JPS63102700A - ヒトのグリコアルブミンの定量において使用するための抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １週ノと１２一 本発明は、ヒトの血液試料中の、ここではグリコアルブ
ミン記す、アルブミンのグリコシル化した形態の決定に
関するものである６個々の血液中のアルブミンのグリコ
シル化の程度の決定は糖尿病患者におけるグルコース濃
度抑制の有用な指オスである。特に、本発明はヒトのア
ルブミン中の５２５の位置におけるグリコシル化リシン
残基を特異的に認識する単クローン性抗体の製造に関す
るものである。

アルブミンは血液の主な血清蛋白質であり循環中Ｃ′１
０日の半減期を有している。非酵素的なグリコシル化反
応は、すべての個体中の僅かな割合に対するグルコース
の共有結合をもたらす。非酵素的なグリコシル化は循環
するグルコースの濃度に依存するから、血液中グルコー
スの比較的高い平均濃度を有する糖尿病患者はグリコシ
ル化アルブミンの増大を有している。それ故、糖尿病状
態の重さは、グリコシル化アルブミンの割合に反映する
。

類似の反応はグルコースとヘモグロビンの間で生じてヘ
モグロビンＡｌｃ及びその他のグリコシル化ヘモグロビ
ンを産生ずる。ヘモグロビンは１２０日の寿命を有し、
それ故、グリコシル化ヘモグロビン値の決定はその期間
に対する平均的な循環グルコース濃度を反映するのに対
して、グリコアルブミンの定量は１０日の平均循環グル
コース濃度ヲ表わす。グリコシル化ヘモグロビン値の重
要性は、糖尿病の症状の正確な評価のために臨床的にｍ
要であるものとして広く認識されている。グリコシル化
ヘモグロビンのための検定は、ヘモグロビン分子が着色
しており、従って安価な分光計を用いて容易に定量する
ことができるから、比較的容易に発達した。アルブミン
は無色であり、グリコアルブミンの定量のための方法は
炭水化物を着色物に誘導体化するか又はグリコアルブミ
ンの蛋白質部分で反応させて着色物質を生じさせること
を必要とする。この理由によって、現在のところでは、
臨床検査室における大規模な使用のためのグリコアルブ
ミンの検定は存在していない。

多くのグリコアルブミンの分析方法の提案が文献により
公知である。それらの中の主なものはボロン酸塩クロマ
トグラフィー及びチオバルビッール酸分析に基づくもの
である。ボロン酸塩クロマトグラフィ一方法は、たとえ
ば、ピアースケミカル社のグリコゲルに対して結合した
、結合蛋白質の比色定量を包含する。この検定において
は、血清をボロン酸塩アフィニティーカラムに付与する
と、そこですべてのシスージオール含有物茸（たと乏ば
、グリコアルブミン及びその他の糖蛋白質）が結合する
。これらの物質を次いで溶出し、蛋白質と反応して着色
生成物を与える染料を添加したのちに、結合及び溶離画
分の両者を定量する。この方法の主要な欠点は血清中の
多くの非アルブミン蛋白質が糖蛋白質（たとえば、免疫
グロブリン）であり、それ故、ボロン酸塩クロマトグラ
フィー検定において結合し且つ測定されること；カラム
方法は分離と分析のために多くの段階を要し且つ自動１
ヒが容易でないこと；及びグルコースがボロン酸塩結合
を妨害することを示唆するデータもまた存在すること、
である。チオバルビッール酸検定においては、ケトアミ
ン−蛋白質付加物を、しゆう酸による加水分解によって
５−ヒドロキシメチルフルフラールに変えて着色物を生
じさせる。

この場合の主な欠点は加水分解が１００℃以上で２〜４
時間を要すること；及び現在のところでは、標準物質又
は較正物質が入手できないことである。

グルコースとアルブミンの反応は（ａ）グルコースのＣ
−１とアルブミンのアミノ基の間のシップ塩基の生成及
び（ｂ）アミノ基の窒素に共有結合した１−デオキシフ
ルクトシル炭水化物を生じるアマトリ転位反応を包含す
る。！ルブミン分子は酵素によらないグリコシル化に対
して６０の可能部位（アミノ基）を有している。これは
リシン残基の５９のイプシロンアミノ基と蛋白質のＮ−
末端上の１つのアルファアミノ基から成っている。６０
の可１［５位の中で天然分子中では一つのリシンのみが
グリコシル化されていることが知られている。

しかしながら、他のリシンを種々な程度にグリコシル化
することが可能である。既知のリシンはリシン５２５［
蛋白質のＮ−末端から数えて５２５番目のアミノ酸−〃
−リックら、ジャーナル　オブビオロシカル　ケミスト
リー、２５Ｂ：６１４２（１９８３）］としで同定され
ており、この位置がここでも確認されている。このリシ
ンの特異的なグリコシル化及びアルブミンのグリコシル
化の速い速度についての理由は完全には明らかでない。

リシン５２５に対する特異性は、（ａ）位置５２４にお
ける隣接リシンへの近接効果及びそれによるグリコシル
化反応を一層活性化するリシン５２５のε−アミノ基の
ｐ　Ｋ　ａの低下、（ｂ）アルブミン分子の水性の外部
へのリシン５２５側頻の露出、及び／又は（ｃ）未知の
機構によってグリコシル化反応に討するリシン５２５の
反応性を増大させるアルブミン分子の３−次元的構造、
によるものと思われる。

単クローン性抗体は、合成ペプチドを含む、種種の有機
化合物への結合に対する正確な特異性を有することが知
られている。しかしながら、この方法の有用性とグリフ
アルブミンに対する免疫検定に対して認められている必
要性にもかかわらず、グリコアルブミンの定量に対して
有用な抗体の取得のための方法は未だ報告されていない
。

本明細書中ではペプチド中のアミノ酸単位に対して以下
の略称を使用する： アルギニン　　　　　　　　　Ａｒｇ アスパルチン酸　　　　　　　Ａｓｐ グルタミン酸　　　　　　　　　Ｇｌｕリシン　　　　
　　　　　　　Ｌｙｓ セリン　　　　　　　　　　Ｓｅｒ アスパラギン　　　　　　　　　Ａｓｎグルタミン　　
　　　　　　　Ｇｌｎ グリシン　　　　　　　　　　Ｇｌｙ プロリン　　　　　　　　　　　Ｐｒ。

トレオニン　　　　　　　　　”Ｉ’ｈｒアラニン　　
　　　　　　　　Ａｌａ ヒスタミン　　　　　　　　　Ｈｉｓ システィン　　　　　　　　　Ｃｙｓ メチオニン　　　　　　　　　Ｍ　ｅ　ｔバリン　　　
　　　　　　　Ｖａｌ イソロイシン　　　　　　　　エ１８ ０イシン　　　　　　　　　　　Ｌｅｕチロシン　　　
　　　　　　　Ｔｙｒ フェニルアラニン　　　　　　Ｐｈｅ トリプトファン　　　　　　　　Ｔｒｐアル７アーアミ
ノ酪酸　　　　　Ａｂａλ胛ユ灸咋 か（して本発明の目的は、ヒトの血液試料中のグリフア
ルブミンの定量のための免疫検定法の基礎として役立て
ることができるグリコアルブミンに対して特異的に結合
させるための抗体を提供することにある。糖尿病の症状
を評価するための比較的簡単で信頼性のある手段を提供
する免疫検定法に対しては、十分に認ａされでいるが未
解決の必要性が存在している。

５２５の位置におけるリシン残基、すなわち、遊離のＮ
−末端アミノ基から数えてペプチド連鎖中の５２５＠目
のアミノ酸、１こおいてグリコシル化しであるヒトのア
ルブミンに対して特異的に結合する単クローン性抗体を
生じさせることが特に本発明の目的である。本明細書中
で用いる場合に、グリコシル化したアミノ酸とは、非酵
素反応によりグルツースを用いて１−デオキシフルクト
シル残基によって変性しであるアミノ基を有するアミノ
酸を意味する。

本発明はソましいグリコアルブミン特異性を有する単ク
ローン性抗体を分泌する体細胞ハイブリドーマを取得す
るための方法を提供することによって、これら及びその
他の目的と利点を達成する。

かかるハイプリドーマは免疫原性担体物質に化学的に結
合した適当なグリコシル化ペプチドを包含する免疫原で
免疫にしである動物、好ましくはマウス、からのリンパ
球との骨髄腫細胞の常法による融合によって生成させる
。免疫原中のグリコシル化ペプチドは合成的に又は蛋白
質加水分解によって取得することができ、且つそれは第
一に非酵素反応によってグリコシル化しであるアミノ基
を有するリシン残基、及び第二に、５２５の位置のリシ
ン残基に隣接するヒトのアルブミンのペプチド配列に相
当する位置における少なくとも一つの他のアミノ酸単位
を包含している。

かくして、本発明の基クローン性抗体は、式のグリコシ
ル化したペプチド残基に対して特異的に結合するが、上
式中において、グリコ−（ＮＨ）はリシン残基中の非酵
素反応的にグリコシル化したε−アミノ基を表わし、Ａ
Ａ、及びＡＡ２の中の一つ又は両方は、好ましくは１〜
１２のアミノ酸を含有するアミノ酸の配列であって、そ
の中で、少なくとも一つ、好ましくは全部のアミノ酸単
位がリシン５２５に隣接するヒトのアルブミンのペプチ
ド配列に相当する位置にあり、且つＡＡ、及びＡ　Ａ　
２の中の一つのみがかかる配列である場合には、他のも
のは単なる結合、末端アミノ又はカルボキシル基、ある
いは付加的なアミノ酸残基である。

抗体結合部位を包含するそのフラグメントをも含む上記
の基クローン性抗体、かかる抗体を分泌するハイプリド
ーマ細胞系、かかる細胞系から基クローン性抗体を産生
するための方法、及びかかる方法において用いる細胞系
及び免疫源を取得するための方法に加えて、本発明は、
たとえば全血、血清又は血漿のようなヒトの血液試料中
のグリコアルブミンを定量するための免疫検定方法をも
提供する。この方法においては、血液試料を本発明の基
クローン性抗体又はそのフラグメントと接触させる。必
要又は所望に応じて、血液試料を先ず変性処理するか、
さもなければ、顕著な量のグリコアルブミンが試料中に
存在する場合にリシン５２５においてエピトープを暴露
出させる。然るのち、試料からのグリコアルブミンへの
抗体試薬の結合を、任意の通常の免疫検定法手順に従っ
て、試験する試料中のグリコアルブミンの量の関数とし
て定量する。本発明は合成的に、又は、免疫原中のペプ
チド残基として働らくことができるか又はその前駆体で
あるグリコアルブミンあるいは非グリコシル化フルブミ
ンの蛋白質加水分解によって調製した、新規且つ有用な
ペプチド及プそのグリコシル化形態をも提供する。

