JPH09508374A

JPH09508374A - 抗体に対して特異的な結合物質およびイムノアッセイまたはワクチンへのその使用

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Publication number: JPH09508374A
Application number: JP7519897A
Authority: JP
Inventors: ザイデル，クリストフ; ヘルマン，ルパート; ホース，エヴァ; バッツ，ハンス−ゲオルグ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 1997-08-26
Anticipated expiration: 2018-03-17
Also published as: DE4402756A1; ES2145265T3; DE59508137D1; ATE191568T1; WO1995020764A1; US6210901B1; JP3387928B2; EP0741869B1; EP0741869A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗体に対する免疫学的結合物質、およびその物質のイムノアッセイにおける使用とワクチンとしての使用に関する。免疫学的結合物質は、天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して特異的に反応する抗体に特異的に結合し、さらに、検出可能な標識を担うか、または固相に結合しているか、または特異的結合分子を介して固相に結合できるか、またはＴ細胞エピトープを含有する免疫学的に活性な分子または担体タンパク質分子に結合できるか、のいずれかであり、この物質は、特異的結合物質が天然エピトープに相当するアミノ酸配列を構成し、ここにおいて、その配列は少なくとも一つのペプチド結合またはアミノ酸に相当する箇所で修飾されるが、その修飾は以下のものであり、ａ）１または２以上の-CO-NH-ペプチド結合基がそれらとは異なる２原子または３原子ブリッジによって置換される、ｂ）アミノ酸側鎖が-CH₂-基によって短縮され、または-CH₂，-S，-O，-NH，-SO₂または-CO基によって伸長される、または、ｃ）１または２以上のアミノ酸が、HR'N-Y-COOH型のような生物起源でないL-またはD-アミノ酸によって置換される、〔ここにおいてR'は水素原子を表し、およびYはn=2-8であるような(CH₂)_n基、またはm=0-3であるような-CH-(CH₂)_m-CR¹R²R³基を表し、ここで、R¹、R²およびR³は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、枝分れのある、または枝分れのないC1-C4アルキル残基、またはフェニル、ナフチルまたはＯ、Ｓ、またはＮを含有する５−６員環ヘテロアリール残基を含み、これらはメチル、ハロゲン、NH₂、OHまたはカルボキシで置換されてもよい、またはYはCHR基であり、ここでRは天然型アミノ酸の側鎖であり、ここにおいて -CH₂-基は、-S-、-HN-、-CH=、-SO₂-、-CO-または-O-によって置換され、あるいは１または２以上のH原子がメチル、NH₂、カルボキシ、SH、ハロゲンまたはヒドロキシによって置換されている天然型アミノ酸の側鎖を表わす、ここにおいて、すべての場合において、Ｙは、いかなる天然型アミノ酸にも存在しない基となり、または、R'はメチル、エチルまたはフェニルであり、ＹはＲが天然型アミノ酸の側鎖であるCHR基を表す〕ことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】抗体に対して特異的な結合物質およびイムノアッセイまたはワクチンへのその使用本発明は、抗体に対して特異的な結合物質、イムノアッセイにおけるその使用、およびワクチンとしてのその使用、ならびに抗体に対する結合パートナーとしてこの特異的結合物質を使用する免疫学的定量方法に関する。抗体は、対応する抗原ときわめて特異的に結合することが知られている。抗体が、あるタンパク質の部分的なアミノ酸配列（エピトープ）に対して反応性である場合には、このような部分配列のみを結合に使用できることが知られている。二つの生体分子の特異的な結合は、最初は、酵素−基質結合の場合、鍵−錠の原理にたとえられた。しかしながら、６０年代に、Linus Paulingは、酵素−基質結合と抗体−抗原結合には根本的な違いがあることを認識した。酵素の結合部位は、必ずしも完全に基質にぴったりと合っているわけではない。むしろ、酵素の結合部位は、基質反応の遷移状態の構造の方に非常によく類似していると考えられ、したがって、酵素の基質に対する結合特性を失うことなしに、基質がある程度の構造上の自由度を有することが許容される。これに対して、抗体結合に関してエピトープの空間的変化を基本的に排除する抗原一抗体結合にとっては、抗原エピトープが抗体の結合部位に完全にぴったりと合うことが必要である。このような特異的なエピトープ抗体結合によってこそ、抗体によって生体から外来の物質を特異的に排除することができる。抗体が特異的に反応するエピトープは、主に二つの用途に使用される。ひとつには、エピトープが、通常は担体と結合して、こうしたエピトープに対して、またはこうしたエピトープを含有する抗原に対して反応性である抗体の生産を生体に生じさせる免疫原（ワクチン）として機能する。