JP3167024B2 - エンドセリン―３あるいはエンドセリン―３前駆体に対するモノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエンドセリン−３およびエンドセリン−３の
前駆体、例えばビッグエンドセリン−３に結合特異性を
有する点で有用かつ新規な抗体に関する。更に詳しく
は、抗原抗体反応に基づくエンドセリン−３およびエン
ドセリン−３の前駆体、例えばビッグエンドセリン−３
の測定法の開発、あるいはエンドセリン−３が関与する
疾患の診断、予後治療に有用な抗体に関する。

〔従来の技術〕

エンドセリン−１は血管内皮細胞の培養上清中に見出
された21個のアミノ酸からなるペプチドであり、極めて
強力かつ持続的な血管平滑筋収縮活性ならびに血圧上昇
活性を有する。また、エンドセリン−１のcDNAの解析か
ら、その生合成過程の中間体として、アミノ酸約40個か
らなるビッグエンドセリン−１（エンドセリン−１前駆
体）の存在も想定されている。これまでにエンドセリン
−１およびビッグエンドセリン−１に対するモノクロー
ナル抗体が作製され、高感度な酵素免疫測定法が開発さ
れたことによりエンドセリン−１の生理的役割・病態と
の関連の解明に向けて幅広に研究を展開することが可能
となった。既に、中和活性能を有するモノクローナル抗
体を特異的アンタゴニストとして用いることにより、エ
ンドセリン−１が虚血性疾患と深い関わりを有すること
が明らかにされ、さらに該測定法を用いて血漿エンドセ
リン−１レベルと病態との関連について詳細な研究が進
められている。

一方、染色体DNAの解析から、新たにエンドセリン−
２およびエンドセリン−３の配列が見出され、エンドセ
リンが遺伝子ファミリーを形成していることが明らかに
された。特にエンドセリン−３は、エンドセリン−１、
エンドセリン−２とは、以下の例に示すように21アミノ
酸残基中６残基（アンダーライン参照）が異なってお
り、その平滑筋収縮、血圧上昇活性もエンドセリン−
１、エンドセリン−２と比較してかなり微弱であること
が報告されている。

また、エンドセリン−３のcDNAの解析から、エンドセ
リン−３の前駆体構造が明らかにされ（特願平１−2537
97）、エンドセリン−３が下記の配列を有するビッグエ
ンドセリン−３を直接の前駆体として合成されることが
示唆された。

このように、構造および薬理作用の研究結果は、エン
ドセリン−３がエンドセリン−１、−２とは異なるリセ
プターシステムを形成していることを強く示唆してお
り、その生理的役割に深い関心が寄せられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述したように、エンドセリン−３の生理的役割に対
する関心が高まっているにもかかわらず、これまで、エ
ンドセリン−３の発現部位、血漿レベル等、基本的な生
理的情報はほとんど得られていない。この主たる原因と
して、これまでエンドセリン−３あるいはエンドセリン
−３前駆体を特異的に認識するモノクローナル抗体が作
製されておらず、さらにエンドセリン−３あるいはエン
ドセリン−３前駆体を特異的かつ高感度に測定する免疫
学的測定法が開発されていないことが挙げられる。これ
らの免疫学的手法は、エンドセリン−３の研究、特に代
謝経路、分泌機構、リセプターシステム、病態との関連
等に関する研究を総合的に行う上で最も有効な手段の一
つと考えられ、該手法の確立が各界から切望されてい
た。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、エンドセリン−３あるいはエンドセリ
ン−３前駆体である、例えばビッグエンドセリン−３に
結合特異性を有するモノクローナル抗体を作製し、該抗
体を用いてエンドセリン−３あるいはビッグエンドセリ
ン−３を高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を
開発した。さらに該抗体特有の薬理作用、すなわち、該
抗体が種々の動物の平滑筋のエンドセリン−３による収
縮を抑制することを見出した。これらの知見は、該抗体
をエンドセリン−３の特異的アンタゴニストとして使用
し得ることを示しており、該抗体がエンドセリン−３と
因果的に、または症候的に関連する各種疾患の予防ある
いは治療薬となり得ることを示している。

すなわち、本発明はエンドセリン−３あるいはエンド
セリン−３前駆体に結合性を有するモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞、および該抗体を用いた競合法あるいはサンドイッチ
法によるエンドセリン−３およびエンドセリン−３前駆
体である、例えばビッグエンドセリン−３の免疫測定法
に関する。エンドセリン−３のサンドイッチ法において
は、１次反応および２次反応に用いられる抗体はそれぞ
れポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であっ
てもよいが、好ましくはその一方がエンドセリン−３と
は反応するが、エンドセリン−３のＣ端部とは反応しな
い抗エンドセリン−３モノクローナル抗体であって、他
方がエンドセリン−３のＣ端部と反応する抗エンドセリ
ン−３ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体が用
いられる。この後者のエンドセリン−３のＣ端部と反応
する抗エンドセリン−３ポリクローナルもしくはモノク
ローナル抗体は、上記のエンドセリン−1,2とのアミノ
酸配列の比較から判るように、エンドセリン−１または
−２のＣ端部と反応する抗体と同一のものを含み、これ
については特願平１−46560号で言及している。

また、ビッグエンドセリン−３のサンドイッチ法にお
いても、好ましくは、１次反応および２次反応に用いら
れる抗体の一方が、ビッグエンドセリン−３とは反応す
るが、エンドセリン−３とは反応しないモノクローナル
抗体であって、他方がエンドセリン−３と反応するモノ
クローナル抗体が用いられる。さらに、ビッグエンドセ
リン−３とは反応するが、エンドセリン−３とは反応し
ないモノクローナル抗体において、特に好ましくは、ビ
ッグエンドセリン−３のＣ端部分の構造に対し、広い特
異性を有する抗体、例えばＣ末端がArg−Glyの配列で
も、Arg−NH₂の配列でも、同程度に反応する抗体が用い
られる。

本発明のポリクローナル抗体の調製は一般に免疫抗原
のエンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン−３と
キャリアー蛋白との複合体をつくり、このものを動物に
接種して免疫を行い、該免疫動物から目的とする抗体含
有物を採取、抗体の分離精製を行うことによる。

本発明のモノクローナル抗体の調製に当っては、上記
免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫２〜５
日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それらに含まれる
抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定的に力価の
高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、モノクロ
ーナルなハイブリドーマを得ることによる。

免疫抗原としては、天然精製標品、合成標品等いずれ
も使用でき、先に述べたエンドセリン−３、ビッグエン
ドセリン−３、およびビッグエンドセリン−３の一部分
が用いられる。また免疫抗原として、エンドセリン−３
の構造を含む化合物、あるいはエンドセリン−３の一部
分の構造を含む化合物が用いられる場合もある。

本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成
の公知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成
法のいずれによってもよい。例えば固相法によりエンド
セリン−３を合成する場合、メリーフィールドの固相ペ
プチド合成方法〔ジャーナル オブ ジ アメリカン
ケミカル ソサィエティ（J.Am.Chem.Soc.）,85,2149
（1963）〕を用いるのが好ましい。不溶性樹脂として当
該技術分野で知られたもののいずれであってもよく、例
えばクロロメチル化されたスチレン−ジビニルベンゼン
共重合体、フェナシルアセティックメチル化されたスチ
レン−ジビニルベンゼン共重合体のようなポリスチレン
型樹脂、ポリジメチルアクリルアミド樹脂のようなポリ
アミド型樹脂が挙げられる。Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸
を不溶性樹脂に結合させた後、エンドセリン−３のＣ末
端側から保護アミノ酸を常法に従って順次結合し、次い
でフッ化水素で処理した後、ジスルフィド結合を形成さ
せ目的とするエンドセリン−３を合成することができ
る。Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基はすべて
Boc基で保護し、セリンおよびスレオニンの水酸基はBzl
基で、グルタミン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸
はOBzl基、リジンのε−アミノ基はCl−Ｚ基、システイ
ンのチオール基はAcm基、MeBzl基、チロシンの水酸基は
Br−Ｚ基、ヒスチジンのイミダゾール基およびアルギニ
ンのグアニド基はTos基、トリプトファンのインドール
基はCHO基で保護するのが好ましい。

液相法による合成の手段としては、たとえば「ザ ペ
プチズ（The Peptides）」、第１巻（1966年）、Schrod
er and Lubke著、Academic Press,New York,U.S.A.ある
いは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（1975
年）に記載された方法、たとえばアジド法、クロライド
法、酸無水物法、混合無水物法、DCC法、活性エステル
法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダ
ゾール法、酸化還元法、DCC/アディテイブ（例、HONB,H
OBt,HOSu）法などがあげられる。

哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャ
リアー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリアー蛋白の種
類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリア
ーにカプリングさせて免疫したハプテンに対して抗体が
効率よく出来れば、どの様なものをどの様な比率でカプ
リングさせてもよいが、例えば、牛血清アルブミンや牛
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１対し0.1〜20、好ましくは１〜５の割合でカプルさせ
る方法が用いられる。

また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々
の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデビト
やカルボジイミド、マレイミド活性エステル等が好都合
に用いられる。

縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与されるが、なかでも皮下注射が好ましい。投与に際し
て抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバン
トや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。
投与は通常２〜６週毎に１回ずつ行われる。

用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサ
ギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギ、ニワトリがあげられる。

抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水
（好ましくは血液）などから採取される。例えば、免疫
原がエンドセリン−３あるいはその部分ペプチドである
場合、抗血清中の抗エンドセリン−３抗体価の測定は、
例えば後記の標識化エンドセリン−３と抗血清とを反応
させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定するこ
とによりなされる。抗体の分離精製は免疫グロブリンの
分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈
殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸
脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原抗体結合物あるい
は活性吸着剤により特異抗体のみを採取し、結合を解離
させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。

このようにして作製された抗体は、IgGを主たる成分
とし、IgM,IgA等、他の免疫グロブリンも含む。

一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免
疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合させることにより、抗エンドセリン−３抗
体および抗エンドセリン−３前駆体抗体産生ハイブリド
ーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、
たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Nature）、256、495（1975）〕に従い実施できる。融
合促進剤としてはポリエチレングリコール（PEG）やセ
ンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが
用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばNS−１、P3U
1、SP2/0などがあげられるが、特にP3U1が好ましく用い
られる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄
細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG
（好ましくはPEG1000〜PEG6000）が10〜80％程度の濃度
で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で１〜10分
間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実
施できる。