発贋しと災岸ｊＪ歓認− 第１図及ゾ第２図は、本発明において有用な免疫原を生
成させるために通常の免疫原担体物質に対して結合させ
ることができる好適ないくつかのグリコシル化ペプチド
フラグメント又は残基を示している。構造（１）及び（
２）は、リシン５２５の区域におけるグリコアルブミン
の部分的配列及び蛋白質加水分解酵素トリプシン（実線
三角）及び■８プロテアーゼ（点線三角）に対する開裂
部位を示す。リシン５２５上の星印は生体内グリコシル
化の部位を示す。構造（３）乃至（１２）は合成的に製
造することができるペプチドフラグメントを示す。

リシン５２５における以外の星印は試験管内合成の間に
付加的にグリコシル化する可能性のある部位を示す。図
面中で、且つ本明細書全体にわたって、配列は左側のＮ
−末端から右側のＣ−末端へと示されている。一層詳細
な説明を以下に実施例に示す。

奸　−形１、の　明 本発明の基クローン性抗体は、主として、ヒトのアルブ
ミン中のリシン５２５の頌域におけるグリコシル化した
ペプチド配列の結合に討するその特異性を特徴とする。

このグリコシル化残基はグリコアルブミンの顕着なりＩ
造的特徴である。本発明の抗体は、少なくとも、グルコ
ースとリシン中のε−アミノ基間の反応生成物のアマト
リ転位によって生じた１−デオキシフルクトシル変性リ
ジン単位、及びそれからのびている、リシン５２５に隣
接するグリコアルブミンに相当する位置に少なくとも一
つのアミノ酸単位を包含しているペプチド配列から成る
エピトープすなわち抗原決定部位を必要とする。エピト
ープを特性化するペプチド配列中の他のアミノ酸単位は
天然のグリコアルブミン配列中に表われるものと同一で
あっても異なっていてもよい。このようにして、エピト
ープは、抗体が結合し且つグリコアルブミン中のグリコ
シル化リシン５２５配列に対して独特である炭水化物と
ペプチド配列から成るものとして特徴付けることができ
る。抗体は式： のグリコシル化ペプチド残基と特異的に結合することが
好ましいが、上式中においてグリコ−（ＮＨ）、Ａ　Ａ
　、及びＡＡ２は前記と同様である。最低限度として、
アミノ酸配列ＡＡ、及びＡＡ２は、試験試料中に存在す
る可能性のあるグリフアルブミン中の池のグリコシル化
リジン単位又はその他の蛋白質あるいはペプチドに対し
てではなくてリシン５２５におけるグリコシル化に対し
て特異的であるため（こ１土、リシン５２５の近くのグ
リコ７ルブミン中の配列に相当する位置にあるアミノ酸
を包含していることが必要である。ＡＡ、及びＡ　Ａ　
２の一方又は両方が、グリコアルブミン中の位に５２５
におけるリシン残基に隣接するペプチド配列に正確に一
致する１〜１２のアミノ酸の配列であることが好ましい
。

リシン５２５の両方の側に１２のアミノ酸を含んでいる
グリコアルブミンの配列は次のようである（Ｎ−末端か
らＣ−末端の方向へ）ニー−１１ｅ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈ
ｒ　−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙｓ　−−Ｇ
ｌｕ−＾ｒＨ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（５２
５）−−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−１
１：１ｕ−Ｌｅｕ−−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−一本発明の単クローン性抗体は、前記の式
（Ａ）中でＡＡ、及びＡＡ２が下記のものから選んだも
のである場合の式（Ａ）のペプチド残基に討して特異的
に結合することがもっとも好適である：＾＾＋ニーＬｙ
ｓ−Ｇｌｕ−＾ｒＨ−に１（１−１１ｅ−Ｌｙｓ−１−
Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−１−＾ｒＨ
−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−１−Ｇｌｎ−１１ｅ１Ｌｙ
ｓ−１ −Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−１ Ｌｙｓ−又は結合、及び ＾＾２ニーＧｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｇｌｕ−−ＧＩｒ＋−Ｔｈｒ−八Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ− −Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ− −Ｇｉｒ＋−Ｔｈｒ− −Ｇ　Ｉ　ｎ−１又は結合。

本発明に従って、全蛋白質に対してではな（、アルブミ
ン分子のグリコシル化したリシン５２５部分に対しての
み抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系を生ゼしぬ且つ
そのような細胞系及びその抗体をスクリーニングするこ
とによってグリコシル化リシン５２５エピトープと選択
的に反応することができる単クローン性抗体を確認し且
つ単離する。

このような抗体を産生させるために、天然に生じるグリ
コシル化ペプチド配列に一致する蛋白質連鎖のフラグメ
ントを担体に結合させ且つ実験動物に注射することによ
って免疫応答を引き出す。

免疫を与えた動物からのたとえば評＆１細胞のようなリ
ンパ球を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリ
ドーマを生じさせ、それを単クローン性抗体の産生のた
めに培養し且っスクリーニングする。単クローン性抗体
を、グリコシル化ペプチドエピトープに対して選択的な
ものについてスクリーニングし、特定の細胞系を、一層
の量の単クローン性抗体の産生において使用するために
クローンする。このような単クローン性抗体技術につい
ての総説は、メルチャーズら者、リンパ球ハイブリドー
マ、スプリンガー出版にニーヨーク、１９７８）、ネー
チャー２６６：４９５（１９７７）、サイエンス２０８
：６９２（１９８０）、及プ酵素学における諸方法７３
（パートＢ）：３〜４６（１９８１）中に認められる。

実験動物、たとえば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、ラットなど
に注射するための適する免疫源を調製するためには、グ
リコシル化したアルブミンフラグメントを、天然に生じ
るヒトのアルブミン又はグリコアルブミンから産生及び
単離するか又は化学的に合成し且つ精製しなければなら
ない。本発明において有用なグリコシル化ペプチドフラ
グメント及ゾその非グリコシル化形態又は前駆体は式：
（ＱＮｌｌ） ； （Ｎ）１２＞（Ｃｙｓ）Ｑ−（Ｔｙｒ）ｒ−ＡＡ＋−Ｌ
ｙｓ−Δへ２−（Ｔｙｒ）ｓ−（Ｃｙｓ）ｔ（ＣＯＯＨ
）＜Ｂ＞ のちのであるが、上式中でＡＡ、及びＡ　Ａ　２の中の
少なくとも一つはヒトのアルブミン中のリシン５２５に
膿接するペプチド配列に相当する１〜１２のアミノ酸の
配列であり、且つＡＡ、及びＡ　Ａ　２の中の一つのみ
がかかる配列である場合には、他方は結合であり；ｑ及
びしは、他と無関係に、ゼロ又は１であり；ｒ及びＳは
、他と無関係に、ゼロ、１又は２であり；ＱＮＨはリシ
ン中のε−アミノ基を表わし且つＱは水素又は１−デオ
キシフルクトシルであり：（Ｎ　Ｈ２）Ａ　Ａ　１中の
Ｎ−末端アミノ基及びＡＡ、又はＡ　Ａ　２中のリシン
単位はグリコシル化してあってもグリコシル化してなく
てもよい。フラグメント中でＱのみがグリコシル化しで
あることが好ましい。通常はｑとｔの中の一つが１であ
る場合は、他方はゼロであり、且つさらにｑ又はｔがゼ
ロである場合はｒ又はＳは、それぞれ、やはりゼロであ
る。

好適実施形態においては、グリフアルブミンをヒトの血
液から単離し、適当な蛋白質加水分解酵素又は酵素類を
用いて１１１Ｎ裂して、グリコシル化したリシン５２５
及Ｖ隣接するアミノ酸を包含する適当な大きさのペプチ
ドフラグメントを与える。

アルブミンはその本来の立体配座において蛋白質加水分
解に対して実質的に耐性であるから、通常は望ましい蛋
白質加水分ヤを生じさせるために必要な程度に蛋白質を
変性することが必要である。

かくして生じるグリコペプチドフラグメントを、炭水化
物残基に対する選択的な親和性を有するデル上のクロマ
トグラフィー及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）のような通常の方法によって単離する。非グリコ
シル化アルブミンの開裂によって非グリコシル化ペプチ
ドフラグメントを調製したのち、そのフラグメントをグ
リコシル化することもまた可能であるが、リシン５２５
に加えて、たとえば、他のリシン単位及びＮ−末端アミ
ノ基の部位においてグリコシル化が生じる可能性がある
から、逼かに望ましくないということば明らかである。

ヒトのアルブミンの蛋白質加水分解によって調製した好
適なグリコシル化ペプチドフラグメントは次のものであ
る： ＱＮＨ （Ｎｔ１２）Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ　−Ｌｙｓ（ＣＯＯ
Ｈ）、及び （ＱＮＨ） （Ｎｌ２）Ａｒｇ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾ｌ　ａ　−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ｇ
ｌｕ（ＣＯＯＨ）、 上式中でＱは１−デオキシフルクトシルである。

望ましい配列のペプチドフラグメントの７１４＊に討し
ては、通常の手順に従かい且つ市販のペプチド合成装置
を用いる化学的合成をも使用することができる。ペプチ
ド合成によって生成するペプチドを、適当な条件下に、
たとえば、グルツース−飽和ビリノン、又はグルツース
−飽和ビリノン：酢酸（１：１　）中で、室温において
４８時間グリコシル化する。このような試験管内グリコ
シル化の間に、リシン５２５に相当するものを含み且つ
それに加えて当該ペプチド中のＮ−末端アミノ基及びす
べてのリシン単位のε−アミノ基がグリコシル化する可
能性がある。このような付加的なグリコシル化は、ペプ
チドフラグメント中のかかるグリコシル化の末梢位置又
はその配置のために、このようなグリコシル化１こ関し
て非特異的に応答する動物によって免疫の間に異なるよ
うに耐容させることができるか、又は、たとえば一つ以
上の末端アミノ酸、特に場合によってはグリコシル化さ
れたＮ−末端アミノ酸の蛋白質加水分解によるようにし
て、選択的に除去することができる。ペプチド合成によ
って調製される好適なグリコシル化及び非グリコシル化
ペプチドフラグメントは以下のものであるニ ーＴｙｒ−Δ＾、（ＣＯＯＨ）、 −Ｌｅｕ（ＣＯＯｔｌ）、 （ＱＮＨ） 本　　　　　１ （Ｎｌ２）Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−
Ｔｈｒ−八Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃ１ｕ−−Ｌｅｕ−
＾へ４（ＣＯＯ１１）、 （ＮＩ＋２）ＡＡ５−Ｇｉｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　−−Ｇｌ
ｕ（ＣＯＯＨ）、 （ＱＮＩＩ） （Ｎ１１２）八Δ６−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ
−Ｌｅｕ−＾へ、（ＣＯＯＩ＋）、及び （Ｎｌ２）＾＾５−ＡｒＨ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−
Ｌ、ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ。