またひとつには、このようなエピトープを含有する抗原に対する免疫反応によって抗体が産生された体液中のその抗体を特異的に検出するためのイムノアッセイに、こうしたエピトープを使用する（たとえば感染性生物による感染後）。エピトープがポリペプチドである場合には、それらが生体内でワクチンとして使用される場合、または診断上の使用において血清のような体液と接触する場合、代謝分解によって、特に体液中に存在するプロテアーゼによって、ポリペプチドが分解されてその機能を失うという問題が生じる。治療のために、すなわち酵素またはホルモンレセプターに結合させるために生体において使用されるポリペプチドは、アミノ酸配列を修飾することによって体内の代謝分解から保護することができることが知られている。このような治療薬としてのいわゆるペプチド擬似物およびその製造に関する説明は、特に、Gianni S、”Angewandte Chemie”105(1993)1303-1326；Lee，Bull Chem．Soc．Jpn 66 （1993）2006-2010 およびDorsch ら、”Kontakte”（Darmstadt）1993(2)に述べられている。しかしながら、周知のとおりエピトープ−抗体結合の高い特異性ゆえに、この修飾方法は抗体に結合するエピトープおよび抗体産生のための免疫原としてのエピトープには適用できないと思われた。最近、ロンドンで行われた第三回 European BIAcore Symposium 1993で、ペプチド-ヒト血清アルブミン融合産物がこのようなポリペプチドエピトープの安定化のために提唱された（S．Reboulら、発見部門におけるバイオコアの統合）。しかしながら、ペプチドエピトープとヒト血清アルブミンとの結合は、単にポリペプチドの酵素的分解をある程度遅延させるのみで、分解を阻止するわけではない。本発明の目的は、抗体を産生するためにワクチンのエピトープとして機能することができ、イムノアッセイにおいては、一定の天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応性の抗体を検出するために機能することができる結合物質であって、さらに、代謝安定性、特にプロテアーゼ安定性を変化させ、または動物体内での免疫原として作用の持続時間、または試料として体液を使用するイムノアッセイにおける結合パートナーとしての作用の持続時間を変化させたが、それにもかかわらず、対応する天然型エピトープに対して反応性の抗体と、特異的かつ選択的に結合することができ、またはこうした抗体を免疫応答において産生することができる結合物質を提供することであった。この目的は、請求の範囲に明記したように本発明によって達成される。驚くべきことには、抗原−抗体反応の極めて高い特異性にもかかわらず、本発明の方法でアミノ酸配列を修飾することによって生じた天然型エピトープポリペプチド配列における構造的な変化は、非修飾エピトープに対して反応性の抗体に対する修飾エピトープの結合を妨げないことが明らかになった。しかしながら、非修飾エピトープと比較して、修飾エピトープは、体液との接触に際して、または動物の代謝に際して、たとえば内因性プロテアーゼに対する安定性の変化といった、異なる代謝上の特性を示す。本発明によれば、天然型エピトープのアミノ酸配列の中のアミノ酸の修飾として、以下のような可能性が考えられる：ａ）少なくとも一つのペプチド結合の-CO-NH-基の、２原子または３原子ブリッジによる置換（骨格修飾）。２原子ブリッジは、-NH-CO-，-CH₂-CH₂-，-CH=CH-，-CH₂-NH-，-NH-CH₂-，-O- CH₂-，-CH₂-O-，-CH₂-S-，または-S-CH₂-基と考えるのが適当である。３原子ブリッジは、-CH₂-CH₂-CH₂-基と考えるのが望ましく、ここで-CH₂-は、やはり-O- または-NH-、-S-または-CO-基で置換可能である。２原子ブリッジの方が望ましい。 -CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-または-NH-CO-基が特に望ましい。もし、たとえば、ペプチドの-CO-NH-基が-NH-CO-基に置換されると、形式的には天然型エピトープの二つのアミノ酸からジアミンおよびジカルボン酸が得られる。もし、たとえば、-C O-NH-基が-CH₂-CH₂-基に置換されると、形式的には本発明の結合物質の配列内にアミノ吉草酸誘導体が含まれる。ｂ）天然型エピトープの１または２以上のアミノ酸側鎖の伸長または短縮。この場合、追加の-CH₂-，-S-，-O-，-NH-，-SO₂-，-CO-基を組み込むこと、または側鎖のβ−メチレン基を除くことが望ましい。エピトープのすべてのアミノ酸に存在する側鎖においてこれを実施することが望ましい。側鎖だけが修飾されている場合、天然型アミノ酸はこの方法で製造されるはずである。ｃ）１または２以上の、HR'N-Y-COOH型のような生物起源でないＬ−またはＤ−アミノ酸による、天然型エピトープ中の天然型アミノ酸の置換。ここにおいて、R'は水素原子を表し、Yはn=2-8であるような(CH₂)_n基、または m=0-3であるような-CH-(CH₂)_m-CR¹R²R³基を表す。後者において、R¹、R²およびR³ は、同一でも、異なっていてもよく、水素原子、枝分れのある、または枝分れのないC1-C4アルキル残基、またはフェニル、ナフチルまたはＯ、Ｓ、またはＮを含有する５−６員環ヘテロアリール残基を表すが、これらはメチル、ハロゲン、NH₂、OHまたはカルボキシルで置換されてもよい。