抗エンドセリン−３抗体産生ハイブリドーマあるいは
抗ビッグエンドセリン−３抗体産生ハイブリドーマのス
クリーニングには種々の方法が使用できるが、たとえば
エンドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるいは
ビッグエンドセリン−３の部分ペプチドを吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で
標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる
細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用
いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した
抗エンドセリン−３モノクローナル抗体を検出するELIS
A（Enzyme−linked immunosorbent assay）法、抗免疫
グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、HRPで標識したエン
ドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるいはビッ
グエンドセリン−３の部分ペプチドを加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出するEIA（Enzyme immuno
assay）法などがあげられる。ハイブリドーマの選別、
育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む動物細
胞用培地（例、RPMI 1640）で行われる。ハイブリドー
マ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定
と同様にして測定できる。

抗エンドセリン−３モノクローナル抗体あるいは抗ビ
ッグエンドセリン−３抗体の分離精製は上記のポリクロ
ーナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精
製法に従って行われる。

エンドセリン−３の一部領域と反応する抗エンドセリ
ン−３ポリクローナル抗体は、その一部領域に相当する
ペプチド（部分ペプチド）をハプテンとして免疫し上記
の方法で調製することもできるが、エンドセリン−３を
ハプテンとして用いて調製された抗エンドセリン−３ポ
リクローナル抗体から、その一部領域に相当するペプチ
ドを結合したカラムによるアフィニティクロマトグラフ
ィを用いて調製することもできる。

また、ビッグエンドセリン−３の一部領域と反応する
抗ビッグエンドセリン−３ポリクローナル抗体は、その
一部領域に相当するペプチドをハプテンとして免疫し上
記の方法で調製することもできるが、ビッグエンドセリ
ン−３をハプテンとして用いて調製された抗ビッグエン
ドセリン−３ポリクローナル抗体から、その一部領域に
相当するペプチドを結合したカラムによるアフィニティ
クロマトグラフィを用いて調製することもできる。

また、エンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン
−３の一部領域と反応するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマおよび、エンドセリン−３あるいはビ
ッグエンドセリン−３とは反応するがその一部領域とは
反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの選別はたとえばその一部領域に相当するペプチドと
ハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定するこ
とにより行うことができる。

特にエンドセリン−3 C端ペプチドCys His Leu Asp I
le Ile Trp以外を認識するモノクローナル抗体のスクリ
ーニングには、該ペプチドに対する抗体の標識体を用い
るサンドイッチ型EIAを用いるのが好ましい。すなわ
ち、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着さ
せた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、エンドセ
リン−３を加え、さらにHRPで標識した抗エンドセリン
−3 C端ペプチド抗体を反応させたのち、固相上の酵素
活性を測定するEIA法である。

上記で得られた抗エンドセリン−３および抗ビッグエ
ンドセリン−３モノクローナル抗体を用いて、エンドセ
リン−３の測定ないし組織染色等を行ない得る。エンド
セリン−３およびビッグエンドセリン−３の測定法には
通常、以下に述べる競合法が用いられるが、後述するサ
ンドイッチ法を用いるのが好ましい。

競合法においては、本発明で得られた抗エンドセリン
−３あるいは抗ビッグエンドセリン−３抗体と、被検液
および標識化エンドセリン−３あるいは標識化ビッグエ
ンドセリン−３あるいはその部分ペプチドとを競合的に
反応させたのち、抗体に結合した標識剤の割合を測定す
ることにより、被検液中のエンドセリン−３、ビッグエ
ンドセリン−３、あるいはビッグエンドセリン−３の部
分ペプチドを定量する。

該エンドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、ある
いはビッグエンドセリン−３の部分ペプチドの標識剤あ
るいは後記の抗体の標識剤としては、放射性同位元素、
酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同
位元素としては、例えば¹²⁵I,¹³¹I,³H,¹⁴Cなどが、上記
酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸
脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物
質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、
抗体あるいはエンドセリン３、ビッグエンドセリン−
３、あるいはビッグエンドセリン−３の部分ペプチドと
標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることも
できる。

上記の標識剤の活性の測定に当っては、例えばエンド
セリン−３の測定の場合、抗体に結合した標識化エンド
セリン−３と遊離の標識化エンドセリン−３とを分離
（以後B/F分離と略す）する必要があるが、標識剤とし
て酵素を用いた場合には、このための試薬に不溶化した
抗エンドセリン−３抗体に対する抗体あるいは不溶化し
たプロテインＡ等の活性吸着剤が有利に用いられる。例
えば、抗IgG抗体（抗エンドセリン−３抗体に対する抗
体に相当）を固相として用い、これと反応性のある上記
抗体を介して標識化エンドセリン−３を固相にある抗Ig
G抗体に結合させ、該固相上の標識剤を測定することに
よって行なうことができる。標識剤として酵素を用いた
場合には、不溶化担体上の酵素活性の測定には通常の比
色法あるいは蛍光法が用いられる。標識剤にラジオアイ
ソトープ等、非蛋白性物質を用いた場合には、B/F分離
に上記の試薬以外にも不溶化しない抗エンドセリン−３
に対する抗体、硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポ
リエチレングリコール等の試薬が用いられる。いずれの
方法においても上清中あるいは沈降物中の標識剤の活性
を測定する。

上記の不溶化に当っては、物理的吸着を用いてもよ
く、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化す
るのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体
としては、アガロース、デキストラン、セルロースなど
の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、
シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられ
る。

競合法においては、例えばエンドセリン−３の測定の
場合、抗エンドセリン−３抗体、被検液、標識化エンド
セリン−３、およびB/F分離用試薬は、どのような順序
に反応させることも可能であり、また全部あるいは一部
を同時に反応させてもよいが、少なくとも標識化エンド
セリン−３は、被検液と抗エンドセリン−３抗体との反
応と同時に、あるいは反応後に遅れて反応系に加えられ
ることが好ましい。

ただし硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポリエチ
レングリコール等のB/F分離試薬は主として反応系の最
後に用いられる。

一方、サンドイッチ法においては不溶化した抗エンド
セリン−３あるいはビッグエンドセリン−３抗体に被検
液を接触（反応）させ（１次反応）、さらに標識化抗エ
ンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン−３抗体を
反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の
活性を測定することにより被検液中のエンドセリン−３
あるいはビッグエンドセリン−３量を定量することがで
きる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時
間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の
方法は前記のそれらに準じることができる。

２次反応に用いられる抗エンドセリン−３抗体あるい
は抗ビッグエンドセリン−３抗体としては、１次反応に
用いられる抗エンドセリン−３抗体あるいは抗ビッグエ
ンドセリン−３抗体とはエンドセリン−３あるいはビッ
グエンドセリン−３の該抗体と結合する部位が相異なる
抗体が好ましく用いられる。たとえばエンドセリン−３
の測定の場合、１次反応で用いられる抗体がエンドセリ
ン−３のＣ端部との結合能を有する場合、２次反応で
は、好ましくはＣ端部以外（例、Ｎ端部）と結合する抗
エンドセリン−３抗体が用いられ、また１次反応で用い
られる抗体がエンドセリン−３のＮ端部との結合能を有
する場合、２次反応では、好ましくはＮ端部以外（例、
Ｃ端部）と結合する抗エンドセリン−３抗体が用いられ
る。

１次反応および２次反応に用いられる抗体はそれぞれ
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であって
もよいが、例えばエンドセリン−３の測定の場合、好ま
しくはその一方がエンドセリン−３とは反応するが、エ
ンドセリン−３のＣ端部とは反応しない抗エンドセリン
−３モノクローナル抗体であって、他方がエンドセリン
−３のＣ端部と反応する抗エンドセリン−３ポリクロー
ナルもしくはモノクローナル抗体が用いられる。

サンドイッチ法によるエンドセリン−３の免疫学的測
定法において特に好ましくは、エンドセリン−３のＣ端
ペプチド、すなわちCys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Tr
pと反応する抗エンドセリン−３ポリクローナル抗体お
よび、エンドセリン−３とは反応するが、上記エンドセ
リン−３のＣ端ペプチドとは反応しない抗エンドセリン
−３モノクローナル抗体が用いられる。

サンドイッチ法による免疫測定法においては、固相用
抗体および標識用抗体いずれもいかなるクラス、サブク
ラスのものでもよく、また、抗体活性が保持されている
なら、それらからFc′あるいはFc領域を除去したＦ（a
b′）_２画分、Fab′画分あるいはFab画分でもよい。

サンドイッチ法による免疫測定法において、モノクロ
ーナル抗体を用いる場合、固相用抗体あるいは標識用抗
体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はな
く、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体
の混合物を用いてもよい。

また、本発明で得られた抗体を用いる免疫測定法は、
エンドセリン−３が関与する疾患の診断および予後管理
に使用し得る。

被検試料としては、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹
水、胸水、羊水等の体液や、痰、便などが使用し得る。
これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液で希釈
あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料とし得
る。試料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒としては
どのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよいが、
好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩水、
酢酸緩衝液、アセトン、クロロホルム−メタノールある
いは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられる。ま
た、濃縮は、試料を直接減圧下、あるいは常圧、窒素気
流下濃縮してもよいし、また試料をイオン交換あるいは
逆相クロマトグラフィー用担体あるいは抗エンドセリン
−３抗体結合担体に添加したのち、適当な溶出条件で溶
出後、減圧下あるいは常圧、窒素気流下濃縮しても良
い。濃縮用担体として特に好ましくは、逆相クロマトグ
ラフィー用担体のC2,C8あるいはC18カートリッジが用い
られる。濃縮物はイムノアッセイ用緩衝液に溶解後、イ
ムノアッセイの試料とする。

さらに、本発明で得られた抗エンドセリン−３および
抗ビッグエンドセリン−３抗体はエンドセリン−３およ
びビッグエンドセリン−３の免疫組織染色法等にも用い
る事ができる。その方法は、例えば標識化抗エンドセリ
ン−３あるいは標識化ビッグエンドセリン−３抗体を用
いる直接法、抗エンドセリン−３抗体あるいはビッグエ
ンドセリン−３抗体および該抗体に対する抗体の標識化
されたものを用いる間接法等に準ずることができる。

