、HABAに比べて光学異性アビジン類に対して高い親和性を有するからである。HABA３２が、ポリペプチド３３のＬ－ビオチン基と置換すると、光学異性アビジン類の四量体３１に結合していたHABA３２の一部又は全部がポリペプチド３３によって置換された複合体３４が形成される。複合体３４は、複合体３０に比べて、波長500 nmの吸収が低下する。吸収の低下の程度は、被検試料におけるＬ－ビオチンの濃度に依存する。図２に示される例では、当該濃度は、被検試料中の全てのポリペプチド３３が有するＬ－ビオチン基の数に対応する。そのため、本実施形態の測定方法では、吸光度の測定値が、Ｌ－ビオチンを含む試料におけるＬ－ビオチンの濃度の指標となる。
本実施形態の測定方法では、吸光度の測定値に基づいて、Ｌ－ビオチンを含む試料におけるＬ－ビオチン濃度を測定できる。例えば、遊離のＬ－ビオチンを所定の濃度で含む複数のキャリブレータを、被検試料と同様に測定して、吸光度の測定値とＬ－ビオチン濃度との関係を示す検量線を作成する。得られた検量線を用いて、被検試料の吸光度の測定値から、被検試料中のＬ－ビオチン濃度の値を決定できる。
本発明の別の実施形態は、Ｌ－ビオチン標識された物質の標識数の決定方法である。以下、この方法を「本実施形態の決定方法」ともいう。本明細書において「Ｌ－ビオチン標識された物質の標識数」は、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数をいう。物質やＬ－ビオチン標識試薬の種類によっては、物質にはＬ－ビオチン基が１つ以上付加され得る。例えば、物質が抗体である場合、Ｌ－ビオチン標識抗体１分子当たりのＬ－ビオチン基の数は、Ｌ－ビオチン標識抗体を用いるアッセイの結果に寄与し得る。本実施形態の決定方法によれば、Ｌ－ビオチン標識抗体の品質を管理することが可能となる。
本実施形態の決定方法では、まず、Ｌ－ビオチン標識された物質を含む試料と、本実施形態の試薬とを混合して測定試料を調製する。Ｌ－ビオチン標識された物質及び測定試料の調製の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同様である。本実施形態の決定方法において、Ｌ－ビオチン標識された物質を含む試料を「被検試料」とも呼ぶ。
本実施形態の決定方法では、調製した測定試料の吸光度を測定する。そして、吸光度の測定値に基づいて、被検試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する。吸光度の測定及びＬ－ビオチン濃度の決定の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同様である。ここで、吸光度の測定値に基づいて決定されたＬ－ビオチン濃度は、被検試料中のＬ－ビオチン標識された物質全体が有するＬ－ビオチン基の数に対応する。したがって、決定されたＬ－ビオチン濃度と、被検試料中の物質の濃度との対比により、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定できる。すなわち、本実施形態の決定方法では、被検試料におけるＬ－ビオチンの濃度及び物質の濃度に基づいて、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する。
本実施形態の決定方法は、被検試料における物質の濃度を決定する工程をさらに含んでもよい。物質の濃度を決定する方法は、物質の種類に応じて適宜選択できる。例えば、Ｌ－ビオチン標識された物質が、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドである場合は、公知の総タンパク質の定量方法により、被検試料におけるポリペプチド濃度を決定できる。総タンパク質の定量方法としては、吸光度に基づく定量方法が好ましく、例えば紫外吸光光度法(280 nm法)、BCA法、Bradford法、Lowry法、Pierce(商標) 660 nm Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社)を用いる方法などが挙げられる。また、Ｌ－ビオチン標識された物質が、Ｌ－ビオチン標識ポリヌクレオチドである場合は、公知のポリヌクレオチドの定量方法により、被検試料におけるポリヌクレオチド濃度を決定できる。ポリヌクレオチドの定量方法としては、例えば、260 nm及び280 nmの吸光度に基づく吸光分析法、蛍光色素又は蛍光プローブを用いる蛍光分析法などが挙げられる。
Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数は、物質の分子数に対するＬ－ビオチンの分子数の比に相当する。そのため、被検試料におけるＬ－ビオチンの濃度及び物質の濃度は、モル濃度(単位はmol/L、mol/dm3又はM)であることが好ましい。被検試料における物質の濃度を、吸光度に基づく定量方法で決定した場合、吸光度の値からモル濃度を算出することが好ましい。例えば、濃度既知の物質の標準溶液の吸光度を測定し、当該標準液の吸光度、物質の濃度及び物質の分子量を用いて、被検試料の物質についての吸光度からモル濃度を算出できる。
好ましい実施形態では、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数は、下記の式により算出する。
Ｘ＝Ａ／Ｂ
(式中、Ｘは、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数であり、
Ａは、被検試料におけるＬ－ビオチンのモル濃度であり、
Ｂは、被検試料における物質のモル濃度である)
Ｘ＝Ａ／Ｂ
(式中、Ｘは、Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数であり、
Ａは、被検試料におけるＬ－ビオチンのモル濃度であり、
Ｂは、被検試料における物質のモル濃度である)
本発明の別の実施形態は、光学異性アビジン類が固定化された固相の製造方法である。以下、この方法を「本実施形態の製造方法」ともいう。本実施形態の製造方法では、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを含む液体から分取された試料を用いて、液体におけるＬ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する。そして、決定したＬ－ビオチン基の数が所定の範囲内であったとき、同じ液体を用いて、光学異性アビジン類を固定化した固相を製造する。
図３を参照して、本実施形態の製造方法により製造される固相について説明する。図３に示される例では、固相４０は、球状の粒子であるが、本発明はこれに限定されない。固相４０は、その表面がＬ－ビオチン標識ポリペプチドのポリペプチド部分４１と結合可能な粒子である。本実施形態の製造方法では、固相４０とＬ－ビオチン標識ポリペプチドのポリペプチド部分４１とを結合した後、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドのＬ－ビオチン基４２と、光学異性アビジン類４３とを結合する。図３に示される例では、光学異性アビジン類４３は四量体である。また、図３に示される例では、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数は４であるので、４つの光学異性アビジン類４３が結合する。このように、図３には、固相上に固定化されたＬ－ビオチン標識ポリペプチドのＬ－ビオチン基と光学異性アビジン類との結合を介して、複数の光学異性アビジン類が固相化された固相が示される。しかし、本発明はこの例に限定されない。
本実施形態の製造方法では、まず、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを含む液体から分取された試料と、本実施形態のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する。本実施形態の製造方法において、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを含む液体から分取された試料を「被検試料」とも呼ぶ。Ｌ－ビオチン標識された物質及び測定試料の調製の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同様である。被検試料の量は、特に限定されないが、吸光度の測定に必要最小限の量であることが好ましい。
次いで、測定試料の吸光度を測定し、吸光度の測定値に基づき、当該測定試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する。吸光度の測定及びＬ－ビオチン濃度の決定の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同様である。そして、Ｌ－ビオチンの濃度及びポリペプチドの濃度に基づいて、被検試料におけるＬ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する。当該Ｌ－ビオチン基の数の決定の詳細は、本実施形態の決定方法について述べたことと同様である。