または、上記アミノ酸において、YはCHR基を表し、ここでRは天然型アミノ酸の側鎖を表すが、ここにおいて-CH₂-基は、-S-、-HN-、-CH=、-SOB-、-CO-または-O-によって置換され、あるいは１または２以上のH原子がCH₃、NH₂、カルボキシル、SH、ハロゲンまたはヒドロキシルによって置換される。ここにおいて、すべての場合において、Ｙは、いかなる天然型アミノ酸にも存在しない基となり、または、R'はメチル、エチルまたはフェニルであり、ＹはＲが天然型アミノ酸の側鎖であるCHR基を表す。上記の場合、ハロゲンはF、Cl、Br、またはヨウ素であるが、特にClと考えられる。ヘテロアリール残基の中で、ピリジン、ピロール、フランおよびチオフェンが特に望ましい。本発明の結合物質は、天然型アミノ酸配列からなる対応するエピトープを有する抗原に対して反応性であるような抗体と結合する。特に、こうした抗体は、感染性生物のエピトープに対して反応性の抗体を包含する。例は、HCVまたはHIVウイルスである。天然型アミノ酸配列を有するエピトープは、たとえば感染性生物のような天然抗原の天然型アミノ酸からなる、抗原によって産生された抗体と結合するために必要な、最小のアミノ酸配列であると考えられる。これは、最低６個のアミノ酸、望ましくは少なくとも10個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。もちろん、それ以上のアミノ酸をエピトープのアミノ酸配列に、そのC-またはN-末端で連結することができる。しかしながら、これらは、もはや抗体結合に重要な寄与をしない。本発明の免疫学的結合物質は、少なくともこのような天然エピトープのアミノ酸配列に相当するはずであるが、本発明の方法により修飾されるこうしたアミノ酸配列内に最低１部位を有する。ペプチド結合の-CO-NH-基は、本発明にしたがって置換されることが望ましく、特に配列内の随伴するアミド結合が特にプロテアーゼによる切断を受けやすい位置で置換されることが望ましい。これに関して、考えられうるそれぞれのプロテアーゼ切断部位について-CO-NH-基を加水分解に安定な原子団で置換する必要はない。さまざまな体液中で問題となるプロテアーゼの濃度および種類は当業者に公知である。しばしば見出されるプロテアーゼとしては、たとえば、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、トロンビン、プラスミンまたはカリクレインがある（例、N．Katunumaら、Japan，Sci．Soc．Press．Tokyo /Springer Verlag Berlin，37-44ページ(1983)）。さらに、さまざまなプロテアーゼの切断部位のそれぞれのアミノ酸配列も当業者に公知である。また、非特異的プロテアーゼも存在する。たとえば、アミノ酸配列の末端にあるプロテアーゼ切断部位は特に切断を受けやすい。この場合、そうしたアミノ酸配列はエキソペプチダーゼによる分解のために特に危険な状態である。さらに、グリシンを含有するペプチド配列は、グリシンに側鎖がないことで特に非特異的プロテアーゼによる加水分解攻撃が助長されるため、特に切断を受けやすい。ペプチダーゼ攻撃を受けやすいアミド結合、特にグリシンのペプチド結合だけを本発明にしたがって修飾することによって、天然型エピトープと比較して、プロテアーゼによる分解に関して本発明の結合物質の安定性を向上させることができる。本発明の結合物質を、たとえば、パンクレアチン、しばしば存在するプロテアーゼの混合物（カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、エラスターゼを包含する）またはプロナーゼ（アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルカリ性および中性ペプチダーゼを包含する）に曝すことによって、本発明の結合物質のプロテアーゼ安定性を好適に判定することが可能である。ペプチド断片の出現したときのHPLC分析によって、結合物質の酵素分解による減少を測定することができる。 -CO-NH-基を-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-または-NH-CO-基で置換することが特に望ましい。配列の末端をさらにブロックすることによって、結合物質はエキソペプチダーゼに対していっそう安定化される。免疫学的結合物質は、検出可能な標識分子、固相、または固相に特異的に結合可能な特異的結合分子のいずれかに結合される。この結合は、結合物質のＣ−またはＮ−末端を介した直接的な、またはスペーサーを介した、共有結合であることが望ましい。たとえば、放射能、化学ルミネセンス、りん光、蛍光または電気化学ルミネセンスによって、または目に見える色によって、検出可能な標識が直接、間接に測定可能なシグナルを生じる。間接的な測定可能なシグナルはたとえば酵素標識の場合である。この場合、酵素基質の添加によって着色が生じる。酵素標識の例としては、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはパーオキシダーゼによる標識がある。結合物質は、当業者に公知の方法にしたがって固相に結合される。たとえば、ビーズ、プラスチックチューブ、マイクロタイタープレートまたは試験用検査担体が固相として機能する。また、免疫学的結合物質は、それを介して固相に結合できるような特異的な結合分子と結合することもできる。望ましい例としては、ビオチンがあり、ビオチンは結合物質のN-末端に結合し、ストレプトアビジンで被覆した表面に特異的に結合することができる。本発明の結合物質は、イムノアッセイに有利に使用することができる。