また、さらに本発明で得られた抗エンドセリン−３抗
体のうちエンドセリン−３の血管収縮能を中和し得る抗
体は、エンドセリン−３の特異的アンタゴニストとして
使用し得る。

抗エンドセリン−３抗体の中からエンドセリン−３の
作用を特異的に抑制する抗体をスクリーニングする方法
としては、エンドセリン−３の薬理作用を検出するいか
なる方法を用いることも可能であり、例えば、エンドセ
リン−３のブタ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、
ヒト等、各種血管平滑筋収縮活性を指標とする生体外の
測定系、あるいはエンドセリン−３の上記動物の血圧上
昇活性または血圧下降活性を指標とする生体の測定系が
挙げられる。

得られたエンドセリン−３の作用を特異的に抑制する
抗体はIgG,IgA,IgMいかなるクラスのものでもよく、ま
たそれらからFc′あるいはFc領域を除去したFab′ある
いはFab画分あるいはその重合体でもよい。また、エン
ドセリン−３の作用を特異的に抑制及し得るモノクロー
ナル抗体の可変遺伝子部と、ヒトイムノグロブリン定常
遺伝子部とを融合させ、組み換え体として発現させたキ
メラ抗体を用いることもできる。

〔実施例〕

以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるべきものではない。

後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル
抗体AET−30aを産生するハイブリドーマ細胞AET−30は
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 50193とし
て平成１年７月７日から寄託されている。また、該ハイ
ブリドーマは通商産業省工業技術院微生物工業研究所
（FRI）に受託番号FERM BP−2523としてブダペスト条
約に基き平成１年７月20日から寄託され、FRIに保管さ
れている。

後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル
抗体bET−31aを産生するハイブリドーマ細胞bET−31は
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 50247とし
て平成２年５月24日から寄託されている。また、該ハイ
ブリドーマは通商産業省工業技術院微生物工業研究所
（FRI）に受託番号FERM BP−2949としてブダペスト条
約に基き平成２年６月12日から寄託され、FRIに保管さ
れている。

後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル
抗体bET−23aを産生するハイブリドーマ細胞bET−23は
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 50246とし
て平成２年５月24日から寄託されている。また、該ハイ
ブリドーマは通商産業省工業技術院微生物工業研究所
（FRI）に受託番号FERM BP−2948としてブダペスト条
約に基き平成２年６月12日から寄託され、FRIに保管さ
れている。

I.酵素標識化抗エンドセリン−3 C端ペプタイド抗体の
作製 Ｉ−1.ペプタイドの合成 ｉ）Ｈ−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp−OH（エ
ンドセリン−３のＣ端部）の合成 Boc−Ile−Trp−OBzl:H−Trp−OBzl−pTsOH84gをDMF1
00mlに溶解し、TEA25mlで中和ののちBoc−Ile−OH・1/2
H₂O48.9g,HONB40.12g、DCC46.20gより調製のBoc−Ile
−ONBを加え一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物
にジエチルエーテル400mlと酢酸エチル20mlを加え溶解
し、0.5N−HCl,5％−NaHCO₃水で洗い、水洗ののち無水M
gSO₄で乾燥した。溶媒を留去し、残留物に石油エーテル
を加え結晶をろ取した。収量 83.1g（90.9％） ▲〔α〕¹⁸ _D▼−19.7゜（ｃ＝0.99 MeOH） 元素分析:C₂₉H₃₇N₃O₅として 計算値:C,68.62;H,7.35;N,8.28 実測値:C,68.69;H,7.35;N,8.16 Boc−Ile−Ile−Trp−OBzl:Boc−Ile−Trp−OBzl53.3
gをジオキサン120mlに溶解し、氷冷下に7.1N−HCl−ジ
オキサン160mlを加え、90分間撹拌した。溶媒を減圧留
去し、残留物にジエチルエーテルを加え、析出物をろ取
した。これをアセトニトリル150mlとDMF250mlの混合溶
媒に溶解し、氷冷下、TEA14.6mlで中和し析出するTEA・
HClをろ去した。ろ液にBoc−Ile−ONB45.33gを加え一晩
撹拌した。溶媒を留去し残留物をCHCl₃1に溶解し、0.
5N−HCl,5％−NaHCO₃,水で洗い、無水MgSO₄で乾燥し
た。溶媒を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加
え析出物を結晶としてろ取したのちアセトニトリルとジ
エチルエーテルで洗い乾燥した。

収量 54.95g（84.3％） ▲〔α〕¹⁸ _D▼−12.0゜（ｃ＝0.98,CHCl₃） 元素分析:C₃₅H₄₈N₄O₆としての 計算値:C,67.72;H,7.79;N,9.03 実測値:C,67.72;H,7.91;N,8.87 Boc−Asp−（OBzl）−Ile−Ile−Trp−OBzl:Boc−Ile
−Ile−Trp−OBzl49.7gを氷冷下に10％−1,2−エタンジ
チオール含有TFA250mlに溶解し、室温下に15分間放置し
た。溶媒を留去し、残留物に4N−HCl−ジオキサン20ml
を加えよくかきまぜたのち、ジエチルエーテルを加え、
析出物をろ取した。これをDMF250mlに溶解し、氷冷下に
TEA11.1mlで中和したのち、析出するTEA・HClをろ去し
た。ろ液にBoc−Asp−（OBzl）−OH31.0g,HONB20.6g,DC
C23.8gより調製のBoc−Asp−（OBzl）−ONBを加え一晩
攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物に酢酸エチル800m
lを加え溶解し、10％クエン酸水、５％−NaHCO₃、水で
洗い、無水MgSO₄で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留
物にジエチルエーテルを加え析出物を結晶としてろ取
し、アセトニトリルから再結晶した。

収量 54.0g（81.7％） ▲〔α〕¹⁸ _D▼−13.7゜（ｃ＝1.04,CHCl₃） 元素分析:C₄₆H₅₉N₅O₉としての 計算値:C,66.89;H,7.20;N,8.48 実測値:C,66.69;H,7.23;N,8.31 Boc−Leu−Asp（OBzl）−Ile−Ile−Trp−OBzl:Boc−
Asp（OBzl）−Ile−Ile−Trp−OBzl48.0gを氷冷下に10
％−1,2−エタンジチオール含有TFA210mlに溶解し、室
温下に15分間放置した。溶媒を留去し、残留物に4N−HC
l−ジオキサン14.5mlを加えよくかきまぜたのち、ジエ
チルエーテルを加え、析出物をろ取した。これをDMF300
mlに溶解し、氷冷下TEA42mlで中和したのち、析出するT
EA−HClをろ去し、ろ液にBoc−Leu−ONB27.3gを加え、
一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物にCHCl₃600ml
を加えて溶解し、10％−クエン酸水、５％−NaHCO₃、水
で洗い無水MgSO₄で乾燥した。残留物に石油エーテルを
加え析出物をろ取し、含水アセトニトリルより再結晶し
た。収量 53.1％（97.5％） ▲〔α〕¹⁸ _D▼−20.6゜（ｃ＝1.02,CHCl₃） 元素分析:C₅₂H₇₀N₆O₁₀・1/2H₂Oとしての 計算値:C,65.87;H,7.55;N,8.86 実測値:C,66.08;H,7.58;N,8.78 Boc−His−Leu−Asp（OBzl）−Ile−Ile−Trp−OBzl:
Boc−Leu−Asp（OBzl）−Ile−Ile−Trp−OBzl46.5gを
氷冷下に10％−1,2−エタンジチオール含有TFA220mlに
溶解し、室温下15分間放置した。溶媒を減圧留去し、残
留物にジエチルエーテルを加えろ取した。これをDMF25m
lに溶解し、TEA20mlを加えよくかきまぜたのち、ジエチ
ルエーテル500mlを加え析出物を粉末としてろ取した。
これをDMF200mlに溶解し、Boc−His（Tos）−OH22.3g,H
ONB11.7g,DCC13.5gより調製した。Boc−His（Tos）−ON
Bを加え、一晩攪拌した。溶媒を留去し、残留物にアセ
トニトリルを加え、粉末をろ取した。

収量 45.9g（86.2％） ▲〔α〕¹⁸ _D▼−16.6゜（ｃ＝1.0,DMF） 元素分析:C₅₈H₇₇N₉O₁₁・2.5H₂Oとしての 計算値:C,62.13;H,7.37;N,11.24 実測値:C,62.25;H,7.02;N,11.03 Boc−Cys（MeBzl）−His−Leu−Asp（OBzl）−Ile−I
le−Trp−OBzl:Boc−His−Leu−Asp（OBzl）−Ile−Ile
−Trp−OBzl17.2gを氷冷下、10％−1,2−エタンジチオ
ール含有TFA88mlに溶解し、室温下15分間放置した。溶
媒を減圧留去し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ
取したのちDMF25mlに溶解した。これにTEA25mlを加えよ
く撹拌したのち、エーテル500mlを加え析出物を粉末と
してろ取した。これをDMF40mlに溶解し、Boc−Cys（MeB
zl）−OH5.72g,HONB3.48g,DCC4.00gより調製したBoc−C
ys（MeBzl）−ONBを加え、一晩撹拌した。溶媒を留去
し、残留物にアセトニトリルを加え、析出物を粉末とし
てろ取し、さらに熱アセトニトリル中で洗い、室温に冷
却後粉末をろ取した。

収量 15.0g（72.9％） ▲〔α〕¹⁸ _D▼−23.3゜（ｃ＝1.02,DMF） 元素分析:C₆₉H₉₀N₁₀O₁₂S・3H₂Oとしての 計算値:C,61.96;H,7.23;N,10.47;S,2.40 実測値:C,62.24;H,6.90;N,10.49;S,2.53 Ｈ−Csy−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp−OH:Boc−C
ys（MeBzl）−His−Leu−Asp（OBzl）−Ile−Ile−Trp
−OBzl100mgを氷冷下、10％−1,2−エタンジチオール含
有TFA1mlに溶解し、室温下15分間放置後、溶媒を減圧留
去した。残留物にエーテルを加え粉末としてろ取、乾燥
したのち、ｍ−クレゾール0.5mlと共にHF5mlで０℃、１
時間処理した。HFを減圧留去し、残留物にジエチルエー
テルを加え、析出物を粉末としてろ過し、水洗した。こ
れを60％酢酸に溶解し、同溶媒で充填したセファデック
スLH−20（2.5×90cm）のカラムに付し160ml〜180mlの
区分を集め凍結乾燥した。