本実施形態の製造方法では、被検試料におけるＬ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数が、所定の範囲内であるか否かを判定する工程を含んでもよい。本実施形態の製造方法では、図３に示されるように、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが有するＬ－ビオチン基と光学異性アビジン類との結合を介して、固相に光学異性アビジン類が固定化される。固相化される光学異性アビジン類の数は、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが有するＬ－ビオチン基の数に依存する。そのため、当該Ｌ－ビオチン基の数は、本実施形態の製造方法により得られる固相の品質に影響する。
本実施形態の製造方法では、被検試料におけるＬ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数が所定の範囲内であったとき、上記の液体と、ポリペプチドと結合可能な固相とを接触して、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを固相上に固定化する。液体は全部を用いてもよいし、一部を用いてもよい。接触の条件は特に限定されないが、例えば、４℃～40℃、好ましくは室温(約20℃)～37℃にて、10分間～４時間、好ましくは30分間～３時間インキュベーションしてもよい。固相が粒子の場合、インキュベーションの間、固相とＬ－ビオチン標識ポリペプチドとの混合物は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。
被検試料におけるＬ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数が所定の範囲内でなかったときは、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを調製し直して、新たな液体を用意する。あるいは、液体が複数ある場合は、別の液体について、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定してもよい。
固相は、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドのポリペプチド部分と結合可能な不溶性の担体であればよい。固相とＬ－ビオチン標識ポリペプチドのポリペプチド部分との結合様式は、特に限定されず、例えば、固相表面との物理的吸着又は共有結合が挙げられる。固相表面とポリペプチドとの共有結合としては、例えば、固相表面にNHSエステル、マレイミド基などの官能基を付与して、当該官能基によりポリペプチド部分を固相表面に共有結合できる。あるいは、二価性架橋剤をポリペプチド部分と固相表面とを共有結合してもよい。
固相の素材は特に限定されず、例えば有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子及びマイクロプレートが好ましい。粒子としては、特に磁性粒子が好ましい。
固相とＬ－ビオチン標識ポリペプチドとを接触した後、光学異性アビジン類をさらに接触する前に、未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、例えば、固相に固定化しなかったＬ－ビオチン標識ポリペプチドであり得る。固相が粒子である場合、遠心分離により粒子を沈殿させ、未反応の遊離成分を含む上清を除くことによりB/F分離ができる。固相が磁性粒子の場合、例えば磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態で、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。固相が、マイクロプレートなどの容器である場合、未反応の遊離成分を含む液を容器内から除去することによりB/F分離ができる。B/F分離した後、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが固定化された固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
本実施形態の製造方法では、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが固定化された固相と、光学異性アビジン類とを接触して、光学異性アビジン類を上記の固相上に固定化する。図３に示されるように、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが有するＬ－ビオチン基と光学異性アビジン類との結合を介して、固相に光学異性アビジン類が固定化される。接触の条件は特に限定されないが、例えば、４℃～40℃、好ましくは室温(約20℃)～37℃にて、１分間～１時間、好ましくは５分間～30分間インキュベーションしてもよい。固相が粒子の場合、インキュベーションの間、固相と光学異性アビジン類との混合物は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。固相と光学異性アビジン類とを接触した後、B/F分離を行ってもよい。固相と光学異性アビジン類との接触により、光学異性アビジン類が固定化された固相を得ることができる。
本実施形態の製造方法により得られた光学異性アビジン類が固定化された固相と、Ｌ－ビオチン標識抗体とを組み合わせることで、酵素結合免疫吸着(ELISA)法に用いられる固相と捕捉体とを含む試薬キットとすることができる。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１： Ｌ－ビオチン測定用試薬の調製及び使用
アビジン類とHABAとの複合体は波長500 nmでの吸収を有し、当該複合体中のHABAが遊離型又は結合型のＤ－ビオチンと容易に置き換わることを利用して、試料中のビオチンを測定する方法が知られている。当該測定方法において、アビジン類に代えて光学異性アビジン類を用いたとき、試料中のＬ－ビオチンを測定できるか否かを検討した。具体的には、光学異性ストレプトアビジン及びHABAを含むＬ－ビオチン測定用試薬を調製し、当該試薬を用いて、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドの測定及びビオチン標識数の決定を行った。比較のため、Ｄ－ビオチン測定用試薬も調製して、同様の実験を行った。
アビジン類とHABAとの複合体は波長500 nmでの吸収を有し、当該複合体中のHABAが遊離型又は結合型のＤ－ビオチンと容易に置き換わることを利用して、試料中のビオチンを測定する方法が知られている。当該測定方法において、アビジン類に代えて光学異性アビジン類を用いたとき、試料中のＬ－ビオチンを測定できるか否かを検討した。具体的には、光学異性ストレプトアビジン及びHABAを含むＬ－ビオチン測定用試薬を調製し、当該試薬を用いて、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドの測定及びビオチン標識数の決定を行った。比較のため、Ｄ－ビオチン測定用試薬も調製して、同様の実験を行った。
１．ビオチン測定用試薬の調製
(1.1) Ｌ－ビオチン測定用試薬の調製
0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 200 mL)と塩化ナトリウム(1.75 g)とを混合して、PBSを調製した。HABA(1.12 mg：東京化成工業株式会社)とPBS(20 mL)とを混合して、HABA溶液を得た。光学異性ストレプトアビジンを、株式会社糖鎖工学研究所に委託してペプチド合成により得た。得られた光学異性ストレプトアビジンは、グリシン以外のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基であって、そのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の13番目から133番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一であった。光学異性ストレプトアビジン(1.28 mg)をPBS(2 mL)に溶解して、光学異性ストレプトアビジン溶液を得た。光学異性ストレプトアビジン溶液(368μL)とHABA溶液(432μL)とを混合して、Ｌ－ビオチン測定用試薬を調製した。当該試薬において、光学異性ストレプトアビジンの濃度は294μg/mLであり、HABAの濃度は30μg/mLであった。
(1.1) Ｌ－ビオチン測定用試薬の調製