抗体に特異的に結合する二つの結合パートナーとともに抗体試料をインキュベートし、抗体-結合パートナー複合体の形成を結合パートナーのうちの少なくとも一方が、本発明の結合物質であることを特徴とする適当な方法で定量することによって、対応する天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応性を有する抗体を検出するための、サンドイッチ原理に基づくイムノアッセイにおいて、発明の結合物質を特に有利に使用することができる。このようなイムノアッセイは、不均一系イムノアッセイとして実施することが望ましい。この方法において、結合パートナーの一方は、直接またはスペーサーを介して固相に結合するか、たとえばビオチンのような、イムノアッセイ中に固相に結合できる特異的結合部位に結合するか、のいずれかである。本発明の結合物質をこのような結合パートナーとして使用する。第２の結合パートナーは標識される。標識分子を付与された本発明の結合物質はこのような結合パートナーのために使用することが可能であり、検出すべき抗体に対して反応性の標識された抗-抗体のために使用することもできる。望ましい標識は、酵素標識であり、または、たとえば金属コロイド溶液を用いた直接標識である。イムノアッセイを実施するために、検出すべき抗体試料を第１の結合パートナー、標識された結合パートナー、および固相とともに同時にまたは連続的にインキュベートし、第1の結合パートナー、抗体および標識された結合パートナーからなる固相−結合複合体を生成させる。次に、液相中の結合していない標識結合パートナーを固相に結合した標識結合パートナーから分離することが望ましく、二相のうちの一方において、測定すべき抗体の存在または濃度の指標として、標識を測定する。たとえば、酵素標識の場合、測定のために上記に酵素基質溶液を添加する。測定は、たとえば、可視的に、または光度測定によって、行なうことができる。本発明のもう一つの主題は、Ｔ−細胞エピトープを含有するアミノ酸配列または担体分子に結合した本発明の結合物質を含有する免疫原またはワクチンである。ワクチンは、それぞれの天然型アミノ酸配列を有するエピトープを含有する抗原によって引き起こされる感染の予防処置のために使用される。免疫原として使用されるためには、本発明の結合物質のC-またはN-末端を、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘモシアニン、ウシ血清アルブミンまたはエデスチンのような適当な高分子担体タンパク質に結合させなければならない。たとえば、アミノ酸配列のN-末端にマレインイミドヘキサン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを介して結合することができる。一般に、ワクチン（免疫原）は本来はペプチドであるＴまたはＢ細胞のエピトープでもあるので、本発明の結合物質はＴ細胞エピトープを含有するアミノ酸配列にも結合することができる。ワクチンは、薬理学上有効な用量および製剤学上許容しうる剤型として存在する。天然型エピトープと異なるアミノ酸構造を有する人工エピトープに対する抗体が免疫応答において産生されるが、このような抗体は天然型エピトープにも結合し、したがってそれをこうしたエピトープを含有する抗原に対する免疫防御のために使用することができる。しかしながら、その配列が修飾されているため、動物体内での代謝について変化した挙動、たとえばプロテアーゼ安定性の変化を示す。天然型エピトープのアミノ酸配列を含有する抗原を免疫学的定量法で検出するために使用することができる抗体を、一般的な免疫感作の方法によって得るために、本発明の免疫原を使用することもできる。したがって、本発明の別の主題は、たとえば担体タンパク質分子のような、Ｔ細胞エピトープを含有する分子に結合した該当する本発明の結合物質を用いて、哺乳動物を免疫感作すること、および産生された抗体をたとえば血清や脾臓から公知の方法によって単離することを特徴とする、天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応する抗体の製造方法である。本発明の結合物質は、一方では、生物体内において変化した代謝挙動、特に変化したプロテアーゼ安定性を示す。このような変化にもかかわらず、上記物質は天然型エピトープに対して反応性の抗体に対するイムノアッセイにおいて選択的に結合する。さらに驚くべきことには、本発明の結合物質、特にCONH基置換(骨格修飾)を有する物質は、感染直後の患者をモニターする時、ごく初期の段階で血清転換をしばしば検出することができることが明らかになった。さらに、本発明の結合物質を用いて、特に側鎖修飾を有する同物質を用いて、陽性の血清に対する感度は天然型エピトープに匹敵するが、ゼロ血清の特異的な検出が可能である。当業者に公知のペプチド合成法にしたがって、本発明の結合物質を製造することができる(たとえば、Merrifield，JACS 85(1964)，2146)。したがって、本発明のもう一つの主題は、天然型エピトープ配列のうち少なくとも一つのペプチド結合の位置で、配列中にこのペプチド結合を形成する第１のアミノ酸NH₂-CHR¹-C OOHおよび第２のアミノ酸NH₂-CHR²-COOHの代わりに非-天然型アミノ酸NH₂-CHR¹- X-CHR²-COOHをペプチド合成のために使用すること(ここで、R¹およびR²は同一でも異なっていてもよいが、天然型アミノ酸の側鎖を構成し、Xはプロテアーゼに安定な原子団、特に２原子または３原子鎖、たとえば-NH-CO-，-CHB-CHB-，-C H=CH-，-NH-CHB-，-CHB-NH-，-CHB-O-，-O-CHB-，-CHB-S-，-S-CHB-または-CHB- CHB-CHB-基を表す)を特徴とする、C-末端となるアミノ酸の担体への結合、C-末端から開始する任意のアミノ酸配列の逐次合成、次にこのアミノ酸配列の担体からの切断、および担体からの切断前または後の標識分子、特異的固相結合分子、固相、または担体分子との結合からなる、本発明の結合物質の製造方法である。