式中でＱは水素又は１−デオキシフルクトシルであり：
　Ａ　Ａ’　３はＬ　ｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｒＨｌＡｒ
ｇ又は結合であり；ＡＡ４はＣｙｓ又は結合であり：　
Ａ　Ａ　ｓはＡｒｇ又は木 Ｌ　ｙｓ、又は結合であり；ＡＡ、はＣｙｓＴ　ｙｒ−
Ｔ　ｙｒ。

ＣｙｓＴ　ｙｒ、　Ｃｙｓ、又は結合であり；ペプチド
中のＮ−末端アミノ基及びＬｙｓ、１１１位はグリコシ
ル化しであるか又はグリコシル化してない。上式のもつ
とも有用なグリコシル化ペプチドは、１−デオキシフル
クトシルであるＱとグリコシル化してないＮ−末端アミ
ノ基及びその他のＬｙｓ単位を有している。

好適な非グリコシル化前駆体ペプチドは以下の式のもの
である： Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−＾ｒＦｌ−Ｇｌｎ−１！ｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−−Ｌｅｕ　−Ｖａ　
ｌ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、　Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌ　ｕ−＾
ｒｇ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｈｒ−＾Ｉａ−ＬｅｕＳＧｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｖａ１−に１
ｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ、及びＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Δ
Ｉ　ａ　−Ｔｙｒ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、　Ｌｙｓ　−
Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｙｒ−ＣｙｓＳＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−＾！ａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ１ＧＩｎ−１１ｅ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃ１ｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｔｙｒ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、及びＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−八ｒｇ
−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ。

リシン５２５に相当するリシンの一層特異的なグリコシ
ル化はａ−アミノ保護したε−アミン１−デオキシフル
クトシルリジンと結合させた？８液及び固相ペプチド合
成の組合わせによって取得゛することができる。この合
成において、Ａ　Ａ　＝　−（Ｔ　ｙｒ）ｒ−（Ｃｙｓ
）ｓ−（ＣＯＯＨ）は通常の合成によって調製すること
ができる。リジン（ａ−アミノ保護したε−デオキシフ
ルクトシルリジン）は別個に調製し且っ古典的な溶液相
化学を用いてかかるペプチドのアミノ末端に結合させて
、 （ＱＮＨ） （Ｂ）Ｌｙｓ−＾＾２−（Ｔｙｒ）ｓ−（Ｃｙｓ）ｔ−
（ＣＯＯＨ）を与えるが、上式中でＢはリシンのα−ア
ミノ基上の、たとえばｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂ
　ＯＣ）、ノニトロフェニル（Ｄ　Ｎ　Ｐ　）、ｐ−フ
ルオレニルメトキシカルボニル（ｆＭ　ＯＣ）、又はＱ
ＨＮ−Ｌｙｓ（１−デオキシフルクトシルリジン）を変
化させることなく除去することができる他の適当な保護
基のような、保護基である。保護基はリシンの１−デオ
キシフルクトシル構造を変化させることがない選択した
化学的手段（当該保険基に依存する）に五つで除去する
ことができる。このペプチドは直接に免疫原として又は
免疫検定法において使用することができ、あるいはＮ　
Ｈ、−（Ｃｙｓ）ｑ−（Ｔ’ｙｒ）ｒ−Ａ　Ａ　＋の付
加によって延長して、 を生じさせることができる。この付加は古典的な溶液又
は同相ペプチド合成を用いる連続的な延長によって、あ
るいは予め形成させたＮｌ２−（Ｃｙｓ）ｑ−（Ｔｙｒ
）ｒ−＾Δ、をＱＨＮ−Ｌｙｓ−ＡＡ２−（Ｔｙｒ）ｓ
−（Ｃｙｓ）ｔ　−（ＣＯＯＨ）に対して縮合させて最
終生成物を与えることから成るセグメント縮合によって
、行なうことができる。

末端Ｃｙｓ単位の導入は、たとえば、この分野で公知の
二官能性結合剤、たとえば、ｍ−アレイミドベンゾイル
−Ｎ−スルホスクシンイミドエステル（Ｍ　Ｂ　Ｓ　）
、によるようにして、免疫源性担体物質に対するペプチ
ドの選択的カップリングを可能とする。あるいはまた、
通常のペプチド縮合法、たとえば、カルボジイミドカッ
プリング剤を使用して、Ｃ−末端力ルボキシル基を通じ
てペプチドフラグメントを結合させることができる。一
般的に公知のその他の結合方法をも用いることができる
。

ペプチド上の末端単位として、又はアルブミン特異性配
列及び／又はペプチドの免疫源性担体物質に対するカッ
プリングに対して用いられる末端アミノ酸に隣接させて
、たとえば末’ｉ＠Ｃｙｓ単位に隣接させて、一つ又は
二つあるいはそれ以上のＴｙｒ単位を導入することもま
た、一般に好適である。ペプチド残基の非特異的望域中
のＴｙｒ単位の存在は、ペプチドのグリコシル化特異性
の領域の免疫源性を増進し、それによって抗体の応答を
刺激するものと思われる。

それ故、特に好適な実施形態においては、上式中のＡＡ
、とＡＡ２は、それぞれ、配列Ｃｙｓ−（Ｔｙｒ）ｒ−
によって始まり、配列−（Ｔｙｒ）ｓ　　Ｃｙｓによっ
て終るが、ここでｒ及びＳは１から多いときは１０以上
までの整数、好ましくは１又は２である。

もつとも一般な意味において適当な免疫グロブリンの産
生を刺激するために用いる免疫原は、免疫原性担体物質
に対して化学的に結合した一つ以上のグリコシル化ペプ
チド残基を包含する。このような免疫原に対する一般式
は犬のものである：式中でグリ：＋−（ＮＨ）、Ａ　Ａ
　＋及びＡ　Ａ　２は、論又はｎがゼロである場合は、
それぞれ末端アミノ又はカルボキシル基であってもよく
；Ｒは結合又は結合基であり；担体は免疫原性担体物質
であり；ｍ及びｎの中の一つは１であり且つ他のものは
ゼロであり；且つｐは平均して１乃至担体上に存在する
カップリング部位の数であることを条件として、前記と
同様な意味を有する。残基ＡＡ、及びＡ　Ａ　２は前記
のようなＴｙｒ及びＣｙｓ単位を含有することができる
。

免疫原性担体物質は、グリコシル化ペプチド残基へのカ
ップリングのために使用することができる官能基を有す
る一般的に公知のものの中から選択することができる。

大部分の場合、担体は蛋白質又はポリペプチドであるけ
れども、十分な大きささ免疫原性の、たとえば、炭水化
物多糖類、リボ多糖類、核酸などのような他の物質をも
同様に使用することができる。大部分に対して免疫原性
蛋白質入ゾポリベプチドは、４０００〜１０，０００．
０００、好ましくはｉｓ、ｏｏｏよりも大、さら１こ一
般的には５０，０００よりも大きい分子量を有する。一
般に、一つの動物種から得た蛋白質は、池の種の血液流
中に導入するときに免疫原性である。特に有用な蛋白質
はアルブミン、グロブリン、酵素、ヘモシアニン、グル
テリン、者るしく非蛋白質的な成分を有する蛋白質など
である。

通常の免疫原性担体物質及びそれに対してノ１ブテンを
結合させるための方法に関する技術の現状についてのそ
の他の文献は以下のものである：パーカー、生物学的に
活性な化合物の放射性免疫検定法、プレンチスーホール
（エングルウッドクリックス、ニューツヤ−ジー、米国
、１９７６）；パトラ−、ジャーナル　オブ　イミュノ
ロジカル　メソッド７：１〜２４（１９７ｆ３）；ウニ
インリプ及びシュロック、ドラッグメタポライドレビュ
ー１０：２７１〜２８３（１９７４）；ブラフトン及び
ストロング、クリニカルケミストリー、２２ニア２６〜
７３２（１９７６）；及びプレイフェアら、プリティッ
シュメディカルブレチン３０：２４〜３１（１９７４）
。

式（Ｃ）中のｐの文字は担体１こ抱合するグリコシル化
残基の数、すなわち、免疫原のエピトープ密度を表わし
且つ１から担体丘に存在する結合部位の数に至る範囲で
あり、且つたとえばポリリシンのような、ある種の高分
子量合成ポリペプチドの場合には５０００のような高い
値とすることができる。特定の担体上のエピトープ密度
は担体の分子量及び存在する結合部位の密度に依存する
。免疫原の合成の容易さと再現性及び抗体応答について
の考Ｘ！から、最適なエピトープ密度は当該担体上に存
在するカップリング基の約１０％乃至約５０％の範囲に
ある。

結合基Ｒは本質的に何らかの便宜且つ安定な構造とする
ことができる。このような結合基Ｒは通常は、単結合又
は、水素を省き、且つたとえば窒素、酸素及び硫黄のよ
うなヘテロ原子を含めたときに、１乃至約２０原子を包
含する脂肪族連鎖の形態にある。グリコシル化残基は、
結合ＭＲを形成させるために、メチレン、エーテル、チ
オエーテルイミノなどを含む、種々の基によって結合さ
せることができる。この分野の専門家には、免疫原の調
製のために選択することができる広く異なる結合基が公
知である。一般に、グリコシル化ペプチドは、担体分子
中の適当な基へのカップリング反応において活性である
、たとえばアミノ、カルボキシル、千オール、ヒドロキ
シル又はマレイミドのような官能基を末端基として調製
する。