0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 200 mL)と塩化ナトリウム(1.75 g)とを混合して、PBSを調製した。HABA(1.12 mg：東京化成工業株式会社)とPBS(20 mL)とを混合して、HABA溶液を得た。光学異性ストレプトアビジンを、株式会社糖鎖工学研究所に委託してペプチド合成により得た。得られた光学異性ストレプトアビジンは、グリシン以外のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基であって、そのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の13番目から133番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一であった。光学異性ストレプトアビジン(1.28 mg)をPBS(2 mL)に溶解して、光学異性ストレプトアビジン溶液を得た。光学異性ストレプトアビジン溶液(368μL)とHABA溶液(432μL)とを混合して、Ｌ－ビオチン測定用試薬を調製した。当該試薬において、光学異性ストレプトアビジンの濃度は294μg/mLであり、HABAの濃度は30μg/mLであった。
(1.2) Ｄ－ビオチン測定用試薬１の調製
HABA(1 mg)とPBS(33 mL)とを混合して、HABA溶液を得た。アビジン(1 mg：富士フイルム和光純薬株式会社)とHABA溶液(4 mL)とを混合して、Ｄ－ビオチン測定用試薬１を調製した。当該試薬において、アビジンの濃度は250μg/mLであり、HABAの濃度は30μg/mLであった。
HABA(1 mg)とPBS(33 mL)とを混合して、HABA溶液を得た。アビジン(1 mg：富士フイルム和光純薬株式会社)とHABA溶液(4 mL)とを混合して、Ｄ－ビオチン測定用試薬１を調製した。当該試薬において、アビジンの濃度は250μg/mLであり、HABAの濃度は30μg/mLであった。
(1.3) Ｄ－ビオチン測定用試薬２の調製
HABA(1.12 mg)とPBS(20 mL)とを混合して、HABA溶液を得た。ストレプトアビジン(1.28 mg：Roche社)とPBS(2 mL)とを混合して、ストレプトアビジン溶液を得た。ストレプトアビジン溶液(368μL)とHABA溶液(432μL)とを混合して、Ｄ－ビオチン測定用試薬２を調製した。当該試薬において、ストレプトアビジンの濃度は194μg/mLであり、HABAの濃度は30μg/mLであった。
HABA(1.12 mg)とPBS(20 mL)とを混合して、HABA溶液を得た。ストレプトアビジン(1.28 mg：Roche社)とPBS(2 mL)とを混合して、ストレプトアビジン溶液を得た。ストレプトアビジン溶液(368μL)とHABA溶液(432μL)とを混合して、Ｄ－ビオチン測定用試薬２を調製した。当該試薬において、ストレプトアビジンの濃度は194μg/mLであり、HABAの濃度は30μg/mLであった。
２．キャリブレータとしてのビオチン標準液の調製
(2.1) Ｌ-ビオチン標準液の調製
Ｌ－ビオチンを次のようにして得た。Lavielle S.ら, J.Am.Chem.Soc., vol.100, pp.1558-1563, 1978に記載の方法により、Ｄ－ビオチンとＬ－ビオチンとの混合物を合成した。株式会社ダイセルに委託して、当該混合物を液体クロマトグラフィーにより光学分割して、Ｌ－ビオチンを得た。カラムにはCHIRALPAK(登録商標) IG(Φ46×50 mm：株式会社ダイセル)を用い、移動相には、メタノールと酢酸の混合溶媒(100：0.1(v/v))を用いた。光学分割は、流速1.0 mL/分、カラム温度40℃、検出波長205 nmの条件下で行った。得られたＬ－ビオチン(1 mg)と0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 40.9 mL)とを混合して、100μMのＬ-ビオチン標準液を調製した。この標準液を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で希釈して、25μM及び50μMのＬ-ビオチン標準液をさらに調製した。
(2.1) Ｌ-ビオチン標準液の調製
Ｌ－ビオチンを次のようにして得た。Lavielle S.ら, J.Am.Chem.Soc., vol.100, pp.1558-1563, 1978に記載の方法により、Ｄ－ビオチンとＬ－ビオチンとの混合物を合成した。株式会社ダイセルに委託して、当該混合物を液体クロマトグラフィーにより光学分割して、Ｌ－ビオチンを得た。カラムにはCHIRALPAK(登録商標) IG(Φ46×50 mm：株式会社ダイセル)を用い、移動相には、メタノールと酢酸の混合溶媒(100：0.1(v/v))を用いた。光学分割は、流速1.0 mL/分、カラム温度40℃、検出波長205 nmの条件下で行った。得られたＬ－ビオチン(1 mg)と0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 40.9 mL)とを混合して、100μMのＬ-ビオチン標準液を調製した。この標準液を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で希釈して、25μM及び50μMのＬ-ビオチン標準液をさらに調製した。
(2.2) Ｄ-ビオチン標準液の調製
Ｄ－ビオチン(1 mg：キシダ化学株式会社)と0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 40.9 mL)とを混合して、100μMのＤ-ビオチン標準液を調製した。この標準液を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で希釈して、25μM及び50μMのＤ-ビオチン標準液をさらに調製した。
Ｄ－ビオチン(1 mg：キシダ化学株式会社)と0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 40.9 mL)とを混合して、100μMのＤ-ビオチン標準液を調製した。この標準液を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で希釈して、25μM及び50μMのＤ-ビオチン標準液をさらに調製した。
３．試料の調製
(3.1) Ｌ－ビオチン標識試薬の調製
Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを調製するために、上記(2.1)で取得したＬ－ビオチンを用いて、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを付与したＬ－ビオチン(Ｌ-ビオチン-AC5-NHS)及びマレイミド基を付与したＬ－ビオチン(Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド)を、下記のようにして合成した。Ｄ-ビオチン-AC5-NHS及びＤ-ビオチン-PE-マレイミドは、株式会社同仁化学研究所より購入した（Biotin-AC5-OSu：製品コードB305、Biotin-PEAC5-maleimide：製品コードB299）。なお、本明細書における化合物名及び化学式中のNHSの表記はOsuと同義である。
(3.1) Ｌ－ビオチン標識試薬の調製
Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを調製するために、上記(2.1)で取得したＬ－ビオチンを用いて、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを付与したＬ－ビオチン(Ｌ-ビオチン-AC5-NHS)及びマレイミド基を付与したＬ－ビオチン(Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド)を、下記のようにして合成した。Ｄ-ビオチン-AC5-NHS及びＤ-ビオチン-PE-マレイミドは、株式会社同仁化学研究所より購入した（Biotin-AC5-OSu：製品コードB305、Biotin-PEAC5-maleimide：製品コードB299）。なお、本明細書における化合物名及び化学式中のNHSの表記はOsuと同義である。
(3.1.1) Ｌ-ビオチン-AC5-NHSの合成
Ｌ－ビオチン(化合物１)を用いて、下記の合成スキームに従って、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 5-((3aR,4R,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタン酸エステル(化合物２)を合成した。具体的には次のとおりであった。Ｌ-ビオチン(123 mg, 0.503 mmol)とNHS(69.4 mg, 0.603 mmol)とをN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)(3.4 mL)に溶解し、エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボキシジイミド(EDC)(116 mg, 0.603 mmol)を加えて、室温(rt)にて24時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物をエタノール：酢酸：水(95：1：4 v/v)から再結晶して、化合物２(166 mg)を得た。