収量 23mg（32.8％） アミノ酸分析値:Asp1.0（１）,Cys0.80（１）,Ile2.13
（２）,Leu0.99（１）,His1.07（１）,Trp0.67（１）． 平均回収率 90.5％ ii）Ｈ−Arg−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp−OH（エ
ンドセリン−3 C端部に類似、溶解性大）の合成 Boc−His−Leu−Asp（OBzl）−Ile−Ile−Trp−OBzl5
38mgを氷冷下、20％−1,2−エタンジオチール含有TFA5m
lに溶解し、室温下15分放置後、pTsOH・H₂O95mgを加え
溶解したのち、溶媒を減圧留去した。残留物をDMF5mlに
溶解し、氷冷下、10％−TEA含有DMF0.75mlを加え中和し
た。これにBoc−Arg（NO₂）−OH60mg,HONB50mg,WSCD・H
Cl50mgを加え一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物
に水を加え沈殿をろ取した。これを乾燥ののち熱アセト
ニトリル10mlに懸濁し、室温に冷却後、析出物をろ取し
た。

収量 0.5g（78.3％） このうち102mgをアニソール0.2ml、1,2−エタンジチ
オール0.2mlと共にHFで０℃60分間処理し、HFを減圧留
去した。残留物をジエチルエーテルで洗ったのち、50％
−酢酸6mlに溶解し、同じ溶媒で充填したセファデック
スＧ−25（2.5×90cm）のカラムに付し展開し、100〜13
7mlの区分を集め凍結乾燥した。

収量 20mg（26.3％） アミノ酸分析値:Asp0.98（１）,Ile1.95（２）,Leu1.0
（１）,His0.95（１）,Arg0.98（１）,Trp0.72（１）． 平均回収率 89.7％ Ｉ−２ 免疫原の作製 上記Ｉ−１（ｉ）で得られたポリペプタイドCys His
Leu Asp Ile Ile Trpと牛血清アルブミン（以下BSAと略
す）との縮合物を以下に述べるマレイミド架橋法により
作製し、免疫原とした。

即ち、BSA20mgを1.4mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0に
溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシ
ニミド（以下GMBSと略す）2.6mgを含むDMF溶液100μ
と混合し、室温で40分反応させた。反応後、あらかじ
め、2.5mMのEDTAを含む、0.1Mリン酸緩衝液、pH6.5で平
衡化したセファデックスＧ−25カラムで分画した。次に
マレイミド基の導入されたBSA5.4mgを含む該溶出画分1.
2mlと、90％ジメチルスルホキシドを含む水溶液1.2mlに
溶解あるいは分散させたポリペプチドCys His Leu Asp
Ile Ile Trp1.8mgとを４℃で３日間反応させた。反応
後、生理食塩水に対し、４℃、２日間透析した。

Ｉ−３ 免疫 上記Ｉ−２で得た免疫原600μｇを含む生理食塩水450
μに550μの完全フロイントアジュバント（Freund
complete adjuvant）を加えてよく混和し乳剤を作成
し、ウサギの皮下約20ケ所に接種した。６週間後に、不
完全フロイントアジュバントを用い、同様の操作で乳剤
を作りウサギの皮下に接種した。この操作を以後１ケ月
おきに４回行ない、追加免疫の７日後、ウサギから血液
を部分採取し常法により抗血清を得た。

Ｉ−４ アフィニティ固相の作製 ポリペプタイドArg His Leu Asp Ile Ile Trpを直接C
NBr活性化セファロース4Bに結合させ、アフィニティ固
相とした。

即ち、Arg His Leu Asp Ile Ile Trp1.5mgを10mlの0.
5M食塩を含む0.1M炭酸水素ナトリウムに溶解させ、1gの
CNBr活性セファロース4Bと室温３時間反応させた。次
に、未反応の活性基を0.1Mトリス−塩酸緩衝液、pH8で
処理したのち、PBSに分散させ、４℃で保存した。

Ｉ−５ アフィニティ固相による抗エンドセリン−3 C
端ペプタイド抗体の精製 上記Ｉ−３記載ウサギ抗血清16mlから、硫安塩析法に
より抗体を部分精製した。すなわち、抗血清10mlにPBS1
0mlを加え、さらに16.5mlの飽和硫安を徐々に撹拌しな
がら加えた（最終45％）。30分間放置したのち、12,000
×ｇで20分間遠心し、沈殿をPBS10mlに溶解させた。次
に、同様に飽和硫安を最終30％飽和になるように加えた
のち遠心した。沈殿を、0.15M食塩を含む0.01Mホウ酸緩
衝液、pH8（以下BBSと略す）,10mlに溶解させたのち0.0
1M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液pH8（緩衝液Ｂ）に対
し、４℃,2日間透析した。抗体画分をBBSに透析した
後、上記Ｉ−４記載のアフィニティ固相を充填したカラ
ム（10mmφ×40mm）に付した。BBSで十分に洗浄したの
ち特異抗体を、0.5M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液、pH4.5
で溶出し、さらに0.1M食塩を含む0.05Mグリシン−塩酸
緩衝液、pH2.0で溶出した。

溶出液は中和したのち、BBSに対し透析した。特異抗
体はpH2で溶出した画分に認められ、該画分から18mgの
特異抗体が得られた。

Ｉ−６ 西洋ワヤビパーオキシダーゼ（HRP）標識化抗
エンドセリン−3 C端ペプタイド抗体の作製 上記Ｉ−５記載のアフィニティ精製抗Cys His Leu As
p Ile Ile Trp抗体より石川らの方法〔ジャーナル オ
ブ アプライド バイオケミストリィー（J.Appl.Bioch
em.）,6:56−63（1984）〕に従ってFab′−HRP標識体を
作製した。

即ち、0.1M酢酸緩衝液、pH4.5に溶解した特異抗体6.4
mgにペプシン（シグマ社、２回結晶）160μｇを加え、3
7℃、16時間反応させたのち、BBSで平衡化したスーパー
ロース12カラムを用いるFPLC（ファルマシア社製）でＦ
（ab′）_２画分を精製した。該画分を0.1M酢酸緩衝液、
pH5で透析したのち、最終20mMのβ−メルカプトエチル
アミンを加え、37℃で90分間放置した。反応液を2.5mM
EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0で平衡化したスー
パーロース12カラムを用いるFPLCで分離し、Fab′画分
を得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ5mgを0.9mlの0.1M
リン酸緩衝液、pH7に溶解させ、50μのDMFに溶解させ
たGBS1.05mgを加えて室温40分反応させた。

反応液をセファデックスＧ−25カラム（溶離液0.1Mリ
ン酸緩衝液、pH6.8）で分離し、得られたマレイミド化
ペルオキシダーゼ3.5mgと上記Fab′画分0.8mgとを混合
し、コロジオンパック（エムエス機器社）で約0.3mlに
まで濃縮したのち、４℃で16時間放置した。反応液を溶
離液に0.1Mリン酸緩衝液、pH6.5を用いるウルトロゲルA
cA44カラム（10mmφ×40mm）に供し、Fab′−ペルオキ
シダーゼ複合体画分を精製した。

II.モノクローナル抗体エンドセリン−３抗体の作製 II−１ 免疫原の作製 エンドセリン−３と牛チログロブリン（TG）とを以下
に述べるマレイミド架橋法により縮合させ、免疫原とし
た。

即ち、エンドセリン−３（ペプチド研究所より購入）
265n moleを450μの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0（10％
のDMFを含む）に溶解させ、GMBS6.6μmoleを含むDMF溶
液50μと混合し、室温で30分反応させた。

一方、TG20mg（40n mole）を0.15M食塩を含む0.02Mリ
ン酸緩衝液、pH6.8、1.4mlに溶解させ、Ｎ−サクシニミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以
下SPDPと略す）2.5mg（8.0μmole）を含むDMF溶液100μ
を混合したのち室温40分間反応させた。反応後、ジチ
オスレイトール12.4mg（80μmole）を含む0.1M酢酸緩衝
液、pH4.5、0.5mlを加え、室温20分反応させたのち、セ
ファデックスＧ−25カラムで分画を行ない、SH基の導入
されたTG12mg（24n mole）を得た。

次にマレイミド基導入エンドセリン3 190n moleと、S
H基導入TG5.9n moleとを混合し、４℃で２日間反応させ
たのち、生理食塩水に対し、４℃、２日間透析した。

II−２ 免疫 ６〜６週令のBALB/C雌マウスに上記II−１記載の免疫
原100μg/匹をアジュバントとともに皮下免疫した。以
後３週間おきに２〜３回追加免疫を実施した。

II−３ HRP標識化エンドセリン−３の作製 エンドセリン−3 80n moleを450μの0.1Mリン酸緩
衝液、pH7.0に溶解させ、GMBS295μｇ（2.0μmole）を
含むDMF溶液50μと混合し、室温で30分反応させた。
反応後、セファデックスＧ−15カラムで分画を行ないマ
レイミド基の導入されたポリペプチド60n moleを得た。

一方、HRP（250n mole）を0.15M食塩を含む0.02Mリン
酸緩衝液、pH6.8、1.4mlに溶解させ、SPDP1.17mg（3.75
μmole）を含むDMF溶液100μを混合したのち室温40分
間反応させた。反応後、ジチオスレイトール12.4mg（80
μmole）を含む0.1M酢酸緩衝液、pH4.5、0.5mlを加え、
室温20分反応させたのち、セファデックスＧ−25カラム
で分画を行ない、SH基の導入された酵素6mg（150n mol
e）を得た。

次に、マレイミド基導入エンドセリン−3 50n moleと
SH基導入ペルオキシダーゼ20n moleとを混合し、４℃、
16時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44（LKB−
ファルマシア社製）カラムで分画し、ペルオキシダーゼ
標識化エンドセリン−３を得た。