特に好適な式（Ｃ）の免疫原は、その中で（ａ）　　Ａ
Ａ、が末端アミノ基であり、Ａ　Ａ　２がＧ　ｌｎＴ　
ｈｒ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　１ｕ−Ｌ　
ｅｕ−Ｖ　ａｌ　−Ｃｙｓであり、ｍがゼロであり、且
つｎが１である；（ｂ）　　ＡＡ、が（Ｎ　Ｈ：）Ａ　
ｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−、Ｉ　Ｉｅ−Ｌ　ｙｓであり、ＡＡ２
がＧ　Ｉｎ−Ｔ　ｈｒ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ−Ｖ　ａｌ
−Ｇ　Ｉｕであり、ｍがゼロであり、且つｎが１である
；（ｃ）ＡＡ、が（Ｎ　Ｈ２）Ｌ　ｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ
　ｒｇ−Ｇ　ｌｎ−■１ｅ−Ｌｙｓであり、ＡＡ２がＧ
　Ｉｎ−Ｔ　Ｉ＋ｒ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ−Ｖ　ａｌ−
Ｔ　ｙｒ−Ｃｙｓであり；ｌがゼロであり且っｎが１で
ある； （ｃｌ）　　ＡＡ、がＣｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｒｇ−Ｇ
　ｌｎ−Ｉ　１ｅ−Ｌ　ｙｓであり且つＡＡ２がＧ　Ｉ
ｎ−Ｔ　ｈｒ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ（Ｃ００Ｈ）であり
、鴫が１であり且つｎがゼロであり；ここ本 でＬｙｓはグリコシル化しであるか又はグリコシル化し
てないリシン単位である； （ｅ）ＡＡ、がＧｉｎ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ、　Ｉ　１ｅ
−Ｌｙｓ。

Ｌｙｓ又は末端アミノ基であり、ＡＡ２がＧｌｎ−Ｔｌ
＋ｒ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅ’ｕ−Ｔ　ｙｒ−Ｔ　ｙｒ−Ｃ
ｙｓであり、ｍがゼロであり、且つｎが１である： （ｆ）ＡＡ、がＣｙｓ−Ｔ　ｙｒ−Ｔ　ｙｒ−Ａ　ｒｇ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｉ　Ｉｅ−Ｌｙｓであり、ＡＡ２がＧ　Ｉ
ｎ−Ｔ　ｈｒ−であり、ｍが１であり且つｎがゼロであ
る 場合のものである。

免疫検定法において使用するために選択される抗体は免
疫グロブリンの部類のもの、たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＭ
なと、及びそれらのサブクラスのものとすることができ
る。一般に、抗体はＩｇＧの部類のものであり、所望す
るならば、抗体結合部位を含有するかかる抗体のフラグ
メント、たとえば、Ｆ　ａｂ、　Ｆ　（ａｂ’　）及び
Ｆ　（ａｂ’　）２を用いることができる。生物学的液
体中のグリコアルブミンの定量のための何らかの免疫検
定法において、選択した抗体試薬を用いることができる
。このような免疫検定法は免疫拡散法、免疫電気泳動法
、凝集方法及び補体固定のような比較的古典的な方法、
並びに、たとえば放射線免疫検定法及び非放射性同位元
素法を含む比較的新しい方法を包含する５後者の方法は
、抗体試薬への結合に対して標識試薬をグリコシル化分
析物と競争させる競争的結合方式のような、広く異なる
方式で実施することができる。抗体試薬に結合した標識
試薬又はそのよう１こ結合しない標識試薬から成る遊雑
の種の量を適当な方法で測定し且つ試料中のグリコシル
化分析物の量に機能的に相関させることができる。

放射性免疫検定法においては、標識が発生する信号は遊
離種と結合部の両者において定性的に同一であるから、
標識を測定するためには、その両者を物理的に区別しな
ければならない。このような方法は、相分籠の必要があ
ることから不均一なものとしてこの分野で公知である。

場合によってはＥＬ　Ｉ　ＳＡ法（米国特許第３，６５
４，０９０号参照）と呼ばれる、酵素標識免疫検定法及
び蛍光免疫検定法（米国特許第４，２０１，７６３号、
４゜１３３．６３９号及び３，９９２，６３１号参照）
、特に粒子濃度蛍光免疫検定法（ヨーロッパ特許公開明
細書出１２４，０５０号参照）を包含する、その他の不
均一免疫検定法が公知である。

かなり最近、結合相手、たとえば、抗体による４楳識試
薬の結合によって検出可能な信号を変調させることがで
きる標識の使用により分離段階を不必要とする多くの免
疫検定法が開発された。このような方法は均−法として
知られ、分離の必要がなく且つ放射性同位元素を用いな
いことから、本発明において使用する際に有利である。

このような方法のいくつかは、蛍光消光及び強化（米国
特許第４．１６０，０１６号参！＠）、エネルギー移動
免疫検定法（米国特許第３，９９６，３４５号）及び二
重抗体立体１草書免疫検定法（米国特許第３，９３５、
（’１７４号及び３，９９８，９４３号参照）である。

特に好適な均一免疫検定法は、酵素触媒反応に関わる標
識を使用するものである。その例は基質標識免疫検定法
（米国特許第４，２７９，９９２号及び英国特許第１，
５５２，６０７号参照）、補欠分子団（ＦＡＤ）標識免
疫検定法（米国特許第４，３４８．５６５号参照）たと
えば、抑制子標識を用いる、酵素モノニレ−ター標識免
疫検定法（米国特許第４．１３４，９７２号及び４，２
７．３，８６６号参照）及び酵素ＰＪ識免疫検定法（米
国特許第３，８１７゜８３７号参照）である。

本発明の単クローン性抗体は、ヒトのアルブミン中のリ
シン５２５を包含するグリコンル化ペプチド残基への結
合に対して特異的である。場合によっては、望ましい免
疫検定を達成するために、天然のアルブミン中のグリコ
シル化リシン５２５エピトープを露出させることが、検
定性能の向上のために必要であるか又は特に望ましいこ
とがある。完全な蛋白質中のエピトープの露出は、少な
くともエピトープの領域における物理的又は化学的な変
性又は消化によって達成すべきものと了解される。この
ような変性又は消化は、エピトープの領域に局在化させ
てもよいし、あるいはさらに一般的に、又は蛋白質の三
次、さらに加えて二次構造の実質的に完全な変性すら、
あるいは蛋白質の部分的又は完全な消化を包含してもよ
い。

必要又は所望に応じ、変性は、たとえば熱、超音波照射
、高又は低ｐＨのような物理的手段による蛋白質の通常
の処理、溶液中のカオトロピック剤、すなわち、カオト
ロープとの相互作用による化学的変性を包含する種々の
方法で達成することがでさる。有用なカオトロピック剤
は、通常は、制限なしに、グアニジン尿素及び、たとえ
ば、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）及び、制
限なしに、デオキシコール酸塩及びある種の胆汁酸塩、
３−（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアミノ−
１−プロパンスルホン酸塩、メタノール、プロパノール
、アセトニトリルのような有機溶剤及びチオシアン酸ナ
トリウムのような、ある種の塩類を包含する、その他の
ものを含んでいる。たとえば、トリトンＸ−１００、／
ニデットＮＰ−４０及びオクチル−グリコシドのような
非イオン洗剤もまた蛋白質変性剤として働らくことがで
きる。ジスルフィド結合を還元する試剤（たとえばメル
カプトエタ／−ル又はジチオトレイトール）の包含は、
変性プロセスの有効な促進剤となる。蛋白質変性は通常
は、化学的手段及び／又は化学的手段と物理的手段の組
合わせ（たとえば、グアニジンと加熱、グアニジンとＳ
ＤＳ、又はグアニジンとジチオトレイトール）を用いる
場合に、もつとも効果的に達成することができる。いう
までもなく、露出したエピトープの顕著な量が抗体結合
のための溶液に対して接近することができなくなるよう
な蛋白質の実質的な不溶化、漿果又は沈殿を生じさせる
変性条件は避ける。有用な免疫結合を得るためには十分
な量の変性蛋白質が、溶液又は１ｇｌ濁液として、留ま
っていなければならない。必要な可溶化の程度は、意図
する又は望ましい結合の環境に依存する。

本発明を以下の実施例によって例証するが、これらの実
施例は本発明を制限するものではない。

実施例 正常な供血者の全血を、くえん酸塩−デキストロース溶
液中に集めて、遠心分離により赤血球と血漿に分離した
。血漿画分を１００ｚ１のボロン酸塩−７ガロース力ラ
ム（グリコデル、ピアース　ケミカル社、ロック７オー
ド、イリノイ州、米国）上で、ｐＨ８，０の０．２５Ｍ
酢酸アンモニウム、５０　ｗｒＭ　　Ｍ　ｇｃ　ｂ中で
、クロマトグラフィーにかけた。結合した両分（主とし
てグリフアルブミンと免疫グロブリンを含有）を０．１
　Ｍ　）リス、０゜２Ｍソルビトール、１０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡＳｐＨ８゜０、を用いて溶出した。免疫グロブリ
ンからグリコアルブミンを分離するために、結合した両
分を５０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ８，０、中に透析
して、１００ｚ１のＤＥＡＥアフイーゲル　ブルーカラ
ム（ビオ−ラッド研究所、リッチモンド、カルホルニア
、米国）上に負荷した。カラムをゼロ乃至１．４ＭのＮ
　ａ　Ｃ１のグラジエントを含有する５０ｍＭのりん酸
ナトリウム、緩衝剤、ｐＨ８，０、で溶出した。溶離液
を２８０ｎｍでモニターして、グリコアルブミンをＳＤ
Ｓ〜ポリアクリルアミドデル電気泳動によって確認した
。いくつかの実験においては、血漿を、グリコデル　カ
ラム前に、ＤＥＡＥアフイーデル　ブルー上でクロマト
グラフィーにかけた。分離の順序はアルブミン又はグリ
コアルブミンの純度に影響を与えなかった。

上記のようなりＥＡＥ−７フイーデル　ブルーカラム上
で引続いて分離したグリコデル非結合画分から非グリコ
シル化アルブミンを精製した。アルブミンとグリコアル
ブミンを、０．０５％のナトリウムアジＹを含有するり
ん酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、７．２ｕＭ　　Ｎａ２ＨＰ
Ｏ−，２，８ｍＭＮａＨ２ＰＯ，，１２７＋ｎＭ　　Ｎ
ａＣＮ、、ｐＨ７，４）中に透析し、凍結乾燥して、そ
の後の使用まで一８０℃で保存した。

羨１ ヒトの血清アルブミンは５９のリシン残基を有し、その
中の−っが天然分子中の主なグリコシル化の部位である
。グリコシル化したリシン（位置５２５で）を含有する
ペプチドを産生させるために、２種のプロテアーゼ　ト
リプシン及び黄色ブドフ状球菌■８プロテアーゼの独特
の特異性と結合させたアルブミンの既知の蛋白質配列を
用いた。