Ｌ－ビオチン(化合物１)を用いて、下記の合成スキームに従って、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 5-((3aR,4R,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタン酸エステル(化合物２)を合成した。具体的には次のとおりであった。Ｌ-ビオチン(123 mg, 0.503 mmol)とNHS(69.4 mg, 0.603 mmol)とをN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)(3.4 mL)に溶解し、エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボキシジイミド(EDC)(116 mg, 0.603 mmol)を加えて、室温(rt)にて24時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物をエタノール：酢酸：水(95：1：4 v/v)から再結晶して、化合物２(166 mg)を得た。
化合物２を用いて、下記の合成スキームに従って、6-(5-((3aR,4R,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサン酸(化合物３)を合成した。具体的には次のとおりであった。化合物２(166 mg, 0.458 mmol)をDMF(2.6 mL)に溶解した。6-アミノヘキサン酸(63.0 mg, 0.481 mmol)を0.25 M炭酸ナトリウム水溶液(1.0 mL)に溶解した。この溶液を化合物２のDMF溶液に加え、室温にて24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物を水に溶解した。水性層を０℃にて４M塩酸で酸性にし、沈殿物をろ過により回収して、化合物３(159 mg)を得た。
化合物３を用いて、下記の合成スキームに従って、Ｌ-ビオチン-AC5-NHS、すなわち、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-(5-((3aR,4R,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサン酸エステル(化合物４)を合成した。具体的には次のとおりであった。化合物３(159 mg, 0.408 mmol)とNHS(93.9 mg, 0.816 mmol)とをDMF(7.6 mL)に溶解し、EDC(157 mg, 0.816 mmol)を加えて、室温にて撹拌した。反応混合物を35℃にて23時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/メタノール(8:1 v/v))で精製して、化合物４(141 mg)を得た。
化合物４のNMR分析及び質量分析の結果は、次のとおりであった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.75 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.12-3.07 (m, 1H), 3.04-2.98 (m, 2H), 2.85-2.78 (m, 1H), 2.81 (s, 4H), 2.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.65-1.22 (m, 12H)。ESI-MS m/z 455.1967 [M+H]+ (calcd for C20H31N4O6S, 455.1959)。
(3.1.2) Ｌ-ビオチン-PE-マレイミドの合成
無水マレイン酸(化合物５)及びフラン(化合物６)を用いて、下記の合成スキームに従って、(3aR,4S,7R,7aS)-3a,4,7,7a-テトラヒドロ-4,7-エポキシイソベンゾフラン-1,3-ジオン(化合物７)を合成した。具体的には次のとおりであった。無水マレイン酸(4.0 g, 40.0 mmol)を酢酸エチル(20.0 mL)に溶解し、フラン(4.0 mL, 63.0 mmol)を加えて、激しく撹拌した。反応混合物を室温にて48時間撹拌した。沈殿物をろ過により回収し、酢酸エチルで洗浄して、化合物７(4.03 g)を得た。
無水マレイン酸(化合物５)及びフラン(化合物６)を用いて、下記の合成スキームに従って、(3aR,4S,7R,7aS)-3a,4,7,7a-テトラヒドロ-4,7-エポキシイソベンゾフラン-1,3-ジオン(化合物７)を合成した。具体的には次のとおりであった。無水マレイン酸(4.0 g, 40.0 mmol)を酢酸エチル(20.0 mL)に溶解し、フラン(4.0 mL, 63.0 mmol)を加えて、激しく撹拌した。反応混合物を室温にて48時間撹拌した。沈殿物をろ過により回収し、酢酸エチルで洗浄して、化合物７(4.03 g)を得た。
化合物７及びN-(2-アミノエチル)ピペラジン(化合物８)を用いて、下記の合成スキームに従って、(3aR,4S,7R,7aS)-2-(2-(ピペラジン-1-イル)エチル)-3a,4,7,7a-テトラヒドロ-1H-4,7-エポキシイソインドール-1,3-(2H)ジオン(化合物９)を合成した。具体的には次のとおりであった。化合物７(600 mg, 3.61 mmol)をエタノール(6.0 mL)に溶解し、化合物８(0.520 mL, 3.97 mmol)、トリエチルアミン(0.520 mL, 3.97 mmol)及びエタノール(1.2 mL)を加えて０℃にて30分間撹拌した。反応混合物を70度まで加温して、70℃にて15時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物を酢酸エチルに溶解した。有機質層を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させて、セライトでろ過した。ろ過物を濃縮して化合物９(518 mg)を得た。
Ｌ－ビオチン(化合物１)及び化合物９を用いて、下記の合成スキームに従って、(3aR,4S,7R,7aS)-2-(2-(4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタノイル)ピペラジン-1-イル)エチル)-3a,4,7,7a-テトラヒドロ-1H-4,7-エポキシイソインドール-1,3(2H)ジオン(化合物10)を合成した。具体的には次のとおりであった。Ｌ－ビオチン(89.6 mg, 0.367 mmol)、化合物９(123 mg, 0.442 mmol)及び4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)(8.60 mg, 70.0 μmol)をDMF(2.4 mL)に溶解し、EDC(84.7 mg, 0.442 mmol)を加えて、室温にて15時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/メタノール(8:1 v/v))で精製して、化合物10(102 mg)を得た。
化合物10を用いて、下記の合成スキームに従って、Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド、すなわち、1-2-(4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタノイル)ピペラジン-1-イル)エチル)-1H-ピロール-2,5-ジオン(化合物11)を合成した。具体的には次のとおりであった。化合物10(102 mg, 0.200 mmol)をトルエン(20.0 mL)に溶解して、溶液を３時間環流した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/メタノール(8:1 v/v))で精製して、化合物11(70.0 mg)を得た。