II−４ 細胞融合 比較的高い抗体価を示したマウスに対して240μｇの
免疫原を生理食塩水0.25mlに溶解させたものを静脈内に
接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫３日
後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメツシュで圧
迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エツセンシヤルメ
デイウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。
細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミエロ
ーマ細胞P3−×63.Ag8.U1（P3U1）を用いた〔カレント
トピツクス イン マイクロバイオロジー アンド
イムノロジー、81、１（1978）〕。細胞融合は、原法
〔ネイチャー、256、495（1975）〕に準じて行なった。
即ち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ血清を含有しない
MEMで３度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5:1になる
よう混合して、800回転で15分間遠心を行なって細胞を
沈殿させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐ
し、45％ポリエチレングリコール（PEG）600（コッホラ
イト社製）を0.3ml加え、37℃温水槽中で７分間静置し
て融合を行なった。融合後細胞に毎分2mlの割合でMEMを
添加し、合計12mlのMEMを加えた後600回転15分間遠心し
て上清を除去した。この細胞沈殿物を10％牛胎児血清を
含有するGITメデイウム（和光純薬）（GIT−10FCS）にP
3U1が1ml当り２×10⁶個になるように浮遊し、24穴マル
チデイシユ（リンブロ社製）に１ウェル1mlずつ120ウェ
ルに播種した。播種後、細胞を37℃で５％炭酸ガスフラ
ン器中培養した。24時間後HAT（ヒポキサンチン１×10
^-4M、アミノブリテリン４×10^-7M、チミジン1.6×10
^-3M）を含んだGIT−10FCS培地（HAT培地）を１ウェル当
り1mlずつ添加することにより、HAT選択培養を開始し
た。HAT選択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液を1
ml捨てたあと、1mlのHAT培地を添加することにより継続
した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜14日で
認められ、培養液が黄変したとき（約１×10⁶セル/m
l）、上清を採取し、後述するEIA法で、抗体価を測定し
た。

II−５ ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマ培養上清中の抗体価を以下の２種の方
法により測定した。いずれの方法にも抗マウスイムノグ
ロブリン抗体結合マイクロプレートを用いた。該プレー
トは、まず抗マウスイムノグロブリン抗体（IgG画分、
カッペル社製）を20μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液、pH9.6
溶液を96ウェルマイクロプレートに100μずつ分注
し、４℃で24時間放置した。次に、プレートをPBSで洗
浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため25％
ブロックエース（雪印乳業社製）を含むPBSを300μず
つ分注し、少なくとも４℃で24時間処理した。

ｉ）HRP標識化エンドセリン−３を用いるEIA法 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート
にバッファーＥ（10％ブロックエース、2mg/ml BSA、0.
4M NaCl、2mM EDTAおよび0.1％NaN₃を含む0.02Mリン酸
緩衝液、pH7.0）50μおよびハイブリドーマ培養上清5
0μを加え、室温４時間反応させた。反応後、PBSで洗
浄したのち、上記II−３で作製したHRP標識化エンドセ
リン−３〔１％BSAを含む0.02Mリン酸緩衝液、pH7（バ
ッファーＡ）で100倍希釈〕100μを加え、４℃で16時
間反応させた。反応後PBSで洗浄したのち、固相上の酵
素活性を測定するため0.2％オルソフェニレンジアミ
ン、0.02％過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液、pH5.
5を100μずつ分注し、室温で10分間反応させた。４規
定硫酸100μを加え、反応を停止させたのち492nmの吸
収をプレートリーダー（MTP−32,コロナ社製）で測定し
た。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた
全120ウェルの上清を調べたところ、No.5およびNo.93の
ウェルに強い抗体価が検出された。

ii）HRP標識化エンドセリン−3 C端ペプチド抗体を用い
るEIA法 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート
にバッファーE50μ、ハイブリドーマ培養上清50μ
、および6ng/mlのエンドセリン−３を含むバッファー
Ｅ溶液50μを加え、室温で４時間反応させた。プレー
トをPBSで洗浄したのち、上記Ｉ−６で作製したHRP標識
化エンドセリン−3 C端ペプチド抗体〔バッファーＣ
（１％BSA、0.4M NaCl、2mM EDTAを含む0.02Mリン酸緩
衝液、pH7.2）で300倍に希釈〕100μを加え、４℃で1
6時間反応させた。次に、プレートをPBSで洗浄したの
ち、固相上の酵素活性を上記II−５（ｉ）記載の方法に
より測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた
全120ウェルの上清を調べたところ、No.93のウェルに強
い抗体価が検出された。

II−６ クローニング 抗体活性が陽性を示したNo.5およびNO.93のウェルの
各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付
した。即ちハイブリドーマが1.5個/mlになるようRPMI16
40−20FCSに浮遊させ、96穴マイクロプレート（ヌンク
社製）１ウェル当り0.2mlずつ分注した。分注する際、
フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウェル
当り５×10⁵個になるように加えた。約１週間後には細
胞の増殖が認められるようになり、上清中の抗体価を上
記II−５記載のEIA法により調べたところ、No.5ハイブ
リドーマでは41クローン中８クローンが、またNo.93の
ハイブリドーマでは41クローン中７クローンが抗体を産
生していた。

これらのクローンのうち、No.93−18より得られたク
ローンAET−30およびその産生するモノクローナル抗体A
ET−30aに注目し、以下の実験を実施した。

II−７ 大量のモノクローナル抗体の調製 ミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス、あ
るいは未処置マウス（BALB/C）にハイブリドーマAET−3
0 1〜３×10⁶セル／匹を腹腔内注射したのち、10〜30日
後に抗体含有腹水を採取した。

II−８ モノクローナル抗体の精製 上記II−７調製腹水よりプロテイン−Ａカラムにより
モノクローナル抗体を精製した。

即ち腹水8mlを等量の結合緩衝液（3.5M NACl、0.05％
NaN₃を含む1.5Mグリシン、pH9.0）で希釈したのち、あ
らかじめ結合緩衝液で平衡化したプロテイン−Ａ−セフ
ァロース（ファルマシア製）カラムに供し、特異抗体を
溶離緩衝液（0.05％NaN₃を含む0.1Mクエン酸緩衝液、pH
3.0）で溶出した。以上の操作により、40mgの特異抗体
を得た。

II−９ モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決
定 上記II−８精製モノクローナル抗体を１μg/mlを含む
0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレー
トに100μずつ分注し、４℃で24時間放置した。上記I
I−５で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部位
をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピ
ングキット（Mouse−Typer^TMSub−Isotyping Kitバイオ
ラッド社製）を用いるエンサイム−リンクトイムノソー
ベントアッセイ（ELISA）によってクラス、サブクラス
を調べた。その結果AET−30aはIgG1、κクラスに属する
ことが分かった。

III.競合法−EIA 上記II−５記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合
マイクロプレートに、バッファーＣで75倍に希釈したAE
T−30含有培養上清50μ、およびエンドセリン−１標
準液50μあるいはエンドセリン−３標準液50μを加
え、室温で１時間反応させたのち、上記II−３記載HRP
標識化エンドセリン−３（バッファーＡで100倍希釈）
を加え、４℃で16時間反応させた。反応液、PBSで洗浄
したのち固相上の酵素活性をII−５（ｉ）記載の方法に
より測定した。結果を第１図に示す。図中、−●−がエ
ンドセリン−３の標準曲線を、また−○−がエンドセリ
ン−１の標準曲線を示す。

第１図の結果から、AET−30aがエンドセリン−３と反
応し、エンドセリン−１と反応しないことが分った。

IV.サンドイッチ法−EIA 精製したモノクローナル抗体AET−30a 20μg/mlを含
む0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレ
ートに100μずつ分注し、４℃で24時間放置した。ウ
ェルの余剰の結合部位をPBSで４倍希釈したブロックエ
ース（雪印乳業社製、大日本製薬社販売）300μを加
え不活化した。

以上のように調製したプレートにバッファーＥで希釈
したエンドセリン−３、エンドセリン−１、エンドセリ
ン−２（ヒト）、ビッグエンドセリン−１（ヒト）、ビ
ッグエンドセリン−１（ブタ）およびビッグエンドセリ
ン−３（22−42）（ヒト）標準液100μを加え、４℃
で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、上記Ｉ−６
で作製したHRP標識化エンドセリン−3 C端ペプタイド抗
体（バッファーＣで300倍希釈）100μを加え、４℃で
24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、上記II−５
（ｉ）記載の方法により固相上の応訴活性を測定した。
結果を第２図に示す。図中、−●−がエンドセリン−３
の、また−▲−がエンドセリン−１の、−■−がエンド
セリン−２（ヒト）の、−○−がビッグエンドセリン−
１（ヒト）の、−△−がビッグエンドセリン−１（ブ
タ）、および−□−がビッグエンドセリン−３（ヒト）
の標準曲線を示す。

第２図の結果から、この測定法がエンドセリン−３に
特異的であり、エンドセリン−3 4×10^-17モル／ウェル
を、他のエンドセリンとはほとんど反応することなく
（交差反応性、0.1％以下）、検出し得ることが分っ
た。

V.モノクローナル抗ビッグエンドセリン−3 C端ペプタ
イド抗体の作製 Ｖ−1.ペプタイドの合成 （１）ビッグエンドセリン−３（big ET−３）（22−4
2）;H−Ile−Asn−Thr−Pro−Glu−Glu−Thr−Val−Pro
−Tyr−Gly−Leu−Ser−Asn−Tyr−Arg−Gly−Ser−Phe
−Arg−Gly−OHの合成 市販のBoc−Gly−OCH₂−PAM樹脂（アブライド バイ
オシステムズ社製）0.77g（0.5n mole）を用い、ペプチ
ド合成機（アブライド バイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレ
ンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、Boc−Arg（Tos）,Boc−Phe,Boc−Ser（Bzl）,Boc−
Gly,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Asn,Boc−Leu,Boc−Pro,
Boc−Val,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Gln,Boc−Glu（OBz
l）,Boc−Ileをbig ET−３（22−42）のアミノ酸配列通
り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDCCまた
は、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮
合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化
し、保護されたbig ET−３（22−42）−OCH₂−PAM樹脂
0.88gを得た。

この樹脂0.35gをｐ−クレゾール0.70g共存下無水フッ
化水素5mlで０℃,60分間処理した後、フッ化水素を減圧
留去し、残渣をエチルエーテル5mlで２回洗浄した後、
残渣を50％−酢酸水5mlで抽出した。不溶物を濾去し、5
0％−酢酸水5mlで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜3m
lに減圧濃縮し、セファデックスLH−20（２×90cm）の
カラムに付し、50％−酢酸で溶出した。主要画分を集め
濃縮し0.1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−O
DS AM120 Ｓ−50樹脂カラム（2.6×7cm）に付け、0.1
％トリフルオロ酢酸水と50％アセトニトリル（0.1％ト
リフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出し
た。主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末76mgを得
た。