トリプシンは、リジンとフルギニンのカルボキシ側にお
いてペプチド結合を開裂させるが、グリコシル化したリ
シンのカルボキシ側においては開裂させない。スタフイ
Ｖ８はセパルチン酸とグルタミン酸のカルボキシ側で開
裂させる。それ故、トリプシンによる消化又は■８によ
る消化は、位置５２５においてグリコシル化しであるリ
ジンを含有する各ペプチドを与えるものと思われる［図
面中の構造（１）及び（２）参照−実線及び点線の三角
は、それぞれ、トリプシンと■８プロテアーゼに対する
開裂部位を示す１゜ アルブミンはその自然の立体配座において蛋白質加水分
解に対して実質的に耐性である。蛋白質をプロテアーゼ
に対して最高に露出させるために、グリコアルブミンを
８Ｍの尿素、５ｍＭのノチオトレイトール（Ｄ　Ｔ　Ｔ
　）、０．１Ｍの重炭酸７ンモニツム・ｐＨ７，５、中
で室温において２時間変性した。変性した蛋白質溶液を
、プロテアーゼの蛋白質に対する１：５００比（酵素の
重さ：グリコアルブミンの重さ）を有する０、１Ｍの重
炭酸アンモニウム、ｐＨ７，８５、に徐々に加えた。生
しる尿素の最終濃度は０．８Ｍであり、その溶液を３７
°Ｃで１６時間保った。次いで酵素（重量は第一の添加
と等量）を加え、溶液を８時間培養した。溶液をボロン
酸塩アジイーグル６０１カラム（ビオラッド、リッチモ
ンド、カリホルニア、米国）に加えて炭水化物含有ペプ
チドを選択的に結合させた。カラムを５０ｍＭｍ炭酸ア
ンモニウムで十分に洗浄したのち、結合したベブチＶを
０．１Ｍ酢酸で溶出した。溶離したペプチドを乾燥し、
２゜ＩＩＩＭのりん酸カリウム、ｐＨ７，０、中に再懸
濁して、アルテックス−〇　Ｄ　Ｓ　（４、１ＩＩＩｍ
Ｘ　２５　ｃｍ）ＨＰＬＣカラム（レーニン、エマ−ビ
ル、カリホルニア、米国）上に注入した。上記の緩衝液
中の１％アセトニトリル／分から６０％アセトニトリル
の最終濃度までのグラジェントを用いて結合成分を溶出
した。各両分を集め、乾燥し、アルゴン下に０．０２％
のフェノールを含有するｅＮ　　ＨＣｆ中で２４Ｒ間加
水分解した。加水分解物を乾燥し、ＯＰＡプレカラム誘
導体化手順（ベンゾン及びヘア、プロシーディング、ナ
ショナルアカデミーオブ　サイエンス７２：６１９〜６
２２．１９７５）及ヒアミノ酸の分離−ＨＰＬＣＣ−１
８カラム（スベルコ、ベルホンテ、パサデナ州、米国）
上の○ＰＡ付加物の分離を用いて分析した。アミノ酸を
既知の標準（標準物Ｈ；ピアース　ケミカル社、ロック
７オード、イリノイ州、米国）との比較により識別し且
つ定量した。トリプシン及び＼１８ペプチドに対する予
想値と実測値を第１表中に示す。

亀１ｆｉ スタフイ■８プロテアーゼペプチド アミノ酸　　　　Ｌ１江　　実測値 ＧＬＵ　　　　　　　３　　　３．Ｉ ＴＨＲ１１，０ ＡＲＧ　　　　　　　１　　　１．２ ＡＬＡ　　　　　　　１　　　１，０ ＶＡＬ　　　　　　　１　　　１，０ ＩＬＥ　　　　　　　１　　　０．７ ＬＥＵ　　　　　　　１　　　１．０ ＬＹＳ　　　　　　　２　　　１．９ トリプシンペプチド アミノ酸　　　　予想値　　癩ｕ１ ＧＬＵ　　　　　　　２　　　２．Ｉ ＴＨＲ１，１，０ ＡＬＡ　　　　　　　１　　　１．２ ＶＡＬ　　　　　　　２　　　１．８ ＬＥＵ　　　　　　　２　　　２．０ ＬＹ３　　　　　　２　　　２．０ 実施例３：ｉ　　　　＊５’）解約に開裂させたグリコ
ペプチドの担体蛋白質への　合 Ｃ−末端カルボン酸を選択的に活性化して担体蛋白質の
アミンに対して結合させたくセル３４：５８７−５９６
．１９８３）。２００μｆｆｉの０．０１ＮＨ（ｌ中の
２ＨのＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド、ピアース　ケミカル社
）を実施例１の２１１１ｇの乾燥グリコペプチドに加え
た。この溶液を迅速に２１のＨ２Ｏ中の６ＩＩ１ｇのキ
ーホール　リンベット　ヘモシアニン（ＫＬＨ）に加え
て沈殿を生じさせた。溶液のｐＨを０．１Ｍの炭酸アン
モニウムによって９゜０に上げ、３時間攪拌したのち、
Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｌ：対して透析した。チオバルビッール酸
試験（７ラツキンが−及びウィンターハルター、ＦＥＢ
Ｓレターズ７１：３５６〜３６０．１９７６）は、標準
としてフルクトースを使用して、少な（とも２の炭水化
物／１００，０００分子景のＫＬＨを示した。

実施例４：フルプミンベプチドの　−人成（ａ）　　ア
プライド　ビオシステム４３０Ａペプチド合成装置（ア
プライド　ビオシステムズ、７オスター　シティ−、カ
リホルニア、米国）を用いてベブチｒを得た。

カルボキシル末端アミノ酸を、フェニル７−１＝）アミ
ドメチル結合によって、１３３　Ｗｌ　１　ｇ当り０．
７ｘｌモルの置換度で、樹脂に結合させた。一般に、−
回の合成で０．５ＩＩＩＩＩＩ０１のペプチドが生じた
。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の６０％トリフルオロ酢
酸を用いでＮ−末端ｔ−ＢＯＣを除去し且っα−アミン
をジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）中の１０％ノ
イソプロとルエチルアミンで中和した。ｔ−ＢＯＣアミ
ノ酸（２ｌ６ｉｏ＆）を、２ｘｌのジクロロメタン中の
ｌｌｌ１ωｏｌのジシクロへキシルカルボジイミドの添
加によって、対称無水物に転化させた。ｔ−Ｂ　ＯＣア
ミノ酸の側鎖を次のようにして保護した：Ａｒｇ（ＴＯ
Ｓ）、Ａ　ｓｐ（○Ｂ　ｚｌ＞、Ｃｙｓ（４−ＣＨＢ　
ｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯＢｚｉ’）、Ｈｉｓ（ＴＯＳ）、Ｌ
ｙｓ（Ｃｉ’　　Ｚ）、５ｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂ
ｚｉ’）及びＴ　ｙｒ（Ｂ　ｒ−Ｚ　）。ｔ−Ｂ　ＯＣ
アミノ酸Ａｌａ、　　Ａｓｎ、　Ｇｌｎ、　　Ｇｌｙ、
　　Ｉ　１ｅＳＬｅｕ。

Ｍｅｔ、　ＰｈｅＳＰｒｏＳＴｒｐ及びＶａｔは保護し
なかった。ｔ−Ｂ　ＯＣ−Ｌ−ト１ｉｓ（ＴＯＳ）のノ
シクロヘキシルアミン塩をカップリングの１時間以内に
ＡＧ−５０−Ｘ　８　（Ｈ十〇Ｊｆ脂（ビオ−ラッド）
上のイオン又換によって遊離酸に転化させた。ｔ−Ｂ　
ＯＣアミノ＠　Ａ　ｓｎ、　Ａ　ｒＨｌ及びＧ　Ｉｎ（
２ｍｍｏｌ）を、２　ｍｍｏｆのＨＯＢｔと２　＋ａａ
＋ｏｉのＤＣＣの添加によってあらかじめ形成させたヒ
ドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）活性エステル
を用いて、結合させた。Ｎ−末端ｔ−Ｂ　ＯＣを完成し
たペプチドから除去して、ペプチド樹脂を減圧下に終夜
乾燥した。

１０％のアニソールを含有する無水ＨＦを用いるＯ″Ｃ
において３０分の処理によって、ペプチドを完全に脱保
護基し且つｆｌｆｌｌｌＷから開裂させた。樹脂を酢酸
エチルで洗浄し且つ１．ＯＮ酢酸を用いてペプチドを樹
脂から抽出した。抽出物を液体窒素中で直ちに凍結させ
、凍結乾燥したのち、その後の使用まで一２０℃で保存
した。

（ｂ）　　ＡＬ、Ｂ　　Ｋ１４Ｃ ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−ＬＹＳ−
ＬＹＳ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−Ｔ
　Ｙ　Ｒ−ＣＹ　Ｓ この１・ｔアミノ酸ペプチドは前末１ＴＹＲとＣ−末端
ＣＹＳと共に１２のアミノ酸配列を有している。ＣＹＳ
のスルホヒドリルは担体又は蛍光試薬（実施例６及び９
参照）に討して選択的に結合させることができる。試験
管内グリコシル化の開にＮ−末端及びＮ−末端リシンの
ε−アミノ基もまたグリコシル化する可能性がある。し
かしながら、■８による蛋白質分解的な消化は末端Ｌ　
Ｙ　Ｓ　−ＧＬＵを除去し、あるいはトリプシンによる
消化は末端Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｕ　−Ａ　ＲＧを除
去して、グリコシル化の可能性のあるＮ−末端リジンを
有していない、短かくなったペプチドを生じさせる。

（ｃ）　　ＡＬＢ　　ＣＩＩＬ ＣＹＳ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＧＬＮ−ＩＬＥ−ＬＹＳ−Ｌ
　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ　ＨＲ−Ａ　Ｌ　Ａ　−
Ｌ　ｅｕこのペプチドはアルブミン配列の１０アミノ酸
に加えて選択的カップリングに対するＮ−末端ＣＹＳを
有している。ＣＹＳのＮ〜末端アミノ基はグリコシル化
するものと思われるが、それは担体又は標識に近接して
いるから、グリフアルブミンに対して特異的な抗体の産
生に対して影響を有していないものと思われる［図中の
構造（４）参照］。

このペプチドはＣ−末端疎水性アミノ酸ＶＡＬ及びＴＹ
Ｒを有していないので、水性及びピリジン緩衝液中で比
較的良好な溶解性を有してν・る。

（ｄ）ＡＬＢ　　　１２Ｃ ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−
Ａ　Ｌ　Ａ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−Ｇ　Ｌ　
Ｕ　−Ｌ　Ｅ　ＩＪ　−ＣＹ　Ｓこのペプチドはアルブ
ミン配列の１１のアミノ酸に加えて、選択的カップリン
グに対するＣ−末端ＣＹＳを有している［図中の構造（
５）参照１゜望ましいリシンエピトープ（５２５）はＮ
−末端から４番目のアミノ！１であり、その露出性と抗
原性が増大している。