化合物11のNMR分析及び質量分析の結果は、次のとおりであった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.01 (s, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 4.28-4.24 (m, 1H), 4.11- 4.08 (m, 1H), 3.55 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.37-3.26 (m, 4H), 3.08-3.03 (m, 1H), 2.80-2.76 (m, 1H), 2.58- 2.52 (m, 1H), 2.43 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.34-2.32 (m, 2H), 2.28-2.26 (m, 2H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.61-1.24 (m, 6H)。[α]15 = -54.6° (C = 1.00, MeOH)。ESI-MS m/z found 436.1995 [M+H]+ (calcd for C20H31N4O6S, 436.2013)。
(3.2) ビオチン標識ポリペプチドを含む試料の調製
(3.2.1) ビオチン標識BSAの調製
Ｌ-ビオチン-AC5-NHS(32.5 mg)をDMF(0.65 mL)に溶解して、Ｌ-ビオチン-AC5-NHS溶液を得た。BSA(5.63 g： Proliant社)を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 112.5 mL)に溶解して、BSA溶液を得た。BSA溶液(0.65 mL)とＬ-ビオチン-AC5-NHS溶液(0.65 mL)とを混合して、35℃にて１時間静置した。反応混合物を、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化したPD-10カラム(Cytiva社)に通し、画分を500μLずつ回収した。各画分の吸光度を測定して、280 nmの吸収ピークを有する画分を、Ｌ－ビオチン標識BSAを含む試料として以降の実験に用いた。Ｌ-ビオチン-AC5-NHSに代えてＤ－ビオチン-AC5-NHSを用いたこと以外は上記と同様にして、Ｄ－ビオチン標識BSAを含む試料を得た。
(3.2.1) ビオチン標識BSAの調製
Ｌ-ビオチン-AC5-NHS(32.5 mg)をDMF(0.65 mL)に溶解して、Ｌ-ビオチン-AC5-NHS溶液を得た。BSA(5.63 g： Proliant社)を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5, 112.5 mL)に溶解して、BSA溶液を得た。BSA溶液(0.65 mL)とＬ-ビオチン-AC5-NHS溶液(0.65 mL)とを混合して、35℃にて１時間静置した。反応混合物を、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化したPD-10カラム(Cytiva社)に通し、画分を500μLずつ回収した。各画分の吸光度を測定して、280 nmの吸収ピークを有する画分を、Ｌ－ビオチン標識BSAを含む試料として以降の実験に用いた。Ｌ-ビオチン-AC5-NHSに代えてＤ－ビオチン-AC5-NHSを用いたこと以外は上記と同様にして、Ｄ－ビオチン標識BSAを含む試料を得た。
(3.2.2) ビオチン標識抗体の調製
Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド(10 mg)をジメチルスルホキシド(DMSO)(1.7 mL)に溶解して、Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド溶液を得た。マウス抗甲状腺刺激ホルモン(TSH)モノクローナル抗体(北山ラベス株式会社)から、ペプシンを用いる常法により、抗TSH抗体のF(ab’)2を得た。EDTA・2ナトリウム塩及び水酸化ナトリウムを超純水に溶解して、0.1 Mエチレンジアミン４酢酸(EDTA)溶液を調製した。リン酸化1ナトリウム2水和物、EDTA.2ナトリウム塩及び水酸化ナトリウムを超純水に溶解して、ゲルろ過用緩衝液を調製した。得られた抗TSH抗体のF(ab’)2に、0.1 M EDTA溶液及びゲルろ過用緩衝液を加えて、抗体濃度が8 mg/mLの溶液を得た。この溶液に0.3 M 2-メルカプトエチルアミン(MEA)溶液を添加して、抗体のジスルフィド結合を還元した。反応混合物を、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化したPD-10カラム(Cytiva社)に通し、280 nmの吸収ピークを有する画分を得た。抗体を含む画分(500μL)とＬ-ビオチン-PE-マレイミド(1.7 mL)とを混合して、35℃にて１時間静置した。反応混合物を限外ろ過(カットオフ分子量30,000)及びゲルろ過カラムにより精製して、Ｌ－ビオチン標識抗TSH抗体Fab’の溶液を得た。得られた溶液を、Ｌ－ビオチン標識抗体を含む試料として以降の実験に用いた。Ｌ-ビオチン-PE-マレイミドに代えてＤ－ビオチン-PE-マレイミドを用いたこと以外は上記と同様にして、Ｄ－ビオチン標識抗体を含む試料を得た。
Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド(10 mg)をジメチルスルホキシド(DMSO)(1.7 mL)に溶解して、Ｌ-ビオチン-PE-マレイミド溶液を得た。マウス抗甲状腺刺激ホルモン(TSH)モノクローナル抗体(北山ラベス株式会社)から、ペプシンを用いる常法により、抗TSH抗体のF(ab’)2を得た。EDTA・2ナトリウム塩及び水酸化ナトリウムを超純水に溶解して、0.1 Mエチレンジアミン４酢酸(EDTA)溶液を調製した。リン酸化1ナトリウム2水和物、EDTA.2ナトリウム塩及び水酸化ナトリウムを超純水に溶解して、ゲルろ過用緩衝液を調製した。得られた抗TSH抗体のF(ab’)2に、0.1 M EDTA溶液及びゲルろ過用緩衝液を加えて、抗体濃度が8 mg/mLの溶液を得た。この溶液に0.3 M 2-メルカプトエチルアミン(MEA)溶液を添加して、抗体のジスルフィド結合を還元した。反応混合物を、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化したPD-10カラム(Cytiva社)に通し、280 nmの吸収ピークを有する画分を得た。抗体を含む画分(500μL)とＬ-ビオチン-PE-マレイミド(1.7 mL)とを混合して、35℃にて１時間静置した。反応混合物を限外ろ過(カットオフ分子量30,000)及びゲルろ過カラムにより精製して、Ｌ－ビオチン標識抗TSH抗体Fab’の溶液を得た。得られた溶液を、Ｌ－ビオチン標識抗体を含む試料として以降の実験に用いた。Ｌ-ビオチン-PE-マレイミドに代えてＤ－ビオチン-PE-マレイミドを用いたこと以外は上記と同様にして、Ｄ－ビオチン標識抗体を含む試料を得た。
４．試料の測定
(4.1) 検量線の作成
Ｌ－ビオチン測定用試薬(91.7μL)と、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5、18.3μL)又はＬ-ビオチン標準液(18.3μL)とを混合して、室温にて５分静置した。そして、反応混合物の500 nmでの吸光度(A500)を分光光度計UV-2600(株式会社島津製作所)により測定した。また、Ｄ-ビオチン測定用試薬１及び２とＤ-ビオチン標準液とを用いて同様に測定した。検量線は、最小二乗法による直線を用いた。吸光度の測定結果を表１に示す。また、各測定用試薬についての検量線の一例を図４Ａ～図４Ｄに示す。
(4.1) 検量線の作成
Ｌ－ビオチン測定用試薬(91.7μL)と、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5、18.3μL)又はＬ-ビオチン標準液(18.3μL)とを混合して、室温にて５分静置した。そして、反応混合物の500 nmでの吸光度(A500)を分光光度計UV-2600(株式会社島津製作所)により測定した。また、Ｄ-ビオチン測定用試薬１及び２とＤ-ビオチン標準液とを用いて同様に測定した。検量線は、最小二乗法による直線を用いた。吸光度の測定結果を表１に示す。また、各測定用試薬についての検量線の一例を図４Ａ～図４Ｄに示す。
表１、図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、アビジン又はストレプトアビジンとHABAとの複合体は波長500 nmでの吸収を有し、吸光度は、標準液のＤ－ビオチン濃度に依存して減少した。検量線の決定係数(R2)は0.9997であり、Ｄ－ビオチン濃度と吸光度との間に良好な相関が認められた。よって、Ｄ-ビオチン測定用試薬１及び２は、非特許文献１に示されるような市販のビオチン定量用試薬を再現できた。表１、図４Ｃ及び図４Ｄを参照すると、光学異性ストレプトアビジンとHABAとの複合体も波長500 nmでの吸収を有し、吸光度は、標準液のＬ－ビオチン濃度に依存して減少した。Ｌ－ビオチン測定用試薬についての検量線の決定係数も0.9997であり、Ｌ－ビオチン濃度と吸光度との間に良好な相関が認められた。よって、光学異性ストレプトアビジンとHABAとを含む試薬によって、試料中の遊離型Ｌ－ビオチンの濃度を定量できることが示された。
(4.2) 試料におけるビオチン濃度の決定