アミノ酸分析値 Asp1.97（２）,Thr1.76（２）,Ser1.68（２）,Glu2.04
（２）,Gly3.00（３）,Val1.00（１）,Pro1.90（２）,I
le0.95（１）,Leu0.99（１）,Tyr0.95（１）,Phe1.02
（１）,Arg2.27（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺2356.16 HPLC溶出時間 17.01分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分） 流 速:1.0ml/分 （２）big ET−３（１−42）； Ｈ−Cys−Thr−Cys−Phe−Thr−Tyr−Lys−Asp−Lys−G
lu−Cys−Val−Tyr−Tyr−Cys−His−Leu−Asp−IleOIl
e−Trp−Ile−Asn−Thr−Pro−Glu−Glu−Thr−Val−Pr
o−Tyr−Gly−Leu−Ser−Asn−Tyr−Arg−Gly−Ser−Ph
e−Arg−Gly−OHの合成 市販のBoc−Gly−OCH₂−PAM樹脂（アプライド バイ
オシステムズ社製）0.78g（0.5n mole）を用い、ペプチ
ド合成機（アブライド バイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレ
ンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、Boc−Arg（Tos）,Boc−Phe,Boc−Ser（Bzl）,Boc−
Gly,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Asn,Boc−Leu,Boc−Pro,
Boc−Val,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Gln,Boc−Glu（OBz
l）,Boc−Ile,Boc−Trp（CHO）,Boc−Asp（OBzl）,Boc
−His（DNP）,Boc−Cys（MeBzl）,Boc−Lys（Cl−Ｚ）
をbig ET−３（１−42）のアミノ酸配列通り順にHOBt/D
CCで活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DCCで
活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未
反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護された
big−ET−３（１−42）−OCH₂−PAM樹脂を得た。これを
N,N′−ジメチルホルムアミド20mlに懸濁し、チオフェ
ノール2mlを加え、室温で２時間ゆるやかに攪拌した後
グラスフィルター上に樹脂を濾過し、N,N′−ジメチル
ホルムアミドとジクロロメタンで洗浄の後乾燥し1.00g
の樹脂を得た。

この樹脂0.39gをｐ−クレゾール0.74g,1,4−ブタンジ
チオール1.0ml共存下無フッ化水素10mlで０℃,60分間処
理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエー
テル5mlで２回洗浄した後、残渣をトリフルオロ酢酸4ml
で抽出した。不溶物を濾去し、トリフルオロ酢酸2mlで
２回洗浄した。これを4M−ウレア水溶液750mlにそそ
ぎ、氷冷下にpH8.25に調節し、緩やかに空気を吹き込み
ながら一晩攪拌した。Ellmanテストが陰性になったこと
を確認した後、全溶液をYMC−ODS AM120 Ｓ−50樹脂
カラム（2.6×7cm）に付け、0.1％トリフルオロ酢酸水
と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）
の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、
凍結乾燥し、白色粉末16mgを得た。同じカラムを用い、
20−50％のあいだでの直線型濃度勾配の溶出で再クロマ
ト精製し目的物6.3mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp3.84（４）,Thr3.31（４）,Ser2.02（２）,Glu3.04
（３）,Pro2.22（２）,Gly3.31（３）,Cys1.20（２）,V
al1.77（２）,Ile1.83（３）,Leu2.00（２）,Tyr4.64
（５）,Phe1.92（２）,Lys1.78（２）,His0.88（１）,A
rg2.12（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺4979.48 HPLC溶出時間 21.00分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分） 流速 :1.0ml/分 （３）big ET−３（22−41）−NH₂; Ｈ−Ile−Asn−Thr−Pro−Glu−Gln−Thr−Val−Pro−T
yr−Gly−Leu−Ser−Asn−Tyr−Arg−Gly−Ser−Phe−A
rg−NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アブライド バイオシス
テムズ社製）0.60g（0.5nmole）を用い、ペプチド合成
機（アブライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

樹脂にBoc−Arg（Tos）をHOBt/DCCで導入した後、樹
脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで
処理し、アミノ基を遊離させた。このアミノ基に、Boc
−Phe,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Gly,Boc−Arg（'Tos）,Bo
c−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Asn,Boc−Leu,Boc−Pro,Boc−V
al,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Gln,Boc−Glu（OBzl）,Boc−
Ileをbig ET−３（22−41）−NH₂のアミノ酸配列通り順
にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOB
t/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をし
た後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保
護されたbig ET−３（22−41）−BHA樹脂1.96gを得た。

この樹脂0.23gをｐ−クレゾール0.40g共存下無水フッ
化水素5mlで０℃,60分間処理した後、フッ化水素を減圧
留去し、残渣をエチルエーテル5mlで２回洗浄した後、
残渣を50％−酢酸水5mlで抽出した。不溶物を濾去し、5
0％−酢酸水5mlで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜3m
lに減圧濃縮し、セファデックスLH−20（２×90cm）の
カラムに付し、50％−酢酸で溶出した。主要画分を集め
濃縮し0.1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−O
DS AM120 Ｓ−50樹脂カラム（2.6×7cm）に付け、0.1
％トリフルオロ酢酸水と50％アセトニトリル（0.1トリ
フルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出し
た。主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末56mgを得
た。

アミノ酸分析値 Asp1.97（２）,Thr1.88（２）,Ser1.75（２）,Glu2.05
（２）,Gly3.00（３）,Val1.00（１）,Pro1.93（２）,I
le0.95（１）,Leu0.98（１）,Tyr0.95（１）,Phe1.02
（１）,Arg2.18（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺2298.19 HPLC溶出時間 17.01分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分） 流速 :1.0ml/分 （４）big ET−３（１−41）−NH₂; Ｈ−Cys−Thr−Cys−Phe−Thr−Tyr−Lys−Asp−Lys−G
lu−Cys−Val−Tyr−Tyr−Cys−His−Leu−Asp−Ile−I
le−Trp−Ile−Asn−Thr−Pro−Glu−Gln−Thr−Val−P
ro−Tyr−Gly−Leu−Ser−Asn−Tyr−Arg−Gly−Ser−P
he−Arg−NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライド バイオシス
テムズ社製）0.60g（0.5n mole）を用い、ペプチド合成
機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

樹脂にBoc−Arg（Tos）をHOBt/DCCで導入した後、樹
脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで
処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基に、Bo
c−Phe,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Gly,Boc−Arg（Tos）,Bo
c−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Asn,Boc−Leu,Boc−Pro,Boc−V
al,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Gln,Boc−Glu（OBzl）,Boc−
Ile,Boc−Trp（CHO）,Boc−Asp（OBzl）,Boc−His（DN
P）,Boc−Cys（MeBzl）,Boc−Lys（Cl−Ｚ）をbig ET−
３（１−41）−NH₂のアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで
活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DCCで活性
化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応
のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護されたbig
−ET−３（１−41）−BHA樹脂を得た。これをN,N′−ジ
メチルホルムアミド20mlに懸濁し、チオフェノール2ml
を加え、室温で２時間ゆるやかに撹拌した後グラスフィ
ルター上に樹脂を濾過し、N,N′−ジメチルホルムアミ
ドとジクロロメタンで洗浄の後乾燥し1.34gの樹脂を得
た。

この樹脂0.74gをｐ−クレゾール1.0g、1,4−ブタンジ
チオール1.0ml共存下無水フッ化水素10mlで０℃,60分間
処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエ
ーテル5mlで２回洗浄した後、残渣をトリフルオロ酢酸6
mlで抽出した。不溶物を濾去し、トリフルオロ酢酸2ml
で２回洗浄した。これを4M−ウレア水溶液1000mlにそそ
ぎ、氷冷下にpH8.0に調節し、緩やかに空気を吹き込み
ながら一晩撹拌した。Ellmanテストが陰性になったこと
を確認した後、全溶液をYMC−ODS AM120 Ｓ−50樹脂
カラム（2.6×7cm）に付け、0.1％トリフルオロ酢酸水
と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）
の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、
凍結乾燥し、白色粉末35mgを得た。同じカラムを用い、
20−50％のあいだでの直線型濃度勾配の溶出で再クロマ
ト精製を繰り返し、目的物9.5mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp3.89（４）,Thr3.81（４）,Ser1.98（２）,Glu3.04
（３）,Pro2.09（２）,Gly3.30（３）,Cys1.60（２）,V
al1.79（２）,Ile1.83（３）,Leu2.00（２）,Tyr4.72
（５）,Phe1.92（２）,Lys1.88（２）,His0.91（１）,A
rg2.20（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺4921.31 HPLC溶出時間 21.00分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分） 流速 :1.0ml/分 Ｖ−2.免疫原の作製 上記Ｖ−１で得られたビッグエンドセリン−3 C末端
ペプタイドIle−Asn−Thr−Pro−Glu−Gln−Thr−Val−
Pro−Tyr−Gly−Leu−Ser−Asn−Tyr−Arg−Gly−Ser−
Phe−Arg−Gly（１）と牛チログロブリン（TG）とを以
下に述べるマレイミド架橋法により縮合させ、免疫原と
した。

即ち、ポリペプタイド1.28μmoleを350μｌの0.1Mリ
ン酸緩衝液、pH7.0（10％のDMFを含む）に溶解させ、GM
BS25.6μmoleを含むDMF溶液100μｌと混合し、室温で30
分反応させた。

一方、TG30mg（60n mole）を0.15M食塩を含む0.02Mリ
ン酸緩衝液、pH6.8、1.4mlに溶解させ、SPDP3.7mg（12.
0μmole）を含むDMF溶液を混合したのち室温40分間反応
させた。反応後、ジチオスレイトール18.6mg（120μmol
e）を含む0.1M酢酸緩衝液、pH4.5、0.5mlを加え、室温2
0分反応させた後、セファデックスＧ−25カラムで分画
を行ない、SH基の導入されたTG18mg（36n mole）を得
た。

次にマレイミド基導入ポリペプタイド920n moleと、S
H基導入TG29n moleとを混合し、４℃で２日間反応させ
たのち、生理食塩水に対し、４℃、２日間透析した。