修飾が、アミノ酸側鎖における変化である場合、または天然型エピトープの天然型アミノ酸を人工的な、非天然のアミノ酸によって置換することである場合、本発明の製造方法は、エピトープに属する天然型アミノ酸の代わりに適切に修飾されたアミノ酸を使用することを特徴とする。このような人工アミノ酸の一部は市販されており、または当業者に公知の方法によって合成可能である（例、L．G azerroら，Solid phase synthesis,403ページ、1990；G．Jung，Peptides 1988 ，Walter de Gruyter，Berlin，New York 1989，646-648ページ；A．Jager，Pep tides 1992，Escom Science PublisherB．V．1993，47-49ページ；R．Varrel，P eptides 1990，Escom Science Publishers B．V．1991，642-664ページ，393-39 4ページ，385-386ページ，370-371ページ）。アミノ酸配列を合成するために、特に、アミノ酸のC-末端をそのカルボキシル基を介して、容易にろ過することのできる不溶性ポリマーに結合し、次に、C-末端で開始してペプチド鎖を段階的に合成する。この目的のために、N-末端保護アミノ酸をポリマーの反応性基と反応させる。N-α保護基を担体に共有結合したアミノ酸からはずし、得られたアミノアシルポリマーを次のN−保護アミノ酸と反応させる。N-α保護基を担体に共有結合したジペプチドからはずし、得られたアミノアシルポリマーを次のN−保護アミノ酸と反応させる。すべての過剰な試薬および副生成物は、単純なろ過によって除去される。この方法で必要とする修飾ペプチド配列を合成したならば、ポリマー担体の結合基とC−末端アミノ酸との共有結合を切断する。溶液中に存在するペプチドから不溶性担体を単純なろ過によって除去する。ペプチドをクロマトグラフィーの手法によって精製する。ペプチドの、固相、担体分子、特異的固相結合部位、または標識との結合は、公知の方法にしたがって行われ、ペプチド配列のN−末端で行なうことが好ましい。ビオチニル化は、たとえば PNAS USA 80,1983，4045にしたがって行なうことができる。望ましいビオチニル化剤はビオチニルアミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。このような原子団を固相合成の最後に修飾アミノ酸配列のN−末端に導入しておくこともできる。実施例１ＨＣＶウイルスのコア−エピトープに対して反応性の抗体に対して本発明のビオチニル化結合物質を用いたイムノアッセイの方法。使用した結合物質において、１または２以上のCO-NHペプチド結合基を本発明にしたがって置換し（コア2mＩ−コア2mVI）、天然型エピトープ”コア2m”と比較した。それぞれの場合について、血清20μlをBoehringer Mannheim Company製のストレプトアビジン被覆ES22チューブに入れた（陰性血清、陽性血清、陽性血清Ａ− Ｃ）。次に、1000μｌのペプチド溶液(コア２ｍまたはコア２ｍＩ−VII濃度、40 mmol/l,pH7.0のリン酸カリウムバッファー中100ng／ml）をピペットにより添加し、Boehringer Mannheim Company製ES22装置内で60分間放置した。60分のインキュベーション後、ペプチド/血清溶液をピペットにより除去し、チューブを試験洗浄溶液：40mmol/lリン酸カリウムバッファー、pH7.0で洗浄する。次に1000 μlのパーオキシダーゼ結合体溶液(抗Fcγ抗体と結合したパーオキシダーゼ、0. 5U/ml)をピペットにより添加し、さらに60分間インキュベートする。結合体溶液をピペットにより除去し、チューブを洗浄溶液で洗浄する。その後、1000μｌの ABTS溶液（1.9mmol/l）をピペットにより添加し、さらに60分間インキュベートする。60分のインキュベーション後、溶液をピペットによりチューブから光度計に移し、405nmで測定する。表１には、天然型エピトープ(コア2m)と比較した人工エピトープ、コア２ｍＩ−VIの相対反応性を示す。反応性は、標準曲線と比較したイムノアッセイの測定結果から導かれた。修飾にもかかわらず、人工エピトープは特異的かつ選択的に結合する(たとえばコア2mＩ)。相対反応性ペプチド抗原Ｉ-VIについて使用した相対濃度は、それらのHPLC積分値から導いた。抗原Ｉ−VIの反応性は、同一濃度の対照抗原コア2mと比較して定量した。実施例２パンクレアチンを用いたコア2m消化のための実験方法。まず最初に、およそC=1-3mg/mlとなるよう蒸留水でコア2m溶液を調製した。この溶液を分析用HPLCに注入した（注入量＝40μl）。次に、再度HPLCに注入するときその面積が40 000となるようにこの溶液を希釈した。たとえば、コア2mIV溶液の面積は、注入量40μｌについて分析用HPLCで60 0 000であった。そこで、この溶液の２容量を１量の蒸留水で希釈する。