上記(3.2.1)で調製したＬ－ビオチン標識BSAを含む試料を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で100倍に希釈した。Ｌ－ビオチン測定用試薬(91.7μL)と、希釈したＬ－ビオチン標識BSAを含む試料(18.3μL)又はＬ－ビオチン標識抗体を含む試料(18.3μL)とを混合して、室温にて５分静置した。そして、反応混合物のA500をUV-2600により測定した。Ｌ－ビオチン測定用試薬についての検量線(回帰式)から、各試料に含まれるＬ－ビオチン量(μM)を決定した。また、Ｄ-ビオチン測定用試薬１と、Ｄ-ビオチン標識BSA又はＤ-ビオチン標識抗体を含む試料とを用いて同様に測定して、検量線から各試料に含まれるＤ－ビオチン濃度(μM)を決定した。各試料のA500及びビオチン濃度の測定結果を表２に示す。なお、Ｌ－ビオチン標識BSA及びＤ－ビオチン標識BSAを含む試料のビオチン濃度は、検量線から決定した値を100倍した値を用いた。
上記(3.2.1)で調製したＬ－ビオチン標識BSAを含む試料を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で100倍に希釈した。Ｌ－ビオチン測定用試薬(91.7μL)と、希釈したＬ－ビオチン標識BSAを含む試料(18.3μL)又はＬ－ビオチン標識抗体を含む試料(18.3μL)とを混合して、室温にて５分静置した。そして、反応混合物のA500をUV-2600により測定した。Ｌ－ビオチン測定用試薬についての検量線(回帰式)から、各試料に含まれるＬ－ビオチン量(μM)を決定した。また、Ｄ-ビオチン測定用試薬１と、Ｄ-ビオチン標識BSA又はＤ-ビオチン標識抗体を含む試料とを用いて同様に測定して、検量線から各試料に含まれるＤ－ビオチン濃度(μM)を決定した。各試料のA500及びビオチン濃度の測定結果を表２に示す。なお、Ｌ－ビオチン標識BSA及びＤ－ビオチン標識BSAを含む試料のビオチン濃度は、検量線から決定した値を100倍した値を用いた。
表２から分かるように、Ｄ-ビオチン測定用試薬１により、Ｄ－ビオチン標識BSA及びＤ－ビオチン標識抗体のそれぞれを含む試料におけるＤ－ビオチン濃度を測定できた。また、Ｌ-ビオチン測定用試薬により、Ｄ-ビオチン測定用試薬と同様に、Ｌ－ビオチン標識BSAを含む試料及びＬ－ビオチン標識抗体を含む試料におけるＬ－ビオチン濃度を測定できた。よって、Ｌ－ビオチン測定用試薬により、Ｄ-ビオチン測定用試薬と同様に、試料中の結合型Ｌ－ビオチンの濃度を測定できることが示唆された。
５．ビオチン標識ポリペプチドが有するビオチン基の数の決定
上記の試料のタンパク質濃度(BSA又はFab’の濃度)を決定するために、各試料の280 nmでの吸光度(A280)を分光光度計NanoDrop(商標)(Thermo Fisher Scientific社)により測定した。BSA溶液(1 mg/mL)のA280を0.63として、Ｄ－ビオチン標識BSAを含む試料及びＬ－ビオチン標識BSAを含む試料のA280の測定値から、各試料中のBSA濃度(mg/mL)を算出した。BSAの分子量を66200として、各試料中のBSA濃度(mg/mL)をモル濃度(μM)に変換した。同様に、Fab’溶液(1 mg/mL)のA280を1.38として、Ｄ－ビオチン標識抗体を含む試料及びＬ－ビオチン標識抗体を含む試料のA280の測定値から、各試料中のFab’濃度(mg/mL)を算出した。Fab’の分子量を46000として、各試料中のFab’濃度(mg/mL)をモル濃度(μM)に変換した。各試料について、上記４．で決定したビオチン濃度をBSA又はFab’のモル濃度で除算することにより、１分子のビオチン標識ポリペプチドが有するビオチン基の数(以下、標識数ともいう)を算出した。結果を表３に示す。
上記の試料のタンパク質濃度(BSA又はFab’の濃度)を決定するために、各試料の280 nmでの吸光度(A280)を分光光度計NanoDrop(商標)(Thermo Fisher Scientific社)により測定した。BSA溶液(1 mg/mL)のA280を0.63として、Ｄ－ビオチン標識BSAを含む試料及びＬ－ビオチン標識BSAを含む試料のA280の測定値から、各試料中のBSA濃度(mg/mL)を算出した。BSAの分子量を66200として、各試料中のBSA濃度(mg/mL)をモル濃度(μM)に変換した。同様に、Fab’溶液(1 mg/mL)のA280を1.38として、Ｄ－ビオチン標識抗体を含む試料及びＬ－ビオチン標識抗体を含む試料のA280の測定値から、各試料中のFab’濃度(mg/mL)を算出した。Fab’の分子量を46000として、各試料中のFab’濃度(mg/mL)をモル濃度(μM)に変換した。各試料について、上記４．で決定したビオチン濃度をBSA又はFab’のモル濃度で除算することにより、１分子のビオチン標識ポリペプチドが有するビオチン基の数(以下、標識数ともいう)を算出した。結果を表３に示す。
表３に示されるように、Ｄ-ビオチン測定用試薬１により決定した試料におけるＤ－ビオチン濃度と、当該試料におけるタンパク質濃度とから、Ｄ－ビオチン標識ポリペプチドが有するＤ－ビオチン基の数が決定できた。同様に、Ｌ-ビオチン測定用試薬により決定した試料におけるＬ－ビオチン濃度と、当該試料におけるタンパク質濃度とから、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが有するＬ－ビオチン基の数が決定できた。よって、Ｌ－ビオチン測定用試薬により、Ｄ-ビオチン測定用試薬と同様に、試料中のＬ－ビオチン標識物質の標識数を測定できることが示唆された。
実施例２： 免疫学的測定用試薬キットの製造及び使用
実施例１において標識数の規格値を満たすことが確認されたＬ－ビオチン標識BSA及びＬ－ビオチン標識抗体を用いて、免疫学的測定用試薬キットを製造した。また、当該試薬キットを用いて、試料中のTSHを測定した。
実施例１において標識数の規格値を満たすことが確認されたＬ－ビオチン標識BSA及びＬ－ビオチン標識抗体を用いて、免疫学的測定用試薬キットを製造した。また、当該試薬キットを用いて、試料中のTSHを測定した。
１．光学異性ストレプトアビジンを固定化した固相の製造
磁性粒子MAG2201(2 g：JSR株式会社)を20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 4 mL)で洗浄した。この磁性粒子は、官能基としてカルボキシル基を表面に有していた。カルボキシル基をNHSエステルに変換するための活性化剤の溶液を、N-ヒドロキシスクシンイミド(6.2 g)及びカルボジイミド(19.2 g)を20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 2000 mL)に溶解して調製した。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、活性化剤の溶液(4 mL)を加え、15℃～30℃にて300 rpmで15分間撹拌した。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 4 mL)を加えて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5, 3.6 mL)を加えて撹拌した。磁性粒子の懸濁液に、実施例１で調製したＬ－ビオチン標識アルブミン(10 mg/mL, 0.4 mL)を加え、15℃～30℃にて300 rpmで120分間撹拌した。これにより、磁性粒子上のNHSエステルと、Ｌ－ビオチン標識アルブミンのアルブミン部分とが結合して、磁性粒子の表面がビオチンで標識された。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5, 3.6 mL)を加えて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子に20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5, 2 mL)を加えた。光学異性ストレプトアビジン(544 mg)を20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 1000 mL)に溶解して、光学異性ストレプトアビジン溶液を得た。磁性粒子の懸濁液に、光学異性ストレプトアビジン溶液(3.6 mL)を加え、15℃～30℃にて300 rpmで10分間撹拌した。これにより、磁性粒子上のＬ－ビオチンと、光学異性ストレプトアビジンとが結合して、磁性粒子の表面に光学異性ストレプトアビジンが固定化された。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、磁性粒子保存用緩衝液(MES緩衝液(pH 6.5))を加えて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子に磁性粒子保存用緩衝液を添加して、光学異性ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子(18 mL)を得た。