（ｅ）　　ＡＬＢ　　ＲＩＩＥ ＡＲＧ−ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＮ−
Ｔ　ＨＲ−Ａ　Ｌ　Ａ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　
−Ｇ　Ｌ　Ｕこのペプチドはアルブミン配列の１１のア
ミノ酸を有している（図中の構造（６）参照１゜Ｎ−末
端ＡＲＧは、試験管内グリコシル化の開にＮ−末端アミ
ノ基がグリコシル化する場合は、トリプシンを用いて除
去することができる。所望のリシンエピトープ（５２５
）はＮ−末端から４番目のアミノ酸であり、その露出性
と抗原性が増大してり）る。

このペプチドもまた良好な水性及びピリジン緩衝液中の
溶解性を有している。

（ｆ）　　ＡＬＢ　　Ｑ１０ Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ　ＨＲ−Ａ　Ｌ　Ａ　
−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−Ｇ　Ｌ　Ｕ　−Ｌ　Ｅ
　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−ＣＹ　ＳＮ　−ｔ−Ｂ　ＯＣ−
Ｌ−リシン（シグマ　ケミカフ１社、セントルイス、ミ
ズーリ州、米国）を、グルツースで飽和させた無水メタ
ノール中の９５％ピリジン、５％酢酸又は１０％ピリジ
ン中で５０℃において７日間装置した。この溶液をシロ
ップ状となるまで乾燥したのち、Ｃ−１８（アトラスＣ
ＯＤ。

４．１ｕｍＸ２５ｃｍ）カラム上のＨＰＬＣ（溶媒Ａ＝
５０ｍＭ）リエチルアミンー酢酸塩、ｐＨ６，０；溶媒
Ｂ＝Ａニアセトニトリル５０：５０）によって精製した
。生ｒｌ　物はクロロホルム二メタ７−ル：酢酸（１４
：５：１）を用いるシリカゲル上で０６８１のＲｆを有
し且つ、ＨＣ１蒸気に短時間さらして１００℃に加熱し
ない限りは、アミン検出試薬に対して非反応性であった
。

Ｎ−Ｌ−ＢＯＣ−６−１−デｔ’ｌｒシ’フル９トシル
　’）シンを合成ペプチドＧ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ　ＨＲ−Ａ
　Ｌ　Ａ　−Ｌ　ＥＵ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−Ｇ　Ｌ　Ｕ　
−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−ＣＹ　ＳのＮ−末端に
結合させる。このペプチドはアルブミン配列の８アミノ
酸に加えてカップリングに対するＣ−末端ＣＹＳを有し
ている［図中の構造（７）参照］。

ｔ−Ｂ　ＯＣの除去後に生成するペプチドはε−アミノ
基においてのみグリコシル化したリシン５２５を有して
いる。カップリングには、ジクロロメタン中の１当量の
Ｎ　−ｔ−Ｂ　ＯＣ−ｔ−デオキシフルクトシル　リシ
ンを０．５当量のジシクロヘキシルカルボジイミドと室
温においてアルゴン下に１５分間反応させる。等量のジ
メチルホルムアミドを加えたのち、０．２５モル当量の
合成ペプチドを加える。３０分後に溶液を乾燥し、ジク
ロロメタン中の２５％ＴＦＡ中に３０分間再懸濁させ、
再び乾燥したのち、生成物をＣ−２８カラム上のＨＰＬ
Ｃで精製する。

（ｇ）　　ＡＬＢ　　Ｑ９Ｃ（ＡＡ、）のグ＋）　：ｙ
　シル化生成物とＡＡ２のトリプシンによる縮合 通常の溶液又は同相ペプチド合成によってＮ−末端延長
ヘプｆ−１’Ｂ−ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−ＬＹＳを合成する
。ＨＰＬＣ精製ペプチドを３０％インプロパ／−ル又は
その他の適当な有機溶剤（フルトン、アドバンス　イン
　エイザイモロノ−５３：２３９−３０６．１９８１　
）中ノＴＰＣＫ−処理トリフシン（クーパー　ビオケミ
カル、フルバーン、ペンシルバニア州、米国）と共に湯
漬し且つ等モル量のＬ　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ　
ＨＲ−Ａ　Ｌ　Ａ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｇ　ＬＵ−ＬＥｔ
Ｊ−ＶＡＬ−ＣＹＳ（実施例４ｆ（７）生成物）を加え
る。２４時間後に、生じた生成物Ｂ−ＧＬＮ−Ｉ　Ｌ　
Ｅ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ
　ＨＲ−Ａ　Ｌ　Ａ　−ＬＥ　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−Ｇ
　Ｌ　Ｕ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｖ　Ａ　Ｌ　−ＣＹ　Ｓ　
ヲＨＰＬＣによって単離する。末端保護基ＣＢ）は、リ
シン５２５上の１−デオキシフルクトシル残基に影響を
及ぼさない手順によって、除去することができる。

（ｈ）　　戊ＬＢ　　Ｑ７Ｃ ＬＹＳ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＴＹＲ−Ｔ
ＹＲ−ＣＹＳ このペプチドは（ｆ）中に記すようにノシクロへキシル
カルボジイミドを用いてＮ　−ｔ−Ｂ　ＯＣ−ε−１−
デオキシフルクトシルリシンがＮ−末端ＧＬＮに結合さ
せである（ｆ）Ａ　Ｌ　Ｂ　　Ｑ　９　Ｃについて記し
たものと同様な実験において用いる。このペプチド（Ａ
ＬＢ　　Ｑ７Ｃ）はＣ−末端にＴＹＲ−ＴＹＲ−ＣＹＳ
ｖＩ造を有し、それは合成ペプチド免疫原に対する免疫
応答を増強するものと思われる。配列のフルプミン部分
（５アミノ酸）の小さな大きさは、限定された大きさの
エピトープを提供し、それによって免疫応答をグリコシ
ル化リシン残基に対して集中させるものと思われる。

（ｉ）　　ＡＬＢ　　Ｋ２Ｏ Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ　ＨＲ−Ａ　Ｌ　Ａ　
−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｔ　Ｙ　Ｒ−Ｔ　Ｙ　Ｒ−ＣＹ　５ ＡＬＢ　　Ｋ２ＯはＮ−末端に望ましいグリコシル化リ
シンとＣ−末端に非アルブミンＴ　Ｙ　Ｒ−Ｔ　ＹＲ−
ＣＹ　Ｓ配列を含有している小さなペプチドである。こ
のペプチドは０．１％ＴＦＡ及び無水メタノール中にき
わめて溶解性であり、従ってＨＰＬＣによるその精製及
びこれらの溶剤中のグリコシル化が可能となる。

（ｊ）　　ＡＬＢ　　Ｋ９Ｏ Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｔ　ＨＲ
−Ａ　Ｌ　Ａ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｔ　Ｙ　Ｒ−Ｔ　Ｙ　
Ｒ−ＣＹ　５ ＡＬＢ　　Ｋ９Ｃ１ｉＡＬＢ　　Ｋ２Ｏの性質とＮ−末
端における付加的なリシン残基の性質を合わせて有して
いる。

（ｋ）　　ＡＬＢ　　ｌｌ０Ｃ Ｉ　ＬＥ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−
Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｔ　Ｙ　Ｒ−Ｔ　Ｙ　Ｒ−ＣＹ　５ＡＬ
Ｂ　　Ｉ　１０Ｃは（ｊ）ＡＬＢ　　Ｋ９Ｏの性質を有
しているがＮ−末端に付加的なＩＬＥ残基を有している
。

（Ｎ）　　ＡＬＢ　　　　ＩＩＣ ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−
Ａ　Ｌ　Ａ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ　−Ｔ　Ｙ　Ｒ−Ｔ　Ｙ　Ｒ
−ＣＹ　５ＡＬＢ　　Ｑｌ　１　Ｃは（ｋｏ　１０Ｃの
性質を有ｕているが、Ｎ−末端に付加的なＧＬＮ残基を
有している。

（ｍ）　　ＡＬＢ　　Ｃｌ０Ｔ ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−
ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＮ−ＴＨＲ ＡＬＢ　　Ｃｌ０Ｔはこのペプチドのグリコシル化リシ
ン及びＣ−末端配列に対して優先的に結合することがで
きる抗体に有利であるようにＮ−末端上に非アルブミン
配列（ＣＹ　Ｓ　−Ｔ　Ｙ　Ｒ−Ｔ　Ｙ　Ｒ）を伴なう
ように合成した。

実施例５：合成ペプチドのグリコシル 第２表中に示した４種の合成ペプチドを指示のようにし
てグリコシル化した。Ｑ９Ｃペプチドは実施例４（ｆ）
に記すようにしてグリコシル化することによって調製し
た。

第」」（ ＩＡ旦　吐胆　吐剣　ＲＩＩＥ− （ａ）ピリジン、０．２５８ グルコース　　　　　＋　　十士士 反応は室温乃至５０°Ｃで１〜２０日間行なった。

試料をシロップ状に乾燥して、０．１％のＴＦＡと０．
１％乃至６０％のアセトニトリルグラジエントを使用し
てアルテックスＣ−１８＜ｌＸ２５ｃａ＋）上に注入し
た。ピーク画分を集め、炭水化物について分析し且つグ
リコペプチド−Ｍ　Ｂ　Ｓ−担体蛋白質免疫原の産出に
おいて使用した。

非グリコシル化ペプチドをもＫ　Ｌ　Ｈ−Ｍ　Ｂ　Ｓに
結合させたのち、試験管内で１．０Ｍのグルコースを含
有するＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ９、５又は７．４）中で、３
７℃において７〜１４日間グリコシル化した。

チオバルビッール酸分析は１０〜４０炭水化物／分子量
１００，０ＯＯＫＬＨを示した。

実施例４（ｉ）乃至（輪）のペプチドをグルコース飽和
メタノール中で７０℃の温度（５０〜８０°Ｃ）で２４
時間グリコシル化した。減圧によってメタノールを除き
、グリコペプチドをＨＰＬＣによって精製した。これは
、合成ペプチド中のリシンアミノ基に対して及び実施例
４　（ｆ）ノＮ　−ｔ−Ｂ　ＯＣ−Ｌ　−リシンに対し
てグルコースを結合させるために、きわめて有効である
ことが示された。