それぞれの場合において、200μlの上記のように調整されたコア2m溶液を50μ lのパンクレアチン溶液(C=1mg/ml)と混合した。上記溶液試料を55分後と125分後に分析用HPLCに注入した。対照として、それぞれのコア2m溶液試料200μlを50μl蒸留水と混合し、分析用HPLCに注入した。それぞれのペプチドの分解率を分析用HPLCにおけるペプチドのピーク面積から決定することができる。表２は、55分後と125分後の、個々のエピトープ配列のプロテアーゼ分解に対する抵抗性の割合を％で示す。天然型エピトープ“コア2m”が完全に分解される (０％抵抗性)のに対して、人工エピトープコア2mＩ-VIは、それよりもかなりプロテアーゼに対して抵抗性である。実施例３血清中で安定なHCV抗原コア2mＩの合成 Zinsser Analytics Company製 SMPS 350 ペプチド合成装置を用いたFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）固相ペプチド合成によって、Advanced Chemtec h Company製 4-（2'，4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル）-フェノキシ樹脂SA-5030 15mg上で、0.52mmol/gをロードして抗原を合成した。270μlのジメチルホルムアミド溶液中の90μmol の1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび90 μmol のN,N-ジイソプロピルカルボジイミドおよび105μlジメチルホルムアミド溶液とともに、以下のN-Fmocアミノ酸誘導体のそれぞれ90μmolを、合成している固相結合ペプチドに２回続けて結合させた：バリン、δ-アミノ吉草酸、バリン、グリシン、グリシン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、リジン（te rt.ブチルオキシカルボニル）、アスパラギン酸（tert.ブチルエステル）、グルタミン（トリチル）、プロリン、β-アラニン、ε-アミノカプロン酸、β-アラニン、tert.ブチルオキシカルボニル-リジン、ジメトキシトリチルビオチン。結合時間は、40および50分である。Fmoc保護基の切断段階は、それぞれの２回結合の後、50％ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液600μlを用いて行なった。切断時間は20分である。洗浄段階は、各反応段階の後、各場合において700μlジメチルホルムアミドを用いて８回行なう。90％トリフルオロ酢酸、３％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび３％チオクレゾールの混合物750μlで処理することによってペプチドが遊離される。15ml冷ジイソプロピルエーテルを合わせた濾液に加えることによって生成物を沈殿させ、濾過によって単離する。残渣を 3mlの50％酢酸に溶解し、凍結乾燥する。凍結乾燥工程を２回繰り返す。逆相HPL Cによって、純度94％の粗精製物が17mg得られる（LSIMS: M-⁺; マトリクス:mNBA 、加速電圧:6kV）。実施例４：プロテアーゼに対する抵抗性の増加したテトラマーHCVワクチンコンポーネントの合成ワクチンは、エプスタイン−バーウイルス（EBV LMP 43-53）由来のT細胞エピトープに結合したHCV抗原（HCVコア18-33）のB細胞エピトープからなり、ここにおいて天然型エピトープのグリシン−グリシンペプチド結合は、いずれのエピトープにおいてもCH2-CH2基に置換される（δ-アミノ吉草酸の組み込みに相当する）。合成ワクチンを、Zinsser Analytics Company製 SMPS 350ペプチド合成装置を用いたFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）−固相ペプチド合成によって、 Advanced Chemtech Company製 4-（2'，4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル）-フェノキシ樹脂SA-5030 15mg上に、0.22mmol/gをロードして合成した。の270μlのジメチルホルムアミド溶液中90μmol のl-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび90μmol のN,N-ジイソプロピルカルボジイミドの105μlのジメチルホルムアミド溶液とともに、以下のN-Fmocアミノ酸誘導体のそれぞれ90μmolを、合成している固相結合ペプチドに2回続けて結合させた：Ｎε-Fmocリジン、Nε- Fmocリジン、β−アラニン、β−アラニン、ロイシン、ロイシン、アラニン、δ -アミノ吉草酸、スレオニン（tert．ブチルエステル）、トリプトファン、アスパラギン酸（tert．ブチルエステル）、セリン（tert．ブチルエステル）、メチオニン、バリン、バリン、δ-アミノ吉草酸、バリン、イソロイシン、グルタミン（トリチル）、グリシン、δ-アミノ吉草酸、プロリン、フェニルアラニン、リジン（tert．ブチルオキシカルボニル）、バリン、アスパラギン酸（tert．ブチルエステル）、グルタミン（トリチル）、プロリン、酢酸。結合時間は、40および50分である。Fmoc保護基の切断段階は、それぞれの２回結合の後、50％ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液600μlを用いて行なった。