磁性粒子MAG2201(2 g：JSR株式会社)を20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 4 mL)で洗浄した。この磁性粒子は、官能基としてカルボキシル基を表面に有していた。カルボキシル基をNHSエステルに変換するための活性化剤の溶液を、N-ヒドロキシスクシンイミド(6.2 g)及びカルボジイミド(19.2 g)を20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 2000 mL)に溶解して調製した。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、活性化剤の溶液(4 mL)を加え、15℃～30℃にて300 rpmで15分間撹拌した。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 4 mL)を加えて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5, 3.6 mL)を加えて撹拌した。磁性粒子の懸濁液に、実施例１で調製したＬ－ビオチン標識アルブミン(10 mg/mL, 0.4 mL)を加え、15℃～30℃にて300 rpmで120分間撹拌した。これにより、磁性粒子上のNHSエステルと、Ｌ－ビオチン標識アルブミンのアルブミン部分とが結合して、磁性粒子の表面がビオチンで標識された。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5, 3.6 mL)を加えて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子に20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5, 2 mL)を加えた。光学異性ストレプトアビジン(544 mg)を20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0, 1000 mL)に溶解して、光学異性ストレプトアビジン溶液を得た。磁性粒子の懸濁液に、光学異性ストレプトアビジン溶液(3.6 mL)を加え、15℃～30℃にて300 rpmで10分間撹拌した。これにより、磁性粒子上のＬ－ビオチンと、光学異性ストレプトアビジンとが結合して、磁性粒子の表面に光学異性ストレプトアビジンが固定化された。磁性粒子を磁気分離して上清を除き、磁性粒子保存用緩衝液(MES緩衝液(pH 6.5))を加えて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子に磁性粒子保存用緩衝液を添加して、光学異性ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子(18 mL)を得た。
２．免疫学的測定用試薬キットの各試薬の調製
R1試薬(捕捉抗体試薬)として、実施例１で調製したＬ－ビオチン標識抗TSH抗体Fab’の溶液を用いた。R2試薬(固相)として、上記１．で調製した光学異性ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子の懸濁液を用いた。R3試薬(検出抗体試薬)として、ALP標識マウス抗TSH抗体モノクローナル抗体を含むHISCL(商標) TSH R3試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R4試薬(測定用バッファー)として、HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬(基質溶液)として、CDP-Star(商標)を含むHISCL R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。希釈用緩衝液として、HISCL検体希釈液(シスメックス株式会社)を用いた。洗浄液として、HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)を用いた。比較のため、市販のTSH測定用キットであるHISCL TSH試薬(シスメックス株式会社)を用いた。この試薬には、Ｄ－ビオチン標識抗TSH抗体を含むHISCL TSH R1試薬と、ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子を含むHISCL TSH R2試薬と、HISCL(商標) TSH R3試薬と、HISCL R4試薬及びHISCL R5試薬が含まれていた。
R1試薬(捕捉抗体試薬)として、実施例１で調製したＬ－ビオチン標識抗TSH抗体Fab’の溶液を用いた。R2試薬(固相)として、上記１．で調製した光学異性ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子の懸濁液を用いた。R3試薬(検出抗体試薬)として、ALP標識マウス抗TSH抗体モノクローナル抗体を含むHISCL(商標) TSH R3試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R4試薬(測定用バッファー)として、HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬(基質溶液)として、CDP-Star(商標)を含むHISCL R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。希釈用緩衝液として、HISCL検体希釈液(シスメックス株式会社)を用いた。洗浄液として、HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)を用いた。比較のため、市販のTSH測定用キットであるHISCL TSH試薬(シスメックス株式会社)を用いた。この試薬には、Ｄ－ビオチン標識抗TSH抗体を含むHISCL TSH R1試薬と、ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子を含むHISCL TSH R2試薬と、HISCL(商標) TSH R3試薬と、HISCL R4試薬及びHISCL R5試薬が含まれていた。
３．TSHの測定
試料として、HISCL TSHキャリブレータ(シスメックス株式会社)を用いた。キャリブレータは、異なる６つの濃度のTSHを含有する６つの試料によって構成されたキットである。各試料中のTSHを全自動免疫測定装置HISCL-5000(シスメックス株式会社)により測定した。具体的な操作は、次のとおりであった。R1試薬(30μL)と希釈した血清(30μL)とを混合し、42℃にて２分間インキュベーションした。反応混合物にR2試薬(30μL)を加えて混合し、42℃にて2.5分間インキュベーションした。反応混合物にR3試薬(30μL)を加えて混合し、42℃にて2.5分間インキュベーションした後、磁性粒子を磁気分離して上清を除き、洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。洗浄は４回行った。上清を除き、磁性粒子にR4試薬(50μL)を加えて混合した後、R5試薬(50μL)を加えて混合し、42℃にて５分間インキュベーションした。そして、反応混合物の発光強度を測定した。比較のため、HISCL TSH試薬及びHISCL-5000を用いて、当該試薬の添付書類に従って、TSHの測定を行った。キャリブレータを構成する各試料を連続で３回測定した。３回の測定によって得られた発光カウント値の平均値を求め、測定値とした。
試料として、HISCL TSHキャリブレータ(シスメックス株式会社)を用いた。キャリブレータは、異なる６つの濃度のTSHを含有する６つの試料によって構成されたキットである。各試料中のTSHを全自動免疫測定装置HISCL-5000(シスメックス株式会社)により測定した。具体的な操作は、次のとおりであった。R1試薬(30μL)と希釈した血清(30μL)とを混合し、42℃にて２分間インキュベーションした。反応混合物にR2試薬(30μL)を加えて混合し、42℃にて2.5分間インキュベーションした。反応混合物にR3試薬(30μL)を加えて混合し、42℃にて2.5分間インキュベーションした後、磁性粒子を磁気分離して上清を除き、洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。洗浄は４回行った。上清を除き、磁性粒子にR4試薬(50μL)を加えて混合した後、R5試薬(50μL)を加えて混合し、42℃にて５分間インキュベーションした。そして、反応混合物の発光強度を測定した。比較のため、HISCL TSH試薬及びHISCL-5000を用いて、当該試薬の添付書類に従って、TSHの測定を行った。キャリブレータを構成する各試料を連続で３回測定した。３回の測定によって得られた発光カウント値の平均値を求め、測定値とした。