グルコース飽和メタノール中の５０〜８０℃で２４時間
のＮ　−ｔ−Ｂ　ＯＣ−Ｌ−リシンのグリコシル化は、
特に効果的であった。配列分析（下記実施例６）は、生
成物（α−アミン保護基の除去後）をε−デオキシフル
クトシルリシンとして識別した。迅速原子衝撃質量スペ
クトルもまた予想分子１のグリコシル化Ｎ−ｔ−ＢＯＣ
−Ｌ−リシン誘導体を与えた。

実施例６：グリコシル化　リシンの位　のＩＥと−のた
めの配Ｊ分析 自動化した気相エドマン減成配列方法を用いるグリコシ
ル化リジンの位置の決定と定量のための方法を開発した
。通常の配列分析の間に、リジン上の両アミノ基はＰＩ
ＴＣとの反応性があって、ε−アミノ基上のＰＴＣ基（
フェニルチオカルバミル）とα−アミノ基上のＰＴＨ（
フェニルチオヒグントイン）を有するリジンを形成する
。しかしながら、グリコシル化リジンは炭水化物がε−
アミノ基とＰＩＴＣとの反応を妨げるから、そのアミノ
基上にはＰＴＣ基を有していない。

それ故、リシン生成物はＰＴＨリシンである。

実施例２の自然に産するグリコアルブミンペプチドの配
列分析において、種々のＰＴＨ−アミノ酸を分離し且つ
定量するために用いたｃ−１８逆相カラム上でＰＴＨリ
シン残基が独特のクロマトグラフィー保持時間を有して
いることから、それを識別することができた。すべての
グリコシル化合成ペプチドを、多リシンペプチド中の特
定のグリコシル化リジンを識別し且っリシンのグリコリ
シンに対する比を定量するように配列させた。その結果
は、グリコシル化をメタノール中で行なうときには、リ
ジンの７５％を超えるものが正当なグリコシル化反応生
成物となっていることを示した。

実施例７：介Ｊ（グ」ニーごＦ乙テ」二の」［怪ｊ１駈
望？ΣΩ−カップリング ＣＹＳを含有する合成グリコペプチドを、ラーナーら（
プロシーディング　ナショナル　アカデミ−オブ　サイ
エンス　７８：３４０３．１９８１）が記すようにして
、担体に結合させる。簡単に記すと、ＫＬＨを、５０ｍ
Ｍのりん酸ナトリワム、ｐＨ６，２中で、室温において
、モル的に５０倍の過剰量のスルホ−ＭＢＳ（ピアース
　ケミカル社）と反応させ、同じ！＆衝液中のデル濾過
によって未反応のスルホ−ＭＢＳからＫＬＨ−ＭＢＳ抱
合体を分離した。ＫＬＨ−ＭＢＳ抱合体を直ちに乾燥し
たグリコペプチド（担体のマレイミドに対してモル的に
グリコペプチドの２倍過剰）に加え、室温で終夜反応さ
せた。

ＣＹＳを欠（ペプチドに討しては、Ｃ−末端カルボン酸
を実施例３に記すようにして担体蛋白質の７ミノ基に結
合させた。

実施例８：た（汲 実施例７の選択したグリコペプチドＭＢＳ−ＫＬＨ抱合
体を等量の７０インドの完全７ノエバントによって乳化
させた。マウス（Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃＢ　Ｙ　）に２０
０μビの抱合物を注射して、不完全７ジエバント中で、
抱合物により３０〜６０日間増強させた。融合の３日前
にマウスに５０μｇのＩＶを注射した。マウスを殺して
、その膵臓をコーラ−及びミルスタイン、ネーチャー２
５６：４９５（１９７５）に従かう融合に対して使用し
た。

（ａ）　　ＥＬＩＳＡ検定 実施例１のアルブミンとグリコアルブミンを、別々のポ
リ六ナレン　ミクロタイター板（２μｇ／１００ミクロ
リットル／ウェル）上に４℃で終夜被覆した。板をＰＢ
Ｓ＋０．０５％トウイーン２０で洗浄した。各細胞系か
らの上澄液を、アルブミン又はグリコアルブミン被覆し
た板中で６０分温湯漬た。板をＰＢＳ＋０．０５％トウ
イーン２０によって４回洗浄したのち、２００ミクロリ
ツトルの二次抗体を各ウェルに加えた（ウサギの抗マウ
スＩｇＧ−ベルオキシグーゼ、マイルス研究所、エルク
ハート、インジアナ州、米国の１　：２０００希釈物）
。６０分後に板をＰＢＳ＋０．０５％トウイーン中で４
回洗浄し且つ２００ミクロリツトルの基質溶液（２４，
３１１１Ｍ＜えん酸、５１，４ａ＋Ｍりん酸ナトリウム
、ｐＨ５，３，２、２１１ＩＭの０−フェニレンジアミ
ンと５．２　ａ＋Ｍの過酸化水素を含有）を加えた。２
０分後に５０ミクロリツトルの８ＭＨ２ＳＯ，を加える
ことによって反応を停止させたのち、ペルオキシダーゼ
反応の生成物を４９２ｎｍで読んだ。グリコアルブミン
に対して特異的である単クローン性抗体はグリコアルブ
ミンとは反応するがアルブミンとは反応しない。

（ｂ）　　粒子濃度蛍光免疫検定法 アルブミンとグリコアルブミンを別々にポリスチレン粒
子（バンデツクス研究所、マングーライン、イリノイ州
、米国）上に被覆した。ハイブリドーマ上澄液（２０ミ
クロリツトル）を各ウェルに加えたのち、２０ミリリツ
トルのアルブミン又はグリコアルブミン被覆粒子を加え
た。３０分後にヤギの抗−マウスＩＦｉＧ−ＦＩＴＣ（
実施例１０参照）を加え、さらに３０分の湯煮を続けた
。ｌｌ！過によって全部の非結合反応物を除いたのち、
蛍光を測定した。特異的な応答において、ハイプリドー
マ上澄演中の抗体はグリコアルブミン被覆粒子には結合
するがアルブミン被覆粒子には結合しない。

（ｃ）ｌＩｔクローン性抗体からのアルブミン／グリコ
アルブミンの事前の解離を伴なう粒子濃度蛍光免疫検定
法 ヤギの抗マウス粒子（パンデツクス研究所）をハイブリ
ドーマ上澄液と共に湯煮することによって、マウスの抗
体を捕獲する。ハイブリドーマ細胞の増殖のために用い
る細胞培地中で自然に生じるグリコアルブミンに対して
一定比率のマッス単りローン性抗体が結合する。非結合
成分を濾過によって分離して、ハイブリドーマ培地から
の結合したマウス免疫グロブリン及び、一方、マウス免
疫グロブリンに結合したグリフアルブミンを伴なうヤギ
の抗−マウス粒子を残す。２０ミクロリツトル＋７）　
１００ｍＭり’）　シン、ｐＨ３，０、を加エテ全複合
物を解離させる。２０分後に、スルフヒドリル特異性フ
ルオレセイン−５−マレイミドを用いてフルオレセイン
でラベルしたグリフアルブミンを含有する２０ミクロリ
ツトルの５０ｏ＋Ｍ）リス塩基を加える。かくして生じ
た７、５のｐＨはマウスの免疫グロブリンを再変性し、
それは過剰の蛍光性グリフアルブミンに対して優先的に
結合する。マウス免疫グロブリン−蛍光性グリコアルブ
ミン複合体を存在するヤギ抗マウス粒子によって又は新
しいヤギの抗−マウスＩｇ粒子の添加によって捕獲する
。非結合試薬を濾過によって除くと、信号はハイブリド
ーマ上澄液中に存在するマウス抗−グリコアルブミン抗
体に比例する。

（ｄ）（良尋性ｌ臭 骨髄腫細胞とハイブリドーマ細胞を保ち且つ増殖させる
ために用いたウシの胎児の血清（２０％）は顕著な濃度
のウシのアルブミン及び、恐らくは、５２５の位置のグ
リコシル化リジンを取り囲むヒトのアルブミンと同一の
アミノ酸配列を有することが公知であるグリコアルブミ
ンを有している。

それ故、組織培地中に分泌した僅かな量の抗−グリコア
ルブミン抗体が直ちにグリコシル化アルブミン分子に結
合し且つ標準的なＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定において検出し得
ない可能性がきわめて大さい。

抗体の培体グリコアルブミンへの結合を排除するために
、骨Ｗ！腫細胞及びハイプリドーマ細胞を血清（及びア
ルブミン）が存在しない培地中で増殖させた。一般に使
用される培地は市販のもの（ＨＬ−１、ベントレックス
、ポートランド、メイン州、米国）である。ＨＬ−１培
地中のハイプリドーマ上澄液のスクリーニングは、抗−
グリコアルブミン抗体を分泌するクローンの識別を簡単
化する。

（ｅ）　　グリコアルブミン含有培地中のハイプリドー
マ細胞の増殖 実施例９（ｄ）に記したように、培地中のグリコアルブ
ミンの存在は抗−グリコアルブミン特異性抗体の検出を
妨げるおそれがある。それ故、選択吸着方法によって培
地からグリコアルブミンを除く必要がある。それは、製
造者の指針に従って７フイーデル　ブルー　カラム（ビ
オラッド研究所、リッチモンド、カリホルこア、米国）
の通過によりウシの胎児の血清からアルブミンとグリコ
アルブミンを選択的に吸着することによって、達成され
る。アルブミン画分は、このような条件下に反応性のブ
ルー染料に対する親和性を有しているが、１．４Ｍの塩
化ナトリウムを用いて溶離することができる。約９０％
のアルブミンと１０％のグリコアルブミンを含有する溶
離画分をグリフ−デルＢ（ポロン酸塩カラム−ピアース
　ケミカル社、ロック７オード、イリノイ州、米国）に
加える。このカラムはグリコアルブミンを選択的に結合
する。

非結合画分は非グリコアルブミンを含有しており、それ
をフルブミン以外の全血清成分を含有するアフイーデル
非結合画分に加えもどす。最終混合物はグリフアルブミ
ンが除かれたウシの胎児の血清であって、抗−グリコア
ルブミン特異性抗体を産生するハイプリドーマの増殖の
ための培地の調製のために用いられる。