切断段階は20分である。洗浄段階は、各反応段階の後、各場合において700μlのジメチルホルムアミドを用いて８回行なう。ろ過により溶媒を除去した樹脂を、20分以内に、その後140分間、90％トリフルオロ酢酸、３％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび３％チオクレゾールの混合物750μlで処理することによってペプチドが遊離される。15mlの冷ジイソプロピルエーテルを、合わせた濾液に加えることによって生成物を沈殿させ、濾過によって単離する。残渣を3ml の50％酢酸に溶解し、凍結乾燥する。凍結乾燥工程を２回繰り返す。逆相HPLCによって、純度42％の粗精製物13mg得られ、そのうち4mgは分取用逆相HPLCによって精製した。収量：0.7mg（LSIMS: M-H⁺;マトリクス:mNBA、加速電圧:6kV）。実施例５ HCVエピトープ”コア１”［表３および図１および図２の”12 D1”］の様々な側鎖修飾を受けた本発明の結合物質（ミメトープ）、およびHCVエピトープ”コア２”［表４および図３の”1B2”］のペプチド結合-修飾エピトープの反応性。様々な血清B3からB20について標準抗原コア１（12D1）およびコア２（1B2）と比較したミメトープの反応性を示す（図１〜７）。血清RSおよびRS2（図１および図２）およびB112，B119，B126，B129およびB117（図３）は、陰性血清である。図１は側鎖修飾ミメトープを用いて、陰性血清が特異的に検出されることを示す。ミメトープは天然型エピトープに匹敵する反応性を示し、場合によってはより高い反応性を示すことさえある。図４−７は、最近感染した個体の血清をモニターする場合、比較的早期に、またはごく早期に、血清変化をミメトープによって検出することができることを示す。反応性は、実施例１と同様に判定した。実施例６ HIVウイルスのgp32エピトープに対して反応する抗体に対する本発明のビオチニル化した結合物質を用いたイムノアッセイ法。使用した結合物質（gp32-4からgp32-20）において、天然型エピトープ（HIV g p32Bi”標準配列”）と比較して１または２以上のアミノ酸を非天然アミノ酸１ −７（表３）で置換した。実施例１と同様に５種類の異なる血清についてイムノアッセイを行った。図８は様々な結合物質の天然型エピトープと比較した相対反応性を示す。場合によっては、天然型より高い反応性を測定することさえ可能であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/531 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/547 0276−2Ｊ 33/547 (72)発明者ホース，エヴァドイツ連邦共和国ディー−82319 スターンベルグ，アムミュールベルグ１エイ番地 (72)発明者バッツ，ハンス−ゲオルグドイツ連邦共和国ディー−82327 テューツィング，トラウビンガーシュトラーセ 63番地

Claims

【特許請求の範囲】１．特異的結合物質は天然エピトープに対応するアミノ酸配列に相当し、ここにおいて、その配列は少なくとも一つのペプチド結合またはアミノ酸のところで修飾されるが、その修飾は以下のものであり、ａ）１または２以上の-CO-NH-ペプチド結合基がそれとは異なる２原子または３原子ブリッジによって置換される、ｂ）アミノ酸側鎖が-CH₂-基によって短縮され、または-CH₂，-S，-O，-NH，-SO₂ ，-CO基によって伸長される、または、ｃ）１または２以上のアミノ酸が、HR'N-Y-COOHのような生物起源でないL-またはD-アミノ酸によって置換される、〔ここにおいて R'は水素原子を表し、 Yはn=2-8であるような(CH₂)n基、またはm=0-3であるような-CH-(CH₂)m-CR¹R²R³ 基を表し、および R¹、R²およびR³は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、枝分れのある、または枝分れのないC1-C4アルキル残基、またはフェニル、ナフチルまたはＯ、Ｓ、またはＮを含有する５−６員環ヘテロアリール残基を表すが、これらはメチル、ハロゲン、NH₂、OHまたはカルボキシで置換されてもよい、または YはCHR基を表し、ここでRは天然型アミノ酸の側鎖を表し、ここにおいてRは-C H₂-基が、-S-、-HN-、-CH=、-SO₂-、-CO-または-O-によって置換されているか、あるいは１または２以上のH原子がメチル、NH₂、カルボキシル、SH、ハロゲンまたはヒドロキシによって置換されている天然型アミノ酸の側鎖を表わす、ここにおいて、すべての場合において、Ｙは、いかなる天然型アミノ酸にも存在しない基となり、または、 R'はメチル、エチルまたはフェニルであり、ＹはＲが天然型アミノ酸の側鎖であるCHR基を表す〕ことを特徴とする天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して特異的に反応する抗体に特異的に結合し、さらに、検出可能な標識を担うか、または固相に結合しているか、または特異的結合分子を介して固相に結合できるか、またはＴ細胞エピトープを含有する分子または担体タンパク質分子に結合しているか、のいずれかである、免疫学的結合物質。２．ペプチド結合の-CO-NH-基が、-NH-CO-，-CH₂-CH₂-，-CH-CH-，-CH₂-NH-，-N H-CH₂-，-S-CH₂-，-CH₂-S-，-CH₂-O-，-O-CH₂-,または-CH₂-CH₂-CH₂-基によって置換される、請求項１記載の免疫学的結合物質。