Ｖ−3.免疫 ６〜８週令のBALB/c雌マウスに上記Ｖ−２記載の免疫
原15μg/匹（ビッグエンドセリン−3 C端ペプタイドと
して）をアジュバントとともに皮下免疫した。以後３週
間おきに２回追加免疫を実施した。

Ｖ−4.HRP標識化ビッグエンドセリン−3 C端ペプタイド
の作製 ビッグエンドセリン−3 C端ペプタイド330n moleを50
0μｌの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0に溶解させ、GMBS2.78
mg（9.9μmole）を含むDMF溶液50μｌと混合し、室温で
60分反応させた。反応後、セファデックスＧ−25カラム
で分画を行ないマレイミド基の導入されたポリペプチド
200n moleを得た。

一方、HRP10mg（250n mole）を用いて、II−３記載の
方法によりSH基の導入された酵素6mg（150n mole）を得
た。

次に、マレイミド基導入ビッグエンドセリン−3 C端
ペプチド200n moleとSH基導入ペルオキシダーゼ50n mol
eとを混合し、４℃、16時間反応させた。反応後、ウル
トロゲルAcA44（LKB−ファルマシア社製）カラムで分画
し、ペルオキシダーゼ標識化ビッグエンドセリン−3 C
端ペプチドを得た。

Ｖ−5.細胞融合 Ｖ−３記載の、ビッグエンドセリン−3 C端ペプチド
を免疫中のマウスを用いて、II−４記載の方法により細
胞融合を実施し、ハイブリドーマを得た。

Ｖ−6.ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマ培養上清中の抗体価を以下の２種の方
法により測定した。すなわち、抗マウスイムノグロブリ
ン抗体又はビッグエンドセリン−3 C端ペプチド結合マ
イクロプレートを用いた。該プレートは、まず抗マウス
イムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社製）又は
ビッグエンドセリン−3 C端ペプタイドを20μg/ml含む
0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレー
トに100μｌずつ分注し、４℃で24時間放置した。次に
プレートをPBSで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部
位をふさぐため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を
含むPBSを300μｌずつ分注し、少なくとも４℃で24時間
処理した。

ｉ）HRP標識化ビッグエンドセリン−3 C端ペプタイドを
用いるEIA法 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート
にバッファーＥ（10％ブロックエース、2mg/ml BSA、
0.4M NaCl、2mM EDTAおよび0.1％NaN₃を含む0.02Mリン
酸緩衝液、pH7.0）50μｌおよびハイブリドーマ培養上
清50μｌを加え、室温４時間反応させた。反応後、上記
Ｖ−４で作製したHRP標識化ビッグエンドセリン−3 C端
ペプタイド［バッファーＣで400倍希釈］100μｌを加
え、４℃で16時間反応させた。反応後PBSで洗浄したの
ち、固相上の酵素活性をII−５（ｉ）に記載の方法によ
り測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた
全120ウェルの上清を調べたところ、No.44およびNo.77
のウェルに強い抗体価が検出された。

ii）ビッグエンドセリン−3 C端ペプチド結合 マイクロプレートを用いるELISA法ビッグエンドセリ
ン−3 C端ペプタイド結合マイクロプレートにバッファ
ーE50μｌ、ハイブリドーマ上清100μｌを加え、室温４
時間反応させた。反応液PBSで洗浄したのち、HRP標識抗
マウスイムノグロブリン抗体［バッファーＣで10000倍
希釈］100μｌを加え、４℃で16時間反応させた。次
に、プレートをPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性
を上記Ｖ−６（ｉ）記載の方法により測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた
全120ウェルの上清を調べたところ、No.77のウェルに強
い抗体価が検出された。

Ｖ−7.クローニング 抗体活性が陽性を示したNo.44およびNo.77のウェルの
各ハイブリドーマをII−６の項に従い、クローニングを
行った。約１週間後には細胞の増殖が認められるように
なり、上清中の抗体価を上記Ｖ−６（ｉ）記載のEIA法
により調べたところ、No.44ハイブリドーマでは76クロ
ーン中２クローンが、またNo.77のハイブリドーマでは7
6クローン中75クローンが抗体を産生していた。

これらのクローンのうち、No.77−30より得られたク
ローンbET−31およびその産生するモノクローナル抗体b
ET−31a、No.44−52より得られたクローンbET−23およ
びその産生するモノクローナル抗体bET−23aに注目し、
以下の実験を実施した。

Ｖ−8.大量のモノクローナル抗体の調製 ミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス、あ
るいは未処置マウス（BALB/C）にハイブリドーマbET−3
1またはbET−23 １〜３×10⁶セル／匹を腹腔内注射し
たのち、10〜14日後に抗体含有腹水を採取した。

Ｖ−9.モノクローナル抗体の精製 上記Ｖ−８調製腹水よりプロテイン−Ａカラムにより
モノクローナル抗体bET−31aおよびbET−23aをII−８の
方法に従い精製した。bET−31aが30mg bET−23aが50mg
の特異抗体を得た。

Ｖ−10.モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決
定 上記Ｖ−９精製モノクローナル抗体bET−31aおよびbE
T−23aのクラス・サブクラスのII−９で述べた方法に従
い決定した。その結果、bET−31aおよびbET−23aはいず
れもIgGl、κクラスに属することが分かった。

VI.ビッグエンドセリン−３に関する競合法−EIA 上記Ｖ−６記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合
マイクロプレートに、バッファーＣで100倍に希釈したb
ET−31aおよびbET−23a含有培養上清50μｌ、およびビ
ッグエンドセリン−1,エンドセリン−3,ビッグエンドセ
リン−3,ビッグエンドセリン−3 C端ペプタイド（22−4
2）、あるいはビッグエンドセリン−3 C端ペプタイド
（22−41）−NH₂標準液50μｌを加え、室温で１時間反
応させたのち、上記Ｖ−４記載HRP標識化ビッグエンド
セリン−3 C端ペプタイド（バッファーＣで200倍希釈）
を加え、４℃で16時間反応させた。反応後、PBSで洗浄
したのち固相上の酵素活性をII−５（ｉ）記載の方法に
より測定した。その結果を第３図（Ａ），（Ｂ）に示
す。図中、−▲−がビッグエンドセリン−３を、−○−
がビッグエンドセリン−１を、−●−がエンドセリン−
３を、−■−がビッグエンドセリン−3 C端ペプチド（2
2−42）を、また、−□−がビッグエンドセリン−3 C端
ペプチド（22−41）−NH₂の標準曲線を示し、（Ａ）がb
ET−31a、（Ｂ）がbET−23aを用いた競合法の結果を示
す。

第３図の結果から、bET−31aおよびbET−23aはとも
に、ビッグエンドセリン−１およびエンドセリン−３と
反応しないことから、ビッグエンドセリン−３に特異的
な抗体であり、さらに、ビッグエンドセリン−3 C端ペ
プタイド（22−42）およびビッグエンドセリン−3 C端
ペプタイド（22−41）−NH₂と同程度に反応することか
ら、ビッグエンドセリン−３のＣ端部位に広い特異性を
有することがわかった。

VII.ビッグエンドセリン−３に関するサンドイッチ法−
EIA VII−1.HRP標識化モノクローナル抗体bET−31aの作製 上記Ｖ−９記載の方法で精製したbET−31aをＩ−６記
載の方法に従ってFab′−HRP標識体を作製した。

即ち、0.1M酢酸緩衝液、pH4.5に溶解したモノクロー
ナル抗体bET−31a 10.5mgにペプシン（シグマ社、２回
結晶）3.17μｇを加え、37℃,16時間反応させたのち、B
BSで平衡化したウルトロゲルAcA44カラムでＦ（ab′）
_２画分を精製した。該画分を0.1M酢酸緩衝液、pH5で透
析したのち、最終20mMのβ−メルカプトエチルアミンを
加え、37℃で90分放置した。反応液を2.5mM EDTAを含む
0.1Mリン酸緩衝液,pH6.0で平衡化したセファデックスＧ
−25カラムで分離し、Fab′画分を得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ5mgを0.9mlの0.1M
リン酸緩衝液、pH7に溶解させ、50μｌのDMFに溶解させ
たGMBS1.05mgを加えて室温で40分反応させた。

反応液をセファデックスＧ−25カラム（溶離液0.1Mリ
ン酸緩衝液、pH6.8）で分離し、得られたマレイミド化
ペルオキシダーゼ3.5mgと上記Fab′画分1.3mgとを混合
し、コロジオンパック（エムエス機器社）で約0.3mlに
まで濃縮したのち、４℃で16時間放置した。反応液を溶
離液に0.1Mリン酸緩衝液、pH6.5を用いるウルトロゲルA
cA44カラム（10mmφ×40mm）に供し、Fab′−ペルオキ
シダーゼ複合体画分を精製した。

VII−2.HRP標識化モノクローナル抗体bET−23aの作製 上記VII−１記載の方法に従いモノクローナル抗体bET
−23a12.7mgを用いて、HRP標識化bET−23aを作製した。

VII−3.サンドイッチ法EIA IVで作製したAET−30a結合マイクロプレートにバッフ
ァーＥで希釈したビッグエンドセリン−３、ビッグエン
ドセリン−１（ヒト）、エンドセリン−３、エンドセリ
ン−１およびエンドセリン−２（ヒト）標準液100μｌ
を加え、４℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したの
ち、上記VII−１、VII−２で作製したHRP標識化bET−31
aまたはbET−23a（バッファーＣで200倍希釈）100μｌ
を加え、４℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したの
ち、上記II−５（ｉ）記載の方法により固相上の酵素活
性を測定した。HRP標識化bET−31aを用いた場合の結果
を第４図に、HRP標識化bET−23aを用いた場合の結果を
第５図に示す。図中、−▲−がビッグエンドセリン−３
の、また−○−がビッグエンドセリン−１（ヒト）の、
−●−がエンドセリン−３の、−■−がエンドセリン−
１の、−□−がエンドセリン−２の標準曲線を示す。

第４図の結果から、HRP標識化bET−31aを用いる測定
法はビッグエンドセリン−３に特異的であり、他のエン
ドセリンとはほとんど反応せず（交差反応性、0.1％以
下）、また測定感度は、６×10^-17モル／ウェルである
ことが分った。