実施例１０：人成グリコペプチドの４、−イ・けグリコ
ペプチドはスルフヒドリル特異性フルオレセイン抱合体
を用いて具合良り楳熾付けすることができる。ジメチル
ホルムアミド中のモル的に２倍過剰のフルオレセイン−
５−マレイミド（４０ｍｇ／ｗｌ）を１００ｍＭのりん
酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡＳｐＨ７，１、中のグ
リコペプチド（１０ｍｇ／　ｚｌ　）に加える。試料を
室温で２０時間温１する。グリコペプチド−フルオレセ
イン抱合体をアルテックスＣ−１８４，ｌｌｌｌｍＸ２
５ｃＩＢカラム上で２０ａ＋Ｍりん酸ナトリウム、０．
１％乃至５０％アセトニトリル　グラジェントを用いて
精製する。

グリフアルブミンに対して特異性な抗体をポリスチレン
粒子（０，８μ１１パンデツクス研究所）上に被覆する
。抗体被覆したビーズ（２０μｍ）を、適当に、たとえ
ば、１　：８００１　に希釈した血液試料と共に湯漬刷
る。試料は血清、血漿−又は全血である。希釈剤は生理
学的緩衝液又は赤血球を溶解させてグリフアルブミンエ
ビトープを最高に露出させる変性溶剤とすることができ
る。適当な湯煮（たとえば５分）後に、合成グリコペプ
チドフルオレセイン抱合体（実施例１０）を加えて粒子
上の占１１されていない抗体結合部位に結合させる。さ
らに湯煮（たとえば、２０分）し、次いで全非結合反応
物を濾過によって除いたのち、フルオレセインを定量す
る。フルオレセイン信号は、それ故、臨床試料中の競争
するグリコアルブミンの量に逆比例する。

本明細書中の説明及び実施例は例証のためのものである
が、本発明を限定するためのものではなく、本発明の精
神及び範囲内のその他の実施形態及び修飾は、この分野
の専門家には明白であるということを了解すべきである
。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明において有用な免疫原を形成
させるために通常の免疫原担体物質に対して結合させる
ことができる好適なグリコシル化ペプチドフラグメント
又は残基のいくっがを示す・特許出願人　モレキュラー
・ダイアグノステイッＦＩｏ、　２ エ エ 、ＥＵ−ＴＹＩＩ−ＴＹＲ−ＣＹＳ　　　　　　　　　
　　　ＡＬＢ　Ｘ９Ｃ＋ＥｔＪ−ＴＹＲ−ＴＹＲ−ＣＹ
Ｓ　　　　　　　　　　　　　ＡＬＢ　　Ｘ１０Ｃ、Ｅ
Ｕ−ＴＹＲ−ＴＹＲ−ＣＹＳ　　　　　　　　　　　　
ＡＬＢ　ＱＩＩＣＡＬＢ　　Ｃｌ０Ｔ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、５２５の位置のリシン残基においてグリコシル化し
   てあるヒトのアルブミンに対して特異的に結合する抗体
   結合部位を包含するモノクローナル抗体、又はそのフラ
   グメント。 ２、式 【アミノ酸配列があります】 式中でグリコ−（ＮＨ）はリシン残基中の酵素作用によ
   らずにグリコシル化したε−アミノ基を表わし、且つＡ
   Ａ＿１とＡＡ＿２の一方又は両方はアミノ酸の配列であ
   り、その中でア ミノ酸単位の少なくとも一つは５２５の位 置におけるリシン残基に隣接するヒトのア ルブミンのペプチド配列に相当する位置に あり、且つＡＡ＿１及びＡＡ＿２の中の一つのみがその
   ような配列である場合は、他のもの は結合、末端アミノ又はカルボキシル基、 あるいは付加的なアミノ酸残基である、 のグリコシル化ペプチド残基に特異的に結合する、特許
   請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体又はそのフ
   ラグメント。 ３、式： 【アミノ酸配列があります】 式中でグリコ−（ＮＨ）はリシン残基中の酵素作用によ
   らずにグリコシル化したε−アミ ノ基を表わし；ＡＡ＿１及びＡＡ＿２の一方又は両方は
   アミノ酸の配列であり、その中でア ミノ酸単位の少なくとも一つは５２５の位 置におけるリシン残基に隣接するヒトのア ルブミンのペプチド配列に相当する位置に あり、且つＡＡ＿１とＡＡ＿２の中の一つのみがそのよ
   うな配列であるときは、他のものは 結合、末端アミノ又はカルボキシル基、あ るいは付加的なアミノ酸残基であり；Ｒは 結合又は結合基であり；担体は免疫原性担 体物質であり；ｍ及びｎの中の一つは１であり且つ他の
   ものはゼロであり；且つｐは平均して１乃至担体上に存
   在する利用できる結 合部位の数である、 の免疫原。 ４、段階： （ａ）免疫原性担体物質に化学的に結合したグリコシル
   化ペプチドを包含する免疫原によつて動物に免疫を与え
   、該グリコシル化ペプチドはε−アミノ基が酵素作用に
   よらずにグリコシル化してあるリシン残基及び５２５の
   位置におけるリシン残基に隣接するヒトのアルブミンの
   ペプチド配列に相当する位置にある少なくとも一つの他
   のアミノ酸単位を包含し、 （ｂ）該グリコシル化したヒトのアルブミンに対する抗
   体を生産する免疫を与えた動物からのリンパ球を骨髄腫
   細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ、 （ｃ）ハイブリドーマをそれに対して選択的な培地上で
   クローニングし （ｄ）該グリコシル化したヒトのアルブミンに対して特
   異的な抗体を分泌する単離したハイブリドーマを決定し
   、 （ｅ）かかる単離したハイブリドーマをサブクローニン
   グする、 から成る、５２５の位置のリシン残基においてグリコシ
   ル化してあるヒトのアルブミンに対して特異的に結合す
   るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系
   の産生方法。 ５、免疫原は式： 【アミノ酸配列があります】 式中でグリコ−（ＮＨ）はリシン残基中の酵素作用によ
   らずにグリコシル化したε−アミ ノ基を表わし、且つＡＡ＿１とＡＡ＿２の一方又は両方
   はアミノ酸の配列であつてその中で 少なくとも一つのアミノ酸単位は５２５の 位置におけるリシン残基に隣接するヒトの アルブミンのペプチド配列に相当する位置 にあり、且つＡＡ＿１及びＡＡ＿２の中の一つのみがそ
   のような配列である場合は、他のも のは結合、末端アミノ又はカルボキシル基、あるいは付
   加的なアミノ酸残基であり；Ｒ は結合又は結合基であり；担体は免疫原性 担体物質であり；ｍ及びｎの中の一つは１であり且つ他
   のものはゼロであり；且つｐは平均して１乃至担体上に
   存在する利用できる 結合部位の数である、 のものである、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、段階： （ａ）血液試料を５２５の位置のリシン残基においてグ
   リコシル化してあるヒトのアルブミンに対して特異的に
   結合する、抗体結合部位を包含する単クローン性抗体又
   はそのフラグメントと接触させ； （ｂ）単クローン性抗体又はそのフラグメントのグリコ
   シル化したヒトのアルブミンに対する結合を検査する試
   料中のその量の関数として決定する、 ことから成る、ヒトの血液試料中のグリコシル化したア
   ルブミンの決定のための免疫検定方法。 ７、式： 【アミノ酸配列があります】 式中でＡＡ＿１及びＡＡ＿２の中の少なくとも一つはヒ
   トのアルブミン中の５２５の位置の リシン残基に隣接するペプチド配列に相当 する１〜１２のアミノ酸の配列であり、且 つＡＡ＿１及びＡＡ＿２の中の一つのみがそのような配
   列であるときは、他のものは結合で あり、且つここで（ＮＨ＿２）ＡＡ＿１中のＮ−末端ア
   ミノ基及びＡＡ＿１又はＡＡ＿２中の何れかのリシン単
   位はグリコシル化してあつても グリコシル化してなくてもよく；ｑ及びｔは相互に無関
   係にゼロ又は１であり；ｒ及び ｓは、相互に無関係に、ゼロ、１又は２で あり；ＱＮＨはＬｙｓ中のε−アミノ基を表わし；且つ
   Ｑは水素又は１−デオキシフルクトシルである、 のペプチド。 ８、ａ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは１−デオキシフルクトシル である； ｂ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは１−デオキシフルクトシル である； ｃ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは水素又は１−デオキシフル クトシルであり；ＡＡ＿３はＬ■ｓ−Ｃｌｕ−Ａｒｇ、
   Ａｒｇ、又は結合であり；且つＡＡ＿４はＴｙｒ−Ｃｙ
   ｓ又は結合であり；ここで（ＮＨ＿２）ＡＡ＿３中のＮ
   −末端アミノ基及びペプチド中 の何れのＬ■ｓ単位もグリコシル化して あるか又はグリコシル化してない； ｄ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは水素又は１−デオキシフル クトシルであり且つＡＡ＿４はＣｙｓ又は 結合であり、且つここで（ＮＨ＿２）ＡＡ＿５中のＮ−
   末端アミノ基及びペプチド中 のＬ■ｓ単位はグリコシル化してある か又はグリコシル化してない； ｅ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは水素又は１−デオキシフル クトシルであり、ＡＡ＿４はＣｙｓ又は結 合であり、且つペプチド中の（ＮＨ＿２） Ｇｌｎ及びＬ■ｓ単位中のＮ−末端アミノ 基はグリコシル化してあるか又はグリ コシル化してない； ｆ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは水素又は１−デオキシフル クトシルであり、ＡＡ＿５はＡｒｇ又は結 合であり、且つペプチド中の（ＮＨ＿２） ＡＡ＿２上のＮ−末端アミノ基及びペプチ ド中のＬ■ｓ単位はグリコシル化してあ るか又はグリコシル化してない； ｇ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは水素又は１−デオキシフル クトシルであり；ＡＡ＿６はＧｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌ■ｓ、
   Ｉｌｅ−Ｌ■ｓ、Ｌ■ｓ又は単結合であり；ＡＡ＿７は
   Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ又は結合であり；且つ
   ここで（ＮＨ＿２）ＡＡ＿６中のＮ−末端アミノ基及び
   ペプチド中のＬ■ｓ単位はグ リコシル化してあるか又はグリコシル 化してない； ｈ）【アミノ酸配列があります】 ここでＱは水素又は１−デオキシフル クトシルであり；ＡＡ＿８はＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、
   Ｃｙｓ−Ｔｙｒ、Ｃｙｓ又は結合であり；且つＬ■ｓは
   グリコシル化してあるか又はグリコ シル化してない；及び ｉ）【アミノ酸配列があります】 から成るグループから選択したペプチド。 ９、グリコシル化したヒトのアルブミンに対する抗体を
   生じさせるための特許請求の範囲第７項記載のペプチド
   の何れかの使用。 １０、特許請求の範囲第１及び２項記載の何れかの抗体
   を包含する免疫検定法検査キット。