４．結果
Ｌ－ビオチン標識抗TSH抗体Fab’及び光学異性ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子を含む実施例２の試薬キットを用いてキャリブレータを測定して得た測定値と、HISCL TSH試薬を用いた測定値とをプロットしたグラフを図５に示す。図５から分かるように、実施例２の試薬キットによる測定結果は、市販の試薬キットによる測定結果と同様に良好な直線性を示した。
Ｌ－ビオチン標識抗TSH抗体Fab’及び光学異性ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子を含む実施例２の試薬キットを用いてキャリブレータを測定して得た測定値と、HISCL TSH試薬を用いた測定値とをプロットしたグラフを図５に示す。図５から分かるように、実施例２の試薬キットによる測定結果は、市販の試薬キットによる測定結果と同様に良好な直線性を示した。
１０、２０： 試薬
１１、２１： 第１容器
１２、２３： 梱包箱
１３、２４： 添付文書
２２： 第２容器
３０： 光学異性アビジン類(四量体)とHABAとの複合体
３１： 光学異性アビジン類(四量体)
３２： HABA
３３： Ｌ－ビオチン標識されたポリペプチド
３４： 光学異性アビジン類(四量体)とHABAとＬ－ビオチン標識されたポリペプチドとの複合体
４０： 球状の粒子
４１： Ｌ－ビオチン標識されたポリペプチドのポリペプチド部分
４２： Ｌ－ビオチン基
４３： 光学異性アビジン類(四量体)
１１、２１： 第１容器
１２、２３： 梱包箱
１３、２４： 添付文書
２２： 第２容器
３０： 光学異性アビジン類(四量体)とHABAとの複合体
３１： 光学異性アビジン類(四量体)
３２： HABA
３３： Ｌ－ビオチン標識されたポリペプチド
３４： 光学異性アビジン類(四量体)とHABAとＬ－ビオチン標識されたポリペプチドとの複合体
４０： 球状の粒子
４１： Ｌ－ビオチン標識されたポリペプチドのポリペプチド部分
４２： Ｌ－ビオチン基
４３： 光学異性アビジン類(四量体)
Claims (16)
- 光学異性アビジン類と、下記の式(I)で表されるアゾベンゼン誘導体とを含む、Ｌ－ビオチン測定用試薬。
ただし、R1～R5の少なくとも１つは、ヒドロキシ基、又は、非置換もしくは置換基を有するＣ１～Ｃ６ジアルキルアミノ基であり、且つR6～R10の少なくとも１つは、カルボキシ基である) - 前記光学異性アビジン類が、Ｌ型アビジン類の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列においてグリシン以外のアミノ酸残基の90％以上がＤ－アミノ酸残基であり、Ｌ－ビオチンと結合し、Ｄ－ビオチンと実質的に結合しないポリペプチドである請求項１に記載の試薬。
- 前記光学異性アビジン類が、光学異性ストレプトアビジン、光学異性ストレプトアビジン改変体、光学異性アビジン、光学異性タマビジン、光学異性ブラダビジン及び光学異性リザビジンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載の試薬。
- 前記光学異性アビジン類が、グリシン以外のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基からなるポリペプチドである請求項１～３のいずれか１項に記載の試薬。
- 前記アゾベンゼン誘導体が、4’-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸、4’-ヒドロキシアゾベンゼン-4-カルボン酸又は4’-ジメチルアミノアゾベンゼン-2-カルボン酸である請求項１～４のいずれか１項に記載の試薬。
- Ｌ－ビオチンを含む試料と、請求項１～５のいずれか１項に記載のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、
前記測定試料の吸光度を測定する工程と、
を含み、前記吸光度の測定値が、前記試料におけるＬ－ビオチンの濃度の指標となる、
Ｌ－ビオチンを含む試料の測定方法。 - 前記吸光度の測定値に基づいて、前記試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する工程をさらに含む請求項６に記載の測定方法。
- Ｌ－ビオチン標識された物質を含む試料と、請求項１～５のいずれか１項に記載のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、
前記測定試料の吸光度を測定する工程と、
前記吸光度の測定値に基づいて、前記試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する工程と、
前記試料におけるＬ－ビオチンの濃度及び前記物質の濃度に基づいて、前記Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する工程と、
を含む、Ｌ－ビオチン標識された物質の標識数の決定方法。 - 前記試料における前記物質の濃度を決定する工程をさらに含む請求項８に記載の決定方法。
- 前記Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数が、下記の式により算出される請求項８又は９に記載の決定方法。
Ｘ＝Ａ／Ｂ
(式中、Ｘは、前記Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数であり、
Ａは、前記試料におけるＬ－ビオチンのモル濃度であり、
Ｂは、前記試料における前記物質のモル濃度である) - 前記Ｌ－ビオチン標識された物質が、Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドである請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが、Ｌ－ビオチン標識抗体である請求項１１に記載の方法。
- Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを含む液体から分取された試料と、請求項１～５のいずれか１項に記載のＬ－ビオチン測定用試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、
前記測定試料の吸光度を測定する工程と、
前記吸光度の測定値に基づいて、前記測定試料におけるＬ－ビオチンの濃度を決定する工程と、
前記Ｌ－ビオチンの濃度及び前記ポリペプチドの濃度に基づいて、前記試料における前記Ｌ－ビオチン標識ポリペプチド１分子当たりのＬ－ビオチン基の数を決定する工程と、
前記Ｌ－ビオチン基の数が所定の範囲内であったとき、前記液体と、前記ポリペプチドと結合可能な固相とを接触して、前記Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドを前記固相上に固定化する工程と、
前記Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが固定化された前記固相と、光学異性アビジン類とを接触して、前記光学異性アビジン類を前記固相上に固定化する工程と、
を含む、光学異性アビジン類が固定化された固相の製造方法。 - 前記試料における前記ポリペプチドの濃度を決定する工程をさらに含む請求項１３に記載の製造方法。
- 前記Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数が、下記の式により算出される請求項１３又は１４に記載の製造方法。
Ｘ＝Ａ／Ｂ
(式中、Ｘは、前記Ｌ－ビオチン標識された物質１分子当たりのＬ－ビオチン基の数であり、
Ａは、前記試料におけるＬ－ビオチンのモル濃度であり、
Ｂは、前記試料における前記物質のモル濃度である) - 前記Ｌ－ビオチン標識ポリペプチドが、Ｌ－ビオチン標識アルブミンである請求項１３～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
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| PT1369476E (pt) | 2001-03-12 | 2010-08-25 | Japan Tobacco Inc | Nova proteína, gene que a codifica e método de utilização da mesma |
| WO2006058226A2 (en) | 2004-11-24 | 2006-06-01 | The Trustees Of Boston University | Modified dimeric streptavidins and uses thereof |
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