３．-CO-NH-基が、-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-，-NH-CO-基によって置換される、請求項１または２記載の免疫学的結合物質。４．プロテアーゼ切断を受けやすいペプチド結合の箇所で-NH-CO-基が置換される、請求項１−３記載の免疫学的結合物質。５．少なくとも一方がグリシンである二つのアミノ酸の間で-CO-NH-基が置換される、請求項１−４記載の免疫学的結合物質。６．すべてのアミノ酸側鎖が-CH₂基によって伸長される、請求項１記載の免疫学的結合物質。７．結合物質が固相結合部位に特異的な結合分子と結合している、請求項１−６記載の免疫学的結合物質。８．特異的な結合分子がビオチンである、請求項７記載の免疫学的結合物質。９．免疫学的結合物質が、天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応する抗体に特異的に結合し、担体分子と一緒になって免疫応答として前記の抗体を産生することができ、前記結合物質が免疫学的に活性な担体に結合した請求項１−８記載の結合物質であるような、担体分子またはＴ細胞エピトープを含有する免疫学的に活性な分子に結合した免疫学的結合物質を免疫原として含有するワクチン。１０．請求項９記載の免疫原を用いて哺乳動物を免疫感作し、抗体を常法により単離する、天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応する抗体の製造方法。１１．請求項１−８記載の少なくとも一つの結合物質を抗体に対する結合パートナーとして使用する、抗体に特異的に結合する二つの結合パートナーとともに抗体試料をインキュベートし、抗体-結合パートナー複合体の形成を適当な方法で定量することによって、天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応性の抗体を検出するためのイムノアッセイ。１２．抗体試料を特異的な結合物質、標識された結合パートナーおよび固相と接触させること、および固相または液相における標識を被検体の量の指標として測定することを含んでなる、固相に結合しているか、または特異的な結合分子を介して固相に結合でき、抗体に特異的に結合する第１の結合物質、および抗体に特異的に結合する標識された結合パートナーをもちいて、天然型アミノ酸配列を有するエピトープに対して反応性である抗体を検出するための免疫学的定量方法であって、前記特異的な結合物質が請求項１−８記載の結合物質であることを特徴とする方法。１３．標識された結合パートナーもまた請求項１−８記載の標識された特異的結合物質である、請求項３記載の免疫学的定量方法。１４．標識された結合パートナーが抗体に対して反応する抗−抗体である請求項３記載の方法。１５．結合パートナーが酵素または化学ルミネセンスまたは蛍光標識によって標識される、請求項３−５記載の方法。１６．請求項１−８記載の特異的結合物質のイムノアッセイへの使用。１７．請求項９記載の特異的結合物質のワクチン生産への使用。１８．ペプチド合成するにあたって、プロテアーゼ切断を受けやすいペプチド結合または天然型エピトープ配列のアミノ酸の箇所で以下の修飾を行う、ａ）ペプチド結合を連続的に形成するアミノ酸NH₂-CHR¹-COOHおよびNH₂-CHR²-CO OHの代わりに非-天然型アミノ酸NH₂-CHR¹-X-CHR²-COOHをペプチド合成のために使用する〔ここにおいて、R¹およびR²は同一でも異なっていてもよいが、天然型アミノ酸の側鎖を構成し、Xは２原子または３原子ブリッジをあらわす〕ｂ）天然型エピトープのアミノ酸の代わりに、アミノ酸側鎖が-CH²-基によって短縮され、または-CH₂-，-S-，-O-，-NH-，-SO₂-，-CO基によって伸長されたアミノ酸を使用する、またはHR'N-Y-COOHのような生物起源でないL-またはD-アミノ酸を使用し〔ここにおいて R'は水素原子を表す、および Yはn=2-8であるような(CH₂)n基、またはm=0-3であるような-CH-(CH₂)m-CR¹R²R³ 基を表す、および R¹、R²およびR³は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、枝分れのある、または枝分れのないC1-C4アルキル残基、またはフェニル、ナフチルまたはＯ、Ｓ、またはＮを含有する５−６員環ヘテロアリール残基を表すが、これらはメチル、ハロゲン、NH₂、OHまたはカルボキシで置換されてもよく、または YはCHR基を表し、ここでRは天然型アミノ酸の側鎖を表し、ここにおいて-CH₂-基は、-S-、-NH- 、-CH=、-SO₂-、-CO-または-O-によって置換され、あるいは１または２以上のH 原子がCH₃、NH₂、カルボキシル、SH、ハロゲンまたはヒドロキシによって置換される、ここにおいて、すべての場合において、Ｙは、いかなる天然型アミノ酸にも存在しない基となり、または、 R'はメチル、エチルまたはフェニルであり、ＹはＲが天然型アミノ酸の側鎖であるCHR基を表す〕ことを特徴とする、Ｃ−末端となるアミノ酸の担体への結合、公知の方法によるアミノ酸配列の逐次合成、前記担体からのこの配列のＣ−末端の切断、および担体からの切断前または後のこの配列の標識分子、特異的固相結合分子、固相、担体分子またはＴ細胞エピトープを含有する分子への結合による、請求項１記載の特異的結合物質の製造。