同様に第５図の結果から、HRP標識化bET−23aを用い
る測定法は、ビッグエンドセリン−３に特異的であり、
他のエンドセリンとはほとんど反応しない（交差反応
性、0.1％以下）ことが分った。また、測定感度は、８
×10^-16モル／ウェルであった。

VIII.羊水中のエンドセリン−３の定量 羊水（1ml）をセップパックＣ−18カートリッジで濃
縮・前処理したのち、エンドセリン−３を上記IV記載サ
ンドイッチ法−EIAにより定量した。羊水の前処理の方
法をスキーム１に、測定結果を第１表に示した。第１表
の結果より、出産時の羊水中に4.2±3.9pg/ml（mean±S
D,n＝８）のエンドセリン−３が存在することが分っ
た。

IX.羊水中のエンドセリン−３の逆相高速液体クロマト
グラフィー（RP−HPLC）による検出 第１表、No.3の羊水1.5mlを上記Ｖ記載のセップパッ
クＣ−18カートリッジを用いて前処理したのち、チッ素
気流下で濃縮した。次に濃縮物を、後述する溶離液A100
μに溶解したのち、RP−HPLCで分離した。分離条件を
以下に示す。

カラム:ODS−80TM（4.6mmφ×250mm,東ソー社製） 溶離液A:0.05％−トリフルオロ酢酸（TFA）を含む５
％アセトニトリル 溶離液B:0.05％TFAを含む60％アセトニトリル 溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間の間に０〜
40％に、次の20分間に40〜65％に、さらに次の５分間に
65〜100％に、直線的に上昇させる。

流 速:1ml/分 分 画:0.5ml/tube 溶出画分を減圧下、遠心濃縮乾固したのち、250μ
のバッファーＥに溶解させ、上記IV記載のサンドイッチ
法−EIAに供した。結果を第６図に示す。羊水中のエン
ドセリン−３の免疫活性は合成エンドセリン−３の溶出
位置に検出されたことから、該サンドイッチ法−EIAが
エンドセリン−３を検出していることが確認された。

X.健常人および透析患者血漿中のエンドセリン−３の定
量 ヒト血漿（1ml）をスキーム１に示す方法により、濃
縮、前処理したのち、エンドセリン−３を上記IV記載サ
ンドイッチ法−EIAにより定量した。健常人17名（男
性、37.5±4.9才）および透析患者24名（男性、46.0±
7.0才）の血漿の測定結果を第７図に示す。

この結果から、この測定法により血漿中のエンドセリ
ン−３が定量可能であること、および、透析患者でエン
ドセリン−３の血漿レベルが増加することから、この測
定法が臨床上も有用であることが明らかにされた。

XI.健常人および透析患者血漿中のエンドセリン−３免
疫活性のRP−HPLCによる検出 健常人血漿、20ml、あるいは透析患者血漿80mlを同量
のPBSで希釈したのち、AET−30の結合セファロース4Bカ
ラム（Ｉ−４記載の方法により、1.5mgの抗体を1gのCNB
r活性化セファロース4Bに結合させたゲル1.5mlを含む）
に10ml/時間の速度で通した。カラムを15mlのPBSで洗浄
したのち、3mlの0.05％TFAを含む60％アセトニトリル溶
液で溶出し、窒素気流下濃縮した。濃縮物を0.05％TFA
および0.05％CHAPS（３−［（３−コラミドプロピル）
ジメチルアンモニオ］１−プロパンスルホネート）（３
−［（３−cholamidopropyl）dimethylammonio］−１−
propanesultonate）を含む５％アセトニトリル溶液で溶
解したのち、IX記載の溶出条件により、RP−HPLCで分析
した。

結果を第８図に示す。健常人（Ａ）および透析患者
（Ｂ）いずれの免疫活性も、標準の合成エンドセリン−
３の溶出位置に検出されたことから、該サンドイッチ−
EIAが、血漿中のエンドセリン−３を検出していること
が確認され、その優れた特性が明らかとなった。

XII モノクローナル抗体AET−30aの中和活性能の検討 ブタ左冠状動脈より摘出した約2cmのらせん状条片
を、混合ガス（95％O₂＋５％CO₂）通気下にクレブス−
ヘンゼライト液（以下栄養液と略す）で満たされたマグ
ヌス管内に懸垂した。37℃で３時間放置したのち、血管
平滑筋の収縮により発生する張力をアイソメトリックト
ランデューサー（ポリグラフ、NEC三栄社製）により測
定した。試料として、あらかじめ20倍moleのAET−30aと
37℃、20分間反応させたエンドセリン−３溶液（最終エ
ンドセリン−３濃度１×10^-8M）を添加しても発生する
張力は、同濃度のエンドセリン−３により惹起される張
力の7.0％（ｎ＝５）であるのに対し、対照抗体H272−1
1（抗癌胎児性抗原）とエンドセリン−３とを反応させ
た溶液（最終１×10^-8M）を添加した場合にはエンドセ
リン−３と同程度（121％,n＝５）の収縮による張力が
観測された。以上のことから、AET−30aはエンドセリン
−３の血管平滑筋収縮活性を中和することが明らかとな
った。

〔発明の効果〕

本発明のエンドセリン−３に対するモノクローナル抗
体は、極めて高い結合能を有し、かつエンドセリン−３
の血管平滑筋収縮活性を中和することができる。該モノ
クローナル抗体とエンドセリン−３のＣ端部を認識する
抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫学的測定法に
より、エンドセリン−３を高感度にかつエンドセリン−
１あるいはエンドセリン−２あるいはビッグエンドセリ
ン−３と交差反応することなく定量することができる。
また該抗体は、エンドセリン−３と関連する各種疾患に
おいて、エンドセリン−３の強力なアンタゴニストとし
て使用し得る。

また、本発明のビッグエンドセリン−3 C端ペプチド
に対するモノクローナル抗体は、ビッグエンドセリン−
3 C末端に対し、幅広い特異性を有することから、ビッ
グエンドセリン−３免疫活性の検出に有利であり、該モ
ノクローナル抗体とエンドセリン−３に対するモノクロ
ーナル抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫学的測
定法により、ビッグエンドセリン−３を高感度にかつ、
エンドセリン−１、−２、−３、およびビッグエンドセ
リン−１と交差反応することなく定量することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体AET−30aを用いる競合法−
EIAにおけるエンドセリン−３およびエンドセリン−１
の標準曲線を示す。 第２図はモノクローナル抗体AET−30aおよび抗エンドセ
リン−3 C端ペプタイド抗体を用いるサンドイッチ法−E
IAにおけるエンドセリン−３（−●−）、エンドセリン
−１（−▲−）、エンドセリン−２（−■−）、ヒトビ
ッグエンドセリン−１（−○−）、ブタビッグエンドセ
リン−１（−□−）、およびビッグエンドセリン−３
（−△−）の標準曲線を示す。 第３図（Ａ）はモノクローナル抗体bET−31aを用いる競
合法−EIA、（Ｂ）はモノクローナル抗体bET−23aを用
いる競合法−EIA、各々におけるビッグエンドセリン−
３（−▲−）、ビッグエンドセリン−１（ヒト）（−○
−）、エンドセリン−３（−●−）、ビッグエンドセリ
ン−3 C端ペプチド（22−42）（−■−）、およびビッ
グエンドセリン−3C端ペプチド（22−41）−NH₂（−□
−）の標準曲線を示す。 第４図はモノクローナル抗体AET−30aおよびモノクロー
ナル抗体bET−31aを用いるサンドイッチ法−EIAにおけ
るビッグエンドセリン−３（−▲−）ビッグエンドセリ
ン−１（ヒト）（−○−）、エンドセリン−３（−●
−）、エンドセリン−１（−■−）、およびエンドセリ
ン−２（−□−）の標準曲線を示す。 第５図はモノクローナル抗体AET−30aおよびモノクロー
ナル抗体bET−23aを用いるサンドイッチ法−EIAにおけ
るビッグエンドセリン−３（−▲−）ビッグエンドセリ
ン−１（ヒト）（−○−）、エンドセリン−３（−●
−）、エンドセリン−１（−■−）、およびエンドセリ
ン−２（−□−）の標準曲線を示す。 第６図はセップパックＣ−18カートリッジ処理後のヒト
羊水の逆相HPLCによる分離および、上記サンドイッチ法
−EIAによる検出結果を示す。矢印は合成標準エンドセ
リンおよびビッグエンドセリンの溶出位置を示す。 略号： ET−3,エンドセリン−3;（ａ）ヒトビッグエンドセリン
−１の酸化物;hbig−ET−1,ヒトビッグエンドセリン−
1;（ｂ）エンドセリン−１の酸化物;pbig−ET−1,ブタ
ビッグエンドセリン−1;ET−1,エンドセリン−1,および
ET−2,エンドセリン−２。 第７図は、健常人および透析患者血漿中のエンドセリン
−３濃度の測定結果を、また、第８図は、健常人および
透析患者血漿エンドセリン−３免疫活性の逆相HPLCによ
る分離および上記サンドイッチ法−EIAによる検出結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/08 C07K 16/18 C12N 15/00 - 15/07 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エンドセリン−３に結合性を有し、エンド
   セリン−１及びエンドセリン−２と交差反応性を示さな
   い、AET−30aで標示されるマウスモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】エンドセリン−３に結合性を有し、エンド
   セリン−１及びエンドセリン−２と交差反応性を示さな
   い、AET−30aで標示されるマウスモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマ細胞。
3. 【請求項３】寄託番号がFERM BP−2523（AET−30）で
   ある、請求項２記載のハイブリドーマ細胞。
4. 【請求項４】請求項１記載の抗エンドセリン−３モノク
   ローナル抗体AET−30aと、被検液および標識化エンドセ
   リン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識
   化エンドセリン−３の割合を測定することを特徴とす
   る、被検液中のエンドセリン−３の定量法。
5. 【請求項５】請求項１記載の抗エンドセリン−３モノク
   ローナル抗体AET−30aを用いたサンドイッチ法による被
   検液中のエンドセリン−３の定量法。
6. 【請求項６】担体上に不溶化した請求項１記載の抗エン
   ドセリン−３モノクローナル抗体AET−30aに被検液を接
   触させた後、標識化された抗エンドセリン−3C端ペプチ
   ド（Csy His Leu Asp Ilc Ilc Trp）抗体を接触
   させ、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
   徴とする、被検液中のエンドセリン−３の定量法。